KR20190040757A - 성장인자 모사 단백질이 도입된 생체물질, 이의 제조방법 및 이의 응용 - Google Patents

성장인자 모사 단백질이 도입된 생체물질, 이의 제조방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질, 이를 포함하는 천연 생체물질 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

성장인자 모사 단백질이 도입된 생체물질, 이의 제조방법 및 이의 응용{BIOMATERIAL INDUCED GROWTH FACTOR MIMICKING PEPTIDE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME AND APPLICATION OF THE SAME}
본 발명은 성장인자 모사 단백질이 도입된 생체물질, 이의 제조방법 및 이의 응용에 관한 것이다.
생체물질로서, 생체적합성이 우수하고 생체 내에서 분해되는 생분해성 소재에 대한 연구는 오랜시간 지속되고 있다. 구체적으로, 천연 생분해성 고분자 소재 또는 합성 생분해성 고분자 소재 등에 대한 연구가 집중되고 있다. 보다 구체적으로 천연 생분해성 고분자 소재로는 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트 등의 폴리사카라이드류; 콜라겐, 젤라틴 등의 폴리펩타이드류; 폴리-L-글루탐산, 폴리-L-라이신 등의 폴리아미노산류 등이 있다. 이때, 폴리사카라이드류는 카르복실기를 작용기로 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 천연 생체물질에 다양한 기능을 가지도록 하는 기술이 개발되고있다. 이와 관련하여, 천연 생체물질 및 성장인자 모사 단백질을 물리적으로 포함하는 기술에 대한 연구는 진행된 바 있으나, 천연 생체물질 및 성장인자 모사 단백질 간의 화학적 결합에 대한 연구는 전무한 것으로 알려져 있다.
본 발명은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질을 제공한다.
상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 성장인자 모사 단백질은 혈관내피 성장인자(VEGF) 모사 단백질, 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질, 뼈 형성 단백질(BMP-2, BMP-4 또는 BMP-7) 모사 단백질, 인슐린 성장인자(IGF) 모사 단백질, 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 모사 단백질, 혈소판-유래 성장인자(PDGF) 모사 단백질, 기저세포 유래 인자(SDF-1α) 및 물질 P(Substance P)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 제1 화학 작용기 및 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질을 포함하는 제1액; 및 제2 화학 작용기 및 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질을 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 성장인자 모사 단백질 및 상기 제2 성장인자 모사 단백질은 각각 상기 제1 천연 생체 물질 및 상기 제2 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 것이고, 상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 제공한다.
상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기의 조합은 (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, (a) 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; (b) 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기와 화학적으로 결합가능한 제2 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1액 및 상기 제2액을 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 (a)에서 제1 성장인자 모사 단백질 또는 상기 (b)에서 제2 성장인자 모사 단백질의 도입은 축합제의 투입에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 여전히 다른 구현예로, 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진방법을 제공한다.
본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는바, 성장인자 모사 단백질이 단순 혼합된 경우에 비해, 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진 효과 등이 우수한 이점을 가진다.
본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 하이드로겔 형태로 제조되어, 주사제형 등으로 다양한 응용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 및 이를 포함하는 하이드로겔 및 이를 포함하는 천연 생체물질 하이드로겔을 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 실시예 4, 7에서 성장인자 모사 단백질(BMP2_MP, VEGF_MP) 및 Tet가 도입된 히알루론산 및 비교예 1에서 Tet가 도입된 히알루론산을 1H-NMR을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질(TGF_MP, BMP2_MP, VEGF_MP)가 도입된 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 유변학적 특성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질(TGF_MP, BMP2_MP, VEGF_MP)가 도입된 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 외형을 보여주는 사진이다.
도 5는 실험예 3에 따른 In vitro 상에서 TGF_MP의 방출 거동 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 4에 따른 In vivo 상에서 TGF_MP의 방출 거동 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 줄기세포에서 연골세포로 분화 유도시켰는지 여부를 확인한 사진[(a) alcian blue 염색, (b) safranin O]이다.
도 8는 실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 3에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 줄기세포에서 골세포로 분화 유도시켰는지 여부를 확인한 사진[(a) von Kossa(VK) 염색, (b) alizarin red S(ARS)]이다.
도 9는 실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1, 2에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 줄기세포에서 골세포로 분화를 촉진시켜 osteocalcin (OC) 유전자 및 collagen type 1 (COL1A) 유전자의 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 실시예 7에서 제조된 VEGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 혈관신생을 촉진시켰는지 여부를 확인한 사진[Hematoxylin & eosin(H&E) 염색]이다.
본 발명자들은 천연 생체물질을 대상으로 한 연구를 지속하던 중, 천연 생체물질에 아마이드 결합을 통해 성장인자 모사 단백질을 도입함으로써, 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진 용도로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질
본 발명은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질을 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질을 포함하는데, 상기 천연 생체물질은 천연 유래의 생체적합성 및 생분해성 소재에 해당하는 것으로, 카르복실기를 작용기로 포함하는 것을 말한다. 이때, 상기 카르복실기는 후술하는 성장인자 모사 단백질의 아민기와 아마이드 결합을 이룰 수 있다.
구체적으로, 상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 천연 생체물질은 히알루론산을 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 천연 생체물질이 히알루론산인 경우, 이의 분자량은 500,000 Da 내지 6,000,000 Da일 수 있다. 이때, 히알루론산의 분자량이 상기 범위 미만인 경우, 물성이 너무 낮아지는 문제점이 있고, 히알루론산의 분자량이 상기 범위를 초과하는 경우, 점도 상승에 따른 사용시 문제점이 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 성장인자 모사 단백질을 포함하는데, 상기 성장인자 모사 단백질은 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 것이다.
