KR20140090287A

KR20140090287A - 신규한 히알루론산 기반 하이드로겔 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140090287A
Application number: KR1020120145758A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 한세광; 김기문; 김수진; 염준석; 정현태; 서유석; 진현탁
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 주식회사 제넥신
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-07-17
Also published as: KR101605528B1

Abstract

본 발명은 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔, 상기 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물, 상기 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하는 하이드로겔과 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물 및 본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔과 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 히알루론산 기반 하이드로겔은 세포치료제로서 사용되는 치료물질을 발현시키는 줄기세포를 지지하는 보조제로서의 역할을 수행하여, 상기 치료물질의 분비를 촉진시키고, 세포 생존율을 증가시켜서 세포 치료제의 치료효과를 극대화 시킬 수 있으므로, 보다 향상된 효능을 나타내는 세포치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 히알루론산 기반 하이드로겔 및 이의 용도{Novel hydrogel based on hyaluronic acid and use thereof}

본 발명은 신규한 히알루론산 기반 하이드로겔 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔, 상기 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물, 상기 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하는 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물 및 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물에 관한 것이다.

현대의 세포치료연구는 1958년 프랑스 과학자들에 의해 HLA system이라는 혈액형 매칭 시스템을 개발하고 1973년 실질적인 골수 이식 수술의 성공으로 시작이 되었다. 또한 1999년 Pittinger에 의해 골수 및 지방에 존재하는 중간엽 줄기세포가 다양한 조직으로 분화한다는 것을 밝힘으로써 줄기세포를 이용한 세포 치료제에 대한 연구가 본격적으로 시작되었다. 하지만 세포만을 사용하였을 경우 체내에서 빠른 clearance로 인해, 효능을 보이기 위해서는 50 million - 5 billion 정도의 세포를 필요로 하는데, 적은 세포수로도 세포치료제의 효능을 증진하는 방법으로 체내 체류시간을 증가시키는 지지체의 사용이 유용한 방법이다.

최근 다양한 생체재료가 3차원적인 세포 배양과 효율적인 세포 전달을 위해 개발이 되고 있다. 그 중 이 목적에 부합하는 가장 효과적인 물질이 하이드로겔인 것으로 부각되었고 다양한 연구가 진행되고 있다. 하이드로겔은 그물망 구조를 가진 수용성 고분자로서, 물에는 녹지 않으면서 높은 수분 함유량을 가져 조직과 비슷한 성질을 가진다. 하이드로겔은 반응성이 좋은 화학물질을 이용하여 작용기 사이의 공유결합을 유도하여 젤 형태를 유도할 수 있다. 최근에는, 변성 없이 약물이나 세포를 충진시킬 수 있으며, 최소한의 상처를 발생시키면서 인체에 주입할 수 있는 주입형 하이드로겔에 대한 관심이 집중되고 있다. 주입형 하이드로겔을 개발하기 위해 효소나 화학물질, 빛에 의한 화학반응을 이용한 방법, 온도나 pH 변화와 같은 외부자극에 의한 방법, 용매의 변화와 팽윤에 의한 물리적 변화에 의한 방법을 사용하는 연구가 시도 되고 있다.

화학반응을 이용한 대표적인 방법 중에서는 반응성이 좋은 화학물질을 이용하는 방법으로서 티올기(thiol)와 이중결합(double bond)의 반응인 Michael addition을 이용하는 것이다. 상용화 된 Hystem-C와 중합 가능한 반응기를 가진 고분자를 빛을 이용한 initiator로 중합시켜 형성된 광중합방법을 이용한 PEGDA가 있다. Hystem은 히알루론산에 티올기를 도입하여 PEGDA와 간단하게 섞음으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다는 장점이 있고, PEG 유도체만으로 구성된 제품으로 PEGDA에 photoinitiator를 첨가하여 자외선을 주사하면 5분내의 빠른 시간에 하이드로겔이 형성할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 광중합방법은 initiator를 사용하여야 반응을 일으킬 수 있지만 현재까지 상용화되어 있는 initiator는 대부분 세포독성을 가지고 있다는 문제가 있으며, 또한 광중합을 위한 자외선이 피부를 통과하기 어렵기 때문에 실질적으로 주입형 하이드로겔로 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 두 제품에서 공통적으로 사용되는 PEGDA의 경우, 반응성이 좋은 이중결합을 이용하기 때문에 젤 형성에 참여하지 않은 이중결합의 경우 체내에 도입되었을 경우 독성 유발 가능성이 잠재되어 있다는 단점이 있다.

또한, horseradish peroxidase와 같이 활성산소를 유도하여 화학반응을 일으키는, 효소를 이용하는 CorgelTM이 있고, 음이온을 띠는 고분자물질이 2가 이상의 양이온과 정전기적 인력을 이용하여 킬레이트를 형성하는 이온반응을 이용하는 Gelite®라는 제품이 상용화되어 있다. 하지만 효소를 이용한 방법은 생체 내 고유의 효소를 이용한 방법보다는 horseradish peroxidase와 같이 대부분 주입 직전에 외부의 효소를 섞어서 주입을 하기 때문에 효소에 의한 면역거부 반응의 가능성이 있다. 그리고 이온 반응을 이용한 방법은 양이온의 농도에 의해 겔의 굳기가 좌우되므로 생체 내에서는 긴 시간 동안 젤 상태로 유지되기 어렵기 때문에 현재는 주로 약물 전달을 위한 제품 개발 연구에서 이용되고 있다.

외부 자극에 의해 하이드로겔이 형성되는 방법 중 한가지로 온도 민감성 시스템을 활용하는 방법이 있으며 PLGA-PEG-PLGA의 3중 블록 공중합체를 이용한 ReGel®, PEO-PPO-PEO의 3중 블록공중합체를 이용한 Pluronic® (Poloxamer), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 쥐의 sarcoma 세포에서 유래된 콜라겐을 이용한 MatrigelTM등이 상용화되어 있다. 온도 민감성 시스템에서는 임계 용액 온도 (Lower critical solution temperature, LCST) 현상을 보이는데 자세히 설명하면 온도가 낮을 때에는 액체로 존재하고 있다가 37oC로 체온의 온도가 되면 고체형태가 되는 현상이다. 액체상태로 낮은 온도에서 보관하고 있다가 필요할 때 생체 내에 주입하여 젤을 만들어 약물전달 및 세포전달을 간편하게 시도할 수 있다는 장점이 있다. 특히 MatrigelTM의 경우 각종 세포성장 인자가 있어서 세포의 생존기간을 연장시킬 수 있는 장점이 있다. 하지만 이렇게 온도 민감성 주입형 하이드로겔은 마이셀을 형성하는 물리적 결합으로 그물망 구조를 형성하고 있기 때문에, 초반 방출량도 많고 생체 내 분해속도가 빨라서 생체 내에서 오랜시간동안 안정적으로 유지하지 못한다는 단점이 있다. 또한 Regel®의 경우 합성고분자를 이용하였기 때문에 분해산물이 부분적으로 세포 독성을 나타내고, MatrigelTM의 경우 쥐의 암세포 유래의 물질이기 때문에 실제 사람에게 사용하기에는 한계가 있다.

pH 민감성 시스템으로는 Polyacrylic Acid를 이용한 Carbopol® 제품이 상용화 되어있는데 이 제품의 경우 pH가 4일 때 점성이 낮아서 용액상태로 존재하다가 pH가 높아지게 되면 이온화 되어있던 acrylic acid 그룹이 서서히 중성화되면서 소수성을 띠게 되어 hydrophobic 반응에 의한 물리적 결합이 일어나게 되어 점성이 높아지다가 생리활성 pH인 7.4 이 되면 고체화가 된다. 따라서 액체상태로 주입을 하면 생리 활성 pH인 7.4에 쉽게 도달하기 때문에 젤을 간단하게 만들 수 있다는 장점이 있다. 하지만 젤을 주입하기 위해서는 산성의 환경인 pH 4인 상태로 사용하여야 하므로, 투여 시 세포에 손상을 줄 수 있다는 단점이 있다.

