CN109912791A - 一种羧基化peg衍生物、基于该peg衍生物的水凝胶、及它们的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种羧基化PEG衍生物，它是由线性或支化聚乙二醇衍生物的端羟基与聚羧酸类聚合物的羧基缩合得到的酯，其结构如式(I)所示：其中，X为带侧羧基的聚羧酸类聚合物结构，R为所述线性或支化聚乙二醇衍生物的核结构；n取1‑750；m取值与所述R的支化臂数对应，为1‑20的整数。本发明还提供一种PEG衍生物活性酯，它是所述羧基化PEG衍生物经N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基后得到的酯，其结构如下式(II)所示；Y‑COOSu为羧基被NHS活化后的聚羧酸类聚合物结构。本发明还提供基于所述PEG衍生物活性酯制备的含金属元素的水凝胶组合物、及其制备方法和在骨修复中的应用。本发明的水凝胶组合物能够灵活加载或引入钙、镁、或铁等多种金属元素和无机盐，突破了水凝胶软体材料在骨修复领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种羧基化PEG衍生物、基于该PEG衍生物的水凝胶、及它们的制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是以水为分散介质，具有空间网络结构的天然或合成聚合物材料。近年来，水凝胶在生物医用领域有广泛的应用，如止血剂、粘接剂、组织工程支架、药物释载体、敷料等。
PEG是一类生物相容性优异的亲水性高分子，具有非免疫原性并且防止蛋白吸附。结构上可以是线性的，也可以是支化的，而且端羟基可以被方便地修饰成为醛基、巯基、羧基、氨基等，在水凝胶构筑方面展现出了高度灵活性。现有常规的羧基化PEG衍生物经N-羟基琥珀酰亚胺活化后形成活化酯，例如多臂的聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯、多臂的聚乙二醇琥珀酰亚胺丁二酸酯和多臂的聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯等，通常用于修饰大分子药物，以增强其稳定性和药物动力学性质，并降低其免疫原性和毒性。
此外，专利文献CN105963792A、CN108525016A、CN101524560A等还公开了利用上述活化酯制备可降解的医用水凝胶，以解决水凝胶在生物相容性、机械性能、降解性能、粘附性能或溶胀度等方面的问题。但是这些水凝胶只能用作组织粘合剂、封闭剂、释药载体、创伤覆盖物、止血涂层、防组织黏连剂等，无法用于损伤后的骨修复。
在修复牙齿缺损、骨肿瘤切除后修补、股骨头坏死后的再造等临床修复治疗中都需要能够快速填补异型缺损、具有优良骨再生性能的软体材料。钙元素是骨组织所必须的，其中羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(TCP)、磷酸氢钙、磷酸氢二钙等是常用的活性材料。镁也是人体所必须的基本元素，几乎参与了人体所有的新陈代谢过程，具有成骨和成血管活性。血管长入有助于骨组织发育，而铁元素同样具有助于成血管活性。如何在医用的水凝胶类软体材料中引入或加载这些必要的金属元素，使水凝胶在修复位置能够发挥骨组织再生的作用，成为了目前研究的重点。
发明内容
鉴于上述技术背景，本发明的最重要的目的在于：提供一种能够灵活加载或引入钙、镁、或铁等多种金属元素和无机盐的水凝胶，以突破水凝胶软体材料在骨修复领域的应用。
本发明的另一个目的在于：提供制备所述水凝胶的方法。
本发明的再一个目的在于：提供适合临床应用的制备所述水凝胶的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
首先，提供一种羧基化PEG衍生物，它是由线性或支化聚乙二醇衍生物的端羟基与聚羧酸类聚合物的羧基缩合得到的酯，其结构如下式(I)所示：
其中，X为带侧羧基的聚羧酸类聚合物结构，R为所述线性或支化聚乙二醇衍生物的核结构；m取值与所述R的支化臂数对应，为1-20的整数；n取1-750。
本发明所述的羧基化PEG衍生物中，式(I)的R优选自以下任意一种结构：
CH3(CH2)14CH2-、CH3CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3O(CH3)3-、
或者(z＝6、7或8)。
本发明优选的羧基化PEG衍生物中，所述式(I)中的X的羧基数量至少为2个；更优选羧基数量为10-20个。
本发明进一步优选的羧基化PEG衍生物中，所述带侧羧基的聚羧酸类聚合物结构选自：聚苹果酸类聚合物结构、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种或它们的共聚物。