상기 성장인자 모사 단백질은 일반적인 성장인자에 비해, 천연 생체물질에 안정적인 도입이 가능한 이점을 가질 뿐만 아니라, 비용면에서도 경제적인 이점을 가진다.
구체적으로, 성장인자 모사 단백질은 혈관내피 성장인자(VEGF) 모사 단백질, 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질, 뼈 형성 단백질(BMP-2, BMP-4 또는 BMP-7) 모사 단백질, 인슐린 성장인자(IGF) 모사 단백질, 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 모사 단백질, 혈소판-유래 성장인자(PDGF) 모사 단백질, 기저세포 유래 인자(SDF-1α) 및 물질 P(Substance P)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 혈관내피 성장인자(VEGF) 모사 단백질, 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질, 뼈 형성 단백질(BMP-2) 모사 단백질, 기저세포 유래 인자(SDF-1α) 및 물질 P(Substance P)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 상기 천연 생체물질이 히알루론산인 경우, 이의 반복단위 당 상기 도입된 성장인자 모사 단백질의 평균 개수는 0.1개 내지 0.3개인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때 성장인자 모사 단백질의 도입비가 너무 낮은 경우에는 성장인자 모사 단백질로 인한 효과가 제대로 발휘되지 않는 문제점이 있고, 성장인자 모사 단백질의 도입비가 너무 높은 경우에는 원활한 도입이 어려운 문제점이 있다.
선택적으로, 상기 천연 생체물질에 상기 성장인자 모사 단백질을 도입하기 위해서는 상기 천연 생체 물질 용액에 축합제를 추가로 포함함으로써, 축합 반응을 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 축합제로 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)를 사용하였고, 축합제의 양은 축합 반응 정도를 제어하기 위해 조절될 수 있다.
일예로, 상기 천연 생체물질에 성장인자 모사 단백질로서, 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질을 도입하는 구체적인 반응은 하기 반응식 1에서 나타내었다. 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질 외에 다른 성장인자 모사 단백질의 경우에도 유사한 반응을 통해 도입될 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00001
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및 상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는바, 성장인자 모사 단백질이 단순 혼합된 경우에 비해, 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진 효과 등이 우수한 이점을 가진다.
성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔
본 발명은 제1 화학 작용기 및 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질을 포함하는 제1액; 및 제2 화학 작용기 및 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질을 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 성장인자 모사 단백질 및 상기 제2 성장인자 모사 단백질은 각각 상기 제1 천연 생체 물질 및 상기 제2 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 것이고, 상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 제공한다.
즉, 본 발명자들은 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질의 효과를 확인하기 위한 일 구현예로서, 하이드로겔 형태로 제조한 것이다. 상기 하이드로겔은 물을 분산매로 하는 겔로서, 겔은 졸이 유동성을 잃고 고화된 상태로 분산상의 용해도가 저하되어 서로 연결되고 망목구조를 취하며 그 중에 분산모가 포함되어 있는 것이다.
상기 제1 또는 제2 천연 생체물질은 상기 제1 또는 제2 화학 작용기 및 상기 제1 또는 제2 성장인자 모사 단백질의 도입 전을 기준으로, 분자량이 서로 동일하거나, 상이할 수 있고, 구체적으로, 500,000 Da 내지 6,000,000 Da인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 제1 또는 제2 천연 생체물질은 상기 제1 또는 제2 성장인자 모사 단백질 외에, 상기 제1 또는 제2 화학 작용기를 도입한 것을 특징으로 한다.
상기 제1 및 제2 화학 작용기는 서로 화학적으로 결합가능할 수 있다. 이러한 화학적 결합은 짧은 시간, 특히, 수초 이내에 이루어질 수 있는 것으로, 단시간 안에 겔화가 가능한 이점을 가진다. 구체적으로, 상기 제1 및 제2 화학 작용기의 조합은 (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기)일 수 있다.
상기 제1 히알루론산의 반복단위 당 상기 도입된 제1 화학 작용기의 평균 개수; 또는 상기 제2 히알루론산의 반복단위 당 상기 도입된 제2 화학 작용기의 평균 개수를 조절함으로써, 상기 천연 생체물질 하이드로겔의 가교도를 조절할 수 있고, 결과적으로, 적용 부위를 최적화시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 천연 생체물질 하이드로겔이 낮은 가교도를 가지는 경우에는, 낮은 강도 및 높은 팽윤도로 인하여 각종 연조직에 적용이 가능할 수 있다. 한편, 상기 천연 생체물질 하이드로겔이 중간 가교도를 가지는 경우에는, 연골 조직에 적용되어, 관절염, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 한편, 상기 천연 생체물질 하이드로겔이 높은 가교도를 가지는 경우에는, 높은 강도 및 낮은 팽윤도로 인하여 골 조직에 적용되어, 골다골증 또는 골결손질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
선택적으로, 상기 제1 또는 제2 천연 생체물질에 상기 제1 또는 제2 화학 작용기를 도입하기 위해서는 상기 제1 또는 제2 천연 생체 물질 용액에 축합제를 추가로 포함함으로써, 축합 반응을 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 축합제로 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)를 사용하였고, 축합제의 양은 축합 반응 정도를 제어하기 위해 조절될 수 있다.
그밖에, 상기 제1 또는 제2 천연 생체물질(즉, 천연 생체물질)과, 상기 제1 또는 제2 성장인자 모사 단백질(즉, 성장인자 모사 단백질)에 대해서는 전술한 바와 동일하므로, 중복설명을 생략하기로 한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질은 하이드로겔 형태로 제조되어, 특히, 주사제형 등으로 다양한 응용이 가능하다.
