CN116747344A - 双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法 - Google Patents

双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法，该止血海绵具有相互贯通的孔隙结构，该止血海绵由氨基化明胶与双醛淀粉经过交联反应和冷冻干燥制备得到，交联反应过程中，氨基化明胶的游离氨基与双醛淀粉的醛基发生希夫碱反应。本发明通过交联反应有效增加了止血海绵的机械强度，赋予止血海绵优异的力学性能和回弹性能；同时，通过交联反应和冷冻干燥形成的丰富的孔隙结构，提升了止血海绵与血细胞结合能力；此外，以氨基化改性的明胶为基础进行交联制备的止血海绵表面的表面具有丰富的氨基，它们能与水分子间产生氢键作用，并能通过静电作用与表面带负电荷的血细胞快速聚集，提升了现有明胶海绵的快速止血能力。

Description

双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法
技术领域
本发明属于止血材料领域，涉及一种双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法。
背景技术
不可控出血是创伤患者死亡的主要原因之一，在临床手术以及战争中，不可控出血导致的死亡率高达30％。当遭受致命伤或不可控大出血时，仅靠人体自身的凝血机制难以实现止血，这时需要通过外加止血材料来帮助止血。因此，开发出快速、安全、有效的止血材料十分重要。
止血材料根据其材料来源分为无机类止血材料、合成类止血材料以及生物类止血材料三大类。大部分止血材料在进行止血时，第一步是接触血液后吸收血液中的水分，浓缩血液成分，从而增加局部位置的凝血因子浓度，促进凝血级联反应。一般情况下，材料的物理吸收能力越强，其止血效果也越好。其次，血小板在止血和血栓的形成过程中也起到了重要的作用。而血凝块主要由红细胞组成，因而红细胞的聚集对于血凝块的稳定存在也具有十分重要的作用。
明胶是一种吸水性极好的蛋白质水解产物，其侧链上含有丰富的羧基和氨基。明胶类生物止血材料在体内2～3周内即可降解，且几乎无抗原性，不会引起机体的不良炎症反应，具有良好生物相容性。自从1945年明胶作为止血材料首次用于临床手术后，明胶已被开发为各种形态的止血材料，比如：纤维网状、多孔材料状、薄膜状等，其中以多孔材料状的名叫海绵产品最多。明胶海绵是由明胶经过交联后冷冻干燥制成的多孔状物质，可以吸收自身体积30倍以上的液体，在外科手术中常用于止血。当放置于出血部位时，除了使凝血过程接触活化外，明胶吸水后体积膨胀，可填充伤口，发挥压迫止血作用。但是，明胶类止血材料的缺点包括机械强度较差，在使用过程中易破裂、脱落，对于血细胞、血小板的牵拉能力有限等，其快速只能能力和止血效果还有待提升，难以用于对大出血伤口进行止血。因此，有必要对现有明胶止血材料进行改进，提升其机械强度，加快其止血速度和改善其止血效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法，以提高现有明胶止血材料的机械强度，加快止血速度和改善止血效果。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，该止血海绵具有相互贯通的孔隙结构，该止血海绵由氨基化明胶与双醛淀粉经过交联反应和冷冻干燥制备得到，交联反应过程中，氨基化明胶的游离氨基与双醛淀粉的醛基发生希夫碱反应；氨基化明胶中的氨基含量为0.18～0.25mmol/g，氨基化明胶的结构式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中，R1为
上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案在中，所述止血海绵优选由氨基化明胶与双醛淀粉按照1:(0.5～1.5)的质量比经过交联反应和冷冻干燥制备得到。
上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，一种可行的氨基化明胶的制备方法为：将明胶溶解于pH＝3～6的磷酸盐缓冲液中，加入羧基活化剂和氨基供给剂，利用氨基供给剂与明胶的羧基发生酰胺化反应将明胶中的部分羧基转化为酰胺基，冷冻干燥，即得；所述氨基供给剂为乙二胺或二乙烯三胺。
进一步地，上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，在制备氨基化明胶时，控制明胶、羧基活化剂与氨基供给剂的质量比优选为1:(0.5～1):(0.5～3)，优选地，控制明胶、羧基活化剂与氨基供给剂的质量比为1:(0.5～1):(1～2)。所述羧基活化剂可以是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐。
进一步地，上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，在制备氨基化明胶时，将明胶溶解于pH＝3～6的磷酸盐缓冲液中之后，明胶在磷酸盐缓冲液中的浓度为1wt％～20wt％。
上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，所述双醛淀粉是将淀粉中的葡萄糖残基的C2-C3连接氧化成邻二醛基形成的，所述双醛淀粉的醛基化程度为60％～98％。
上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，一种可行的双醛淀粉的制备方法是将淀粉糊化，按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:(0.5～1)的比例加入高碘酸钠，于避光环境在35～45℃反应4～6h，再经过纯化得到的。上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的技术方案中，所述止血海绵具有相互贯通的孔隙结构的孔径为100～300μm。
本发明还提供了上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氨基化明胶溶解于水中，得到氨基化明胶溶液；将双醛淀粉溶解于水中，得到双醛淀粉溶液；
