CN102065917A - 肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒 - Google Patents

肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN102065917A
CN102065917A CN200980123952XA CN200980123952A CN102065917A CN 102065917 A CN102065917 A CN 102065917A CN 200980123952X A CN200980123952X A CN 200980123952XA CN 200980123952 A CN200980123952 A CN 200980123952A CN 102065917 A CN102065917 A CN 102065917A
Authority
CN
China
Prior art keywords
heparin
fibrinogen
link coupled
fibrin gel
gel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200980123952XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102065917B (zh
Inventor
金柄秀
田梧住
梁熙錫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanyang holding Co.
Original Assignee
Hanyang Hak Won Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanyang Hak Won Co Ltd filed Critical Hanyang Hak Won Co Ltd
Publication of CN102065917A publication Critical patent/CN102065917A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102065917B publication Critical patent/CN102065917B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/225—Fibrin; Fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/80—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special chemical form
    • A61L2300/802—Additives, excipients, e.g. cyclodextrins, fatty acids, surfactants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，该方法包括将肝素活化；将所述活化的肝素与纤维蛋白原偶联以制备肝素偶联的纤维蛋白原；将游离纤维蛋白原与所述肝素偶联的纤维蛋白原混合以制备纤维蛋白原混合物；并将凝血酶与所述纤维蛋白原混合物混合。另外，本发明提供了通过上述方法制备的肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的试剂盒。根据制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，可以以低成本制备对诸如生长因子的药物具有亲和力的肝素偶联的纤维蛋白凝胶，通过注射入人体，持续地向局部位置长期持续释放诸如生长因子的药物，可以将肝素偶联的纤维蛋白凝胶用作非常有效地再生诸如骨、皮肤、血管、软骨等的组织的治疗药物。

