JP2007521937A - タンパク質ポリマーおよび多機能スペーサーを含む創傷被覆材 - Google Patents

Abstract

創傷被覆材の形成方法が記載されている。その方法は、タンパク質を多官能性スペーサー、もしくはその活性化誘導体と反応させることによってタンパク質ポリマーを形成することを含む。多官能性スペーサーは好ましくは、ポリカルボン酸であり、特に好ましくはジカルボン酸であり、このようなスペーサーを用いて調製されるタンパク質ポリマーは、創傷被覆材としての使用、治療上活性な物質を生体に送達するため、及び生体接着剤及びシーラントとして、など広い範囲の治療用途に適している。

Description

本発明は創傷ケアの分野、特には、創傷被覆材として局所処置に適切なタンパク質ポリマーゲルの形成に関する。本発明は薬物送達、特には、治療薬を静脈内もしくは局所的のいずれかで送達するための方法および組成物にも関する。本発明は、疾患部位の治療、出血の管理および組織修復のために治療薬を付着もしくは包含させるためのタンパク質坦体系の調製方法をも説明する。

本発明は、容易に実行される化学的手順を用いる、可溶性小タンパク質ポリマーからゲルまでの、一連の薬物送達ビヒクルの形成に関する。その方法は簡潔であり、商業用途に拡張可能である。

可溶性ポリマーは、体内の特定の部位を標的化し、小さい薬物から大きいタンパク質までの１以上の治療的に活性な物質を送達するのに用いることができる。活性物質のポリマーへの付着は、好ましくは、化学結合によるもの、もしくは吸着によるもの、もしくは形成の間に活性剤をポリマー中に包含させることによるものである。２以上の物質を同じポリマーで送達することができる。

本発明は、例えば、他の用途もあるものの、外部創傷、火傷および潰瘍への局所処置に適するゲルの形成にも関する。この適用は、包帯への包含として、または被覆材として、または皮膚に直接適用してゲル状にさせるスプレーもしくは溶液としてのいずれかであり得る。これらのゲルは薬物の徐放もしくは制御放出のためのビヒクルとして内部的に用いることもでき、および、隣接する組織膜の間に障壁を形成することにより、外科的処置に続く組織癒着の予防もしくは阻害に用いることもできる。

本発明は、手術器具、例えば、カテーテルもしくはステント、および診断用（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ）もしくは処理用、例えば、幹細胞を含む細胞の成長において用いるための、ガラスもしくはプラスチックプレートのコーティングに適する化合物の形成を説明する。

本発明は、止血剤および／もしくは凝結剤の添加の有無に関わりなく、「天然」組織封止剤の形成も説明する。

創傷被覆材の選択は複雑である。患者のための適切な被覆材の選択は創傷の慎重かつ正確な評価、治癒プロセスの知識、および市場で入手可能な多くの被覆材の具体的な知識を必要とする。患者および経済的な要素も考慮しなければならない。

すべての要素の慎重な考慮なしでは、被覆材の選択は、おそらく、恣意的で潜在的に無効である。

暖かく湿った創傷環境が治癒を促進し、組織の脱水および細胞の死を防止することは広く受け入れられている。もっとも近代的な創傷ケア製品はこれらの条件を提供するものと指摘されている。

利用可能な幾つかのタイプの創傷ケア被覆材が存在する。もっと一般的に用いられるものうちにはヒドロゲル、ヒドロコロイド、アルギン酸塩、ポリマーフィルムおよびポリマーフォームがある。各々の製品タイプは一般的な特徴を有するが、特定のブランドの各々の構成、したがって、その性能は、特性の製品タイプのうちで相当に変化し得る。すべての創傷タイプにおいて、もしくは治癒のすべての段階で用いるのに適する単一の製品は存在しない。

特定のタイプの創傷への適用のその適合性を決定する被覆材の主な特性には、身体に対するその追従性（完全な創傷の閉鎖の維持に望ましい）、流体および臭気吸収特性、取り扱いおよび接着特性、並びに、適切であるならば、抗菌および止血活性の存在が含まれる。製品の選択に影響を及ぼし得る他の要素には、感受性反応を生じる被覆材の潜在能力、適用および除去の容易さ（創傷表面に対する痛みおよび外傷の最少化において重要）並びに被覆材交換の間隔が含まれる。被覆材は粒子もしくは繊維を脱落すべきではなく、これは治癒を遅らせるか、もしくはその創傷を感染し易くし得る。それらは細胞成長に有害効果を有することがある抽出性物質を含むべきではない。

深い創傷を完全に充填する（ｐａｃｋｉｎｇ）ことは水分相互作用性創傷治癒に重要であり、これは細菌障壁を確実にし、および感染率を低下させ、水分喪失を減少し、並びに痛みを最少化する。腔を確実に完全に充填するとき、被覆材はしばしば創傷内に押し込まれ、組織をさらに損傷させる。

ヒドロゲル創傷被覆材は、とりわけ、それらが痛みを和らげ、冷感をもたらし、および創傷表面の水分補給の制御をもたらすため、火傷、潰瘍および深い創傷、例えば、床づれに特に有用である。多くのアルギン酸塩被覆材とは異なり、それらは創傷に粘着することはなく、予浸することなしに容易に除去することができる。しかしながら、使用が容易ではあるものの、（例えば、脚の潰瘍を充填するとき）創傷腔をヒドロゲル被覆材で完全に満たすことはしばしば困難であり、それ故、ヒドロゲル被覆材がもたらす細菌に対する障壁はしばしば不十分なものであり、感染した創傷での使用には適さないものであり得る。

より多数の望ましい特性を示し、より広範囲の創傷タイプおよび治癒段階に適する、より「万能」である創傷被覆材に対する必要性が明らかに存在する。

特には、ヒドロゲル被覆材の利益を備えるが、優れた抗菌特性並びにあらゆる形状およびサイズの創傷腔を完全に充填する能力を有する被覆材が現行のヒドロゲルを上回る有益な改善を提供する。

さらに、その上、活性成分、例えば薬物、を創傷部位に制御された様式で送達する創傷被覆材がさらに有益なものである。望ましい活性成分は、例えば凝血を促進することにより、感染との格闘もしくはそれに対する防御を助力し、痛みを減少させ、炎症を減少させ、および／または治癒を促進してもよい。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質は、それを創傷治癒に特に有益なもとする幾つかの特性を示すことが見出されている。例えば、広範な薬物分子を可逆的に結合することにより、ＨＳＡは薬物送達に制御放出機構を付与することができる。ＨＳＡは、創傷の抗感染治療において重要であり得、並びに創傷部位を解毒し、およびフリーラジカルを捕捉し得る、金属イオン（例えば、亜鉛、銅および銀）を結合する。病理学的血小板凝集がＨＳＡによって阻害され、炎症性化学物質レベル（および、したがって、掻痒）も減少する。ＨＳＡは非アレルギー性であり、抗菌／抗ウイルス活性を創傷部位に自然に付与し得る。

アルブミンは幾つかの他の医学用途、例えば、血液容積の増加に用いられる。ＷＯ ９９／６６９６４は生体接着剤、外科用シーラント、並びに薬物送達および補綴用の移植可能な装置として用いるためのアルブミン系組成物に関する。これらの組成物の接着特性はそれらを外部創傷被覆材として用いるのに不適切なものとし、および、これらの組成物は体内で分解することが意図されているものの、内部使用の適合性も望ましくない接着によって制限される。外科的処置の後、損傷した組織を再接合することを意図する接着剤は、創傷部位を隣接する組織／臓器に結合させてさらなる損傷を生じる場合がある。
ＷＯ ９９／６６９６４