(2)将氨基化明胶溶液于双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:(0.5～1.5)，在搅拌条件下于35～45℃反应3～8h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵。
上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的制备方法的技术方案中，氨基化明胶溶液中氨基化明胶的浓度优选为1wt％～10wt％，双醛淀粉溶液中双醛淀粉的浓度优选为1wt％～10wt％。
本发明通过实验证实：上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵具有优异的力学性能和回弹性能、丰富的孔隙结构以及良好的快速吸水能力，经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求，并且吸液倍数可达到39～43倍；上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的溶血率不超过1.5％，具有良好的血液相容性。本发明通过红细胞聚集能力测试证实，上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵比现有商用明胶海绵具有更好的红细胞聚集能力。本发明还通过体外凝血实验测试证实，相对于现有商用明胶海绵，上述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵具有明显更优异的快速止血能力。
本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的止血机理主要如下：
由于明胶材料本身具有强吸水能力，在对明胶进行氨基化改性后，可以丰富双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵表面的氨基，这些氨基能与水分子间通过氢键作用力相互作用，赋予了其快速吸液能力。同时，由于双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵具有丰富的相互贯通的孔隙结构，发挥分子筛作用选择性吸收水分子，进一步浓缩血小板以及凝血因子，形成局部凝血块凝血。再者，双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵表面丰富的氨基能与表面带负电荷的血细胞通过静电作用快速聚集，也有利于与创面组织细胞有效结合。以上多方面共同作用，可使得出血部位血细胞迅速聚集，促进血小板栓的形成，进而实现快速凝血。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，由氨基化明胶与双醛淀粉经过交联反应和冷冻干燥制备得到，一方面，交联反应可以有效增加止血海绵的机械强度，赋予止血海绵优异的力学性能和回弹性能，解决了现有可吸收性明胶海绵力学性能不足、在使用过程中容易断裂的问题；另一方面，通过交联反应和冷冻干燥形成的丰富的孔隙结构，可以起到分子筛作用，使得止血海绵与血细胞结合能力大大提升，改善现有可吸收性明胶海绵与血细胞结合能力不足的问题；再一方面，以氨基化改性的明胶为基础进行交联，得到的止血海绵表面的表面具有丰富的氨基，这些氨基能与水分子间通过氢键作用力相互作用，并能通过静电作用与表面带负电荷的血细胞快速聚集、与创面组织细胞有效结合，提升了现有明胶海绵的快速止血能力。
2.本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，以双醛淀粉作为交联剂，由淀粉氧化得到，作为一种改性多糖，其生物相容性良好，改善了现有常用交联剂如戊二醛此类小分子醛类细胞毒性大的问题。同时，本发明通过实验证实，相比于采用京尼平、单宁酸等同样具有良好生物相容性的交联剂，本发明以双醛淀粉作为交联剂还可以使得交联反应的可控性更好，不会发生交联不均匀的现象，有利于提升制备的止血的海绵的品质。
3.本发明通过体外凝血实验证明，本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，相较于未进行氨基化改性或市面上常见的可吸收性明胶海绵而言，凝血指数得到了显著的降低，具有更优异的止血性能。同时又红细胞聚集实验也可看出，相比于未进行氨基化改性或市面上常见的可吸收性明胶海绵而言，本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵与血细胞的聚集黏附能力也得到了提升。
4.本发明还提供了双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的制备方法，该方法的工艺简单，生产成本低，可实现批量生产，同时，交联反应均匀发生，具有可调可控性好的特点。
附图说明
图1是实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的光学照片。
图2是实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的扫描电镜图。
图3是实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在吸水后、压缩至50％形变和撤销压缩外力后的光学照片。
图4是实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵用镊子尾部反复按压前、后的光学照片。
图5是实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的光学照片。
图6是实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的扫描电镜图。
图7是实施例3制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在吸水前后的光学照片。
图8是实施例4制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在吸水前后的光学照片。
图9是对比例3制备的交联止血海绵的光学照片。
图10是对比例3制备的交联止血海绵的扫描电镜图。
