KR100971271B1 - 헤파린이 결합된 피브린젤, 그 제조방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법을 제공한다:

a) 헤파린을 활성화시키는 단계;

b) 활성화된 헤파린과 피브리노겐을 결합하여, 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하는 단계;

c) 자유(free) 피브리노겐과 상기 단계 b)에서 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 혼합하여 혼합 피브리노겐을 제조하는 단계; 및

d) 상기 단계 c)에서 제조된 혼합 피브리노겐에 트롬빈을 혼합하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 헤파린이 결합된 피브린젤 및 그 제조용 키트를 제공한다.

본 발명의 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법에 따르면 성장인자 단백질 등의 약물에 결합 친화성이 있는 헤파린이 결합된 피브린젤을 저비용으로 간편하게 제조할 수 있을 뿐 아니라, 그 방법에 의하여 제조된 본 발명의 피브린젤은 인체에 주사되어 국소적으로 장기간에 걸쳐 성장인자 단백질 등의 약물을 지속 방출함으로써 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 조직 재생에 탁월한 효과를 나타내는 치료제로 사용할 수 있다.

피브린, 피브린젤, 헤파린, 성장인자 단백질

Description

헤파린이 결합된 피브린젤, 그 제조방법 및 키트{HEPARIN-CONJUGATED FIBRIN GEL AND METHOD AND KIT FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 손상된 조직 및 장기의 복원에 초점을 맞춘 생체 조직 공학 분야, 특히 성장 인자 단백질의 전달과 관련한 생체 조직 재생 분야에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 성장인자 단백질을 포함하는 주사가능한 (injectable) 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에서는 활성화된 헤파린을 피브리노겐과 결합시키고 이를 자유(free) 피브리노겐과 혼합하고 용해시킨 후, 이에 트롬빈을 혼합시킴으로써 주사가능한 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법을 개시한다.

한편, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 헤파린이 결합된 피브린젤을 헤파린과 친화성이 있는 성장인자 단백질과 물리적으로 결합시킨 후 인체에 주사하여 장기간 성장인자 단백질을 지속 방출시킴으로써 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 조직 재생을 촉진하는 치료제로 사용할 수 있다.

생체 조직 공학은 질병 또는 사고로 인하여 생체 조직이나 장기의 손상을 입은 경우에 있어서, 손상된 조직 및 장기의 복원에 초점을 맞추고 있는 연구 분야이 다. 이와 관련하여, 생체 조직 재생용 지지체로서 주사가능한 젤을 이용하는 방법이 널리 연구되고 있는데, 이와 같이 주사가능한 젤을 이용하는 방법은 외과적 시술없이 필요한 부위에 용이하게 주입할 수 있으므로 환자의 회복기간, 고통, 비용 등을 감소시킬 수 있다는 장점이 있다. 상기 주사가능한 젤로서 현재까지 콜라겐젤, 피브린젤, 알긴산젤 등이 사용되어 왔다. 특히, 피브린젤은 환자 자신의 혈액에서 얻을 수 있으므로 면역유발 등의 문제가 발생하지 않는 바, 자가치료(autologous)용 생체 조직 공학용 지지체로서 크게 주목받고 있다.

피브린은 경단백질(硬蛋白質)의 일종으로 혈장 속의 피브리노겐에 효소 트롬빈이 작용하여 생기는 불용성 단백질이다. 즉, 피브린은 상온에서 트롬빈의 존재 하에 피브리노겐의 효소적 중합 반응에 의해 젤(gel)을 형성한다. 이와 같이 형성된 피브린젤은 손상된 조직 및 장기의 복원에 초점을 맞춘 조직 공학 분야에서 있어서 중요한 의의가 있으며, 특히 성장 인자 단백질의 전달이 용이하여, 뼈, 피부 혈관, 연골 등의 생체 조직 재생 분야에서 피브린젤과 관련한 많은 연구가 진행되고 있다.

글리코사미노글리칸의 일종인 헤파린은 황산기를 다량 포함하여 고도로 음전하를 띠는 성질 때문에 특정 부류의 헤파린-결합성 단백질과 결합하는 친화성 리간드로서 사용되곤 한다. 이와 같은 성질은 주로 단백질 분리에서 크로마토그래피에 이용되기도 하지만 최근에는 단백질 제제의 운반체에 고정화되어 헤파린-결합성 단백질을 특이적으로 체내 특정 부위로 운반하는 것에 그 응용 가능성이 주목되고 있다.

