CN110180017B - 一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，(1)羧甲基壳聚糖CMC加入去离子水中得到CMC溶液；邻硝基苯甲醇Nb加入去离子水得到Nb悬浊液；(2)在CMC溶液中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，得到Nb混合液；(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌、透析；冷冻干燥、避光保存Nb‑CMC；(4)将Nb‑CMC与CMC，搅拌溶解得到双组份水凝胶粘合剂溶液；(5)将双组份水凝胶粘合剂溶液采用紫外光照射制得Nb‑CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂；本发明所涉及的组织粘合剂材料采用CMC为原料，价格低廉，合成条件及步骤简单；该水凝胶粘合剂具有良好的生物相容性、生物可降解性，同时具有凝血及抗菌功能，使用时操作便捷，粘结过程快速、可控，可广泛满足临床的各种组织粘结需求。

Description

一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及基于紫外光交联的一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法。
背景技术
传统的外科缝合技术包括采用缝合线、铆钉等进行伤口机械缝合是临床上最常用的伤口粘合方法。这种方法通常会对伤口周围的组织造成损害(出血或者留疤)，并且对某些软组织，例如肝、肾和脾等不适用。此外，不可降解的缝合线或铆钉需要通过二次手术取出，给病人带来额外痛苦。近年来，随着医用组织粘合剂的蓬勃发展，手术中采用粘合取代传统缝合可以有效解决上述问题。
医用组织粘合剂是一种可粘附在组织表面或者使组织表面之间发生粘合的生物材料，它能够快速封闭创面、减轻患者疼痛、抑制创面感染以及避免对周围组织造成二次损伤。目前，应用于临床的组织粘合剂主要包括氰基丙烯酸酯粘合剂、白蛋白/戊二醛粘合剂和纤维蛋白粘合剂。虽然以上三类粘合剂均已应用于临床，但是仍然存在一定缺陷。例如，氰基丙烯酸酯粘合剂通过小分子单体聚合反应产生粘结，所使用的小分子具有毒性，且在聚合反应中产生的热量会对周围组织造成热损伤。此外，该类粘合剂在储存、使用过程中降解产生甲醛，会对人体造成伤害。基于戊二醛的粘合剂已经显示出急性毒性和慢性毒性。纤维蛋白粘合剂虽然具有良好的生物相容性，但其组织粘结强度较低，固化时间较长，且其组分(包括纤维蛋白原和凝血酶)来自异体人或动物血清，可能存在血源性疾病转移和感染传播风险。因此，理想的医用组织粘合剂应具备以下特点：(1)无毒性，不致畸、致癌和致突变；(2)良好的生物相容性；(3)温和条件下与组织快速粘合且保持一定强度；(4)保持局部无菌或具有抑菌功能；(5)具有生物可降解性；(6)使用方便，易于制备、保存。
水凝胶是一类具有网状交联结构的聚合物，它与人体内细胞外基质的三维交联结构类似，且具有很高的含水量(＞95％)。因此，水凝胶材料有可能成为一种很有潜力的组织粘合剂。水凝胶材料根据其来源可以分为两类：天然高分子水凝胶以及合成高分子水凝胶。尽管二者已广泛应用，但其各自存在局限性，例如天然高分子水凝胶力学性能较弱、功能单一、缺乏对周围环境的响应；合成高分子水凝胶不具备良好的生物相容性和生物可降解性等，这些原因促使人们尝试对其进行改性，以获得具有优异理化性能和生物性能的改性高分子水凝胶。因此，开发基于改性高分子水凝胶的组织粘合剂显得尤为重要。
羧甲基壳聚糖是壳聚糖经过羧甲基接枝改性的产物。它不仅具备天然生物高分子壳聚糖优异的生物相容性、生物可降解性、抗菌性和凝血性能等特点，而且因羧甲基的引入提高了其在中性以及碱性条件下的溶解度，使得羧甲基壳聚糖已经在药物释放载体、抗微生物制剂、化妆品、组织工程及再生医学领域广泛应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，以羧甲基壳聚糖作为原料，使其具有良好的生物相容性、生物可降解性，同时具有凝血及抗菌功能；所涉及的粘合材料采用紫外光引发亚胺交联反应，使粘合材料实现交联的时空可控性；同时，低剂量紫外光照射(波长：365nm)具有临床安全性，可达到安全组织粘结的目的；本发明涉及的多功能双组份粘合剂有望解决已有组织粘合剂生物相容性和可降解性不佳、粘结强度低、粘合剂制备和保存复杂等问题，能够满足使用过程中可控交联的临床需求。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)天平称量0.3～1.0g羧甲基壳聚糖CMC，加入100mL去离子水中，搅拌至其完全溶解得到CMC溶液；同时称量10～50mg邻硝基苯甲醇Nb，加入10mL去离子水得到Nb悬浊液；
(2)在CMC溶液中加入250～300mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入50～100mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌至Nb完全溶解得到Nb混合液；
(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌48h(转速：300rpm)，合成Nb-CMC溶液，采用10,000分子量透析袋分装Nb-CMC溶液，将分装好的透析袋置于去离子水中透析；每24h更换去离子水一次，持续3～5d；将透析好的Nb-CMC溶液置于-80℃过夜；最后，将预冷冻的Nb-CMC溶液置于低温冷冻干燥机，冷冻干燥3～5d，取出样品，-20℃避光保存Nb-CMC；
(4)称量20～40mg避光保存的Nb-CMC，同时称量20～40mg CMC，搅拌溶解至1～1.2mL PBS溶液中，得到双组份水凝胶粘合剂溶液；