위에서 기술한 바와 같이 화학반응을 이용한 주입형 하이드로겔 제작 방법은 반응성이 좋은 화학 물질 때문에 담지된 세포에 심각한 손상을 유발할 수 있다는 단점이 있어 고분자에 작용기를 도입하지 않고 물리적인 상호작용만으로 하이드로겔을 형성하고자 하는 시도가 많이 진행되고 있고, ReGel®, MatrigelTM, Pluronic® 등과 같은 제품들이 상용화되었다. 하지만 이 제품들을 세포치료제로서 생체 내에 적용하기에는 위에서 기술한 바와 같은 약점을 가지고 있어 생체 내에서 적절한 시간 동안 안정하게 유지되고, 생체적합성, 생분해성이 뛰어나고 면역거부반응이 적으면서 독성이 없는 안전한 주입형 하이드로겔의 개발이 요구된다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 신규한 히알루론산 기반 하이드로겔이 줄기세포의 세포치료효과를 지지할 수 있는 지지체로서 유용함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하는 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 용어 "세포분화제"란, 줄기세포의 세포분화를 촉진할 수 있는 물질을 의미하는데, 대체로 ATRA(All-trans-Retinoic Acid)를 포함하는 레티노이드(Vitamin A와 그 유도물질의 총칭), PtA(Pantothenic Acid)를 포함하는 비타민 B와 그 유도물질, 비타민 D와 그 유도물질 등 비타민과 그 유도물질들, EGF(Epidermal Growth Factor), 덱사메타손(dexamethasone, Dexa)을 포함하는 ㄱ그글루코코르티코이드(스테로이드성 호르몬의 총칭), BMP(Bone Morphonenic Protein)와 같은 각종 성장인자 등이 될 수 있고, 바람직하게는 혈관분화를 촉진시키는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor) 또는 PDGF(Platelet derived growth factor), 신경분화를 촉진시키는 BDNF(Brain Derived Neurotropic Factor) 또는 ATRA, 골분화를 촉진시키는 Dexa, Cyclic-RGD 또는 BMP, 피부분화를 촉진시키는 ATRA, EGF, 판테놀(Panthenol) 또는 PtA 등이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 ATRA, Dexa 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "세포활성 유도물질"이란, 세포의 유전자 발현을 유도하여 특정 활성을 나타내거나 또는 강화시키는 분자를 발현시키는 물질을 의미하는데, 대체로 All-trans-Retinoic Acid(ATRA)를 포함하는 Retinoids(Vitamin A 유도물질의 총칭), Dexamethasone(Dexa)을 포함하는 Glucocorticoids(스테로이드(steroids) 호르몬의 총칭), 콜레스테롤(Cholesterol), Vitamin D와 그 유도물질, Tyroid hormone, Trichostatin A(TSA)와 그 유도물질, Fatty Acids, Prostaglandin, Sterol 등 Nucleic Receptor나 promoter에 binding할 수 있는 호르몬(hormone) 이나 리간드(ligand) 등이 될 수 있고, 바람직하게는 세포활성을 강화시킬 수 있는 ATRA, 글루코코르티코이드, 트리코스타틴(Trichostatin(A)), 스테롤(sterol) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "쿠커비투릴(Cucurbituril, CB[n])"이란, n개의 글리코우릴이 모여 형성된 호박모양의 속이 빈 분자를 의미하는데, 상기 n은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 10,000의 정수, 보다 바람직하게는 5, 6, 7, 8 또는 10, 가장 바람직하게는 6이 될 수 있다. 상기 CB[n]은 내부의 소수성 공간을 이용하여, 다양한 손님분자들과 강하게 상호작용하며 복합체를 형성할 수 있는데, 상기 손님분자로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 이온성 물질 또는 극성물질이 될 수 있고, 바람직하게는 아미노기, 카르복실산 등의 작용기를 가진 화합물이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 기체 화합물, 지방족 화합물, 방향족 화합물 등의 다양한 유기물질, 살충제, 제초제, 아미노산, 핵산, 이온 화합물, 금속 이온, 유기 금속이온 등이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 폴리아민류의 화합물이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "폴리아민(polyamine)"이란, 생물계에 널리 존재하는 생체아민으로서 제1급 아미노기를 2개 이상 가진 지방족 탄화수소를 의미한다. 상기 폴리아민은 단백질 및 핵산합성이 활발한 조직에 많이 존재한다. 특히 암조직에 많이 존재하며 혈액이나 오줌에도 나타나기 때문에 종양표지로서도 유용하다. 폴리아민의 생리작용으로는 핵산의 안정화, 핵산, 단백질 합성촉진, 단백질의 번역후 수식(아세틸화, 인산화), 여러 효소의 활성화, 세포막의 안정화 등을 들 수 있다. 상기 폴리아민은 특별히 이에 제한되지 않으나 폴리아민은 바람직하게는 하나 이상의 아민기를 갖는, C1-C20 알킬기; C2-C20 알케닐기; C2-C20 알키닐기; C1-C20 알콕시기; C1-C20아미노알킬기; C4-C20 시클로알킬기; C4-C7 헤테로아릴시클로기; C6-C20 아릴기; C5-C20 헤테로아릴기; C1-C20 알킬실릴기; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 아다만탄; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 페로센 또는 메탈로센; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 카르보레인; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 플러렌; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 시클람 또는 크라운에테르; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 산소가 보호된 아미노산; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 펩티드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 알칼로이드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 시스플라틴; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 올리고뉴클레오티드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 로다민; 및 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 나노파티클 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 하나 이상의 아민기를 갖는 C1-C20 아미노알킬기, 하나 이상의 아민기를 갖는 C5-C20 헤테로아릴기, 메탈로센이 포함된 C1-C20 아미노알킬기, 메탈로센이 포함된 C5-C20 헤테로아릴기 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 프트레신, 카타베린, 스페르미딘, 스페르민, Diaminohexane(DAH) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "히알루론산(hyaluronic acid)"이란, 아미노산과 우론산으로 구성된 뮤코다당류의 일종으로서, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 사슬 모양으로 결합한 분자량이 20만∼40만 되는 고분자 화합물을 의미하는데, 식물의 펙틴질과 비슷하며, 히알루로니다아제에 의하여 가수분해된다. 생체내에서는 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하는데, 점성이 크고 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 역할을 한다. 본 발명의 목적상 상기 히알루론산은 하이드로겔을 형성하는 기본 골격으로서 사용된다.

본 발명의 용어 "히알루론산 기반 하이드로겔"이란, 쿠커비투릴이 결합된 히알루론산 유도체와 폴리아민이 결합된 히알루론산 유도체가, 상기 쿠커비투릴과 폴리아민의 특이적인 hydrophobic/hydrophilic 작용에 의하여, 비공유결합적으로 연결되어 형성되는 하이드로겔을 의미한다. 상기 하이드로겔은 반응성이 좋은 화학물질이나 독성 유발 가능성을 가진 initiator(개시제)를 사용하지 않아서 세포독성 유발가능성은 거의 없고, 외부의 효소를 사용하지 않기 때문에 면역거부 반응가능성이 낮으며, pH변화, 이온의 영향에 상관없이 하이드로젤을 형성할 수 있고, 주인-손님 분자 작용이 매우 강력하기 때문에 세포치료제로서 세포를 오랜 시간동안 안정적으로 유지할 수 있지만 필요에 따라 히알루론산의 치환율을 조절하여 하이드로젤 시스템을 자유자재로 용도에 맞도록 적용할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 용어 "하이드로겔(hydrogel)"이란, 물을 분산매로 하는 겔을 의미하는데, 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성될 수 있다. 전해질 고분자의 하이드로겔은 고흡수성을 나타내는 것이 많으며 흡수성 고분자로서 다방면에 실용화되어 있다. 히드로겔 중에는 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화하는 것도 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 폴리아민의 일종인 DAH가 결합된 히알루론산 유도체, 덱사메타손과 MonoCB[6]가 결합된 히알루론산 유도체 및 레티노산과 MonoCB[6]가 결합된 히알루론산 유도체를 각각 합성하고(도 3, 도 5 및 실시예 2-4), 이들의 생체내 독성을 평가한 결과 생체내에서 별다른 독성을 나타내지 않음을 확인하였으며(도 4), 상기 각 히알루론산 유도체를 혼합하여 하이드로겔을 제조하였다(실시예 3-1).

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 쿠커비투릴과 폴리아민의 상호작용을 이용하여 히알루론산 기반 하이드로겔 및 그의 제조방법을 이미 개발하였으며(대한민국 특허등록 제1201473호), 본 발명을 통하여 상기 히알루론산 기반 하이드로겔의 세포치료제 보조용도를 새로이 개발하였다. 특히, 상기 히알루론산 기반 하이드로겔에 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 결합시킬 경우, 상기 결합된 세포분화제 또는 세포활성 유도물질로 인하여 세포치료제의 유효성분인 중간엽줄기세포의 활성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 치료 유전자인 인터루킨 12(IL-12) 돌연변이체 또는 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)를 발현시키는 재조합 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)를 제작하고(실시예 1), 이들을 상기 하이드로겔과 혼합하여 효능을 평가한 결과, C/D-RD-HA hydrogel을 사용한 경우 50일 경과 후에도 체내에 잔류하고(실시예 3-3), in vitro 조건에서 C/D-RD-HA hydrogel을 사용한 경우, C/D-HA hydrogel 보다 높은 IL-12 발현을 나타내며(도 10), in vivo 조건에서 Matrixen 또는 C/D-HA hydrogel을 지지체로 사용할 경우 보다도, C/D-RD-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우 IL-12의 발현 농도가 높았으며, 15일까지도 IL-12의 발현이 검출되었고(도 11(A)), 치료 유전자 IL-12M이 도입된 중간엽 줄기세포의 항암효과를 향상시켰으며(도 12(A)), 치료 유전자 IL-12M이 도입된 중간엽 줄기세포인 C/D-DR-HA hydrogel MSC의 항암 생존 증가 효과를 향상시켰고(도 12(B)), 이러한 항암활성은 반복투여시에도 동일하게 유지됨을 확인하였다(도 13).