본 발명의 목적은 함유 약물의 지속방출성이 우수한, 헤파린이 직접 결합된 피브린젤의 간편한 제조방법를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 함유 약물의 지속방출성이 우수한, 헤파린이 직접 결합된 피브린젤을 포함하는 단백질 전달체 및 그와 같은 피브린젤의 제조용 키트를 제공하는 것이다.

이에 본 발명자들은 펩타이드를 사용하지 않으면서 다량의 성장인자 단백질을 함유할 수 있는 피브린젤 조성물에 대한 연구를 거듭한 결과, 헤파린을 활성화시킨 후, 이를 직접 피브리노겐에 결합시킴으로써 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐을 제조하였다.

또한, 이와 같이 제조된 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐만으로 중합 가교반응을 수행하면 젤 형태의 피브린을 쉽게 얻을 수 없는 반면, 헤파린이 결합되지 않은 자유(free) 피브리노겐을 상기 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐과 혼합하여 중합 가교반응을 수행하면 함유 약물의 지속방출 성능이 우수하고 취급(handling)이 용이한 피브린젤을 얻을 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 a) 헤파린을 활성화시키는 단계; b) 활성화된 헤파린과 피브리노겐을 결합하여, 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하는 단계; c) 자유 피브리노겐과 상기 단계 b)에서 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 혼합하여 혼합 피브리노겐을 제조하는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 제조된 혼합 피브리노겐에 트롬빈을 혼합하는 단계를 포함하는, 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 헤파린이 결합된 피브리노겐, 헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트 및 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐을 포함하는 피브린젤 및 성장인자 단백질을 포함하는 성장인자 단백질 전달체를 제공한다.

본 발명의 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법에 따르면 성장인자 단백질 등의 약물에 결합 친화성이 있는 헤파린이 결합된 피브린젤을 저비용으로 간편하게 제조할 수 있을 뿐 아니라, 그 방법에 의하여 제조된 본 발명의 피브린젤은 인체에 주사되어 국소적으로 장기간에 걸쳐 성장인자 단백질 등의 약물을 지속 방출함으로써 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 조직 재생에 탁월한 효과를 나타내는 치료제로 사용할 수 있다.

이하에서는 구체예를 통하여 본 발명을 더 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 a) 헤파린을 활성화시키는 단계; b) 활성화된 헤파린과 피브리노겐을 결합하여, 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하는 단계; c) 자유 피브리노겐과 상기 단계 b)에서 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 혼합하여 혼합 피브리노겐을 제조하는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 제조된 혼합 피브리노겐에 트롬빈을 혼합하는 단계를 포함하는, 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하여 제조된 피브린젤은 주사가능한 피브린젤이다.

본 발명에 따른 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법에서, 상기 피브리노겐은 임의의 포유류에서 유래한 피브리노겐을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 피브리노겐은 사람 혈장 유래의 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 '헤파린이 결합된 피브리노겐'은 본 명세서에서 설명된 바에 따른 헤파린의 활성화 반응을 이용하여 제조된 헤파린이 결합되어 있는 피브리노겐을 의미하며, 이와 비교하여 본 발명에서 사용되는 용어 '자유 피브리노겐' 또는 단독으로 사용되는 용어 '피브리노겐'은 다른 화합물과 결합되어 있지 않은 피브리노겐, 특히 헤파린이 결합되어 있지 않은 피브리노겐을 의미한다.

