KR20060135761A - 단백질 중합체 및 다관능성 스페이서를 포함하는 상처드레싱 - Google Patents

단백질 중합체 및 다관능성 스페이서를 포함하는 상처드레싱 Download PDF

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KR20060135761A
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Abstract

본 발명에는 상처 드레싱의 형성 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 단백질을 다관능성 스페이서 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 단백질 중합체를 형성하는 것을 포함한다. 다관능성 스페이서는 바람직하게는 폴리-카르복실산, 특히 디카르복실산이고, 상기 스페이서를 이용하여 제조된 단백질 중합체는 치료적으로 활성인 약품을 신체에 전달하기 위한 상처 드레싱으로, 및 생체접착제 및 봉합제로서의 용도를 포함하는 광범위한 치료적 응용에 적합하다.
상처 드레싱, 스페이서, 단백질 중합체, 폴리카르복실산, 생체접착제, 봉합제

Description

단백질 중합체 및 다관능성 스페이서를 포함하는 상처 드레싱 {Wound Dressings Comprising a Protein Polymer and a Polyfunctional Spacer}
본 발명은 상처 보호 분야, 특히 상처 드레싱으로서 국소적 투여에 적합한 단백질 중합체 겔의 형성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약 전달 분야, 특히 정맥 내로 또는 국소적으로 치료 약품을 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병 상태의 치료, 출혈의 관리 및 조직 회복을 위한 치료제의 부착 또는 포함을 위한 단백질 캐리어 계의 제조 방법을 기재한다.
본 발명은 쉽게 수행되는 화학적 과정을 이용하여 일정 범위의 의약 전달 비히클을 용해성인 작은 단백질 중합체로부터 겔로 형성하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 상업적으로 사용하기에 간단하고 규모 가능하다.
용해성 중합체가 신체의 표적하는 특정 부위에 사용되어, 1종 이상의 치료적으로 활성인 물질, 작은 의약으로부터 큰 단백질까지를 전달할 수 있다. 중합체에 활성 물질을 부착시키는 것은 바람직하게는 화학적 결합, 또는 흡착, 또는 상기 활성 약품을 형성 도중 중합체 내에 포함시키는 것에 의한다. 2종 이상의 물질이 같은 중합체 상에 전달될 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 응용들 중에서도 예를 들면 외상, 화상 및 궤양과 같은 국소적 투여에 적합한 겔의 형성에 관한 것이다. 상기 응용은 붕대에의 포함물 로서, 드레싱으로서, 또는 피부에 직접 적용되어 겔화되는 분무 또는 용액으로서 가능하다. 겔은 또한 의약의 느린 또는 조절된 방출을 위한 비히클로서 내복용으로 사용될 수도 있고, 인접한 조직 막 사이에 장벽을 형성함으로써 외과 수술 과정에 따르는 조직 유착을 방지 또는 저해하기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한 외과적 도구, 예를 들면 카테테르 또는 스텐트, 및 진단(예, ELISA, ELISPOT) 또는 처리 목적을 위한, 예를 들면 줄기 세포를 포함하는 세포 배양을 위한 유리 또는 플라스틱 플레이트의 코팅에 적합한 화합물의 형성을 기재한다.
본 발명은 또한 지혈 및(또는) 응혈제를 첨가하거나 첨가하지 않고 "천연의" 조직 봉합제를 형성하는 것을 기재한다.
상처 드레싱의 선택은 복잡하다. 환자에게 적합한 드레싱의 선택은 상처의 조심스럽고 정확한 평가, 치유 과정의 지식 및 시중에서 입수가능한 다양한 드레싱의 성질에 대한 구체적 지식을 필요로 한다. 환자 및 경제적 요인도 고려되어야 한다.
모든 요인을 주의깊게 고려하지 않으면, 드레싱의 선택은 임의적이고 잠정적으로 비효과적이기가 쉽다.
따뜻하고, 습기 있는 상처 환경은 치유를 촉진하고 조직 탈수 및 세포의 죽음을 방지하는 것이 널리 인정된다. 가장 현대적인 상처 보호 제품은 이러한 조건을 제공하도록 고안된다.
몇 가지 종류의 상처 보호 드레싱이 입수가능하다. 이들 중에서 가장 일반 적으로 사용되는 것은 하이드로겔, 하이드로콜로이드, 알기네이트, 중합체 필름 및 중합체 발포체이다. 각각의 제품 유형은 일반적인 특징을 갖지만 그 구성 및 따라서 각 특정 브랜드의 성능은 특정의 제품 유형 내에서도 상당히 다양할 수 있다. 어느 하나의 제품이 모든 상처 유형에 또는 치유의 모든 단계에 적합한 것은 아니다.
특정 유형의 상처에 적용하기 위한 그의 적합성을 결정하는 드레싱의 주요 특성은 그의 신체에 대한 일치성(완전한 상처 봉합을 유지하는 데 바람직함), 유체 및 냄새 흡수 특성, 취급 및 접착 성질, 및 필요하다면 항균 및 지혈 활성의 존재를 포함한다. 제품 선택에 영향을 줄 수 있는 다른 요인은 민감성 반응을 일으키기 위한 드레싱의 가능성, 부착 및 제거의 용이성(상처 표면에 대한 통증 및 외상을 최소화하는 데 중요) 및 드레싱 교환 사이의 시간간격을 포함한다. 드레싱은 치유를 지연시키거나 상처를 감염되기 쉽게 할 수 있는 입자 또는 섬유를 발생하지 않아야 한다. 이들은 또한 세포 성장에 나쁜 영향을 가질 수 있는 추출가능 물질을 함유하지 않아야 한다.
깊은 상처를 완전히 감싸는 것이, 세균 장벽 및 감소된 감염 속도를 보장하고, 습기 손실을 줄이며 통증을 최소화하는, 습기 상호반응성 상처치유를 위해 중요하다. 공동이 완전히 채워지는 것을 보장함에 있어서, 드레싱은 종종 상처 내에 억지로 밀어넣어져 조직을 더 손상시킨다.
하이드로겔 상처 드레싱은 화상, 궤양 및 욕창과 같은 깊은 상처에 특히 유용한데, 그 이유는 다른 것들 중에서도 이들이 통증을 완화시키고 시원한 감각을 주며 상처 표면의 수화에 대한 조절을 제공하기 때문이다. 다수의 알기네이트 드레싱과는 달리, 이들은 상처에 들러붙지 않고 미리-적시지 않고도 쉽게 제거될 수 있다. 그러나, 사용이 용이함에도 불구하고, 상처 공동을 하이드로겔 드레싱으로 완전히 채우기는 종종 어렵고 (예를 들면 다리 궤양을 채울 경우), 따라서 하이드로겔 드레싱은 종종 세균에 대하여 빈약한 장벽을 제공하고 감염된 상처에 사용되기에는 적합하지 않을 수 있다.
광범위한 상처 유형 및 치유 단계에 적합하다는 점에서 더욱 "보편적인", 보다 많은 수의 원하는 특징을 나타내는 개량된 상처 드레싱에 대한 요구가 명백히 존재한다.
특히, 하이드로겔 드레싱의 유익을 갖지만 우수한 항균 성질 및 임의의 형태와 크기를 갖는 상처 공동을 완전히 채우는 능력을 갖는 드레싱이 현재의 하이드로겔에 비하여 가치있는 개선을 제공할 것이다.
또한, 상처 부위에 활성 성분, 예를 들면 의약을 조절된 방식으로 전달하는 상처 드레싱은 추가의 유익을 가질 것이다. 바람직한 활성 성분은 감염에 대하여 싸우거나 보호하는 데 도움을 주고, 통증을 감소시키며, 염증을 감소시키고/또는 응혈을 촉진하는 등에 의해 치유를 촉진할 수 있다.
인간 혈청 알부민(HSA) 단백질은 그것을 상처 치유에 특별히 유익하게 만드는 다수의 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 광범위한 의약 분자와 가역적으로 결합함으로써 HSA는 의약 전달을 위한 조절된 방출 메카니즘을 제공할 수 있다. HSA는 금속 이온(예, 아연, 구리 및 은)과 결합하며, 이는 상처의 감염- 방지 처치에 중요할 수 있고, 상처 부위를 해독하며 자유 라디칼을 제거할 수 있다. 병리적인 혈소판 응집이 HSA에 의해 저해되며, 염증을 일으키는 화학적 수준(따라서 가렵게 하는) 또한 감소된다. HSA는 비-알레르기성이며 상처 부위에서 항균/항바이러스 활성을 자연스럽게 부여할 수 있다.
알부민은, 예를 들면 혈액량을 증가시키기 위한, 다수의 다른 의학적 용도로 사용된다. WO 99/66964는 생체접착제, 외과용 봉합제, 및 의약 전달 및 보철을 위한 이식가능한 장치로 사용하기 위한 알부민-기재 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물의 접착 성질은 그들을 외부 상처 드레싱으로 사용하기 부적합하게 만들며, 상기 조성물이 신체에서 붕괴되도록 의도된다 할지라도, 내복 사용의 적합성 또한 원치않는 접착에 의해 제한된다. 외과수술 과정 후에, 손상된 조직을 다시 접합시키도록 의도된 접착제 또한 상처 부위를 인접한 조직/기관에 부착시켜 추가의 손상을 일으킬 수 있다.
WO 99/66964는 알부민 분자들 사이의 가교의 속도 및(또는) 정도를 변화시키기 위한 부속 분자의 사용을 개시하고 있다. 디카르복실산은 소 혈청 알부민의 겔화를 촉진할 수 있는 것으로 언급되어 있다. 그러나, WO99/66964에 따라서 형성된 제품은 본 발명의 중합체에 비하여 건성이고 취약성인 것으로 밝혀졌다. 그러한 취약성 제품은 상처 드레싱으로 사용하기에 부적합하다.
