CN102209731A - 结合bmp2的硫酸类肝素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使用BMP2的肝素结合结构域的亲合色谱所获得的硫酸类肝素GAG。所述GAG获自成骨细胞细胞外基质和可商购的硫酸类肝素(Celsus HS)。

Description

结合BMP2的硫酸类肝素
技术领域
本发明涉及能够结合BMP2的糖胺聚糖，包括它们的分离和鉴定，以及分离的糖胺聚糖在组织生长和/或发育中的应用。
背景技术
糖胺聚糖(GAG)是复杂的碳水化合物大分子，其负责执行和调控多种基本细胞功能。
GAG与数百种已知的肝素结合生长和粘附因子协作参与信号系统的调节或介导。已考虑生长因子与GAG的结合通过多种作用调节它们的多种活动，如通过保护它们不被蛋白水解降解来延长它们的半衰期，调节这些细胞因子在细胞表面上的定位，介导分子相互作用和稳定配基-受体复合物。
已鉴别的肝素结合生长因子的数目不断增加，加上数百种已知的肝素结合生长因子，它们中大多数是通过肝素亲合色谱纯化的。它们包括较大的成纤维细胞生长因子(FGF)家族、PDGF、多效营养因子(或多效生长因子，pleiotropin)以及细胞因子TGF-β超家族。后一个因子家族涵盖了骨诱导性骨形态发生蛋白(BMP)亚家族，该亚家族是根据它们诱导异位骨形成的能力命名的。
GAG与生长因子间相互作用的性质和作用仍不清楚。尽管已表明FGF2与肝素内存在的特定糖序列之间的相互作用具有高亲合性，但是一般来说，仍不清楚其它生长因子与类肝素之间的结合是否涉及蛋白质生长因子上的氨基酸序列或构象表位与嵌入GAG中的糖序列之间的高亲合性或特异结合相互作用，或者这种结合是否是由GAG与蛋白生长因子之间的低亲合性、非特异相互作用所介导的。
如果GAG与存在于细胞外基质中或分泌到细胞外基质中的蛋白质之间的相互作用是特异性的，那么需要鉴别结合配偶体(binding partner)以解释该相互作用并理解可以如何使用或调节这些相互作用以提供新型治疗。
因此，所产生的主要问题是在与生长因子多肽主链内的一级氨基酸序列/3维三级构象匹配的GAG分子链中是否嵌入了糖序列，从而以绝对或至少相对的特异性控制它们的结合，并由此控制它们的生物活性。
骨形态发生蛋白2(也称作骨形态形成蛋白2、BMP2或BMP-2)是与骨和软骨发育密切相关的TGF-β超家族的成员。它是一种成骨蛋白，即成骨细胞分化的强效诱导剂(Marie等人，(2002)″Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2，FGFR-2and BMP-2signaling″.Histol.Histopathol.17(3)：877-85)。浸渍有BMP2的胶原海绵的植入显示出对新骨形成的诱导(Geiger M，Li RH，Friess W(2003年11月).Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2.Adv.Drug Deliv.Rev.55(12)：1613-29)。在美国，重组人BMP2可用于整形外科应用(例如，
Figure BDA0000060318390000021
Bone Graft，Medtronic Inc，USA)。
发明内容
本发明涉及硫酸类肝素制剂、硫酸类肝素HS/BMP2。已发现HS/BMP2能够提高结缔组织的生成、修复和再生。
在本发明的一个方面，提供了硫酸类肝素HS/BMP2。可以提供分离形式或基本纯化形式的HS/BMP2。这可以包括提供其中硫酸类肝素组分为至少80％HS/BMP2的组合物，更优选地，为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在优选的实施方式中，HS/BMP2能够结合具有氨基酸序列SEQ IDNO：1或6或由该氨基酸序列组成的肽或多肽。在一些实施方式中，该肽为SEQ ID NO：1或6，在其它实施方式中，它为BMP2蛋白。在一些实施方式中，HS/BMP2与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或6或由该氨基酸序列组成的肽结合的KD小于100μM，更优选地，小于50μM、40μm、30μm、20μM或10μM之一。
在一些优选的实施方式中，HS/BMP2为N-硫酸化的。这可以包括硫酸类肝素寡糖链中N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)残基的N-硫酸化。优选地，HS/BMP2中的至少80％N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)残基被N-硫酸化。在一些实施方式中，这可以是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在一些优选的实施方式中，HS/BMP2被6-O-硫酸化(N-硫酸葡糖胺(GlcNS)残基在C6处的O-硫酸化)。优选地，HS/BMP2中的至少80％N-硫酸葡糖胺(GlcNS)残基被6-O-硫酸化。在一些实施方式中，这可以是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
根据本发明人在本文中所述的方法，可以获得、鉴定、分离或富集HS/BMP2，所述方法可以包括下列步骤：
(i)提供固体载体，其具有附着到该载体上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或6的肝素结合结构域；
(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物流分与混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
在本发明人的方法中，所述混合物可以包含得自可商购来源的糖胺聚糖。一种适合来源为硫酸类肝素流分，例如，可商购的硫酸类肝素。一种适合的硫酸类肝素流分可以在从猪肠粘膜分离肝素期间获得(例如，Celsus Laboratories Inc.-有时被称为“Celsus HS”)。硫酸类肝素的其它适合来源包括来自任何哺乳动物(人或非人)的硫酸类肝素，尤其是来自肾、肺或肠粘膜的硫酸类肝素。在一些实施方式中，硫酸类肝素来自猪(猪科)或母牛(牛科)的肠粘膜、肾或肺。另一种适合来源为成骨细胞细胞外基质材料，或者获自成骨细胞细胞外基质材料的硫酸类肝素流分。
在本发明的另一个方面，提供了包含根据上述任一方面的HS/BMP2和BMP2蛋白的组合物。
在本发明的一个方面，提供了包含根据上述方面的HS/BMP2的药物组合物或药剂。所述药物组合物或药剂还可以包含药用载体、佐剂或稀释剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物用于在治疗方法中使用，所述方法包括断骨的修复和/或再生。在一些实施方式中，该药物组合物或药剂还可以包含BMP2蛋白。在一些实施方式中，该药物组合物或药剂还可以包含间充质干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了HS/BMP2，其用于在医疗方法中使用。该医疗方法可以包括体内伤口愈合的方法、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或哺乳动物或人骨的修复和/或再生。
在本发明的相关方面中，提供了HS/BMP2在制造用于医疗方法的药剂中的应用。在一些实施方式中，该医疗方法包括哺乳动物或人的断骨的修复和/或再生。
在本发明的另一个方面，提供了包含生物材料和HS/BMP2的生物相容性植入物或假体。在一些实施方式中，该植入物或假体涂覆有HS/BMP2。在一些实施方式中，该植入物或假体浸渍有HS/BMP2。所述植入物或假体还可以涂覆或浸渍有BMP2蛋白和/或间充质干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了形成生物相容性植入物或假体的方法，该方法包括用HS/BMP2涂覆或浸渍生物材料的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括用BMP2蛋白和间充质干细胞中的之一或两者涂覆或浸渍生物材料。
在本发明的另一个方面，提供了治疗患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的HS/BMP2。在一些实施方式中，所述方法包括将HS/BMP2施用至骨折周围的组织。在一些实施方式中，所述方法包括将HS/BMP2注射至骨折周围的组织。在这些方法中，可以将HS/BMP2配制成包含HS/BMP2和药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物或药剂。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括将BMP2蛋白施用至患者。在这些方法中，可以将HS/BMP2和BMP2蛋白配制成包含HS/BMP2和BMP2蛋白以及可药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。
在一些实施方式中，所述方法还可以包括向患者给予间充质干细胞。在这些方法中，可以将HS/BMP2、BMP2蛋白和间充质干细胞中的至少两种配制成包含HS/BMP2、BMP2蛋白和间充质干细胞中的至少两种以及药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。
优选地，分别以治疗有效量提供HS/BMP2、BMP2蛋白和间充质干细胞。在一些实施方式中，治疗骨折的方法还包括以下步骤：将治疗有效量的HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/或间充质干细胞配制成包含HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/或间充质干细胞以及药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物，其中向患者给予该药物组合物。
在本发明的另一个方面，提供了治疗患者骨折的方法，所述方法包括将生物相容性植入物或假体手术植入到在骨折部位处或骨折部位周围的患者组织中，该植入物或假体包含生物材料和HS/BMP2。
在一些实施方式中，所述植入物或假体涂覆有HS/BMP2。在一些实施方式中，所述植入物或假体浸渍有HS/BMP2。在一些实施方式中，所述植入物或假体还浸渍有BMP2蛋白和间充质干细胞中之一或两者。
在本发明的另一个方面，提供了培养基，所述培养基包含HS/BMP2。
在本发明的另一个方面，提供了HS/BMP2在体外细胞培养中的应用。在本发明的相关方面，提供了HS/BMP2在结缔组织体外生长中的应用。在本发明的另一个相关方面，提供了结缔组织体外生长的方法，所述方法包括培养与外源添加的HS/BMP2接触的间充质干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了促进骨生成的方法，所述方法包括将HS/BMP2施用至骨前体细胞或骨干细胞。所述方法可以包括使骨前体细胞或骨干细胞与HS/BMP2体内或体外接触。在一些实施方式中，使骨前体细胞或骨干细胞与BMP2蛋白接触，并同时与HS/BMP2接触。在优选的实施方式中，骨前体细胞或骨干细胞为间充质干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了在需要该治疗的人或动物患者中骨组织的修复、置换或再生的方法，所述方法包括：
(i)将与HS/BMP2接触的间充质干细胞体外培养足以使所述细胞形成骨组织的一段时间；
(ii)收集所述骨组织；
(iii)将所述骨组织在创伤或疾病部位处植入到患者的身体中以修复、置换或再生患者的骨组织。
在一些实施方式中，所述方法还包括使培养物中的间充质干细胞与外源BMP2蛋白接触。
在本发明的另一个方面，提供了通过在存在HS/BMP2的情况下体外培养间充质干细胞所获得的骨组织。在一些实施方式中，该骨组织是通过在存在HS/BMP2和BMP2蛋白的情况下体外培养间充质干细胞获得的。
在本发明的另一个方面，提供了培养间充质干细胞的方法，所述方法包括培养与HS/BMP2接触的间充质干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了包含多个部件的试剂盒，所述试剂盒包含预定量的HS/BMP2和预定量的BMP2。所述试剂盒可以包含含有预定量HS/BMP2的第一容器和含有预定量BMP2的第二容器。所述试剂盒还可以包含预定量的间充质干细胞。可以提供该试剂盒以在医疗方法中使用。该医疗方法可以包括体内伤口愈合、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或哺乳动物或人骨的修复和/或再生的方法。可以与所述试剂盒一同提供说明单独、顺序或同时施用HS/BMP2、BMP2蛋白和/或间充质干细胞以提供医学治疗的说明书。
在本发明的另一个方面提供了产品，所述产品含有治疗有效量的下列物质：
(i)HS/BMP2；和以下中的之一或两者
(ii)BMP2蛋白；
(iii)间充质干细胞，
以用于在医疗方法中同时、单独或顺序使用。该医疗方法可以包括体内伤口愈合、结缔组织修复和/或再生、骨的修复和/或再生和/或哺乳动物或人骨的修复和/或再生的方法。可以可选地将该产品配制为用于同时给药的复合制剂。
以下说明了本发明的其它方面。
在本发明的一个方面，提供了对BMP2具有高结合亲合力的GAG。更优选地，GAG为硫酸类肝素(HS)。在一种实施方式中，按照本文所述的方法，从成骨细胞的细胞外基质获得的GAG混合物中分离出HS，其中将包含BMP2的肝素结合结构域(SEQ ID NO：1)的多肽连接到固体载体上并且使得形成GAG-多肽复合物。GAG组分从GAG-多肽复合物的解离导致在本文被称为“HS/BMP2”(有时称为“HS-3”或“HS3”)的独特HS的分离。
在另一种实施方式中，使用相同方法从肝素与猪肠粘膜分离期间获得的并且得自Celsus Laboratories Inc(Cincinnatti，USA)的可商购硫酸类肝素(Celsus HS)(例如，INW-08-045，硫酸类肝素I，Celsus Lab Inc，HO-03102，HO-10595，10×100mg)中分离出HS/BMP2。
本发明人相信，能够从获自多种来源的HS流分中获得HS/BMP2，所述来源包括哺乳动物(人和非人)组织和/或细胞外基质。
因此，在本发明的一个方面，提供了HS/BMP2。可以提供分离或纯化形式的HS/BMP2。在另一个方面，提供了包含HS/BMP2的培养基。
在本发明的另一个方面，提供了包括HS/BMP2的药物组合物或药剂，其可选地与药用载体、佐剂或稀释剂组合。在一些实施方式中，药物组合物或药剂还可以包含BMP2蛋白。提供了用于创伤或疾病的预防或治疗的包含HS/BMP2的药物组合物或药剂。还提供了HS/BMP2在制造用于预防或治疗创伤或疾病的药剂中的应用。
在本发明的另一个方面，提供了预防或治疗需要治疗的患者中创伤或疾病的方法，所述方法包括向患者给予有效量的HS/BMP2。可以将所给予的HS/BMP2配制到适合的药物组合物或药剂中，并且还可以包含药用载体、佐剂或稀释剂。可选地，该药物组合物或药剂还可以包含BMP2蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了促进或抑制骨生成(骨细胞和/或骨组织形成)的方法，包括向骨前体细胞或骨干细胞施用HS/BMP2。
在本发明的另一个方面，提供了促进或抑制软骨组织形成(软骨形成)的方法，包括向软骨前体细胞或软骨干细胞施用HS/BMP2。
可选地，提供了在存在外源加入的BMP2蛋白的情况下，通过使骨或软骨前体细胞或干细胞与HS/BMP2接触，可以体外实施刺激或抑制骨生成或软骨组织形成的方法。所述前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在促进组织形成的情况下，可以收集所形成的组织并用于向人或动物患者移植。
因此，在本发明的一个方面，提供了结缔组织，其中该结缔组织是在存在HS/BMP2(即，外源HS/BMP2)，并且可选地在存在BMP2(即，外源BMP2)的情况下，通过间充质干细胞的体外培养获得的。所述结缔组织可以是骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。
使用HS/BMP2的疾病预防或治疗可以包括组织的修复、再生或置换，尤其是结缔组织，如骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。
在这些组织之一发生恶化的患者中，可向恶化部位施用HS/BMP2以用于刺激该部位的组织生长、增殖和/或分化。例如，对施用部位处或附近的间充质干细胞的刺激(优选地，当该部位处也存在BMP2时)会导致间充质干细胞增殖且分化为适当的结缔组织，由此提供了对损伤组织的置换/再生以及创伤的治疗。
可替代地，可收集从与HS/BMP2接触的间充质干细胞的体外培养物中获得的结缔组织并且在创伤或疾病部位处植入以置换损伤或恶化的组织。可选地，可以首先将损伤或恶化的组织从创伤或疾病部位切除。
在另一个方面，可以提供含有干细胞(优选间充质干细胞)和HS/BMP2的药物组合物。组合物在创伤、疾病或恶化部位处的施用(例如，注射)提供了该部位处组织的再生。
因此，HS/BMP2可用于体内伤口愈合，包括组织修复、再生和/或置换(例如，瘢痕组织或断骨的愈合)，其通过将HS/BMP2，可选地与BMP2和/或干细胞组合而直接应用至需要治疗的患者来起作用。HS/BMP2还可用于组织的体外生成，所述组织适合于移植到需要组织修复、再生和/或置换的患者体内。
下列编号段落包含了对本文所公开的创造性技术特征的广泛组合的说明：
1、一种分离能够与具有肝素结合结构域的蛋白质结合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供固体载体，其具有附着到该载体上的多肽分子，其中该多肽包含肝素结合结构域；
(ii)使该多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得能够形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从该多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
2、一种鉴别能够刺激或抑制细胞和/或组织生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供固体载体，其具有附着到该载体上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；
(ii)使该多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得能够形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的糖胺聚糖；
(vi)将收集的糖胺聚糖添加到细胞或组织中，其中存在含有肝素结合结构域的氨基酸序列的蛋白质；
(vii)测量以下的一项或多项：细胞增殖、细胞分化、一种或多种蛋白质/糖蛋白/糖脂标记物的表达。
3、第1段或第2段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有细胞外基质材料。
4、第3段所述的方法，其中细胞外基质材料来源于结缔组织或结缔组织细胞。
5、第1段至第4段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸类肝素中的一种或多种。
6、第1段至第5段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物富含硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸类肝素中的一种。
7、第1段至第6段中任一段所述的方法，其中所述方法还包括对所收集的糖胺聚糖进行进一步分析以确定GAG的结构特征。
8、第1段至第7段中任一段所述的方法，其中糖胺聚糖-多肽复合物与裂合酶接触。
9、第1段至第8段中任一段所述的方法，其中所述多肽为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之一或包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之一。
10、硫酸类肝素HS/BMP2。
11、包含HS/BMP2的培养基。
12、包含HS/BMP2的药物组合物或药剂。
13、第12段所述的药物组合物或药剂，还包含药用载体、佐剂或稀释剂。
14、第12段或第13段所述的药物组合物或药剂，还包含BMP2蛋白。
15、第12段至第14段中任一段的药物组合物或药剂，用于预防或治疗创伤或疾病。
16、HS/BMP2在制造用于预防或治疗创伤或疾病的药剂中的应用。
17、第15段或第16段所述的药物组合物或应用，其中所述预防或治疗选自：结缔组织的修复、再生或置换以及伤口愈合。
18、一种预防或治疗需要治疗的患者中创伤或疾病的方法，所述方法包括向患者给予有效量的HS/BMP2。
19、第18段所述的方法，其中将所给予的HS/BMP2配制为药物组合物或药剂。
20、第19段所述的方法，其中所述药物组合物或药剂还包含BMP2蛋白。
21、一种促进或抑制骨生成的方法，包括将HS/BMP2施用于骨前体细胞或骨干细胞。
22、第21段所述的方法，其中所述骨前体细胞或骨干细胞与HS/BMP2体外接触。
23、第21段所述的方法，其中所述骨前体细胞或骨干细胞与HS/BMP2体内接触。
24、第21段至第23段中任一段所述的方法，其中骨前体细胞或骨干细胞与BMP2接触，同时与HS/BMP2接触。
25、一种促进或抑制软骨组织形成的方法，包括向软骨前体细胞或软骨干细胞施用HS/BMP2。
26、第25段所述的方法，其中软骨前体细胞或软骨干细胞与HS/BMP2在体外接触。
27、第25段所述的方法，其中软骨前体细胞或软骨干细胞与HS/BMP2在体内接触。
28、第25段至第27段中任一段所述的方法，其中软骨前体细胞或软骨干细胞与BMP2接触，同时与HS/BMP2接触。
29、一种用于修复、置换或再生需要治疗的人或动物患者中的结缔组织的方法，该方法包括：
(i)将与HS/BMP2接触的间充质干细胞体外培养足以使所述细胞形成结缔组织的一段时间；
(ii)收集该结缔组织；
(iii)将所述结缔组织在创伤或疾病部位处植入到患者的身体中以修复、置换或再生患者的结缔组织。
30、第29段所述的方法，还包括使培养物中的间充质细胞与外源BMP2接触。
31、在存在HS/BMP2的情况下，通过间充质干细胞的体外培养获得的结缔组织。
32、第31段中所述的结缔组织，其中在存在外源BMP2，并且可选地在存在BMP2的情况下培养该间充质细胞。
33、一种药物组合物，包含干细胞和HS/BMP2。
34、第32段所述的药物组合物，其中所述干细胞为间充质干细胞。
35、第33段或第34段所述的药物组合物，其中所述组合物还包含BMP2。