또한, 본 발명의 방법에서 헤파린은 저분자량의 것으로서, 구체적으로는 분자량 1,000 내지 20,000 인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 피브린젤 제조방법 중 단계 a)의 헤파린의 활성화 단계는, 헤파린에 NHS-기를 도입하는 단계이며 이의 달성을 위한 어떠한 수단을 사용하여도 무방하다. 이는 헤파린에 카르보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드를 반응시킴으로써 헤파린을 NHS-헤파린으로 활성화시키는 방법에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 피브린젤 제조방법 중 단계 b)의 헤파린이 결합된 피브리노겐의 제조 단계는 NHS-헤파린과 피브리노겐의 결합 반응에 의하여 달성되는데, 보다 구체적으로는 NHS-헤파린의 카르복시기와 피브리노겐의 단백질에 존재하는 아미노기와의 작용에 의하여 이루어진다. 한편, 상기 반응에 의하여 제조되는 헤파린이 결합된 피브리노겐은 즉시 사용되어 다음 단계로 이행할 수도 있으나, 필요에 따라서 액체 및 건조 분말 등의 형태로 보관한 후 사용할 수 있다. 바람직하게는, 보관의 용이성 등의 측면에서 동결 건조 형태로서 보관되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 피브린젤 제조방법 중 단계 c)의 혼합 피브리노겐(헤파린이 결합된 피브리노겐과 자유 피브리노겐의 혼합물)의 제조시, 자유 피브리노겐과 헤파린이 결합된 피브리노겐의 질량 비율은 1:1 내지 5:1 인 것이 바람직하다. 상기의 비율을 유지함으로써 피브린젤의 응괴를 조절할 수 있다. 그 비율이 1:1 미만일 경우 젤의 기계적 물성이 약해서 피브린젤이 잘 형성되지 않는다. ([도 5] 참조) 젤 형성이 되지 않으면 본 발명의 목적인 서방성을 얻을 수 없으며, 기계적 물성이 너무 약한 젤은 형성되어 체내에 주사되더라도 주사 후 초기방출양이 많아 장기간 지속 방출이라는 궁극적 효과를 얻을 수 없다. 또한, 그 비율이 5:1 을 초과하여 사용하면, 젤 형성은 잘 이루어질 수 있지만 결과적인 피브린 젤에서 피브리노겐과 혼합된 헤파린의 상대적 양이 줄어들게 되고 따라서 이에 결합하는 성장인자 단백질의 양이 줄어든다. 궁극적으로는 치료 유효량의 단백질 약물을 포함하기 위하여 사용하여야 할 피브린젤의 양이 증가하여 단백질 약물의 효과적 지속방출이라는 장점이 반감된다.

본 발명의 한 구체예에서는 헤파린이 결합된 피브리노겐, 헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐, 및 트롬빈을 포함하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 키트에서 헤파린이 결합된 피브리노겐과 헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐의 비율은 1:1 내지 5:1 이다. 바람직하게는 헤파린이 결합된 피브리노겐, 헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐, 및 트롬빈 각각 은 분리하여 동결건조 상태로 보관하다가 피브린젤 형성 직전 각각을 완충용액에 용해한 후 혼합하여 본 발명의 제조방법에 따라 젤을 형성시킨다. 더 바람직하게는 완충용액에 각각 용해된 각 성분이 사용 직전 혼합될 수 있는 투웨이(two-way) 주사기 같은 도구를 사용하여 간편하게 혼합하여 피브린젤을 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서는 헤파린이 결합된 피브리노겐, 헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐, 및 트롬빈에 추가하여 헤파린에 결합하는 성장인자 단백질을 더 포함하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 성장인자 단백질은 골형성 단백질(bone morphogenenic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자(transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자(platelet-derived growth factor:PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 성장인자 단백질은 한 가지 이상으로 함유될 수 있으며, 예를 들어 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma: PRP)과 같이 다양한 종류의 성장인자가 혼합된 혼합물 형태로 제공될 수 있다.

한편, 본 발명의 피브린 형성을 위한 추가적인 성분이나 반응 조건의 조절은 당업자에게 주지이다. 예를 들어, 상기의 혼합 피브리노겐의 용해를 위하여서는 아프로티닌 용액을 사용할 수 있다. 아프로티닌은 피브리노겐이 트롬빈에 의하여 가교 중합하여 피브린을 형성하였을 때 피브린의 자연적인 효소분해 작용을 지연시키는 역할을 한다. 또한, 본 발명의 방법에서 트롬빈은 염화칼슘이 용해되어진 용액 에 녹여서 사용하는 것이 바람직하다. 피브리노겐 및 트롬빈 용액의 농도에 따라 응괴 형성 시간, 응괴 강도 등의 조절이 가능하다. 이때 용해된 트롬빈의 양은, 혼합 피브리노겐과 동량을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구체예는 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐을 포함하는 피브린젤 및 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 성장인자 단백질 전달체를 제공한다. 본 발명의 방법에 의하여 제조된 피브린젤은 상기 예시한 성장인자 등과 결합된 후 피브린젤 조성물의 형태로서 인체에 주사되어, 국소적으로 장기간 성장인자 단백질을 방출시킴으로써 뼈, 피부, 혈관, 연골 등의 조직 재생을 촉진시키는 치료제로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 피브린젤 조성물은 인체에 주사하는 간단한 시술로써, 골결손, 화상, 당뇨병성 또는 허혈성 족부 궤양, 허혈성 심질환, 하지허혈, 퇴행성 연골질환 등의 치료에 널리 이용될 수 있다.