종래 기술과 관련된 상기 언급된 및(또는) 다른 단점들을 극복하거나 실질적으로 완화시키는 상처 드레싱의 형성 방법이 이제 고안되었다.
본 발명의 제1 국면에 따르면, 단백질을 다관능성 스페이서 또는 그의 활성 화된 유도체와 반응시켜 단백질 중합체를 형성하는 것을 포함하는, 상처 드레싱의 형성을 위한 방법이 있다.
상처 드레싱은 제자리에서 (in situ) 형성될 수 있다. "제자리에서"라는 말은 본 발명의 문맥에서, 드레싱을 형성하기 위한 단백질과 다관능성 스페이서와의 반응이 상처 부위에서 일어나는 것을 의미한다. 상기 조성물의 성분은 상처 부위에 동시에 또는 신속히 잇달아 적용되거나, 상기 성분은 사용 직전에 혼합된 다음 그 혼합물을 상처 부위에 적용할 수 있다.
상처 드레싱의 제자리에서의 형성은 드레싱이 상처의 정확한 형태 위에 적용되어, 노출된 조직을 악화시키지 않고 상처 공동을 완전히 채운다는 점에서 특히 유리하다. 정확한 피팅은 상처가 완전히 봉합되는 것을 보장한다.
지지 기재는 겔화가 일어나기 전에 또는 겔화 과정 도중에 상기 조성물에 첨가됨으로써 제자리에서 드레싱 내에 도입될 수 있다. 특히, 상기 조성물을 증기-투과성 막으로 덮는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 상기 중합체 겔이 마르는 것을 방지하고, 가장 중요하게는 상처의 습기를 유지할 것이다. 상기 증기-투과성 막은 겔화 과정의 마지막에 첨가되어, 그것이 견고하고 고르게 부착되지만 그 조성물 내로 너무 깊이 가라앉지는 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상처 드레싱은 또한 미리-형성될 수 있다 (즉 상처 부위에 적용되기 전에 가교됨). 그러한 드레싱은 지지 기재의 존재 또는 부재 하에 단백질 중합체, 또는 겔 시트로 함침된 붕대의 형태를 취할 수 있다. 특정 형태 및 크기의 겔이 특별한 상처 유형 또는 신체 부위를 위해 특정하게 성형될 수 있다. 그렇지 않 으면, 적절하게 크기조절된 드레싱이 더 큰 겔 시트로부터 적용 직전에 절단될 수 있다.
"단백질 중합체"는 본 발명의 문맥에서 다관능성 스페이서로부터 유래된 결합 기에 의해 함께 결합된 복수의 완전한 단백질 단위로 구성된 중합체 화학종을 의미한다. 개개의 단백질 분자는 함께 공유결합된 아미노산 잔기의 사슬로 이루어졌다는 점에서 "중합체성"임이 잘 인식될 것이다. 그러한 개개의 단백질 분자는 여기에서 사용되는 용어의 의미 내에서 "단백질 중합체"가 아니다. 대신, 단백질 중합체는 개개의 단백질 분자를 함께 커플링하여, 결합 기들을 통해 함께 공유 결합된 상기 분자의 사슬 또는 매트릭스를 형성함으로써 생성된 반응 생성물이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 단백질은 구상 단백질 및 섬유상 또는 구조적 단백질, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
구상 단백질의 예로서 합성 또는 천연의 혈청 단백질, 그의 천연 또는 합성의 유도체, 염, 효소적으로, 화학적으로 또는 달리 개질되거나, 절단되거나, 짧게 되거나 가교되거나, 산화되거나 가수분해된 유도체 또는 그의 부단위를 포함한다. 혈청 단백질의 예는 알부민, α-글로불린, β-글로불린, γ-글로불린, 피브리노겐, 헤모글로빈, 트롬빈 및 다른 응고 인자이다. 섬유상 또는 구조적 단백질의 예로서 합성 또는 천연 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴, 피브린 및 피브로넥틴, 이들의 천연 또는 합성의 유도체, 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.
특히 바람직한 단백질은 알부민이다.
본 발명에 따라서 제조된 단백질 중합체가 인간에 투여하도록 의도된 경우, 사용되는 단백질은 인간 근원의 것, 즉 실제로 인간으로부터 유래되거나 인간 근원의 단백질과 그 구조가 동일한 (또는 실질적으로 동일한) 것이 바람직하다. 따라서 특히 바람직한 단백질은 인간 혈청 알부민이다.
인간 혈청 알부민은 혈청-유래의 것, 예를 들면 헌혈로부터 수득된 것일 수 있다. 인간 혈청 알부민은 분별된 혈액 제품으로서 쉽게 입수가능하며, 혈액 확장제로서 정맥내 전달용으로 다년간 안전하게 사용되어 왔다. 그러나, 혈액-유래된 제품에 존재할 수 있는, 예를 들면 바이러스성 또는 다른 유해한 물질과 같은, 가능한 오염물의 전이 위험을 제거하거나 감소시키기 위해, 뿐만 아니라 헌혈로부터 단리된 물질과 관련된 잠정적인 공급 한계를 제거하거나 감소시키기 위해, 예를 들면 인간 혈청 알부민과 같은 단백질은 미생물(예를 들면 세포주)로부터 유래된 재조합 생성물, 상기 단백질을 발현시키기 위해 변형되거나 감염된 이식 유전자의 식물 또는 동물일 수 있다.
척추 동물에 사용을 위해, 적절하다면 비-인간의 동물-유래된 단백질이 사용될 수 있다. 그러한 단백질의 예로서 말 혈청 알부민, 개 혈청 알부민 등을 들 수 있다.
단백질의 혼합물, 즉 2종 이상의 상이한 단백질이 사용될 수도 있다.
스페이서와 함께 반응할 수 있는 단백질 분자 위의 작용기로서 아미노 기를 들 수 있다. 따라서 바람직한 단백질은 유리 아미노 기, 특히 NH2 기를 포함하는 비교적 높은 비율의 아미노산 잔기를 갖는 단백질을 포함한다. 그러한 아미노산 잔기의 하나의 예는 리신이고, 본 발명에 사용하기 위한 그와 같이 특별히 바람직한 단백질로서 리신 잔기를 포함하는 단백질, 특히 예를 들면 단백질 분자 당 20 개를 초과하는 리신 잔기를, 더욱 바람직하게는 30 개를 초과하거나 40 개를 초과하는 리신 잔기와 같이 높은 비율의 리신 잔기를 갖는 단백질을 들 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 다관능성 스페이서는 폴리카르복실산, 폴리아민, 폴리(카르복시/아미노) 화합물 (즉 다수의 카르복실 및 아미노 기를 갖는 화합물), 폴리알코올, 폴리케톤, 폴리알데히드 및 폴리에스테르를 포함한다.
폴리카르복실산 또는 폴리아민 스페이서가 바람직하고, 디카르복실산 또는 디아민이 더욱 바람직하다.
폴리카르복실산은 시트르산 및 폴리아크릴산을 포함한다.
바람직한 스페이서는 2-관능성 스페이서, 특히 동종-2관능성 스페이서이다.
폴리아민은 폴리(리신) 및 키토산을 포함한다.
특히 바람직한 스페이서는 디카르복실산이다.
상기 디카르복실산 스페이서는 가장 바람직하게는 알킬렌 디카르복실산, 특히 다음 화학식의 직쇄 알킬렌 디카르복실산 분자이다:
HOOC(CH2)nCOOH
여기에서 n은 1 내지 약 20이다. 바람직하게는 n은 2 내지 12이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 8이다.
바람직한 직쇄 알킬렌 디카르복실산 스페이서는 다음과 같다:
n 일반명 계통적 명칭 화학식
2 숙신산 부탄디온산 HOOC(CH2)2COOH
3 글루타르산 펜탄디온산 HOOC(CH2)3COOH
4 아디프산 헥산디온산 HOOC(CH2)4COOH
5 피멜산 헵탄디온산 HOOC(CH2)5COOH
6 수베르산 옥탄디온산 HOOC(CH2)6COOH
7 아젤라산 노난디온산 HOOC(CH2)7COOH
8 세박산 데칸디온산 HOOC(CH2)8COOH
직쇄 알킬렌 디카르복실산이 특히 유용한 스페이서이며, 그 이유는 수득되는 단백질 중합체의 성질이 알킬렌 사슬의 길이를 변화시킴으로써 간단히 변화될 수 있기 때문이다. 일반적으로, 고정된 단백질 농도에서 디카르복실산의 사슬 길이가 증가함에 따라 겔화 시간은 짧아지고 상기 중합체는 더 경질이 되고 고무같은 성질이 감소되며 더 탁해진다. 화학적 원리는 간단하지만 단지 적은 수의 변수를 조절함으로써 광범위한 단백질 중합체 계가 제조될 수 있다. 고도의 제어를 촉진할 뿐 아니라, 중합체의 성질이 그 조성 및 반응 조건으로부터 합리적으로 잘 예상될 수 있다.
상기 스페이서와 단백질 분자의 반응을 촉진하기 위해, 상기 스페이서가 활성화되는 것이, 즉 상기 스페이서의 작용기가 단백질에 있는 기에 대하여 더 큰 반응성의 기로 변환되는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 적합한 활성화 화학은 당업자에게 친숙할 것이며 활성 에스테르 기의 형성을 포함할 것이다.
디카르복실산 스페이서와 함께 사용하기 적합한 활성화제의 하나의 특별한 부류는 카르보디이미드 화합물이고, 본 발명에 사용하기 특히 바람직한 활성화제는 에틸[디메틸아미노프로필]-카르보디이미드(EDC)이다. 본 발명의 하나의 구현예에 서는 디카르복실산(바람직하게는 C6-C10 길이)이 상기 단백질 용액에 첨가된다. EDC를 상기 혼합물에 가하고 반응을 진행시킨다. 원하는 결과를 위해 단백질 용액의 농도, 디카르복실산 대 단백질의 비율, EDC의 양 및 시간이 모두 중요하다. EDC는 -COOH 기를 활성화하여 단백질 상의 유리 아민 기와 결합되도록 한다.