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하는 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 히알루론산 기반 하이드로젤은 세포 담지 지속성 유지와 세포치료제의 치료 유전자 발현 및 항암 효능을 증진시킨다는 것을 확인할 수 있었으므로, 항암치료제 뿐 아니라, 도입하고자 하는 치료 유전자에 따라 다양한 난치성 질환 치료를 위한 줄기세포치료제 개발에 히알루론산 하이드로젤을 응용할 수 있을 것으로 기대되었다. 또한 세포분화제 /세포활성유도물질이 적용된 hydrogel은 유전자의 발현 시간을 지속시킬 뿐 아니라 증진된 치료효과를 보여 세포치료제로 응용가능성을 확인하였다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화하 수 있는 다능성 미분화세포를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 줄기세포는 mouse, rat, 개, 소, 사람 등에서 유래한 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), 조혈모 줄기세포 (hematopoietic stem cell), 신경능 줄기세포 (neural crest stem cell), 내피 줄기세포 (endothelial stem cell) 등의 천연 줄기세포가 될 수도 있고, 세포치료 유전자를 도입하거나 또는 내재적인 세포치료 유전자를 과량 발현시켜서 세포치료에 유용한 성분을 대량으로 생산하도록 상기 천연 줄기세포를 유전적으로 변형시킨 변이된 줄기세포가 될 수도 있다. 유전적으로 변형된 줄기세포에서 발현되는 세포치료에 유용한 성분은 특별히 이에 제한되지 않으나, 사이토카인, 성장인자, 영양인자 등이 될 수 있고, 바람직하게는 인터루킨-1, 인터루킨-6, 인터루킨-12, 인터페론 감마, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 사이토카인, BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor) 등의 영양인자, EGFP, BMP family, VEGF, FGF, HGF, TRAIL, HSV-TK 등의 성장인자 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 유전자를 줄기세포에 도입할 때 사용되는 벡터로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 아데노바이러스, naked DNA, 폭스바이러스, 렌티바이러스 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 세포치료용 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수,덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한 되는 것은 아니다.

상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다.투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 피하 내, 피내투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 세포치료용 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 히알루론산 기반 하이드로겔 자체로도 종래의 세포치료제의 지지체보다도 세포치료제의 유효성분인 중간엽 줄기세포의 활성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 치료 유전자인 인터루킨 12(IL-12) 돌연변이체 또는 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)를 발현시키는 재조합 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)를 제작하고(실시예 1), 이들을 상기 하이드로겔과 혼합하여 효능을 평가한 결과, 종래의 세포치료제 지치체로 사용된 Matrixen을 사용한 경우 10일 이내에, Matrigel을 사용한 경우 3주만에 분해가 되었으나, C/D-HA hydrogel을 사용한 경우 50일 경과 후에도 체내에 잔류하고(실시예 3-3), in vitro 조건에서 C/D-HA hydrogel을 사용한 경우 Matrigel 과 비교하여 보다 높은 IL-12 발현을 나타내며(도 10), in vivo 조건에서 Matrixen을 지지체로 사용할 경우보다도, C/D-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우 IL-12의 발현 농도가 높았으며, 15일까지도 IL-12의 발현이 검출되었고(도 11(A)), 치료 유전자 IL-12M이 도입된 중간엽 줄기세포의 항암효과를 향상시켰으며(도 12(A)), 치료 유전자 IL-12M이 도입된 중간엽 줄기세포인 C/D-HA hydrogel MSC의 항암 생존 증가 효과를 향상시켰고(도 12(B)), 이러한 항암활성은 반복투여시에도 동일하게 유지됨을 확인하였다(도 13).