본 발명의 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법에 따르면 성장인자 단백질 등의 약물에 결합 친화성이 있는 헤파린이 결합된 피브린젤을 저비용으로 간편하게 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 헤파린과 결합된 피브린젤은 헤파린과 친화성이 있는 성장인자 단백질을 결합시킴으로써, 성장인자 단백질을 함유하는 피브린젤 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 본 발명의 방법에 의하여 제조된 피브린젤 조성물은 성장인자 단백질을 효과적으로 전달하여, 인체에 주사하는 간단한 시술로써, 인체에 주사되어 국소적으로 장기간에 걸쳐 성장인자 단백질 등의 약물을 지속 방출함으로써 골결손, 화상, 당뇨병성 또는 허혈성 족부 궤양, 허혈성 심질환, 하지허혈, 퇴행성 연골질환 등의 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 저비용 고효율의 치료제로 개발될 수 있다.

실시예 1 : 헤파린의 활성화

저분자량의 헤파린 100 mg (0.00002 몰)(4000-6000, Sigma)을 MES 완충용액 ([2-(N-몰폴리노)에탄 술폰산] 버퍼, 0.05 M, pH 6.0) 1 ml 에 완전히 용해시킨 후, 0.0046 g 의 N-하이드록시숙신이미드(NHS, 0.00008 M)와 0.015336g의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, 0.004 M)을 첨가한 후, 4℃ 에서 12 시간 동안 반응시켜, NHS-헤파린 용액을 제조하였다. 상기에 의하여 제조된 NHS-헤파린 용액을 무수 아세톤으로 침전 및 추출하고, 24 시간 동안 동결 건조시켰다.

실시예 1-1 : 활성화된 헤파린과 피브리노겐의 결합

상기 실시예 1 에서 제조한 동결 건조된 NHS-헤파린 (60 mg)과 사람 혈장 유래 피브리노겐 (100 mg)을 20 ml 인산 완충용액 (Phosphate buffered saline, pH 7.4)에 완전히 용해시킨 후, 4 ℃ 에서 3 시간 동안 반응시켰다. 이때, 피브리노겐을 용해시킬 때 거품이 일어나지 않도록 서서히 용해시켰다. 상기 반응이 끝난 후의 용액을 다시 무수 아세톤으로 침전시키고 침전물을 차광하여 동결 건조시켜, 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하였다. 활성화된 헤파린이 피브리노겐에 결 합하였음을 NMR 및 FTIR 분석을 통하여 확인하였으며, 그 결과를 각각 [도 1] 및 [도 2]에 도시하였다. 한편, 상기에 의하여 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 20 ml 인산 완충용액에 용해시키고, 투석막(dialysis membrane, MWCO: 12-14,000)을 이용하여 4 ℃ 에서 24 시간 동안 3 회 이상 증류수를 교환하면서 미반응 헤파린을 용출시켰다. 이를 통하여 얻어진 헤파린이 결합된 피브리노겐을 차광하여 48 시간 이상 동결 건조시킴으로써, 흰색 분말의 헤파린이 결합된 피브리노겐을 얻었다.

실시예 1-2: 헤파린이 결합된 피브리노겐의 헤파린 정량

실시예 1-1에서 제조한 헤파린이 결합된 피브리노겐 중의 헤파린 양을 톨루이딘 블루(toluidine blue) 분석법에 의하여 정량하였다. 요약하면, 시험관에 2ml의 0.02% NaCl 수용액을 넣고 상기 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 첨가한 후, 0.001N HCl 중의 0.005% 톨루이딘 블루 용액을 500 ㎕ 가하였다. 약하게 교반하면서 30 분 인큐베이션 한 후 n-헥산을 3 ml 가하여 10-15초 강하게 교반한 후 정치하여 층을 안정화 시켰다. 기포가 제거된 것이 확인되고, 상층인 헥산 층과 하층인 수용액층 구분이 뚜렷해지면 수용액층인 아랫층에서 약 200 ㎕의 샘플을 채취하여 ELISA를 수행하고 UV 분광계를 사용하여 630 nm에서 측정였다. 헤파린 함량은 42.73 mg/g으로 측정되었다.