반응의 제어는 같은 반응 혼합물로부터 용해성 중합체, 불용성 입자 또는 겔을 제공하도록 중합이 제어될 수 있음을 의미한다. 출발 단백질 농도의 95% 이상의 중합체로의 변환, 및 100%에 이르는 겔로의 변환이 수득될 수 있다.
디카르복실산 스페이서를 생략하고 EDC만을 사용하는 것은 (여기에 기재된 조건 하에), 디카르복실산이 사용되는 경우 수득된 것에 비하여 중합체의 낮은 수율로, 몇 시간 내지 몇 일의 기간에 걸쳐 단지 부분적인 중합을 선도하였다.
일반적으로, 본 발명에 따르는 방법은 용액에서 수행될 것이다. 바람직하게는, 활성화제, 예를 들면 EDC가 단백질과 디카르복실산의 용액에 첨가된다. EDC는 예를 들면 증류수와 함께 용액으로 존재하거나, 단백질 및 디카르복실산 용액에 고체 형태, 예를 들면 분말로 첨가될 수 있다. 원리적으로, 디카르복실산을 먼저 EDC로 활성화시킨 다음 상기 활성화된 스페이서를 단백질 용액에 가하는 것도 가능하지만, 이는 실제로 단백질과 스페이서의 혼합물에 EDC를 가하여 수득된 것만큼 좋은 결과를 내지 못하는 것으로 밝혀졌다.
적용을 용이하게 하도록, 적용 직전에 물, 염수 또는 완충 용액을 거기에 가하는, 혼합된 건조 분말로 상기 반응물을 조제하는 것이 바람직할 수 있다. 단백질과 디카르복실산은 EDC의 첨가 없이 반응할 수 있고, 따라서 때이른 반응의 위험 이 없이 분말로 시약들을 보관하기 위해, 예를 들면 별도의 작은 주머니에 담아두는 등에 의해 상기 단백질/디카르복실산 분말을 EDC 분말과는 별도로 보관하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 적용 방법은 단백질/디카르복실산 용액 및 EDC 분말의 용액이 담긴, 상기 용액과 분말이 취약한 막에 의해 분리되어 있는 주사기이다. 주사기의 피스톤을 누름으로써 사용자는 막을 강제로 파열시켜 상기 시약들이 적용 직전에 혼합되게 한다.
용액을 상처 부위에 적용하는 것은 용액을 붓거나, 바르거나 분무함으로써 될 수 있다.
상처 드레싱이 상처 부위에 치료적 활성 성분을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 항균제, 항바이러스제, 소염제, 지혈제, 진통제 및 파지 등과 같은 의약이 상기 조성물에 직접 첨가되거나 예를 들면 리포좀과 같이 상처 부위로부터의 흡수를 촉진하는 캐리어를 통해 첨가될 수 있다. 예를 들면 성장 인자, 흉터-방지제 및 혈관신생을 촉진하는 물질 등과 같이, 조직의 회복을 촉진하거나 향상시키는 활성 물질이 또한 도입될 수 있다. 배출물의 감염 및 흡수를 제거함으로써, 악취나는 상처의 냄새가 감소될 수 있다. 그러나, 상처의 냄새는 또한 상기 드레싱에 냄새의 원인이 되는 휘발성 분자를 흡수하는 물질(예, 차콜)을 도입함으로써 감소/제거될 수도 있다.
도입된 활성 화합물은 겔로부터 침출에 의해 또는 겔로부터의 방출에 의해 그것이 분해될 때 상처 부위로 전달될 것이다. 활성물질의 방출 속도를 결정하는 주요 인자는 단백질 중합체의 연성/경성일 것이다. 활성 화합물은 그들이 가교된 단백질 분자에 의한 것만큼 효과적으로 고정되어 있지 않기 때문에 보다 연성인 중합체로부터 더욱 쉽게 침출되어 나올 것이다. 보다 연성인 중합체는 또한, 그 느슨한 구조가 습기 및 효소로 하여금 더욱 쉽게 침투하도록 허용할 것이므로, 더욱 빠른 속도로 붕괴될 것이다.
본 발명의 또 하나의 국면에 따르면, 전술한 방법에 의해 제조된 상처 드레싱, 즉 단백질을 다관능성 스페이서 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 형성된 단백질 중합체를 포함하는 상처 드레싱이 제공된다.
본 발명의 특히 바람직한 화학은 다수의 여타 치료적 응용에 적합한 단백질 중합체를 제조한다는 것이 또한 발견되었다.
따라서, 본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 단백질을 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시키는 것을 포함하는 단백질 중합체의 형성 방법이 제공된다 (단, 상기 단백질은 소 혈청 알부민은 아님).
본 발명의 추가의 국면은 단백질을 알킬렌 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시키는 것을 포함하는, 단백질 중합체의 형성 방법이다.
상기 단백질은 바람직하게는 알부민, 특히 인간 혈청 알부민이다.
반응물 및 반응 조건의 적절한 선택에 의해, 광범하게 다양한 성질을 갖는 생성물이 제조될 수 있다. 즉, 단백질 중합체는 용해성 형태로, 불용성 입자의 형태로, 또는 겔의 형태로 제조될 수 있다. 겔 형태는 매우 점착성에서부터 연성이지만 비-접착성으로 변할 수 있고, 경도는 낮은 변형을 갖는 매우 경질의 겔에 이르도록 점차 증가될 수 있다. 이러한 다양한 결과를 수득하도록 변할 수 있는 변 수는 단백질 출발 물질의 선택, 스페이서의 선택, 각종 반응물의 농도, 반응 온도 및 다양한 반응 단계의 지속시간을 포함한다.
겔 형성의 속도 또한 넓은 범위에 걸쳐, 몇 초 내지 몇 분 내지 몇 시간에 걸쳐, 겔을 형성하는 데 사용되는 시약의 비 및 온도를 조절함으로써 변할 수 있다.
겔화 반응은 약산성 pH(예, pH = 5-6)에서 가장 잘 수행된다. 그러나, 겔의 최종 pH를 생리적 pH에 가깝게 올리는 것이 종종 바람직하다. 최종 겔의 pH를 조절하는 다수의 방법이 있다. 하나의 접근은 단백질 대 디카르복실산의 몰비를 변화시키는 것이다; 낮은 수준의 디카르복실산이 생리적 pH에 가까운 겔을 제공한다. 제2 접근은 단백질 대 EDC의 몰비를 변화시키는 것이다; 높은 EDC 수준이 보다 높은 pH의 겔을 수득하게 한다. 당업자의 경우, 원하는 pH에서 특정 응용을 위해 필요한 겔 점도를 수득하는 조건의 균형을 찾는 것이 가능함을 알 수 있다.
겔화 반응은 초기 겔화에 부수적인 "경화" 단계가 이어지는 2-단계 반응일 수 있다. 반응은, 예를 들면 EDC의 수준이 너무 낮을 경우와 같이, HSA, 디카르복실산 및 EDC의 특정 조합의 경우 경화 단계로 진행되지 않을 것이다. 대신, 겔화 후 pH의 강하가 관찰되고 겔이 다시 용해된다. 반응이 경화 단계까지 줄곧 진행되기 위해서, 카르복실산 기의 최소 백분율이 EDC에 의해 활성화되어야 하는 것으로 생각된다. 낮은 pH를 갖는 중합체는, 반응하지 않은 카르복실산 기가 스페이서 및 HSA 상에 존재하기 때문에 일반적으로 안정성이 덜하다.
추가의 화합물의 첨가가 유리할 수 있다. 예를 들면, 조절된 방출(상기 상 처 드레싱에 관련하여 기재한 것과 같은)을 위한 의약 또는 다른 활성 화합물, 및(또는) 예를 들면 수분을 방출하거나 가요성에 영향을 주는 등 중합체의 성질을 변화시키는 여타 개질제의 첨가가 단백질 중합체의 흡수성, 피부-감촉 및 미학, 기계적 및(또는) 접착 강도를 향상시키거나 상기 단백질 중합체의 붕괴 윤곽을 변화시킨다.
에탄올, 글루코스 및 글리세롤이 본 발명의 단백질 겔에 첨가될 수 있는 화합물의 예이다.
잘 알려진 정균제인 에탄올이 겔의 항균 성질을 향상시키기 위해, 글루코스가 에너지원을 제공하여 세포 성장을 촉진하기 위해, 그리고 글리세롤이 습기 손실을 방지하고 상처 부위에서 겔의 일체성을 유지하는 것을 돕도록 첨가될 수 있다.
만성의 상처는 일반적으로 불량한 혈액 공급을 가지며 따라서 불량한 에너지 공급 및 따라서 불량한 세포 성장을 가지므로, 글루코스는 만성 상처에 사용하기 위한 본 발명의 상처 드레싱에 특히 유용할 수 있다.
에탄올, 글리세롤 또는 글루코스의 첨가는 취약성을 더 감소시킴으로써 중합체의 점도를 향상시키는 것으로 본 발명자에 의해 발견되었다.
HSA 및 디카르복실산에 개질제를 한 단계로 가하는 것이 가능하지만, 실제로 (에탄올, 글루코스 또는 글리세롤을 이용하는) 일정 백분율의 HSA를 개질제로 개질한 다음 개질되지 않은 나머지 HSA를 카르복실산 스페이서와 혼합하는 것이 더욱 효과적인 것으로 본 발명자들에 의해 발견되었다. 따라서, 개질제를 수성 HSA에 가하고, EDC를 가하여 반응을 촉진시킨다. 개질된 HSA 및 에탄올 용액을 개질되지 않은 HSA 및 디카르복실산의 용액에 가한 다음, 상기 "겔화 용액"을 EDC와 반응시켜 겔을 형성한다.