本发明最优选的羧基化PEG衍生物中，所述式(I)中的X为聚苹果酸类聚合物结构、聚柠檬酸类聚合物结构中的任意一种。
本发明优选的羧基化PEG衍生物中，所述式(I)中的m为1-12的整数；更优选2、4、6或8；最优选4。
本发明优选的羧基化PEG衍生物中，所述式(I)中的n≤500，更优选n≤230。
本发明所述的羧基化PEG衍生物结构中具有多个羧基，这些羧基都可以用于与金属化合物反应。
在此基础上，本发明进一步提供一种PEG衍生物活性酯，它是本发明所述的羧基化PEG 衍生物经N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基后得到的酯，其结构如下式(II)所示：
其中，所述的Y-COOSu为羧基被NHS活化后的聚羧酸类聚合物结构；R为线性或支化聚乙二醇或其衍生物的核结构；m取值与所述R的支化臂数对应，为1-20的整数；n取1-750。
本发明优选的PEG衍生物活性酯中，式(II)的R优选自以下任意一种结构：
CH3(CH2)14CH2-、CH3CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3O(CH3)3-、
或者(z＝6、7或8)。
本发明优选的PEG衍生物活性酯中，所述的Y-COOSu为羧基被NHS活化后的聚苹果酸类聚合物、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种结构；最优选为羧基被NHS活化后的聚苹果酸类聚合物或聚柠檬酸类聚合物中的任意一种。
本发明进一步优选的羧基化PEG衍生物中，所述的Y-COOSu结构中被活化的羧基比例大约在0.1％～90％。
本发明所述的羧基化PEG衍生物本身具有多臂的超支化结构，经NHS活化后得到的活性酯，其结构中分布在聚羧酸类结构的主链或侧链上不同位置的活性位点都易与氨基反应，能够更好地用于修饰药物大分子等含氨基活性物质。
第二个方面，本发明还进一步提供基于本发明所述的PEG衍生物活化酯的医用水凝胶。
本发明的一种优选方案中，提供一种医用水凝胶，它是由本发明所述的PEG衍生物活性酯与多氨基聚合物交联得到的可生物降解水凝胶。该类水凝胶具有良好的可生物降解性，和载药灵活性，可以用作组织粘合剂、封闭剂、释药载体、创伤覆盖物、止血涂层、防组织黏连剂等。
本发明的另一种优选方案中，提供一种加载金属元素的医用水凝胶，它是由所述的PEG 衍生物活性酯、无机金属化合物和多氨基聚合物混合反应得到的含金属元素的水凝胶组合物。该类水凝胶不仅具有良好的可生物降解性，而且可灵活加载或引入多种金属元素或无机盐，可以用于牙齿缺损、骨肿瘤切除后及股骨头坏死后的再造等临床修复治疗。
本发明优选的所述加载金属元素的医用水凝胶中，所述的无机金属化合物选自钙、镁或铁的化合物中的任意一种或多种；进一步优选钙、镁或铁的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或多种。
本发明的方案中，所述的多氨基聚合物可以是现有的可用于医用水凝胶的各种含氨基聚合物，优选的多氨基聚合物包括：聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
第三个方面，本发明还提供制备所述的加载金属元素的医用水凝胶的方法，包括：
1)将线性或多臂PEG衍生物的端羟基和带侧羧基的聚羧酸类聚合物发生酯化反应，得到末端被羧基化修饰的PEG衍生物；
2)用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化1)所得末端被羧基化修饰的PEG衍生物的一部分羧基，得到PEG衍生物活性酯；
3)将2)所得PEG衍生物活性酯、无机金属化合物和多氨基聚合物在水溶液中反应，得到无机盐分散均匀的水凝胶组合物。
本发明所述的制备方法中，1)所述的线性或多臂PEG衍生物分子量Mn≤30000，优选 5000-7500。
本发明所述的制备方法中，1)所述的线性或多臂PEG衍生物的臂数可以是1-20；例如可以是下面任意一种结构作为核的线性或多臂PEG衍生物：
CH3(CH2)14CH2-、CH3CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3O(CH3)3-、
或者(z＝6、7或8)；
优选的线性或多臂PEG衍生物的臂数是2-12；更优选2、4、6或8；最优选4。
本发明所述的制备方法中，1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物羧基数量至少为2个；优选羧基数量为10-20个；所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物可以是树型、梳型或星型；优选的带侧羧基的聚羧酸类聚合物包括：聚苹果酸类聚合物、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种或其共聚物，且分子量在200-1000,000。