图11是对比例3制备的交联止血海绵在切开之后的光学照片。
图12是实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在切开之后的光学照片。
图13是实施例6中的ATR图谱。
图14是实施例7中的FT-IR图谱。
图15是实施例8中的吸液能力表征结果图。
图16是实施例9中的红细胞聚集能力表征结果图。
图17是实施例10中的体外凝血指数表征结果图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例中，pH＝5的磷酸盐缓冲液的配制方法为：分别配制0.1mol/L的磷酸二氢钾与磷酸氢二钾溶液，滴定获得pH＝5的磷酸盐缓冲液。pH＝9的磷酸盐缓冲液的配制方法为：分别配制0.1mol/L的磷酸二氢钾与磷酸氢二钾溶液，滴定获得pH＝9的磷酸盐缓冲液。若需要其他pH值的磷酸盐缓冲液，也可以参照上述方法进行配制。
实施例1
本实施例中，制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
本实施例中，以明胶为基础反应制备氨基化明胶的反应过程如下式所示：
将明胶(Gel)溶解于pH＝5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后加入乙二胺，用浓度为5mol/L的盐酸调节所得混合液的pH值至5，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝5的磷酸盐缓冲液，再加入羧基活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)，于40℃的水浴中搅拌反应6h，将所得反应产物用截留分子量8000～12000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到氨基化明胶(MGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用，将本实施例制备的氨基化明胶命名为MGel-1。
该步骤在制备氨基化明胶时，控制明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐与乙二胺的质量比为1:0.5:1。
(2)制备双醛淀粉
将淀粉(Starch)加入去离子水中，淀粉与去离子水的质量比为5:100，于60℃水浴加热条件下，搅拌糊化30min，然后按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:0.6的比例加入高碘酸钠，于避光环境在40℃的水浴中搅拌反应5h，然后加入反应液3倍体积的无水乙醇进行沉淀，将所得沉淀物用截留分子量3000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到双醛淀粉(DS)，将本实施例制备的双醛淀粉命名为DS3。
(3)制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将氨基化明胶溶液于双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:0.5，在40℃的水浴中搅拌反应5h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(MS)，将本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵命名为2M1D3-5。
本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的光学照片和扫描电镜图分别如图1和图2所示。由图1～2可知，该止血海绵呈微黄色、止血海绵内部具有相互贯通的多孔结构，多孔结构的尺寸在100～300μm。
本实施例通过实验证实，该止血海绵在水中不溶解，在吸水后具有优异的快速回弹性，吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水。该止血海绵在吸水后的照片如图3的(A)图所示，将该吸水后的止血海绵压缩至50％形变的照片如图3的(B)图所示，在压缩至50％形变后，撤销压缩的外力，该止血海绵可以快速回弹至压缩前的状态，如图3的(C)图所示。将该止血海绵浸泡于水中，用镊子尾部反复按压，该止血海绵未发生破碎，如图4所示，图4的(A)(B)两图是使用镊子尾部反复按压前、后的照片。同时，该止血海绵经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求。
实施例2
本实施例中，制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
将明胶(Gel)溶解于pH＝5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后加入乙二胺，用浓度为5mol/L的盐酸调节所得混合液的pH值至5，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝5的磷酸盐缓冲液，再加入羧基活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)，于40℃的水浴中搅拌反应6h，将所得反应产物用截留分子量8000～12000Da透析袋透析4天，透析结束后冷冻干燥，得到氨基化明胶(MGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用，将本实施例制备的氨基化明胶命名为MGel-2。
该步骤在制备氨基化明胶时，控制明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐与乙二胺的质量比为1:0.5:2。
(2)制备双醛淀粉
将淀粉(Starch)加入去离子水中，淀粉与去离子水的质量比为5:100，于60℃水浴加热条件下，搅拌糊化30min，然后按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:1的比例加入高碘酸钠，于避光环境在40℃的水浴中搅拌反应5h，然后加入反应液3倍体积的无水乙醇进行沉淀，将所得沉淀物用截留分子量3000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到双醛淀粉(DS)，将本实施例制备的双醛淀粉命名为DS5。