(5)将双组份水凝胶粘合剂溶液滴加入圆柱形模具，采用紫外光交联仪照射70～100s，光强30mW/cm2，距离1cm，制得Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂。
有益效果：
1.与现有技术相比，本发明所涉及的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂能够在临床安全的低剂量紫外光照射下，通过温和的亚胺交联反应，形成与周围组织共价粘合的水凝胶，从而达到原位组织粘合的目的。通过改变两组分的比例可调节水凝胶的交联速度、机械强度和粘结强度。
2.Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂具有良好的生物相容性及生物可降解性。交联反应中所涉及的苯甲醛基团被有效限制在凝胶体系中，无法扩散，将大幅度降低对组织的毒性。该水凝胶材料的细胞成活率较高，能够维持细胞正常生理活动。同时，该水凝胶材料在创伤愈合过程中可生物降解，保护伤口的同时不妨碍创伤愈合。
3.Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂具有抗菌、凝血的效果。其组分CMC可以有效抑制创伤以及创伤周围组织的细菌生长。同时，该水凝胶粘合剂能够有效黏附血细胞，可满足临床上创伤止血的需求。
4.本发明所涉及的组织粘合剂材料采用CMC为原料，价格低廉，合成条件及步骤简单，使用时操作便捷，粘结过程快速、可控，可广泛满足临床的各种组织粘结需求。
附图说明
图1为不同组分的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的物理性能表征结果；其中，(a)为成胶性能；(b)为降解性能；(c)为粘结性能；*,p<0.1；**,p<0.01；与纤维蛋白胶相比,##,p<0.01。
图2为不同组分的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的生物相容性结果。
图3为不同组分的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的抗菌性结果；其中，(a)为大肠杆菌；(b)为铜绿假单胞菌；(c)为金黄色葡萄球菌。
图4为不同组分的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的凝血性结果。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明做详细叙述。
实施例一
本实施例包括以下步骤：
(1)天平称量0.8g羧甲基壳聚糖CMC，加入100mL去离子水中，搅拌至其完全溶解得到CMC溶液；同时称量30mg邻硝基苯甲醇Nb，加入10mL去离子水得到Nb悬浊液；
(2)在CMC溶液中加入280mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入80mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌至Nb完全溶解得到Nb混合液；
(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌48h(转速：300rpm)，合成Nb-CMC；采用10,000分子量透析袋分装Nb-CMC溶液，将分装好的透析袋置于去离子水中透析；每24h更换去离子水一次，持续5d，将透析好的Nb-CMC溶液置于大号培养皿中，-80℃过夜；最后，将预冷冻的Nb-CMC溶液置于低温冷冻干燥机，冷冻干燥4d，取出样品，-20℃避光保存Nb-CMC；
(4)分别称量20、30、40mg避光保存的Nb-CMC，同时称量40、30、20mg CMC，分别依次对应混合，溶解于1mL PBS溶液，得到三种不同比例(WNb-CMC/WCMC:1/2、1/1和2/1)的双组份水凝胶粘合剂溶液；
(5)将三种不同比例的双组份水凝胶粘合剂溶液加入圆柱形模具(直径*高：6mm*2mm)，采用紫外光交联仪(OmniCure，加拿大)照射100s，波长320-500nm，光强30mW/cm2，距离1cm，制得三种不同比例的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂。
本实施例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的物理性能
在紫外光照射下(波长320-500nm，光强30mW/cm2，距离1cm)，采用HAAKE MARSⅢ流变仪(Thermo Scientific，美国)测定本实施例中三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂溶液的储能模量G’和损耗模量G”随时间的变化曲线并确定Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的成胶点。从图1中(a)可以看出，Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的交联时间与其组成密切相关；随着水凝胶粘合剂中Nb-CMC含量增加，交联时间显著减少(1/2vs.1/1：p<0.01；1/1vs.2/1：p<0.1)。