本发明所述的制备方法中，1)所述的聚羧酸类聚合物与线性或多臂PEG衍生物的摩尔比优选为2-20；更优选为4。
本发明所述的制备方法中，1)所述的酯化反应可以是所述的线性或多臂PEG衍生物与所述的聚羧酸类聚合物在溶液中缩合成酯，也可以是所述的线性或多臂PEG衍生物与所述的聚羧酸类聚合物以固态直接熔融缩聚成酯。
本发明所述的制备方法中，2)所述的NHS与1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比优选为0.01-100；更优选0.01-20；以此调控聚羧酸类聚合物中被活化的羧基比例。
本发明所述的制备方法中，3)所述的无机金属化合物选自含金属元素的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或两种以上的组合物；所述的金属元素进一步优选钙、镁或铁中的任意一种或多种；所述的无机金属化合物更优选无机钙盐、无机铁盐、无机镁盐、氢氧化钙、氧化钙、氢氧化亚铁、三氧化二铁、氢氧化镁、氧化镁中的任意一种或两种以上的组合物；所述的无机钙盐进一步优选羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、苹果酸钙、聚苹果酸钙、丁二酸钙、富马酸钙或磷酸三钙中的任意一种或多种的组合物，最优选纳米级羟基磷灰石；所述的无机铁盐优选氯化铁、富马酸亚铁或丁二酸亚铁；所述的无机镁盐优选氯化镁、硫酸镁、苹果酸镁、柠檬酸镁或聚苹果酸镁。
本发明所述的制备方法中，3)所述的多氨基的聚合物可以是现有的可用于医用水凝胶的各种含氨基聚合物，优选的多氨基聚合物包括：聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
本发明的一种优选的实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：
①将带侧羧基的聚羧酸类聚合物与2-8臂的PEG衍生物以2-20的摩尔比在室温下溶解在 DMF中，加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP) 进行缩合反应，反应6-24小时，得到末端羧基化的PEG衍生物溶液；
②在①所得溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和EDC，控制NHS的加入量，使其和①所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比为0.01-100，继续反应6-20小时，而后反应液在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥得到末端被羧基化并具有琥珀酰亚胺活化酯的PEG衍生物(命名为PEG-1)；
③取多氨基聚合物，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，浓度1％-30％(W/V)；
④取②得到的PEG-1，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，加入一定量的无机金属化合物，调节PH值到5-9，而后和③配制的水溶液进行混合，得到水凝胶组合物；所述的无机金属化合物为金属无机盐和金属氧化物的混合物，或金属无机盐和氢氧化物的混合物。
本发明的另一种优选的实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将带侧羧基的聚羧酸类聚合物与2-8臂的PEG衍生物以2-20的摩尔比在室温下溶解在 DMF中，加入EDC和DMAP进行缩合反应，反应6-24小时，得到末端羧基化的PEG衍生物溶液；
(2)在(1)所得溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和EDC，控制NHS和EDC的加入量，使其和(1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比为0.01-100，继续反应6-20小时，而后反应液在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥得到末端被羧基化并具有琥珀酰亚胺活化酯的PEG衍生物(命名为PEG-1)；
(3)取多氨基聚合物，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，浓度1％-30％(W/V)；