(3)制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将氨基化明胶溶液与双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:1，在40℃的水浴中搅拌反应3h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(MS)，将本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵命名为1M2D5-3。
本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的光学照片和扫描电镜图分别如图5和图6所示。由图5～6可知，该止血海绵呈微黄色、止血海绵内部具有相互贯通的多孔结构，多孔结构的尺寸在100～300μm。
本实施例通过实验证实，该止血海绵在水中不溶解，在吸水后具有优异的快速回弹性，吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水。将该止血海绵浸泡于水中，用镊子尾部反复按压，该止血海绵未发生破碎。同时，该止血海绵经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求。
实施例3
本实施例中，制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
将明胶(Gel)溶解于pH＝5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后加入乙二胺，用浓度为5mol/L的盐酸调节所得混合液的pH值至5，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝5的磷酸盐缓冲液，再加入羧基活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)，于40℃的水浴中搅拌反应6h，将所得反应产物用截留分子量8000～12000Da透析袋透析4天，透析结束后冷冻干燥，得到氨基化明胶(MGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用，将本实施例制备的氨基化明胶命名为MGel-1。
该步骤在制备氨基化明胶时，控制明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐与乙二胺的质量比为1:0.5:1。
(2)制备双醛淀粉
将淀粉(Starch)加入去离子水中，淀粉与去离子水的质量比为5:100，于60℃水浴加热条件下，搅拌糊化30min，然后按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:1的比例加入高碘酸钠，于避光环境在40℃的水浴中搅拌反应5h，然后加入反应液3倍体积的无水乙醇进行沉淀，将所得沉淀物用截留分子量3000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到双醛淀粉(DS)，将本实施例制备的双醛淀粉命名为DS5。
(3)制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将氨基化明胶溶液与双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:0.5，在40℃的水浴中搅拌反应6h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(MS)。
本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在吸水前后的光学照片如图7的(A)(B)两图所示。由图7可知，该止血海绵本在吸水后体积变大。该止血海绵吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水。该止血海绵在水中不溶解，经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求。
实施例4
本实施例中，制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
将明胶(Gel)溶解于pH＝5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后加入乙二胺，用浓度为5mol/L的盐酸调节所得混合液的pH值至5，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝5的磷酸盐缓冲液，再加入羧基活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)，于40℃水浴加热条件下搅拌反应6h，将所得反应产物用截留分子量8000～12000Da透析袋透析4天，透析结束后冷冻干燥，得到氨基化明胶(MGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用，将本实施例制备的氨基化明胶命名为MGel-1。
该步骤在制备氨基化明胶时，控制明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐与乙二胺的质量比为1:0.5:1。
(2)制备双醛淀粉
将淀粉(Starch)加入去离子水中，淀粉与去离子水的质量比为5:100，于60℃水浴加热条件下，搅拌糊化30min，然后按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:1的比例加入高碘酸钠，于避光环境在40℃的水浴中搅拌反应5h，然后加入反应液3倍体积的无水乙醇进行沉淀，将所得沉淀物用截留分子量3000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到双醛淀粉(DS)，将本实施例制备的双醛淀粉命名为DS5。