36、第33段至第35段中任一段的药物组合物，用于治疗创伤或疾病。
37、一种治疗需要治疗的患者中的创伤或疾病的方法，包括向所述患者给予包含干细胞和HS/BMP2的药物组合物。
38、第37段所述的方法，其中所述干细胞为间充质干细胞。
39、第37段或第38段所述的方法，其中所述方法还包括向患者给予BMP2。
40、HS/BMP2在结缔组织体外生长中的应用。
41、一种用于体外生长结缔组织的方法，包括培养与外源加入的HS/BMP2接触的间充质干细胞。
42、一种生物植入物，包含浸渍有HS/BMP2的固体或半固体基质材料。
43、第42段所述的生物植入物还浸渍有BMP2。
44、第42段或第43段所述的生物植入物还浸渍有间充质干细胞。
45、一种试剂盒，包含对具有肝素结合结构域的蛋白质具有高亲合力的预定量的糖胺聚糖和预定量的所述蛋白质。
46、第45段所述的试剂盒，其中所述糖胺聚糖为HS/BMP2，所述蛋白质为BMP2。
优选实施方式的说明
HS/BMP2
本发明涉及HS/BMP2，其可通过富集含有一种或多种GAG的化合物的混合物的方法获得，所述GAG与对应于BMP2的肝素结合结构域的多肽结合。该富集方法可用于分离HS/BMP2。
本发明还涉及富含HS/BMP2的化合物的混合物，以及使用这样的混合物的方法。
HS/BMP2被认为能够加强(例如，促进)BMP-2的活性，并且因此加强了它刺激干细胞增殖和骨形成的能力。
除了可通过本文所述方法获得之外，还可以在功能和结构上限定HS/BMP2。
在功能上，HS/BMP2能够结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQID NO：6或由氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6组成的肽。优选地，HS/BMP2结合SEQ ID NO：1或6的肽的KD小于100μM，更优选地，小于50μM、40μM、30μM、20μM或10μM之一。
优选地，HS/BMP2还结合BMP2蛋白，其KD小于100μM，更优选地，小于50μM、40μM、30μM、20μm或10μM之一。可以通过以下测定方法确定HS/BMP2和BMP2蛋白之间的结合。
将BMP2以3μg/ml的浓度溶解于封闭液(Blocking Solution)(0.2％明胶在SAB中的溶液)，并用封闭液建立0-3μg/ml的稀释系列。将200μl的每种BMP2的稀释液分配到用肝素预涂覆的肝素/GAG结合板的三个孔中；在37℃温育2小时，用SAB和200μl的加入封闭液中的250ng/ml的生物素化抗BMP2小心清洗三次。在37℃温育1小时，用SAB、200μl加入封闭液中的220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次，在37℃温育30分钟，用SAB和自来水小心清洗三次以除去残余液体，加入200μl显色试剂(SigmaFAST磷酸对硝基苯酯)。在室温下温育40分钟，在1小时内在405nm处读取吸光度。
在该测定中，可以通过测量吸光度来确定结合并且可相对于对照确定结合，所述对照例如是不加入硫酸类肝素的BMP2蛋白，或者加入了不与BMP2蛋白结合的硫酸类肝素的BMP2蛋白。
相对于非特异性结合并且在HS/BMP2可通过以下方法选自其它硫酸类肝素和/或GAG的情况下，HS/BMP2的结合优选地为特异性的，所述方法涉及对表现出与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的肽或与BMP2蛋白具有高亲合力结合相互作用的硫酸类肝素的选择。
根据本发明的HS/BMP2优选地使小鼠成肌细胞系C2C12细胞中BMP2诱导的碱性磷酸酶(ALP)活性增加到比单独添加相应量的BMP2蛋白或肝素所获得的增加更高的程度。优选地，它还使C2C12细胞中BMP2诱导的ALP活性增加到比组合加入相应量的BMP2蛋白和肝素，或者BMP2蛋白和与BMP2蛋白不能高亲合力结合的硫酸类肝素所诱导的活性增加更高的程度(例如，参见图46)。
可以通过实施以下ALP测定来测量ALP活性的增加。在37℃/5％CO2的条件下，将C2C12细胞以20,000个细胞/cm2铺于24孔板中的DMEM(例如，Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)中，所述DMEM含有10％FCS(例如，Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1％的青霉素和1％的链霉素)(例如，Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)。24小时后，将培养基换成含有100ng/mL BMP2(例如，R & D Systems，Minneapolis，MN)、3mg/mL Celsus HS和不同浓度的BMP2特异性(+ve HS)和非特异性(-veHS)Celsus HS制剂的不同组合的5％FCS低血清培养基。3天后，使用含有1％Triton X-100、150mM NaCl、10mM Tris pH 7.4、2mM EDTA、0.5％Igepal(NP40)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)和1％蛋白酶抑制剂混合物III(Calbiochem，德国)的RIPA缓冲液进行细胞溶解。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Chemical Co.，rockford，IL)确定细胞裂解物的蛋白质含量。然后，通过将细胞裂解物与磷酸对硝基苯酯底物(Invitrogen，Carlsbad，CA)一同温育来确定细胞裂解物中的ALP活性。将读数归一化为总蛋白量并表示为相对于只含有BMP2处理组的相对量。
还可以通过如图47所示出的以下ALP染色实验方案的免疫组织化学技术来跟踪C2C12细胞中ALP活性的提高。ALP染色。如上述测定方法中所述，培养C2C12细胞。处理3天后，在PBS中清洗细胞层，并根据制造商的说明书使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(例如，Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)进行染色。将细胞层固定在用柠檬酸盐缓冲的60％丙酮中，并且在含有萘酚AS-MX碱性磷酸酶和重氮盐的碱性染料混合物中染色。使用迈尔苏木紫染液(Mayer’s Hematoxylin solution)进行核染色。
这些技术可用于将HS/BMP2鉴别为与非特异性硫酸类肝素(例如，不结合BMP-2蛋白的硫酸类肝素)相比，能够将C2C12细胞中BMP2蛋白诱导的ALP活性更大程度增加的硫酸类肝素。
根据本发明的HS/BMP2还将BMP2信号作用延长到等于或超过肝素那些作用的水平。这可以通过下列测定进行评价。将C2C12细胞暴露于(i)无、(ii)仅BMP2、(iii)BMP2+肝素或(iv)BMP2+HS/BMP2 72小时，并且通过免疫印迹法监测BMP2特异性胞内信号分子Smad1/5/8的磷酸化水平。
HS/BMP2的重要功能特性是其增强骨修复过程的能力，尤其是在哺乳动物受试者中。这可以在骨修复模型中进行测试，如实施例8和实施例9中所述的模型，其中比较了对照动物(例如，未给予HS的动物或者给予了不结合BMP2蛋白或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6所示的肽的HS的动物)和HS/BMP2治疗动物中骨修复的速度和质量。通过分析伤口部位处的骨体积随时间的生成(例如，通过对伤口进行X射线和微CT成像分析)来评价骨修复的速度和质量。
在结构上，已发现HS/BMP2中N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)残基的N-硫酸化对于保持对BMP2蛋白的结合亲合力是重要的。N-脱硫酸化显示会导致BMP2蛋白结合亲合力显著降低(图49)。
还发现N-硫酸葡糖胺(GlcNS)残基的6-O-硫酸化(C6处的O-硫酸化)对于保持对BMP2蛋白的结合亲合力具有中等程度的重要性。6-O-脱硫酸化导致BMP2蛋白结合亲合力发生一定程度的降低(图49)。
发现IdoA和/或D-葡萄糖醛酸(GlcA)残基的2-O-硫酸化(C2处的O-硫酸化)不影响BMP2蛋白结合。这样，HS/BMP2可以可选地为2-O-硫酸化的或2-O-脱硫酸化的。
图43示出了HS/BMP2的二糖组成。根据本发明的HS/BMP2包括二糖组成在图43中标题为“BMP2特异性HS”一栏中对每种二糖所示数值的±10％(更优选±9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之一)以内的并且对BMP2蛋白或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6所示的肽表现出高亲合力结合的硫酸类肝素，如本说明书中所述的。
还通过进行表面等离子共振分析说明了HS/BMP2与不结合BMP2蛋白的硫酸类肝素相比的结构差异。例如，图44所示的角偏移曲线可用于区分HS/BMP2和其它硫酸类肝素。
通过进行强阴离子交换高压液相色谱法(SAX-HPLC)进一步说明了HS/BMP2与不结合BMP2蛋白的硫酸类肝素相比的结构差异。图40示出了HS/BMP2的SAX-HPLC谱图，其可以与不结合BMP2蛋白的硫酸类肝素的SAX-HPLC谱图(图41和图42)进行比较。
为了鉴别HS/BMP2，本发明人发明了涉及富集对具有肝素结合结构域的特定多肽表现出结合的糖胺聚糖分子的方法。从而能够鉴别分离的GAG混合物和/或分子并测试它们对表达含有肝素结合结构域的蛋白质的细胞和组织的生长和分化的调节能力。这使得能够受控地分析特定GAG糖序列对细胞和组织的生长和分化的体外和体内影响。本发明人对骨形态发生蛋白2(BMP2)应用了该方法以分离和表征对BMP2具有高结合性的GAG。
因此，为了鉴别HS/BMP2，本发明人提供了分离能够与具有肝素/类肝素结合结构域的蛋白质结合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供固体载体，其具有附着到该载体上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；
(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得能够形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与该混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的糖胺聚糖。
本发明人还提供了通过它们调节细胞或组织的生长或分化的能力所鉴别的分离的糖胺聚糖。为了实现该目标，他们提供了鉴别能够刺激或抑制细胞和/或组织的生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：
(i)提供固体载体，其具有附着到该载体上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；
(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得能够形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的糖胺聚糖；
(vi)将收集的糖胺聚糖添加到细胞或组织中，其中存在含有肝素结构结合结构域的氨基酸序列的蛋白质；
(vii)测量以下一项或多项：细胞增殖、细胞分化、一种或多种蛋白质标记物的表达。
本发明人使用这些方法来鉴别能够结合于BMP2的GAG(他们称之为HS/BMP2或HS3或HS-3)，其中在本发明人的方法中使用的多肽包含来自BMP2的氨基酸序列的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的肝素结合结构域。
在本发明人的方法中，包含GAG的混合物可以含有合成糖胺聚糖。然而，得自细胞或组织的GAG是优选的。
例如，所述混合物可以含有细胞外基质，其中所述细胞外基质材料是通过原位刮取活组织获得的(即，直接从获得所述材料的人或动物身体中的组织获得)或者通过刮取已从人或动物身体中提取的组织(活或死组织)获得。可替代地，该细胞外基质材料可以活自在培养物中生长的细胞。该细胞外基质材料可以获自结缔组织或结缔组织细胞，例如，骨、软骨、肌肉、脂肪、韧带或腱。对于HS/BMP2的分离，细胞外基质材料的一个适合来源为成骨细胞，如小鼠MC3T3细胞。
GAG组分可以从组织或细胞样品中提取或通过本领域技术人员所熟知的一系列常规分离步骤(例如，阴离子交换色谱法)提取。
GAG混合物可以含有不同类型糖胺聚糖的混合物，所述糖胺聚糖可以包括硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸类肝素。优选地，与固体载体接触的GAG混合物富含硫酸类肝素。可通过对GAG混合物对适当流分具有选择的实施柱色谱法以获得富含硫酸类肝素的GAG部分，例如，弱、中或强阴离子交换色谱法以及强高压液相色谱法(SAX-HPLC)。
可对收集的GAG进行进一步分析以鉴别GAG，例如，确定GAG组成或序列，或确定GAG的结构特征。GAG的结构通常是高度复杂的，并且考虑到现有可用的分析技术，在大多数情况下对GAG序列结构进行准确确定是不可能的。
然而，可对收集的GAG分子进行部分或完全糖消化(例如，通过亚硝酸进行化学消化或通过如肝素酶III的裂合酶进行酶消化)以获得GAG的具有特征性和诊断性的糖片段。具体地，消化得到二糖(或四糖)可用于测量所获得的每种二糖的百分比，其将提供GAG的特征二糖“指纹图谱”。
还可以确定GAG的硫酸化类型并且利用该硫酸化类型来确定GAG结构。例如，对于硫酸类肝素，在氨基糖以及在C2、C3和C6位置处的硫酸化类型可以用于表征硫酸类肝素。
二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可以与诸如HPLC、质谱和NMR的其它分析技术结合使用，所述其它分析技术可以各自提供GAG的独特光谱。组合时，这些技术可提供GAG的明确结构表征。
GAG与肝素结合结构域之间的高亲合力结合相互作用表明GAG将含有有助于高亲合力结合相互作用的特定糖序列。其它步骤可以包括参与该结合相互作用的GAG完整或部分糖序列或GAG关键部分的确定。
可以用裂解糖胺聚糖链的试剂(例如，裂合酶)处理GAG-多肽复合物。裂合酶处理可以切割结合的GAG上不参与多肽结合相互作用的部分。参与多肽结合相互作用的GAG部分可以被保护不受裂合酶的作用。除去裂合酶后，例如，在清洗步骤后，仍保持与多肽结合的GAG分子代表了多肽的特异结合配偶体(“GAG配体”)。由于较短GAG分子的复杂性较低，因此GAG配体解离和收集后，可以期望获得GAG配体的高度结构表征。例如，糖序列(即，包含在GAG配体中的单糖一级(线性)序列)、硫酸化类型、二糖和/或四糖消化分析、NMR光谱、质谱光谱和HPLC谱的任何组合可以提供GAG配体的高水平结构表征。
如本文所使用的，术语“富集”、“富集的”等说明了这样一种方法(或状态)，即混合物的相对组成以由一种或多种实体组成的该混合物流分增加，而由一种或多种不同实体组成的该混合物部分降低的方式改变(或已经发生改变)。
通过富集分离的GAG可以是纯的，即基本只含有一种类型的GAG，或者可以继续为不同类型GAG的混合物，但是相比于起始混合物，该混合物具有较高比例的与肝素结合结构域结合的特定GAG。
在与表达或包含含有肝素结合结构域的蛋白质的细胞或组织接触时，所鉴别的GAG优选地表现出功能性作用。该功能性作用可以是调节或增强作用。
该功能性作用可以是促进(刺激)或抑制某种类型细胞的增殖或者一种细胞类型向另一种细胞类型的分化，或者一种或多种蛋白标记物的表达。例如，GAG可促进细胞增殖(即，细胞数目增加)，或者促进干细胞向特化细胞类型的分化(例如，结缔组织中的间充质干细胞)，促进或抑制指示细胞多能性或分化状态的蛋白标记物的表达(例如，标记物，如碱性磷酸酶活性、RUNX2、奥斯特利斯(osterix)、胶原I、II、IV、VII、X、骨桥蛋白、骨钙素、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)、脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液酸糖蛋白2(BSPII)、胶原2a1(Coll2a)和SOX9的检测)。
如本文所使用的，术语“调节作用”应理解为表示第一实体对第二实体的作用，其中通过第一实体的存在改变了第二实体在另一过程中的正常功能。该调节作用可以是激动(或促进，agonistic)或拮抗的。
该调节作用可以是增强作用。术语“增强作用”应理解为表示提高效力的作用。在本发明优选的实施方式中，术语“增强作用”是指第一实体对第二实体的作用，该作用使第二实体在另一过程中的效力增加。在本发明的其它优选实施方式中，增强作用应理解为表示分离的GAG对肝素结合因子的作用，其中所述作用使所述肝素结合因子的效力增加。
该增强作用可以是肝素结合因子生物利用率的提高。在本发明的优选实施方式中，增强作用是BMP2生物利用率的提高。测量肝素结合因子生物利用率提高的一种方法是通过确定肝素结合因子局部浓度的增加。
增强作用可以是保护肝素结合因子不被降解。在本发明的一种特别优选的实施方式中，增强作用是保护BMP-2不被降解。确定肝素结合因子降解降低的一种方法是通过测量肝素结合因子半衰期的增加。
增强作用可以是将肝素结合因子与细胞受体隔离或者可以是稳定配基-受体相互作用。
可以通过使用适当测定来确定增强作用(例如，生长或分化的调节)。例如，可以通过ELISA确定HS对BMP-2稳定性的作用。可以通过测量SMAD 1、5或8中的一种或多种的激活/表达，或者测量一种或多种成骨标记物基因(如Runx2、碱性磷酸酶、奥斯特利斯(Osterix)、骨钙素和BSP1)的表达，或者使用如茜素红和冯库萨(von Kossa)染色的染色方法测量矿化作用的水平来确定HS对BMP-2活力的作用。
如本文所使用的，“接触”的过程包括使两种或更多种不连续实体在物理上靠近。“接触”的过程包括使两种或更多种不连续实体在物理上靠近一段时间并且在一定的条件下，从而足以使两种或更多种不连续实体的一部分在分子水平上发生相互作用。优选地，如本文所使用的，“接触”的过程包括使具有一个或多个GAG的化合物的混合物与对应于肝素结合因子的肝素结合结构域的多肽靠近。“接触”过程的实例包括混合、溶解、溶胀、清洗。在优选的实施方式中，GAG混合物与多肽的“接触”足以在彼此表现出高亲合力的GAG和多肽之间形成复合物，其可以是共价的，但优选非共价的。
多肽可以包含具有肝素结合结构域的所选蛋白质的全长或接近全长的一级氨基酸序列。由于较长的多肽中会发生折叠从而会导致肝素结合结构域可能被掩盖从而不能与GAG混合物接触，因此优选该多肽较短。优选地，多肽将具有包含肝素结合结构域的氨基酸序列并且可选地在肽的N和C末端之一或每一个包含一个或多个氨基酸。这些另外的氨基酸可以使得将多肽连接至固体载体所需的接头或连接分子能够被加入到多肽中。
在本发明人发明的方法的优选实施方式中，除了肝素结合结构域中的氨基酸数之外，所述多肽还含有1-20个，更优选地1-10个，更优选地1-5个其它氨基酸。在一些实施方式中，肝素结合结构域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80％，更优选地占至少90％，更优选地占至少95％。
为了将多肽附着到固体载体的表面上，优选地对多肽进行修饰以包含分子标记，并且修饰固体载体的表面以掺入对该分子标记具有高亲合力的相应分子探针，即，分子标记和探针形成结合对。标记和/或探针可以选自以下任一种：抗体、细胞受体、配体、生物素、这些结构的任何片段或衍生物、上述项的任意组合，或者通过其可以设计或配置探针以进行特异性结合或联合的任何其它结构。适合用作标记和探针的优选结合对为生物素和抗生物素蛋白。
多肽来源于所关心的蛋白质，其在本发明中为BMP2。“来源于”表示由于含有所关心蛋白质中存在的肝素结合结构域的氨基酸序列，因此选择、选定或制备了该多肽。可以修饰所关心蛋白质中出现的肝素结合结构域的氨基酸序列(例如)以研究肝素结合结构域序列的变化对GAG结合的影响。
在本说明书中，所述蛋白质为BMP2。来自BMP2的优选肝素结合结构域的氨基酸序列为QAKHKQRKRLKSSCKRHP(SEQ ID NO：1)，其位于SEQ ID NO：2(图35)的氨基酸283-300处，或者为QAKHKQRKRLKSSCKRH(SEQ ID NO：6)，其位于SEQ ID NO：2的氨基酸283-299处。
本领域技术人员应理解，特定多肽的氨基酸序列的微小改变会保持该部分的固有功能。还应理解用同配的(isosteric)和/或等电子的其它氨基酸残基取代肽内的某些氨基酸残基可保持或改善未取代肽的某些性能。这些改变也涵盖在本发明的范围内。例如，有时可以用氨基酸丙氨酸取代氨基酸甘氨酸(反之亦然)并且同时保持该肽的一种或多种性能。术语“同配的”是指两种实体之间的空间类似性。在中等高温下同配部分的两个实例为异丙基和叔丁基基团。术语“等电子的”是指两种实体之间的电子类似性，实例为两种实体具有相同或相似pKa功能性的情况。
对应于肝素结合结构域的多肽可以是合成的或重组的。
固体载体可以是具有可通过共价或非共价键直接或间接连接于分子的表面的任何基底。所述固体载体可以包括能够为连接到该表面上的探针提供物理支持的任何基底材料。它可以是基质载体。该材料通常能够承受与将探针连接至所述表面有关的条件以及执行测定期间所遇到的任何后续处理、操作和加工。所述材料可以是天然存在的材料、合成材料或经修饰的天然材料。所述固体载体可以是塑料材料(包括聚合物，例如，聚氯乙烯)；环-烯烃共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸亚乙酯)、聚四氟乙烯(PTFE或
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)、尼龙，聚(丁酸乙烯酯))等，它们单独使用或结合其它材料使用。可以考虑诸如玻璃的其它刚性材料，其包括二氧化硅并且还包括，例如，可作为生物玻璃获得的玻璃。可以使用的其它材料包括多孔材料，例如，可控多孔玻璃珠。还考虑了能够(例如)在其表面上掺入一种或多种官能团(如氨基、羧基、巯基或羟基官能团中的任一种或多种)的本领域已知的任何其它材料。
优选的固体载体包括将多肽固定在柱表面上的柱。所述表面可以是该柱的壁和/或可以由装填到柱中央空间内的珠提供。
可以将多肽固定在固体载体上。固定方法的实例包括：吸附、共价结合、包埋和膜包覆。在本发明的一种优选实施方式中，多肽和基质之间的相互作用基本上是永久性的。在本发明的另一种优选实施方式中，肽和基质之间的相互作用对离子交换色谱具有适当的惰性。在优选的安排中，将多肽连接到固体载体的表面。应理解本领域技术人员将具有许多种可选项以供选择从而将两个实体彼此化学和/或物理连接。这些选项均涵盖在本发明的范围内。在优选的安排中，通过生物素与抗生蛋白链菌素之间的相互作用将多肽吸附到固体载体上。在这种安排的代表性实例中，将生物素分子共价键合到多肽上，生物素-多肽缀合物与抗生蛋白链菌素结合，而抗生蛋白链菌素又已经共价键合到固体载体上。在另一种安排中，间隔区或接头部分可以用于将生物素分子与多肽连接，和/或将抗生蛋白链菌素与基质连接。