Description

肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年4月28日提交的韩国专利申请2008-39322号以及于2009年4月24日提交的2009-35779号的优先权，每个申请的公开通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及致力于修复受损组织和器官的组织工程，更具体地，涉及与转移生长因子有关的组织再生。
具体地，提供了制备含有生长因子的与可注射肝素偶联的纤维蛋白的方法，其中将与纤维蛋白原偶联的活化肝素与游离纤维蛋白原混合并溶解，然后将其与凝血酶混合，从而获得可注射肝素偶联的纤维蛋白凝胶。
同时，使对肝素具有亲和力的生长因子与根据本发明的上述方法制备的肝素偶联的纤维蛋白凝胶物理结合，并注射入人体，从而提供生长因子的长时间缓释。因此，其可以用作用刺激诸如骨、皮肤、血管、软骨等的组织再生的治疗药物。
背景技术
组织工程是致力于修复由于疾病或意外而受损的组织和器官的研究领域。利用可注射凝胶作为基质来再生组织的方法已经得到了广泛的研究，并且可以减少恢复时间、痛苦及患者的花费，因为可以将药物容易地注射入靶位点而不需要外科手术方法。目前使用的可注射凝胶的实例包括胶原蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶和褐藻酸凝胶。特别地，由于可以从患者血液获得纤维蛋白凝胶，所以其不会引起免疫反应。因此，纤维蛋白凝胶作为用于组织工程的自体基质获得了极大的关注。
纤维蛋白是一种硬蛋白，其是由血浆中的纤维蛋白原与酶凝血酶的反应所产生的不溶性蛋白。即，在室温下，通过酶促聚合，由与纤维蛋白原在凝血酶的存在的反应来制备凝胶类型的纤维蛋白。这样制备的纤维蛋白凝胶对于致力于修复受损组织和器官的组织工程是有意义的。特别地，纤维蛋白凝胶促进递送生长因子，因此进行了关于纤维蛋白凝胶的各种研究以再生诸如骨、皮肤、血管、软骨等的组织。
由于肝素，其是一种糖胺聚糖，含有大量的硫酸根，因而带有大量的负电，因此其经常用作与特异性肝素偶联的蛋白偶联的亲和力配体。亲和力配体的特征还用于纯化蛋白的色谱。然而，最近的注意力集中于将这种特征用于将肝素偶联的蛋白固定于蛋白药物的载体以特异性地递送至身体的特定位点。
发明内容
本发明涉及制备与肝素直接偶联的纤维蛋白凝胶的简单方法，从而获得所含药物的长期缓释。
本发明还涉及包含与肝素直接偶联的纤维蛋白凝胶的蛋白载体，从而获得所含药物的长期缓释；以及用于制备上述纤维蛋白凝胶的试剂盒。
因此，本发明人进行了关于能够含有大量生长因子而不使用肽的纤维蛋白凝胶组合物的研究，从而实现制备与偶联前活化的肝素直接偶联的纤维蛋白原，
另外，据发现，难以仅通过肝素直接偶联的纤维蛋白原的交联聚合获得纤维蛋白凝胶，但是纤维蛋白凝胶允许所含药物的完美缓释，并且可以通过与肝素直接偶联的纤维蛋白原和未与肝素偶联的游离纤维蛋白原的交联聚合来获得便捷的操作。
因此，本发明一方面提供了制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，该方法包括将肝素活化；将所述活化的肝素与纤维蛋白原偶联以制备肝素偶联的纤维蛋白原；将前一步骤中制备的肝素偶联的纤维蛋白原与游离纤维蛋白原混合以制备纤维蛋白原混合物；以及将前一步骤中制备的纤维蛋白原混合物与凝血酶混合。
提供了用于制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的试剂盒，该试剂盒包含肝素偶联的纤维蛋白原、未与肝素偶联的游离纤维蛋白原和凝血酶；以及生长因子载体，该生长因子载体包含含有与肝素直接偶联的纤维蛋白原的纤维蛋白凝胶和生长因子。
根据制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，可以以低成本制备对诸如生长因子的药物具有亲和力的肝素偶联的纤维蛋白凝胶，通过注射入人体，持续地向局部位置长期持续释放诸如生长因子的药物，可以将该纤维蛋白凝胶用作非常有效地再生诸如骨、皮肤、血管、软骨等的组织的治疗药物。
附图说明
根据示例性实施方案的描述，并结合以下的附图，将明确和更容易地理解本发明的这些和/或其他目的。
图1示出证实活化的肝素是否与纤维蛋白原偶联而获得的NMR数据；
图2示出证实活化的肝素是否与纤维蛋白原偶联而获得的FTIR数据；
图3为示出以下内容的图：可注射肝素偶联的纤维蛋白凝胶组合物中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的释放行为；
图4为示出以下内容的照片：分别利用无肝素纤维蛋白原或肝素偶联的纤维蛋白原与凝血溶液的混合物，通过交联聚合的凝胶形成；
图5为示出以下内容的照片：根据渐增含量的无肝素纤维蛋白原的凝胶形成；以及
图6为示出以下内容的图：可注射肝素偶联的PRP纤维蛋白凝胶组合物中血小板源性生长因子(PDGF)的释放行为。
具体实施方式
此后，参照示例性实施方案，将更详细地描述本发明。
本发明提供了制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，该方法包括：将肝素活化；将所述活化的肝素与纤维蛋白原偶联以制备肝素偶联的纤维蛋白原；将前一步骤中制备的肝素偶联的纤维蛋白原与游离纤维蛋白原混合以制备纤维蛋白原混合物；以及将前一步骤中制备的纤维蛋白原混合物与凝血酶混合。本发明制备的纤维蛋白凝胶可以为可注射纤维蛋白凝胶。