ＷＯ ９９／６６９６４は、アルブミン分子間の架橋の速度および／または程度の変更へのアクセサリ分子の使用を開示する。ジカルボン酸がウシ血清アルブミンのゲル化を促進し得ることが述べられている。しかしながら、我々は、ＷＯ ９９／６６９６４に従って形成される生成物が本発明のポリマーと比較して乾燥し、かつ脆いことを見出した。そのような脆弱な生成物は創傷被覆材としての使用には不適切である。
いまや、上述の、および／または他の従来技術に関連する不都合を克服または実質的に緩和する創傷被覆材を形成する方法が考案された。

本発明の第１の態様によると、創傷被覆材を形成するための方法であって、タンパク質を多官能性スペーサーもしくはその活性化誘導体と反応させることによってタンパク質ポリマーを形成することを含む方法である。

この創傷被覆材は原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成してもよい。「原位置で」が本発明との関連において意味するところは、被覆材を形成するタンパク質と多官能性スペーサーとの反応が創傷部位で生じることである。組成物の成分を創傷部位に同時に、もしくは迅速に連続的に塗布してもよく、または成分を使用直前に混合した後、その混合物を創傷部位に塗布してもよい。

創傷被覆材の原位置形成は、被覆材が創傷の正確な形状を獲得し、露出された組織を悪化させることなく創傷腔を完全に充填するので特に有益である。この正確な一致は創傷が完全に封止されることを保証する。

支持基体を、ゲル化が生じる前もしくはゲル化プロセスの間に組成物に添加することにより、原位置で被覆材内に組み込んでもよい。特には、ポリマーゲルの乾燥を防止し、および、より重要なことには、創傷を湿潤状態に保つ水蒸気透過性膜で組成物を覆うことが好ましいものであり得る。この水蒸気透過性膜は、好ましくは、ゲル化プロセスの最後に添加され、そうすることでしっかりとかつ均一に結合するが組成物中に極端に沈むことがない。

本発明の創傷被覆材は予備形成（すなわち、創傷部位に適用する前に架橋させる）してもよい。そのような被覆材は、支持基体の有無に関わらず、タンパク質ポリマーが含浸された包帯、もしくはゲルシートの形態をとってもよい。特定の形状およびサイズのゲルを特定の創傷タイプもしくは身体領域に合わせて特別に成形してもよい。あるいは、適切なサイズの被覆材を適用直前により大きなゲルシートから切断してもよい。

「タンパク質ポリマー」が本発明との関連において意味するところは、多官能性スペーサーから誘導される連結基によって共に連結される複数の完全なタンパク質単位で構成されるポリマー種である。共に共有結合するアミノ酸残基の鎖で構成されるという意味で、個々のタンパク質分子が「ポリマー性」であることは理解されるであろう。そのような個々のタンパク質分子はここで用いられる用語の意味のうちでは「タンパク質ポリマー」ではない。そうではなく、タンパク質ポリマーは、個々のタンパク質分子が共にカップリングし、連結基を介して共に共有結合するそのような分子鎖もしくはマトリックスを形成することによって生成される反応生成物である。

本発明において用いることができるタンパク質には、球状タンパク質および繊維状もしくは構造タンパク質、並びにそれらの混合物が含まれる。

球状タンパク質の例には、合成もしくは天然血清タンパク質、それらの天然もしくは合成誘導体、塩、それらの酵素的、化学的、もしくは他の様式で修飾、開裂、短縮化もしくは架橋された、酸化もしくは加水分解誘導体又はサブユニットが含まれる。血清タンパク質の例はアルブミン、α−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、トロンビンおよび他の凝結因子である。繊維状もしくは構造タンパク質の例には、合成もしくは天然コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブリン、およびフィブロネクチン、それらの天然もしくは合成誘導体、並びにそれらの混合物が含まれる。

特に好ましいタンパク質はアルブミンである。

本発明に従って調製されるタンパク質ポリマーがヒト身体への投与を目的とする場合、用いられるタンパク質は、好ましくは、ヒト起源のもの、すなわち、実際にヒトに由来するもの、もしくは構造上ヒト起源のタンパク質と同一（もしくは実質的に同一）である。したがって、特に好ましいタンパク質はヒト血清アルブミンである。

ヒト血清アルブミンは血清に由来するもの、例えば、提供血液から得られるものでもよい。ヒト血清アルブミンは分画血液製品として容易に入手可能であり、長年、血液増量剤として静脈内送達に安全に用いられている。しかしながら、血液由来製品中に存在し得る潜在的な汚染物質、例えば、ウイルスもしくは他の有害作用物質の伝染の危険性を排除もしくは低下させ、その上、提供血液から単離される物質に関連する供給に対する潜在的な制限を排除もしくは低減するため、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンは、そのタンパク質を発現するように形質転換もしくはトランスフェクトされている（細胞株を含む）微生物、トランスジェニック植物もしくは動物に由来する組換え生成物であってもよい。

獣医学的用途には、適切であるとき、非ヒト動物由来タンパク質を用いてもよい。そのようなタンパク質の例には、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン等が含まれる。

タンパク質の混合物、すなわち、２以上の異なるタンパク質を用いることができる。

スペーサーが反応することができるタンパク質分子上の官能基にはアミノ基が含まれる。したがって、好ましいタンパク質には比較的高い割合のアミノ酸残基を有するタンパク質が含まれ、このアミノ酸残基にはフリーのアミノ基、特には、ＮＨ₂基が含まれる。そのようなアミノ酸残基の一例はリジンであり、したがって、本発明における使用に特に好ましいタンパク質にはリジン残基を含むタンパク質、特には、高い割合のリジン残基、例えば、タンパク質分子あたり２０を上回るリジン残基、より好ましくは、３０を上回る、もしくは４０を上回るリジン残基を有するタンパク質が含まれる。

本発明において用いることができる多官能性スペーサーには、ポリカルボン酸、ポリアミン、ポリ（カルボキシ／アミノ）化合物（すなわち、多数のカルボキシルおよびアミノ基を有する化合物）、ポリアルコール、ポリケトン、ポリアルデヒド、およびポリエステルが含まれる。

ポリカルボン酸もしくはポリアミンスペーサーが好ましく、より好ましくは、ジカルボン酸もしくはジアミンである。

ポリカルボン酸にはクエン酸およびポリアクリル酸が含まれる。

好ましいスペーサーは二官能性スペーサー、特には、ホモ二官能性スペーサーである。

ポリアミンにはポリリジンおよびキトサンが含まれる。

特に好ましいスペーサーはジカルボン酸である。

ジカルボン酸スペーサーは、最も好ましくは、アルキレンジカルボン酸、特には、式：
ＨＯＯＣ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ
の直鎖アルキレンジカルボン酸分子であり、式中、ｎは１ないし約２０である。好ましくは、ｎは２ないし１２、より好ましくは、３ないし８である。

好ましい直鎖アルキレンジカルボン酸スペーサーは以下のものである：

直鎖アルキレンジカルボン酸は、単にアルキレン鎖の長さを変化させることによって、得られたタンパク質ポリマーの特性が変化し得るため、特に有用なスペーサーである。一般には、固定されたタンパク質濃度で、ジカルボン酸鎖長の増加に従ってゲル化時間が減少し、ポリマーがより硬く、弾性が少なく、より濁ってくる。その化学は単純であるが、小数の変数のみを調整することによって広範なタンパク質ポリマー系を調製することができる。高度の制御を促進する他、ポリマーの特性を組成および反応条件から合理的に予想することができる。

スペーサーとタンパク質分子との反応を促進するため、スペーサーを活性化する、すなわち、スペーサーの官能基をタンパク質中の基に対するより大きな反応性を有する官能基に変換することが一般に望ましい。適切な活性化化学は当該技術分野における熟練者に馴染みのあるものであり、活性エスエル基の形成が含まれる。