다른 실시양태로서, 본 발명은 상쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔과 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 제공하는 히알루론산 기반 하이드로겔은 세포치료제로서 사용되는 치료물질을 발현시키는 줄기세포를 지지하는 보조제로서의 역할을 수행하여, 상기 치료물질의 분비를 촉진시키고, 세포 생존율을 증가시켜서 세포 치료제의 치료효과를 극대화 시킬 수 있으므로, 보다 향상된 효능을 나타내는 세포치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1(A)는 중간엽 줄기세포에 주인분자인 CB[6]와 손님분자인 DAH를 각각 HA에 접합시킨 다음 수용액 상에서 섞으면 CB[6]와DAH 사이의 호스트-게스트 비공유결합이 가교제 역할을 함으로써 하이드로젤(C/D-HA hydrogel)이 형성되는 과정을 나타낸다.(B)는 히알루론산과 결합된 치료물질 또는 세포분화요소와 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC) 또는 유전자변형 중간엽줄기세포(Engineered MSC)와 작용에 관한 모식도이다. Tag1, Tag2는 치료 물질 또는 세포 분화 요소이다. 예를 들면 All-trans-Retinoic Acid, Dexamethasone, epidermal growth factor, pantothenic acid 등이 될 수 있다. CB[6]-HA 및 DAH-HA는 하이드로젤 제조의 뼈대가 되는 구성물이다. 유전자변형 중간엽 줄기세포(Engineered MSC)는 치료물질 또는 분화 요소가 분비되도록 대상 유전자가 도입된 세포이다. 본 발명에서는 Engineered MSC를 포함하는 모든 줄기세포 치료제에 적용이 가능하다.
도 2의(A)는 Engineered MSC의 제조과정을 나타낸다. IL-12 mutant(IL-12M), Brain Derived Neurotrophic Factor(BDNF), 또는 Enhanced Green Fluorescent Protein(EGFP) 유전자를 아데노바이러스 및 철이온(Fe³ ⁺)을 이용하여 MSC에 이입하여, 유전자변형 MSC가 생산되도록 조작 방법을 예시하였다. (B)는 재조합 아데노바이러스 제작 모식도이다.
도 3은 C/D-HA hydrogel의 합성 모식도 및 1H NMR분석도이다.(A)는 C/D-HA hydrogel합성 모식도이다.(B)는 monoallyloxyCB[6]가 HA에 접합되어 monoCB[6]가 되면서 NMR의 peak의 변화를 나타낸다.(C)는 주인 물질인 CB[6]와 강력하게 결합하는 손님 물질인 스퍼민(spermine)을 첨가하여 결합 후 변화하는 peak의 크기를 계산하여 히알루론산 체인에 10%의 CB[6]가 도입되었다는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 히알루론산 하이드로젤의 구성물질인monoCB[6]-HA 및 DAH-HA의 C57BL/6 마우스를 이용한 단회 피하투여 독성시험 결과이다.(A)는 독성시험에 사용된 시험군의 구성표이다.(B) 는 투여 후 15일 경과까지 사망동물이 없어 치사량이 2 mg/head를 상회 함을 표시하였고, 도 4(C) 는 일반증상결과 15일까지 정상적임을 표시,(D) 체중변화에 있어 대조군(G1)과 비교하여 의미있는 차이가 없음을 표시,(E) 는 부검(necropsy) 결과이다. 부검결과에서도 투여물질과 연관된 독성학적 이상소견이 관찰되지 않았다.
도 5는 Dexamethasone-CB[6]의 구조식과 1H NMR분석도이다.(A)는 합성된 Dexamethasone-CB[6] 모식도이다.(B)는 Dexa-CB[6]의 peak에 Dexamethasone과 CB[6]의 peak이 공존하는 것을 나타낸다.(C)는 Dexamethasone과 CB[6]가 접합이 된 것을 보여주는 2차원1H NMR 결과이다.
도 6은 HA-Dexamethasone conjugate(HA-Dexa)의 합성과 1H NMR 분석도이다.(A)는 HA- Dexamethasone 합성의 모식도이다.(B)는 HA- Dexamethasone 의 peak에 Dexamethasone과 트라우트리에이전트 및 HA의 peak이 공존하는 것을 나타낸다.
도 7은 HA-All-trans-Retinoic Acid conjugate(HA-ATRA)의 합성과 1H NMR 분석도이다.(A)는 HA-ATRA 합성의 모식도이다. BOP는 benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, HOBt는 anhydrous 1- hydroxybenzotriazole, EDC는 1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl] carbodiimide를 뜻한다. (B)는 HA-ATRA의 peak에 All-trans-Retinoic Acid와 HA의 peak이 공존하는 것을 나타낸다.
도 8은 EGFP를 발현하는 아데노바이러스를 Fe³ ⁺ 을 이용해 Rat 골수유래 MSC에 이입하고 이때 만들어진 MSC/EGFP를 C/D-HA hydrogel, C/D-D-HA hydrogel, C/D-R-HA hydrogel, C/D-DR-HA hydrogel, 또는 대조 세포지지체로써 Matrigel, Matrixen을 세포지지체로 사용하였을 경우, 세포 담지 지속 정도를 형광 이미징 분석으로 비교한 것이다. 이미징 분석은 초기 시점인 day 5일을 시작으로 day 10일부터는10일 간격으로 측정되었다. C/D-HA hydrogel을 도입한 경우와 비교하여, 하이드로젤에 줄기세포 분화 및 활성화 유도인자를 도입한 경우(C/D-D-HA hydrogel, C/D-R-HA hydrogel, C/D-RD-HA hydrogel) 세포 retention이 증가하는 것을 보여, 명확히 활성인자 도입의 유용성을 확인할 수 있다.
도 9는 Matrigel, Matrixen, C/D-HA hydrogel, C/D-RD-HA hydrogel의 체내 잔류 및 분해 정도를 남아있는 물질의 volume으로 평가하여 3개월에 걸쳐서 측정 및 분석하여 비교하였다.
도 10은 시험관 내에서 IL-12M 유전자가 도입된 MSC(MSC/IL-12M)가 다양한 세포지지체를 사용함에 따라 발현하는 IL-12의 지속성을 21일까지 비교한 결과이다. MSC/IL-12M에 Matrixen, Matrigel 및 C/D-HA hydrogel단독이나 Dexamethasone(100uM) 과 All-trans-Retinoic Acid(100uM)을 도입한 하이드로젤(C/D-DR-HA)에 담지된MSC/IL-12M의 시험관 내에서 발현하는 IL-12의 농도를 살펴보면, C/D-DR-HA hydrogel을 지지체로 사용하였을 경우 가장 높은 농도의 IL-12의 발현을 보이는 것으로 확인되었다. 기존에 사용되는 Matrigel과 본 발명의C/D-HA hydrogel을 사용한 경우, C/D-DR-HA 사용한 경우 IL-12 발현에서 통계학적 차이(two-tailed t-test)를 *로 표시하였다.
도 11은 IL-12M 유전자를 가진engineered MSC가 충진된 C/D-HA hydrogel 및 C/D-RD-HA hydrogel을 B16F10 종양을 가진 C57BL/6 마우스에 종양 내 투여 후, 혈청에서 IL-12 및 IFN-gamma의 발현을 비교한 결과이다. 세포지지체의 대조물질로서 Matrixen을 사용하였다. 각 지지체의 투여 이후 시간이 경과함에 따라 혈청에서 존재하는 IL-12의 농도(A)와 IFN-gamma(B)의 농도를 R&D systems의 ELISA kit을 사용하여 분석하였다. 유전자를 이입하지 않은 MSC와 지지체를 사용하지 않은 engineered MSC(MSC/IL-12M)를 대조물질로 사용되었다. 기존에 사용되는 Matrixen과 C/D-HA hydrogel을 사용한 경우, C/D-DR-HA hydrogel을 사용한 경우 발현에 있어 통계학적 차이(two-tailed t-test)를 *로 표시하였다.
도 12는 IL-12M 유전자를 가진Engineered MSC가 충진된 C/D-HA hydrogel 및 C/D-RD-HA hydrogel을 B16F10 종양을 가진 C57BL/6 마우스에 종양 내 투여 후 종양의 부피(tumor volume)(A)와, 종양을 가진 마우스의 생존율(B)을 비교하였다. 대조 지지체로 Matrigel과 Matrixen을 사용하였으며, 유전자를 이입하지 않은 MSC와, 지지체를 사용하지 않은 engineered MSC(MSC/IL-12M)를 control로 사용되었다.
도 13은 Engineered MSC가 충진된 hydrogel 을 B16F10 tumor-bearing C57BL/6 마우스 모델에서 반복투여 후 항종양 효능결과이다. 57BL/6 마우스에 B10F10 종양세포를 투여한지 6일, 20일 경과시점에서, MSC/IL-12M 단독, C/D-RD-HA hydrogel을 세포지지체로 사용한 MSC/IL-12M, 또는 세포지지체 대조물질로서 Matrixen을 MSC/IL-12M에 도입하여 투여하였으며, 시간이 경과함에 따라 마우스에서(A) 종양크기 변화와(B) 생존율을 관찰하였다.
도 14는 GFP transgeneic 마우스의 지방조직에서 유래한 중간엽줄기세포인 GFP MSCs에 BDNF 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 Fe³ ⁺을 이용해 도입시켜 MSC/BDNF 를 만든 다음, C/D-HA hydrogel 및 그 유도체들(C/D-HA, C/D-R-HA, C/D-D-HA, C/D-RD-HA)과 대조 세포지지체인 Matrigel, Matrixen를 세포지지체로 사용하여, 세포지지체의 차이에 의한, engineered MSC에서 치료물질의 발현시간을 비교하였다. 신경 줄기세포의 증식 및 분화를 유도하는 BDNF의 발현 농도를 ELISA로 분석하였다. C/D-RD-HA를 지지체로 사용하였을 때 21일 시점에서 가장 높은 농도의 BDNF 발현을 보였으며, 그룹간 통계학적 차이(two-tailed t-test)를 *로 표시하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포치료제의 제조

치료 유전자인 인터루킨 12(IL-12) 돌연변이체 또는 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)를 발현시키는 재조합 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)를 제작하고, 이를 세포 치료제로서 사용하고자 하였다.

실시예 1-1: MSC / IL -12M 의 제작

인터루킨 12(IL-12)는 p35와 p40의 두 개의 단위체가 결합한 p70 이형이합체 단백질로서, 본 발명에서는 p40 단위체의 이형이합체 형성에 중요한 당화 부위를 변형함으로써 p40 동형이합체의 형성을 감소시켜서 Th1 면역반응을 극대화 할 수 있는 돌연변이형태의 IL-12(IL-12M, Nature Biotechnology, 2004)을 사용하였다.

상기 IL-12M을 발현하는 아데노바이러스 제작을 위해 IL-12M 유전자를 셔틀벡터에 클로닝하여 도입하고 이를 아데노바이러스 vector(pAd/EASY)와 BJ5183 균주에서 상동재조합을 통해 도입함으로써, 최종 아데노바이러스 DNA(pAd/IL-12M)를 제작하였다. 상기 pAd/IL-12M를 아데노바이러스 생산세포주인 293 세포주에 도입하여, IL-12M을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제작하였다.

그런 다음, 랫트의 하지(Femur, tibia)의 뼈에 존재하는 골수유래 중간엽 줄기세포(MSCs)에 IL-12M을 발현하는 재조합 아데노바이러스 50 MOI와 Fe³ ⁺(50uM)을 가하고, 10% FBS 및 1% antibiotics antimycotics가 첨가된 Low Glucose DMEM 배지에서 배양하여 IL-12M을 생산하는 MSCs(MSC/IL-12M)를 제작하였다.

실시예 1-2: MSC / BDNF 의 제작

사람 BDNF를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위해, 코돈 최적화된 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)(BDNFco) 유전자를 합성하고, pShuttle 벡터에 클로닝하여 pShuttle/BDNFco를 제조하였다. 상기 pShuttle/BDNFco를 COS7세포주에 도입하여 발현을 확인하고, 상기 pShuttle/BDNFco를 아데노바이러스 벡터(pAd/EASY)와 BJ5183 균주에서 상동재조합을 통해 도입함으로써, 최종 아데노바이러스 DNA(pAd/BDNF)를 제작하였다. 상기 pAd/BDNF를 아데노바이러스 생산세포주인 293 세포주에 도입하여, BDNF를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제작하였다. rAd/BDNF-TK 벡터를 개발하여 세포 내에서 두 단백질을 동시에 생산할 수 있는 자가조절형 줄기세포를 제작하였다. 본 연구에 사용된 HSV-TK 서열은 코돈 최적화된 서열이며 BDNF 유전자와 HSV-TK 유전자는 IRES(internal ribosome entry site)를 통해 연결되어 하나의 벡터 내에서 동시에 발현될 수 있음을 확인하였다.

그런 다음, GFP 형질전환(transgenic) 마우스에서 추출한 지방유래 줄기세포 105개에 BDNF를 발현하는 재조합 아데노바이러스 50 MOI와 Fe³ ⁺(50uM)을 가하고, 10% FBS 및 1% antibiotics antimycotics가 첨가된 Low Glucose DMEM 배지에서 배양하여 BDNF를 생산하는 MSCs(MSC/BDNF)를 제작하였다.