단백질의 개질은 단백질 중합체의 물성을 향상시키기 위해 사용될 뿐만 아니라, 개질된 HSA는 치료제로서의 용도를 가질 수 있다. 예를 들면 탈-리간드된 알부민은 독소, 사이토킨 등을 포획 및 제거할 수 있는 사용가능한 결합 부위를 갖는다.
중합체는 낮은 단백질 농도를 이용하여 용해성의 형태로 제조될 수 있다. 용해성 중합체는 중성 pH에서 더욱 쉽게 제조된다. 낮은 농도 및 중성 pH는 적절한 완충액, 예를 들면 인산염 완충된 염수를 가함으로써 쉽게 수득된다. 용해성 중합체는 비경구 전달에 적합하며, 예를 들면 의약의 전달, 영상 기술에서 유용한 콘트라스트 물질의 전달과 같은 전달 비히클로서, 또는 혈소판 대체물 또는 증진제(지혈제의 전달)로서 다수의 응용을 갖는다.
혈소판 대체물 및(또는) 증진제에 대한 요구는 암 환자의 치료에서 그의 응용이 성립되고 있다. 암 치료의 부작용의 하나는 혈소판의 현격한 감소, 또는 혈소판 감소증이다. 상기 상태는 현재 혈액-유래된 혈소판의 주입으로 처치되지만, 화학요법의 체제가 훨씬 더 공격적이 되고 골수 이식의 사용이 증가함에 따라 혈소판에 대한 요구가 증가하고 있다. 또한, 혈액-유래된 혈소판은 바이러스 감염을 전달할 가능성을 가지고, 보관 도중 불안정성이 있으며, 면역 반응을 일으킨다.
'혈소판 대체물' 및 '혈소판 증진제'라는 용어는 종종, 오용되어 또는 편의상 상호교환된다. 본 발명의 문맥에서 '혈소판 대체물'은 천연에서 생성된 혈소판 의 존재를 반드시 필요로 하지 않는 완전한 혈소판의 대체를 의미한다. 반면에 '혈소판 증진제'는 상처 부위에서 혈소판 플러그에 대한 천연의 형성을 필요로 할 수 있다 (따라서 천연의 혈소판 계수는 문턱 수준을 넘을 필요가 있을 수 있다). 그러면 혈소판 증진제는 혈소판 플러그에서 응집되어 응혈을 형성하고, 그럼으로써 혈전 형성 상태에서 혈소판의 활성을 향상시킨다. 혈소판 대체물/증진제는 응혈제 또는 다른 활성 펩타이드 유도체를 중합체의 표면에, 그들의 생화학적 활성을 유지하도록 하는 방식으로 고정화시킴으로써 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 단백질 중합체는, 상기 혈소판 표면 상에 발현된 특이적 수용체를 통해 혈소판 접착 및 응집을 촉진하거나 조절하는 물질과 결합할 수 있다. 하나의 예는 피브리노겐, 피브리노겐의 활성 펩티드 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's factor)와 상호작용하는 GPIIb/IIIa 수용체이다. 피브리노겐과 결합하는 방법은 단백질 중합체를 티올화하고, 피브리노겐을 N-[말레이미도카프로산]히드라지드로 활성화시킨 다음 활성화된 피브리노겐을 티올 기를 통해 단백질 중합체 위에 결합시키는 것을 포함한다. 상기 혈소판 대체물/증진제는 정맥내 주입에 의해 전달될 수 있고 혈관의 내부 상처 부위에서 활성화된다.
전달 비히클로서, 단백질 중합체는 의약의 느린 방출 또는 조절된 방출에 적합하다. 또한, 활성 물질의 전달에 의해서 또는 그들의 흡수 성질 덕분에, 본 발명의 단백질 중합체는 해독 응용에 유용할 수 있다.
단백질 중합체는 본래, 독립적으로 표적화하기 어려운 신체의 영역에 의약 전달을 향상시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, 단백질 중합체는 신체의 특정 위치 와 친화성을 갖는 1종 이상의 표적화 잔기와 결합될 수 있다. 적합한 표적화 잔기는 항체일 수 있다. 항체는 그 자체로서 치료제로서 작용하거나, 그렇지 않으면 예를 들면 세포독성 물질, 표적화된 항암 치료를 위한 방사선 핵종, 또는 백신 또는 유전자와 같은 1종 이상의 부수적 물질이 부착될 수 있다. 표적화 잔기는 질병의 특정 기관 또는 부위와 친화성을 가질 수 있고, 이는 부수적 물질의 그 위치로의 전달을 증진시킬 수 있고/또는, 예를 들면 상기 물질을 특정 기관, 예를 들면 간에 축적시켜 그 기관이 표적화되게 함으로써 상기 물질의 생체분포를 변화시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 단백질 중합체는 표적화 잔기 및 콘트라스트 물질과 결합할 수 있다. 콘트라스트 물질은 자기 공명 영상(MRI), 또는 핵 영상에서, 또는 방사선요법에서 치료제로서 유용한 금속일 수 있다.
불용성 단백질 입자는 활성화제에 대하여 상대적으로 증가된 디카르복실산 스페이서의 농도 및(또는) 낮은 단백질 농도를 유지하면서 증가된 반응 시간을 이용하여 제조될 수 있다. 그렇지 않으면, 불용성 입자는 예를 들면 아세톤 등의 유기 용매에 본 발명의 용해성 단백질 중합체를 분산시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여, 단백질 중합체 겔은 다양한 점도(연질 내지 경질), 및 다양한 접착 강도로 제조될 수 있다.
본 발명의 비-접착성 단백질 겔은 인접한 조직 막 사이에 장벽을 형성함으로써 외과수술 과정에 뒤따르는 조직 유착을 방지 또는 저해하는 데 유용하다. 시약 및 반응 조건의 조절에 의해, 붕괴 속도는 예를 들면 상기 중합체가 그 상처가 치 유됨에 따라 붕괴되도록 고안될 수 있게 선택될 수 있다. 겔의 제자리에서의 형성은 특정 영역이 바람직한 두께로 완전히 덮이는 것을 보장할 것이다. 겔은 얇은 막으로 적용되거나 그렇지 않으면 더 큰 공동 내에 부어 공동을 채우도록 할 수 있다.
그렇지 않으면, 본 발명의 접착성 겔은, 예를 들면 절개, 째짐, 관통 및(또는) 조직에서 유체 또는 기체의 누출을 봉하는 등, 조직을 함께 붙이기 위해 사용될 수 있다. 섬세한 조직을 봉합하거나 꿰매는 것이 그 자체에서 조직 손상/쇠약화, 및 결과적으로 예를 들면 생물학적 유체의 누출 또는 세균 감염의 문제를 일으킬 수 있음은 잘 이해된다. 조직 결합의 수단을 제공하는 생체접착제가 기재되어 있다. 그러나 상기 조성물의 어느 것도 완전히 만족스러운 것으로 밝혀지지 않았다. 진정으로 안전하고 효율적이며 그 성질이 조직의 성질 및 손상의 정도에 적합하게 쉽게 맞추어질 수 있는 효과적인 생체접착제 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다.
유사하게, 상기 단백질 겔은 보철물, 및 카테테르 또는 스텐트와 같은 외과 도구를 코팅하는 데 적합하다. 그러한 코팅은 장치를 원하는 위치에 유지하는 데 도움을 주는 생체접착 성질을 가질 수 있다. 중합체 내 천연 단백질, 특히 HSA의 사용은 이물질의 도입에 대한 신체의 자연스런 방어에 의해 거부되는 이식물의 위험을 경감시킬 것이다.
본 발명의 단백질 중합체는 진단용 (예, ELISA, ELISPOT) 또는 처리 목적(예를 들면 줄기 세포를 포함하는 세포의 성장에 사용하기 위한)을 위한 유리 또는 플 라스틱 플레이트를 코팅하는 데 적합하다.
경질 겔은 높은 수준의 디카르복실산 스페이서 및(또는) EDC를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 경질 겔은, 인공 뼈 이식물 또는 여타 보철 장치와 같은, 뼈 또는 연골을 강화 및(또는) 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 겔은 제자리에서 형성되거나 금형에서 미리-형성될 수 있다.
이제 본 발명을 이하의 비제한적 실시예를 참고하여 단지 예시로서 더욱 상세하게 기재할 것이며, 상기 실시예들은 다음을 보여준다:
○ 반응 조건을 성분 농도 및 조성, pH 및 시간의 면에서 변화시키는 것은 다양한 형태의 중합체를 생성할 수 있다.
○ 용해성 중합체는 보다 낮은 단백질 농도로 중성 pH에서 더욱 쉽게 제조된다.
○ 반응에서 스페이서 및 활성화제의 수준을 증가시키는 것은 용해성 중합체가 유기 용매와 혼합될 경우에도 제조되는 불용성의 입자를 생성할 것이다.
○ 단백질 농도를 증가시키고 반응의 pH를 낮추는 것은 겔을 생성한다. 또한, 겔 성분의 비, 단백질 농도 및 pH의 변화 또는 상기 요인들의 조합에 의해 겔의 물리적 특성(연질 내지 경질 및 접착 성질)을 변화시키는 것이 가능하다. 이는 상처 드레싱, 겔 이식물 및 생체접착제를 포함하는 치료 용도를 위한 겔의 제조에서 중요한 요인이다.
약어
DMSO 디메틸술폭시드
EDC 에틸[디메틸아미노프로필]카르보디이미드
EMCH N-[말레이미도카프로산]히드라지드
HSA 인간 혈청 알부민
PBS 인산염 완충된 염수
도 1은 표준 조건을 이용하는 세파로스(Sepharose) 6B 컬럼 상에서의 겔 여과에 의한 본 발명의 용해성 중합체의 분리를 나타내며, 여기에서 흡광도는 280 nm에서 추적되었다.