根据本发明的制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，纤维蛋白原可以源自哺乳动物，并且优选地源自人血浆。
术语“肝素偶联的纤维蛋白原”表示与通过本文所述的肝素活化而制备的肝素偶联的纤维蛋白原，并且本文分别使用的术语“游离纤维蛋白原”或“纤维蛋白原”表示未与其他化合物，特别是未与肝素偶联的纤维蛋白原。
本发明的方法所用的肝素可以具有1000至20000的低分子量。
本发明的制备纤维蛋白凝胶的方法中肝素的活化指可以通过任何方法将NHS-引入肝素。尽管肝素的活化可以通过肝素、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的反应进行，并活化为NHS-肝素，但是本发明并不限于此。
本发明的制备纤维蛋白凝胶的方法中肝素偶联的纤维蛋白原的制备通过NHS-肝素与纤维蛋白原之间的反应完成。特别地，肝素偶联的纤维蛋白原通过NHS-肝素的羧基与纤维蛋白原的蛋白中的氨基之间的反应来制备。同时，可以将通过所述反应制备的肝素偶联的纤维蛋白原容易地用于随后的步骤，或根据其目的保存为液体或干粉类型以用于以后的用途。优选地，可以将肝素偶联的纤维蛋白原冻干并容易地保存。
在本发明的制备纤维蛋白原凝胶的方法中制备纤维蛋白原混合物中，游离纤维蛋白原与肝素偶联的纤维蛋白原的比率可以为1∶1至5∶1。在该范围中，可以控制纤维蛋白凝胶的凝块形成。当比率低于1∶1时，凝胶的机械性质不好，并且难以形成纤维蛋白凝胶(参见图5)。如果未形成凝胶，则不能提供本发明的目的延长的释放，甚至当注射入人体时，机械性质很差的凝胶由于大量的初始裂解而不能提供长期缓释。在另一方面，当比率大于5∶1时，凝胶形成良好，但是纤维蛋白凝胶中与纤维蛋白原混合的肝素的相对量降低，因而与其偶联的生长因子的量也降低。因此，用与含有治疗有效剂量的蛋白药物的纤维蛋白凝胶的量上升，而蛋白药物的缓释效率则下降。
在一实施方案中，提供了制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的试剂盒，该试剂盒包含肝素偶联的纤维蛋白原、无肝素纤维蛋白原和凝血酶。试剂盒中肝素偶联的纤维蛋白原与无肝素纤维蛋白原的比率为1∶1至5∶1。可以分别地将肝素偶联的纤维蛋白原、无肝素纤维蛋白原和凝血酶冻干并保存，在本发明的制备凝胶的方法前，将它们的每一种溶于缓冲溶液，然后共同混合。优选地，在制备纤维蛋白凝胶之前，利用双通道注射器，容易地将每种溶于缓冲溶液的组分混合。
在另一实施方案中，提供了用于制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的试剂盒，该试剂盒除了肝素偶联的纤维蛋白原、未与肝素偶联的游离纤维蛋白原和凝血酶以外，包含与肝素偶联的生长因子。生长因子可以选自但不限于BMP、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在本发明中，可以包含至少一种生长因子，其可以是例如，通过混合各种类型的生长因子而产生的混合物，例如富含血小板的血浆(PRP)。
如何控制用于制备纤维蛋白的其他组分或反应条件是本领域技术人员已知的。例如，为了溶解纤维蛋白原混合物，可以使用抑酶肽溶液。当通过纤维蛋白原与凝血酶的交联聚合来制备纤维蛋白时，抑酶肽延缓纤维蛋白的天然酶促降解。在本发明的方法中，可以将凝血酶溶于含有氯化钙的溶液中。取决于纤维蛋白原和凝血酶溶液的浓度，可以控制凝块形成时间和凝块硬度。在这种情况下，溶解的凝血酶的量可以与纤维蛋白原混合物相同。
在本发明的另一实施方案中，提供了生长因子载体，其包含具有肝素直接偶联的纤维蛋白原的纤维蛋白凝胶；以及至少一种生长因子。使本发明制备的纤维蛋白凝胶与上述生长因子键合，并以纤维蛋白凝胶组合物的形式注射入人体，从而向局部位置长期释放生长因子。因此，其可以用作刺激诸如骨、皮肤、血管、软骨等的组织再生的治疗药物。特别地，通过简单地注射入人体，通过本发明的方法制备的纤维蛋白凝胶可以广泛地用于治疗骨缺损、灼伤、糖尿病或缺血性足部溃疡、缺血性心脏病、肢体缺血、退行性软骨病等。
实施例
实施例1：肝素的活化
将100mg(0.00002摩尔)低分子量肝素(分子量：4000-6000；Sigma)完全溶于1ml的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，Sigma)缓冲溶液(0.05M，pH 6.0)中，并向其中添加0.0046g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.00008M)和0.015336g的盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC，0.004M)以在4℃下反应12小时，从而制备NHS-肝素溶液。利用丙酮酸酐(acetone anhydride)，将NHS-肝素溶液沉淀并萃取，然后冻干24小时。
实施例1-1：活化的肝素与纤维蛋白原的偶联