실시예 1-3: MSC / EGFP 의 제작

중간엽 줄기세포에 EGFP를 발현하는 재조합 아데노바이러스 (recombinant adenovirus, rAd)를 감염시켜 원하는 유전자가 발현이 되도록 하는 Engineered MSCs를 제작하였다. MSC에 아데노바이러스의 감염효율을 증가시키기 위한 전략으로 양이온으로서 50μM 농도의 Fe³ ⁺을 사용하였다. EGFP를 발현하는 아데노바이러스와 Fe³⁺을 가하고 30분간 실온에서 방치시킨 배지를 MSC 감염에 사용하였다. MSC에 형질도입을 시키기 위해 재조합 아데노바이러스의 MOI(multiplicity of infection)의 작용범위를 다양하게 적용하여 발현율이 높은 조건을 선정하였다. 이때, 중간엽 줄기세포가 발현하는 유전자의 높은 전달효율을 위해 Fe³ ⁺의 유무에 따른 발현을 확인함과 동시에 발현율이 높으면서, 줄기세포 자체에는 세포독성을 주지 않는 역가인 50MOI로 적정조건을 정하였다. 재조합 아데노바이러스 벡터와 철이온을 이용해 30분 동안 골수 유래 랫트유래 중간엽 줄기세포(rBM-MSC)에 감염시켜서 EGFP를 발현시키는 MSC인 MSC/EGFP를 제작하였다.

실시예 2: 히알루론산 유도체 합성

실시예 2-1: DAH - HA 유도체 합성

증류수에 대한 히알루론산(분자량 235,000)의 농도가 5mg/ml인 히알루론산 용액을 제조하였다. 여기에 1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide(EDC)와 sulfo-N-Hydroxysuccinimide(Sulfo-NHS)를 사용하여 히알루론산의 카르복실기를 활성화 시킨 다음, 디아미노헥산(Diaminohexane, DAH) 를 첨가하고, 1.0N 염산으로 pH를 약 4.8로 유지하면서 실온에서 약 2시간 반응 시켰다. 이때, EDC와 Sulfo-NHS, DAH의 첨가량은 히알루론산의 카르복실기에 대하여 각각 몰비로 4배, 1배, 20배였다.

반응 결과물은 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 히드라지드기가 도입된 HA-DAH를 얻었다. 히알루론산의 도입율은 1H-NMR(DPX300, Bruker, Germany)로 정량하여 약 50몰 %가 도입된 것을 확인하였다.

실시예 2-2: MonoCB [6]- HA 유도체 합성

히알루론산(분자량 100,000)의 농도가 5mg/ml인 히알루론산 용액을 제조하였다. 여기에 EDC(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide)와 HOBt(Hydroxybenzotriazole)를 사용하여 히알루론산의 카르복실기를 활성화 시킨 다음, 시스타민(Cystamine)를 첨가하고, 1N 염산으로 pH를 약 4.8로 유지하면서 실온에서 약 8시간 반응 시켰다. 이때, EDC와 HOBt, Cystamine의 첨가량은 히알루론산의 카르복실기에 대하여 각각 몰비로 4배, 4배, 0.5배였다. 반응 결과물은 100mM 염화나트륨 용액, 증류수로 투석하였다. 정제된 물질을 tris(2-carboxyethyl)phosphine를 치환된 Cystamine의 4배를 사용하여 cystamine 내에 존재하는 disulfide 그룹을 끊고 에탄올을 이용한 재결정방법을 통해 티올기가 치환된 히알루론산(HA-SH)를 얻었다. 티올기의 도입율은 1H-NMR(DPX300, Bruker, Germany)로 정량하여 약 50몰%가 도입된 것을 확인하였다.

히알루론산에 도입시킬 CB[6]의 치환율을 높이기 위해, 모노하이드록시기로 치환된 CB[6]를 anhydrous DMSO에 녹인 후 10 당량의 sodium hydride와 60℃에서 12시간동안 반응을 보냈다. 그 후, 10당량의 allylbromide를 천천히 주입한 후 다시 24시간동안 반응을 보냈다. 반응 결과물은 3리터, 2리터, 1리터의 diethyl ether로 washing후, 생성된 침전물을 acetonitrile로 취한 후 말렸다. Aluminum oxide 칼럼을 이용, 20%의 증류수와 아세토니트릴 혼합액부터 40%의 혼합액을 5% 간격으로 이동상으로 사용하여 모노알릴기로 치환된 CB[6]를 얻었다.

HA-SH를 증류수에 3mg/ml로 녹이고 알릴기가 도입된 CB[6]와 TCEP를 석영 튜브 내에 용해한 후, 광반응기에서 3시간동안 반응시켰다. 이때, 알릴기가 도입된 CB[6]와 TCEP의 첨가량은 히알루론산의 카르복실기에 대하여 각각 몰비로 2배, 2배였다. 이 반응물을 증류수에서 투석하여 정제하고 이를 동결건조하여 CB[6]가 도입된 히알루론산(monoCB[6]-HA hydrogel)를 얻었다. CB[6]의 도입율은 도3와 같이 1H NMR 측정을 통해 전체 히알루론산 단위체의 약 10%에 대해 CB[6]가 도입된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2-3: DAH - HA 와 MonoCB [6]- HA 의 독성평가

도 4의(A)는 독성시험에 사용된 시험군의 구성표이다. 부형제(G1) 및 단일제 투여군(G5, G6)은 C57BL/6 계통의 마우스에 시험물질 I(DAH-HA) 및 시험물질 II(MonoCB[6]-HA)를 그대로 피하에 투여한 것이고, 복합제투여군 G2 및 G3은 각 시험물질의 혼합물을 투여한 것이며, 복합제투여군 G4는 시험물질 I 및 II를 순차적으로 투여한 것이다. 채혈 후 개복하여 후대정맥 및 복대동맥을 절단하는 방법으로 방혈치사시켜 육안적으로 모든 장기와 투여부위를 검사하였다. 도 4(B)는 사망동물(mortality). 도 4(C)는 시험물질 투여와 관련된 일반증상을, 도 4(D)는 체중변화를, 도 4(E)는 necropsy 결과를 나타낸다. 시험물질 monoCB[6]-HA 및 DAH-HA를 C57BL/6 계통의 마우스에 단회 피하투여를 하였을 때, 복합제 및 단일제투여군에서 사망동물은 관찰되지 않았고, 시험물질 투여와 관련된 일반증상, 체중변화 및 부검소견 관찰 결과시험물질 투여와 관련된 육안적 이상소견은 관찰되지 않았다. 또한, 복합제투여군과 각각의 단일제투여군과의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 시험조건 하에서 monoCB[6]-HA과 DAH-HA의 복합제 투여에 의한 개략의 치사량(Approximate Lethal Dose, ALD)은 암수 모두 2(1+1) mg/head를 상회하는 것으로 판단되며, 따라서 마우스의 경우 사용 가능한 단회 투여량은 2(1+1)를 mg/head 상회할 것이다.

실시예 2-4: 세포 분화제 혹은 세포 활성 유도물질이 도입된 히알루론산 유도체 합성

실시예 2-4-1: 덱사메타손이 도입된 히알루론산 유도체 합성

실시예 2-4-1-1: 덱사메타손이 도입된 CB[6]( Dexamethasone -CB[6]) 합성

Dexa와 같이 하이드록시기가 있는 세포 분화제 혹은 세포 활성 유도물질의 경우 아세톤에 녹여서 카르복실기를 도입하였다. 구체적으로, Dexa는 무수아세톤에 대하여 10mg/ml인 용액을 제조하였다. 여기에 succinic anhydride와 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 추가하여 8시간동안 상온에서 반응시켰다. 카르복실기가 도입된 Dexa는 아세톤에서 침전이 생기게 되는데 이를 여과하여 정제된 Dexa-COOH를 준비하였다.

무수 DMSO에 대한 Dexa-COOH의 농도가 10 mg/ml 인 용액을 제조하였다. 여기에 Dexa-COOH의 카르복실기의 3몰배에 해당하는 DCC와 NHS를 첨가하면 urea 형태의 침전이 생기는데, urea를 제거 한 이후 아민이 도입된 쿠커비투릴[6](CB[6])를 Dexa-COOH의 2몰배만큼, TEA를 3몰배만큼 넣고 3일동안 반응시켜 Dexa와 CB[6]가 결합되도록 하였다. 이 반응물을 MWCO 500인 dialysis tube를 이용하여 DMSO와 초순수에 대하여 투석을 하여 동결건조하여 Dexa-CB[6]를 얻었다. Dexa-CB[6]의 반응은 도 5와 같이 1H NMR을 통해 확인할 수 있었다.