ジカルボン酸スペーサーと共に用いるのに適する活性化因子の特定のクラスの１つはカルボジイミド化合物であり、本発明において用いるのに特に好ましい活性化因子はエチル［ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド（ＥＤＣ）である。本発明の一実施形態においては、ジカルボン酸（好ましくは、長さがＣ６−Ｃ１０）をタンパク質溶液に添加する。ＥＤＣをその混合物に添加し、反応を進行させる。タンパク質溶液の濃度、ジカルボン酸のタンパク質に対する割合、ＥＤＣの量および時間はすべて望ましい結果に重要である。ＥＤＣは−ＣＯＯＨ基を活性化し、タンパク質上のフリーのアミノ基との連結を可能にする。

反応の制御は、重合を制御して可溶性ポリマー、不溶性粒子もしくはゲルを同じ反応混合物から得ることができることを意味する。出発タンパク質濃度からポリマーへの９５％を上回る変換を得ることができ、ゲルへの１００％までの変換を得ることができる。

ジカルボン酸スペーサーの省略およびＥＤＣのみの使用（上で説明される条件下での）は数時間ないし数日の期間にわたる部分的な重合につながるだけであり、ジカルボン酸が用いられるときに得られるものと比較してポリマーの收率が低い。

一般には、本発明による方法は溶液中で行う。好ましくは、活性化剤、例えばＥＤＣ、をタンパク質およびジカルボン酸の溶液に添加する。ＥＤＣは、例えば蒸留水での、溶液の状態であってもよく、またはタンパク質およびジカルボン酸の溶液に固体形態、例えば、粉末で添加してもよい。原理的には、まずジカルボン酸をＥＤＣで活性化した後、その活性化されたスペーサーをタンパク質溶液に添加することも可能であるが、これは、実際には、ＥＤＣをタンパク質およびスペーサーの混合物に添加することによって得られるものと同じ程度に良好な結果を生じないことが見出されている。

適用を容易にするため、反応物質を、水、生理食塩水もしくは緩衝溶液が適用の直前に添加される混合乾燥粉末として処方することが望ましいものであり得る。タンパク質およびジカルボン酸はＥＤＣの添加なしには反応することができず、それ故、試薬を粉末として時期尚早の反応の危険性なしに貯蔵するため、例えば、別々の小袋（ｓａｃｈｅｔ）に封入することにより、タンパク質／ジカルボン酸粉末をＥＤＣ粉末と分離して保持することが望ましいものであり得る。好ましい適用方法はタンパク質／ジカルボン酸の溶液およびＥＤＣ粉末を収容し、その溶液と粉末とが壊れやすい膜によって分離されるシリンジである。シリンジのプランジャを押すことにより、使用者は適用の直前にその膜を破壊し、試薬を混合させる。

創傷部位への溶液の適用は、その溶液を注ぎ、塗布し、もしく噴霧することによるものであり得る。

創傷被覆材が治療上活性の成分を創傷部位に送達することが望ましいものであり得る。薬物、例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、止血剤、鎮痛剤（ｐａｉｎ ｋｉｌｌｅｒ）およびファージを直接、もしくは創傷部位からの吸収を促進する坦体、例えば、リポソームを介して、組成物に添加してもよい。組織修復を促進もしくは改善する活性剤、例えば、成長因子、抗瘢痕剤、および血管形成を促進する物質を組み込んでもよい。感染を排除および浸出液を吸収することにより、悪臭のひどい創傷の臭気を減少させることができる。しかしながら、臭気の原因である揮発性分子を吸収する物質を被覆材に組み込むことによっても、創傷の臭気は減少／除去され得る。

組み込まれた活性化合物は、ゲルから浸出することにより、およびそれが分解するときにゲルから放出されることにより、創傷部位に送達される。活性物の放出速度の決定において鍵となる要素はタンパク質ポリマーの柔らかさ／硬さである。活性化合物はより柔らかいポリマーからより容易に浸出し、これはそれらが架橋するタンパク質分子によって効果的に保持されていないためである。より柔らかいポリマーはまた、そのより粗い構造が水分および酵素を容易に浸透させるため、より速い速度で分解する。

本発明の別の態様によると、上で説明される方法によって調製される創傷被覆材、すなわち、タンパク質を多官能性スペーサーもしくはその活性化誘導体と反応させることによって形成されるタンパク質ポリマーを含む創傷被覆材が提供される。

本発明の特に好ましい化学は、幾つかの他の治療用途に適するタンパク質ポリマーを生成することが見出されている。

したがって、本発明の別の態様によると、タンパク質ポリマーの形成方法であって、タンパク質がウシ血清アルブミンではないという条件で、タンパク質をジカルボン酸もしくはその活性化誘導体と反応させることを含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様は、タンパク質ポリマーの形成方法であって、タンパク質をアルキレンジカルボン酸もしくはその活性誘導体と反応させることを含む方法である。

このタンパク質は、好ましくは、アルブミン、特には、ヒト血清アルブミンである。

反応物質および反応条件の適切な選択により、様々な特性を有する生成物を調製することができる。したがって、タンパク質ポリマーは可溶性形態、不溶性粒子の形態、もしくはゲル形態で調製されてもよい。ゲル形態は非常に粘着性のものから柔らかいが非接着性のものまで変化させることができ、硬度は変形の少ない非常に硬いゲルまで漸増させることができる。これらの異なる結果を達成するために変化させることができるパラメータには、タンパク質出発物質の選択、スペーサーの選択、様々な反応体の濃度、反応温度および様々な反応工程の持続時間が含まれる。

ゲル形成の速度も、ゲルの形成に用いられる試薬の比率および温度を制御することにより、数秒から数分ないし数時間まで、広い範囲にわたって変化させることができる。

ゲル化反応は弱酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ＝５−６）で最良に行われる。しかしながら、ゲルの最終ｐＨを生理学的ｐＨ近傍まで上昇させることがしばしば好ましい。最終ゲルのｐＨを制御する幾つかの方法が存在する。アプローチの１つはタンパク質のジカルボン酸に対するモル比を変化させることである。低レベルのジカルボン酸が生理学的ｐＨ近傍のゲルをもたらす。第２のアプローチはタンパク質のＥＤＣに対するモル比を変化させることである。高ＥＤＣレベルがより高いｐＨのゲルを生じる。当該技術分野における熟練者には、特定の用途に必要とされるゲル粘ちょう度を望ましいｐＨで達成する条件の均衡を見出すことが可能であることが理解できる。

ゲル化反応は、最初のゲル化に第２の「硬化」段階が続く二相反応でもよい。この反応はＨＳＡ、ジカルボン酸およびＥＤＣの特定の組み合わせ、例えば、ＥＤＣのレベルが低すぎる場合には、硬化段階に進まない。その代わりに、ゲル化およびゲル再溶解の後にはｐＨの低下が観察される。反応を硬化段階まで推し進めるためには、最小限のパーセンテージのカルボン酸基がＥＤＣによって活性化されなければならないものと考えられる。ｐＨの低いポリマーは、一般には、未反応のカルボン酸基がスペーサーおよびＨＳＡ上に存在するため、安定性に劣る。

さらなる化合物の添加が有利なものであり得る。例えば、（上記創傷被覆材に関連して説明される）薬物および制御放出用の他の活性化合物、並びに／またはポリマーの特性を変更する、例えば、水を放出し、柔軟性に影響を及ぼし、吸収性、皮膚感および美観、機械的および／もしくは接着強度を改善し、もしくはタンパク質ポリマーの分解プロフィールを変更する他の修飾剤の添加。

エタノール、グルコースおよびグリセロールが本発明のタンパク質ゲルに添加することができる化合物の例である。

よく知られた静菌剤であるエタノールを添加してゲルの抗菌特性を改善することができ、グルコースはエネルギー源を提供し、それにより細胞の成長を促進し、およびグリセロールは水分喪失の防止を助力し、かつ創傷部位でのゲルの一体性を維持する。

グルコースは慢性創傷で用いるための本発明の創傷被覆材において特に有用であり得る。これは、慢性創傷が一般に血液供給に劣り、それ故にエネルギー供給に劣り、したがって細胞成長が劣るためである。