실시예 2 : 골형성 단백질이 함유된 피브린젤의 제조

골형성 단백질은 단백질 분해효소 저해제로서 사용되는 아프로티닌 용액에 용해시켰다. 상기 실시예 1-1 에서 제조한 헤파린이 결합된 피브리노겐(33mg)과 시판중인 사람 혈장 유래 피브리노겐(66mg)을 1 : 2 로 혼합하여 제조한 혼합 피브리노겐을 골형성 단백질이 혼합되어진 아프로틴 용액(1000 ㎕)에 용해하여 피브리노겐 용액을 제조하였다. 한편, 동량의 사람 혈장 유래 트롬빈(10 mg)을 염화칼슘이 용해되어진 용액(1000 ㎕)에 녹인 후, 이를 상기의 혼합 피브리노겐 용액과 혼합하여 최종적으로 골형성 단백질(500ng)이 결합된 피브린젤(100 ㎕) 단백질 전달체를 수득하였다.

실시예 2-1 : 피브린젤에서의 골형성 단백질의 방출 거동

기존에 시판중인 헤파린이 함유되지 않은 피브린젤에 골형성 단백질을 인위적으로 혼합하여 대조군 1 로 사용하였으며, 추가적으로 기존에 시판중인 피브린젤과 헤파린, 골형성 단백질을 인위적으로 혼합하여 대조군 2 로 사용하였다. 즉, 대조군 1 및 2 에서 골형성 단백질은 피브린젤 및/또는 헤파린과 결합되어 있지 않은 상태인 것이다.

한편, 상기 실시예 2 에서 제조된 골형성 단백질이 결합된 피브린젤 조성물을 실험군으로 사용하여 37℃ 에서 천천히 교반하면서, 28일 동안 골형성 단백질의 방출 거동을 조사하였다. 골형성 단백질의 방출 거동을 [도 3] 에 그래프로 나타내었다. [도 3] 에 제시된 바와 같이, 골형성 단백질이 대조군 1 및 2 의 피브린젤 조성물에서는 3 일 만에 80 % 이상이 방출된 반면, 골형성 단백질이 헤파린에 결합된 형태인 실험군(본 발명의 실시예 2)의 피브린젤 조성물에서는 80 % 이상이 13 일 동안 방출되는 경향을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 피브린젤 형성에 있어 헤파린 양과 자유피브리노겐의 영향 평가

헤파린이 결합된 피브리노겐이 단독으로 트롬빈의 작용에 의하여 피브린젤을 형성할 수 있는지 여부를 관찰하였다.

헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐은 혼합하지 않고 실시예 1에 따라 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하여 트롬빈 등 피브린 형성 조건을 적용하여 젤 형성 정도를 관찰하였다. 헤파린을 결합하지 않은 피브리노겐만을 사용하여 아프로틴 완충액 중의 피브리노겐과 트롬빈 용액을 혼합하여 중합 가교반응을 수행한 경우는 젤 형성이 양호하였으나 헤파린이 결합된 피브리노겐으로 중합 가교반응을 하는 경우에는 젤이 형성되지 않았다([도 4] 참조). [도 4]의 사진은 젤 형성 반응 후 형성 판을 기울였을 때 헤파린을 결합하지 않은 피브리노겐 반응물은 젤을 형성시켜 흘러내리지 않은 반면, 헤파린이 결합된 피브리노겐만을 사용한 반응물을 젤을 형성시키지 못하고 흘러내리는 모습을 촬영한 것이다.

다음으로, 반응 개시 전에 헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐(자유 피브리노겐)을 헤파린이 결합된 피브리노겐에 대한 질량 비율로서 각각 1:1, 1.5:1 및 2:1의 비율로 혼합하여 상기 각각의 조성으로 피브린젤을 제조하였다. 도 5에서는 헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐의 함량이 증가함에 따라 형성되는 젤을 촬영한 사진을 나타낸다. 헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐의 함량이 증가함에 따라 젤의 형성이 더 양호했다.

실시예 4: 피브린젤에서의 혈소판 유도 생장 인자의 방출 거동

혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma: PRP) 1ml를 상기 실시예 1-1 에서 제조한 헤파린이 결합된 피브리노겐과 시판중인 사람 혈장 유래 피브리노겐을 1 : 2 로 혼합하여 제조한 혼합 피브리노겐 100 mg과 혼합하여 사람 혈장 유래 트롬빈(10 mg)을 염화칼슘이 용해되어진 용액(1000 ㎕)에 녹인 후, 이를 상기의 혼합 피브리노겐 용액과 혼합하여 최종적으로 PRP가 결합된 피브린젤(100 ㎕) 단백질 전달체를 수득하였다.