通过将GAG混合物与固体载体接触使得形成了GAG-多肽复合物。通过(例如)清洗固体载体以洗脱未结合材料将剩余的混合物从固体载体中除去从而使这些混合物与剩余的混合物分离。在使用柱作为固体载体的情况下，可以从柱上洗脱GAG混合物的未结合组分，从而留下与柱结合的GAG-多肽复合物。
应理解某些寡糖可通过非特异方式与多肽相互作用。在某些实施方式中，通过非特异方式与多肽相互作用的寡糖可以包括在富含调节肝素结合因子作用的一种或多种GAG的化合物的混合物中或排除在所述混合物之外。非特异相互作用的实例为在合适尺寸和/或形状分子的袋(pocket)中的暂时包覆。另外，应理解这些寡糖可能要比对肽根本未表现出相互作用的那些寡糖洗脱得更慢。另外，应理解非特异结合的化合物可能不需要输入相同的外界刺激以使得它们如通过特异方式结合(例如，通过离子相互作用)的那些化合物一样被洗脱。本发明人的方法能够将寡糖混合物分成该混合物的以下那些组分：以特异方式与多肽结合的那些；以非特异方式与多肽结合的那些；和不与多肽结合的那些。对每一种GAG-肽对运用性地(operationally)定义了这些名称。
通过改变发生GAG和多肽结合的固体载体表面上所存在的条件(例如，盐浓度)，可以选择对肝素结合结构域具有最大亲合力和/或特异性的那些GAG。
因此，可以获得对所关心蛋白和/或所关心蛋白的肝素结合结构域具有高结合亲合力的GAG。结合亲合力(Kd)可以选自下列之一：小于10μM、小于1μM、小于100nM、小于10nM、小于1nM、小于100pM。
通过所述方法获得的GAG可用于一系列体外和/或体内应用中。可以提供GAG用于刺激或抑制体外细胞或组织培养物中或者体内细胞或组织中的细胞或组织的生长和/或增殖和/或分化。
出于该目的，可以提供作为制剂的GAG。例如，可以提供培养基，其包含通过所述方法获得的GAG，即，包含HS/BMP2。
可以收集在存在HS/BMP2的情况下从体外细胞或组织培养物中获得的细胞或组织并将其植入到需要治疗的人或动物患者中。因此，提供了细胞和/或组织植入的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)体外培养与HS/BMP2接触的细胞和/或组织；
(b)收集所述细胞和/或组织；
(c)将所述细胞和/或组织植入到需要治疗的人或动物受试者中。
可对部分(a)中与HS/BMP2接触的细胞进行培养足以使所述细胞或组织生长、增殖或分化的一段时间。例如，所述的一段时间可以选自：至少5天、至少10天、至少20天、至少30天或至少40天。
在另一实施方式中，可以配制HS/BMP2以在医疗方法中使用，包括创伤或疾病的预防或治疗。可以提供包含HS/BMP2和药用稀释剂、载体或佐剂的药物组合物或药剂。可以提供该类药物组合物或药剂以用于创伤或疾病的预防或治疗。还提供了HS/BMP2在制造用于预防或治疗创伤或疾病的药剂中的使用。可选地，根据本发明的药物组合物和药剂还可以包含具有与GAG结合的肝素结合结构域的所关心的蛋白(即BMP2)。在其它实施方式中，所述药物组合物和药剂还可以包含干细胞，例如，间充质干细胞。
创伤或疾病的治疗可以包括细胞或组织的修复、再生或置换，所述组织如结缔组织(例如，骨、软骨、肌肉、脂肪、腱或韧带)。对于组织修复，可以将包含HS/BMP2的药物组合物或药剂直接施用于创伤或疾病部位以刺激新组织的生长、增殖和/或分化从而起到修复创伤的作用或者治愈或减轻疾病状况(例如，减轻症状)的作用。可以通过将干细胞混合在药物组合物或药剂中来改善组织的修复或再生。
对于组织置换，可以在细胞和/或组织的体外培养期间使HS/BMP2与细胞和/或组织接触以产生用于在患者创伤或疾病部位植入的细胞和/或组织。细胞或组织的植入可以通过受伤或患病组织的置换来用于对患者的受伤或患病组织产生修复作用。这可以包括受伤/患病组织的切除和通过与HS/BMP2接触的细胞和/或组织的培养所制备的新组织的植入。
因此，根据本发明的药物组合物和药剂可以包含以下之一：
(a)HS/BMP2；
(b)HS/BMP2与干细胞结合；
(c)HS/BMP2与含有HS/BMP2结合的肝素结合结构域(即，SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：6)的蛋白结合；
(d)HS/BMP2与干细胞和含有HS/BMP2结合的肝素结合结构域(即，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6)的蛋白结合；
(e)从与HS/BMP2接触的细胞或组织的培养物中获得的组织或细胞。
HS/BMP2可用于身体组织的修复或再生，特别是骨再生、神经再生、骨胳组织构建、心血管创伤修复以及胚胎和成体干细胞的扩增和自更新。因此，HS/BMP2可用于预防或治疗多种疾病和创伤，其包括骨关节炎、软骨置换、任何种类的断骨(例如，椎间盘融合治疗、长骨断裂、颅骨缺损)、临界或不连接骨缺损再生。
HS/BMP2在组织修复、再生或置换中的应用可以包括在伤口愈合中的应用，例如，加速伤口愈合、疤痕或骨组织愈合以及组织移植。
在另一个方面，本发明提供了包含HS/BMP2的生物支架。在一些实施方式中，可以在整形外科、血管、假体、皮肤和角膜应用中使用本发明的生物支架。本发明所提供的生物支架包括延长释放药物递送装置、组织瓣膜、组织瓣膜小叶、药物洗脱支架、血管移植物、伤口愈合或皮肤移植物以及整形外科假体，如骨、韧带、腱、软骨和肌肉。在本发明的一种优选实施方式中，生物支架是导管，其中内(和/或外)表面包含连接到该导管上的一种或多种GAG化合物(包括HS/BMP2)。
在另一个方面，本发明提供了通过所述方法分离的一种或多种GAG(包括HS/BMP2)，其用作佐剂。所述佐剂可以是免疫佐剂。
在另一个方面，本发明提供了药用制剂，其包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物相对于HS/BMP2含量丰富。在另一个方面，本发明提供了药用制剂，其包含：
(i)包含一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物中富含HS/BMP2；和
(ii)BMP-2，
其用于单独、同时或顺序给予。在一种优选的实施方式中，所述制剂包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富含紧密混合物(均匀混合物，intimate admixture)中的HS/BMP2和BMP-2，并且向需要治疗的患者同时给予所述制剂。
在本发明的另一个方面，提供了在组织修复或再生中使用的试剂盒，所述试剂盒包含(i)预定量的HS/BMP2，和(ii)预定量的BMP2。
可将本发明富集的混合物的化合物作为其药用盐给予受试者。例如，本发明富集的混合物的化合物的碱性盐包括，但不限于，与可药用阳离子所形成的那些盐，所述可药用阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵离子。阳离子盐包括在本发明的范围内，例如，钠盐或钾盐。
应理解，可以将具有羧基的本发明富集的混合物的化合物以可给予的前体药物的形式递送，其中酸部分被酯化(以具有-CO2R’的形式)。术语“前体药物”具体地涉及-OR’基团体内转化为-OH基团，或其来源的羧酸根阴离子。因此，本发明的前体药物可以起到提高药物吸收和/或药物向细胞递送的作用。可以通过细胞酶(如脂肪酶或酯酶)或通过化学切割(如体内酯水解)促进前体药物的体内转化。
可将根据本发明各方面的药剂和药物组合物配制成用于通过多种途径施用，包括，但不限于，疾病或创伤部位处的注射。可以将药剂和组合物配制成液体或固体形式。可以配制液体制剂以用于通过注射对人或动物身体的所选区域施用。
优选地，以“治疗有效量”给予，这足以显示出对个体的益处。所给予的实际量以及给药速率和时间过程将取决于所治疗的创伤或疾病的性质和严重程度。治疗的确定，例如，剂量的决定等，是全科医生及其他医生的职责，并且通常会考虑待治疗的病症、个体患者的病况、递送位点、给药方法以及医师已知的其它因素。可以在“雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)”，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams &Wilkins中查找到上述技术和方案的实例。
在本说明书中，待治疗的患者可以是任何动物或人。所述患者可以是非人哺乳动物，但是更优选地为人类患者。所述患者可以是男性或女性。
如所说明的，可以体外或体内实施根据本发明的方法。术语“体外”旨在涵盖使用培养物中细胞的程序，而术语“体内”旨在涵盖使用完整多细胞有机体的程序。
干细胞
与HS/BMP2接触的细胞包括干细胞。
本文中所培养并描述的干细胞可以是任何种类的干细胞。它们可以是全能性或多能性的。它们可以是来自任何组织的胚胎干细胞或成体干细胞，并且可以是造血干细胞、神经干细胞或者间充质干细胞。优选地，它们是成体干细胞。更优选地，它们是成体间充质干细胞，例如，能够分化成结缔组织和/或骨细胞，如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。干细胞可以获自任何动物或人，例如，非人动物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括来自啮齿目中任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类或其它非人脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人。可选地，它们是非人的。
在本说明书中，干细胞是指能够分裂(即自更新)并且保持全能性或多能性并且如果需要能够产生特化细胞的任何细胞类型。
在本发明中所培养的干细胞可以获自或来源于现有的培养物或者直接获自或来源于任何成体、胚胎或胎儿组织，包括血液、骨髓、皮肤、上皮或者脐带(通常被丢弃的组织)。
可以通过利用适合的测定来确定干细胞的多能性。这些测定可以包括检测多能性的一种或多种标记物，例如，碱性磷酸酶活性、检测RUNX2、osterix、胶原I、II、IV、VII、X、骨桥蛋白、骨钙素、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)、脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨唾蛋白2、(BSPII)、胶原2a1(Coll2a)和SOX9。
将间充质干细胞或人骨髓基质干细胞定义为具有产生软骨、骨、肌肉、腱、韧带和脂肪能力的多能性祖细胞。这些原始祖代细胞在出生后存在并显示出干细胞的特征，即低发生率和广泛的更新潜力。这些性质结合它们的发育可塑性使得对间充质干细胞置换受损组织的潜在使用产生了很大的兴趣。本质上，可以培养间充质干细胞以使它们的数量增加，然后移植到创伤部位或者在接种到支架中/上后产生适当的组织构建。
因此，骨骼、肌肉、腱和韧带修复的替代方法是在骨结合传导或诱导支架以支持和引导性再生以及正确选择特异性组织生长因子的情况下，选择、扩增和调节适当的祖细胞(如，骨祖细胞)。
可以使用选择性标记物分离和检测人骨髓间充质干细胞，所述标记物例如来自CD34+流分的STRO-I，其指示它们的骨髓再增殖潜力。这些细胞表面标记物仅存在于间充质干细胞的细胞表面并且是细胞多能性的指征。
通过微创技术能够容易地从骨髓获得间充质细胞并且可以将其在培养物中扩增并使其分化成所需的细胞系。可以通过应用特异性生长因子来诱导分化。如骨形态发生蛋白(BMP)的转化生长因子β(TGF-β)超家族成员蛋白是间充质干细胞软骨形成和成骨分化的重要因子。
适合的MSC可以获自或来源于从骨髓抽出物中采集的骨髓单核细胞(BMMNC)(例如，Wexler等人，成人骨髓是人类间充质“干”细胞的丰富来源，而脐带和被动员起来的成人血液则不是。(Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal“stem”cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not.)HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2)：368-374，2003年4月)或者获自或来源于脐带的脐带胶样组织(华顿氏胶，Wharton′s Jelly)(例如，Ta等人，Long-term Expansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton′sJelly-Derived Mesenchymal Stem Cells.Stem Cells Dev.2009年7月20日(Epub))。
如本领域所熟知的，可以通过应用适合的分化因子从多能性干细胞的分化中获得间充质干细胞，所述多能性干细胞如人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
在本发明的另一个方面，提供了包含通过本发明的任何方法所产生的干细胞或者它的片段或产物的药物组合物。所述药物组合物在医疗方法中有用。适合的药物组合物还可以包含药用载体、佐剂或稀释剂。
在本发明的另一个方面，通过本发明的任何方法所产生的干细胞可以在医疗方法中使用，优选地，提供医疗方法，包括向需要治疗的个体给予治疗有效量的所述药剂或药物组合物。
通过根据本发明的培养方法和技术获得的干细胞可以用于分化为在医疗方法中使用的另一种细胞类型。因此，分化的细胞类型可以来源于并且可以视为通过所述培养方法和技术获得的并且随后能够发生分化的干细胞的产物。可以提供药物组合物，其包含该类分化细胞(可选地)和药用载体、佐剂或稀释剂。该药物组合物可以在医疗方法中使用。
糖胺聚糖
如本文所使用的，术语“糖胺聚糖”和“GAG”可以替换使用并且应理解为是指多种包含寡糖的分子，其中那些结合的糖中的一种或多种具有氨基取代基或其衍生物。GAG的实例为硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸皮肤素、透明质酸酯和硫酸类肝素。硫酸类肝素是本发明的优选实施方式。
如本文所使用的，术语“GAG”还延伸至涵盖作为GAG缀合物的那些分子。GAG缀合物的实例为蛋白糖胺聚糖(PGAG，蛋白聚糖)，其中肽组分共价键合到寡糖组分上。
在本发明中，应理解存在多个GAG化合物来源，包括天然的、合成的或半合成的来源。GAG的优选来源为生物组织。GAG的优选来源为干细胞。GAG的特别优选来源为干细胞，其能够分化为对应于将要接受治疗的受试者的组织的细胞。例如，GAG可以来源于前成骨细胞以用于骨再生或骨骼组织构建。在本发明特别优选的实施方式中，GAG可以来源于永生化细胞系。在本发明的其它优选实施方式中，GAG可以来源于在生物反应器中生长的永生化细胞系。GAG的另一个优选来源为合成来源。在这一方面，可以通过本领域技术人员已知的或能够获知的技术从将可商购起始材料转化为更复杂的化学形式的合成加工中获得GAG。这种可商购起始材料的实例为葡糖胺。GAG的另一个优选来源为半合成来源。在这一方面，使用本领域技术人员已知的或能够获知的技术通过合成加工了具有所需材料天然起始材料的大部分复杂性的合成加工。该天然起始材料的实例为几丁质和葡聚糖，并且将起始材料加工成适合在本发明中使用的GAG混合物的合成步骤类型的实例为酰胺键水解、氧化和硫酸化。具有所需结构的GAG的半合成途径的另一个实例包括相关GAG的合成互变以获得适合在本发明中使用的GAG。
硫酸类肝素(HS)
在本发明的优选方面，糖胺聚糖或蛋白聚糖优选为硫酸类肝素。
类肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多样化亚组，并且它们是由共价连接到蛋白质主链的硫酸类肝素糖胺聚糖侧链组成的。核心蛋白以三种主要形式存在：称为基底膜蛋白聚糖的分泌形式、称为磷脂酰基醇蛋白聚糖的锚定在质膜上的形式以及称为多配体蛋白聚糖的跨膜形式。它们是哺乳动物细胞表面和大多数细胞外基质的普遍组成。还存在其它蛋白质，如集聚蛋白或淀粉样前蛋白，其中HS链可以连接到不太常见的核心。
“硫酸类肝素”(“硫酸类肝素”或“HS”)最初是在高尔基体中作为由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)的串联重复所组成的多糖进行合成。随后，可以对刚合成的多糖进行一系列的修饰步骤：GlcNAc的N-脱乙酰化/N-硫酸化，GlcA向艾杜糖醛酸(IdoA)的C5差向异构化，IdoA和GlcA在C2处的O-硫酸化，N-硫酸葡糖胺(GlcNS)在C6处的O-硫酸化和GlcNS偶尔在C3处的O-硫酸化。HS的N-脱乙酰化/N-硫酸化、2-O-、6-O-和3-O-硫酸化分别是通过HS N-脱乙酰基酶/N-磺基转移酶(HSNDST)、HS 2-O-磺基转移酶(HS2ST)、HS 6-O-磺基转移酶(HS6ST)和HS 3-O-磺基转移酶所介导的。在每个修饰步骤中，仅有一部分可能的底物被修饰，从而导致产生了相当大的序列多样性。HS的这种结构复杂性使得难以确定它的序列并了解HS结构与功能之间的关系。
硫酸类肝素侧链是由通过(1→4)糖苷键连接的交替排列的D-葡萄糖醛酸或者L-艾杜糖醛酸和D-葡糖胺所组成的。葡糖胺通常是N-乙酰化的或N-硫酸化的，并且糖醛酸和葡糖胺均可另外被O-硫酸化。特定HSPG对特定结合配偶体的特异性是由连接到葡糖胺和糖醛酸上的羧基、乙酰基和硫酸酯基团的特定类型所产生的。与肝素相比，硫酸类肝素含有较少的N-和O-硫酸酯基团，而含有较多的N-乙酰基团。硫酸类肝素侧链通过四糖键(-葡萄糖醛酸基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→4)-木糖基-β-1-O-(丝氨酸))区域连接到核心蛋白的丝氨酸残基。
硫酸类肝素链和核心蛋白均可经受最终可影响它们生物活性的一系列修饰。已经认识到HS的复杂性超过了核酸的复杂性(Lindahl等人，1998，J.Biol.Chem.273，24979；Sugahara和Kitagawa，2000，Curr.Opin.Struct.Biol.10，518)。HS类物质的变型是由被含有N-乙酰化葡糖胺的二糖的未硫酸化区域分开的糖残基的非随机的、高度硫酸化序列的合成所产生的。N-乙酰葡糖胺向N-硫酸葡糖胺的最初转化产生了对其它修饰的关注，包括葡萄糖醛酸向艾杜糖醛酸的差向异构化和葡糖胺或艾杜糖醛酸上O-硫酸化的复杂类型。另外，在未修饰、低硫酸化的N-乙酰化序列中，己糖醛酸酯残基仍保持为葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化区域中，以C-5差向异构体艾杜糖醛酸酯为主。这限制了任意给定链中可能的潜在二糖变体的数目，但是未限制每种变体的丰度。大部分修饰发生在N-硫酸化区域，或直接与它们相邻，从而在成熟链中存在被低硫酸化结构域分开的高硫酸化区域(Brickman等人，(1998)，J.Biol.Chem.273(8)，4350-4359，该文献以其整体作为参考并入本文)。
假设高度可变的硫酸类肝素链通过自分泌、邻分泌和旁分泌反馈环的复杂组合在多种胞外配基的调节作用中起关键作用，包括对细胞生长和粘附因子的调控和表现，从而控制胞内信号并由此控制干细胞的分化。例如，尽管可能在遗传学上说明了硫酸类肝素糖胺聚糖(Alberts等人，(1989)Garland Publishing，Inc，New York&London，第804和805页)，但是从单一来源分离的硫酸类肝素糖胺聚糖类在生物活性上可能是不同的。如在Brickman等人，1998，Glycobiology 8，463中所示的，根据促有丝分裂的状态，获自神经上皮细胞的硫酸类肝素糖胺聚糖的两种单独混合物(pool)可特异性地激活FGF-1或FGF-2。类似地，在WO 96/23003中说明了硫酸类肝素(HS)与FGF-1或FGF-2之间相互作用的能力。根据本专利申请，在胚胎的约11至约13天从鼠细胞中获得了能够与FGF-1相互作用的各个HS，而在胚胎的约8至约10天获得了能够与FGF-2相互作用的HS。
如上所述，HS的结构是高度复杂的并且在HS之间是可变的。的确，HS结构的变化被认为是对有助于每种HS在促进细胞生长和指导细胞分化中具有不同活力起到了重要作用。这种结构复杂性被认为是超过了核酸的结构复杂性，并且尽管可以将HS结构表征为具有特异和独特硫酸化类型的重复二糖单元的序列，但是目前尚没有与可用于核酸测序的那些技术相当的标准测序技术以用于确定HS序列结构。在不存在确定明确HS序列结构的简单方法的情况下，本领域技术人员通过使用多种分析技术明确地鉴别了并在结构上表征了HS分子。这些包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量确定中的一种或组合。这些分析技术是本领域技术人员所熟知和使用的。
从HS产生二糖和四糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂合酶消化。仅仅是出于举例说明的目的，以下提供了执行这些消化技术中一种方法的描述，这样的描述未限制本发明的范围。
亚硝酸消化
硫酸类肝素基于亚硝酸的解聚在完成时导致碳水化合物链最终降解为其各个二糖组分。
例如，可以通过分别在冰上将250μl 0.5M的H2SO4和0.5M的Ba(NO2)2冷却15分钟来制备亚硝酸。冷却后，将Ba(NO2)2与H2SO4混合并在离心除去硫酸钡沉淀前涡流混合。将125μl HNO2加入到悬浮于20μlH2O中的GAG样品中并且涡流混合，然后在不时混合的情况下在25℃温育15分钟。温育后，将1M Na2CO3加入到样品中使其pH为6。接着，将100μl 0.25M的NaBH4在0.1M NaOH中的溶液加入到样品中并将混合物加热至50℃，保持20分钟。然后，将混合物冷却至25℃并加入酸化的冰醋酸使样品的pH为3。然后，用10M NaOH中和混合物并通过冷冻干燥缩小体积。将最终样品上Bio-Gel P-2柱以分离二糖和四糖从而验证降解程度。
裂合酶消化
肝素酶III在葡萄糖醛酸键处切割糖链。一系列肝素酶(I、II和III)分别通过在特定硫酸化识别位点使某些硫酸类肝素序列解聚而显示出相对特异的活性。肝素酶I沿HS链切割具有NS区域的HS链。这导致硫酸化结构域的断裂(disruption)。肝素酶III使具有NA域的HS解聚，从而导致碳水化合物链分解成各个硫酸化结构域。肝素酶II主要切割HS链的NA/NS“肩(shoulder)”结构域，其中存在不同的硫酸化类型。注：类肝素聚合物的重复二糖主链为连接到氨基糖葡糖胺上的糖醛酸。“NS”表示氨基糖，其在氨基上带有硫酸酯，从而能够使C2、C6和C3处的其它基团硫酸化。“NA”表示未被硫酸化且其仍保持乙酰化的氨基。
例如，对于使用肝素酶III在NA区域中的解聚，在含有20mMTris-HCl、0.1mg/ml BSA和4mM CaCl2的缓冲液(pH 7.5)中制备了酶和冻干的HS样品。仅仅是通过举例说明的方式，可以以5mU/1μgHS加入肝素酶III并在37℃温育16h，然后通过加热至70℃，保持5分钟使反应停止。