我々は、エタノール、グリセロールもしくはグルコースの添加が、脆性をさらに低下させることにより、ポリマーの粘ちょう度を改善することを見出した。

修飾剤をＨＳＡおよびジカルボン酸に一工程で添加することが可能ではあるものの、（エタノール、グルコースもしくはグリセロールを用いる）実務において、我々は、特定のパーセンテージのＨＳＡを修飾剤で修飾した後に残りの被修飾ＨＳＡおよびカルボン酸スペーサーと混合することがより有効であることを見出した。したがって、修飾剤を水性ＨＳＡに添加し、ＥＤＣを添加してその反応を促進する。修飾ＨＳＡおよびエタノール溶液を被修飾ＨＳＡおよびジカルボン酸の溶液に添加し、この「ゲル化溶液」をＥＤＣと反応させてゲルを形成する。

タンパク質の修飾がタンパク質ポリマーの物理的特性を改善するのに用いられるのと同様に、修飾ＨＳＡは治療薬としての有用性を有してもよい。例えば、脱リガンドアルブミンは毒素、サイトカイン等を捕捉および除去し得る利用可能な結合部位を有する。

ポリマーは、低タンパク質濃度を用いて、可溶性形態で調製されてもよい。可溶性ポリマーは中性ｐＨでより容易に生成される。低濃度および中性ｐＨは適切な緩衝剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を添加することによって容易に達成される。可溶性ポリマーは非経口送達に適し、送達ビヒクルとしての幾つかの用途、例えば、薬物の送達、画像診断技術において有用な造影剤の送達、または血小板代替物もしくは賦活剤（止血剤の送達）としての用途を有する。

血小板代替物および／または賦活剤の需要は癌患者の治療におけるそれらの適用によって推し進められている。癌治療の副作用の１つが血小板の劇的な減少、すなわち、血小板減少症である。その状態は、現在、血液由来血小板の輸液で治療されるが、化学療法のレジメがさらにより積極的になり、骨髄移植の使用が増加するに従い、血小板に対する要求が増加している。さらに、血液由来血小板は、ウイルス感染を伝染し、貯蔵中に不安定になり、および免疫反応を生じる可能性がある。

「血小板代替物」および「血小板賦活剤」という用語は、不正確であろうと便宜上であろうと、しばしば同じ意味で用いられる。「血小板代替物」が本発明との関連において意味するところは、天然に産生される血小板の存在を必ずしも必要としない完全な血小板の代替物である。他方、「血小板賦活剤」は創傷部位での血小板血栓の自然形成を必要とし得る（および、それ故、天然血小板数が閾値レベルを上回る必要があり得る）。その後、血小板賦活剤は血小板塞栓に凝集して血塊を形成し、それにより血栓形成条件における血小板の活性を改善する。血小板代替物／賦活剤は、本発明に従い、凝血剤もしくは他の活性ペプチド誘導体をポリマーの表面に、それらの生化学的活性が維持されるような方法で、固定することによって調製されてもよい。特には、本発明のタンパク質ポリマーを、血小板表面上に発現する特定の受容体を介する血小板の粘着および凝集を促進もしくは調節するような物質と結合させてもよい。一例はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体であり、これはフィブリノーゲン、フィブリノーゲンの活性ペプチドおよびフォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子と相互作用する。フィブリノーゲンと結合する方法は、タンパク質ポリマーをチオール化し、Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジドでフィブリノーゲンを活性化し、そしてタンパク質ポリマー上のチオール基を介する活性化フィブリノーゲンを結合すること含む。血小板代替物／賦活剤は静脈内注入によって送達することができ、血管内の内部創傷部位で活性化される。

送達ビヒクルとして、タンパク質ポリマーは薬物の徐放もしくは制御放出に適する。さらに、活性剤の送達により、またはそれらの吸収特性のため、本発明のタンパク質ポリマーは解毒用途に有用であり得る。

これらのタンパク質ポリマーは、独立に標的化するのが困難である身体の領域への薬物送達を自然に強化し得る。より好ましくは、タンパク質ポリマーは、体内の特定の部位との親和性を有する１以上の標的化部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）と結合してもよい。適切な標的化部分は抗体であり得る。抗体はそれ自体で治療薬として作用してもよく、さもなくば１以上の二次薬剤、例えば、細胞毒、標的化抗癌治療用の放射性核種、またはワクチンもしくは遺伝子を結合させてもよい。標的化部分は特定の器官もしくは疾患部位との親和性を有してもよく、その位置への二次薬剤の送達を強化してもよく、および／またはそれらの薬剤の生体分布を、例えば薬剤を特定の器官、例えば肝臓、内に集積させることにより、変化させ、それによりその器官を標的としてもよい。

同様に、本発明のタンパク質ポリマーを標的化部分および造影剤と結合させることができる。造影剤は磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）もしくは核画像診断において、または放射線療法における治療薬として、有用な金属であり得る。

不溶性タンパク質粒子は、低タンパク質濃度を維持しながら、活性化剤に対するジカルボン酸スペーサーの濃度を増加させて、および／または反応時間を増加させて調製することができる。あるいは、不溶性粒子は、本発明の可溶性タンパク質ポリマーを有機溶媒、例えば、アセトン中に分散させることによって生成することもできる。

本発明の方法を用いて、異なる硬度（軟質から硬質）および異なる接着強度を有するタンパク質ポリマーゲルを生成することができる。

本発明の非接着性タンパク質ゲルは、隣接する組織膜の間に障壁を形成することにより、外科的処置後の組織癒着の防止もしくは阻害において有用である。試薬および反応条件を調整することにより、ポリマー分解速度を選択することができ、例えば、創傷に治癒に従って分解するようにポリマーを設計することができる。ゲルの原位置形成は、望ましい厚みへの、特定の領域の全体的な被覆を保証する。ゲルは薄膜として塗布することができ、さもなくば組成物をより大きな腔に、その腔が充填されるように、注ぎ入れることができる。

また、本発明の接着性ゲルを組織同士の結合、例えば、切創、裂創、穿孔および／または組織における流体もしく気体の漏出の封止に用いることができる。繊細な組織の縫合およびステープル処理それ自体が組織の損傷／弱体化を、したがって、問題、例えば、生物学的流体の漏出もしくは細菌感染を生じ得ることは十分に理解される。生体接着剤は組織を結合する手段を提供するものと説明されている。しかしながら、これらの組成物で完全に満足のいくものであることが見出されているものはない。真に安全かつ効率的であり、その特性を組織の性質および損傷の程度に適合するように容易にあつらえることができる有効な生体接着剤組成物に対する必要性が依然として存在する。

同様に、タンパク質ゲルは補綴材および手術器具、例えば、カテーテルもしくはステントのコーティングに適する。そのようなコーティングは、望ましい位置における装置の保持を補助する生体接着特性を有していてもよい。ポリマーにおける天然タンパク質、特には、ＨＳＡの使用は、埋め込まれたもの（ｉｍｐｌａｎｔ）が異物の導入に対する身体の自然防御によって拒絶される危険性を低下させる。

本発明のタンパク質ポリマーは、診断（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ）もしくは処理、例えば、幹細胞など、細胞の成長における使用のためのガラスもしくはプラスチックプレートのコーティングに適する。

硬質ゲルは高レベルのジカルボン酸スペーサーおよび／またはＥＤＣを用いて調製してもよい。本発明の硬質ゲルは、人工骨インプラントもしくは他の補綴装置として、骨もしくは軟骨の強化および／または修復に用いてもよいと考えられる。このゲルは原位置で形成してもよく、または型内で予備形成してもよい。