(3)制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将氨基化明胶溶液与双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:1，在40℃的水浴中搅拌反应8h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(MS)。
本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵在吸水前后的光学照片如图8的(A)(B)两图所示。由图8可知，该止血海绵本在吸收去离子水后体积变大。该止血海绵吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水。该止血海绵在水中不溶解，经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求。
对比例1
本对比例中，直接以明胶作为原料与双醛淀粉进行交联制备明胶海绵，步骤如下：
将明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的明胶溶液；将实施例1步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将明胶溶液与双醛淀粉溶液混合，控制明胶与双醛淀粉的质量比为1:1，在40℃的水浴中搅拌反应5h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得明胶海绵，将本对比例制备的明胶海绵命名为2GD5。
对比例2
本对比例中，以季铵盐改性的明胶作为原料与双醛淀粉进行交联制备季铵盐改性明胶海绵，步骤如下：
(1)制备季铵盐改性明胶
将明胶(Gel)溶解于pH＝9的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后按照明胶与季铵盐的质量比为1:1的质量比加入季铵盐，用氢氧化钠溶液调节所得混合液的pH值至9，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝9的磷酸盐缓冲液，于40℃水浴加热条件下搅拌反应10h，将所得反应产物用截留分子量3500Da透析袋透析4天，透析结束后冷冻干燥，得到季铵盐改性明胶(QGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用，将本对比例制备的季铵盐改性明胶记作QGel1。
(2)制备双醛淀粉
按照实施例2步骤(2)的操作制备双醛淀粉。
(3)制备季铵盐改性明胶海绵
将步骤(1)制备的季铵盐改性明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的季铵盐改性明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将季铵盐改性明胶溶液与双醛淀粉溶液混合，控制季铵盐改性明胶与双醛淀粉的质量比为1:1，在40℃的水浴中搅拌反应3h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得季铵盐改性明胶海绵，将本对比例制备的季铵盐改性明胶海绵命名为1Q1D5-3。
对比例3
本对比例中，以京尼平与单宁酸作为交联剂与氨基化明胶反应，制备交联止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
按照实施例1步骤(1)的操作制备氨基化明胶。
(2)制备交联止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将京尼平用无水乙醇溶解形成京尼平溶液，将单宁酸溶解于去离子水中形成单宁酸溶液。将京尼平溶液和单宁酸溶液加入氨基化明胶溶液中，使氨基化明胶、京尼平与单宁酸的质量比为90:1:0.5，在40℃的水浴中搅拌反应5h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得交联止血海绵，将本对比例制备的交联止血海绵命名为M1GT。
京尼平是从栀子果实中提取的栀子苷的水解产物，它能与高分子化合物的氨基相互作用形成类似细胞外基质(ECM)的立体网状的支架结构。作为一种天然物质的水解产物，京尼平的生物相容性较好、具有抗炎抗过敏的功效。明胶与京尼平交联时，第一个反应是伯胺基攻击京尼平的C3碳原子，导致京尼平形成杂环化合物，连接到明胶中的碱性残基，第二个反应是京尼平所含酯基的亲核取代，与明胶形成二级酰胺链。京尼平与明胶中的伯胺在氧气存在下反应形成亮蓝色素，通常被成为栀子蓝，该色素对热、光、pH高度稳定。
单宁酸是一种植物多酚类的天然衍生化合物，具有高浓度的邻苯三酚。单宁酸的水溶性和生物相容性好，能够通过破坏微生物细胞壁、细胞膜影响微生物存活，其本身的邻苯三酚基团能够模拟贻蛋白粘附机制，从而提高交联产物的粘附性。由于它可以与血液中的各种蛋白质结合，因而其止血效率很高。单宁酸不仅可以作用交联剂，而且可以作为在酸性条件下持续释放的抗菌剂。明胶与单宁酸交联时，主要通过氢键作用相互结合。
本对比例制备的交联止血海绵的光学照片和扫描电镜图分别如图9和图10所示。由图9～10可知，该交联止血海绵呈蓝色、内部具有相互贯通的多孔结构。结合图2、6、10可知，本对比例制备的交联止血海绵与实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的内部孔结构有所不同。将本对比例制备的交联止血海绵切开观察内部结构，切开之后的光学照片如图11所示，由图11可知，交联止血海绵各处的颜色存在差异，孔隙率的分布不均匀，这说明交联不均匀。而实施例1～4制备的产品在剪开之后则未发现该情况，实施例1～4制备的产品在剪开之后颜色和孔隙率都非常均匀，例如，图12是实施例1制备的止血海绵在切开之后的截面光学照片。由此可知，虽然京尼平具有抗炎抗过敏功效，单宁酸本身具有止血性能和抗菌性能，这些对于伤口止血和抗菌都是十分有利的，但是，本对比例通过实验发现，以单宁酸和京尼平作为交联剂，存在着交联反应的可控性不强，难以实现均匀交联的问题。
本对比例还通过实验证实，该交联止血海绵在充分吸水后，具有优异的回弹性，吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水；该交联止血海绵在水中不溶解，经较重反复揉搓后不致崩碎。