二糖和四糖可以通过柱色谱洗脱。
肝素结合结构域
Cardin 和Weintraub(Molecular Modeling of Protein-Glycosaminoglycan Interactions，Arteriosclerosis，第9卷，第1期，1989年1月/2月，第21-32页)说明了多肽肝素结合结构域的共有序列，该文献以其整体作为参考并入本文。该共有序列具有终止于一个或多个碱性残基的两个或三个亲水残基分开的一段二-或三碱性残基序列。鉴别出两种特定的共有序列：XBBXBX[SEQ ID NO：3]和XBBBXXBX[SEQ ID NO：4]，其中B为碱性残基(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，而X为亲水残基(例如，丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸)。据报道，肝素结合结构域富含氨基酸Asn、Ser、Ala、Gly、Ile、Leu和Tyr而氨基酸Cys、Glu、Asp、Met、Phe和Trp的出现率较低。
这些共有序列可以用于搜索蛋白质或多肽氨基酸序列以鉴别候选肝素结合结构域氨基酸序列，其可以合成并根据本发明测试GAG结合。
WO 2005/014619A2还公开了多种肝素结合肽。WO 2005/014619A2的内容以其整体作为参考并入本文。
骨折
在一些方面，本发明涉及HS/BMP2的治疗性使用(人和兽医)以治疗骨折。本文报道了HS/BMP2以增强骨伤口愈合。HS/BMP2刺激创伤后的骨再生并且有助于改善骨的伤口愈合。HS/BMP2加快了骨折修复的速度，从而能够缩短创伤后的恢复时间。
骨折是一种医学病况。在本发明申请中，“骨折”包括骨的损伤或创伤，其中骨发生开裂、断裂或碎裂。断裂是指骨的不连续。骨折可以是由物理冲击或机械应力或者由如骨质疏松症或骨关节炎的医学病况造成的。
骨折的整形外科分类包括闭合性或开放性以及单碎片或多碎片骨折(multi-fragmentary fracture)。在闭合性骨折中，皮肤保持完整，而在开放性骨折中，骨可以暴露穿过伤口部位，这使得感染的风险更高。单纯性骨折是沿一条线发生的，趋于将骨分为两段。多碎片折断将骨分成多片。
其它骨折类型包括压缩骨折、嵌插骨折、螺旋骨折、完全和不完全骨折、横骨折、线性骨折和斜骨折以及粉碎性骨折。
在大部分受试者中，骨愈合(骨折连接)是自然发生的并且在创伤后开始。出血通常导致凝块并吸引白血球和成纤维细胞，从而产生胶原纤维。接着，骨基质(钙羟磷灰石)沉积(矿化作用)从而将胶原基质转化为骨。不成熟的再生骨通常比成熟的骨脆弱，并且不成熟的骨随时间经历了重建过程以产生成熟的“板状(lamellar)”骨。完全骨愈合过程通过需要相当长的时间，通常为数月。
发生骨折并且可以从使用HS/BMP2的治疗中受益的骨包括所有的骨类型，尤其是所有哺乳动物的骨，包括但不限于，长骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁平骨(例如，颅骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆带)、不规则骨(例如，椎骨)、籽骨(例如，膝盖骨)。
发生骨折并且可从使用HS/BMP2的治疗中受益的骨包括骨骼骨(即，骨架的任何骨)、颅-面区域的骨、中轴骨骼的骨(例如，椎骨、肋骨)，附属骨(例如，肢的骨骼)、骨盆骨骼的骨(例如，骨盆)。
发生骨折并且可从使用HS/BMP2的治疗中受益的骨还包括头部(颅骨)和颈部的那些骨，包括面部的那些骨，如颌骨、鼻骨和颊骨。在这个方面，在一些优选的实施方式中，HS/BMP2可以用于辅助牙科或面部或颅骨手术中的骨修复和再生，其可以包括面部和/或口腔骨(不同于牙齿)的重建，例如，包括颚骨。
骨折还包括病理性多孔性，如骨质疏松症受试者所表现出的。
尽管未限制本发明，但是HS/BMP2的主要作用可以是针对伤口部位内、伤口部位附近或造成迁移到伤口部位中的细胞，并且可以是针对骨干细胞、前成骨细胞或成骨细胞，或者针对存在于伤口床内或造成迁移到伤口床中或在伤口床内迁移的任何辅助细胞或血管源性细胞。
提供了HS/BMP2和包含HS/BMP2的药物组合物和药剂以用于哺乳动物受试者的骨折治疗方法中。
治疗可以包括骨中的伤口愈合。治疗可以包括骨的修复、再生和生长。HS/BMP2通过促进新骨生长来促进骨折修复。HS/BMP2起到改善骨折修复的速度的作用，从而使骨愈合的发生更快，导致创伤后恢复时间的缩短。治疗可以导致骨强度得到改善。
治疗还可以包括骨质疏松症或骨关节炎的治疗。
优选地，将HS/BMP2施用于骨折周围的组织。这可以包括直接施用于其中发生骨折的骨组织。可以施用于骨或骨折周围的结缔组织或者施用于靠近并供给骨的脉管系统(例如，血管)。可以直接施用于创伤部位，并且可以施用于由伤口初始愈合所形成的骨痂。
可以配制根据本发明的药剂和药物组合物以通过多种途径施用。最优选地，将HS/BMP2配制为用于注射的液体或液态形式。
在一些实施方式中，将HS/BMP2配制为控释制剂，例如，在用于植入到伤口部位的药物胶囊中。HS/BMP2可以附着于、浸渍于或吸收到载体材料中(例如，生物材料)，如纳米纤维或生物可降解的纸或织物。
包含HS/BMP2的药物组合物、药剂、植入物和假体还可以包含BMP2。由于HS/BMP2与BMP2结合的能力，HS/BMP2可以起到BMP2载体的作用以辅助将BMP2递送到伤口部位并维持BMP2的稳定性。
优选地，以“治疗有效量”给予，与相应的未治疗骨折相比，这足以改善骨折的愈合。所给予的实际量以及给药速率和时间过程将取决于骨折的性质和严重程度。治疗的确定，例如，剂量的决定等，是全科医生以及其他医生的职责，并且通常将会考虑骨折的性质、个体患者的病况、递送部位、给药方法以及医师已知的其它因素。根据主治医生的指导，可以单次或多次给予HS/BMP2剂量。仅仅是通过举例说明的方式，可将HS/BMP2以至少1ng/ml的剂量递送，更优选地，以至少5ng/ml的剂量递送并且可选地以10ng/ml或以上的剂量递送。各个HS/BMP剂量可以为约小于1mg并且大于1μg，例如，约5μg、约10μg、约25μg、约30μg、约50μg、约100μg、约0.5mg或约1mg之一。可以在“雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)”，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams &Wilkins中查找到上述技术和方案的实例。
HS/BMP2可以与其它治疗一起用于治疗骨折，所述其它治疗是例如给予止痛剂或抗炎药剂、骨固定和正骨(例如，在石膏模中固定受创伤的肢体)、手术干预(例如，重新放置骨或移动骨以修正位移、弯曲或脱位)。如果需要手术的话，可以在手术过程中将HS/BMP2直接施用于(例如，应用于)骨折。
生物材料
本发明的药物组合物和药剂可以采用涂覆有和/或浸渍有HS/BMP2的生物材料的形式。可以由生物材料形成植入物或假体。可以将这些植入物或假体通过手术植入以辅助骨生长、再生、重建和/或再成型。
可以将HS/BMP2应用于植入物或假体以加快所需位置的新骨形成。应理解，不同于蛋白质，硫酸类肝素是特别强健的并且对制造合成生物支架以及对植入物和假体的应用所需的溶剂具有更好的耐受能力。
生物材料可以涂覆或浸渍有HS/BMP2。浸渍可以包括(例如)在聚合期间通过将HS/BMP2与生物材料的组成成分混合以形成该生物材料，或者将HS/BMP2吸收到该生物材料中。涂覆可以包括将HS/BMP2吸附到该生物材料表面上。
当施用于或植入到受试者中时，生物材料应能够使得涂覆或浸渍的HS/BMP2从该生物材料上释放。可以通过改变生物材料的结构(例如，多孔性)来改变生物材料的释放动力学。
除了用HS/BMP2涂覆或浸渍生物材料外，可以将一种或多种生物活性分子浸渍或涂覆到生物材料上。例如，选自由以下组成的组中的至少一种：BMP-2、BMP-4、OP-1、FGF-1、FGF-2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；VEGF；胶原；层粘连蛋白；纤连蛋白；玻璃粘连蛋白。除了上述生物活性分子以外或者作为上述生物活性分子的替代物，可以将一种或多种二膦酸盐与HS/BMP2一起浸渍或涂覆到生物材料上。有用的二膦酸盐的实例可以包括选自由以下组成的组中的至少一种：依替膦酸盐；氯屈膦酸盐；阿仑膦酸盐；帕米膦酸盐；利塞膦酸盐；唑来膦酸盐。
涂覆或浸渍了HS/BMP2的生物材料可以在医学和兽医中使用。应该理解本发明可以改善患者的生活质量或者潜在地延长动物的寿命，例如，用于繁殖的珍贵的赛马。
生物材料提供了支架或基质载体。生物材料可以适合于组织中的植入或者可以适合于给药(例如，作为溶液中的微胶囊)。
植入物或假体应是生物相容性的，例如，无毒并且低免疫原性(最优选无免疫原性)。生物材料可以是可生物降解的，从而随着伤口愈合的发生，生物材料降解，并且在受试者中最终仅原位留下再生骨。作为另外一种选择，可以使用非生物降解的生物材料(例如)以在较大的断裂处引导骨再生和/或用作骨愈合过程中的结构支撑，并且伤口成功愈合后，手术除去该生物材料是可选的要求。
生物材料可以是软的和/或柔性的，例如，水凝胶、纤维蛋白网或网状物，或者胶原海绵。“水凝胶”是有机聚合物(可以是天然的或合成的)凝固或固化以产生捕获水或其它溶液分子的立体开放栅格结构从而形成凝胶时所形成的物质。可以通过聚集、凝结、疏水性相互作用或交联发生固化。
可替代地，生物材料可以是相对刚性的结构，例如，由例如塑料或生物惰性金属(如钛)的固体材料形成。
生物材料可以具有多孔基质结构，其可以通过交联聚合物提供。优选地，该基质是骨生长所需的营养物和生长因子可透过的。
基质结构可以通过交联纤维形成，例如，纤维蛋白或胶原，或者海藻酸钠、壳聚糖或其它多糖通过适合的交联剂(例如，钙盐、聚丙烯酸、肝素)的液膜。可替代地，可以形成作为凝胶的支架，其通过胶原或海藻酸盐制成，使用本领域技术人员所知的已建立的方法交联。
用于基质形成的适合的聚合材料包括，但不限于，可生物降解/可生物吸收的聚合物，其可以选自由以下物质组成的组：琼脂糖、胶原、纤维蛋白、壳聚糖、聚己酸内酯、聚(DL-丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚乙交酯、聚交酯、聚羟基烷基酸酯、它们的共聚物，或者非生物可降解的聚合物，其可以选自由以下物质组成的组：醋酸纤维素；丁酸纤维素、海藻酸盐、聚砜、聚氨脂、聚丙烯腈、磺化聚砜、聚酰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它们的共聚物。
由于胶原的生物相容性和支持细胞附着和功能的有利性质，其是基质构建的优良材料(美国专利No.5019087；Tanaka，S.；Takigawa，T.；Ichihara，S.& Nakamura，T.Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolicacid-collagen nerve guide tube Polymer Engineering & Science 2006，46，1461-1467)。临床上可用的胶原海绵是基质的一个实例并且在本领域中是熟知的(例如，来自Integra Life Sciences的胶原海绵)。
纤维蛋白支架(例如，纤维蛋白胶)提供了替代性基质材料。作为伤口密封剂、递送生长因子的贮器以及作为放置和固定生物植入物的辅助物，纤维蛋白胶在临床上得到了广泛应用(Rajesh Vasita，Dhirendra S Katti.Growth factor delivery systems for tissue engineering：a materials perspective.Expert Reviews in Medical Devices.2006；3(1)：29-47；Wong C，Inman.E，Spaethe R.Helgerson S.Thromb.Haemost.2003.89(3)：573-582；Pandit AS，Wilson DJ，Feldman DS.Fibrin scaffold as an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor(FGF-1).J.Biomaterials Applications.2000；14(3)：229-242；DeBlois Cote MF.Doillon CJ.Heparin-fibroblast growth factor fibrincomplex：in vitro and in vivo applications to collagen based materials.Biomaterials.1994；15(9)：665-672)。
Luong-Van等人(In vitro biocompatibility and bioactivity of microencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28(2007)2127-2136)说明了HS从聚己酸内酯微胶囊中延长的局部递送，该文献作为参考并入本文。
生物材料的另一个实例是掺入羟基磷灰石或透明质酸的聚合物。
适合于与HS/BMP2结合使用的生物材料的一个实例为JAXTM骨填料(Smith&Nephew)。Jax颗粒是由高纯度硫酸钙构成的并且保留了它们的形状以提供具有可控颗粒间孔隙度和颗粒迁移稳定性的支架。Jax颗粒在体内能够安全并且完全溶解。
其它适合的生物材料包括陶瓷或金属(例如，钛)、羟基磷灰石、磷酸三钙、去矿物质骨基质(DBM)、自体移植物(即，来源于患者组织的移植物)或同种移植物(来源于患者以外动物组织的移植物)。生物材料可以是合成的(例如，金属、纤维蛋白、陶瓷)或生物的(例如，由动物组织制成的载体材料，例如，非人哺乳动物(例如，母牛、猪)或人)。
生物材料可以补充有其它细胞。例如，可以用未分化的骨前体细胞“接种”生物材料(或与之共合成)，所述未分化的骨前体细胞例如，干细胞，如间充质干细胞，更优选人间充质干细胞。
待治疗的受试者可以是任何动物或人。所述受试者优选地为哺乳动物，更优选地为人。所述受试者可以是非人哺乳动物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括来自啮齿目中任何动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，例如，奶牛或牛属中的任何动物)、马(包括马科中的任何动物)、驴和非人灵长类)。非人哺乳动物可以是家养宠物或者出于商业目的饲养的动物，例如，赛马，或者家畜，如猪、羊或牛。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是患者。
培养基
包含HS/BMP2的培养基可以是任何种类的，但是优选地为液体或凝胶，并且可以含有其它营养物和生长因子(例如，FGF-2)。HS/BMP2优选地以非痕量存在。例如，培养基中HS/BMP2的浓度可以在约1.0ng/ml培养基至约1000ng/ml培养基的范围内。优选地，培养基中HS/BMP2的浓度在约5ng/ml培养基至200ng/ml培养基之间，更优选地，在约20ng/ml培养基至170ng/ml培养基之间。
BMP2蛋白
在本说明书中，BMP2是指骨形态发生蛋白2(也称为骨形态发生蛋白2、BMP2或BMP-2)，它是TGF-β超家族的成员并且与骨和软骨发育有关。
图35中示出了来自人(Homo sapiens)的BMP2前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。氨基酸1至23代表信号肽，而氨基酸24至396代表前蛋白的氨基酸序列。本文中，成熟蛋白质的氨基酸序列表示为SEQ IDNO：5。
在本说明书中，“BMP2蛋白”包括与图35中所示的BMP2前体蛋白(preprotein)或BMP2前蛋白(proprotein)的氨基酸序列或者与SEQ IDNO：5所示的成熟BMP2蛋白的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的蛋白质，更优选具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列同一性的蛋白质。
BMP2蛋白优选地还包括肝素结合结构域，其具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列(存在于SEQ ID NO：2的氨基酸283-300处)，或者具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6具有75％、80％，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％之一的序列同一性的氨基酸序列。
对于BMP2蛋白，优选地包括Ruppert等人(Eur J.Biochem 1996)中所述的BMP-2蛋白。
BMP2蛋白优选地为成骨的，即，具有诱导或辅助诱导成骨细胞分化的活性。
BMP2蛋白可以来自或来源于任何动物或人，例如，非人动物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括来自啮齿目中任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括母牛，例如，奶牛，或牛属中的任何动物)、马(包括马科中的任何动物)、驴和非人灵长类或者其它非人脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人。
除明显不允许或者明确应避免的组合之外，本发明包括所述方面和优选特征的组合。
本文所使用的章节标题仅是出于组织结构的目的，而不应视作对所述主题内容的限制。
现在，将通过举例说明并参考附图对本发明的方面和实施方式进行说明。其它方面和实施方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中所提到的所有文件均将并入本文作为参考。
附图说明
现在，将参考附图对说明本发明原理的实施方式和实验进行讨论，其中：
图1.使用8M尿素/CHAPS缓冲液破坏的MX样品的阴离子交换色谱。在1M NaCl洗脱后观察到了较大的GAG峰。
图2.在来源于MX的GAG纯化期间，脱盐系统的代表性色谱图。初始峰(12-18min)代表全长GAG链。电导率峰和碎片峰(19-30min)代表盐和GAG碎片的洗脱。
图3.加载到未衍生化的Hi-Trap抗生蛋白链菌素柱上的tGAG(2.5mg)。所有GAG在流过液中从柱洗脱，表明GAG与柱无“背景”附着。
图4.BMP2-HBP(1mg)与tGAG(25mg)预温育30分钟。洗脱分布图示出了肽(280nm)与tGAG样品一起在流过液中离开柱。
图5.加载到Hi-Trap柱上的BMP2-HBP(1mg)。280nm的吸光度水平表明即使在高盐条件下，肽仍保持附着于柱；因此，生物素化的肽与抗生蛋白链菌素接头成功偶联。
图6.加载了25mg tGAG的BMP2-HBP(1mg)偶联的柱。色谱图(232nm)清楚地示出了流过液中的柱过载以及一些GAG与BMP2-HBP床的结合。
图7.上次实验(图6)中的GAG(流过)流分的再次应用。显著的GAG+洗脱峰的存在表明所有可用的BMP2-HBP结合位点已饱和，从而导致大部分易结合的GAG在流过液中离开柱。
图8.加载了tGAG(6mg)的BMP2-HBP(2mg)偶联的柱。色谱图(232nm)清楚地示出了柱未过载，并且存在对BMP2-HBP具有相对亲合力的GAG亚组。
图9.上次运行(图8)中GAG(流过)的再次运行。GAG+洗脱峰的消失表明在上次运行中可用的BMP2-HBP结合位点未饱和，从而使得能够在单次运行中有效提取GAG+糖。
图10.分离的全长GAG+流分(2mg)的再次施加显示在肝素酶III消化前对BMP2-HBP(2mg)柱的亲合力未发生变化。对BMP2-HBP柱再次施加GAG-流分还显示亲合力未发生变化，基本如图9所示，所有GAG均在流过液中离开柱。
图11.在加载到BMP2-HBP(2mg)柱之前，用肝素酶III消化的GAG-流分(1mg)。色谱图(232nm)清楚地显示GAG样品未与柱保持结合，而是在流过液中离开。这表明全长GAG-链中不存在任何GAG+结构域。
图12.在加载到BMP2-HBP(2mg)柱之前，用肝素酶3消化的GAG+流分(2mg)。色谱图(232nm)证明GAG+样品保留在柱上，表明全长GAG+链上的所有结构域均对BMP2-HBP具有相对亲合力。与相同干重的GAG+相比(图10)，吸光度峰的增加表明肝素酶3处理的效力。
图13.使用排阻限在1.5kDa至20kDa之间的Biogel P10柱分离全长GAG+链。色谱图显示大部分样品链具有大于20kDa的整体分子量。
图14.将全长GAG+糖链用亚硝酸处理20分钟以诊断性地降解硫酸类肝素类物质。由Biogel P10排阻色谱柱产生的色谱图显示与图13相比，所有GAG+链几乎完全降解，表明GAG+分离链主要由硫酸类肝素组成。
图15.加载到BMP2-HBP(2mg)柱上的4-硫酸软骨素(6mg)。色谱图清楚地显示由于在与GAG+样品相似的盐浓度洗脱，因此大部分GAG链对肽具有亲合力。
图16.加载到BMP2-HBP(2mg)柱上的6-硫酸软骨素(6mg)。色谱图表明几乎没有C6S GAG链对肽柱具有任何亲合力。
图17.加载到BMP2-HBP(2mg)亲合柱上的硫酸皮肤素(6mg)。色谱图表明几乎没有DS GAG链对肽具有任何亲合力，只有少量GAG在与GAG+样品相似的盐浓度洗脱。
图18.加载到BMP2-HBP(2mg)柱上的牛硫酸类肝素(2.5mg)。色谱图(232nm)显示仅有一小部分GAG与柱结合。
图19.加载到BMP2-HBP(2mg)柱上的肝素-LMW(50mg)。色谱图(232nm)显示几乎没有GAG与肽结合。
图20.加载到BMP2-HBP(2mg)柱上的肝素-HMW(28mg)。色谱图(232nm)显示几乎没有GAG与肽结合。
图21.将用肝素酶I预消化的肝素-HMW(25mg)加载到BMP2-HBP(2mg)柱上。色谱图(232nm)显示极少GAG片段与肽结合。
图22.示出了亲合色谱分离BMP-2肽特异性HS的步骤的色谱图。
图23.示出了亲合色谱洗脱BMP-2肽特异性HS(GAG+)的色谱图。
图24.示出了亲合色谱洗脱BMP-2肽非特异性HS(GAG-)的色谱图。
图25.示出了通过排阻色谱法在Superdex 75柱上洗脱Sigma HS(H9902)标准品的色谱图。
图26.示出了通过排阻色谱法在Superdex 75柱上洗脱BMP-2肽特异性HS(GAG+)的色谱图。
图27.示出了对对照培养基、100ng/ml BMP2和300ng/ml BMP2响应的C2C12细胞中Osterix表达的图。
图28.示出了对对照培养基、100ng/ml BMP2和300ng/ml BMP2响应的C2C12细胞中骨钙素表达的图。
图29.示出了对对照培养基、100ng/ml BMP2和300ng/ml BMP2响应的C2C12细胞中Runx2表达的图。