本発明を、説明のためだけに、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に説明するが、これらの実施例は以下を実証する。
・成分濃度および組成、ｐＨおよび時間の観点での反応条件の変更で異なる形態のポリマーを生成することができる。
・可溶性ポリマーは、中性ｐＨで、低タンパク質濃度を用いてより容易に生成される。
・反応におけるスペーサーおよび活性化剤のレベルを増加させることで不溶性粒子が生成され、これは可溶性ポリマーを有機溶媒と混合するときにも生成される。
・タンパク質濃度を増加させ、反応のｐＨを低下させることでゲルが生成する。さらに、ゲル成分の比率、タンパク質濃度およびｐＨまたはこれらの要素の組み合わせを変化させることにより、このゲルの物理的特徴（軟質から硬質および接着特性）を変更することができる。これは、創傷被覆材、ゲルインプラントおよび生体接着剤を含む、治療用途のゲルの生成において重要な要素である。

略語
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ エチル［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド
ＥＭＣＨ Ｎ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド
ＨＳＡ ヒト血清アルブミン
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水

実施例１：可溶性タンパク質ポリマーの形成

１．１ セバシン酸を用いるＨＳＡの可溶性ポリマーの形成
ＤＭＳＯ ２．５ｍｌ中のセバシン酸（１４６ｍｇ）を１０ｍｌの２０％ＨＳＡ溶液（ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）および２０ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳバッファ、ｐＨ＝７．４に、攪拌しながら、その溶液が透明になるまで添加した。ＰＢＳバッファ７．５ｍｌ中のＥＤＣ（２７６ｍｇ）をその溶液に添加し、１６時間（一晩）攪拌した。生じる溶液を遠心して少量の不溶性ポリマーを除去した。可溶性画分を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムで、標準条件を用いてゲル濾過した。タンパク質の溶離はＡ_280nmで測定した。その結果を図１に示す。モノマーＨＳＡは〜３４０ｍｌで溶離した。

１．２ アジピン酸を用いるＨＳＡの可溶性ポリマーの調製
５０％エタノール １ｍｌ中のアジピン酸２６．３ｍｇを５ｍｌの２０％ＨＳＡ溶液（ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）および２５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳバッファ、ｐＨ＝７．４の攪拌溶液に添加し、その溶液が透明になるまで攪拌した。ＰＢＳバッファ４ｍｌ中のＥＤＣ、６９ｍｇをその溶液に、攪拌しながら、滴下により添加した。生じる溶液をさらに２時間攪拌した。生じる溶液を遠心して少量の不溶性ポリマーを除去した。可溶性画分を（上記実施例１．１と同様に）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムで、標準条件を用いてゲル濾過した。

１．３ 血小板代替品を生成するためのフィブリノーゲンの可溶性ＨＳＡタンパク質ポリマーへの連結
この例においては、凝結因子、フィブリノーゲン、をＨＳＡ可溶性ポリマーの表面に、フィブリノーゲンの生化学的活性が維持されるような方法で、固定化することによって血小板代替物（賦活剤）を調製する。この血小板代替物は静脈内輸液によって送達することができ、血管内の内部創傷部位で活性化する。

１．３．１ 可溶性タンパク質ポリマーの調製
ＤＭＳＯ １．２５ｍｌ中のセバシン酸（３０ｍｇ）をＰＢＳバッファ（０．０１Ｍ；ｐＨ＝７．４）１５ｍｌ中の２０％ＨＳＡ溶液（ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）５ｍｌに添加し、その溶液が透明になるまで攪拌した。ＰＢＳバッファ４ｍｌ中のＥＤＣ（５７ｍｇ）をそのＨＳＡ／スペーサー溶液に添加し、室温で３時間攪拌した。
様々な炭素鎖長の他のジカルボン酸をセバシン酸の代わりに上記反応において用いることができる。

１．３．２ タンパク質ポリマーのチオール化
２−イミノチオラン（２１０ｍｇ）を固体としてポリマー溶液に添加した後、暗所において室温で１．５時間インキュベートした。次に、そのポリマーを、０．０１Ｍ；ｐＨ＝７．４ ＰＢＳ溶液中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムで、標準条件を用いてゲル濾過することによって脱塩した。

１．３．３ ポリマーにカップリングするためのフィブリノーゲンの活性化
０．０５Ｍリン酸バッファ１０ｍｌ中のフィブリノーゲン（７５０ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ中の１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム２．５ｍｌと混合し、暗所において室温で３０分間インキュベートした。次に、活性化されたフィブリノーゲンを０．０１Ｍ；ｐＨ＝７．４ ＰＢＳ溶液中で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムでのゲル濾過によって脱塩した。それらの活性化糖をヒドラジド、この例においてはＮ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（ＥＭＣＨ）（１１ｍｇ）と、暗所において室温で２時間反応させた。

１．３．４ 活性化フィブリノーゲンとタンパク質ポリマーとの結合
活性化ＥＭＣＨ−フィブリノーゲン溶液をイミノチオール化ポリマー溶液に添加し、一晩攪拌した。生じる溶液を遠心してあらゆる不溶性物質を除去した後、０．０１Ｍ；ｐＨ＝７．４ ＰＢＳ溶液中、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムでゲル濾過した。

実施例２：不溶性粒子の形成

２．１ 水溶液中での不溶性粒子の形成
不溶性タンパク質ポリマー粒子は、実施例１に類似する方法により、しかしながら低タンパク質濃度を維持しながらジカルボン酸スペーサーおよびＥＤＣの濃度を増加させ、および／または反応時間を増加させることで調製することができる。
ＨＳＡ（１ｍｌ ２０％；ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）およびグルタル酸を蒸留水３ｍｌ中、１／４０のモル比で混合した。蒸留水１ｍｌ中のＥＤＣをその攪拌溶液にＨＳＡ／ＥＤＣのモル比１／１２０で添加した。その溶液を室温で３時間攪拌した後、遠心した。沈殿を蒸留水で洗浄した後、乾燥させた。

２．２ 有機溶媒中での不溶性粒子の形成
不溶性粒子は、上記実施例１において生成された可溶性ポリマーを有機溶媒、例えば、アセトン中に分散させることによって生成することもできる。
１容積の可溶性ポリマー溶液（実施例１）を１０容積のアセトンと室温で１５分間混合した。生じる粒子は遠心もしくはデカントによって集めることができた。

実施例３：タンパク質ポリマーゲルの形成

３．１ セバシン酸および高濃度のＨＳＡ溶液を用いるＨＳＡポリマーゲルの調製
ＤＭＳＯ １ｍｌ中に４８．５ｍｇのセバシン酸の溶液を４ｍｌのＨＳＡ ２０％溶液（ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）に添加した。その溶液を透明になるまで攪拌した。蒸留水２ｍｌ中に９２ｍｇのＥＤＣの溶液を添加した。この反応におけるＨＳＡの最終濃度は１１４ｍｇ／ｍｌであった。ＨＳＡ／セバシン酸／ＥＤＣの最終モル比は１／２０／４０であった。

得られる混合物はＥＤＣ添加の３０秒後にゲルを形成した。
この例と等しいがジカルボン酸が存在しない実験においては２時間後にゲルが生成したことが注目された。この場合におけるゲルの特性は創傷被覆材に適するものではなく、硬く脆い性質であり、これはそれらの適用および除去を困難なものとする。原位置でゲル化する時間は実用には長すぎるものであろう。

３．２ セバシン酸および低濃度のＨＳＡ溶液を用いるＨＳＡポリマーゲルの調製
ＨＳＡの最終濃度が７２ｍｇ／ｍｌであったことを除いて、実施例３．１において説明されるものと同じ実験手順を用いた。ＨＳＡ／セバシン酸／ＥＤＣの最終モル比は１／２０／４０であった。
得られる混合物は５分未満にゲルを形成した。

３．３ アジピン酸および高濃度のＨＳＡ溶液を用いるＨＳＡポリマーゲルの調製
アジピン酸、３５ｍｇ、を４ｍｌの２０％ＨＳＡ溶液（ＢＰＬ、Ｚｅｎａｌｂ）に溶解した。蒸留水２ｍｌ中に９２ｍｇのＥＤＣの溶液を上述のように添加した。ＨＳＡ／アジピン酸／ＥＤＣの最終モル比は１／２０／４０であった。
得られる混合物は２分後に軟質ゲルポリマーを形成した。