实施例5
本实施例中，采用茚三酮显色法测定明胶(Gel)及实施例1、实施例2制备的氨基化明胶MGel-1、MGel-2的氨基含量。
称取2.10g柠檬酸、0.80g氢氧化钠和0.08g氯化亚锡，溶解于去离子水中得到100mL茚三酮甲液；称取4.0g茚三酮溶解于乙二醇甲醚中得到100mL茚三酮乙液。配制浓度为0～0.9mg/mL的甘氨酸标准液，配制浓度为20mg/mL的明胶或氨基化明胶溶液作为待测液。
取1.0mL的标准液或待测溶液与1.0mL茚三酮甲液和1.0mL茚三酮乙液混合后定容至10mL。将混合物煮沸20min后使用紫外-可见分光光度计测试其在570nm处的吸光度，根据标准曲线通过待测液的吸光度计算明胶和氨基化明胶的氨基含量。结果显示，Gel、MGel-1、MGel-2氨基含量分别为0.0427、0.1861、0.2446mmol/g，随着氨基供给剂用量的增加，产物氨基含量也随之增加。
实施例6
本实施例中，对明胶(Gel)及实施例1、实施例2制备的氨基化明胶MGel-1、MGel-2进行傅里叶红外变换光谱(FT-IR)测试。
在测试之前，将明胶颗粒溶解、透析后，冷冻干燥，得到用于测试的明胶样品。采用红外衰减全反射(ATR)对明胶及氨基化明胶样品进行表征，测量样品在600～4000cm-1范围内的吸光度，结果如图13所示。由图13可知，3292cm-1处的特征吸收谱带归属于O-H和酰胺A带N-H伸缩振动；2924cm-1处的特征吸收谱带归属于明胶酰胺B带亚甲基C-H反对称伸缩振动；1653cm-1处的特征吸收谱带归属于酰胺Ⅰ带C＝O伸缩振动；1532cm-1处的特征吸收谱带归属于酰胺Ⅱ带N-H面内弯曲振动及C-N伸缩振动的耦合；1455cm-1处的特征吸收谱带归属于亚甲基C-H面内弯曲振动；1230cm-1处的特征吸收谱带归属于酰胺Ⅲ带的N-H弯曲振动和C-N伸缩振动。与明胶相比，氨基化明胶的吸收峰强度有所增加，这可归因于氨基化明胶自由氨基含量的增加。
实施例7
本实施例中，对淀粉(Starch)和实施例3制备的双醛淀粉DS5进行傅里叶红外变换光谱(FT-IR)测试。
将样品(淀粉或DS5)与溴化钾按照1:100的质量比混合研磨均匀，制备得到样品压片。测量样品在400～4000cm-1范围内的吸光度。高碘酸钠是一种高选择性氧化剂，能特异性地氧化切割淀粉中葡萄糖残基的C2-C3连接，形成邻二醛基，且没有其他明显的副反应。对由高碘酸钠氧化淀粉制备的DS5进行FT-IR测试，图14为Starch及DS5的红外图谱。
由图14可知，3475cm-1处的特征吸收谱带归属于O-H伸缩振动；2927cm-1处的特征吸收谱带归属于C-H伸缩振动；1652cm-1处的特征吸收谱带归属于H-O-H伸缩振动。值得注意的是，DS5在1736cm-1处出现了一个新的特征峰，对应于C＝O的生成。Starch的红外谱图在小于800cm-1有较强的特征峰，这是由葡萄糖吡喃糖环的骨架振动产生的复杂振动，而在DS5中在此处的这些特征峰消失或减弱，证明了葡萄糖吡喃糖环的开环。由红外谱图可以判断，成功制备了双醛淀粉。
实施例8
本实施例中，对实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)、对比例1制备的明胶海绵(2GD5)、对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)以及商用明胶海绵(GS)进行吸液能力表征。商用明胶海绵(GS)是明胶经过发泡、交联制备得到的，通常使用的交联剂包括甲醛、戊二醛等。
实验使用的海绵样品的尺寸为Ф10mm×2mm，精密称量海绵样品的初始重量，记作Wdry，将海绵样品置于培养皿中待用。将生理盐水置于37℃水浴中预热，充分预热后取5mL生理盐水加入培养皿中，使海绵样品充分浸没在生理盐水中，静置5min后取出，使用镊子夹住海绵一角30s，随后精密称量吸液后的重量，记作Wwet，多次重复实验后使用以下公式计算吸液倍数A，测试结果如图12所示。
上式中，Wwet表示充分吸液之后的海绵样品重量，Wdry表示干燥状态下的海绵样品的重量。
由图12可知，实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)的吸液倍数分别为39、43倍；对比例1制备的明胶海绵(2GD5)，对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)和商用明胶海绵(GS)的吸液倍数分别为13、20和38倍。
与对比例1中未改性的明胶海绵以及对比例2中季铵盐改性的明胶海绵相比，实施例1和实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶海绵的吸液倍数有明显的提升，同时，实施例1和实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶海绵的吸液倍数较商用明胶海绵也有一定成都的提升。这主要是由于明胶通过本发明的氨基化改性后，使得海绵表面含有丰富氨基，这有利于通过氢键作用快速与水分子结合，从而提高其吸水能力。对于止血材料而言，通常材料的物理吸收能力越强，其止血效果也越好。说明本发明的方法可以提高止血材料的止血性能。
实施例9
本实施例中，对实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)、对比例1制备的明胶海绵(2GD5)、对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)以及商用明胶海绵(GS)的红细胞聚集能力进行测试。
实验使用的海绵样品的尺寸为Ф10mm×2mm，采用枸橼酸钠抗凝兔全血进行实验。将兔全血在3000rpm条件下离心15min，取试管底部聚集红细胞，用生理盐水配制5％的红细胞悬浮液。将海绵样品放入5mL离心管中，加入3mL的红细胞悬浮液。使用试管混匀仪在37℃下孵育10min，取经止血材料浸泡后的红细胞悬浮液稀释10倍后在540nm处测量其吸光度，结果如图13所示。