将实施例1中制备的冻干NHS-肝素(60mg)和人血浆来源的纤维蛋白原(100mg)完全溶于20ml的磷酸缓冲盐水(pH 7.4)中，并在4℃下反应3小时。此时，纤维蛋白原缓慢地溶解，从而不起泡。反应后，利用丙酮酸酐将所得的溶液沉淀并避光冻干，从而制备肝素偶联的纤维蛋白原。通过NMR和FTIR分析证实了活化的肝素与纤维蛋白原的偶联，并且分析结果分别示于图1和2中。同时，将如上制备的肝素偶联的纤维蛋白原完全溶于20ml的磷酸缓冲盐水中，并且于4℃下，通过多孔膜袋(MWCO：12-14000)渗析24小时将残留的未反应肝素洗脱，同时更换蒸馏水超过3次。将洗脱的肝素偶联的纤维蛋白原避光冻干48小时，从而获得肝素偶联的纤维蛋白原的白色粉末。
实施例1-2：肝素偶联的纤维蛋白原中肝素的定量
实施例1-1中制备的肝素偶联的纤维蛋白原中的肝素通过甲苯胺蓝分析来定量。简言之，将肝素偶联的纤维蛋白原添加至试管中的2ml的0.02％NaCl水溶液中，然后添加500μl的含0.005％甲苯胺蓝的0.001N HCl溶液。将上述混合物孵育30分钟，并温和地摇动。向混合物中添加3ml正己烷并剧烈摇动10至15秒，然后将混合物放置以稳定层。当确定除去泡时，借此稳定地分离己烷的上层和水的下层，从水的下层取出约200μl的样品以进行ELISA。然后，利用UV分光光度计，于630nm处分析样品。计算的肝素含量为42.73mg/g。
实施例2：含有骨形态发生蛋白的纤维蛋白凝胶的制备
将骨形态发生蛋白(BMP)溶于用作蛋白酶抑制剂的抑酶肽溶液中。将实施例1-1中制备的肝素偶联的纤维蛋白原(33mg)与可商购的人血浆来源的纤维蛋白原(66mg)以1∶2的比率混合，并溶于上述抑酶肽溶液(1000μl)中，从而制备纤维蛋白原溶液。同时，将等量的人血浆来源的凝血酶(10mg)溶于溶解了氯化钙的溶液(1000μl)中，并与所述纤维蛋白原溶液混合，从而获得BMP偶联的纤维蛋白凝胶(100μl)蛋白载体。
实施例2-1：纤维蛋白凝胶中的BMP的释放行为
通过人工地将BMP与可商购的无肝素纤维蛋白凝胶混合来获得对照组1，通过将肝素和BMP与可商购的纤维蛋白凝胶混合来获得对照组2。即，在对照组1和2中，使BMP不与纤维蛋白凝胶和肝素混合，或者与纤维蛋白和肝素之一混合。
同时，将作为实验组的实施例2中制备的BMP偶联的纤维蛋白凝胶组合物缓慢地在37℃下搅拌，并检查BMP释放行为28天。BMP释放行为示于图3的图中。如图3所示，可以证实，在开始的3天中，从对照组1和2的纤维蛋白凝胶组合物释放了约80％或更多的BMP，而在13天内从实验组(本发明的实施例2)的纤维蛋白凝胶组合物中缓慢地释放了约80％或更多的与肝素偶联的BMP。
实施例3：游离纤维蛋白原和肝素含量对制备纤维蛋白凝胶的影响的评价
通过凝血酶的作用检查了肝素偶联的纤维蛋白原是否能够单独地制备纤维蛋白凝胶。
不混合无肝素纤维蛋白原，根据实施例1制备了肝素偶联的纤维蛋白原，并且利用包含凝血酶的纤维蛋白制备条件，在形成凝胶的程度中进行检查。当将抑肽酶缓冲溶液中的纤维蛋白原与凝血酶溶液的混合物仅利用无肝素纤维蛋白原通过交联进行聚合时，促进了凝胶形成，但是当仅利用肝素偶联的纤维蛋白原通过交联将该混合物进行聚合时，没有形成凝胶(参见图4)。在图4中可以证实，甚至当在凝胶形成反应后将形成板倾斜时，利用无肝素纤维蛋白原的产物不流动(run)，而利用肝素偶联的纤维蛋白原的产物不能形成凝胶，因而会流动。
然后，通过分别将纤维蛋白原与肝素偶联的纤维蛋白原以1∶1、1.5∶1和2∶1的比率混合来制备纤维蛋白凝胶，所述纤维蛋白原在开始反应前没有与肝素偶联(游离纤维蛋白原)。在图5中，示出了根据无肝素纤维蛋白原的渐增含量而形成的凝胶。无肝素纤维蛋白原含量的增加促进形成凝胶。
实施例4：纤维蛋白凝胶中血小板源性生长因子的释放行为
将1ml富含血小板的血浆(PRP)与100mg纤维蛋白原混合物混合，所述纤维蛋白原混合物是通过将实施例1-1中制备的肝素偶联的纤维蛋白原与可商购的人血浆来源的纤维蛋白原以1∶2的比率混合而制备的，并且将人血浆来源的凝血酶(10mg)溶于溶解了氯化钙的溶液(1000μl)中，并与所述纤维蛋白原混合物溶液混合，从而获得100μl的PRP偶联的纤维蛋白凝胶蛋白载体。
作为对照组，除了利用可商购的无肝素纤维蛋白凝胶以外，使用如上文所述地制备的纤维蛋白凝胶蛋白载体。
作为实验组，将体外制备PRP-凝血酶纤维蛋白凝胶和PRP-肝素偶联的纤维蛋白原(HCF)在37℃下缓慢搅拌，并检查血小板源性生长因子(PDGF)的释放行为10天。PDGF的释放行为示于图6的图中。如图6所示，可以证实，在第1天至第6天，从对照组纤维蛋白凝胶释放了大部分PDGF，而从实验组缓慢地释放了PDGF，并且第10天的水平甚至高于第1天，所述实验组为PDGF-肝素偶联的纤维蛋白凝胶。
根据肝素偶联的纤维蛋白凝胶的制备方法，可以以低成本制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶，其是与肝素偶联的纤维蛋白凝胶，并且对诸如生长因子的药物具有亲和力。
另外，通过与对肝素具有亲和力的生长因子结合，可以将通过本发明的方法制备的肝素偶联的纤维蛋白凝胶制备为含有生长因子的纤维蛋白凝胶组合物。通过本发明的方法制备的纤维蛋白凝胶组合物可以有效地递送生长因子，因此通过注射入人体，持续地向局部位置长期持续释放诸如生长因子等的药物，通过本发明的方法制备的纤维蛋白凝胶组合物可以以低成本开发为能够有效地治疗治疗骨缺损、灼伤、糖尿病或缺血性足部溃疡、缺血性心脏病、肢体缺血和退行性软骨病的高效治疗药物。
尽管示出和描述了本发明的示例性实施方案，但是本领域技术人员应当理解，可以对所述的示例性实施方案做出各种变化而不偏离由所附权利要求及其等同物所定义的本发明的精神和范围。