图30.示出了对对照培养基、BMP-2，阴性GAG(GAG-)、阳性GAG(GAG+)、总HS和肝素(Hep)响应的C2C12细胞中通过定量PCR测量的碱性磷酸酶表达的图。
图31.示出了对对照培养基、BMP-2，阴性GAG(GAG-)+BMP-2、阳性GAG(GAG+)+BMP-2、总HS和肝素(Hep)响应的C2C12细胞中通过定量PCR测量的Osterix表达的图。
图32.示出了对对照培养基、BMP-2，阴性GAG(GAG-)+BMP-2、阳性GAG(GAG+)+BMP-2、总HS和肝素(Hep)响应的C2C12细胞中通过定量PCR测量的Bspll表达的图。
图33.示出了对对照培养基、BMP-2，阴性GAG(GAG-)+BMP-2、阳性GAG(GAG+)+BMP-2、总HS和肝素(Hep)响应的C2C12细胞中通过定量PCR测量的Runx2表达的图。
图34.示出了对BMP和从MC3T3-E1细胞分离的GAG+(+BMP-2)响应的C2C12细胞中骨钙素表达的图。
图35.来自人的骨形态发生蛋白2前蛋白的氨基酸序列，NCBI登录号No.NP_001191(NP_001191.1GI：4557369)(SEQ ID NO：2)。
图36.示出了亲合色谱洗脱BMP-2肽特异性HS的色谱图。将6mg生物素化的BMP2-肽(SEQ ID NO：1)偶联到1ml抗生蛋白链菌素柱。色谱图显示所有生物素化的BMP2-肽与柱结合。
图37.示出了BMP2-肽(SEQ ID NO：1)特异性硫酸类肝素纯化的色谱图。
图38.示出了BMP2肽(SEQ ID NO：1)柱结合的硫酸类肝素脱盐的色谱图。
图39.示出了BMP2肽(SEQ ID NO：1)柱未结合的硫酸类肝素脱盐的色谱图。
图40.二糖消化后BMP2阳性硫酸类肝素的SAX-HPLC分布图。
图41.二糖消化后BMP2阴性硫酸类肝素的SAX-HPLC分布图。
图42.二糖消化后Celsus HS的SAX-HPLC分布图。
图43.示出了BMP2特异性HS、BMP2非特异性HS和Celsus HS的裂合酶来源的二糖百分比组成的表。对每个峰下方的面积积分以计算每种二糖的百分比。--＝未检出。
图44.示出了BMP2阳性和BMP2阴性HS表面等离子共振(SPR)分析的图。
图45.示出了涂覆在Iduron肝素/GAG结合板上的BMP2阳性和BMP2阴性Celsus HS制剂的BMP2结合量的图。
图46.示出了C2C12细胞上BMP2阳性和BMP2阴性HS的碱性磷酸酶(ALP)活性的图。
图47.ALP活性的HS增强的免疫组织化学分析的照片。当通过组织化学评价时，与非特异性HS相比，BMP2特异性HS提高BMP2诱导的ALP活力的程度更高。结合0、0.3、3和30μg/ml的BMP2阳性或BMP2阴性HS，引入了100ng/ml的BMP2。
图48.无图。
图49.示出了选择性(2-O、6-O和N-)去硫酸化的BMP2阳性HS的BMP2结合量并且表明结合BMP2所需的HS链的电荷取代类型的图。
图50.示出了肝素对BMP-2稳定性作用的图。
图51.JAXTM-磷酸三钙骨填料的SEM照片，兔尺骨缺损模型的X光照片。与位于200μl水凝胶(88％水、甘油、羧甲基纤维素钠)中的30μgHS/BMP2组合的说明。
图52.在处理第4周时，用JAXTM骨填料(对照)或JAXTM骨填料加HS/BMP2处理的兔尺骨缺损模型的X光和微CT扫描分析。
图53.在处理第8周时，用JAXTM骨填料(对照)或JAXTM骨填料加HS/BMP2处理的兔尺骨缺损模型的X光和微CT扫描分析。
图54.示出了在JAXTM骨填料(对照)、JAXTM骨填料加HS/BMP2(HS3)或JAXTM骨填料加BMP2阴性HS处理的兔尺骨缺损模型中通过微CT扫描评价的处理第4周(A)和处理第8周(B)时的％骨体积的图。
图55.示出了暴露于阴性对照、仅BMP2、BMP2+肝素或BMP2+HS3后，Smad 1/5/8磷酸化水平的免疫印迹图。
图56.不连接的严重兔尺骨缺损修复实验设计的图示说明。
图57.示出了肝素随时间从JAXTM颗粒上释放的百分比的图。
图58.示出了在第0、4和8周时，对用JAXTM骨填料加对照(无HS)、30μg HS3(HS30)或100μg HS3(HS100)处理的兔尺骨缺损模型治愈时的X光显微照片。
图59.示出了与图像处理过的X光重建(新骨用黄色表示)相比，术后4和8周后骨缺损内Jax星的3D图像再现的微CT(计算机断层)显微照片。与右侧的X光图像相比，微CT的图像为灰色。
图60.示出了第4和8周时，处理组(对照组相对于HS30组和HS100组)中总体积的％骨体积(BV/TV)定量的图。
图61.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的H&E染色(见下文)的显微照片。
图62.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的H&E染色的高倍放大显微照片(与图61相比)。
图63.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的Rails四色染色(见下文)的显微照片。
图64.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的Rails四色染色的高倍放大显微照片(与图63相比)。
图65.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的骨钙素免疫染色(见下文)的显微照片。
图66.示出了3个处理组(对照组(无HS)、30μg HS3组(HS30)或100μg HS3组(HS100))在4和8周中的骨钙素免疫染色的高倍放大显微照片(与图65相比)。
图67.扭转测试设备的照片。
图68.示出了8周时，HS30的典型扭转相对于未受损尺骨角度，加刚度和最大转矩的图。
图69.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型在第0周时的X光显微照片。
图70.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型中的愈合在第4周时的X光显微照片。
图71.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型中的愈合在第8周时的X光显微照片。
图72.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型在第4和8周时的微CT分析的图。
图73.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型在第8周时的最大转矩和刚度的图。
图74.示出了用吸收了30μg HS3、10μg BMP-2、30μg HS3+10μgBMP-2或等体积PBS中的一种治疗剂(总计300μL，溶于PBS)的胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型在第4周时的百分比骨体积的图和微CT图像。
图75.示出了当与10μg BMP-2(BMP10)、30μg HS3(HS30)、10μgBMP-2+30μg HS3、100μg HS3(HS100)或对照结合时，比较采用JAXTMTCP星和胶原海绵处理的兔尺骨缺损模型在第4周时的百分比骨体积的图。
具体实施方式
通过举例，在以下说明中说明了本发明的一个或多个实施方式的细节，包括本发明人对实施本发明所考虑的最佳方式的具体细节。对本领域技术人员来说显而易见的是，可对这些具体细节不加限制地实践本发明。
我们研究了GAG增强骨形态形成蛋白2(BMP2)活力的潜力。已很好地说明了BMP2对鼠肌性细胞系C2C12的高成骨诱导活性。该细胞系中的研究和体内研究均显示出糖胺聚糖在调节该活性中的作用。
类似地，很好地说明了BMP2对肝素的亲合力。已经进行了大量研究来设法检验BMP2和GAG之间的动态相互作用。一些研究提出这种相互作用是抑制性的，并因此负责将细胞因子与受体隔离或诱导其与其多种抑制剂结合，如已类似地对肝素显示出亲合力的头蛋白(noggin)。替代性发现表明BMP2与GAG之间的相互作用是维持需要其信号以分化为成骨细胞系的细胞周围的细胞因子局部浓度的方法之一。
这些发现还表明结合用于显著延长同型二聚体的半衰期，从而允许它在ECM中保持较长时间的活性。通常对于大多数系统来说，这种相互作用的真实作用可能是上述一些或全部作用的混合。
尽管许多研究已提供了BMP2对模型糖具有相互作用的证据，但是BMP2肝素结合肽(BMP2-HBP)，即位于每个BMP2单体N末端的一串氨基酸(QAKHKQRKRLKSSCKRHP[SEQ ID NO：1])，与适合的糖胺聚糖之间的特异性相互作用却很少受到关注。这产生的主要问题在于HS链中是否嵌入了控制绝对、或至少相对特异性结合的互补糖序列。
我们设法分离可以通过与细胞因子的直接相互作用调节BMP2活性的序列特异性糖胺聚糖。
实施例1
材料和方法
缓冲液制备
在严格关注质量的情况下，配制了用于GAG提取和分析的所有缓冲液。关键的是将缓冲液的pH维持在正确的水平并且对所有缓冲液实施过滤和脱气以避免沉淀物或气泡堵塞色谱柱。具体地，气泡的形成会造成柱的严重损坏，并且对于密封的预装柱来说，会导致它们不能使用。
用不含Ca2+或Mg2+的1×PBS(150mM NaCl)或双蒸水(ddH2O)过滤所有使用的缓冲液以制备最终溶液。
破碎缓冲液
8M尿素/CHAPS破碎缓冲液是由加入1％CHAPS、8M尿素和0.02％NaN3(防止在储存期间被微生物生长污染)的PBS(150mM NaCl)组成的。该溶液用于破碎基质(MX)样品，因此未经脱气或过滤。
PGAG阴离子交换低盐(250mM)缓冲液
低盐PGAG阴离子交换缓冲液包含具有另外100mM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用NaOH和0.02％NaN3将缓冲液平衡至pH 7.3。然后，在负压下对溶液脱气并且在通过0.4μm过滤器过滤之前持续搅拌直至不再释放气泡。
PGAG阴离子交换较高盐(1M)缓冲液
高盐PGAG阴离子交换缓冲液包含具有另外850mM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用加入的NaOH和0.02％NaN3将缓冲液平衡至pH 7.3。然后，在负压下对溶液脱气并且在通过0.4μm过滤器过滤之前持续搅拌。
链霉蛋白酶/神经氨酸酶PGAG复原缓冲液
该缓冲液用于在阴离子交换后使脱盐的PGAG样品复原以制备它们用于进行相关核心蛋白的酶消化。它是由25mM的醋酸钠(CH3COOHNa)组成的。用冰醋酸(CH3COOH)将缓冲液平衡至pH 5.0。根据生产商的说明，复原链霉蛋白酶和神经氨酸酶。
GAG亲合色谱低盐(150mM)缓冲液
使用未加入任何其它盐的PBS(150mM NaCl)制备低盐GAG阴离子交换缓冲液。用NaOH和0.02％NaN3将缓冲液平衡至pH 7.3。在负压下对溶液脱气并且在通过0.4μm过滤器过滤之前持续搅拌直至不再释放气泡。
GAG亲合色谱高盐(1M)终缓冲液
使用加入另外850mM NaCl的PBS(150mM NaCl)制备高盐GAG阴离子交换缓冲液。用NaOH将缓冲液平衡至pH 7.3，并且加入0.02％NaN3，然后将溶液脱气并通过0.4μm过滤器过滤。
脱盐溶液
使用通过0.02％NaN3平衡至pH 7.0的ddH2O制备脱盐溶液。然后，将溶液脱气并过滤。
样品制备
使用破碎缓冲液(8M尿素/CHAPS)利用破碎基质样品，然后在该缓冲液中刮去培养表面，并在37℃搅拌过夜以确保最大的细胞溶解。然后，将样品在5000g离心30min，并且将上清液通过0.4μm过滤器净化以准备用于通过阴离子交换色谱的PGAG提取。
柱准备和使用
用于GAG分离和表征中每个顺序步骤的柱类型的选择和准备对于该方案的成功是至关重要的。在每个步骤中，小心平衡和清洗该柱是重要的。
阴离子交换柱
由于用于GAG提取的MX底物的量相对较大，且加载到柱系统上的加载量大，因此必须手动装填和准备专门用于该研究的大阴离子交换柱。将Capto Q阴离子交换珠(Pharmacia)装填到Pharmacia XK 26柱(Pharmacia)中以产生每次运行的最大加载量为500ml MX裂解物的柱。
使用前，将柱和所有缓冲液平衡至室温30分钟，然后将该柱在PGAG阴离子交换低盐(250mM)缓冲液中清洗和平衡30分钟直至所有吸光度通道保持稳定。然后，将澄清的细胞裂解物通过该柱，并且再用500ml低盐缓冲液清洗该柱以除去任何非特异性结合的碎片。然后，使用250mlPGAG阴离子交换高盐(1M)缓冲液洗脱PGAG，并且在脱盐前冻干。然后，将该柱在低盐缓冲液中清洗并返回4℃保存。
脱盐方案
PGAG/GAG分离后，必须除去从柱中洗脱时在样品中积累的大量的盐。对于该步骤，合并相同实验组的所有洗脱样品，并且将其加载到4×Pharmacia HiPrepTM 26/10脱盐柱上。使用前，将柱和所有溶液平衡至室温30分钟，然后将该柱在脱盐溶液中清洗和平衡30min直至所有吸光度通道达到稳定。将冻干样品在能够获得透明溶液的最小可能体积的脱盐溶液中复原。柱的这种组合允许加载多达60ml样品。将先从柱上洗脱的那些流分冻干并且保留用于进一步分离或细胞培养应用。然后，将柱在脱盐溶液中清洗并返回4℃保存。
BMP2-HBP柱的制备
使用BMP2-HBP柱分离了对BMP2具有相对亲合力的GAG。在1mlGAG亲合色谱低盐(150mM)缓冲液中制备了约2mg生物素化的BMP2-HBP。将该量加载到HiTrap抗生蛋白链菌素HP柱(Pharmacia)上并且允许对该柱连接5分钟。然后，在不存在GAG的情况下对该柱进行完整的运行循环。以0.5ml/min的流速用13ml低盐缓冲液清洗该柱，然后以1ml/min运行10ml GAG高盐缓冲液。最后，用10ml低盐缓冲液清洗该柱。在该过程中，小心监测数据以确保未观察到肽的洗脱或柱降解。
GAG+样品分离
一旦制备好BMP2-HBP柱并在正常运行条件下测试了稳定性，就已准备好用于GAG+链从tGAG(总GAG)样品中分离。在3ml GAG亲合低盐(150mM)缓冲液中制备了tGAG样品(6mg)并将其注射到用于对柱进行加载的静态进样环(static loop)中。使用前，将BMP2-HBP柱和所有缓冲液平衡至室温30分钟，然后将该柱在低盐缓冲液中清洗和平衡30分钟直至所有吸光度通道稳定。然后，以0.5ml/min将样品加载到该柱上并且以0.5ml/min用10ml低盐缓冲液清洗柱和样品。随后，通过用10ml高盐(1M)缓冲液洗脱回收保留的GAG+样品并将其冻干用于脱盐。然后，将该柱在10ml低盐缓冲液中清洗并在4℃保存。
链霉蛋白酶/神经氨酸酶处理
为了将GAG链与它们的核心蛋白分离，用链霉蛋白酶和神经氨酸酶对它们进行消化。将冻干的PGAG样品再悬浮于最小体积的25mM醋酸钠(pH 5.0)中并通过用0.4μm注射器式过滤器过滤澄清。将总样品体积以500μl的等份分配到10ml玻璃管中。加入500μl 1mg/ml的神经氨酸酶并在37℃温育4h。温育后，向每个样品中加入5ml 100mM的Tris-乙酸(pH 8.0)。向每个样品中加入用500mM Tris-乙酸、50mM乙酸钙(pH 8.0)复原的另外的1.2ml 10mg/ml的链霉蛋白酶并在36℃温育24h。处理后，合并所有体积并将其通过离心和过滤准备用于阴离子交换处理。
GAG消化方案
通过使用包括亚硝酸或裂合酶降解的已建立的方案对GAG进行分析，包括其硫酸化结构域的大小和相对硫酸化水平。
亚硝酸消化
硫酸类肝素的基于亚硝酸的解聚在完成时导致碳水化合物链最终降解为其各个二糖组分。通过在冰上分别将250μl 0.5M的H2SO4和0.5M的Ba(NO2)2冷却15分钟来制备亚硝酸。冷却后，将Ba(NO2)2与H2SO4混合并在离心以除去硫酸钡沉淀前涡流混合。将125μl HNO2加入到悬浮于20μl H2O中的GAG样品中并且涡流混合，然后在不时混合的情况下在25℃温育15分钟。温育后，将1M Na2CO3加入到样品中使pH为6。接着，将100μl 0.25M的NaBH4在0.1M NaOH中的溶液加入到样品中并将混合物加热至50℃，保持20分钟。然后，将混合物冷却至25℃并在通风橱中用冰醋酸酸化使pH为3。然后，用10M NaOH中和混合物并通过冷冻干燥使体积减小。将最终样品在Bio-Gel P-2柱上运行以分离二糖和四糖从而验证降解。
肝素酶III消化
肝素酶III是在葡萄糖醛酸键处切割糖链的酶。一系列肝素酶(I、II和III)分别通过在特定硫酸化识别位点使某些硫酸类肝素序列解聚来显示相对特异性活性。肝素酶I沿链切割具有NS区域的HS链。这导致认为具有HS大部分生物活性的硫酸化结构域的破碎。肝素酶III使NA结构域内的HS解聚，从而导致碳水化合物链分解成各个硫酸化结构域。最后，肝素酶II主要切割HS链的NA/NS“肩”结构域，其中存在不同的硫酸化类型。
为了分离潜在的活性结构域，我们关注GAG+的NA区域的解聚。在含有20mM Tris-HCl、0.1mg/ml BSA和4mM CaCl2的缓冲液(pH 7.5)中制备了酶和冻干的HS。加入至每个样品中的肝素酶III的浓度取决于样品中HS组分的相对量。我们通过亚硝酸解聚的分析表明GAG+样品主要由HS组成；因此，以5mU/1μg HS使用该酶。将样品在37℃温育16h，然后通过加热至70℃，保持5min来终止反应。然后，将样品应用于适当的柱系统进行进一步分析。
细胞培养
GAG生产
为了分离代表正在发育的成骨细胞的GAG类物质，使MC3T3细胞在成骨条件下生长8天。通过在25℃，在0.02M氢氧化铵(NH4OH)稀释溶液中温育5分钟以除去细胞组分。5分钟后，通过翻转培养表面除去NH4OH。使处理过的培养物在超净工作台中干燥过夜。第二天，用无菌PBS将处理过的培养物清洗三次，并使其在超净工作台中干燥。然后，将所制备的基质培养物在4℃的无菌条件下存放直至通过破碎缓冲液和阴离子交换色谱处理释放出主要的蛋白聚糖为止。
BMP2-特异性GAG的生物活性
通过在添加了10％FCS的达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)上以1.3×104个细胞/cm2铺板，将C2C12成肌细胞每48h继代培养至最多15代。以2×104个细胞/cm2，在添加了5％FCS的DMEM中诱导成骨分化，重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP2)和对rhBMP2具有阳性或阴性亲合力的糖胺聚糖部分(分别为GAG+和GAG-)的标称浓度。在加入至其相应的C2C12培养物中之前，将rhBMP2和GAG部分在25℃预温育30min。使该培养物在这些条件下生长5天，每48小时更换用于每种条件的培养基，然后提取mRNA样品并将其准备用于RQ-PCR分析。使用ABIPrism序列检测系统(PerkinElmer Life Sciences)进行骨钙素表达的实时PCR。使用引物表达软件(v2.1，PE Applied Biosystems)设计引物和探针。重新设计靶标探针以掺入LNA碱基并用BHQ-1(Sigma-Proligo)标记。将核糖体亚基基因18S(VIC/TAMRA)用作内源对照，每个条件包括三个重复，每一测试重复三次。使用ABI序列检测器软件分析原始PCR数据。在计算相对表达单位(REU)前，将靶标基因表达值归一化为18S的表达。
结果
阴离子交换色谱
为了从MX样品中成功提取GAG，必须除去可能污染该样品的其它基质蛋白。由于GAG构成了ECM中带负电荷最强的分子，因此采用阴离子交换色谱能够最有效地完成。
使用8M尿素/CHAPS缓冲液破碎样品并将其加载到阴离子交换色谱柱上。从柱上清洗掉不想要的蛋白和ECM碎片并用1M NaCl洗脱带负电的GAG。典型的色谱图(图1)清楚地显示大量未附着的碎片从中流过，并且从MX制备的大量GAG清洁并且紧密地洗脱。因此，该结果不但证明了通过该方法对GAG的纯化，而且它还确认用NH4OH处理后ECM中保留了大量GAG。
脱盐
在各个处理阶段，几乎所有用于纯化和分析GAG的色谱方法均需要使用高盐缓冲液洗脱。由于高盐条件干扰了基于亲合力的色谱方法，因此在每个处理阶段后必须对样品脱盐。该过程通常是使用排阻色谱完成的。在这些条件下，诸如GAG的较大分子在包括盐和小GAG碎片的小分子之前离开柱。可以通过所得的色谱图(图2)观察GAG与污染盐的分离，该色谱图还用于确认GAG链在处理过程中保持完整。
BMP2-HBP柱系统
柱制备
由于使用可商购试剂制备BMP2生长因子柱的成本限制，我们取而代之地使用了已知的BMP2肝素结合结构域(BMP2-HBP)的生物素化制备物。将该肽固定在Hi-Trap抗生蛋白链菌素HP柱(1ml)上以特异性地保留对特定肝素结合结构域肽具有亲合力的GAG链。
首先，通过对不含BMP2-HBP的柱床运行总GAG(tGAG)流分来检查GAG对空白抗生蛋白链菌素柱可能具有的任何背景亲合力(图3)。我们的结果确认从MX获得的tGAG样品对抗生蛋白链菌素柱不具有固有的亲合力。我们还研究了两种不同的方法，其将tGAG暴露于BMP2-HBP以便分离具有特异亲合力的链。在加载到抗生蛋白链菌素柱上之前，将该肽与25mg tGAG预温育30min，或者先加载该肽，随后将tGAG流过柱床。
tGAG与BMP2-HBP的预温育表明该肽完全不能与柱结合(图4)，更不必说介导特异性GAG的任何分离了。然而，当将该肽单独加载到该柱上时，它与柱的结合是绝对的，即使在1M盐的条件下也不能有效地洗脱该肽(图5)。这种高亲合力结合表明生物素-抗生蛋白链菌素的结合正确地起作用，并且表明当与tGAG一同加载时，由于位阻而对与柱之间的结合产生可能的抑制。
柱加载量
由于对BMP2-HBP可能具有相对亲合力的tGAG的比例未知，因此我们首先将每次分离运行中加载到肽柱上的tGAG的量进行标准化。通过固定1mg BMP2-HBP制备了Hi-Trap柱以用于提取对BMP2肝素结合位点具有特异亲合力的tGAG。选择该量以使得用于今后实验的可用肽的量最大化，这会使柱稳定性随时间而被破坏。不稳定性是肽柱的显著问题，会相应地影响一致性。开始尝试将25mg tGAG加载到1mg BMP2-HBP偶联柱上，其导致明显过载，如通过232nm的流过液吸光度所观察的(图6)。尽管观察到了明显的洗脱峰，但是由于过载，在流过液中损失了对HBP具有亲合力的tGAG。通过使流过液再次通过肽柱来检查这种情况(图7)。这导致产生了明显的GAG+(洗脱)峰，表明上次运行使该柱饱和。
进一步的优化使我们通常将不超过6mg的tGAG加载至2mgBMP2-HBP柱。如流过液峰(图8)和阳性结合部分的缺少(图9)所证明的，这防止了柱过载。反过来，在单次通过中从每个样品组提取对BMP-HBP具有亲合力的那些tGAG使我们能够更有效地分离GAG+和GAG-流分。
GAG结构域分析
GAG+链特异性
通过建立标准化方案，我们能够可复现地分离GAG+部分以用于进一步分析。
考虑到介导蛋白结合特异性的硫酸类肝素的域结构，很有可能是与柱结合的多域GAG链实际上是由对BMP2具有较低特异性亲合力或不具有特异性亲合力的大部分链组成的。类似地，有可能表现为GAG-的链实际上可能含有对BMP2-HBP具有一定亲合力的结构域。为了检查这些可能性，必须将GAG链破坏成它们的组分域以进行更广泛的检查。