在本实施例中，吸光度越小，表明溶液中的红细胞越少，即相应的海绵样品聚集的红细胞越多。由图13可知，相比对比例1制备的明胶海绵(2GD5)、对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)和商用明胶海绵(GS)，实施例1、2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5、1M2D5-3)的吸光度值更小。这是由于实施例1、2中的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵由氨基化明胶为基础制备得到，因而止血海绵表面的氨基含量相等更多，止血海绵表面的氨基可通过静电作用与红细胞作用，使红细胞聚集。尽管对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)的吸光度值比2GD5和GS相对更低，但其降低幅度却不如实施例1、2大，说明具体的氨基改性方式也会对红细胞的聚集能力造成影响。在止血过程中，血凝块主要由红细胞组成，所以红细胞的聚集对血凝块的稳定存在有着十分重要的作用。本发明以氨基化改性明胶为基础制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，与红细胞的结合能力更强，说明通过本发明的方式对明胶进行氨基化改性，可有效提高明胶海绵的止血能力。
实施例10
本实施例中，对实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)、对比例2制备的季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)以及商用明胶海绵(GS)进行体外凝血实验测试，表征其快速止血能力。
实验使用的海绵样品的尺寸为Ф10mm×5mm，所采用的血液为枸橼酸钠抗凝的兔全血。将兔全血充分混匀后于37℃水浴中预热，预热结束后取0.2mL兔全血加入0.16mL浓度为0.2mol/L的CaCl2水溶液。混合10s后取160μL加在待测海绵样品上，凝血时长达到20s、40s、60s、80s后加入3mL去离子水终止凝血，在37℃、50rpm的气浴振荡器中摇5min，随后吸取上清液，采用酶标仪测定其在540nm处的吸光度。以不添加海绵样品的情况作为对照组。采用以下公式计算体外凝血指数(BCI)：
上式中，ODs为海绵样品的吸光度值，ODc为对照组的吸光度值。
图17为不同海绵样品在不同凝血时长的动态凝血指数图，BCI的值越小，说明海绵样品的体外凝血性能越好。由图17可知，当凝血时间为20s时，双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)、季铵盐改性明胶海绵(1Q1D5-3)和商用明胶海绵(GS)的BCI值分别为17.8％、11.9％、80.3％、97.4％；当凝血时间为40s时，2M1D3-5、1M2D5-3、1Q1D5-3和GS的BCI值分别为13.8％、12.0％、74.8％、84.0％；当凝血时间为60s时，2M1D3-5、1M2D5-3、1Q1D5-3和GS的BCI值分别为10.5％、9.8％、68.6％、74.5％；当凝血时间为80s时，2M1D3-5、1M2D5-3、1Q1D5-3和GS的BCI值分别为6.6％、7.7％、51.8％、64.1％。
在本实施例的测试条件下，双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵2M1D3-5、1M2D5-3在凝血时间20s时的BCI值能达到10％～20％左右，表明本发明制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵具有良好的快速凝血能力；季铵盐明胶海绵的BCI值在80％左右，具有一定的止血能力，而商用明胶海绵GS的BCI值接近100％，可近乎看作没有止血能力。随着凝血时长的增加，双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵、季铵盐改性明胶海绵和商用明胶海绵的BCI值均进一步下降，在凝血时间为60s之后，双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的BCI值下降至10％，说明本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵具有良好的凝血能力。尽管随着凝血时间的增加，季铵盐改性明胶海绵和商用明胶海绵的BCI值液有所下降，但二者的BCI值始终保持在50％以上，表明二者的止血能力有限。由本实施例可知，本发明提供的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵有着有优异的快速凝血能力。
实施例11
本实施例中，对实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)、实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)、对比例1制备的明胶海绵(2GD5)以及商用明胶海绵(GS)的血液相容性进行表征。
通过测定海绵样品的溶血率对其血液相容性进行评估，实验使用的海绵样品的尺寸为Ф10mm×2mm，使用紫外线对海绵样品进行杀菌，随后将海绵样品装入试管，浸没于5mL生理盐水中，在37℃水浴中预热，向试管中加入200μL抗凝血，将试管放置于37℃的空气摇床中孵育60min。孵育结束后在2000rpm条件下离心5min。取上清液100μL置于96孔板中，用酶标仪测定其在540nm处的吸光度，每组样品重复5次，结果取平均值。用去离子水和生理盐水处理的血液分别作为阳性对照和阴性对照，样品溶血率(HR)采用以下公式进行计算：
上式中，As表示样品组的吸光度值，Ap表示阳性组的吸光度值，An表示阴性组的吸光度值。
结果表明，商用明胶海绵(GS)、对比例1制备的明胶海绵(2GD5)、实施例1制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(2M1D3-5)和实施例2制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(1M2D5-3)的溶血率分别为0.78％、0.53％、0.45％、1.48％，各海绵样品的溶血率均小于5％，说明它们都具有良好的血液相容性。