도 2는 45 시간에 걸쳐 본 발명의 겔로부터 테트라사이클린의 방출을 보여준다.
실시예 1: 용해성 단백질 중합체의 형성
1.1 세박산 을 이용하는 HSA 의 용해성 중합체의 형성
2.5 ml의 DMSO 중 세박산(146 mg)을 10 ml의 20% HSA 용액 (BPL, Zenalb) 및 20 ml의 0.01M PBS 완충액 (pH=7.4)에, 용액이 투명해질 때까지 교반하면서 가하였다. 7.5 ml PBS 완충액 중 EDC(276 mg)를 상기 용액에 가하고 16 시간 동안 (밤새) 교반하였다. 수득되는 용액을 원심분리하여 소량의 불용성 중합체를 제거하였다. 용해성 분획을 표준 조건을 이용하여 세파로스 6B 컬럼 상에서 겔-여과하였다. 단백질 용리를 A280nm에서 추적하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 단량체성 HSA는 ~340 ml에서 용리된다.
1.2 아디프산을 이용하는 HSA 의 용해성 중합체의 제조
1 ml의 50% 에탄올 중 아디프산 26.3 mg을 5 ml의 20% HSA 용액(BPL, Zenalb) 및 25 ml의 0.01M PBS 완충액(pH = 7.4)에 가하면서 용액이 투명해질 때까지 교반하였다. 4 ml의 PBS 완충액 중 69 mg의 EDC를 상기 용액에 교반하면서 적가하였다. 수득되는 용액을 2 시간 동안 더 교반하였다. 수득되는 용액을 원심분리하여 소량의 불용성 중합체를 제거하였다. 용해성 분획을 표준 조건을 이용하여 세파로스 6B 컬럼(상기 실시예 1.1에서와 같은) 상에서 겔-여과하였다.
1.3 피브리노겐을 용해성 HSA 단백질 중합체에 결합시켜 혈소판 대체물을 제조함
본 실시예에서는, 피브리노겐의 생화학적 활성을 유지하는 방식으로 상기 HSA 용해성 중합체의 표면에 응혈 인자, 피브리노겐을 고정화시킴으로써 혈소판 대체물(증진제)을 제조한다. 상기 혈소판 대체물은 정맥 내 주입에 의해 전달될 수 있고, 혈관 중 내부 상처의 부위에서 활성화된다.
1.3.1 용해성 단백질 중합체의 제조
1.25 ml의 DMSO 중 세박산(30 mg)을 15 ml의 PBS 완충액(0.01M; pH=7.4) 중 5 ml의 20% HSA 용액(BPL, Zenalb)에 가하고 용액이 투명해질 때까지 교반하였다. 4 ml의 PBS 완충액 중 EDC(57 mg)를 상기 HSA/스페이서 용액에 가하고 실온에서 3 시간 동안 교반하였다.
다양한 탄소 사슬 길이의 여타 디카르복실산이 상기 반응에서 세박산 대신 대체될 수 있다.
1.3.2 단백질 중합체의 티올화
2-이미노티올란(210 mg)을 고체로 상기 중합체 용액에 가한 다음, 어두운 중 실온에서 1.5 시간 동안 항온처리하였다. 다음 상기 중합체를 0.01M; pH=7.4 PBS 용액 중 세파덱스 G25 컬럼 상에서 표준 조건을 이용하는 겔 여과에 의해 탈염하였다.
1.3.3 중합체에 대한 커플링을 위한 피브리노겐의 활성화
10 ml의 0.05 M 인산염 완충액 중 피브리노겐(750 mg)을 0.1M 소듐 아세테이트 완충액 중 2.5 ml의 100 mM 소듐 페리오데이트와 혼합하고 어두운 중 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 다음, 활성화된 피브리노겐을 0.01M; pH=7.4 PBS 용액 중 세파덱스 G25 컬럼 상에서 겔 여과에 의해 탈염하였다. 활성화된 당을 히드라지드와, 본 실시예에서는 N-[말레이미도카프로산]히드라지드(EMCH)(11 mg)와 어두운 중 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다.
1.3.4 활성화된 피브리노겐과 단백질 중합체의 결합
활성화된 EMCH-피브리노겐 용액을 이미노티올화 중합체 용액에 가하고 밤새 교반하였다. 수득되는 용액을 원심분리하여 임의의 불용성 물질을 제거한 다음 0.01M; pH=7.4 PBS 용액 중 세파로스 6B 컬럼 상에서 겔-여과하였다.
실시예 2: 불용성 입자의 형성
2.1 수용액 중 불용성 입자의 형성
낮은 단백질 농도를 유지하면서 증가된 농도의 디카르복실산 스페이서 및 EDC 및(또는) 증가된 반응 시간을 이용하여, 불용성 단백질 중합체 입자를 실시예 1의 것과 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.
HSA(1 ml 20%; BPL, Zenalb) 및 글루타르산을 3 ml의 증류수 중에서 1/40의 몰비로 혼합하였다. 1 ml의 증류수 중 EDC를 상기 교반되는 용액에 1/120의 HSA/EDC 몰비로 가하였다. 상기 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반한 다음 원심분리하였다. 상기 펠렛을 증류수로 세척한 다음 건조시켰다.
2.2 유기 용매 중 불용성 입자의 형성
상기 실시예 1에서 제조된 용해성 중합체를 예를 들면 아세톤과 같은 유기 용매에 분산시킴으로서 불용성 입자를 또한 제조할 수 있다.
1 부피의 용해성 중합체 용액(실시예 1)을 10 부피의 아세톤과 실온에서 15분 동안 혼합하였다. 수득되는 입자를 원심분리 또는 가만히 따름으로써 수거할 수 있었다.
실시예 3: 단백질 중합체 겔의 형성
3.1 세박산 과 고농도의 HSA 용액을 이용하는 HSA 중합체 겔의 제조
1 ml의 DMSO 중 48.5 mg의 세박산 용액을 4 ml의 HSA 20% 용액(BPL, Zenalb)에 가하였다. 상기 용액을 투명해질 때까지 교반하였다. 2 ml의 증류수 중 92 mg의 EDC 용액을 가하였다. 반응에서 HSA의 최종 농도는 114 mg/ml였다. HSA/세박산/EDC의 최종 몰비는 1/20/40이었다.
수득되는 혼합물은 EDC의 첨가 후 30 초 만에 겔을 형성하였다.
디카르복실산이 존재하지 않는 것 외에는 상기 실시예와 동등한 실험에서, 겔은 2 시간 후에 형성되었음이 인지되었다. 상기 경우 겔의 성질은 경질의 취약한 성질로서 적용 및 제거를 어렵게 만들기 때문에 상처 드레싱에 적합하지 않았다. 제자리에서 겔화되는 시간은 실제 사용하기에는 너무 길었다.
3.2 세박산 과 저농도의 HSA 용액을 이용하는 HSA 중합체 겔의 제조
HSA의 최종 농도가 72 mg/ml인 것 외에는 실시예 3.1에 기재된 것과 동일한 실험 과정을 사용하였다. HSA/세박산/EDC의 최종 몰비는 1/20/40이었다.
수득되는 혼합물은 5 분 미만에 겔을 형성하였다.
3.3 아디프산과 고농도의 HSA 용액을 이용하는 HSA 중합체 겔의 제조
4 ml의 20% HSA 용액(BPL, Zenalb)에 35 mg의 아디프산을 용해시켰다. 2 ml의 증류수 중 92 mg EDC의 용액을 위와 같이 가하였다. HSA/아디프산/EDC의 최종 몰비는 1/20/40이었다.
수득되는 혼합물은 2 분 후 연질의 겔 중합체를 형성하였다.
3.4 헤모글로빈을 함유하는 겔의 제조
HSA (300 mg) 및 헤모글로빈 (100 mg), 세박산(0.5 ml DMSO 중 24.25 mg), EDC (1 ml 증류수 중 46 mg) 및 2 ml의 PBS 완충액(위와 같음)을 함께 혼합하여 80 mg/ml의 최종 단백질 농도를 수득하였다.
10 분 후 겔이 형성되었다.
실시예 4: 스페이서 길이가 겔 특성에 미치는 효과
디카르복실산 스페이서 사슬 길이를 변화시키는 것의 효과를 판단하기 위해, 다양한 농도의 HSA 및 4종의 상이한 디카르복실산 스페이서를 이용하여 활성화제로 서의 EDC와 함께 단백질 중합체 겔을 제조하였다.
DMSO 중 디카르복실산의 용액(250 μl 중 120 μmole) 또는 (250 μl 중 90 μmole)을 1 ml의 20% HSA 수용액에, 디카르복실산/HSA 몰비 40/1 및 30/1로 가하였다. 상기 용액을 실온에서 투명해질 때까지 교반하였다. EDC의 수용액을 그 후 EDC/디카르복실산 몰비 2/1로 가하였다. 겔화 시간 및 겔의 성질을 하기 표 1-3에 상세히 나타낸다.
겔화 반응은 2-상의 반응이다: 초기 겔화에 이어 2차적인 "경화" 단계가 따른다. 겔화 시간은 초기 관찰된 겔화와 관련되며, 겔 경도는 "경화" 후 겔의 최종 상태를 의미한다.