将本实施例中三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶分别浸泡在2mg/mL溶菌酶/PBS溶液中，并于37℃开展降解实验，每3d更换酶溶液一次。Nb-CMC/CMC双组份水凝胶分别于1、4、7、10、14d取样，冷冻干燥后称重，采用水凝胶剩余质量百分比随时间的变化评估其降解性能。从图1中(b)可以看出，三种不同比例的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶均在第一天出现较大比例质量损失，可能是凝胶体系中部分未交联CMC溶出，尤其是1/2双组份水凝胶，质量损失大约为40％。随后，三种不同比例的双组份水凝胶以较为恒定的速率继续降解。降解14d，2/1和1/1双组份水凝胶的剩余质量约为原质量40％，1/2双组份水凝胶的剩余质量约为原质量20％。上述实验结果证明了Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂具有良好的生物降解性。
采用α－氰基丙烯酸乙酯胶水将猪肠衣(长*宽：1cm*1cm)固定在玻璃片(长*宽：3cm*1cm)一端，制备肠衣玻璃。将本实施例中三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂溶液分别涂覆于肠衣表面，并将另一片肠衣玻璃的肠衣覆盖端与粘合剂溶液相接触，采用紫外光照射，使粘合剂溶液发生交联反应并粘结肠衣。对照组采用已在临床应用的纤维蛋白胶粘结肠衣。采用BOSE ELF 3200动态力学分析仪(BOSE，美国)测试不同比例双组份水凝胶粘合剂和纤维蛋白胶断裂前的最大拉力，并计算其粘结强度。从图1中(c)可以看出，三种比例的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的粘结强度均明显高于纤维蛋白胶(p<0.01)。同时，通过调节Nb-CMC和CMC双组份比例，可以有效调控该双组份水凝胶粘合剂的粘结强度。
本实施例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的生物相容性
按照本实施例中所述方法分别制备具有圆柱形貌(直径*高：6mm*2mm)的三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶。将冻干的双组份水凝胶浸泡在无血清的培养基中，37℃摇床震荡24h，分别制备三种比例的双组份水凝胶样品浸提液(浓度：5、10、15、20mg/mL)待用。将小鼠NIH3T3细胞接种于96孔板(细胞密度：5,000个/孔)，CO2浓度为5％，37℃培养24h。弃去培养基，分别加入含有胎牛血清(浓度：10％)的不同浓度浸提液。细胞培养24h，采用CCK-8试剂盒(Dojindo,日本)分别测试不同比例、不同浓度Nb-CMC/CMC双组份水凝胶浸提液培养的NIH3T3细胞活性。实验结果显示，三种比例的双组份水凝胶浸提液中培养的细胞均保持较高活性，且浸提液浓度对细胞活性无显著性影响，见图2所示。上述结果表明Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂具有良好的生物相容性。
本实施例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的抗菌性
按照本实施例中所述方法分别制备具有圆柱形貌(直径*高：6mm*2mm)的三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶，紫外光照射消毒1h，待用。使用Luria-Bertani(LB)培养基于37℃培养大肠杆菌。随后，将菌液用LB培养基稀释至一定浓度。取48孔板，每孔加入500μL菌液并分别将三种不同比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶置于菌液。阳性对照组只加入菌液，阴性对照组只加入双组份水凝胶和500μL LB培养基。采用Fluoroskan酶标仪(ThermoScientific，美国)每小时测量600nm吸光度，持续测量12h，计算可得大肠杆菌生长曲线。重复上述步骤，依次获得Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂对铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。图3为不同组分的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的抗菌性结果；其中，(a)为大肠杆菌；(b)为铜绿假单胞菌；(c)为金黄色普通球菌。从上述结果可以看出，Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有明显的抑制作用，尽管存在因其组分导致的细菌生长抑制作用略有差异。上述实验结果表明该双组份粘合剂可满足临床抗菌需求。
本实施例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的凝血性
按照本实施例中所述方法分别制备具有圆柱形貌(直径*高：6mm*2mm)的三种比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶，37℃预热，待用。将10μL再钙化全血溶液(10mM CaCl2)滴加在预热的双组份水凝胶样品表面，放入EP管。随后，将EP管置于37℃，分别孵育60s、90s、120s、150s和180s。对照组EP管中直接加入10μL再钙化全血溶液，孵育条件及时间同上。孵育结束后，将4mL去离子水缓慢加入EP管中，释放未凝固血液。分别取100μL上清液于96孔板，采用Fluoroskan酶标仪(Thermo Scientific，美国)测量540nm吸光度，计算凝血指数。从图4可以看出，与对照组相比，不同比例Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂均具备有效的凝血能力。尤其是1/2双组份水凝胶，在每个时间点其凝血指数均明显低于其他两种比例的双组份水凝胶(p<0.1)。上述结果表明，适当调节该水凝胶粘合剂双组份比例，可在一定范围内满足临床止血需求。
实施例二