성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법
본 발명은 (a) 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; (b) 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기와 화학적으로 결합가능한 제2 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1액 및 상기 제2액을 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법은 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계[(a) 단계]; 및 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기와 화학적으로 결합가능한 제2 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
구체적으로, 상기 제 1액은 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질에 제1 화학 작용기 포함 물질을 투입한 용액으로, 상기 제1 성장인자 모사 단백질의 도입은 축합제의 투입에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 제1 화학 작용기 포함 물질은 메틸테트라진-아민(methyltetrazine-amine), 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine), 메틸테트라진-프로필아민(methyltetrazine-propylamine), 테트라진-PEG5-NHS 에스테르(tetrazine-PEG5-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-NHS 에스테르(methyltetrazine-PEG4-NHS ester), 메틸테트라진-설포-NHS 에스테르(methyltetrazine-sulfo-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-산(methyltetrazine-PEG4-acid), 메틸테트라진-PEG12-NHS 에스테르(methyltetrazine-PEG12-NHS ester), 메틸테트라진-NHS 에스테르(methyltetrazine-NHS ester), 메틸테트라진-산(methyltetrazine-acid), 테트라진-산(tetrazine-acid), 아미노-PEG4-알킬렌(amino-PEG4-alkyne), 알킬렌-PEG5-산(alkyne-PEG5-acid), 알킬렌-PEG-아민(alkyne-PEG-amine), 옥시란닐아민(oxiranylamine), 2-옥시란닐-에틸아민(2-oxiranyl-ethylamine), 아크릴아마이드(acrylamide), 아크릴산(acrylic acid) 및 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 상기 제1 화학 작용기 포함 물질로서, 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine)을 투입하였고, 구체적인 반응은 하기 반응식 2에서 나타내었다.
[반응식 2]
Figure pat00002
또한, 상기 제2액은 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질에 제2 화학 작용기 포함 물질을 투입한 용액으로, 상기 제2 성장인자 모사 단백질의 도입은 축합제의 투입에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2 화학 작용기 포함 물질은 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine), 트랜스-사이클로옥텐-NHS 에스테르(trans-cyclooctene-NHS ester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG-NHS 에스테르(trans cyclooctene-PEG-NHS ester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG4-산(trans cyclooctene-PEG4-acid), 아자이드-PEG4-아민(azide-PEG4-amine), 3-아미노-1-프로판티올(3-amino-1-propanethiol), 11-메르캅토운데칸산(11-mercaptoundecanoic acid), 아미노-메탄티올(amino-methanethiol), 티올 PEG 아민(thiol PEG amine), 에틸렌 디아민(ethylene diamine), PEG 디아민(PEG diamine), (S)-3-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판산((S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid) 및 아미노-아세트산(amino-acetic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 상기 제2 화학 작용기 포함 물질로서, 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)을 투입하였고, 구체적인 반응은 하기 반응식 3에서 나타내었다.
[반응식 3]
Figure pat00003
상기 제1 또는 상기 제2 천연 생체물질 용액에 제1 또는 제2 화학 작용기의 도입 역시, 축합제의 투입에 의해 수행될 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법은 (c) 상기 제1액 및 상기 제2액을 화학적으로 결합시키는 단계를 포함한다.
상기 제1액 및 상기 제2액의 화학적 결합은 제1 화학 작용기 및 제2 화학 작용기의 화학적 결합을 통해 이루어지는 것으로, 이러한 화학적 결합은 짧은 시간, 특히, 수초 이내에 이루어질 수 있는 것으로, 단시간 안에 겔화가 가능한 이점을 가진다.
본 발명에서는 제1 화학 작용기 및 제2 화학 작용기의 조합으로 (테트라진, 사이클로옥텐)을 채용하였고, 이들이 서로 반응하여 화학적 결합을 이루었고, 구체적인 반응식은 하기 반응식 4에 나타내었다:
[반응식 4]
Figure pat00004
줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진용 조성물
본 발명은 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신행 촉진용 조성물은 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 포함하는 것으로, 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔 각각에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 명세서 내 “줄기세포”라 함은 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 것으로, 상기 줄기세포는 골수(bone-marrow, BM), 말초신경 혈액, 제대혈, 골막(periosteum), 진피(dermis) 및 중배엽 기원의 조직 등으로부터 분리되고 정제될 수 있다.
본 명세서 내 "분화(differentiation)"라 함은 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상이다.
상기 줄기세포 분화 유도용 조성물은 줄기세포로부터 골세포 또는 연골세포로 분화를 유도할 수 있는 것으로, 줄기세포로부터 골세포로 분화를 유도하는 경우, 골다골증 또는 골결손질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있고, 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도하는 경우, 관절염, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 줄기세포 분화 유도용 조성물은 줄기세포 포집용 조성물과 함께 사용할 수 있는데, 상기 줄기세포 포집용 조성물이라 함은 환자의 치료하고자 하는 부위에 환자 자신의 줄기세포를 끌어들여 스스로의 세포로 치료할 수 있도록 하는 조성물을 말한다.