실시예 2-4-1-2: 덱사메타손이 도입된 CB[6]( Dexamethasone -CB[6])를 포함하는 히알루론산 유도체( HA - Dexa ) 합성

반응시간을 10분으로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 HA-DAH를 준비하였다. 이때 도입된 DAH는 30%로 확인하였다. 이 HA-DAH를 증류수에 5mg/ml의 농도로 용액을 제조하였다. 한편으로는 이온교환레진(Dowex 50WX8, Sigma-aldrich, US)을 하이드록시테트라부틸암모늄과 섞어서 레진에 테트라부틸 암모늄이 결합되도록 하였다. 이 레진을 HA-DAH 용액과 다시 섞은 후 8시간동안 교반시킨 후, 여과시켜 동결건조하여서 HA-DAH/TBA를 준비하였다. 상기 HA-DAH/TBA를 다시 무수 DMSO에 5mg/ml로 녹인 후, 트라우트리에이전트(traut’s reagent, Thermo scientific, US)와 덱사메타손 메실레이트(dexamethasone mesylate, steraloids, US)를 첨가하여 트라우트리에이전트의 ring opening 반응을 이용해 HA의 아민과 덱사메타손을 연결하여 HA-Dexamethasone을 준비하였다. 이때, Traut’s reagnet, dexamethasone mesylate의 첨가량은 히알루론산에 도입된 DAH에 대하여 각각 몰비로 2배, 2배였다. 반응 결과물은 100mM 염화나트륨 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 HA-Dexa를 얻었다. 도 6에서 Dexamethasone의 도입율은 1H-NMR(DPX400, Bruker, Germany)로 정량하여 약 9몰 %가 도입된 것을 확인하였다.

실시예 2-4-2: 레티노산이 도입된 히알루론산 유도체 합성

실시예 2-4-2-1: 레티노산이 도입된 CB[6]( All - trans - Retinoic Acid -CB[6]) 합성

ATRA와 같이 카르복실기가 있는 세포 분화제 혹은 세포활성 유도물질의 경우 바로 무수 DMSO에 녹여 ATRA의 농도가 10 mg/ml 인 용액을 제조하였다. 여기에 ATRA의 카르복실기의 3몰배에 해당하는 DCC와 NHS를 첨가하면 urea 형태의 침전이 생기는데, urea를 제거 한 이후 아민이 도입된 쿠커비투릴[6](CB[6])를 ATRA의 2몰배만큼, TEA를 3몰배만큼 넣고 3일동안 반응시켜 ATRA와 CB[6]가 결합되도록 하였다. 이 반응물을 MWCO 500인 dialysis tube를 이용하여 DMSO와 초순수에 대하여 투석을 하여 동결건조하여 ATRA-CB[6]를 얻었다. ATRA-CB[6]의 반응은 1H NMR을 통해 확인할 수 있었다.

실시예 2-4-2-2: 레티노산이 도입된 CB[6]( All - trans - Retinoic Acid -CB[6])를 포함하는 히알루론산 유도체( HA - ATRA ) 합성

All-trans-Retinoic Acid(Sigma-aldrich, US)를 무수 DMSO에 10mg/ml로 녹인 후, Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate(BOP, TCI, Japan)를 이용해서 DAH와 반응하여 ATRA-DAH를 합성하였다. 이때 DAH, BOP, HOBt는 ATRA에 대하여 각각 몰비로 10배, 4배, 4배였다. 반응 결과물은 100mM 염화나트륨 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 ATRA-DAH를 얻었다. ATRA의 도입의 확인은 ESI-MS를 통하여 분자량이 398로 합성이 제대로 된 것을 확인하였다.

한편으로는 이온교환레진(Dowex 50WX8, Sigma-aldrich, US)을 하이드록시 테트라부틸암모늄과 섞어서 레진에 테트라부틸 암모늄이 결합되도록 하였다. 이 레진을 HA과 다시 섞은 후 8시간동안 교반시킨 후, 여과시켜 동결건조하여서 HA-TBA를 준비하였다.

HA-TBA를 무수 DMSO에 2mg/ml로 녹인 후, 앞서 합성된 ATRA-DAH를 첨가하여 HA-ATRA를 합성하였다. 이때 ATRA-DAH, BOP, HOBt의 첨가량은 HA의 카르복실기에 대하여 각각 10%, 4배, 4배였다. 반응 결과물은 100mM 염화나트륨 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 HA-ATRA를 얻었다. 도7에서 All-trans-Retinoic Acid의 도입율은 1H-NMR(DPX400, Bruker, Germany)로 정량하여 약 9몰 %가 도입된 것을 확인하였다.

실시예 3: 히알루론산 하이드로젤에 담지된 세포에서 발현물질의 지속성 평가

체내에서 빠르게 clearance 되는 기존의 세포치료제를 보완하기 위한 효과적인 세포전달체로써 히알루론산 하이드로젤을 사용하고자 하였다. 투여된 줄기세포가 C/D-HA hydrogel및 그 유도체의 사용에 의해 오랫동안 유지되는지 확인하기 위해, SKH-1 nude 마우스에 투여 후 이미징을 통해 관찰하였다. 구체적으로 EGFP가 발현되는 아데노바이러스를 이용하여 제작된 Engineered rat BM-MSC(MSC/EGFP)가 세포지지체로 충진 되었을 때 MSC에서 발현되는 유전물질의 지속성을 확인하기 위한 실험으로IVIS imaging 장비로 분석을 하였다.

실시예 3-1: 히알루론산 하이드로젤의 제조

C/D-HA 하이드로젤은 상기 실시예 2-1에서 제조한 DAH-HA 20mg/ml와 실시예 2-2에서 제조한 monoCB[6]-HA 20mg/ml을 실온에서 섞어 제조하였다. 세포분화제/세포활성유도물질(Dexa, Retinoic acid) 결합된 C/D-D-HA, C/D-R-HA, C/D-RD-HA hydrogel의 경우 상기 실시예 2-1에서 제조한 DAH-HA, 실시예 2-2에서 제조한 monoCB[6]-HA, 실시예 2-4-1-1에서 제조한 Dexa-CB[6] 및 실시예 2-4-2-2에서 제조한 HA-ATRA를 각각 조합하여 제조하였다. MonoCB[6]-HA와 손님분자가 포함된 DAH-HA, D-D-HA, D-R-HA, D-RD-HA은 모두 공통적으로 주인분자 : 손님분자 = 1 : 1가 되도록 하였다. 히알루론산 하이드로젤의 상온에서 방치하면 농도 및 조건에 따라 수십 분 내 젤 형태로 변화하기 때문에 신속히 실험을 진행하였다.

실시예 3-2: 히알루론산 하이드로젤에 담지된 MSC 에서 발현물질의 지속성 평가

5 X 10⁵의 EGFP를 발현하는 MSC(MSC/EGFP)를 주인-손님분자의 작용에 의해 만들어진 주사가능형 히알루론산 하이드로젤과 함께 C57BL/6 mouse의 피하에 주입하여 시간에 따른 중간엽 줄기세포의 담지 지속성 및 생존율을 GFP imaging 장비로 확인을 하였다. MSC/EGFP에 C/D-HA hydrogel, 또는 대조 지지체로서 Matrigel과 Matrixen이 충진된 것을 피하로 주입하여 시간에 따라 하이드로젤의 크기를 측정함으로써 체내 잔류기간을 확인할 수 있었고, GFP의 밝기 변화를 통해 세포 담지 지속성을 확인하였다. 도 8에서 보듯, C/D-HA hydrogel 및 유도제의 사용으로 50일 째 관찰시점에서도 관찰되어, G1~G3 그룹과 비교하여 세포의 지속성이 장기간 유지됨을 확인할 수 있다. 또한, 세포분화제/세포활성유도물질(Dexa, Retinoic acid) 결합된 C/D-D-HA, C/D-R-HA, C/D-RD-HA hydrogel의 경우, 도입물질이 없는 C/D-HA hydrogel 과 비교했을 때 더 높은 강도의 EGFP 발현을 보여 지속성이 증가한 것을 확인할 수 있다.

실시예 3-3: 히알루론산 하이드로젤의 체내 잔류기간 평가

히알루론산 하이드로젤이 체내 얼마나 오랜 기간 동안 잔류하는지 평가하기 위해, C/D-HA 및 C/D-RD-HA 하이드로젤을 마우스에 피하투한 후 IVIS imaging 장비로 확인하였다.

구체적으로, IVIS imaging 장비로 촬영이 된 사진을 ImageJ 프로그램을 이용하여 하이드로젤의 크기를 분석하고, C/D-HA hydrogel및 C/D-RD-HA hydrogel 및 대조지지체로 Matrigel과 Matrixen을 C57BL/6 mouse의 피하에 주입을 하여 시간에 따라 하이드로젤의 크기를 측정을 하여 하이드로젤의 체내 잔류기간을 평가하였다.

도 9에서 보듯, Matrixen을 사용한 경우 10일 이내에, Matrigel을 사용한 경우 3주만에 분해가 되는 것을 확인할 수 있었고, C/D-HA hydrogel및 C/D-RD-HA hydrogel을 사용한 경우 50일 경과 후에도 체내에 잔류하는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 이러한 결과를 통하여 본 발명의 히알루론산 하이드로겔은 체내에서 오랫동안 지속성을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 히알루론산 하이드로젤에 도입된 MSC / IL -12의 효능 평가

실시예 4-1: 발현 평가

실시예 4-1-1: in vitro 발현 평가

주인-손님분자의 작용에 의해 만들어진 주사가능형 히알루론산 하이드로젤에 IL-12M아데노바이러스를 MSC에 도입시킨 MSC/IL-12M를 충진하여 배양한 후 IL-12의 발현을 ELISA로 확인하였다.