Claims (12)

1.制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的方法，包括：
a)将肝素活化；
b)将所述活化的肝素与纤维蛋白原偶联以制备肝素偶联的纤维蛋白原；
c)将游离纤维蛋白原与步骤b)中的肝素偶联的纤维蛋白原混合以制备纤维蛋白原混合物；以及
将凝血酶与步骤c)中的纤维蛋白原混合物混合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述纤维蛋白凝胶为可注射凝胶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述纤维蛋白原为源自哺乳动物的纤维蛋白原。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述肝素的分子量为约1000至约20000。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，通过肝素、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺之间的反应将所述肝素活化为NHS-肝素。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中，所述肝素偶联的纤维蛋白原通过NHS-肝素的羧基与所述纤维蛋白原的蛋白中的氨基之间的反应来制备。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤c)中的纤维蛋白原混合物通过将所述纤维蛋白原与所述肝素偶联的纤维蛋白原以1∶1至5∶1的比率混合来制备。
9.用于制备肝素偶联的纤维蛋白凝胶的试剂盒，包含：
肝素偶联的纤维蛋白原；
未与肝素偶联的游离纤维蛋白原；以及
凝血酶。
10.如权利要求9所述的试剂盒，还包含与肝素偶联的生长因子。
11.如权利要求9或10所述的试剂盒，其中所述生长因子包括选自骨形态发生蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGFs)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGFs)和成纤维细胞生长因子(FGF)的至少一种。
12.生长因子载体，包含含有与肝素直接偶联的纤维蛋白原的纤维蛋白凝胶和至少一种生长因子。
CN200980123952.XA 2008-04-28 2009-04-28 肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒 Active CN102065917B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2008-0039322 2008-04-28
KR20080039322 2008-04-28
KR1020090035779A KR100971271B1 (ko) 2008-04-28 2009-04-24 헤파린이 결합된 피브린젤, 그 제조방법 및 키트
KR10-2009-0035779 2009-04-24
PCT/KR2009/002220 WO2009134054A2 (en) 2008-04-28 2009-04-28 Heparin-conjugated fibrin gel and method and kit for preparing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102065917A true CN102065917A (zh) 2011-05-18
CN102065917B CN102065917B (zh) 2014-05-14