본 명세서 내 "혈관신생(angiogenesis)"이라 함은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생하는 것을 의미한다. 이러한 혈관신생 과정은 혈관생성 성장인자(angiogenic growth factor)가 기존 혈관에 휴지상태로 존재하는 혈관내피세포에 존재하는 수용체를 활성화시키고, 활성화된 혈관 내피세포가 주변의 기저막 및 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소를 분비하기 시작하여, 혈관내피세포가 기존 혈관벽으로부터 벗어나서 혈관생성인자(angiogenic factor)를 분비하는 조직을 향해 이동하고 증식함으로써, 이루어질 수 있다. 혈관신생이 제대로 이루어지지 않거나 혈액 공급이 원활하게 이루어지지 않는 경우에는 혈관신생 의존성 질환이 발생할 수 있다.
상기 혈관신생 촉진용 조성물은 혈관신생 의존성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있는 것으로, 상기 혈관신생 의존성 질환은 상처, 화상, 동맥경화, 심근경색, 협심증, 정맥류 및 뇌혈관성 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 질환일 수 있다.
상기 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 처리량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 처리할 수 있다. 처리는 하루에 한 번 처리할 수도 있고, 수회 나누어서 처리할 수도 있다. 다만, 상기 처리량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 마우스, 래트, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 처리할 수 있다.
그밖에, 본 발명은 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 상기 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 형질전환 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 및 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 히알루론산(HA)(분자량: (1,000,000 Da)) 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 히알루론산 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 각각의 바이알에 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 0.7 mg을 투입한 후, 이를 아미노산 서열이 LIAEAK인 형질전환 성장인자 모사 단백질(Transforming growth factors mimicking peptide)(TGF_MP) 0.332 mg 포함하는 3차 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 TGF_MP가 도입된 히알루론산을 제조하였다.
(3) TGF_MP가 도입된 히알루론산을 1중량% 되도록 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 용액 5 mL를 제조하였다, 여기에 축합제로서 DMTMM 8.3 mg과 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine)(Tet) 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 TGF_MP가 도입된 HA-Tet를 제조하였다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이, Flash EA1112 장치 (CE Instruments, Italy) 원소분석을 통해 HA-Tet에 TGF_MP가 도입된 양을 분석하였다.
(4) (3)과 동일한 방법으로 수행하고 Tet 대신 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)(TCO) 7.7mg을 투입하여 TGF_MP가 도입된 HA-TCO를 제조하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, Flash EA1112 (CE Instruments, Italy)장치를 이용하여 원소분석을 통해 HA-TCO에 TGF_MP가 도입된 양을 분석하였다.
샘플 C (%) H (%) N (%) C/N 몰비 치환도(%)
HA-Tet 39.4 5.9 4.5 10.2 -
TGF_MP가 도입된 HA-Tet 37.1 5.4 4.2 10.3 0.2
HA-TCO 38.8 6.4 3.8 12 -
TGF_MP가 도입된 HA-TCO 39.3 5.8 3.9 11.9 0.2
(5) TGF_MP가 도입된 HA-Tet와 TGF_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 2: 형질전환 성장인자 모사 단백질이 도입된 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 제조
(1) 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 실시예 1과 동일하게 진행하여 TGF_MP가 도입된 CMC-Tet 및 TGF_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 제조하였다.
(2) TGF_MP가 도입된 CMC-Tet 및 TGF_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TGF_MP가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 3: 형질전환 성장인자 모사 단백질이 도입된 알지네이트 및 알지네이트 하이드로겔 제조
(1) 알지네이트 (alginate, AGNT)를 사용하여 실시예 1과 동일하게 진행하여 TGF_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 TGF_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 제조하였다.
(2) TGF_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 TGF_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 TGF_MP가 도입된 알지네이트 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 4: 뼈 형성 단백질 모사 단백질이 도입된 히알루론산 및 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 HA 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 히알루론산 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 각각의 바이알에 축합제로서 DMTMM 0.7 mg을 투입한 후, 이를 아미노산 서열이 KIPKASSVPTELSAISTLYL인 뼈 형성 단백질 모사 단백질(Bone morphogenetic protein 2 mimicking peptide)(BMP2_MP) 1.06 mg을 포함한 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 BMP2_MP가 도입된 히알루론산을 제조하였다.
(3) BMP2_MP가 도입된 히알루론산을 1중량% 되도록 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 용액 5 mL를 제조하였다, 여기에 축합제로서 DMTMM 8.3 mg과 Tet 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 BMP2_MP가 도입된 HA-Tet를 제조하였다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이, TNBSA 분석을 통하여 도입된 BMP2_MP를 확인하였다.
(4) (3)과 동일한 방법으로 수행하고 Tet 대신 TCO 7.7mg을 투입하여 BMP2_MP가 도입된 HA-TCO를 제조하였다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이, TNBSA 분석을 통하여 도입된 BMP2_MP를 확인하였으며, 1H-NMR을 통하여 도 2와 같이 BMP2_MP를 확인하였다.
샘플 BMP2_MP(ug/mg)meas
BMP2_MP가 도입된 HA-Tet 16.5
BMP2_MP가 도입된 HA-TCO 14.8
(5) BMP2_MP가 도입된 HA-Tet 및 BMP2_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 BMP2_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 5: 뼈 형성 단백질 모사 단백질이 도입된 카복시메틸셀루로오스 및 카복시메틸셀루로오스 하이드로겔 제조
(1) 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 실시예 5과 동일하게 진행하여 BMP2_MP가 도입된 CMC-Tet 및 BMP2_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 제조하였다.
(2) BMP2_MP가 도입된 CMC-Tet 및 BMP2_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 BMP2_MP가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 6: 뼈 형성 단백질 모사 단백질이 도입된 알지네이트 및 알지네이트 하이드로겔 제조
(1) 알지네이트(alginate, AGNT)를 사용하여 실시예 5과 동일하게 진행하여 BMP2_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 BMP2_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 제조하였다.