도 10 에서 하이드로젤을 도입한 MSC/IL-12M과 대조 세포지지체인 Matrixen, Matrigel을 도입한 MSC/IL-12 2X104 세포를 6웰 세포컬쳐플레이트에 10% Fetal bovine serum 1% antibiotics가 포함된 Low glucose DMEM(Gibco, US)를 배지를 사용하여 키운 후, 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21일이 경과 후 배양액에서 IL-12의 발현을 측정하였다. 도 10에서 보듯, Matrixen 을 사용한 경우와 세포지지체를 도입하지 않은 MSC/IL-12에서 IL-12 발현농도는 Matrigel과 C/D-HA hydrogel 을 사용한 경우 보다 낮았다. 특히 C/D-HA hydrogel을 사용한 경우 Matrigel 과 비교하여 21일째 발현 IL-12의 농도가 높았다.

C/D-HA hydrogel에 Retinoic acid(RA)와 Dexamethasone(Dexa)을 도입하였을 ? MSC/IL-12M로 부터 IL-12의 발현이 어떻게 변화하는지를 확인하고자 C/D-R-HA hydrogel, C/D-D-HA hydrogel, C/D-RD-HA hydrogel을 사용한 경우 IL-12의 발현을 비교하였다, 도 10에서 보듯, MSC/IL-12M의 세포지지체로 C/D-RD-HA hydrogel을 사용한 경우, C/D-HA hydrogel 보다 높은 IL-12 발현을 보였다.

실시예 4-1-2: in vivo 발현 평가

히알루론산 하이드로젤을 Engineered 세포치료제인 MSC/IL-12에 대한 세포지지체로 사용하였을 때 유전자발현의 증가를 확인하고자, 마우스의 종양 내 투여한 후 혈액에서 발현 산물의 농도를 측정하였다.

C/D-HA hydrogel을 도입한 MSC/IL-12M의 생체 IL-12 발현의 지속성을 평가하기 위하여 6주령의 C57BL/6 mouse의 피하에 1 X 10⁶의 B16F10을 주입하여 흑색종 모델을 만들었다. 종양의 지름이 5mm가 된 시점에(종양형성5일 후) MSC/IL-12M 단독그룹과, C/D-HA 또는 C/D-RD-HA hydrogel이 충진된 MSC/IL-12M 그룹, 그리고 대조 지지체로서 Matrixen이 충진된 MSC/IL-12M을 종양 내로 주입하여, 0, 1, 3, 6, 10, 15일이 경과한 시점에서 혈청 내 IL-12 및 IFN-gamma의 발현을 ELISA로 확인하였다.

도 11(A)에서 보듯, 투여 후 1일이 경과한 시점에서는 지지체 사용여부과 관계없이 모든 그룹에서 1000 pg/ml 이상 높은 발현을 보이는 반면, 3일이 경과한 후에는 Matrixen을 사용한 경우보다, C/D-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우가, C/D-HA hydrogel 보다는 C/D-RD-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우 IL-12의 발현 농도가 높았으며, 15일까지도 IL-12의 발현이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

IL-12의 활성으로 유도되는 IFN-gamma의 농도의 경우, 투여 후 3일 경과 시점에서 Matrixen과 C/D-RD-HA hydrogel보다 C/D-RD-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우 가장 높았으며, 6일이 경과한 시점에서는 Matrixen, C/D-RD-HA hydrogel, C/D-RD-HA hydrogel을 세포지지체로 사용한 순서로 혈액에서 IFN-gamma 농도가 측정되었다. C/D-RD-HA hydrogel을 지지체로 사용한 경우 투여 후 15일까지 경과된 시점까지 타 시험군과 비교하여 높은 IFN-gamma 농도를 보였다.

실시예 4-2: 항암효능 평가

C/D-HA hydrogel을 도입한 MSC/IL-12M의 항종양 효과에 미치는 영향을 알기 위해 6주령의 C57BL/6 mouse의 피하에 1 X 10⁶의 B16F10을 주입하여 흑색종 모델을 만들었다. 종양의 지름이 5 mm가 된 시점에(종양형성 5일 후) 세포지지체가 없는MSC/IL-12M과, C/D-HA hydrogel또는 C/D-HA-DR-HA hydrogel이 충진된 MSC/IL-12M 그룹, 그리고 대조 지지체로서 Matrigel 또는 Matrixen이 충진된 MSC/IL-12M을 종양 내로 주입하여, 종양크기 및 생존율을 확인하였다. 이 때, 사용한 MSC/IL-12M의 수는 1 X 10⁵개를 사용하였다.

실시예 4-2-1: 종양성장억제 효능 평가

항암효능을 비교하기 위해 B16F10 생쥐 흑색종 세포주를 이용하였다. 1 X 10⁶ cell 을 피하주사 5일 후 종양 지름이 5mm 이상이 되었을 때 1 x 10⁵ cell 의 MSC/IL-12M를 각각의 세포지지체와의 조합으로 종양 내로 투여하였다(MSC alone, MSC/IL-12M, MSC/IL-12M/Matrigel, MSC/IL-12M/Matrixen, MSC/IL-12M/C/D-HA hydrogel, MSC/IL-12M/C/D-DR-HA hydrogel). 도 12(A) 에서 보듯, 종양주입 후 25일(engineered MSC 투여 후 21일)까지 이틀 간격으로 종양 크기 변화를 관찰하였다.

도 12(A) 에서 보듯, day 10(종양주입 후 10일)까지, therapy 후 약 5일 동안은 모든 그룹에서 종양의 크기가 증가하였으나, MSC/IL-12M을 사용하는 치료 그룹들은 15 내지 19일까지 약 6 내지 10 일동안 종양 성장의 정체기를 보였다. 한편 19일 이후 Matrigel 또는 Matrixen을 사용한 그룹은 종양의 크기가 급격히 증가하는 경향이 보였으나 C/D-HA hydrogel 사용 그룹은 여전히 종양의 성장이 지연되는 것을 관찰할 수 있었다. Day 25에서는 C/D-HA hydrogel 사용그룹에서는 서서히 종양이 성장하고 있으나, MSC/IL-12M/C/D-DR-HA hydrogel 그룹에서는 여전이 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 치료 유전자 IL-12M이 도입된 줄기세포치료제 지지체의 항암효과는 C/D-DR-HA hydrogel, C/D-HA hydrogel, Matrigel, Matrixen 순서로 우수하다고 결론 내릴 수 있었다.

실시예 4-2-2: 생존율 증가 효능 평가

상기 실시예 4-2-1에서 사용된 각 치료군의 생존율을 조사하였다. 종양의 지름이 15mm 이상이거나 부피가 1700㎣ 이상인 쥐들은 죽은 것으로 간주하여 데이터를 정리하였다. 도 12(B) 에서 보듯. 세포지지체가 없이 MSC/IL-12M 투여한 그룹은 최대 30일까지, 대조 세포지지체인 Matrixen과 Matrigel을 도입한 경우는 40일 전후에서 모든 쥐가 사망한 것으로 관찰되었다. 반면, C/D-HA hydrogel을 도입한 그룹은 최대 45일까지 증가된 생존이 관찰되었다. MSC/IL-12M/C/D-DR-HA hydrogel 그룹의 경우 종양 투여 후 31 내지 37일 시점에서는 MSC/IL-12M/C/D-HA hydrogel 그룹 보다 더 높은 비율로 생존하였으나, 50일 시점에서는 MSC/IL-12M/C/D-HA hydrogel그룹과 동일하게 모든 쥐가 사망하였다.

이를 통해 MSC 지지체의 항암 생존 증가 효과는 C/D-DR-HA hydrogel, C/D-HA hydrogel, Matrigel, Matrixen 순으로 우수한 것으로 확인되었다. C/D-HA hydrogel과 Matrigel을 적용할 경우 생존율의 차이는 Log-rank(Mantel-Cox) Test 와 Gehan-Breslow-Wilcoxon Test, 두 방법 모두에서 p value가 통계학적으로 유의함을 확인하였다.

실시예 4-3: 반복투여 항암효능 평가

히알루론산 하이드로젤이 충진된 MSC/IL-12M 의 반복투여에 의하여 단회투여 보다 항암효과 증가되는지 확인하기 위해 6주령의 C57BL/6 mouse의 피하에 1 X 10⁶의 B16F10을 주입하여 질환모델을 만들었다. 종양 형성 6일 후와 20일 후에 MSC/IL-12M을 단독 투여하거나, C/D-RD-HA hydrogel이 충진된 MSC/IL-12M, 또는 대조군으로서 Matrixen이 충진된 MSC/IL-12M을 종양 내로 투여한 후 시간에 따라 종양의 성장을 확인하였다. 이 때, 사용한 MSC/IL-12M의 수는 1 X 10⁵개를 사용하였다.