实施例12
本实施例中，制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，步骤如下：
(1)制备氨基化明胶
将明胶(Gel)溶解于pH＝5的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5wt％的明胶溶液，然后加入二乙烯三胺，用浓度为5mol/L的盐酸调节所得混合液的pH值至5，然后加入体积与明胶溶液相等的pH＝5的磷酸盐缓冲液，再加入羧基活化剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)，于40℃的水浴中搅拌反应6h，将所得反应产物用截留分子量8000～12000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到氨基化明胶(MGel)，抽真空后置于-20℃冰箱中保存备用。
该步骤在制备氨基化明胶时，控制明胶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐与二乙烯三胺的质量比为1:1:3。
(2)制备双醛淀粉
将淀粉(Starch)加入去离子水中，淀粉与去离子水的质量比为5:100，于60℃水浴加热条件下，搅拌糊化30min，然后按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:0.5的比例加入高碘酸钠，于避光环境在45℃的水浴中搅拌反应6h，然后加入反应液3倍体积的无水乙醇进行沉淀，将所得沉淀物用截留分子量3000Da透析袋在去离子水中透析5天，透析结束后冷冻干燥，得到双醛淀粉(DS)。
(3)制备双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵
将步骤(1)制备的氨基化明胶溶解于去离子水中，得到浓度为3wt％的氨基化明胶溶液；将步骤(2)制备的双醛淀粉溶解于去离子水中，得到浓度为5wt％的双醛淀粉溶液。将氨基化明胶溶液于双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:1.5，在40℃的水浴中搅拌反应5h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵(MS)。
本实施例制备的双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵呈微黄色、止血海绵内部具有相互贯通的多孔结构，多孔结构的尺寸在100～300μm。本实施例通过实验证实，该止血海绵在水中不溶解，在吸水后具有优异的快速回弹性，吸水后将水挤出，再置于水中，能重复大量吸水。将该止血海绵浸泡于水中，用镊子尾部反复按压，该止血海绵未发生破碎。同时，该止血海绵经较重反复揉搓后不致崩碎，符合药典对于吸收性明胶海绵的要求。

Claims (10)

1.一种双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，该止血海绵具有相互贯通的孔隙结构，该止血海绵由氨基化明胶与双醛淀粉经过交联反应和冷冻干燥制备得到，交联反应过程中，氨基化明胶的游离氨基与双醛淀粉的醛基发生希夫碱反应；氨基化明胶中的氨基含量为0.18～0.25mmol/g，氨基化明胶的结构式(Ⅰ)所示，
式(Ⅰ)中，R1为
2.根据权利要求1所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，该止血海绵由氨基化明胶与双醛淀粉按照1:(0.5～1.5)的质量比经过交联反应和冷冻干燥制备得到。
3.根据权利要求1所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，所述氨基化明胶的制备方法为：将明胶溶解于pH＝3～6的磷酸盐缓冲液中，加入羧基活化剂和氨基供给剂，利用氨基供给剂与明胶的羧基发生酰胺化反应将明胶中的部分羧基转化为酰胺基，冷冻干燥，即得；所述氨基供给剂为乙二胺或二乙烯三胺。
4.根据权利要求4所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，在制备氨基化明胶时，控制明胶、羧基活化剂与氨基供给剂的质量比为1:(0.5～1):(0.5～3)。
5.根据权利要求4所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，在制备氨基化明胶时，将明胶溶解于pH＝3～6的磷酸盐缓冲液中之后，明胶在磷酸盐缓冲液中的浓度为1wt％～20wt％。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，所述双醛淀粉的醛基化程度为60％～98％。
7.根据权利要求6所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，所述双醛淀粉是将淀粉糊化，按照淀粉与高碘酸钠质量比为1:(0.5～1)的比例加入高碘酸钠，于避光环境在35～45℃反应4～6h，再经过纯化得到的。
8.根据权利要求1至5中任一权利要求所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵，其特征在于，该止血海绵具有相互贯通的孔隙结构的孔径为100～300μm。
9.权利要求1至8中任一权利要求所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨基化明胶溶解于水中，得到氨基化明胶溶液；将双醛淀粉溶解于水中，得到双醛淀粉溶液；
(2)将氨基化明胶溶液于双醛淀粉溶液混合，控制氨基化明胶与双醛淀粉的质量比为1:(0.5～1.5)，在搅拌条件下于35～45℃反应3～8h，将所得反应液加入模具中，冷冻干燥，即得双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵。
10.根据权利要求9所述双醛淀粉交联的氨基化明胶止血海绵的制备方法，其特征在于，氨基化明胶溶液中氨基化明胶的浓度为1wt％～10wt％，双醛淀粉溶液中双醛淀粉的浓度为1wt％～10wt％。
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