(2) BMP2_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 BMP2_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 BMP2_MP가 도입된 알지네이트 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 7: 혈관내피 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 및 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 HA 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 히알루론산 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 각각의 바이알에 축합제로서 DMTMM 0.7 mg을 투입한 후, 이를 아미노산 서열이 KLTWQELYQLKYKGIK인 혈관내피 성장인자 모사 단백질(Vascular endothelial growth factors mimicking peptide)(VEGF_MP) 0.95 mg를 포함한 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 VEGF_MP가 도입된 히알루론산을 제조하였다.
(3) VEGF_MP가 도입된 히알루론산을 1중량% 되도록 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 용액 5 mL를 제조하였다, 여기에 축합제로서 DMTMM 8.3 mg과 Tet 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 VEGF_MP가 도입된 HA-Tet를 제조하였다.
(4) (3)과 동일한 방법으로 수행하고 Tet 대신 TCO 7.7mg을 투입하여 VEGF_MP가 도입된 HA-TCO를 제조하였다. 1H-NMR을 통하여 도 2와 같이 VEGF_MP를 확인하였다
(5) VEGF_MP가 도입된 HA-Tet 및 VEGF_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 VEGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 8: 혈관내피 성장인자 모사 단백질이 도입된 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀루로오스 하이드로겔 제조
(1) 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 실시예 7과 동일하게 진행하여 VEGF_MP가 도입된 CMC-Tet 및 VEGF_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 제조하였다.
(2) VEGF_MP가 도입된 CMC-Tet 및 VEGF_MP가 도입된 CMC-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 VEGF_MP가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 9: 혈관내피 성장인자 모사 단백질이 도입된 알지네이트 및 알지네이트 하이드로겔 제조
(1) 알지네이트(alginate, AGNT)를 사용하여 실시예 7과 동일하게 진행하여 VEGF_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 VEGF_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 제조하였다.
(2) VEGF_MP가 도입된 AGNT-Tet 및 VEGF_MP가 도입된 AGNT-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 VEGF_MP가 도입된 알지네이트 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 10: 물질 P(substance P)가 도입된 히알루론산 및 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 HA 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 HA 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 각각의 바이알에 축합제로서 DMTMM 0.7 mg을 투입한 후, 이를 아미노산 서열이 RPKPQQFFGLM인 substance P 3.37 mg를 포함한 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 substance P가 도입된 HA를 제조하였다.
(3) substance P가 도입된 HA를 1중량% 되도록 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 용액 5 mL를 제조하였다, 여기에 축합제로서 DMTMM 8.3 mg과 Tet 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 substance P가 도입된 HA-Tet를 제조하였다.
(4) (3)과 동일한 방법으로 수행하고 Tet 대신 TCO 7.7mg을 투입하여 substance P가 도입된 HA-TCO를 제조하였다.
(5) substance P가 도입된 HA-Tet 및 substance P가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 substance P가 도입된 HA 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 11: 물질 P(substance P)가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 제조
(1) 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 실시예 10과 동일하게 진행하여 substance P가 도입된 CMC-Tet 및 substance P가 도입된 CMC-TCO를 각각 제조하였다.
(2) substance P가 도입된 CMC-Tet 및 substance P가 도입된 CMC-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 substance P가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 12: 물질 P(substance P)가 도입된 알지네이트 및 알지네이트 하이드로겔 제조
(1) 알지네이트(alginate, AGNT)를 사용하여 실시예 10과 동일하게 진행하여 substance P가 도입된 AGNT-Tet 및 substance P가 도입된 AGNT-TCO를 각각 제조하였다.
(2) substance P가 도입된 AGNT-Tet 및 substance P가 도입된 AGNT-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 substance P가 도입된 알지네이트 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 13: 기저세포 유래 인자( stromal cell-derived factor 1 alpha; SDF - 1α )가 도입된 히알루론산 및 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 HA 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 HA 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 각각의 바이알에 축합제로서 DMTMM 0.7 mg을 투입한 후, 이를 아미노산 서열이 KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALN인 SDF-1α 20 mg를 포함한 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 SDF-1α가 도입된 HA를 제조하였다.
(3) SDF-1α가 도입된 HA를 1중량% 되도록 3차 증류수에 투입한 후, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 용액 5 mL를 제조하였다, 여기에 축합제로서 DMTMM 8.3 mg과 Tet 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 SDF-1α 가 도입된 HA-Tet를 제조하였다.
(4) (3)과 동일한 방법으로 수행하고 Tet 대신 TCO 7.7mg을 투입하여 SDF-1α가 도입된 HA-TCO를 제조하였다.
(5) SDF-1α가 도입된 HA-Tet와 SDF-1α 가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 SDF-1α가 도입된 HA 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 14: 기저세포 유래 인자( stromal cell-derived factor 1 alpha; SDF - 1α )가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 제조
(1) 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 실시예 13과 동일하게 진행하여 SDF-1α가 도입된 CMC-Tet 및 SDF-1α가 도입된 CMC-TCO를 각각 제조하였다.
(2) SDF-1α가 도입된 CMC-Tet 및 SDF-1α가 도입된 CMC-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 SDF-1α가 도입된 카복시메틸셀룰로오스 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
실시예 15: 기저세포 유래 인자( stromal cell-derived factor 1 alpha; SDF - 1α )가 도입된 알지네이트 및 알지네이트 하이드로겔 제조
(1) 알지네이트(alginate, AGNT)를 사용하여 실시예 13과 동일하게 진행하여 SDF-1α가 도입된 AGNT-Tet 및 SDF-1α가 도입된 AGNT-TCO를 각각 제조하였다.