1/40/80의 HSA/디카르복실산/EDC 몰비를 이용하여, 디카르복실산 사슬 길이의 겔화 시간에 미치는 효과
HSA 농도 (mg/ml) 겔화 시간 (초)
글루타르산 (C5) 아디프산 (C6) 수베르산 (C8) 세박산 (C10)
151 40 23 21 19
140 42 25 23 22
127 49 27 27 24
108 90 45 30 25
93 130 58 42 30
1/30/60의 HSA/디카르복실산/EDC 몰비를 이용하여, 디카르복실산 사슬 길이의 겔화 시간에 미치는 효과
HSA 농도 (mg/ml) 겔화 시간 (초)
글루타르산 (C5) 아디프산 (C6) 수베르산 (C8) 세박산 (C10)
151 46 31 29 23
140 60 35 33 26
127 75 43 38 32
108 140 60 45 37
93 240 95 62 50
1/40/80의 HSA/디카르복실산/EDC 몰비를 이용하여, HSA 농도 및 디카르복실산 사슬 길이가 겔 성질에 미치는 효과
HSA 농도 (mg/ml) 겔 성질
글루타르산 (C5) 아디프산 (C6) 수베르산 (C8) 세박산 (C10)
151 경질의 고무상 겔, 약간 탁함. 탁하고, 경질인 고무상 겔 탁하고, 매우 경질인 취약성 액상 겔 매우 경질의, 탁한, 취약성 겔
140 투명의 경질인 고무상 겔 탁한, 경질의 고무상 겔 탁한, 매우 경질인 취약성 겔 매우 경질의, 탁한, 취약성 겔
127 투명의 중간/경질의 고무상 겔 탁한, 경질의 고무상 겔 탁한, 경질의 약간 고무상 겔 경질의 백색인 취약성 겔
108 매우 연질의 투명 겔 초기에는 연질의 겔, 3분 후에는 경질. 약간 탁함 초기에는 중간/경질의 탁한 고무상. 4분 후 매우 경질의 백색인 취약성 겔 경질의 백색인 취약성 겔
93 매우 연질의 투명 겔 초기에는 연질의 겔, 중간, 3분 후에는 취약성 겔, 약간 탁함 초기에는 탁한, 연질/중간의 고무상. 4분 후에는 매우 경질의 백색 겔 경질/중간의, 백색인 취약성 겔
각각의 HSA 농도에서, 디카르복실산 사슬의 길이가 증가함에 따라 겔화 시간은 감소하고 겔은 일반적으로 더욱 경질이고, 덜 고무상이며 더욱 탁해졌다. HSA 농도를 증가시키는 것은 겔화 시간을 감소시키고 겔의 경도를 증가시켰다.
실시예 5: 겔화 시간 및 겔 성질의 조절
겔의 다양한 응용은 다양한 겔화 시간 및 겔 점도를 요구할 것이다. 겔은 몇 초 내에 또는 훨씬 더 긴 시간에 걸쳐 형성될 수 있다. 겔은 극히 연질이고 "점착성"이거나 매우 경질이고 고무상일 수 있다. 상기 변수들을 조절하기 위한 몇 가지 접근법이 존재하고 임의의 응용의 경우 하기 접근법 중 임의의 것 또는 모든 것이 사용될 수 있다. 이하에 기재되는 모든 겔은 달리 언급되지 않는 한 투명하였다.
5.1 HSA 대 디카르복실산 스페이서의 몰비를 변화시키는 것에 의한 겔화 시간 및 겔 특성의 조절
HSA 수용액(20% USP)에 글루타르산(GA)을 실온에서 용해시킨 다음, EDC의 증류수 중 용액을 가하여 겔화 반응을 활성화함으로써 겔을 제조하였다. 겔 혼합물을 여러 번 서서히 뒤집어 완전한 혼합을 보장하였다.
HSA 대 글루타르산의 몰비를 두 EDC 농도에서 1/0으로부터 1/40까지 변화시켰다. 실험 결과를 하기 표 4 및 5에 나타낸다.
HSA/GA 몰비 변화의 효과 (HSA 대 EDC의 몰비 1:35)
HSA/GA 겔화 시간 겔 pH 겔 성질
1/0 2 시간 이상 7.1 연질
1/3.5 9분 6.8 중간
1/5 5분 25초 6.5 중간
1/10 3분 15초 5.6 연질
1/20 3분 40초 연질 겔, 3분 후 재용해
1/40 겔이 형성되지 않음
HSA/GA 몰비 변화의 효과 (HSA 대 EDC의 몰비 1:70)
HSA/GA 겔화 시간 겔 pH 겔 성질
1/0 약 30분 7.6 중간
1/3.5 4분 30초 7.2 중간-경질
1/5 2분 45초 7.1 중간-경질
1/10 1분 30초 6.2 경질
1/20 1분 5초 5.3 중간
1/40 1분 15초 중간-연질 겔, 30분 내에 재용해
1/50 1분 45초 연질 겔, 5분 내에 재용해
글루타르산의 수준의 초기 증가는 겔화 시간을 감소시켰고 보다 경성의 겔을 생성하였다. 그러나 글루타르산의 보다 높은 농도에서 겔은 불안정하였으며, 이는 EDC의 수준을 증가시킴으로써 상쇄될 수 있다. 이를 실시예 6에서 논한다.
5.2 HSA 농도를 변화시키는 것에 의한 겔화 시간 및 겔 특성의 조절
실시예 5.1에 기재된 방법을 사용하여 겔을 제조하였다. HSA 대 글루타르산의 몰비 1/5 및 HSA 대 EDC의 몰비 1/70을 사용하였다. HSA의 농도는 182 mg/ml로부터 120 mg/ml까지 변화시켰다. 결과를 하기 표 6에 나타낸다.
HSA 농도의 겔화 시간 및 겔 경도에 미치는 효과
[HSA] mg/ml 겔화 시간 겔 경도 겔 pH
182 2분 27초 경질 7.1
166 2분 45초 중간-경질 7.1
150 4분 12초 중간 7.2
135 5분 55초 중간-연질 7.3
120 7분 15초 연질 7.2
HSA의 농도를 감소시키는 것이 더 긴 겔화 시간 및 더 연질의 겔을 초래하였다.
5.3 HSA 대 EDC 의 몰비를 변화시키는 것에 의한 겔화 시간 및 겔 특성의 조절
실시예 5.1에 기재된 것과 같이 겔을 제조하였다. 1/10의 HSA 대 글루타르산 몰비를 사용하였고 HSA의 최종 농도는 166 mg/ml였다. HSA 대 EDC의 몰비는 1/35로부터 1/80까지 변하였다. 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
HSA/EDC 몰비 변화의 효과
HSA/EDC 몰비 겔화 시간 겔 pH 겔 경도
1/35 3분 5초 5.6 연질
1/50 1분 50초 5.9 중간
1/60 1분 32초 6.1 경질
1/70 1분 23초 6.2 경질
1/80 1분 5초 6.6 매우 경질
표 7, 및 상기 표 4 및 5의 비교는 높은 수준의 EDC가 단축된 겔화 시간 및 보다 경질의 겔을 초래하였음을 보여준다.
5.4 에탄올, 글루코스 및 글리세롤의 첨가에 의한 겔화 시간 및 겔 특성의 조절
추가의 중요한 접근법은 낮은 농도의 EDC 존재 하에 에탄올, 글루코스 또는 글리세롤(이들은 모두 활성 -OH 기를 가짐)과 같은 시약과의 반응에 의해 HSA를 초기에 개질함으로써 HSA "겔화 용액"을 제조하는 것이다. 에탄올과의 반응에 의한 HSA 겔화 용액의 제조를 이하에 기재한다.
5.4.1 에탄올과의 반응에 의한 HSA 겔화 용액의 제조
20% HSA의 교반되는 수용액에 에탄올을 적가하였다. 용액이 투명해질 때까지 이를 교반하였다. 고체 EDC를 상기 용액에 가하고 (1/15의 HSA/EDC 몰비) 실온에서 최소 2 시간 동안 교반하였다. 글루타르산을 20% HSA 수용액에 용해시키고 실온에서 30 분 동안 교반하였다.
최종 "겔화 용액"을 제조하기 위해, 개질된 HSA/에탄올 용액을 개질되지 않은 HSA/글루타르산 용액과 1/1 부피비로 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 교반하였다. HSA 대 글루타르산의 최종 몰비는 1/5였다.
상기 혼합물 또는 "겔화 용액"을 EDC와 반응시켜 전술한 실시예에서와 같이 겔을 형성하였다.
에탄올/HSA 용액의 부피비를 1/7로부터 1/14로 변화시켰고 결과를 하기 표 8에 나타낸다.
개질된 HSA/에탄올 부피비의 겔화 시간 및 겔의 경도에 미치는 효과
HSA/에탄올 용액의 부피비 HSA/EDC* 몰비 겔화 시간 겔 경도
7/1 1/35 1분 45초 경질
8/1 1/35 2분 40초 경질
10/1 1/35 1분 50초 중간/경질
14/1 1/35 2분 30초 연질
에탄올 비첨가 1/35 5분 30초 중간/경질
*겔화 반응에서 첨가된 HSA 대 EDC의 몰비
HSA와 에탄올의 초기 반응은 겔화 시간의 일반적인 감소를 초래하였다. 에탄올의 낮은 수준에서는 보다 연질의 겔이 생성되었다. 그러나, 10%(v/v)를 초과하는 에탄올은 보다 경질의 겔을 초래하였다. 상기 겔에서는 취약성은 발견되지 않았고; 경도에도 불구하고 그들은 가요성을 유지하였다.
전술한 바와 같이 제조된 에탄올/HSA 겔화 용액을 사용하여, 10% v/v 에탄올과 HSA/글루타르산 몰비를 1/0 내지 1/40의 범위로 하여, 실시예 5.1에 기재된 실험을 반복하였다. 그 결과를 하기 표 9 및 10에 나타낸다.