(4)将(2)所得PEG-1、无机金属化合物一起加入到(3)制备的水溶液中，搅拌混合得到水凝胶组合物；所述的无机金属化合物为金属无机盐和金属氧化物的混合物，或金属无机盐和氢氧化物的混合物。
本发明的再一种优选的实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：
(I)将带侧羧基的聚羧酸类聚合物与2-8臂的PEG衍生物以2-20的摩尔比在减压和氮气保护条件下经熔融缩聚成酯，得到末端羧基化的PEG衍生物；
(II)将(I)所得PEG衍生物制备成DMF溶液，并在所述溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)和EDC，控制NHS的加入量，使其和(I)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比为0.01-100，继续反应6-20小时，而后反应液在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥得到末端被羧基化并具有琥珀酰亚胺活化酯的PEG衍生物(命名为PEG-1)；
(III)取多氨基聚合物，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，浓度1％-30％(W/V)；
(IV)将(II)所得PEG-1、无机金属化合物一起加入到(III)制备的水溶液中，搅拌混合得到水凝胶组合物；所述的无机金属化合物为金属无机盐和金属氧化物的混合物，或金属无机盐和氢氧化物的混合物。
第四个方面，本发明还提供一种用于制备所述医用水凝胶的试剂盒，它分隔装载有成胶组分一和成胶组分二；所述的成胶组分一为多氨基聚合物水溶液；所述的成胶组分二是本发明所述的PEG衍生物活性酯固体。
本发明还提供一种用于制备骨修复水凝胶的试剂盒，它分隔装载有成胶组分一、成胶组分二和组分三；所述的成胶组分一为多氨基聚合物水溶液；所述的成胶组分二是本发明所述的PEG衍生物活性酯固体；所述的组分三为固态的无机金属化合物。
本发明优选的方案中，作为所述成胶组分一的多氨基聚合物水溶液浓度为1％-30％ (W/V)。所述的多氨基聚合物选自：聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
本发明优选的方案中，作为所述成胶组分二的PEG衍生物活性酯固体为PEG衍生物活性酯干粉。
本发明优选的方案中，作为所述组分三的固态的无机金属化合物为无机金属化合物粉末。
本发明优选的所述试剂盒中，所述的组分三无机金属化合物选自含金属元素的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或两种以上的组合物；所述的金属元素进一步优选钙、镁或铁中的任意一种或多种；所述的无机金属化合物更优选无机钙盐、无机铁盐、无机镁盐、氢氧化钙、氧化钙、氢氧化亚铁、三氧化二铁、氢氧化镁、氧化镁中的任意一种或两种以上的组合物；所述的无机钙盐进一步优选羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、苹果酸钙、聚苹果酸钙、丁二酸钙、富马酸钙或磷酸三钙中的任意一种或多种的组合物，最优选纳米级羟基磷灰石；所述的无机铁盐优选氯化铁、富马酸亚铁或丁二酸亚铁；所述的无机镁盐优选氯化镁、硫酸镁、苹果酸镁、柠檬酸镁或聚苹果酸镁。
第五方面，本发明还提供所述的加载金属元素的医用水凝胶在制备牙齿缺损、骨肿瘤切除后或股骨头坏死后以及其他骨缺损的临床修复治疗用品中的应用。
与现有技术相比，本发明的方法具有以下几方面有益效果：
1.引入聚乙二醇可以调整单位体积内交联点密度，有研究表明，交联密度过高或者过低都会导致凝胶强度下降。而且聚乙二醇的高亲水特性也有利于调节水凝胶体系的吸水溶胀度。
2.苹果酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸是人体三羧酸代谢中间体，本发明以活性成分将其引入水凝胶体系有助于促进骨修复过程。
3.本发明的方法中，金属氧化物或氢氧化物和聚羧酸反应后以离子键和聚羧酸高分子链结合，能伴随高分子降解过程有更合适的释放行为，和骨修复过程进程相匹配。
4.本发明的羧基化PEG衍生物或其活性酯中，聚羧酸提供的大量羧基可以偶联负载药物或活性生长因子，药物可以是抗菌剂、抗癌药物，用于防止或降低术后感染风险或者一直肿瘤生长。活性生长因子可以是骨形态发生蛋白(BMP)，如rBMP-2、rBMP-4、rBMP-5、rGDF-1、 rGDF-3、rGDF-12等。