３．４ ヘモグロビンを含有するゲルの調製
ＨＳＡ（３００ｍｇ）およびヘモグロビン（１００ｍｇ）、セバシン酸（ＤＭＳＯ ０．５ｍｌ中に２４．２５ｍｇ）、ＥＤＣ（蒸留水１ｍｌ中に４６ｍｇ）および２ｍｌのＰＢＳバッファ（上記と同様）を一緒に混合し、８０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得た。
１０分後にゲルが形成された。

実施例４：ゲルの特徴に対するスペーサーの長さの効果
ジカルボン酸スペーサー鎖長の変化の効果を測定するため、様々な濃度のＨＳＡおよび４種類の異なるジカルボン酸スペーサーを用い、ＥＤＣを賦活剤として用いてタンパク質ポリマーゲルを調製した。

ＤＭＳＯ中のジカルボン酸溶液（２５０μｌ中１２０μモル）もしくは（２５０μｌ中９０μモル）を１ｍｌの２０％ＨＳＡ水溶液に、４０／１および３０／１のジカルボン酸／ＨＳＡモル比で添加した。その溶液を透明になるまで室温で攪拌した。その後、ＥＤＣの水溶液を、ＥＤＣ／ジカルボン酸モル比２／１で添加した。ゲル化時間およびゲルの特性を下記表１〜３に詳述する。

このゲル化反応は二相反応である：最初のゲル化に第２の「硬化」段階が続く。ゲル化時間は最初に観察されるゲル化に関し、ゲル硬度は「硬化」後のゲルの最終状態を指す。

各々のＨＳＡ濃度で、ジカルボン酸鎖長の増加に伴ってゲル化時間は減少し、ゲルは一般により硬質で、弾性が少なく、かつより濁るようになる。ＨＳＡ濃度を増加させるとゲル化時間が減少し、ゲルの硬度が増加する。

実施例５：ゲル化時間およびゲル特性の制御
ゲルの異なる用途は異なるゲル化時間およびゲル粘ちょう度を要求する。ゲルは数秒で、もしくはより長時間にわたって形成することができる。ゲルは極度に軟質で「粘着性」であるか、または非常に硬質でゴム状であり得る。これらのパラメータを制御しようとする幾つかのアプローチが存在し、いかなる用途にも、以下のアプローチのいずれかもしくはすべてを用いることができる。以下で説明されるすべてのゲルは他に述べられない限り透明であった。

５．１ ＨＳＡのジカルボン酸スペーサーに対するモル比を変更することによるゲル化時間およびゲル特性の制御
グルタル酸（ＧＡ）をＨＳＡ水溶液（２０％ ＵＳＰ）に室温で溶解した後、ＥＤＣの蒸留水溶液を添加してゲル化反応を活性化することによってゲルを生成した。ゲル化混合物を穏やかに数回反転させて完全な混合を確かなものとした。

ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比は、２つのＥＤＣ濃度で、１／０から１／４０まで変化させた。実験結果を下記表４および５に示す。

最初にグルタル酸のレベルを増加させることでゲル化時間が減少し、より硬質のゲルが生成する。しかしながら、より高レベルのグルタル酸ではゲルは不安定であり、これはＥＤＣのレベルを増加させることによって相殺することができる。これは実施例６において考察される。

５．２ ＨＳＡ濃度を変化させることによるゲル時間およびゲル特性の制御
実施例５．１において説明される方法を用いてゲルを調製した。ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比１／５およびＨＳＡのＥＤＣに対するモル比１／７０を用いた。ＨＳＡの濃度は１８２ｍｇ／ｍｌから１２０ｍｇ／ｍｌまで変化させた。結果を下記表６に示す。

ＨＳＡの濃度を減少させることでより長いゲル化時間およびより軟質のゲルが生じる。

５．３ ＨＳＡのＥＤＣに対するモル比を変化させることによるゲル化時間およびゲル特性の制御
実施例５．１において説明されるようにゲルを生成した。ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比１／１０を用い、ＨＳＡの最終濃度は１６６ｍｇ／ｍｌであった。ＨＳＡのＥＤＣに対するモル比は１／３５から１／８０まで変化させた。結果を下記表７に示す。

表７、並びに上記表４および５の比較は、より高レベルのＥＤＣがゲル化時間の短縮およびより硬質のゲルを生じることを示す。

５．４ エタノール、グルコースおよびグリセロールを添加することによるゲル化時間およびゲル特性の制御
さらなる重要なアプローチは、試薬、例えば、エタノール、グルコースもしくはグリセロール（これらのすべては活性−ＯＨ基を有する）と低濃度のＥＤＣの存在下で反応させることによって最初にＨＳＡを修飾することによる、ＨＳＡ「ゲル化溶液」の調製である。エタノールと反応させることによるＨＳＡゲル化溶液の調製を以下に説明する。
５．４．１ エタノールと反応させることによるＨＳＡゲル化溶液の調製

エタノールを滴下により２０％ＨＳＡの攪拌水溶液に添加した。その溶液を透明になるまで攪拌した。固体ＥＤＣをその溶液に添加し（ＨＳＡ／ＥＤＣモル比１／１５）、室温で最小限２時間攪拌した。グルタル酸を２０％ＨＳＡ水溶液に溶解し、室温で３０分間攪拌した。

最終「ゲル化溶液」を調製するため、修飾ＨＳＡ／エタノール溶液を非修飾ＨＳＡ／グルタル酸用液と１／１容積比で混合し、室温で３０分間攪拌した。ＨＳＡのグルタル酸に対する最終モル比は１／５であった。

この混合液、すなわち「ゲル化溶液」、をＥＤＣと反応させ、前述の例と同様にゲルを形成した。

エタノール／ＨＳＡ溶液の容積比は１／７から１／１４まで変化させた。結果を下記表８に示す。

ＨＳＡとエタノールとの最初の反応はゲル化時間の一般的な減少を生じる。低レベルのエタノールではより軟質のゲルが生じる。しかしながら、１０％ｖ／ｖを超えるエタノールはより硬質のゲルを生じる。これらのゲルにおいて脆性は見出されない。それらの硬質性にもかかわらず、それらは柔軟なままである。

実施例５．１において説明される実験を、上述のように調製されるエタノール／ＨＳＡゲル化溶液を用い、１０％ｖ／ｖエタノールおよびモル比が１／０ないし１／４０の範囲のＨＳＡ／グルタル酸を用いて反復した。それらの結果を下記表９および１０に示す。

５．４．２ グルコースと反応させることによるＨＳＡゲル化溶液の調製
実施例５．４．１と同様であるがエタノールをグルコースと置き換え、最終ＨＳＡ／グルコースモル比１／１５および最終ＨＳＡ／グルタル酸モル比１／５でゲル化溶液を調製した。

生成したゲルはグルコースを含まない類似のゲルよりも軟質であり、ゲル化時間は減少した。

５．４．３ グリセロールの添加によるＨＳＡゲル化溶液の調製
グリセロールを２０％ＨＳＡ溶液（ＵＳＰ）に０ないし１６．７の容積パーセンテージで添加した。その後、実施例５．１において説明される方法を用いてゲルを調製した。

グリセロールの添加はゲル化時間を減少させ、覆わないまま室温で２週間放置したとき、ゲルの乾燥の減速が示された。

５．４．４ エタノールもしくはグルコースを直接ゲル化溶液に添加することによるＨＳＡゲル化溶液の調製
実施例５．１で説明される方法においてエタノールもしくはグルコースのいずれかをＨＳＡ溶液に直接添加した後、ゲルの形成に用いる場合、これらの添加物でのＨＳＡ予備修飾工程を含む実施例５．４．１および５．４．２にそれぞれ類似するがそれほど顕著ではない効果が見られた。