(2) SDF-1α가 도입된 AGNT-Tet 및 SDF-1α가 도입된 AGNT-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 SDF-1α가 도입된 알지네이트 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
비교예 1: 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
(2) 첫번째 바이알에, 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 8.3 mg과 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine)(Tet) 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 HA-Tet를 제조하였다.
(3) 두번째 바이알에, 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 8.3 mg과 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine)(TCO) 76.657g을 투입하고, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72 시간 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 HA-TCO를 제조하였다.
(4) HA-Tet 및 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 히알루론산 하이드로겔 용액을 최종 제조하였다.
비교예 2: TGF _ MP이 단순 혼합된 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 비교예 1에서 제조한 히알루론산 하이드로겔 용액에 TGF_MP를 실시예 1과 동일한 양이 되도록 넣어주고, 듀얼 실린지를 통해 혼합하여 TGF_MP이 단순 혼합된 히알루론산 하이드로겔 용액을 제조하였다.
비교예 3: BMP2 _ MP이 단순 혼합된 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 비교예 1에서 제조한 히알루론산 하이드로겔 용액에 BMP2_MP를 실시예 1과 동일한 양이 되도록 넣어주고, 듀얼 실린지를 통해 혼합하여 BMP2_MP이 단순 혼합된 히알루론산 하이드로겔 용액을 제조하였다.
실험예 1: 유변학적 특성 평가
실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질(TGF_MP, BMP2_MP, VEGF_MP)가 도입된 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 유변학적 특성을 평가하고자, modular compact rheometer(MCR 102, Anton Paar, Austria)를 이용해 모듈러스 및 점도를 측정하였다. 이때, 사용한 parallel plate는 직경 25 mm이고, 바닥 면과의 간격은 0.3 mm이며, 25℃에서 strain 2%, 1 Hz 조건으로 수행하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3(a)에 나타난 바와 같이, 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔과 동등한 수준의 저장 모듈러스(storage modulus)와 손실 모듈러스 (loss modulus)를 가지는 것을 확인하였고, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔 보다 점도가 상승한 것처럼 보이지만 통계적인 유의성을 나타내지 않았다. 따라서, 성장인사 모사 단백질의 도입이 하이드로젤의 유변한적 특성에 큰 영향을 주지 않았다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: 하이드로겔 형성 관찰
실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질(TGF_MP, BMP2_MP, VEGF_MP)가 도입된 HA-Tet와 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질(TGF_MP, BMP2_MP, VEGF_MP)가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, TGF_MP가 도입된 HA-Tet와 HA-TCO, BMP2_MP가 도입된 HA-Tet와 HA-TCO에 인간 치주인대줄기 세포를 혼합하고, VEGF_MP가 도입된 HA-Tet와 HA-TCO에 인간 제대정맥혈관내피세포를 혼합하여 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 TGF_MP의 경우 1, 4 주 경과 후 적출하였고, BMP2_MP의 3, 6 주 경과 후 적출하였고, VEGF_MP의 경우 3 주 경과 후 적출하였다. 한편, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간치주인대줄기 세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 1, 4 주 경과 후 적출하였다.
도 4는 실시예 1, 4, 7에서 제조된 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 외형을 보여주는 사진으로, 실시예 1~3에서 제조된 성장인자 모사 단백질이 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔은 모두 안정적으로 겔을 형성하는 것으로 확인된다.
실험예 3: In vitro 상에서 TGF _ MP의 방출 거동 확인
실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 HA-Tet와 실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2%가 되도록 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 바이알에 200㎕씩 주입한 후, 생리식염수를 5 mL씩 넣어주고, 100 rpm, 37℃ 조건에서 인큐베이터에서 보관하며 특정 시간에 바이알로부터 1 mL의 생리식염수를 취하고 새로운 생리식염수 1 mL을 바이알에 넣어주었으며 이를 28일 동안 진행하였다. 한편, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 상기 실시예 1에서 제조한 TGF_MP가 도입된 하이드로겔의 TGF_MP와 동일한 농도가 되도록 TGF_MP를 혼합한 다음 동일한 방법으로 TGF_MP의 방출 실험을 진행하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 비교예 2와 같이 TGF_MP를 단순 혼합한 경우에는 방출 실험 초기에 거의 모든 TGF_MP가 방출되는 반면, 실시예 1과 같이 TGF_MP가 화학적으로 도입된 경우에는 하이드로겔 내부에서 거의 방출되지 않는 것으로 확인된다. 따라서, TGF_MP를 단순 혼합한 경우에 비해, TGF_MP가 화학적으로 도입된 경우, 높은 기능성을 가짐을 알 수 있다.
실험예 4: In vivo 상에서 TGF _ MP의 방출 거동 확인
TGF_MP에 형광물질인 fluorescein isothiocyanate (FITC)가 도입된 TGF_MP/FITC를 실시예 1과 동일한 방법으로 TGF_MP/FITC가 도입된 HA-Tet와 실시예 1과 동일한 방법으로 TGF_MP/FITC가 도입된 HA-TCO를 각각 2%가 되도록 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지를 통해 누드마우스의 피하에 각각 100 uL 씩, 총 200 uL의 하이드로겔을 주입하였다. 한편, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 상기 실시예 1에서 제조한 TGF_MP가 도입된 하이드로겔의 TGF_MP와 동일한 농도가 되도록 TGF_MP/FITC를 혼합한 다음 동일한 각가 100 uL씩, 총 200 uL를 누드마우스 피하에 주입하였다. 이후, TGF_MP/FITC의 형광을 측정하여 두 실험군의 방출 거동 차이를 확인하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 비교예 2와 같이 TGF_MP/FITC를 단순 혼합한 경우에 비해, 실시예 1과 같이 TGF_MP/FITC가 화학적으로 도입된 경우, 이는 하이드로겔 내부에서 긴 시간 동안 존재하는 것으로 확인된다. 따라서, TGF_MP/FITC를 단순 혼합한 경우에 비해, TGF_MP/FITC가 화학적으로 도입된 경우, 높은 기능성을 가짐을 알 수 있다.