5.本发明的制备方法选择聚羧酸类聚合物与PEG衍生物缩合，聚羧酸的羧基数量与其聚合度相关，通过选择不同聚合度的聚羧酸与PEG衍生物缩合，能实现PEG端羧基数量的多寡控制，以获得满足不同应用需求的水凝胶。例如，选择高聚合度的聚羧酸制备加载金属元素的水凝胶，用于骨修复等临床治疗领域；而选择聚合度相对较低的聚羧酸类聚合物则用于制备无需复合无机盐或金属化合物的水凝胶体系，可用于其他生物医疗用途，比如防粘连、止血、伤口粘合等。
附图说明
图1是本发明实施例1中的带有羧基或琥珀酰亚胺活性酯的聚乙二醇结构示意图。
图2是本发明实施例2中的骨修复水凝胶网络结构示意图。
图3是本发明实施例2方法制备的包含和不含金属离子的水凝胶。
图4是本发明实施例2方法制备的干燥水凝胶的低倍放大电镜照片。
图5是本发明实施例2方法制备的干燥水凝胶的高倍放大的电镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但不应该将此理解为本发明所涉及的主题仅限于下述实施例。
以下实施例中所使用的所有化合物及试剂均为现有产品，或可由现有方法制备的产品。
实施例1：四臂聚乙二醇/聚赖氨酸水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将23.8gα,β-聚苹果酸(Mn＝1050)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4gEDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。其结构示意见附图1。
(2)四臂聚乙二醇/聚赖氨酸水凝胶的制备
将聚赖氨酸(分子量约4400)用去离子水配成5w/v％浓度，取2ml，0.2g的PEG-1用2ml 去离子水溶解，两者混合搅拌均匀，约2分钟后固化成凝胶，见附图3右。
(3)水凝胶压缩强度测量
经力学性能检测得到，本实施例制备的水凝胶压缩强度在2.8KPa。
(4)水凝胶吸水膨胀率测定
本实施例制备的水凝胶用去离子水浸泡过夜，充分吸水后除掉多余的水，测定吸水膨胀率128％。
实施例2：四臂聚乙二醇/聚赖氨酸/羟基磷灰石水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将23.8gα,β-聚苹果酸(Mn＝1050)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4gEDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/聚赖氨酸/羟基磷灰石水凝胶的制备
将聚赖氨酸(分子量约4400)用去离子水配成5w/v％浓度，取2ml，取0.2g的PEG-1用2ml 去离子水溶解和0.05g羟基磷灰石，将以上物质搅拌均匀，约1分钟20秒后固化成凝胶，其化学结构示意参考附图2，其外观见附图3左。
冷冻干燥后，凝胶电镜照片可以看到均匀分布的羟基磷灰石，尺寸在nm级，见附图4、5。
(3)水凝胶压缩强度测量
经力学性能检测得到，本实施例制备的水凝胶与实施例1中水凝胶相比，加入PEG-1重量 25％的羟基磷灰石后压缩强度在同样形变位移下提高到6.63KPa。其余条件不变，加入PEG-1 重量50％的羟基磷灰石后，压缩强度提高到8.51KPa。
(4)水凝胶吸水膨胀率测定
本实施例制备的水凝胶用去离子水浸泡过夜，充分吸水后除掉多余的水，测定吸水膨胀率99.25％。
实施例3：四臂聚乙二醇/聚赖氨酸/Ca2+/Fe2+/Mg2+水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将28.8gα,β-聚苹果酸(Mn＝1600)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/聚赖氨酸/羟基磷灰石水凝胶的制备
将聚赖氨酸(分子量约4400)用去离子水配成2.5w/v％浓度，取2ml，加入0.2g的PEG-1、 0.011g氢氧化钙、0.016g羟基磷灰石，搅拌均匀，约1分钟30秒后固化成凝胶。
或者，在所述聚赖氨酸溶液中加入0.2g的PEG-1、0.006g氢氧化钙、0.016g羟基磷灰石的同时，进一步加入0.003g的氢氧化镁和/或0.003g的氢氧化铁，搅拌均匀，约50秒后固化成凝胶。
本实施例方法获得的水凝胶结构参考附图2。
实施例4：四臂聚乙二醇/壳聚糖水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将23.8gα,β-聚苹果酸(Mn＝1050)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/壳聚糖凝胶的制备
将水溶性壳聚糖用去离子水配成5w/v％浓度，取1ml，加入0.1g的PEG-1，搅拌均匀，约 2.5分钟后固化成凝胶。