기존에 시판중인 헤파린이 함유되지 않은 피브린젤을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 제조한 피브린젤 단백질 전달체를 대조군으로 사용하였다.

제조된 PRP-트롬빈 피브린젤 및 PRP-HCF(Heparin-conjugated fibrinogen: 헤파린-피브리노겐)-트롬빈 피브린젤을 실험군으로 사용하여 37℃ 에서 천천히 교반하면서, 10일 동안 혈소판 유도 생장 인자(platelet-derived growth factor: PDGF) 단백질의 방출 거동을 조사하였다. 혈소판 유도 생장 인자의 방출 거동을 [도 6] 에 그래프로 나타내었다. [도 6] 에 제시된 바와 같이, 혈소판 유도 생장 인자는 대조군 피브린젤에서는 제 1 일 내지 제 6 일에서 대부분이 방출된 반면, 혈소판 유도 생장 인자가 헤파린에 결합된 형태인 실험군의 피브린젤 조성물에서는 제 10일에도 제 1 일보다 높은 수준의 지속 방출을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1 은 활성화된 헤파린이 피브리노겐에 결합하였는지 여부를 확인하기 위하여 수행한 NMR 분석의 데이타를 도시한 그래프이다.

도 2 는 활성화된 헤파린이 피브리노겐에 결합하였는지 여부를 확인하기 위하여 수행한 FTIR 분석의 데이타를 도시한 그래프이다.

도 3은 주사 가능한 헤파린이 결합된 피브린젤 조성물에서의 골형성 단백질-2(BMP-2)의 방출 거동을 도시한 그래프이다.

도 4는 헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐만을, 또는 헤파린이 결합된 피브리노겐만을 각각 사용하여 트롬빈 용액을 혼합하여 중합 가교반응을 수행한 경우 젤 형성 여부를 나타낸 사진이다.

도 5는 헤파린이 결합되지 않은 피브리노겐의 함량이 증가함에 따라 형성되는 젤을 촬영한 사진이다.

도 6은 주사 가능한 헤파린이 결합된 PRP 피브린젤 조성물에서의 혈소판 유도 성장인자(PDGF)의 방출 거동을 도시한 그래프이다.

Claims (12)

1. 하기 단계를 포함하는, 헤파린이 결합된 피브린젤의 제조방법:

   a) 헤파린을 활성화시키는 단계;

   b) 활성화된 헤파린과 피브리노겐을 직접 결합시켜, 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하는 단계;

   c) 자유(free) 피브리노겐과 상기 단계 b)에서 제조된 헤파린이 결합된 피브리노겐을 혼합하여 혼합 피브리노겐을 제조하는 단계; 및

   d) 상기 단계 c)에서 제조된 혼합 피브리노겐에 트롬빈을 혼합하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 피브린젤은 주사가능한 젤인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 피브리노겐은 포유류 유래 피브리노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 헤파린의 분자량은 1,000 내지 20,000 인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 a)의 헤파린을 활성화시키는 단계는 헤파린과 카르보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드의 반응에 의하여 NHS-헤파린으로 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 b)의 헤파린이 결합된 피브리노겐을 제조하는 단계는, 활성화된 헤파린의 카르복시기와 피브리노겐의 단백질에 존재하는 아미노기와의 반응에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 c)의 혼합 피브리노겐의 제조시, 피브리노겐과 헤파린이 결합된 피브리노겐의 질량 비율이 1:1 내지 5:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐;

   헤파린이 결합되지 않은 자유 피브리노겐; 및

   트롬빈을 포함하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트.
10. 제 9 항에 있어서, 헤파린에 결합하는 성장인자 단백질을 더 포함하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 성장인자 단백질은 골형성 단백질(bone morphogenenic protein; BMP), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 변형 성장 인자(transforming growth factor-β; TGF-β), 혈소판 유도 성장인자(platelet-derived growth factor:PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자 단백질인 것을 특징으로 하는 헤파린-결합 피브린젤 제조용 키트.
12. 헤파린이 직접 결합된 피브리노겐을 포함하는 피브린젤 및 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 성장인자 단백질 전달체.

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