実施例６：形成されるゲルの安定性に対するジカルボン酸のレベルの増加の効果
ゲル化溶液中のグルタル酸のレベルを増加させることで、時間と共に軟質ゲルに戻る、当初は中程度から硬質のゲル、または再溶解して粘性溶液を形成する軟質ゲルのいずれかの形成が生じることが示されている。この溶解プロセスの制御はここで説明される様々な用途において薬物の送達を制御する有用な方法であり得る。

実施例５．１において説明される方法に従ってゲルを調製した。ＨＳＡのＥＤＣに対する２種類のモル比で、ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比を１／５から１／３５まで変化させた。結果を下記表１１に示す。

グルタル酸の比率が増加するに従い、ゲル化時間はゲルが形成されないところまで減少した。中間レベルでは、静置時に再溶解して粘性溶液を形成するゲルが生じた。これは反応中のｐＨ変化の結果であることが示された。低レベルのグルタル酸では、ゲル化溶液のｐＨは、ＥＤＣの添加後、ゲルが形成されるまで、６〜７に上昇した。高レベルのグルタル酸では、ｐＨは最初に上昇し、次いで５〜６の酸性ｐＨに向かって再度下降して、軟質ゲルを再溶解させるか、またはゲルの形成を妨げた。

実施例７：ゲルのｐＨの制御
ゲル化反応は酸性ｐＨで最良に実行される。最終ゲルのｐＨを生理学的ｐＨ近傍まで上昇させることができる。ゲルのｐＨを制御する２種類の方法が存在する。アプローチの１つはＨＳＡのジカルボン酸に対するモル比を変化させることである。低レベルのジカルボン酸は生理学的ｐＨに近いゲルをもたらす。第２のアプローチはＨＳＡのＥＤＣに対するモル比を変化させることであり、高ＥＤＣレベルはよりｐＨの高いゲルを生じる。当該技術分野における熟練者には、特定の用途に必要とされるゲル粘ちょう度を望ましいｐＨで達成する条件の均衡を見出すことが可能であることが理解できる。

７．１ 異なる濃度のジカルボン酸を用いるゲルのｐＨの制御
グルタル酸を２０％ＨＳＡ溶液（ＵＳＰ）に溶解し、ＥＤＣの蒸留水溶液を添加して１６６ｍｇ／ｍｌの最終ＨＳＡ濃度を得ることによってゲルを調製した。ＨＳＡのＥＤＣに対するモル比１：３５および１：７０を用いた。それらの結果は上記表４および５に示される。

これらのＥＤＣレベルでは、ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比１：２０以下を用いてゲルを形成することができる。より高いジカルボン酸レベルでは、実施例６において考察されるように、それらが多少なりとも形成される場合、ゲルは不安定である。５．３ないし７．６の範囲のゲルｐＨ値が得られた。

７．２ ＥＤＣのレベルの変動を用いるゲルのｐＨ制御
グルタル酸を２０％ＨＳＡ溶液（ＵＳＰ）に、ＨＳＡのグルタル酸に対するモル比１：１０で溶解することによってゲルを調製した。ＥＤＣの蒸留水溶液を添加し、１６６ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの最終濃度およびＨＳＡのＥＤＣに対するモル比１：３５から１：８０を得た。結果は上記表６に示される。

ＥＤＣのレベルを変化させることにより５．６ないし６．６の範囲のゲルｐＨ値が達成された。これは上記表４および５におけるデータを比較することによっても支持される。ゲル化混合物中のＥＤＣのレベルの増加はより短いゲル化時間およびより硬質のゲルも生じる。

実施例８：生体接着剤の製造
生体接着剤を液体もしくは乾燥粉末のいずれかとして調製した。引っ張り強さは２つの肉片（３ｃｍ²ビーフステーキ）の間にその液体もしくは粉末を塗布することによって測定した。一方の肉片はカードに取り付け、クランプおよびスタンドによって所定位置に保持することが可能であった。重りを第２の下部肉片に取り付け、引っ張り強さを測定した。肉は、重りを負荷する前に、３７℃で５分間インキュベートした。

８．１ ＨＳＡ（４ｍｌ ２０％：ＢＰＬ Ｚｅｎａｌｂ）をグルタル酸およびＥＤＣと、それぞれ、１／５０／１００の比率で混合した。
測定される引っ張り強さは６３ｍｇ／ｍｍ²であった。

８．２ ２００ｍｇの凍結乾燥ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）をグルタル酸およびＥＤＣと、それぞれ、１／５０／１００もしくは１／６０／１４０のモル比で混合することによって乾燥粉末配合物を調製した
引っ張り強さはスペーサーおよびＥＤＣの比率の増加に伴って増加した。
１／５０／１００配合物は〜１８０ｍｇ／ｍｍ²の引っ張り強さをもたらした。
１／６０／１２０配合物は〜２８０ｍｇ／ｍｍ²の引っ張り強さをもたらした。

実施例９：ゲルからの薬物の放出（テトラサイクリン）
１ｍｌの２０％ＨＳＡ溶液に１０ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンのエタノール溶液１５０μｌを添加した。ＨＳＡ／グルタル酸／ＥＤＣの、それぞれ、１／３０／６０および１／４０／８０のモル比を用いて、上述の例において説明されるようにゲルを形成した。ゲルを一晩放置した後、５ｍｌの蒸留水を収容するバイアルに入れた。時間の経過に伴うテトラサイクリンの放出を３６４ｎｍで測定した（図２）。

実施例１０：ＨＳＡゲル化溶液の安定性

１０．１ ４℃および室温でのエタノール修飾ＨＳＡゲル化溶液の安定性
（実施例５．４．１において説明されるように調製される）エタノール修飾ＨＳＡゲル化溶液を、０．２２μｍフィルターを通して無菌濾過した。その溶液の半分を４℃で、および半分を室温で、密封バイアル内に保存した。第０、７、２１および２８日に、溶液のアリコートをＥＤＣ水溶液と反応させ、ゲル化時間、ゲルの特性、ｐＨおよびゲル安定性を比較した。

調製されたすべてのゲルを密封バイアル内に３７℃で１４日間保持し、ゲルの安定性を比較した。この期間内でいかなる劣化もしくは細菌の成長の徴候をも示すものはなかった。

このデータは、エタノール修飾ＨＳＡゲル化溶液が４℃および室温で少なくとも４週間は安定であることを示す。

１０．２ ４℃および室温でのグルコース修飾ＨＳＡゲル化溶液の安定性
（実施例５．４．２において説明されるような）グルコース修飾ＨＳＡゲル化溶液を用いて上記実験を反復した。室温で保存した溶液は２週間安定であることが示された。４℃で保存した溶液は少なくとも４週間は安定であることが示された。

１０．３ ４℃および室温でのＨＳＡ／グルタル酸溶液の安定性
ＨＳＡ（２００ｍｇ／ｍｌ）およびグルタル酸の溶液（ＨＳＡ／グルタル酸モル比１／３７）は、実施例１０．１において説明される手順を用いて、４℃および室温で少なくとも４週間は安定であることが示された。

１０．４ ３７℃および室温でのＨＳＡ／アジピン酸用液の安定性
ＨＳＡ（２００ｍｇ／ｍｌ）およびアジピン酸の溶液（ＨＳＡ／アジピン酸モル比１／３０）は、実施例１０．１において説明される手順を用いて、３７℃および室温で少なくとも３週間は安定であることが示された。

実施例１１：形成されたゲルの安定性
ＨＳＡ／グルタル酸／ＥＤＣモル比１／４０／８０、１／５０／１００、１／６０／１２０および１／７０／１４０のゲルを４℃、室温および３７℃で密封バイアル内に６週間保持した。４℃および室温で保存したすべてのゲルは、高比率のゲルの濁度が４週間後に僅かに増加したものの、６週間安定であった。３７℃で保存したすべてのゲルは２週間安定であった。３週まで、これらのゲルは硬度が増加し、より濁ってきた。いずれのゲルも細菌成長のいかなる徴候をもさなかった。