실험예 5: 염색을 통한 연골세포로 분화 관찰
실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 HA-Tet와 실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2%가 되도록 생리식염수에 녹인 후, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 1주 및 4주 경과 후 적출하였다. 한편, 비교예 1 에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 1주 및 4주 경과 후 적출하였다. 또한, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 상기 실시예 1에서 제조한 TGF_MP가 도입된 하이드로겔의 TGF_MP와 동일한 농도가 되도록 TGF_MP를 혼합하고, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 1주 및 4주 경과 후 적출하였다. 그 다음, 연골의 주요 구성성분에 해당하는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)(GAG)를 염색하기 위한 alcian blue 및 safranin O 염색을 수행하였다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 TGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1, 2에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 줄기세포에서 연골세포로 분화 유도시켰는지 여부를 확인한 사진[(a) alcian blue 염색, (b) safranin O]으로, 실시예 1과 같이 TGF_MP가 화학적으로 도입된 경우, 비교예 1과 같이 TGF_MP를 도입하지 않은 경우 및 비교예 2와 같이 TGF_MP를 단순 혼합한 경우에 비해, 히알루론산 하이드로겔 내 많은 GAG 성분이 있는 것으로 확인되는바, 줄기세포에서 연골세포로 분화가 잘 이루어진 것으로 확인된다.
실험예 6: 염색을 통한 골세포로 분화 관찰
실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 HA-Tet와 실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 2주 및 8주 경과 후 적출하였다. 한편, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 상기 실시예 4에서 제조한 BMP2_MP가 도입된 하이드로겔의 BMP2_MP와 동일한 농도가 되도록 BMP2_MP를 혼합하고, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 2주 및 8주 경과 후 적출하였다. 그 다음, 칼슘염을 염색하기 위한 von Kossa(VK) 및 alizarin red S(ARS) 염색을 수행하였다.
도 8는 실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 3에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 줄기세포에서 골세포로 분화 유도시켰는지 여부를 확인한 사진[(a) von Kossa(VK) 염색, (b) alizarin red S(ARS)]으로, 실시예 4와 같이 BMP2_MP가 화학적으로 도입된 경우, 비교예 2와 같이 BMP2_MP를 단순 혼합한 경우에 비해, 히알루론산 하이드로겔 내 칼슘염의 양이 많은 것으로 확인되는 바, 줄기세포에서 골세포로 분화가 잘 이루어진 것으로 확인된다.
실험예 7: 유전자 발현 변화를 통한 골분화 측정
실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 HA-Tet와 실시예 4에서 제조된 BMP2_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 2주, 4주 및 8주 경과 후 적출하였다. 한편, 비교예 1에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 상기 실시예 4에서 제조한 BMP2_MP가 도입된 하이드로겔의 BMP2_MP와 동일한 농도가 되도록 BMP2_MP를 혼합하고, 인간치주인대줄기세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 2주, 4주 및 8주 경과 후 적출하였다. 그 다음, 유전자 발현 양상을 확인하기 위하여 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 이용해 cDNA를 합성하고, quantitative real time polymerase chain reaction을 통해 골분화시 발현되는 osteocalcin (OC) 유전자 및 collagen type 1 (COL1A) 유전자의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 4와 같이 TGF_MP가 화학적으로 도입된 경우, 비교예 1과 같이 BMP2_MP를 도입하지 않은 경우 및 비교예 2와 같이 BMP2_MP를 단순 혼합한 경우에 비해, osteocalcin (OC) 유전자 및 collagen type 1 (COL1A) 유전자의 발현량이 큰 것으로 확인되는바, 줄기세포에서 골세포로 분화가 잘 이루어진 것으로 확인된다.
실험예 8: 염색을 통한 혈관신생 관찰
실시예 7에서 제조된 VEGF_MP가 도입된 HA-Tet와 실시예 7에서 제조된 VEGF_MP가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간 제대정맥혈관내피세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 3주 경과 후 적출하였다. 한편, 비교예 1 에서 HA-Tet와 비교예 1에서 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 인간 제대정맥혈관내피세포와 혼합한 다음, 듀얼실린지를 통해 쥐의 피하에 100㎕씩 주입한 후, 이를 3 주 경과 후 적출하였다. 그 다음, 혈관신생 여부를 확인하기 위한 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 수행하였다.
도 10은 실시예 7에서 제조된 VEGF_MP가 도입된 히알루론산 하이드로겔과 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔이 혈관신생을 촉진시켰는지 여부를 확인한 사진[Hematoxylin & eosin(H&E) 염색]으로, 실시예 7의 경우, 비교예 1에 비해, 혈관신생이 잘 이루어진 것으로 확인된다(이때, 화살표는 혈관을 표시하는 것임).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 카르복실기를 포함하는 천연 생체물질; 및
    상기 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 성장인자 모사 단백질을 포함하는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 천연 생체물질은 히알루론산, 카복시메틸셀룰로오스 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 성장인자 모사 단백질은 혈관내피 성장인자(VEGF) 모사 단백질, 형질전환 성장인자(TGF) 모사 단백질, 뼈 형성 단백질(BMP-2, BMP-4 또는 BMP-7) 모사 단백질, 인슐린 성장인자(IGF) 모사 단백질, 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 모사 단백질, 혈소판-유래 성장인자(PDGF) 모사 단백질, 기저세포 유래 인자(SDF-1α) 및 물질 P(Substance P) 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질.