肝素酶III(类肝素酶I)主要在侧接高硫酸化区域的那些区域切割HS链，由此释放与敏感生长因子结合的高荷电蛋白结合结构域，在本文中为BMP2-HBP。将GAG+和GAG-部分暴露于肝素酶消化，尽管任一个流分都未在对BMP2-HBP的亲合力方面显示出任何变化(图10)。
随后，对全长GAG+和GAG-流分进行肝素酶III消化，然后将两个消化的样品组加载到BMP2-HBP柱上以评价保留亲合力。
酶消化后，通过相同干重样品相对吸光度的增加验证了肝素酶消化的效力，如图10和图12所示。由于232nm下GAG链的监测是通过糖链本身进行的并且，具体地，是通过不饱和键进行的，因此导致产生了HS片段不饱和键的肝素酶III沿链长的任何切割都会造成吸光度的增加。
有趣的是，全长GAG-链的肝素酶消化未得到对BMP2-HBP具有任何明显亲合力的流分(图11)。然而，类似地，全长GAG+样品的消化未产生对BMP2-HBP缺乏亲合力的部分(图12)。该结果表明所产生的全部BMP结合的GAG链含有对HBP具有特异亲合力的域重复。作为另外一种选择，在这些最低的条件下，HBP可能不能在具有不同亲合力的GAG+域之间得到充分的区分。
GAG+组合物
全长GAG+的尺寸估计(sizing)
为了检查来自BMP2-HBP柱的GAG+组合物流分，我们首先检查了它们的平均尺寸。这是为了确保我们确实分离了具有适当长度的GAG链，而不是不带有任何特异性亲合力的小片段。尽管由于它们具有相对刚性的杆状构象，GAG链的任何尺寸估计都是有问题的，但是可以做出涉及斯托克半径(Stoke′s radiu)和表观球形度的一组假设。
将全长GAG+样品加载到排阻限为20kDa至1.5kDa之间的BiogelP10凝胶过滤柱(1cm×120cm)上。232nm下测量的吸光度表明大部分GAG+分子具有大于20kDa的总表观尺寸(图13)。
已假设糖链必须长于约10-14个环以增强对有丝分裂原FGF家族的显著生物活性。就表观分子量而言，14个完全硫酸化的二糖链对应于约8.7kDa。由于GAG+样品中存在的大多数链表现出＞20kDa的表观分子量，因此假设它们对BMP2-HBP所具有的相互作用具有一定特异亲合性并且不是由常规非特异相互作用所造成的是合理的。
GAG+糖类物质
存在五种主要的糖胺聚糖家族：透明质酸糖胺多糖(hyaluronan)、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸类肝素。在这五种糖胺聚糖中，只有硫酸类肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素具有产生不同硫酸化的结构域的能力，这些不同硫酸化的结构域可以编码与特定细胞因子(如BMP2)的特异性相互作用。鉴定使用BMP2-HBP柱分离的糖类物质的类型对本研究是至关重要的，并且使用诊断化学和酶降解的组合确定了对它们的鉴定。具体地，作为与BMP2相互作用的主要GAG候选物，硫酸类肝素在存在亚硝酸的情况下可以完全降解为其二糖组分。
因此，将我们的HBP保留的GAG样品与亚硝酸温育20分钟，然后在Biogel P10筛分柱上分离。对所得色谱图的检查表明如对232nm和226nm处的吸光度所测量的，所有GAG+糖样品几乎完全降解(图14)。
该结果明确表明由于其它糖链不受亚硝酸解聚的影响，因此对BMP2-HBP特异性分离的全长糖链主要是由硫酸类肝素组成的。
尽管几乎所有GAG+链都可以按照这种方式降解，但是在较高分子量(＞20kDa)处还是观察到了小峰。可以假定它是由硫酸软骨素组成的，其中CS-B(硫酸皮肤素)和CS-E(4，6-硫酸软骨素)证明了与硫酸类肝素类似的硫酸化复杂性。
GAG类物质分析
BMP2-HBP特异性GAG(替代物质)
全长GAG+链通过暴露于亚硝酸的降解清楚地表明大多数GAG+糖链是由硫酸类肝素糖类物质组成的(图14)。然而，由于在高分子量区域中观察到了残余的峰，因此GAG+样品的降解是不完全的。该峰的存在明显指出了其它种类糖链的可能性，如硫酸软骨素或硫酸皮肤素。接着，我们首先通过检查多种可商购的软骨素和皮肤素糖对BMP2-HBP柱的亲合力来设法检查另外两种糖类对该细胞因子可能具有的可能亲合力。
通过在每种情况下，在与用于将GAG+链从MC3T3基质样品中分离的相同条件下将6mg糖加载到BMP2-HBP柱上，我们测试了4-硫酸软骨素(C4S)、6-硫酸软骨素(C6S)和硫酸皮肤素(DS)。
显示3种糖链类型中每一种的亲合力的色谱图显示只有C4S(图15)对该肽具有任何明显的亲合力。这种亲合力连同对C6S(图16)和DS(图17)样品所观察到的对BMP2-HBP柱缺乏亲合力一起似乎表明C4S对BMP2肝素结合位点具有特定的、潜在显著的相互作用。
由于尚未良好表征硫酸软骨素和BMP2之间的任何可能相互作用，因此这些结果使我们怀疑柱色谱作为BMP2/类肝素相互作用的精确监控的有效性。为了进一步研究动态相互作用的特异性，我们测试了几种可商购糖类对柱的亲合力。这些糖类包括硫酸类肝素、低分子量肝素(肝素-LMW)、高分子量肝素(肝素-HMW)和用肝素酶I处理过的肝素-HMW。
有趣的是，这些可商购的GAG类物质无一看上去能够证明与该肽柱的任何特异相互作用。来自牛肾的硫酸类肝素具有极低的亲合力(图18)，通过其不能正向增强FGF2介导的细胞增殖(数据未示出)进一步确认了该行为，如在存在HS2的情况下所观察到的。该GAG样品与柱结合能力的这种降低可能是由于它是以相对未硫酸化的形式出售所造成的。
所测试的肝素样品无一对柱显示出即使是较低的亲合力。由于在历史上BMP2本身首先是使用肝素柱分离的，因此这是特别有趣的。为了确认该结果，测试了LMW(图19)和HMW(图20)肝素；两者均未对该柱显示出任何明显的亲合力。
由于我们推测相对小的BMP2-HBP肽可能难以维持其与明显更大的肝素分子的结合，因此我们接着使用肝素酶I预消化了肝素-HMW样品。然后，将这些较小的肝素-HMW片段在BMP2-HBP柱上运行；然而，这种处理似乎不能改善任一种肝素样品结合肽柱的能力(图21)。
由于BMP2通常是通过肝素亲合力分离的，因此，肽柱不能对各种肝素制剂中的任一种表现出任何特异相互作用是有些出乎意料的。然而，可能的原因是，这可能是由于“受体-配体”相互作用顺序的颠倒所造成的；在这种情况下，BMP2-HBP代表固定的“受体”，与代表“配体”的肝素相对，或者BMP2-HBP或可溶性肝素的浓度有利于能够快速消除流速/盐压力下的任何亲合力的解离状态。
结论
前成骨细胞来源的ECM底物的使用为我们提供了用于模拟与这种成骨诱导有关的天然分泌的、ECM相关GAG的活力的有用模型。尽管先前的许多研究已经检查了这种天然相互作用在调节BMP2活性中的作用，但是这通常是在细胞因子水平上进行的，而不是着眼于研究生物调节GAG的序列特异性。
因此，在本文中我们设法开发了MX底物中天然分泌的GAG的可用性和它们对于直接、序列特异的相互作用以及调节BMP2诱导的C2C12成肌细胞成为成骨系的潜力。
阴离子交换
使用这种特别的标准并且良好说明的方案为我们提供了从NH4OH处理的MX底物可接近GAG的结论性证据。我们开始的关注点集中在用于使ECM细胞组分溶解的苛刻化学处理，并且这还可能导致大部分GAG从ECM中剥离。然而，阴离子交换色谱图中所观察到的显著高亲合力的峰清楚地显示出大量GAG在MX底物中的保留。尽管这种特定方法不能够鉴别各种GAG类物质，但是由于它们作为细胞分泌的带负电荷最多的分子之一，因此确实提供了它们在样品中存在的结论性证据。
BMP2-HBP柱系统
对BMP2肝素结合肽的功能性作用的先前研究为我们研究BMP2对GAG所具有的潜在特异相互作用提供了有用工具。位于每个BMP2单体N-末端的氨基酸单链似乎仅负责调节BMP2对GAG的亲合力。
因此，我们研究了BMP2分子的这个区域作为配基“诱饵”的使用以尝试保留对细胞因子具有相对亲合力的那些GAG链。以这种方式使用BMP2-HBP导致HS在肽柱(GAG+)上的显著保留。
柱制备
使用N-末端生物素化的HBP，我们制备了BMP2-HBP亲合色谱柱，并且能够成功保留作为控制天然BMP2同型二聚体候选物的GAG样品。柱的初始制备显现出了一些有趣的问题。与tGAG预混合的生物素化的BMP2-HBP的制备显示不能与柱结合。由于随后的测试显示当加载到其自身时，BMP2-HBP易于连接到抗生蛋白链菌素柱上，因此该结果表明GAG干扰肽生物素化位点与抗生蛋白链菌素柱结合的能力。tGAG本身对抗生蛋白链菌素不具有亲合力，这表明与BMP2-HBP可能通过位阻的直接相互作用是造成这种情况的原因。
柱优化
在没有使我们能够估计我们的样品中GAG+糖的结合量的任何直接信息的情况下，需要优化我们的肽柱以确保过量的样品加载不会导致柱饱和以及随后的样品损失。这起初包括故意使柱饱和以检查已知量BMP2-HBP的结合量。即使使用大量tGAG，肽仍能够保留大部分GAG+糖链。在这些条件下，少至1mg的BMP2-HBP能够在两次循环中完全保留所有GAG+链。因此，该柱似乎“模拟”了真实的BMP2生长因子柱并且提供了提取GAG+样品的非常有效的方法。
针对特异GAG的分离，对基于肽的柱的优化是复杂的程序，其根据所使用的蛋白质的尺寸和个体化学特性而有较大不同。利用FGF-1和2生长因子柱(Turnbull和Nurcombe，personal communication(个人通信))的上述研究还显示出显著需要对柱进行持续的维护以及柱的可用寿命周期较短。这些研究证明了使用肽柱的繁复的性质以及必须小心地正确优化该类系统。遗憾的是，尽管存在用于分析特异性蛋白-GAG相互作用的其它系统，但是这些系统通常缺乏分离足够量的GAG以用于进一步分析的能力，从而使它们不适合我们所设计的研究过程。
GAG结构域分析
特别地，对于硫酸类肝素(HS)来说，GAG硫酸化类型经常集中在与较少硫酸化的区域相间隔的高硫酸化结构域中。这种将硫酸化位点分为结构域的分组是提供配体与GAG链区域特异结合的集合，从而使得单个糖分子有可能结合多个不同靶标，并且稳定这些靶标之间的相互作用，如在FGF系统中所显示的。对于所提出的HS-配体相互作用的这种模型的例外情况包括干扰素γ(IFNγ)和硫酸类肝素之间的相互作用。在这种情况下，GAG和IFNγ之间的相互作用导致细胞因子效力的提高。仍保持与局部GAG解离的IFNγ被快速加工成失活形式，由此防止其在扩散后在不适合的区域中发出信号。IFNγ还显示出四个不同的肝素结合结构域，其中每一个都具有不同的序列，这是对于肝素结合蛋白不常见的发现。然而，已表明只有紧邻蛋白质C末端存在的两个结构域介导INFγ的肝素结合特性。重要的是，对这两个IFNγ肝素结合位点具有特异型亲合力的HS序列的序列分析表明了与HS-配体相互作用的通常所观察的模型相比的有趣差异。在这种情况下，发现负责IFNγ结合的HS序列主要是由具有较少硫酸化的N-乙酰化区域组成的。该区域侧接了两个小N-硫酸化区域。这与FGF中所观察到的系统显著不同，在对FGF所观察的系统中，NS结构域中的硫酸化类型是造成介导FGF和HS之间的相互作用的原因。近年来，已在多个其它系统中观察到了这类相互作用，如PDGF、IL-8和内皮抑素(内皮他丁，endostatin)。如在这些细胞因子中所观察的，与HS的这种相互作用的发现可能能够解释在透明质酸糖胺多糖中所观察到的生物活性，其中透明质酸糖胺多糖在沿其链的任一点上不具有硫酸化类型，但是却具有调节该类因子(如NF-κB)活力的能力。
配体和GAG之间的这些所观察到的相互作用，具体地，IFNγ的相互作用，与所提出的以及我们所观察到的HS与BMP2之间的相互作用模式明显不同。BMP2的单个N末端肝素结合结构域未表现出二级结构并且似乎仅基于电荷与HS相互作用。尽管未对结合该肽序列的HS进行深入序列分析，但是其需要在约300mM NaCl的条件下洗脱使我们怀疑存在适当程度的硫酸化，由此将该相互作用归于介导特异相互作用的硫酸化类型的传统模型中。
GAG+链特异性
将硫酸化类型分配成使HS能够稳定蛋白质组相互作用的结构域还会导致存在这种可能性，即具有足够长度和复杂性的GAG+糖链可带有其本身对BMP2-HBP不具有直接亲合力的几个结构域，这是由于这些结构域带有不同的硫酸化序列所造成的。相反地，也有可能鉴别为对BMP2-HBP(GAG-)具有较低亲合力的一些全长糖链可能含有一些确实带有这种亲合力的隐蔽结构域。
近年来，已发表了为这些复杂碳水化合物链内存在“硫酸化编码”提供强有力证据的多个报告。尽管该“硫酸化编码”的详细情况仍难以阐明，并且硫酸化碳水化合物长链的测序是复杂并且费时的过程，但还是由此已提出了GAG和配基之间特异相互作用的多种可能模式。具体地，一种观察已导致产生了对多种GAG-配基模型的表征；沿多种类型GAG(如硫酸类肝素)的长度，将硫酸化分组为不连续的区域或“结构域”。有趣的是，尚未观察到这种现象的模板，并且它似乎主要是由负责GAG合成这一阶段的磺基转移酶的暂时活性所造成的。
特别地，研究特异GAG序列的有用工具为可以用于检查复杂碳水化合物链的靶向解聚的多种肝素裂合酶，借此提供了对它们结构的认识。一种特别的类肝素裂合酶，即肝素酶III(类肝素酶)，在侧接可以在硫酸类肝素链中存在的高度硫酸化结构域的位点切割硫酸肝素链。因此，使用该酶，有可能从全长糖链中释放这些潜在活性区域并且如果它们作为单一结构域起作用，则有可能通过亲合色谱将它们与对BMP2-HBP不具有特异亲合力的区域分离。
重要的是要注意对于GAG-配体相互作用来说，序列的亲合力不一定能保证生物活性。在与它们的各种配体结合期间，GAG介导的活性模式根据系统而明显不同。在其中糖链通过稳定蛋白三级结构来起到延长蛋白-蛋白相互作用的作用的一些情况下，如在FGF与其受体之间所存在的以及HGF/SF和Met之间的相互作用，多个不连续的硫酸化区域可以参与调节糖链的预定生物活性。在这样的情况下，各个硫酸化结构域与全长碳水化合物链的分离实际上会造成糖生物活性的抑制，这是因为尽管每个“结构域片段”仍与其预定靶标结合，但是它不能介导混合的全长碳水化合物链的预定生物效应。
有趣的是，GAG-配体相互作用的这种特定特征正是使这种方法对调节BMP2活性有用的原因。对BMP2生物活性的GAG调节所提出的模型包括细胞因子在ECM中的GAG或在细胞表面上的固定化。在这样的系统中，应用对BMP2的肝素结合结构域特异的外源GAG将会阻止这种相互作用，从而提高短期BMP2介导的信号，这与在加入可溶肝素期间所观察到的效果类似。尽管存在这种方式的相互作用将会继续保护细胞因子不被蛋白水解降解的一些指示，但是从长远来看，BMP2从其生物活性预计区域的离域(delocalization)将有可能对细胞因子的有效性造成负面影响。
我们的全长GAG+和GAG-链的对照测试产生了与在它们一次分离期间所观察的类似的分布图。然而，对用肝素酶III处理后的GAG+和GAG-链的分析获得了出人意料的结果。GAG+链的消化似乎不能产生仅根据对BMP2-HBP的亲合力而可分离的片段。此外，全长GAG-链的消化未获得从阴性糖链中释放的阳性结构域。有一定可能性的是酶消化未达到完全。然而，所得的色谱图清楚地显示与全长GAG链相比，在232nm处的吸光度极大提高。由于232nm下糖胺聚糖的大部分吸光度是通过不饱和键(如，酶解聚期间所形成的那些)的吸光度所介导的，因此它明确地表明事实上酶消化是成功的。
该结果的含意有些不同寻常。该数据表明GAG链不仅是通过细胞合成以特异地与BMP2相互作用，而且对于MC3T3细胞来说，这些糖链带有对BMP2代谢方面特异的多个序列重复。BMP2作为极其强效因子的事实可能为该观察现象提供解释。已经充分地记载了BMP2对间充质祖细胞的成骨诱导作用，例如它在甚至从成骨系中除去的细胞中诱导异位骨形成的能力。考虑到该效力，已知BMP2的异位信号对治愈和发育均具有有害的后果。有可能的是在前成骨细胞GAG上设计了BMP2-HBP相互作用序列的多个重复以确保最大结合，并由此调节该细胞因子诱导改变的细胞结局的能力。相反地，体内产生的极低浓度的BMP2也可能需要这类糖链的产生以确保保留足够的局部浓度，即由体外诱导C2C12成肌细胞的成骨分化所需的极高浓度的BMP2所支持的观察现象。
BMP2-结合结构域的这种重复是通过模板或时间机制尚未被阐明的合成途径所产生的这一事实是特别有趣的。单一糖链内的序列特异性结构域的准确性和可复现性(与对应于其它配基的该类域的随机成簇相反)明确地表明这些细胞实际上确实具有指导特异性糖序列产生的能力。当前对HS结构的了解表明，在序列特异性区域的产生中对碳水化合物链的进行性合成后“编辑”，其中一些观察现象是针对酶“模板”的一些方式的，借此使用特定磺基转移酶以及其它相互作用分子的局部浓度以直接控制特异性糖序列的产生。我们当前对特异合成的这种模式的理解在很大程度上是根据多项研究所获得的，包括Lindahl等人对抗凝血酶III和肝素之间高亲合力相互作用的研究以及Esko等人有关具有不同GAG合成途径的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞突变体的研究。尽管这些研究在GAG分析方法方面差异显著，但是它们均针对用于受指导地调节细胞因子和受体活性的特异GAG合成的高度保守系统。重要地，这些研究还用于说明这些BMP2重复的可能产生，如在我们的研究中所观察到的。
GAG+组成
全长GAG+尺寸
各个GAG链对于FGF的生物活性与碳水化合物链的长度密切相关。评价GAG生物活性的常用方法是测定不断缩短的硫酸化结构域片段，并且从而确定介导所观察的活性所需的最短可能序列。
使用该方法，我们首先检查了全长GAG+糖链，并且确定它们的尺寸为＞20kDa，其足够长以带有对BMP2具有亲合力的多个结构域。有趣的是，该观察现象为用肝素酶3处理的GAG+样品表现出对BMP2具有特异亲合力的碳水化合物链部分的多个重复的早期观察现象提供了支持，这是因为这种尺寸的不同硫酸化的糖链具有带有多个硫酸化结构域的能力。
GAG+糖类物质
由于组成“糖组”的五种糖胺聚糖类型中的大部分能够编码所观察到的与BMP2之间的特异相互作用，因此必须阐明这些GAG类型中有哪些可以参与这种特异性结合。尽管这种相互作用的主要候选物为硫酸类肝素，但是还对硫酸软骨素和硫酸皮肤素鉴别了类似生长因子相互作用。
使用亚硝酸可以将硫酸类肝素完全解聚成其二糖组分。这种与硫酸肝素和硫酸角质素共有的特定特征是分析特异GAG群体所必不可少的。对于我们的GAG+样品的碳水化合物组成的分析来说，由于亚硝酸所造成的降解是硫酸类肝素的判断特征(diagnostic)。这种可能性主要是由于与硫酸肝素或硫酸角质素相比，通过硫酸化其硫酸类肝素的更高度的带电类型所造成的。最终，这种带电类型是造成BMP2与HS的特异性相互作用的原因。
我们使用亚硝酸方案的分析显示了GAG+样品组的完全降解，这表明GAG+样品组中大部分的糖实际上是1，3-连接的，并因此是硫酸类肝素。该结果支持有关硫酸类肝素细胞因子相互作用特异性所观察到的多种现象，特别是BMP2对肝素和HS表现出的相互作用。
GAG类分析
BMP2-HBP特异性GAG(替代性物质)
在亚硝酸降解GAG+样品后所观察到的小残余峰是对GAG+样品组中可能存在带有对BMP2具有一定特异亲合力的其它硫酸化GAG的支持。考虑到我们当前所了解的硫酸化在介导GAG和BMP2之间相互作用中的影响，软骨素和皮肤素是最有可能显示出与BMP2具有特异相互作用的替代糖，这是因为它们在硫酸化类型中显示出最大的可能多样性。
经常用于GAG分析的方法包括检查各个硫酸化位置对GAG-配体相互作用的影响。这种分析方法是各个硫酸化位置在维持GAG链与其特异的靶标之间相互作用中的重要性的指征。此外，由于不同类的GAG仅可能带有对它们的种类特异的硫酸化类型，因此这能够辅助缩小可能对特异性配体表现出亲合力的可能糖胺聚糖候选物的范围。
为此，我们检查了不同硫酸化的CS链、C4S和C6S以及标准DS对BMP2-HBP所带有的亲合力。有趣的是，仅C4S对BMP2-HBP带有任何显著的亲合力。该数据表明4-O-硫酸化有可能是CS与BMP2-HBP相互作用所必须的。有趣的是，硫酸皮肤素对BMP2-HBP未显示出亲合力。由于DS是表现出与HS类似的硫酸化多样性的唯一CS类，因此所观察到的该现象是很有意思的。此外，我们的观察表明DS中GlcA向IdoA的差向异构化有可能损害了这种糖类型结合BMP2-HBP的能力。C4S和DS均能够带有4-O-硫酸化，但是与C4S相比仅有少量DS保留在柱上。可替代地，这种亲合力的缺乏可能只是因为这一特定批次的DS未带有足够的4-O-硫酸化以有效介导与BMP2-HBP的结合。有趣的是，所观察到的这些特别现象似乎表明了BMP2与带有4-O-硫酸化的CS之间的相互作用。尽管上述研究已对药物递送系统中CS-BMP2相互作用的使用进行了研究，但是对各个CS类和BMP2之间的任何序列特异相互作用仍知之甚少。然而，由于HS链是由1，4-连接的二糖单元组成的，因此在HS-BMP2相互作用中未发现造成CS-BMP2相互作用的所观察到的4-O-硫酸化，表明在CS中未发现序列特异相互作用。因此，有可能的是亚硝酸处理后所观察到的残余峰可能含有少量带有C4S或DS的4-O-硫酸盐。
进一步研究显示，可商购的HS和肝素均未对肽柱保持任何明显的亲合力。用于该测定的HS商购自Sigma-Aldrich并且来源于牛肾。考虑到对HS组织特异性的了解，从牛肾来源中分离的这种可商购的HS有可能带有特异性地介导与BMP2的相互作用所需要的可忽略的碳水化合物序列。类似地，LMW和HMW肝素均未对肽柱表现出任何亲合力。用于该分析的肝素也购自Sigma-Aldrich，并且来源于猪肠粘膜。
尽管已经很好地描述了肝素与抗凝血酶III的相互作用，以及它在敏感分子分离中的多种作用，但是由于其均一的硫酸化，一般不认为肝素与生长因子的相互作用是特异性的。然而，考虑到肝素通常用于分离BMP2，有些出人意料的是两种肝素样品中无一与肽柱的相互作用达到任何显著程度。
肽柱与肝素之间缺乏相互作用的另一种可能是由于两种分子之间分子量的差异。连接到柱上的小BMP2-HBP可能难以维持它与较大的高度硫酸化的肝素链的结合。然而，肝素酶切割的肝素不能与柱结合似乎表明对柱使用全长肝素的空间效应不是破坏糖与BMP2-HBP之间可能相互作用的唯一原因。对于商购肝素不能与BMP2-HBP柱结合来说，还没有发现非常明确的原因，尽管可以假定通过间隔区链将BMP2-HBP与其结合的珠在空间上进一步分开可以有助于改善该问题。
总结
在本研究中，我们证明了使用亲合色谱分离带有对BMP2-HBP的特异亲合力的糖胺聚糖亚组，并且显示了该程序获得可复现结果的可能性。在我们对基于基质的GAG与BMP2之间相互作用的这部分研究中，我们对参与介导这种结合的GAG类型以及它们的结构进行了几项观察。
我们的结果表明，硫酸类肝素用于调节BMP2对前成骨细胞ECM所具有的大部分亲合力，这是逐渐被认为负责调节BMP2活性的相互作用。此外，我们研究了根据对BMP2肝素结合位点的亲合力分离ECM保留的GAG的可能结构，并得到了出人意料的结果。
我们的数据表明全长BMP2GAG+链不是由对BMP2具有特异亲合力的各个结构域并且在这些结构域之间间隔了对该因子具有较低或不具有亲合力的区域所组成的。相反，我们的结果表明这些GAG+链是由多个BMP2-结合结构域重复组成的。该结果在几种水平上都是出人意料的。首先，完成在全长＞20kDa的碳水化合物链上的这种观察所需的重复表明存在一定方式的合成模板。的确，尽管上述研究已不能获得组装组织特异性GAG链的模板，但是存在这种特异性的确切事实支持存在基于模板的系统。尽管尚未对该过程阐明基因组模板，但是存在一定可能性的蛋白质组学模板，或者可能是酶模板。