실시예 4-3-1: 종양성장억제 효능 평가

단회투여 실험과 동일하게, MSC/IL-12M의 항암효능을 평가하기 위해 B16F10 마우스 흑색종 세포주를 이용하였다. 1 X 10⁶ cell 을 피하주사 후, MSC/IL-12M을 다양한 세포지지체와 조합으로 종양 내로 반복투여하였다(MSC alone 대조군, MSC/IL-12M, MSC/IL-12M/Matrixen, MSC/IL-12M/C/D-RD-HA hydrogel). 도 13 에서 보듯 종양주입 후 이틀 간격으로 종양 크기 변화를 측정하였고, 종양의 지름이 17mm 이상이 되면 해당 개체를 희생시켜서 사망한 것으로 간주하였다. 첫번째 투여 후 IL-12M을 전달하지 않은 마우스는 항암효과가 나타나지 않았다. 치료물질인 IL-12를 발현하는 MSC/IL-12M그룹의 경우 day 18까지 종양의 성장이 늦춰지는 것을 확인하였고 day 20에 두번째 투여를 실시 하였다. MSC/IL-12M을 C/D-RD-HA hydrogel에 담지한 경우 day 32까지 암의 성장이 지연되는 반면, Matrixen을 MSC/IL-12M의 지지체로 사용한 그룹에서는 종양의 크기가 두번째 투여 후 4~5일정도 유지되다가 급격하게 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 4-3-2: 생존율 증가 효능 평가

상기 실시예 4-3-1과 동일한 방법을 사용하여 C/D-RD-HA hydrogel에 담지된 MSC/IL-12M을 종양생성 마우스에 반복투여하여 마우스의 생존율을 관찰하였다. 단회투여의 경우 종양 투여 후 최대 생존기간이 50일인 반면 반복투여 후에는 약 80일 이상까지 생존된 마우스가 확인되었다. 또한 단회투여의 경우, 종양세포 투여 후 33일 경과시점서부터 사망한 쥐가 관찰된 반면, 반복투여의 경우, 45일 경과 이후에서 사망한 쥐가 관찰되었다. 따라서 히알루론산 하이드로젤을 도입한 세포치료제는 반복투여에 의해 종양 성장억제능과 항종양 생존율을 증가시켜 치료 효과가 강화됨을 알 수 있었다.

본 실시예를 바탕으로 본 발명의 히알루론산 하이드로젤은 세포 담지 지속성 유지와 세포치료제의 치료 유전자 발현 및 항암 효능을 증진시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 항암치료제 뿐 아니라, 도입하고자 하는 치료 유전자에 따라 다양한 난치성 질환 치료를 위한 줄기세포치료제 개발에 히알루론산 하이드로젤을 응용할 수 있었다. 또한 세포분화제 /세포활성유도물질이 적용된 hydrogel은 유전자의 발현 시간을 지속시킬 뿐 아니라 증진된 치료효과를 보여 세포치료제로 응용가능성을 확인하였다.

실시예 5: MSC / BDNF 로부터 BDNF 의 발현에 미치는 히알루론산 하이드로젤의 효능 평가

C/D-HA hydrogel 또는 세포 분화제 혹은 세포활성 유도물질이 적용된 세포지지체가, 항암치료에 사용된 IL-12 뿐만 아니라 다른 유전자를 발현하는 MSCs에서도 같은 효과를 나타내는지, 골수 유래가 아닌 다른 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포에서도 같은 효과가 나타나는지 확인하였다.

본 실시예에서는 치료 유전자로 BDNF를 사용하였고, MSC로 GFP 형질 전환 생쥐의 지방세포 유래의 MSC를 사용하였다. MSC에 BDNF-TK가 발현하는 아데노바이러스를 도입하여 MSC/BDNF를 제조하였다(실험예 1-3). C57BL/6 mouse의 피하에 5X105의 MSC/BDNF가 충진된 100ul의 세포지지체를 주입하고 1일, 5일, 9일, 15일, 21일이 경과한 시점에 마우스의 피를 뽑아, 혈청에서 BDNF 농도를 ELISA로 확인하였다. 세포지지체로 Matrigel, Matrixen, C/D-HA hydrogel, C/D-DR-HA hydrogel를 사용하였다. 도 14에서 보듯, 투여 후 9일부터 C/D-HA hydrogel 및 그 유도체를 사용한 그룹들에서 BDNF의 발현이 다른 그룹에 비해 월등하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, Dexamethasone과 All-trans-Retinoic Acid를 사용하였을 때(C/D-RD-HA)는, C/D-HA hydrogel 만 사용한 그룹과 비교하여 투여한지 21일 경과 시점에서 높은 BDNF 발현을 확인하였다. 대조 지지체인 Matrigel 또는 Matrixen을 사용한 그룹에서는 주입 5일 경과시점에는 하이드로겔을 사용한 경우와 비교하여 BDNF 발현에서 차이가 없었으나, 이후 시점부터는 발현이 급격히 감소하였다

실험 결과 C/D-HA hydrogel의 사용 및 추가로 세포분화제 또는 세포활성 유도물질이 도입된 hydrogel의 사용은 IL-12 뿐만 아니라 BDNF의 발현 지속기간을 증가시킴으로써 engineered MSCs와 히알루론산 하이드로젤 및 그 유도체로 구성된 세포치료제의 높은 활용성을 시사하였다.

Claims

세포분화제 또는 세포활성 유도물질을 포함하고, 쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 세포분화제는 레티노이드, 비타민 또는 그의 유도체, 스테로이드성 호르몬, 성장인자 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 세포분화제는 혈관분화 촉진제, 신경분화 촉진체, 골분화 촉진제, 피부분화 촉진제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제3항에 있어서,
상기 혈관분화 촉진제는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor) 또는 PDGF(Platelet derived growth factor)인 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제3항에 있어서,
상기 신경분화 촉진제는 BDNF(Brain Derived Neurotropic Factor) 또는 ATRA(All-trans-Retinoic Acid)인 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제3항에 있어서,
상기 골분화 촉진제는 덱사메타손, Cyclic-RGD 또는 BMP(Bone Morphonenic Protein)인 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제3항에 있어서,
상기 피부분화 촉진제는 ATRA, EGF(Epidermal Growth Factor), 판테놀(Panthenol) 또는 PtA(Pantothenic Acid)인 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 세포활성 유도물질은 레티노이드, 스테로이드성 호르몬, 비타민 또는 그의 유도체, 리간드 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 쿠커비투릴은 1 내지 10,000의 글리코우릴로 구성되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 폴리아민은 하나 이상의 아민기를 갖는, C1-C20 알킬기; C2-C20 알케닐기; C2-C20 알키닐기; C1-C20 알콕시기; C1-C20아미노알킬기; C4-C20 시클로알킬기; C4-C7 헤테로아릴시클로기; C6-C20 아릴기; C5-C20 헤테로아릴기; C1-C20 알킬실릴기; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 아다만탄; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 페로센 또는 메탈로센; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 카르보레인; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 플러렌; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 시클람 또는 크라운에테르; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 산소가 보호된 아미노산; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 펩티드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 알칼로이드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 시스플라틴; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 올리고뉴클레오티드; 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 로다민; C1-C20 알킬기, C6-C20 아릴기 또는 C5-C20 헤테로아릴기를 갖는 나노파티클; 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 쿠커비투릴이 결합된 히알루론산 유도체와 폴리아민이 결합된 히알루론산 유도체가, 상기 쿠커비투릴과 폴리아민의 특이적인 소수성/친수성 작용에 의하여, 비공유결합적으로 연결되어 형성되는 것인 히알루론산 기반 하이드로겔.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로겔 및 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 줄기세포는 세포치료 유전자를 발현시킬 수 있는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), 조혈모 줄기세포 (hematopoietic stem cell), 신경능 줄기세포 (neural crest stem cell), 내피 줄기세포 (endothelial stem cell) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포치료용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 세포치료 유전자는 사이토카인, 성장인자, 영양인자 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 발현시킬 수 있는 것인 세포치료용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터루킨-1, 인터루킨-6, 인터루킨-12, 인터페론 감마, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포치료용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 영양인자는 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)인 것인 세포치료용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 성장인자는 EGFP, BMP family, VEGF, FGF, HGF, TRAIL, HSV-TK 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 세포치료용 조성물.
제13항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 세포치료용 조성물.
쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔을 포함하는 세포치료 보조용 조성물.
쿠커비투릴과 폴리아민을 이용하여 제조된 히알루론산 기반 하이드로겔과 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료용 조성물.