本实施例一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)天平称量0.3羧甲基壳聚糖CMC，加入100mL去离子水中，搅拌至其完全溶解得到CMC溶液；同时称量10mg邻硝基苯甲醇Nb，加入10mL去离子水得到Nb悬浊液；
(2)在CMC溶液中加入250mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入50mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌至Nb完全溶解得到Nb混合液；
(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌48h(转速：300rpm)，合成Nb-CMC；采用10,000分子量透析袋分装Nb-CMC溶液，将分装好的透析袋置于去离子水中透析；每24h更换去离子水一次，持续5d；将透析好的Nb-CMC溶液置于大号培养皿中，-80℃过夜；最后，将预冷冻的Nb-CMC溶液置于低温冷冻干燥机，冷冻干燥4d，取出样品，-20℃避光保存Nb-CMC；
(4)称量30mg避光保存的Nb-CMC，同时称量30mg CMC，搅拌溶解至1.2mL PBS溶液中，得到双组份水凝胶粘合剂溶液(WNb-CMC/WCMC:1/1)；
(5)将双组份水凝胶粘合剂溶液滴加入圆柱形模具，采用紫外光交联仪照射100s，光强30mW/cm2，距离1cm，制得Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂。
效果：按照本实施例制备的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的成胶时间约为15s,粘结强度约为38kPa。该水凝胶粘合剂无细胞毒性，可生物降解，且具有优异的抗菌性和凝血性。
实施例三
本实施例一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)天平称量1.0g羧甲基壳聚糖CMC，加入100mL去离子水中，搅拌至其完全溶解得到CMC溶液；同时称量50mg邻硝基苯甲醇Nb，加入10mL去离子水得到Nb悬浊液；
(2)在CMC溶液中加入300mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入100mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌至Nb完全溶解得到Nb混合液；
(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌48h(转速：300rpm)，合成Nb-CMC；采用10,000分子量透析袋分装Nb-CMC溶液，将分装好的透析袋置于去离子水中透析；每24h更换去离子水一次，持续5d；将透析好的Nb-CMC溶液置于大号培养皿中，-80℃过夜；最后，将预冷冻的Nb-CMC溶液置于低温冷冻干燥机，冷冻干燥4d，取出样品，-20℃避光保存Nb-CMC；
(4)称量30mg避光保存的Nb-CMC，同时称量30mg CMC，搅拌溶解至1.2mL PBS溶液中，得到双组份水凝胶粘合剂溶液(WNb-CMC/WCMC:1/1)；
(5)将双组份水凝胶粘合剂溶液滴加入圆柱形模具，采用紫外光交联仪照射100s，光强30mW/cm2，距离1cm，制得Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂。
效果：按照本实施例制备的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂的成胶时间约为13s,粘结强度约为41kPa。该水凝胶粘合剂具有良好的生物相容性和生物可降解性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出一定的抑制作用，同时具有优异的止血功能。

Claims (1)

1.一种多功能双组份水凝胶组织粘合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将0.8g羧甲基壳聚糖CMC加入100mL去离子水中，搅拌至其完全溶解得到CMC溶液；将30mg邻硝基苯甲醇Nb加入10mL去离子水得到Nb悬浊液；
(2)在CMC溶液中加入280mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC得到CMC混合液，并在Nb悬浊液中加入80mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，得到Nb混合液；
(3)将Nb混合液加入CMC混合液，搅拌48h，转速为300rpm，采用10,000分子量透析袋分装Nb-CMC溶液，将分装好的透析袋置于去离子水中透析；每24h更换去离子水一次，持续5d；将透析好的Nb-CMC溶液置于大号培养皿中，-80℃过夜，将预冷冻的Nb-CMC溶液置于低温冷冻干燥机，冷冻干燥4d、-20℃避光保存Nb-CMC；
(4)分别称量20mg、30mg、40mg避光保存的Nb-CMC，同时称量40mg、30mg、20mg CMC，分别依次对应上述称量的Nb-CMC混合，然后溶解于1mL PBS溶液，得到三种不同比例的双组份水凝胶粘合剂溶液，分别为WNb-CMC/WCMC＝1/2，WNb-CMC/WCMC＝1/1和WNb-CMC/WCMC＝2/1；
(5)将上述三种不同比例的双组份水凝胶粘合剂溶液，分别加入圆柱形模具中，采用波长为320-500nm，光强30mW/cm2的紫外光，距离1cm，照射100s，制得三种不同比例的Nb-CMC/CMC双组份水凝胶粘合剂。
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