에탄올-개질된 HSA를 이용하는 HSA/글루타르산 몰비의 효과 (1/35의 HSA/EDC 몰비)
HSA/GA 몰비 겔화 시간 겔의 pH 겔 경도
1/0 약 30분 7.5 연질
1/3.5 3분 6.7 중간
1/5 1분 50초 6.4 중간
1/10 1분 5.5 중간-연질
1/20 55초 4.8 매우 연질
1/40 겔이 형성되지 않음
에탄올-개질된 HSA를 이용하는 HSA/글루타르산 몰비의 효과 (1/70의 HSA/EDC 몰비)
HSA/GA 몰비 겔화 시간 겔의 pH 겔 경도
1/0 8분 7.7 연질
1/3.5 1분 30초 7.3 중간
1/5 1분 5초 6.9 중간-경질
1/10 32초 5.6 경질
1/20 25초 5.1 중간
1/40 23초 4.3 연질
5.4.2 글루코스와의 반응에 의한 HSA 겔화 용액의 제조
1/15의 최종 HSA/글루코스 몰비 및 1/5의 최종 HSA/글루타르산 몰비로 에탄올을 글루코스로 대체한 것 외에는 실시예 5.4.1에서와 같이 겔화 용액을 제조하였다.
생성된 겔은 글루코스가 없는 유사한 겔보다 연질이었으며, 겔화 시간은 감소되었다.
5.4.3 글리세롤의 첨가에 의한 HSA 겔화 용액의 제조
글리세롤을 20% HSA 용액(USP)에 0 내지 16.7 부피%로 가하였다. 다음, 실시예 5.1에 기재된 방법을 이용하여 겔을 제조하였다.
글리세롤의 첨가는 겔화 시간을 감소시켰고 실온에서 2 주의 기간 동안 덮지 않고 둘 경우에 겔의 건조를 저지하는 것으로 나타났다.
5.4.4 에탄올 또는 글루코스를 겔화 용액에 직접 첨가하는 것에 의한 HSA 겔화 용액의 제조
에탄올 또는 글루코스를 HSA 용액에 직접 가한 다음 실시예 5.1에 기재된 방법에 서 겔을 형성하는 데 사용할 경우에는, 첨가제를 이용한 HSA 예비-개질 단계가 포함된 실시예 5.4.1 및 5.4.2의 것과 각각 유사하지만 덜 현저한 효과를 보였다.
실시예 6: 디카르복실산 수준의 증가가 형성된 겔의 안정성에 미치는 효과
겔화 용액 중 글루타르산의 수준을 증가시는 것은, 시간에 따라 연질의 겔로 되돌아오는 초기에는 중간 내지 경질인 겔, 또는 재용해되어 점성의 용액을 형성하는 연질의 겔을 초래하는 것으로 나타났다. 상기 용해 과정의 조절은 여기에 기재된 다양한 응용에서 의약의 전달을 조절하는 유용한 방법일 수 있다.
실시예 5.1에 기재된 방법을 따라서 겔을 제조하였다. HSA 대 글루타르산의 몰 비는 HSA 대 EDC의 두 몰비에서 1/5로부터 1/35로 변하였다. 결과를 하기 표 11에 나타낸다.
글루타르산의 비가 증가함에 따라, 겔이 형성되지 않는 지점까지 겔화 시간이 감소한다. 중간 수준은 세워 두면 재용해되어 점성 용액을 형성하는 겔을 생성하였다. 이는 반응 도중 pH 변화의 결과인 것으로 나타났다. 글루타르산의 낮은 수준에서 겔화 용액의 pH는 겔이 형성될 때까지 EDC의 첨가 후 6-7까지 오른다. 글루타르산의 높은 수준에서 pH는 초기에 오른 다음 5-6의 산성 pH로 다시 떨어져 연질의 겔을 초래하여 겔을 재용해시키거나 겔 형성을 방해한다.
형성된 겔의 안정성에 미치는 글루타르산 수준의 효과
HSA/GA/EDC 몰비 겔화 시간 겔 성질
1/5/35 9분 20초 투명 매질 내지 연질 겔
1/10/35 5분 25초 연질 겔이 10분 후 점성 용액이 됨.
1/15/35 --- 겔이 형성되지 않음.
1/10/50 3분 매우 연질의 겔이 5-25분 후 매우 경질이 되고, 밤새 중간의 겔로 되돌아옴.
1/15/50 2분 45초 매우 연질의 겔이 4-8분 후 매우 경질이 되고, 밤새 연질의 겔로 되돌아옴.
1/20/50 2분 30초 연질의 겔이 4분 이내에 중간 내지 경질로 되고, 1 시간 후 점성 용액을 형성함.
1/25/50 2분 30초 연질 겔이 4분 후 중간이 되고, 30분 후 점성 용액을 형성함.
1/30/50 3분 매우 연질의 겔이 7분 후 점성 용액이 됨.
1/35/50 --- 겔이 형성되지 않음
실시예 7: 겔 pH 의 조절
겔화 반응은 산성 pH에서 가장 잘 수행된다. 최종 겔의 pH를 생리적 pH에 가깝도록 올리는 것이 가능하다. 겔 pH를 조절하는 두 가지 방법이 있다. 하나의 접근은 HSA 대 디카르복실산의 몰비를 변화시키는 것이다; 낮은 수준의 디카르복실산이 생리적 pH에 가까운 겔을 제공한다. 제2 접근은 HSA 대 EDC의 몰비를 변화시키는 것이며, 높은 EDC 수준이 보다 높은 pH의 겔을 수득하게 한다. 원하는 pH에서 특정 응용을 위해 요구되는 겔 점도를 수득하는 조건의 균형을 찾는 것이 가능함을 당업자는 알 수 있다.
7.1 디카르복실산의 다양한 농도를 이용하는 겔의 pH 조절
20% HSA 용액(USP)에 글루타르산을 용해시키고 증류수 중 EDC 용액을 가하여 166 mg/ml의 최종 HSA 농도를 수득함으로써 겔을 제조하였다. 1:35 및 1:70의 HSA 대 EDC 몰비가 사용되었다. 결과는 상기 표 4 및 5에 나타낸다.
상기 EDC 수준에서, 겔은 1:20 이하의 HSA 대 글루타르산 몰비를 이용하여 형성될 수 있다. 디카르복실산의 보다 높은 수준에서 겔은 실시예 6에 논의한 바와 같이 형성된다 할지라도 불안정하다. 5.3 내지 7.6 범위의 겔 pH 값이 수득되었다.
7.2 다양한 수준의 EDC 를 이용하는 겔의 pH 조절
글루타르산을 20% HSA 용액(USP)에 1:10의 HSA 대 글루타르산 몰비로 용해시켜 겔을 제조하였다. EDC의 증류수 중 용액을 가하여 166 mg/ml의 HSA 최종 농도 및 1:35 내지 1:80의 HSA 대 EDC 몰비를 수득하였다. 결과를 상기 표 6에 나타낸다.
EDC의 수준을 변화시킴으로써 5.6 내지 6.6 범위의 겔 pH 값을 수득하였다. 이는 또한 상기 표 4 및 5에서 데이터의 비교에 의해 지지된다. 겔화 혼합물 중 EDC의 수준을 증가시키는 것은 또한 보다 짧은 겔화 시간 및 보다 경질의 겔의 결과를 가져온다.
실시예 8: 생체접착제 의 제조
생체접착성 겔을 액체 또는 건조 분말로 제조하였다. 상기 액체 또는 분말을 두 조각의 고기(3 cm2 비프스테이크) 사이에 적용하여 인장 강도를 측정하였다. 한조각의 고기를 카드에 부착시키고 클램프 및 스탠드에 의해 제 자리에 고정시킬 수 있었다. 고기의 제2 하부 조각에 추를 부착시켜 인장 강도를 측정하였다. 고기는 추를 가하기 전 5 분 동안 37℃에서 항온처리되었다.
8.1 HSA (4 ml 20%; BPL , Zenalb )를 글루타르산 및 EDC 와 각각 1/50/100의 비로 혼합함
측정된 인장 강도는 63 mg/mm2이었다.
8.2 200 mg 의 동결 건조된 HSA ( Sigma )를 글루타르산 및 EDC 와, 각각 1/50/100 또는 1/60/140의 몰비로 혼합하여 건조 분말 조성물을 제조함
인장 강도는 스페이서와 EDC의 비가 증가함에 따라 증가하였다.
1/50/100의 배합물은 ~180 mg/mm2의 인장 강도를 제공하였다.
1/60/120의 배합물은 ~280 mg/mm2의 인장 강도를 제공하였다.
실시예 9: 겔로부터 의약의 방출 ( 테트라사이클린 )
1 ml의 20% HSA 용액에 에탄올 중 테트라사이클린 10 mg/ml 용액 150 μl를 가하였다. 전술한 실시예에 기재된 바와 같이 각각 1/30/60 및 1/40/80의 HSA/글루타르산/EDC의 몰비를 사용하여 겔을 형성하였다. 겔을 밤새 두었다가 5 ml의 증류수가 담긴 바이알에 넣었다. 시간에 따른 테트라사이클린의 방출을 364 nm에서 측정하였다 (도 2).
실시예 10: HSA 겔화 용액의 안정성
10.1 4℃ 및 실온에서 에탄올- 개질된 HSA 겔화 용액의 안정성
에탄올-개질된 HSA 겔화 용액(실시예 5.4.1에 기재된 바와 같이 제조된)을 0.22 μm 필터를 통해 무균 여과하였다. 용액의 절반은 4℃에서 절반은 실온에서 씰링된 바이알 중 보관하였다. 0, 7, 21 및 28일에, 용액의 분액을 EDC 수용액과 반응시키고, 겔화 시간, 겔 특성, pH 및 겔 안정성을 비교하였다.