実施例１２：ゲルの原位置適用
イン・ビトロでブタ皮膚片に切り込みを入れてウェル（２ｃｍ²および深さ０．５ｃｍ）を作成した。ゲル（上記実施例５．１において説明されるように調製された）をウェル内に原位置で形成させ、蒸気透過性膜（例えば、Ｔａｇａｄｅｒｍ、３Ｍ）で覆い、３７℃でインキュベートした。ゲルは軟質のままであり、乾燥しなかった。それらは、膜に取り付けた「創傷」から容易に除去された。

標準条件を用いるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムでのゲル濾過による本発明の可溶性ポリマーの分離を示し、吸光度は２８０ｎｍで測定する。 ４５時間にわたる、本発明のゲルからのテトラサイクリンの放出を示す。

Claims (63)

1. 創傷被覆材の形成方法であって、タンパク質を多官能性スペーサー、もしくはその活性化誘導体と反応させることによってタンパク質ポリマーを形成することを含む方法。
2. タンパク質ポリマーを原位置で形成する請求項１記載の方法。
3. 適用前にタンパク質ポリマーを形成する請求項１記載の方法。
4. 支持基体が被覆材に組み込まれる請求項３記載の方法。
5. 被覆材が包帯もしくはゲルシートの形態にある請求項３もしくは４記載の方法。
6. 蒸気透過性膜の創傷被覆材への適用をさらに含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. タンパク質が球状タンパク質である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. タンパク質が繊維状タンパク質である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
9. 球状タンパク質が血清タンパク質である請求項７記載の方法。
10. タンパク質がアルブミンである請求項９記載の方法。
11. アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項１０記載の方法。
12. タンパク質が血液に由来する請求項１記載の方法。
13. タンパク質が組換え産生物である請求項１記載の方法。
14. スペーサーがポリカルボン酸、ポリアミン、ポリ（カルボキシ／アミノ）化合物、ポリアルコール、ポリケトン、ポリアルデヒドおよびポリエステルからなる群より選択される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
15. スペーサーがポリカルボン酸である請求項１４記載の方法もしくは創傷被覆材。
16. ポリカルボン酸がジカルボン酸である請求項１５記載の方法。
17. ジカルボン酸がアルキレンジカルボン酸である請求項１６記載の方法。
18. スペーサーを活性化してタンパク分子との反応を促進する請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 活性化剤がカルボジイミド化合物である請求項１８記載の方法。
20. カルボジイミド化合物がエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである請求項１９記載の方法。
21. 請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の方法によって調製される創傷被覆材。
22. タンパク質を多官能性スペーサー、もしくはその活性化誘導体と反応させることによって形成されるタンパク質ポリマーを含む創傷被覆材。
23. 創傷部位でのタンパク質および多官能性スペーサー、もしくはその活性化誘導体の反応によって原位置で形成される請求項２２記載の創傷被覆材。
24. 創傷部位への被覆材の適用に先立って予備形成される請求項２２記載の創傷被覆材。
25. タンパク質ポリマーが含浸されている包帯を含む請求項２４記載の創傷被覆材。
26. ゲルシートの形態にある請求項２４記載の創傷被覆材。
27. ゲルシートが支持基体を有する請求項２５記載の創傷被覆材。
28. １以上の治療上活性な物質をさらに含む請求項２１ないし２７のいずれか１項に記載の創傷被覆材。
29. 治療上活性な物質が抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、鎮痛剤、止血剤、ファージ、成長因子、抗瘢痕剤、臭気吸収剤、および血管形成を促進する物質からなる群より選択される請求項２８記載の創傷被覆材。
30. タンパク質ポリマーの形成方法であって、タンパク質がウシ血清アルブミンではないという条件で、タンパク質をジカルボン酸もしくはその活性化誘導体と反応させることを含む方法。
31. タンパク質ポリマーの形成方法であって、タンパク質をアルキレンジカルボン酸もしくはその活性誘導体と反応させることを含む方法。
32. タンパク質がアルブミンである請求項３０もしくは請求項３１に記載の方法。
33. タンパク質がヒト血清アルブミンである請求項３２記載の方法。
34. ジカルボン酸が式
    ＨＯＯＣ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ
    を有し、式中、ｎは１ないし２０、好ましくは２ないし１２、より好ましくは３ないし８である、請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載の方法。
35. ジカルボン酸をカルボジイミド活性化剤で活性化する請求項３０ないし３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 活性化剤がエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである請求項３５記載の方法。
37. タンパク質がウシ血清アルブミンではないという条件で、タンパク質をジカルボン酸もしくはその活性化誘導体と反応させることによって形成されるタンパク質ポリマー。
38. タンパク質をアルキレンジカルボン酸もしくはその活性化誘導体と反応させることによって形成されるタンパク質ポリマー。
39. 溶液の形態にある請求項３７もしくは請求項３８に記載のタンパク質ポリマー。
40. 不溶性粒子の形態にある請求項３７もしくは請求項３８に記載のタンパク質ポリマー。
41. ゲルの形態にある請求項３７もしくは請求項３８に記載のタンパク質ポリマー。
42. １以上の治療上活性な成分の身体への送達における請求項３７ないし４１のいずれか１項に記載のタンパク質ポリマーの使用。
43. 創傷、火傷もしくは潰瘍の局所治療における請求項４１記載のタンパク質ポリマーの使用。
44. タンパク質ポリマーが創傷、火傷もしくは潰瘍に予備形成ゲルとして適用される請求項４３記載の使用。
45. タンパク質およびジカルボン酸スペーサーを溶液状態で創傷、火傷もしくは潰瘍に塗布し、原位置でタンパク質ポリマーを形成する、請求項４３記載の使用。
46. 身体に移植される装置のコーティングとしての、請求項３７もしくは請求項３８に記載のタンパク質ポリマーの使用。
47. 血小板代替物もしくは血小板賦活剤としての請求項３９記載のタンパク質ポリマーの使用。
48. タンパク質ポリマーが１以上の凝結剤もしくは活性ペプチド誘導体と結合する請求項３９記載のタンパク質ポリマー。
49. タンパク質ポリマーがフィブリノーゲンと結合する請求項４８記載のタンパク質ポリマー。
50. 治療上活性な物質、もしくはその前駆体、および体内の特定の位置との親和性を有する標的化部分に結合する、請求項３９記載のタンパク質ポリマー。
51. 標的化抗癌療法における請求項５０記載の結合体の使用。
52. 造影剤および体内の特定の位置との親和性を有する標的化部分に結合する、請求項３９記載のタンパク質ポリマー。
53. 医療画像診断用途における請求項３９記載の結合体の使用。
54. 請求項２１もしくは請求項２２による創傷被覆材を調製するためのキットであって、第１組成物および第２組成物を含み、第１組成物および第２組成物が、第１組成物と第２組成物との反応が防止されるように、別々の容器内に保持されるキット。
55. 第１組成物がタンパク質および多官能性スペーサーを含み、第２組成物が多官能性スペーサーの活性化剤を含む、請求項５４記載のキット。
56. 第１組成物が溶液であり、第２組成物が粉末である、請求項５５記載のキット。
57. ヒトもしくは動物身体の治療方法であって、請求項３７ないし４１のいずれか１項に記載のタンパク質ポリマーの身体への投与を含む方法。
58. タンパク質ポリマーを静脈内投与する請求項５７記載の方法。
59. タンパク質ポリマーを局所投与する請求項５７記載の方法。
60. タンパク質ポリマーを溶液の形態で投与する請求項５７ないし５９のいずれか１項に記載の方法。
61. タンパク質ポリマーを粉末の形態で投与する請求項５９記載の方法。
62. タンパク質ポリマーをゲルの形態で投与する請求項５９記載の方法。
63. タンパク質ポリマーが原位置で形成されるようにタンパク質およびジカルボン酸架橋剤を身体に投与する請求項５９記載の方法。

Images