  4. 제1 화학 작용기 및 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질을 포함하는 제1액; 및
    제2 화학 작용기 및 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질을 포함하는 제2액을 포함하고,
    상기 제1 성장인자 모사 단백질 및 상기 제2 성장인자 모사 단백질은 각각 상기 제1 천연 생체 물질 및 상기 제2 천연 생체물질의 카르복실기와 아마이드 결합을 통해 도입된 것이고,
    상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기의 조합은 (테트라진, 사이클로옥텐), (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 티올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 티올기), (아크로일기, 아민기) 또는 (아크로일기, 티올기)인
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔.
  6. (a) 제1 성장인자 모사 단백질이 도입된 제1 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계;
    (b) 제2 성장인자 모사 단백질이 도입된 제2 천연 생체물질 용액에 제1 화학 작용기와 화학적으로 결합가능한 제2 화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제1액 및 상기 제2액을 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (a)에서 제1 성장인자 모사 단백질 또는 상기 (b)에서 제2 성장인자 모사 단백질의 도입은 축합제의 투입에 의해 수행되는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체재료 하이드로겔의 제조방법.
  8. 제1항에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 제4항에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔을 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진용 조성물.해 수행되는
    성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체재료 하이드로겔의 제조방법.
  9. 제1항에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 또는 제4항에 따른 성장인자 모사 단백질이 도입된 천연 생체물질 하이드로겔에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 또는 혈관신생 촉진방법.


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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210062947A (ko) * 2019-11-22 2021-06-01 아주대학교산학협력단 내재성 전구세포 또는 줄기세포 포집능 및 포집된 세포의 혈관 분화 유도능을 갖는 주입형 하이드로겔 조성물
WO2023018069A1 (ko) * 2021-08-09 2023-02-16 주식회사 메디폴리머 주사용 사전-제형 및 이를 이용한 도네페질 초기방출 억제형 키트

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060034634A (ko) * 2003-05-05 2006-04-24 벤-구리온 유니버시티 오브 더 네게브 리서치 앤드 디벨럽먼트 어쏘러티 주사용 가교결합된 폴리머 제제 및 그의 용도
KR20090063235A (ko) * 2006-09-11 2009-06-17 피디아 파마슈티치 에스.피.에이. 클릭 화학 가교를 통해 수득된 하이알루론산 유도체
KR20100026910A (ko) * 2008-08-29 2010-03-10 한스바이오메드 주식회사 서방형 골다공증치료제를 담지한 골충진재
KR20130138763A (ko) * 2010-08-30 2013-12-19 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 고강도 키틴 복합 재료 및 그 제조 방법
KR20140090287A (ko) * 2012-12-13 2014-07-17 포항공과대학교 산학협력단 신규한 히알루론산 기반 하이드로겔 및 이의 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060034634A (ko) * 2003-05-05 2006-04-24 벤-구리온 유니버시티 오브 더 네게브 리서치 앤드 디벨럽먼트 어쏘러티 주사용 가교결합된 폴리머 제제 및 그의 용도
KR20090063235A (ko) * 2006-09-11 2009-06-17 피디아 파마슈티치 에스.피.에이. 클릭 화학 가교를 통해 수득된 하이알루론산 유도체
KR20100026910A (ko) * 2008-08-29 2010-03-10 한스바이오메드 주식회사 서방형 골다공증치료제를 담지한 골충진재
KR20130138763A (ko) * 2010-08-30 2013-12-19 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 고강도 키틴 복합 재료 및 그 제조 방법
KR20140090287A (ko) * 2012-12-13 2014-07-17 포항공과대학교 산학협력단 신규한 히알루론산 기반 하이드로겔 및 이의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KO, K. S. et al., Biomaterials and Biomechanics in Bioengineering (2015) Vol.2, No.1, pp.23-32
KO, K. S. et al., Biomaterials and Biomechanics in Bioengineering (2015) Vol.2, No.1, pp.23-32* *
TAKAHASHI, A. et al., Biomacromolecules (2013) Vol.14, No.10, pp.3581-3588* *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210062947A (ko) * 2019-11-22 2021-06-01 아주대학교산학협력단 내재성 전구세포 또는 줄기세포 포집능 및 포집된 세포의 혈관 분화 유도능을 갖는 주입형 하이드로겔 조성물
WO2021101198A3 (ko) * 2019-11-22 2021-07-15 아주대학교 산학협력단 내재성 전구세포 또는 줄기세포 포집능 및 포집된 세포의 혈관 분화 유도능을 갖는 주입형 하이드로겔 조성물
JP2023501795A (ja) * 2019-11-22 2023-01-19 アジョウ・ユニバーシティ・インダストリー－アカデミック・コーポレイション・ファウンデイション 内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物
EP4062951A4 (en) * 2019-11-22 2023-12-20 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation INJECTABLE HYDROGEL COMPOSITION FOR TRAPPING ENDOGENE PROGENIC OR STEM CELLS AND INDUCING VASCULAR DIFFERENTIATION OF TRAPPED CELLS
WO2023018069A1 (ko) * 2021-08-09 2023-02-16 주식회사 메디폴리머 주사용 사전-제형 및 이를 이용한 도네페질 초기방출 억제형 키트

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