4℃에서 겔화 용액의 보관
일수 겔화 시간 겔 특성
0 2분 10초 투명한 중간/경질 겔
7 2분 15초 투명한 중간/경질 겔
21 2분 투명한 중간/경질 겔
28 2분 15초 투명한 중간/경질 겔
제조된 모든 겔을 37℃에서 14일 동안 씰링된 바이알에서 보관하여 겔 안정성을 비교하였다; 어느 것도 상기 기간 동안 악화 또는 세균 성장의 임의의 징후가 나타나지 않았다.
실온에서 겔화 용액의 보관
일수 겔화 시간 겔 특성 겔 pH
0 2분 10초 투명한 중간/경질 겔 6.9
7 2분 10초 투명한 중간/경질 겔 6.9
21 2분 투명한 중간/경질 겔 7.0
28 2분 10초 투명한 중간/경질 겔 6.9
상기 데이터는 에탄올-개질된 HSA 겔화 용액이 4℃ 및 실온에서 적어도 4 주 동안 안정함을 보여준다.
10.2 4℃ 및 실온에서 글루코스- 개질된 HSA 겔화 용액의 안정성
글루코스-개질된 HSA 겔화 용액(실시예 5.4.2에 기재된)을 이용하여 상기 실험을 반복하였다. 실온에서 보관된 용액은 2 주 동안 안정한 것으로 나타났다. 4℃에서 보관된 용액은 적어도 4 주 동안 안정한 것으로 나타났다.
10.3 4℃ 및 실온에서 HSA / 글루타르산 용액의 안정성
HSA (200 mg/ml) 및 글루타르산의 용액(HSA/글루타르산의 몰비 1/37)은 실시예 10.1에 기재된 방법을 이용할 때 4℃ 및 실온에서 적어도 4 주 동안 안정한 것으로 나타났다.
10.4 37℃ 및 실온에서 HSA / 아디프산 용액의 안정성
HSA (200 mg/ml) 및 아디프산의 용액(HSA/아디프산의 몰비 1/30)은 실시예 10.1에 기재된 방법을 이용할 때 37℃ 및 실온에서 적어도 3 주 동안 안정한 것으로 나타났다.
실시예 11: 형성된 겔의 안정성
HSA/글루타르산/EDC의 몰비 1/40/80, 1/50/100, 1/60/120 및 1/70/140을 갖는 겔을 4℃, 실온 및 37℃에서 씰링된 바이알 중 6 주의 기간 동안 보관하였다. 4℃ 및 실온에서 보관된 모든 겔은 6 주 동안 안정하였지만, 보다 높은 비의 겔의 탁도는 4 주 후 약간 증가하였다. 37℃에서 보관된 모든 겔은 2 주 동안 안정하였다. 3 주까지는 상기 겔은 경도가 증가하였고 더욱 탁해졌다. 겔의 어느 것도 세균 성장의 임의 증후를 보이지 않았다.
실시예 12: 겔의 제자리에서의 응용
웰(2 cm2 및 0.5 cm 깊이)을 돼지 피부의 조각으로 생체 외에서 절단하였다. 겔(상기 실시예 5.1에 기재된 바와 같이 제조된)을 웰에서 제자리에서 형성하였고, 증기 투과성 막(예를 들면 Tagaderm, 3M)으로 덮어 37℃에서 항온처리하였다. 겔은 연질로 유지되었고 마르지 않았다. 이들은 막에 부착된 "상처"로부터 쉽게 제거되었다.

Claims (63)

  1. 단백질을 다관능성 스페이서 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 단백질 중합체를 형성하는 것을 포함하는 상처 드레싱의 형성 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질 중합체를 제자리에서 (in situ) 형성하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단백질 중합체를 적용 전에 형성하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 지지 기재를 드레싱 내에 도입하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 드레싱이 붕대 또는 겔 시트의 형태인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 드레싱에 증기-투과성 막을 적용하는 것을 더 포함하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 구상 단백질인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 섬유상 단백질인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 구상 단백질이 혈청 단백질인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 단백질이 알부민인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 알부민이 인간 혈청 알부민인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 단백질이 혈액-유래의 것인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 단백질이 재조합 생성물인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 폴리카르복실산, 폴리아민, 폴리(카르복시/아미노) 화합물, 폴리알코올, 폴리케톤, 폴리알데히드 및 폴리에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 스페이서가 폴리카르복실산인 방법 또는 상처 드레싱.
  16. 제 15 항에 있어서, 폴리카르복실산이 디카르복실산인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 디카르복실산이 알킬렌 디카르복실산인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서를 단백질 분자와의 반응을 촉진하도록 활성화시키는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 활성화제가 카르보디이미드 화합물인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 카르보디이미드 화합물이 에틸[디메틸에미노프로필]-카르보디이미드인 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조된 상처 드레싱.
  22. 단백질을 다관능성 스페이서 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 형성된 단백질 중합체를 포함하는 상처 드레싱.
  23. 제 22 항에 있어서, 단백질을 상처 부위에서 다관능성 스페이서 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 제자리에서 형성되는 상처 드레싱.
  24. 제 22 항에 있어서, 드레싱을 상처 부위에 적용하기 전에 미리 형성되는 상처 드레싱.
  25. 제 24 항에 있어서, 단백질 중합체로 함침된 붕대를 포함하는 상처 드레싱.
  26. 제 24 항에 있어서, 겔 시트의 형태인 상처 드레싱.
  27. 제 25 항에 있어서, 겔 시트가 지지 기재를 갖는 상처 드레싱.
  28. 제 21 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 치료 활성제를 더 포함하는 상처 드레싱.
  29. 제 28 항에 있어서, 치료 활성제가 항생제, 항바이러스제, 소염제, 진통제, 지혈제, 파지, 성장 인자, 흉터방지제, 냄새-흡수제 및 혈관신생을 촉진하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 상처 드레싱.
  30. 단백질을 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시키는 것을 포함하며, 단 상기 단백질은 소 혈청 알부민이 아닌 것인, 단백질 중합체의 형성 방법.
  31. 단백질을 알킬렌 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시키는 것 을 포함하는, 단백질 중합체의 형성 방법.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 단백질이 알부민인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 단백질이 인간 혈청 알부민인 방법.
  34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 디카르복실산이 하기 화학식을 갖는 방법.
    HOOC(CH2)nCOOH
    (상기 식에서, n은 1 내지 20, 바람직하게는 2 내지 12, 더욱 바람직하게는 3 내지 8임)
  35. 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 디카르복실산을 카르보디이미드 활성화제로 활성화시키는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 활성화제가 에틸[디메틸에미노프로필]-카르보디이미드인 방법.
  37. 단백질을 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 형성되며, 단 상기 단백질은 소 혈청 알부민이 아닌 것인 단백질 중합체.
  38. 단백질을 알킬렌 디카르복실산 또는 그의 활성화된 유도체와 반응시켜 형성된 단백질 중합체.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 용액의 형태인 단백질 중합체.
  40. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 불용성 입자의 형태인 단백질 중합체.
  41. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 겔의 형태인 단백질 중합체.
  42. 신체에 1종 이상의 치료적 활성 성분을 전달하는 데 있어서의 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 따르는 단백질 중합체의 용도.
  43. 상처, 화상 또는 궤양의 국소적 치료에서의 제 41 항에 따르는 단백질 중합체의 용도.
  44. 제 43 항에 있어서, 단백질 중합체가 상처, 화상 또는 궤양에 미리 형성된 겔로서 적용되는 것인 용도.
  45. 제 43 항에 있어서, 단백질 및 디카르복실산 스페이서가 상처, 화상 또는 궤양에 용액으로 적용되고, 단백질 중합체가 제자리에서 형성되는 것인 용도.
  46. 신체에 이식될 장치를 위한 코팅으로서의 제 37 항 또는 제 38 항에 따르는 단백질 중합체의 용도.
  47. 혈소판 대체물 또는 혈소판 증진제로서의 제 39 항에 따르는 단백질 중합체의 용도.
  48. 제 39 항에 있어서, 1종 이상의 응혈제 또는 활성 펩타이드 유도체와 결합된 단백질 중합체.
  49. 제 48 항에 있어서, 피브리노겐과 결합된 단백질 중합체.
  50. 제 39 항에 있어서, 치료 활성제, 또는 그의 전구체, 및 신체 내의 특정 위치에 친화성을 갖는 표적화 부분과 결합된 단백질 중합체.
  51. 표적화된 항암 요법에서의 제 50 항에 따르는 결합물의 용도.
  52. 제 39 항에 있어서, 조영제 및 신체 내의 특정 위치와 친화성을 갖는 표적화 부분에 결합된 단백질 중합체.
  53. 의학적 영상화 응용에서의 제 39 항에 따르는 결합물의 용도.
  54. 제1 조성물과 제2 조성물을 포함하며, 상기 제1 조성물과 제2 조성물은 제1 조성물과 제2 조성물 사이의 반응을 방지하도록 별도의 용기에 보유된 것인, 제 21 항 또는 제 22 항에 따른 상처 드레싱의 제조를 위한 키트.
  55. 제 54 항에 있어서, 제1 조성물이 단백질 및 다관능성 스페이서를 포함하고, 제2 조성물은 다관능성 스페이서를 위한 활성화제를 포함하는 것인 키트.
  56. 제 55 항에 있어서, 제1 조성물이 용액이고, 제2 조성물이 분말인 키트.
  57. 제 37 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 따르는 단백질 중합체를 신체에 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 치료 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 단백질 중합체를 정맥내 투여하는 방법.
  59. 제 57 항에 있어서, 단백질 중합체를 국소 투여하는 방법.
  60. 제 57 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 중합체를 용액의 형태로 투여하는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서, 단백질 중합체를 분말의 형태로 투여하는 방법.
  62. 제 59 항에 있어서, 단백질 중합체를 겔의 형태로 투여하는 방법.
  63. 제 59 항에 있어서, 단백질 및 디카르복실산 가교제가 제자리에서 형성되도록 단백질 중합체를 신체에 투여하는 방법.
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