Family

ID=41255545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980123952.XA Active CN102065917B (zh) 2008-04-28 2009-04-28 肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20110091443A1 (zh)
EP (1) EP2282785B1 (zh)
JP (1) JP5390595B2 (zh)
KR (1) KR100971271B1 (zh)
CN (1) CN102065917B (zh)
AU (1) AU2009243343B2 (zh)
CA (1) CA2728939C (zh)
WO (1) WO2009134054A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497344A (zh) * 2013-09-25 2014-01-08 深圳先进技术研究院 用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用
CN104004709A (zh) * 2014-05-05 2014-08-27 曾奕明 用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统
CN106924807A (zh) * 2017-01-17 2017-07-07 华南师范大学 一种修饰纳米导电聚苯胺心脏组织工程支架的制备方法及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008081463A2 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Hepacore Ltd. Water soluble reactive derivatives of carboxy polysaccharides and fibrinogen conjugates thereof
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
PL2793909T3 (pl) * 2011-12-22 2021-06-28 Corline Biomedical Ab Roztwór wodny zawierający wielkocząsteczkowy koniugat heparyny do traktowania naczyń krwionośnych
KR101399696B1 (ko) * 2012-05-07 2014-05-27 동국대학교 산학협력단 연골손상부위로 줄기세포의 이동을 촉진시키는 물질의 스크리닝 방법
KR101561744B1 (ko) * 2013-12-19 2015-10-20 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 3차원 세포이식용 패치 및 그의 제조방법
GB201415062D0 (en) * 2014-08-26 2014-10-08 Aplagon Oy Therapeutic