实施例5：四臂聚乙二醇/壳聚糖/羟基磷灰石水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将9.6gα,β-聚苹果酸(Mn＝550)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4- 二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr，而后减压蒸馏掉DMF，加入二氯甲烷溶解反应体系，酸洗、水洗，将有机相溶剂干燥后在乙醚中沉淀，真空干燥得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/壳聚糖/羟基磷灰石水凝胶的制备
将水溶性壳聚糖用去离子水配成2.5w/v％浓度，取2ml，加入0.2g的PEG-1和0.1g羟基磷灰石，搅拌均匀，约11分钟后固化成凝胶。
实施例6：四臂聚乙二醇/壳聚糖/羟基磷灰石水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚苹果酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将9.6gα,β-聚苹果酸(Mn＝550)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr。而后减压蒸馏掉DMF，加入二氯甲烷溶解反应体系，酸洗、水洗，将有机相溶剂干燥后在乙醚中沉淀，真空干燥得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/壳聚糖/羟基磷灰石水凝胶的制备
将水溶性壳聚糖用去离子水配成2.5w/v％浓度，取2ml，加入0.2g的PEG-1和0.2g羟基磷灰石，搅拌均匀，约8分钟后固化成凝胶。
实施例7：四臂聚乙二醇/壳聚糖水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚柠檬酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将28.8gα,β-聚柠檬酸(Mn＝1200)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/壳聚糖凝胶的制备
将水溶性壳聚糖用去离子水配成5w/v％浓度，取1ml，加入0.1g的PEG-1，搅拌均匀，约5 分钟后固化成凝胶。
实施例8：四臂聚乙二醇/壳聚糖/水凝胶的制备
(1)聚乙二醇-聚柠檬酸琥珀酰亚胺酯(PEG-1)的制备
将28.8gα,β-聚柠檬酸酸(Mn＝1200)，19.35g四臂聚乙二醇(Mn＝7450)，5.0gEDC和2.85g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到无水DMF中，而后在室温下反应24hr。而后加入2.6gN-羟基琥珀酰亚胺和4.4g EDC继续反应20hr。而后在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥后得到PEG-1。
(2)四臂聚乙二醇/壳聚糖凝胶/Ca2+水凝胶的制备
将水溶性壳聚糖用去离子水配成2.5w/v％浓度，取2ml，加入0.2g的PEG-1和0.01g氢氧化钙，搅拌均匀，约2分钟后固化成凝胶。
实验例：
在CD1小鼠的头盖骨上取下左、右各一片圆形的直径为3.5毫米的头盖骨，将实施例2制备的无菌的四臂聚乙二醇/聚赖氨酸/羟基磷灰石水凝胶材料用小鼠的新鲜骨髓浸润，并植入头盖骨缺损中。6周后，牺牲小鼠，将小鼠头盖骨剥离并在70％的乙醇溶液中固定。采用X光检测，发现小鼠头盖骨左、右两处圆形缺损处已有明显的新骨形成，且填满缺损空间。证明本发明的加载金属元素的医用水凝胶具有良好的骨修复应用前景。
Claims (25)
1.一种羧基化PEG衍生物，它是由线性或支化聚乙二醇衍生物的端羟基与聚羧酸类聚合物的羧基缩合得到的酯，其结构如下式(I)所示：
其中，X为带侧羧基的聚羧酸类聚合物结构，R为所述线性或支化聚乙二醇衍生物的核结构；n取1-750；m取值与所述R的支化臂数对应，为1-20的整数，优选为2-12的整数，更优选2、4、6或8，最优选4。
2.权利要求1所述的羧基化PEG衍生物，其特征在于：所述式(I)中的X的羧基数量至少为2个；更优选羧基数量为10-20个。
3.权利要求1所述的羧基化PEG衍生物，其特征在于，所述式(I)中的R选自以下任意一种结构：
CH3(CH2)14CH2-、CH3CH2-、-CH2CH2-、(CH2)3O(CH3)3、
4.权利要求1所述的羧基化PEG衍生物，其特征在于：所述带侧羧基的聚羧酸类聚合物结构选自：聚苹果酸类聚合物结构、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种或它们的共聚物；优选聚苹果酸类聚合物结构、聚柠檬酸类聚合物中的任意一种或它们的共聚物。