第二，该观察现象提供了一些有关BMP2与GAG之间相互作用的重要性的证据。可能需要沿碳水化合物链长度上的BMP2亲合力位点的多个重复以确保BMP2与ECM的最大结合。已表明这种特定的结合显著地延长了该因子的半衰期，并且可能负责维持显著的局部浓度以维持信号发送。可替代地，一些研究提出了模型，借此由于与基于ECM的GAG之间的相互作用，在空间上抑制了BMP2与其受体的相互作用。在这种特定的方案中，BMP2亲合序列的重复将确保该因子的最大结合，因此降低了它与其受体相互作用的机会。
我们的累积性结果表明用于将GAG与ECM分离的这种系统是可行的并且有可能获得对BMP2具有特异亲合力的GAG链。
本研究支持了有关GAG与BMP2之间相互作用的上述发现。尽管通过加入外源GAG+来防止BMP2与ECM体外结合似乎提高了BMP2的信号并且上调了成骨基因的表达，但是还报道了相反的观察现象。在这些研究中，通过HBP对BMP2调节的体内检查显示当与ECM GAG的结合得到提高时，长期骨生成得到显著改善。这种相互作用有可能是通过防止该因子扩散远离基本活性位点以在维持局部浓度中起到重要作用。按照这些研究和我们自己观察到的现象，我们提出了通过其与GAG的结合正调和负调了BMP2的活力。通过Katagiri及同事所提出的模型可以精确地发生负调，由此BMP2远离其受体在ECM中的保留导致BMP2信号的下调。然而，需要通过该因子发送信号的细胞可以潜在地分泌各种酶(如硫酸酯酶和肝素酶)以使细胞外糖链再成型，从而“剪开”保留ECM中BMP2的GAG，借此释放该因子并允许其发送信号，从而导致BMP2-ECM的相互作用最终成为细胞因子活力正维持中的一种。可替代地，通过细胞表面GAG的BMP2负调控可以是通过GAG链与它们相关BMP2分子的内化作用进行的，如Jiao及同事所观察到的。
这些上述研究结合我们自己的观察使我们得到以下结论：BMP2与硫酸肝素(heparin sulfate)之间的序列特异性相互作用代表了能够正调控和负调控BMP2信号的复杂控制机理。在生理学上，该相互作用负责在胚胎发育、前体提交和伤口愈合等多个方面迫使对该强效细胞因子产生背景依赖性应答。
实施例2-BMP2肽特异性HS的纯化
我们使用来自成熟BMP-2序列的具有肝素结合性质的肽来鉴别与该肽结合的新型HS。
成熟BMP-2氨基酸序列：
QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVL
肝素结合肽的氨基酸序列：
QAKH KQRKRLKSSCKRHP    [SEQ ID NO：1]
为了复制肝素结合位点的天然存在形式，我们在其C-末端对该肽进行生物素化并且保留了脯氨酸(P)以改善该肽一旦结合到抗生蛋白链菌素柱上的柔性/可接近性。
BMP2肽特异性HS的分离
所使用的材料包括BMP2-肽偶联的抗生蛋白链菌素柱、HiPrep脱盐柱(GE Healthcare)、20mM PBS+150mM NaCl(低盐缓冲液)、20mMPBS+1.5M NaCl(高盐缓冲液)、HPLC级水(Sigma)、Biologic-Duoflow色谱系统(Bio-Rad)和冷冻干燥机。
用低盐缓冲液平衡该柱，并且将1mg的Sigma HS(H9902)溶于低盐缓冲液并通过BMP2-抗生蛋白链菌素柱。通过清洗低盐缓冲液(20mMPBS，pH 7.2，150mM NaCl)直至232nm下的流出液吸光度几乎返回为零为止，将未结合的媒介组分从柱上除去。用高盐缓冲液(20mM PBS，pH 7.2，1.5MNaCl)洗脱结合到基质上的HS。混合峰组分并冻干48小时。
将1mg HS应用于该柱，并且用含有低(150mM)NaCl浓度的20mMPBS缓冲液清洗。在用低盐缓冲液清洗后，用含有高(1.5M)NaCl浓度的20mM PBS缓冲液洗脱结合的HS。收集表示保留流分的峰(在232nm处监测)并进行进一步脱盐。
冷冻干燥后，获得了6mg阳性HS(GAG+)和1.8mg阴性HS(GAG-)。
实施例3-BMP-2特异性硫酸类肝素的评价
C2C12为小鼠间充质干细胞，其通常表现出生肌分化但是能够通过在第3代时添加BMP-2诱导为成骨系。将第3代C2C12细胞保持在具有1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、10％FCS、1％P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM中(维持培养基)。
将加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5％FCS、1％P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM用作分化培养基。
BMP-2对骨生成的影响
我们通过测量成骨标记物(骨钙素、奥斯特利斯(osterix)、Runx2)的表达水平评价了外源BMP-2对骨生成的影响。
通过测定将不同量(100ng/ml和300ng/ml)的BMP-2加入至细胞中的影响，我们观察到了与加入300ng/ml BMP-2相比，在第5天时加入100ng/ml BMP-2的细胞中奥斯特利斯(osterix)、骨钙素和Runx2的表达显著降低(图27-图29)。因此，由于任何变化应易于观察，所以我们选择该时间点用于今后的测试。
材料和方法
使用了第3代的C2C12细胞。以1×106个细胞/瓶，将第3代细胞保持在液氮中。一旦从液氮中取出细胞，我们加入500μl培养基，来回吸取以使细胞再冻结并立即加入15ml培养基。
培养基为加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、10％FCS、1％P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM。处理培养基为加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5％FCS、1％P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM。
在从培养基中收获前，允许C2C12细胞生长至75％汇合(通常2至3天)。
如下进行细胞计数。首先吸取/弃去培养基；加入15ml PBS，弃去PBS并加入3ml胰蛋白酶，在37℃温育5分钟以将细胞从烧瓶中提高。加入9ml培养基以中和胰蛋白酶。使用GUAVA确定用于随后在实验板上进行细胞接种的细胞量。例如，对于3组12孔板，30000细胞×36孔×3.7cm2＝4,000,000个细胞。从母液中稀释细胞，并且加入用于细胞接种的所需量的培养基(每个孔需要500μl包含30,000个细胞的培养基)。
要制备BMP2母液，将10μg rhBMP2(骨形态发生蛋白2)再悬浮于100μl的4mM HCl/0.1％BSA中。
使用了以下的RNA提取方案。将350μl RA1缓冲液用于细胞溶解。将细胞与RA1一起在-80℃冷冻1天，然后将细胞融化并且将裂解物在11,000g过滤1分钟。将过滤液与350μl 70％的乙醇在1.5ml管中混合并在11,000g离心30s。加入350μl MDB缓冲液并将混合物在11,000g离心1分钟。加入95μl DNA酶反应混合物并将混合物在室温下保持至少15分钟。然后，用200μl的RA2缓冲液清洗(以使DNA酶失活)，并且在11,000g离心30s。用600μl RA3缓冲液清洗，并且在11000g离心30秒。用250μlRA3缓冲液清洗，并且在11,000g离心2分钟。用60μl不含RNA酶的H2O洗脱RNA，并且在11,000g离心1分钟。使用Nanodrop测量浓度(以ng/μl为单位)。
如下进行RT(反转录)实验。在PCR管中混合下列物质：随机引物(0.1μl)、DNTP(1μl)、RNA(250/500ng)、不含RNA酶的H2O(装满至最终体积为13μl)。在65℃温育5分钟。在冰上温育至少1分钟。收集内含物并且在加入以下物质前简单离心：第一链缓冲液(4μl)、DTT(1μl)、RnaseOUT(1μl)、SSIII反转录酶(1μl)。加满至最终体积为20μl。通过来回吸取进行混合。在室温下温育5分钟。在50℃温育60分钟。在70℃使反应失活15分钟。
在不同天中进行两次反转录实验，并且将PCR产物混合在一起并稀释至2.5ng/μl的最终浓度以用于随后的实时PCR。
使用
Figure BDA0000060318390000701
快速通用PCR master Mix(2×)(Applied Biosystem)进行实时PCR。将PCR master Mix(10μl)、ABI探针(1μl)、cDNA(1μl)、ddH2O(8μl)、GAPDH和β肌动蛋白用作相对于实验标靶OSX(osterix)、OCN(骨钙素)和Runx2对照基因。
BMP-2特异性HS GAG+对骨生成的影响
通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)测量成骨标记物(osterix、Runx2、碱性磷酸酶和Bspll)的表达水平，我们评价了实施例2中分离的BMP-2特异性HS(GAG+)对骨生成的影响。准备了时间过程以比较标志物在10天过程中的表达从而将对照与低和高剂量BMP-2进行比较，其中高剂量是诱导细胞分化的最优条件。
材料和方法
将细胞以30,000个细胞/cm2接种到维持培养基中并保持进行连接过夜。第二天，我们将其转换为含有以下物质的分化培养基：
●无添加物
●100ng/ml BMP-2(阳性对照)
●100ng/ml BMP-2+30μg/ml-GAG(阴性GAG)
●100ng/ml BMP-2+30μg/ml+GAG(阳性GAG)
●100ng/ml BMP-2+30μg/ml肝素(Sigma#H3149)
●100ng/ml BMP-2+30μg/ml总硫酸类肝素(Sigma#H9902-分离前的HS)
将碳水化合物和BMP-2以最小可能体积混合在一起，并且在将它们加入到培养基和细胞上之前在室温下温育30分钟。
5天后，使用Macherey-Nagel试剂盒提取RNA并进行反转录。
如我们在图30-图33中所示出的，来自猪粘膜的硫酸类肝素(总HS)可以提高BMP-2的活力(通过GAG+诱导的碱性磷酸酶、osterix、Bspll和Runx2表达的提高所显示的)并且这种活力包含在结合BMP2的流分中(阳性GAG)。这意味着我们可以通过将它们通过BMP-HBD肽柱来分离商购HS的BMP提高的流分。
实施例4
在添加了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素的αMEM培养基中每72小时扩增MC3T3-E1(s14)前成骨细胞(从胚胎颅顶建立起的小鼠胚胎颅顶成纤维细胞系)直至产生了用于铺板的足够细胞为止。通过在添加了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、25μg/ml抗坏血酸、10mMβ-磷酸甘油和青霉素/链霉素的αMEM培养基中以5×104个细胞/cm2铺板使细胞分化。每72小时更换培养基，进行8天，此时收获细胞和培养基。通过高速离心并且通过0.4μm过滤器过滤使培养基保留和澄清。使用细胞刮刀和含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、1％CHAPS、8M尿素和0.02％NaN3的提取缓冲液使细胞层破碎。
在所有阶段(除非另外说明)，在将样品加载到柱系统上之前使样品澄清。该过程包括在5,000g高速离心30分钟，并通过0.4μm注射器式过滤器过滤。在加载通过柱系统前，始终使样品澄清以防止在不流动的溶液中形成沉淀物。
使用阴离子交换色谱从培养基和细胞层样品中分离蛋白糖胺聚糖(PGAG)流分。在每种情况下，将培养基或细胞层样品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统(Biorad)上通过装填了Capto Q阴离子交换珠(Biorad)的Pharmacia XK 26(56-1053-34)柱。在含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、100mM NaCl、0.02％NaN3的低盐缓冲液(pH 7.3)中加载样品。在含有PBS(150mM NaCl w/oCa2+和Mg2+)、850mM NaCl和0.02％NaN3的高盐缓冲液(pH 7.3)中洗脱样品。收集相关流分并混合成单一的PGAG样品，并且冻干以备用于脱盐。
将PGAG样品以10ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统(Biorad)中通过四个顺序连接的Pharmacia HiPrepTM26/10(17-5087-01)柱进行脱盐。收集相关部分并混合成单一样品组，并且冻干以准备用于进一步处理。
在第四步中，对从脱盐程序中获得的PGAG样品组进行链霉蛋白酶和神经氨酸酶处理以消化掉核心蛋白质并随后释放GAG链。在这个方面，将冻干的PGAG样品再悬浮于最小体积的25mM醋酸钠(pH 5.0)中并通过0.4μm注射器式过滤器过滤澄清。将总样品体积以500μl等份分配到10ml玻璃管中。向该等份中加入500μl 1mg/ml的神经氨酸酶，然后将混合物在37℃温育4小时。温育后，将5ml 100mM的Tris-乙酸盐(pH 8.0)加入至每个样品。将在500mM的Tris-乙酸盐和50mM乙酸钙(pH 8.0)中复原的另外1.2ml 10mg/ml的链霉蛋白酶加入到每个样品中，然后将混合物在36℃温育24小时。在该处理后，合并所有体积并通过离心和过滤准备用于阴离子交换色谱。
在第五步中，在蛋白切割后将分离的GAG样品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统(Biorad)上通过装填了Capto Q阴离子交换珠(Biorad)的Pharmacia XK 26(56-1053-34)柱洗脱。在这个方面，在含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)和0.02％NaN3的低盐缓冲液(pH 7.3)中加载样品。在含有PBS(150mM NaCl w/oCa2+和Mg2+)、850mM NaCl和0.02％NaN3的高盐缓冲液(pH 7.3)中洗脱样品。将相关部分混合、冻干并根据用于PGAG样品脱盐的上述方案进行脱盐。
将对应于BMP-2的肝素结合结构域并且包含QAKHKQRKRLKSSCKRH[SEQ ID NO：6]所表示的氨基酸序列的N-末端生物素化的肽(1mg)与含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)的低盐缓冲液混合。通过装填了抗生蛋白链菌素涂覆的树脂基质的柱洗脱混合物。然后，将该柱暴露于含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、850mM NaCl和0.02％NaN3的高盐缓冲液(pH 7.3)以确定在那些条件下所述的肽是否与基质牢固地结合。未观察到肽从该柱上的明显损失。随后，用制备样品加载的低盐缓冲液清洗该柱。
将使用实施例1中所提到的程序分离的GAG混合物(2mg)悬浮于低盐磷酸钠缓冲液(1mL)，并加载到实施例2所述的肽柱上。用含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)的低盐缓冲液洗脱该样品。在UV-Vis检测器示踪中观察到了对应于具有可忽略的BMP-2亲合力的GAG的峰。合并导致产生该峰的柱流分。这些流分被称为“GAG-”-减号表示对该柱缺乏亲合力。当在UV-Vis检测器中明显可以看出示踪拉平至基线并且不再有寡糖洗脱时，将洗脱溶剂更换为含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、850mM NaCl和0.02％NaN3的高盐缓冲液(pH 7.3)。更换冲洗溶剂后，在UV-Vis检测器示踪中观察到了对应于BMP-2特异性GAG的峰。合并导致产生该峰的柱流分。这些流分被称为“GAG+”-加号表示对该柱存在亲合力。对于来源于前成骨细胞的GAG化合物来说，GAG+流分代表整个GAG混合物的10％。
实施例5
BMP2的加入对诱导C2C12成肌细胞的成骨分化具有明显有限的能力。类似地，BMP2与肝素的预温育已显示出能够延长细胞因子的半衰期及其体外直接活力。本文中，我们检查了GAG+和GAG-流分通过BMP2增强C2C12细胞体外成骨诱导的能力。
将实施例4中的GAG+样品(0、10、100、1000ng/ml)在存在BMP-2(0、50、100ng/ml)的情况下体外加入到C2C12成肌细胞中。骨钙素基因相对表达的测量表明GAG+样品能够增强BMP-2从而在远低于目前在治疗中所使用的BMP-2(300ng/ml)的水平下使骨钙素基因表达。在图34中示出了该测定的结果(包括计算的p-值和误差)，其中每种“培养条件”的实验条件如下所示：
1、对照细胞，未加入BMP-2，未加入GAG
2、50ng/mL的BMP-2
3、50ng/mL的BMP-2、10ng/mL的GAG+
4、50ng/mL的BMP-2、100ng/mL的GAG+
5、50ng/mL的BMP-2、1000ng/mL的GAG+
6、100ng/mL的BMP-2
7、100ng/mL的BMP-2、10ng/mL的GAG+
8、100ng/mL的BMP-2、100ng/mL的GAG+
9、100ng/mL的BMP-2、1000ng/mL的GAG+
有趣的是，尽管1000ng/ml的GAG+能够显著增强BMP2介导的骨钙素表达，但是加入浓度低于1000ng/ml的GAG+似乎逐渐抑制了该表达。此外，加入足够的GAG+还能够使通过50ng/ml BMP2的骨钙素诱导超过仅加入100ng/ml BMP2的骨钙素诱导，从而表明了该相互作用的效力。
这种基于细胞培养的分析证明将GAG+连同BMP2加入到C2C12成骨培养物中导致骨钙素表达的显著上调，从而表明了BMP2信号效力的提高。该结果支持GAG+链与BMP2的特异性结合，借此阻断了BMP2-HBP并防止它与基于基质的PGAG的结合。成骨基因表达的所得的上调与利用肝素的上述研究中所观察到的结果可比较，从而达到了类似的作用。有趣地，加入浓度低于1000ng/ml的GAG+似乎对BMP2信号具有初始的拮抗作用。
解释该观察现象的一个可能假设是围绕着一定数量GAG+分子结合一定数量BMP2分子的能力进行的。在培养系统中未加入外源GAG+的情况下，大部分BMP2分子将能够与ECM结合，借此定位到远离它们的同源受体的位置并且不能立即引发信号。自发地和通过它们结合的GAG链的靶标酶改变，BMP2随后从ECM上的解离具有诱导长期BMP2信号的能力。如添加了1000ng/ml GAG+的样品中的情况，将大量GAG+分子加入到该系统中使得大部分BMP2分子保留在溶液中，在此它们能够自由地介导受体二聚作用并诱导下游信号。细胞因子/受体相互作用的这些过程可能需要特定的浓度阈值以维持有效的信号水平。在含有50ng/ml BMP2的培养条件下，低浓度GAG+的加入使得一部分可用的细胞因子仍保持溶解而其余部分与ECM结合。在这些条件下，仅有少量BMP2保持溶解，但是由于其浓度较低，因此将在培养基中高度扩散，从而导致产生了可忽略的信号。类似地，由于一部分BMP2保持溶解，因此ECM中可以存在较少量的BMP2，从而导致通过直接细胞活性从ECM中释放的BMP2的信号降低。然而，在含有100ng/ml BMP2的培养条件下，在加入100ng/mlGAG+的情况下，溶解的和基于ECM的BMP2的综合作用足以诱导与对照水平类似的BMP2信号。然而，在没有进一步研究的情况下，对涉及BMP2/GAG+信号的动态过程仍不清楚。利用表面等离子共振的今后的研究可以帮助阐明BMP2/GAG+相互作用的效力并且可以辅助解释这些观察现象。
实施例6
根据以下的方法，使用类肝素酶3切割实施例4中的GAG+和GAG-糖链。分别用类肝素酶3(250mU酶/100μg寡糖)对浓度为4mg/mL的GAG+和GAG-在37℃处理16小时。随后，将混合物在70℃加热5分钟使类肝素酶3失活。对消化的GAG+和GAG-混合物分别单独通过肽柱进行处理。每个色谱运行的UV-Vis检测器示踪表明消化的材料对该柱表现出与未消化材料相同的亲合力。
实施例7
生物素化肽与抗生蛋白链菌素柱的偶联
方法：以1mg/ml的浓度，将BMP2HB-肽溶解于含有150mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(低盐缓冲液)中。使用低压液相色谱(Biologic-Duoflow色谱系统，Bio-Rad)，将肽溶液在用低盐缓冲液平衡的抗生蛋白链菌素柱(1ml)上进行亲合色谱。以0.2ml/min的流速加载培养基，并且用相同的缓冲液清洗该柱直至基线为零。要检查肽确实连接到该柱上，用1.5M NaCl(高盐缓冲液)的分级梯度对柱进行洗脱并用低盐缓冲液重新平衡。
合成了BMP2肝素结合位点(5mg)序列(QAKHKQRKRLKSSCKRHP-NHET生物素(SEQ ID NO：1))并偶联到1ml抗生蛋白链菌素柱(GE Healthcare)上。色谱图(图36)显示所有肽均紧密结合在抗生蛋白链菌素柱上。
BMP2-特异性硫酸类肝素的纯化
方法：以1mg/ml的浓度，将Celsus HS溶解于含有150mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(低盐缓冲液)中。使用低压液相色谱(Biologic-Duoflow色谱系统，Bio-Rad)，将肽溶液在用低盐缓冲液平衡的抗生蛋白链菌素柱(1ml)上进行亲合色谱。以0.2ml/min的流速加载培养基，并且用相同的缓冲液清洗该柱直至基线为零。用1.5M NaCl(高盐缓冲液)的分级梯度洗脱结合的BMP2特异性HS，收集峰流分并用低盐缓冲液重新平衡该柱。分别收集洗脱峰(BMP2+ve)和流过峰(BMP2-ve)，将它们冻干并在-20℃保存。
色谱图(图37)显示了特异地结合在柱上的一小部分HS(～15-20％)并且它在高盐缓冲液中洗脱。
BMP2肽柱结合的HS的脱盐
方法：将BMP2特异性HS溶解于10ml蒸馏水中。使用低压液相色谱(Biologic-Duoflow色谱系统，Bio-Rad)，将样品在用蒸馏水平衡的Hi-prep脱盐柱(10ml)上进行脱盐色谱。将HS以10ml/min的流速加载并用蒸馏水清洗该柱。收集纯HS流分，将其冻干并在-20℃保存。
色谱图(图38)显示了纯BMP2特异性HS(吸光度峰)与盐缓冲液(电导率峰)的完全分离。
BMP2肽柱未结合的HS的脱盐
方法：将非特异性HS溶解于10ml蒸馏水中。使用低压液相色谱(Biologic-Duoflow色谱系统，Bio-Rad)，将样品在用蒸馏水平衡的Hi-prep脱盐柱(10ml)上进行脱盐色谱。将HS以10ml/min的流速加载并用蒸馏水清洗该柱。收集纯HS流分，将其冻干并在-20℃保存。