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01190636A (ja) 1988-01-22 1989-07-31 Green Cross Corp:The 制癌作用物質複合体
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
DE69929323T2 (de) * 1999-04-22 2006-09-07 Eidgenössische Technische Hochschule (ETH) Kontrollierte abgabe der wachstumsfaktoren von heparin enthaltenden matrizen
EP1175235A1 (en) * 1999-04-22 2002-01-30 Eidgenossisch Technische Hochschule Zurich Modified protein matrices
MXPA03009760A (es) * 2001-04-25 2005-10-05 Eidgenoessische Technische Hoc Matrices de suministro de farmacos para mejorar la curacion de heridas.
JP5156890B2 (ja) * 2002-09-11 2013-03-06 独立行政法人物質・材料研究機構 高分子架橋体及びその製造方法
WO2004067704A2 (en) 2003-01-30 2004-08-12 Prochon Biotech Ltd. Freeze-dried fibrin matrices and methods for preparation thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497344A (zh) * 2013-09-25 2014-01-08 深圳先进技术研究院 用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用
CN103497344B (zh) * 2013-09-25 2015-09-23 深圳先进技术研究院 用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用
CN104004709A (zh) * 2014-05-05 2014-08-27 曾奕明 用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统
CN106924807A (zh) * 2017-01-17 2017-07-07 华南师范大学 一种修饰纳米导电聚苯胺心脏组织工程支架的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009243343B2 (en) 2012-07-05
CA2728939A1 (en) 2009-11-05
US20110091443A1 (en) 2011-04-21
AU2009243343A1 (en) 2009-11-05
EP2282785A2 (en) 2011-02-16
EP2282785A4 (en) 2013-07-31
EP2282785B1 (en) 2014-12-31
CN102065917B (zh) 2014-05-14
WO2009134054A2 (en) 2009-11-05
KR100971271B1 (ko) 2010-07-20
JP5390595B2 (ja) 2014-01-15
KR20090113770A (ko) 2009-11-02
WO2009134054A3 (en) 2010-01-14
CA2728939C (en) 2013-08-06
JP2011518635A (ja) 2011-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102065917B (zh) 肝素偶联的纤维蛋白凝胶及用于制备其的方法与试剂盒
US8309518B2 (en) Drug delivery matrices to enhance wound healing
AU2006204461C1 (en) Supplemented matrices for the repair of bone fractures
AU2009201588B2 (en) Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7247609B2 (en) Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
MX2007007732A (es) Hidrogeles peg con grupos funcionales para la reaccion de adicion tipo michael con biofactores incorporados con el factor xiiia.
KR20070108868A (ko) Ｂｍｐ 또는 ｐｔｈ 방출 매트릭스에 의한 골 결손의 국소치료
KR20190040757A (ko) 성장인자 모사 단백질이 도입된 생체물질, 이의 제조방법 및 이의 응용
EP1465989B1 (en) Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
EP1837040A2 (en) Drug delivery matrices to enhance wound healing
EP1864681A1 (en) Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
NO331726B1 (no) Fusjonspeptid som omfatter et forste domene som omfatter paratyroidhormon (PTH) og et andre domene som omfatter et substratdomene, sett og matriks som omfatter fusjonspeptidet, og fremgangsmate til a fremstille en matriks
Monteiro et al. Biomaterials Advances

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Lotus cave South Korean city of Seoul Zhong Road District No. 263

Patentee after: Sanyang holding Co.

Address before: Lotus cave South Korean city of Seoul Zhong Road District No. 263

Patentee before: SAMYANG Corp.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210810

Address after: Seoul City, Korea

Patentee after: Sanyang holding Co.

Address before: Lotus cave South Korean city of Seoul Zhong Road District No. 263

Patentee before: Sanyang holding Co.

TR01 Transfer of patent right