5.一种PEG衍生物活性酯，它是权利要求1所述的羧基化PEG衍生物经N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基后得到的酯，其结构如下式(II)所示：
其中，所述的Y-COOSu为羧基被NHS活化后的聚羧酸类聚合物结构；R为线性或支化聚乙二醇或其衍生物的核结构；n取1-750；m取值与所述R的支化臂数对应，为1-20的整数，优选为2-12的整数，更优选2、4、6或8，最优选4。
6.权利要求5所述的PEG衍生物活性酯，其特征在于：所述的Y-COOSu为羧基被NHS活化后的聚苹果酸类聚合物、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种结构；最优选为羧基被NHS活化后的的聚苹果酸类聚合物或聚柠檬酸类聚合物。
7.权利要求5所述的PEG衍生物活性酯，其特征在于：所述的Y-COOSu结构中被活化的羧基比例在0.1％～90％。
8.一种医用水凝胶组合物，它是由权利要求5所述的PEG衍生物活性酯与多氨基聚合物交联得到的可生物降解水凝胶组合物。
9.一种加载金属元素的医用水凝胶组合物，它是由权利要求5所述的PEG衍生物活性酯、无机金属化合物和多氨基聚合物混合反应得到的含金属元素的水凝胶组合物。
10.权利要求9所述的加载金属元素的医用水凝胶组合物，其特征在于：所述的金属化合物选自钙、镁或铁的化合物中的任意一种或多种；进一步优选钙、镁或铁的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或多种。
11.权利要求8或9任意一项所述的医用水凝胶组合物，其特征在于，多氨基聚合物包括：聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
12.制备权利要求9所述的加载金属元素的医用水凝胶组合物的方法，包括：
1)将线性或多臂PEG衍生物的端羟基和带侧羧基的聚羧酸类聚合物发生酯化反应，得到末端被羧基化修饰的PEG衍生物；
2)用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化1)所得末端被羧基化修饰的PEG衍生物的一部分羧基，得到PEG衍生物活性酯；
3)将2)所得PEG衍生物活性酯、无机金属化合物和多氨基聚合物在水溶液中反应，得到无机盐分散均匀的水凝胶组合物。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于：1)所述的线性或多臂PEG，分子量为5000-7500、臂数是1-20；优选的臂数为2-12，更优选2、4、6或8，最优选4。
14.权利要求12所述的方法，其特征在于：1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物羧基数量至少为2个；优选羧基数量为10-20个；优选的带侧羧基的聚羧酸类聚合物包括：聚苹果酸类聚合物、聚柠檬酸类聚合物、聚天冬氨酸类聚合物或聚谷氨酸类聚合物中的任意一种、两种以上的组合物或其共聚物，且分子量在200-1000,000。
15.权利要求12所述的方法，其特征在于：1)所述的聚羧酸类聚合物与线性或多臂PEG衍生物的摩尔比优选为2-20；更优选为4。
16.权利要求12所述的方法，其特征在于：2)所述的NHS与1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比优选为0.01-100；更优选0.01-20。
17.权利要求12所述的方法，其特征在于：3)所述的无机金属化合物选自含金属元素的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或两种以上的组合物；所述的金属元素进一步优选钙、镁或铁中的任意一种或多种；所述的无机金属化合物更优选无机钙盐、无机铁盐、无机镁盐、氢氧化钙、氧化钙、氢氧化亚铁、三氧化二铁、氢氧化镁、氧化镁中的任意一种或两种以上的组合物；所述的无机钙盐进一步优选羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、苹果酸钙、聚苹果酸钙、丁二酸钙、富马酸钙或磷酸三钙中的任意一种或多种的组合物，最优选纳米级羟基磷灰石；所述的无机铁盐优选氯化铁、富马酸亚铁或丁二酸亚铁；所述的无机镁盐优选氯化镁、硫酸镁、苹果酸镁、柠檬酸镁或聚苹果酸镁。
18.权利要求12所述的方法，其特征在于：3)所述的多氨基的聚合物选自：聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
19.权利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①将带侧羧基的聚羧酸类聚合物与2-8臂的PEG衍生物以2-20的摩尔比在室温下溶解在DMF中，加入(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)进行缩合反应，反应6-24小时，得到末端羧基化的PEG衍生物溶液；
②在①所得溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和EDC，控制NHS的加入量，使其和①所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比为0.01-100，继续反应6-20小时，而后反应液在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥得到末端被羧基化并具有琥珀酰亚胺活化酯的PEG衍生物(命名为PEG-1)；
③取多氨基聚合物，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，浓度1％-30％(W/V)；
④取②得到的PEG-1，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，加入一定量的无机金属化合物，调节PH值到5-9，而后和③配制的水溶液进行混合，得到水凝胶组合物；所述的无机金属化合物为金属无机盐和金属氧化物的混合物，或金属无机盐和氢氧化物的混合物。
20.权利要求11所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将带侧羧基的聚羧酸类聚合物与2-8臂的PEG衍生物以2-20的摩尔比在室温下溶解在DMF中，加入EDC和DMAP进行缩合反应，反应6-24小时，得到末端羧基化的PEG衍生物溶液；
(2)在(1)所得溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和EDC，控制NHS和EDC的加入量，使其和(1)所述的带侧羧基的聚羧酸类聚合物的摩尔比为0.01-100，继续反应6-20小时，而后反应液在过量的乙酸乙酯、丙酮和正己烷混合溶剂中沉淀，干燥得到末端被羧基化并具有琥珀酰亚胺活化酯的PEG衍生物(命名为PEG-1)；
(3)取多氨基聚合物，利用去离子水或PBS缓冲液配成水溶液，浓度1％-30％(W/V)；
(4)将(2)所得PEG-1、无机金属化合物一起加入到(3)制备的水溶液中，搅拌混合得到水凝胶组合物；所述的无机金属化合物为金属无机盐和金属氧化物的混合物，或金属无机盐和氢氧化物的混合物。
21.一种用于制备医用水凝胶试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内分隔装载有成胶组分一和成胶组分二；所述的成胶组分一为多氨基聚合物水溶液；所述的成胶组分二是权利要求5所述的PEG衍生物活性酯固体。
22.一种用于制备骨修复水凝胶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内分隔装载有成胶组分一、成胶组分二和组分三；所述的成胶组分一为多氨基聚合物水溶液；所述的成胶组分二是权利要求5所述的PEG衍生物活性酯固体；所述的组分三为固态的无机金属化合物。
23.权利要求21或22任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的多氨基聚合物水溶液浓度为1％-30％(W/V)；所述的多氨基聚合物选自聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖或带侧氨基的聚天冬氨酸中的任意一种。
24.权利要求22所述的试剂盒，其特征在于：所述的无机金属化合物选自含金属元素的无机盐、氧化物或氢氧化物中的任意一种或两种以上的组合物；所述的金属元素进一步优选钙、镁或铁中的任意一种或多种；所述的无机金属化合物更优选无机钙盐、无机铁盐、无机镁盐、氢氧化钙、氧化钙、氢氧化亚铁、三氧化二铁、氢氧化镁、氧化镁中的任意一种或两种以上的组合物；所述的无机钙盐进一步优选羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、苹果酸钙、聚苹果酸钙、丁二酸钙、富马酸钙或磷酸三钙中的任意一种或多种的组合物，最优选纳米级羟基磷灰石；所述的无机铁盐优选氯化铁、富马酸亚铁或丁二酸亚铁；所述的无机镁盐优选氯化镁、硫酸镁、苹果酸镁、柠檬酸镁或聚苹果酸镁。
25.权利要求9所述的加载金属元素的医用水凝胶组合物在制备牙齿缺损、骨肿瘤切除后或股骨头坏死后及其他骨缺损的临床修复治疗用品中的应用。
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