色谱图(图39)显示了未结合的HS(吸光度峰)与盐缓冲液(电导率峰)的完全分离。
SAX-HPLC二糖分析-BMP2阳性HS
方法：将样品(100μg)溶解于100mM醋酸钠/0.2M醋酸钙中(pH 7.0)。肝素酶、类肝素酶I和II均以10mU/ml的浓度在相同缓冲液中使用。将每个样品顺序消化以回收二糖用于SAX-HPLC分析；对于此，将样品如下所示在37℃进行消化：肝素酶消化2h，类肝素酶I消化1h，类肝素酶II消化18h，并且最后用每种裂合酶的等份消化6h。在用0.25M NH4HCO3平衡的BioGel P-2柱(1×120cm)上运行样品。将二糖峰冻干，然后溶于酸化水(用HCl酸化，pH 3.5)中。将其通过连接到高压液相色谱系统上的ProPac PA-1SAX-HPLC柱(Dionex，USA)，并且以1ml/min的流速在60分钟内用0至1.0M NaCl(pH 3.5)的线性梯度洗脱HS二糖。在A232nm监测使用HS二糖标准品(Seikagaku，Tokyo，Japan and Iduron)鉴别的峰。
通过暴露于肝素裂合酶(肝素酶、类肝素酶I和II)的组合至完成，然后将所得的二糖片段进行强阴离子交换HPLC(SAX-HPLC)，对BMP2肽亲合柱保留的HS进行酶二糖分析。色谱图(图40)上的峰使我们能够估计结合HS的群组中每种组成二糖的相对比例。该分析显示BMP2结合肽HS群组中较大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。
SAX-HPLC二糖分析-BMP2阴性HS
通过暴露于肝素裂合酶(肝素酶、类肝素酶I和II)的组合至完成，然后将所得的二糖片段进行强阴离子交换HPLC(SAX-HPLC)，对BMP2肽亲合柱不保留的HS进行酶二糖分析。色谱图(图41)上的峰使我们能够估计HS群组中每种组成的二糖的相对比例。该分析显示流过的HS群组中较大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。
Celsus总HS的SAX-HPLC二糖分布图
通过暴露于肝素裂合酶(肝素酶、类肝素酶I和II)的组合至完成，然后将所得的二糖片段进行强阴离子交换HPLC(SAX-HPLC)，还对作为起始材料购自Celsus的总HS进行了酶二糖分析。色谱图(图42)上的峰使我们能够估计HS群组中每种组成二糖的相对比例。
ESPR-BMP2阳性和BMP2阴性HS的分析
方法：将BMP2+ve和-ve HS(10mg/ml)溶解于1ml 0.1M的MES(pH5.5)中，并且将含有2mg/ml生物素-LC-酰肼(Pierce)、EDC(7mg)的300μl的0.1MES(pH 5.5)加入到混合物中，并且在室温下温育2h，然后加入另外7mg的EDC。另外温育2h后，用脱盐柱(Amersham Pharmacia)除去未掺入的生物素。对BMP2+ve和-ve HS测试它们结合溶解的BMP2的能力。使用SPR进行实时结合分析，其中将生物素硫醇涂覆的金传感器芯片用作固定化抗生蛋白链菌素的平台。使用生物素-抗生蛋白链菌素-生物素桥，可以将生物素化的HS固定在传感器芯片上。然后，将生长因子(200nM)加入到浸泡固定化HS的溶液中，并温育20min。通过测量最小反射角(θ)随时间的变化来监测实时结合。
图44显示了蛋白质-糖相互作用的表面等离子共振(SPR)分析。如曲线所示，其反映“结合率(on-rate)”的强度(Ka)，如较小的角迁移所证明的，BMP2与“流过”的HS的结合不如与BMP2-结合HS的结合强。
涂覆在lduron肝素/GAG结合板上的BMP2+ve和BMP2-ve Celsus HS制剂 的BMP2结合能力
方法：将BMP2以3μg/ml的浓度溶解于阻断溶液(0.2％的明胶在SAB中的溶液)，并且用阻断溶液建立0-3μg/ml的稀释系列。将200μl的BMP2的每种稀释液分配到用肝素预涂覆的肝素/GAG结合板的三个孔中；在37℃温育2小时，用SAB和加入到阻断溶液中的200μl 250ng/ml的生物素化抗-BMP2小心清洗三次。在37℃温育1小时，用SAB、加入到阻断溶液中的200μl 220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次。在37℃温育30分钟，用SAB和自来水小心清洗三次以除去残余液体，加入200μl显色试剂(SigmaFAST磷酸对硝基苯酯)。在室温下温育40分钟，并且在1小时内在405nm读数。
特别制备的板表面(lduron)吸附未修饰的GAG，并且同时保留了它们的蛋白结合特征。在室温下，在生理缓冲液中发生结合。结果(图45)证明BMP2选择性HS制剂对BMP2的亲合力比对流过或天然制剂的亲合力更大。BMP2用作对照。
C2C12细胞上BMP2阳性和阴性HS的ALP活力
方法：ALP测定。在37℃/5％CO2的条件下，将C2C12细胞以20,000个细胞/cm2铺板在24孔板中含有10％FCS(Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1％青霉素和1％链霉素)(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)的DMEM(Sigma-Aldrich Inc.St.Louis，MO)中。24小时后，将培养基转换为5％FCS低血清培养基，其中含有100ng/mL BMP2(R & D Systems，Minneapolis，MN)、3mg/mL Celsus HS和不同浓度的BMP2特异性(+veHS)和非特异性(-ve HS)Celsus HS制剂的不同组合。3天后，使用含有1％Triton X-100、150mM NaCl、10mM Tris(pH 7.4)、2mM EDTA、0.5％的意格倍(Igepal，NP40)、0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)和1％的蛋白酶抑制剂混合组III(Calbiochem，Germany)的RIPA缓冲液进行细胞溶解。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)确定细胞裂解物的蛋白质含量。然后，通过将细胞裂解物与磷酸对硝基苯酯底物(Invitrogen，Carlsbad，CA)温育来确定细胞裂解物中的ALP活力。将读数归一化为总蛋白量并且表示为对于仅包含BMP2处理的组的相对量。
图46显示与非特异性HS(-ve HS)相比，BMP-2特异性HS(+ve HS)对BMP-2诱导的碱性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。将100ng/mL的BMP-2单独引入或结合30μg/mL的Celsus HS或不同浓度的特异性和非特异性HS引入。单独引入30μg/mL的特异性和非特异性HS。
ALP染色
方法：ALP染色。如上所述，温育C2C12细胞。处理3天后，用PBS清洗细胞层并且根据生产商的说明，使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)染色。简要地，将细胞层固定在柠檬酸盐缓冲的60％的丙酮中，并在含有萘酚AS-MX碱性磷酸酶和重氮盐的碱性染料混合物中染色。使用迈尔苏木紫溶液进行核染色。
当通过组织化学评价时(图47)，与非特异性HS(-ve)相比，BMP-2特异性HS(+ve HS)对BMP-2诱导的碱性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。将100ng/mL的BMP-2结合0、0.3、3和30μg/mL的GAG引入。
BMP2稳定性
方法：Smad 1/5/8磷酸化。在37℃/5％CO2的条件下，将C2C12细胞以20,000个细胞/cm2铺板在24孔板中含有10％FCS(Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1％青霉素和1％链霉素)(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)的DMEM(Sigma-Aldrich Inc.St.Louis，MO)中。24小时后，将培养基转换为5％FCS低血清培养基。在细胞已经在低血清培养基中平衡24小时后，加入含有100ng/mL BMP2(R & D Systems，Minneapolis，MN)并且存在/不存在3mg/mL肝素(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)或BMP2特异性(+ve HS)Celsus HS的处理条件。在0、24、48和72小时的时间点处，在1×Laemmli缓冲液中收获细胞裂解物。在NuPAGE Novex4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中分离该裂解物，并使用抗磷酸-Smad 1/5/8(Cell Signaling，Danvers，MA)和Smad 1/5/8(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA)的抗体通过蛋白质印迹进行分析。
将BMP2结合的HS(即HS3)延长BMP2对细胞作用的能力(可能部分是通过保护蛋白不被蛋白水解降解)与商购肝素的作用进行比较。将C2C12细胞对无、仅BMP2、BMP2+肝素或BMP2+HS3暴露72小时，并通过免疫印迹监测BMP2特异性胞内信号分子Smad 1/5/8的磷酸化水平(图55)。结果表明HS3可以将BMP2信号延长至等于或超过肝素的水平。
实施例8
设计本实验以研究当与Smith&Nephew的骨填料JAXTM凝胶+磷酸三钙(TCP)星混合时，HS3是否可以加速长骨修复。
在成年兔的尺骨中造成不连接的严重缺损，在缺损处放置星，闭合伤口并且在4和8周后，使用组织学和成像的组合监测修复。
生物材料
JAXTM是由Smith and Nephew Orthopaedics Ltd，USA生产的β-磷酸三钙(TCP)合成骨代用品。JAXTM是由具有六个臂的颗粒组成的，其连结以在缺损位点提供55％的粒间孔隙度，从而允许细胞和血管渗入。临床适应征为4-5cm的非承重骨缺损。JAXTM还包括水凝胶组分。
体外研究
通过首先用Alexa Flour 488染料标记，然后监测其向培养板中PBS的释放评价了肝素以高或低浓度(作为HS的替代物)从JAX凝胶/TCP混合物的体外释放。两种情况下的释放均是快速和爆发式的。
肝素的荧光标记。对于非生物体外测定，使用我们的研究小组先前发表的方法(E.V.Luong，L.Grondahl，V.Nurcombe，S.Cool.In vitrobiocompatibility and bioactivity of microencapsulated heparan sulfate Biomaterials 2007；28：21272136)，将作为HS糖胺聚糖家族的超硫酸化成员的肝素与Alexa Fluor 488(A488，Molecular Probes，UK)连接。简言之，将3mg肝素(H-3149)溶解于300μL 0.1M的4-吗啉乙烷磺酸(MES，M3671)缓冲溶液(pH 4.5)并与50μL 10％的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)二亚胺碳盐酸盐(EDC，Fluka 03449)在0.1M MES缓冲液中的溶液混合。随后，将1％A488在0.1M MES缓冲液中的溶液(50l)加入到肝素/EDC溶液中。将混合物避光并在室温下温育过夜。将结合了荧光的肝素在Amersham PD10脱盐柱上洗脱。标记效率为约1.3mol A488/mol肝素。
释放分布图。将三种JAXTM颗粒与17或170μg的A488-肝素(50μl，在100μl水凝胶中)一同加载，避光，并且置于1mL PBS中，在37℃放置48h。在1、2、3、4、5、6、24和48h，采集100μL调节过的磷酸盐缓冲溶液(PBS)用于采样并用新鲜的PBS替换。通过荧光测定法定量释放的A488-肝素的浓度，并且将A488-肝素的积累释放报告为加载浓度的百分比(图57)。
体内研究
实验设计。(参见图56)对二十只雄性新西兰白兔(2-2.5公斤重)造成双侧尺骨缺损。将每种缺损随机分配到三个实验组之一。每个缺损接受18个JAXTM颗粒以及含有下列治疗剂之一的150μl水凝胶：30μg HS、100μg HS或等体积的PBS(50μL)。移植4和8周后，将兔处死并收获尺骨。使用2D X射线和微计算机断层(微CT)，非破坏性地评价了每种治疗的四块尺骨在两个时间点的矿物形成。随后，处理这些尺骨进行组织学和免疫组织化学研究。第8周，每种治疗加入另外三个样品用于扭力测试评价。将一些缺损保持为空以用作内部对照从而确保该模型确实是不连接的。
缺损位点中新骨形成的X射线监测
以两种不同的浓度(30和100μg，称为HS30和HS100)将HS3应用到Jax凝胶中，并且与无治疗剂相比，评价0、4和8周中的新骨形成。HS治疗的动物与对照相比表现出新骨形成的明显迹象。
射线照相分析。JAXTM颗粒是射线不透明的，并且因此难以通过2D X射线与缺损位点中的新骨进行区分。然而，在早期的时间点处，颗粒之间以及紧邻桡骨的空隙是清晰可见的并且可以监测这些空间中骨形成的进展(S.A.Clarke，N.L.Hoskins，G.R.Jordan，D.R.Marsh.Healing of an ulnardefect using a proprietary TCP bone graft substitute，JAXTM，in association with autologous osteogenic cells and growth factors.Bone 2007；40：939-947)。使用成像射线照相系统(MUX-100，shimadzu)来获得手术后即刻以及4周和8周时的尺骨缺损2D图像。然后，拍摄X射线的数字显微照片。在全身麻醉的情况下拍摄X射线照片。图52、图53和图58中示出了X射线显微照片。
缺损位点中新骨形成的微CT监测
使用微CT(计算机断层)成像(图52、图53和图59)，将手术时以30和100μg(HS30和HS100)剂量施用的HS3与仅有PBS星的对照进行比较。
微CT分析。在第4周和第8周，用微CT扫描仪(Skyscan 1076；Skyscan，比利时)扫描收获的尺骨。以35μm的分辨率和68mm的扫描宽度进行扫描。扫描仪设置为电压104kV，电流98μA。使用锥束CT-重建A Sasov软件(Skyscan)，将所获得的各向同性片层数据转换为2D图像。对于该重建来说，骨的上下阈值假定为-315和543豪恩斯菲尔德单位(Hounsfieldunit)。然后，使用用于定量的相关CTAn软件(Skyscan)和Mimics 11.1软件(Materialise，比利时)分析并重建数据以产生3D图像。对于所有的样品，将所关心的圆柱形区域(ROI，相对于缺损位点同心定位)和总片层数(对应于缺损的长度)保持恒定。通过对总含骨量、皮层骨(JAXTM和桡骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配预定阈值来测量ROI内新形成骨的总体积。将数据报告为骨体积/总体积(％)。
与对照相比，HS3(30μg和100μg剂量)显著提高了BV/TV(％)。HS30和HS100治疗的尺骨之间没有显著差异(图60)。
组织学
在指定的实验时间段后，收获骨，并将其固定、脱钙、切片并固定用于各种染料的染色。
图61和图62示出了3个治疗组在4和8周内的H&E染色(参见下文)。HS3的治疗清楚地显示与对照相比，有更多组织渗入缺损。
高倍放大的H&E染色显微照片(图62)显示新骨在紧邻Jax星处沉积(更清晰的岛)，其中HS治疗动物中出现了更大量的骨、骨髓和软骨组织。到第8周，HS治疗的尺骨中，新骨已再成型并成熟。
组织学分析。将提取的尺骨在真空下固定到10％中性缓冲福尔马林中，并且在室温下在15％的EDTA(pH 7.2)中脱钙4周。然后，以14h的程序，使用真空组织脱水机(Sakura Finetek，日本)处理尺骨。脱水并清洗后，将骨包埋在Paraplast石蜡(Thermo Scientific)中，并使用轮转切片机(Leica Microsystems，德国)将石蜡块以5μM纵向切片。将石蜡切片置于正电荷显微镜载玻片上，干燥，用苏木紫/伊红以及改性的四色染剂染色并且最后在Olympus Stereo(SZX12)和直立荧光显微镜(BX51)下检查。
图63和图64示出了4和8周内3个治疗组的Ralis四色染剂(Z.A.Ralis，G.Watkins.Modified tetrachrome method for osteoid and defectively mineralized bone in paraffin sections.Biotech and Histochem 1992；67：339-345)染色(参见下文)。HS治疗的缺损清楚地显示与对照相比，有更多组织渗入缺损。
高倍放大的Ralis四色染剂染色的显微照片(图64)显示新骨在紧邻Jax星处沉积(更清晰的岛)，其中HS3治疗动物中出现了更大量的编织骨、骨髓和毛细血管。到第8周，HS治疗的尺骨中，新骨已再成型并成熟。
免疫染色
在指定的实验时间段后，收获骨，并将其固定、脱钙、切片并固定用于各种染料的染色。图65示出了4和8周内3个治疗组的晚成骨标志物骨钙素的免疫染色(参见下文)。HS3治疗的样本清楚地显示与对照相比，有更多阳性(棕色)染色填充缺损。
骨钙素染色的高倍放大图(图66)显示新骨在紧邻Jax星处沉积(更清晰的岛)，其中存在由骨髓、毛细血管和成骨细胞划线的边界组成的更大量的再成型腔。
免疫组织化学分析。用PBS清洗脱石蜡的切片，并与蛋白酶XXIV(BioGenex，San Ramon，USA)温育10分钟以用于抗原修复，随后在室温下与0.3％的过氧化氢水溶液温育20分钟。清洗后，将切片用5％的正常山羊血清在PBS中的溶液封闭30min。将组织切片与适当浓度的第一抗体：骨钙素(ab13420，1∶150，Abeam，UK)或相同浓度的小鼠IgG(MG100，Caltage Lab，USA；作为阴性对照)在封闭缓冲液中在4℃温育过夜。用PBS清洗切片三次，然后与大鼠吸收的生物素标记的抗小鼠IgG(Vector Lab Inc，USA)一起温育1h。将切片用PBS清洗，并与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(ABC)溶液(Immunopure ABC过氧化物酶染色试剂盒，Vector Lab.Inc)温育1h。使用3，3-二氨基联苯胺-四氢氯(DAB；DAKO，USA)检测过氧化物酶活力。清洗切片，固定并使用OlympusSZX12立体显微镜在明视野显微镜下检查。
扭力测试
在指定的实验时间段后，测试骨的机械强度。图67示出了扭力测试装置。
扭力测试。在术后8周将兔处死，取出兔的尺骨，包裹在PBS渗透的纱布中以保持水分，并且在-20℃冷冻直至进行扭转测试。融化后，将尺骨末端放入盛放在定制塑料块中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair，Heraeus Kulzer)中，并使其固化从而能够稳定固定。随后，将尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II测试系统(MTS，Eden Prairie，MN)中。在测试之前，轻轻地除去聚合物块和纱布。然后，对每个样本测试扭转破损并记录所得的扭转角位移曲线。所使用的转速为每秒1度直至达到35度，并且以100Hz采集数据。对每个样本记录刚度、最大转矩和破损角度，其中将刚度测量为扭转角位移曲线的直线部分的斜率(M.Bostrom，J.M.Lane，E.Tomin，M.Browne，W.Berberian，T.Turek，J.Smith，J.Wozney，T.Schildhauer.Use of bone morphogenetic protein-2in the rabbit ulnarnon-union model.Clin Orthop Relat Res 1996；327：272-282)。
统计分析。以三次重复获得定量数据，并报告为平均值±标准偏差。使用学生氏t检验(GraphPad software)进行统计分析，认为p-值小于0.05为显著。
对照和HS治疗的尺骨中评价的刚度和最大转矩的定量。HS治疗骨的刚度得到显著改善。由于星占据了大部分的缺损，其成为新骨渗入的物理屏障，因此它导致了有限的(与显著相反)改善-参见图68。
实施例9-评价HS3加载的胶原海绵诱导的极限缺损中的骨再生
在第二项研究中使用了与实施例8相同的整个方法，除了用FDA批准的胶原海绵代替Jax TCP星。
生物材料。胶原海绵购自Integra Life Sciences(HELISTAT，Integra Life Sciences Corp，USA)并测量为7×21×5mm。从牛深屈肌腱加工得到了这些海绵，它们是生物可吸收的并且是无热原性的。
使用扫描电子显微术(SEM)评价了海绵的形态。简要地，用金溅涂胶原海绵，然后使用SEM(Jeol JSM 5310LV)以10kV的加速电压进行检查。
生物分子。本研究中测试的硫酸类肝素(HS)为骨形态发生蛋白(BMP)特异性HS，也称为HS3。
体内研究
本研究使用每片海绵加载30μg的HS3(HS30)和每片海绵加载10μg的BMP-2(BMP2-10)。产生双侧尺骨缺损并用HS30、BMP2-10或HS30+BMP2-10或PBS对照进行处理。
将HS3(30μg)单独或结合BMP2(10μg)应用到胶原海绵中，并且与无治疗相比评价了0、4和8周内的新骨形成。这些是相对于阴性胶原海绵对照和阳性BMP2对照评价的。
实验设计。对二十只雄性新西兰白兔(2-2.5公斤重)造成双侧尺骨缺损。将每种缺损随机分配到三个实验组之一。每个缺损接受浸有下列治疗剂(总计300μl，在PBS中)之一的1块胶原海绵：30μg HS、10μg BMP-2(有时称为BMP10)、30μg HS+10μg BMP-2或等体积的PBS。移植4和8周后，将兔处死并收获尺骨。使用2D X射线和微计算机断层(微CT)，非破坏性地评价了每种治疗的四块尺骨在两个时间点的矿物形成。随后，处理这些尺骨进行组织学和免疫组织化学研究。第8周，每种治疗加入另外三个样品用于扭转测试评价。将一些缺损保持为空以用作内部对照从而确保该模型确实是不连接的。
手术程序。在兔中进行双侧尺骨截骨术的研究方案通过了动物护理和使用学会的批准，并且按照所有适当的指导进行。所有手术程序均在全身麻醉和无菌条件下进行。麻醉包括氯胺酮(75mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)注射剂的组合以及通过吸气室和面具用于维持的异氟烷。切开6厘米的皮肤切口并且将叠加肌肉层分开直至暴露出尺骨的长度。使用Acculan在中央骨干产生1.5厘米的纵向缺损。
射线照相分析。使用成像射线照相系统(MUX-100，shimadzu，日本)来捕获手术后即刻以及4周和8周时的尺骨缺损2D图像。然后，拍摄X射线的数字显微照片(图69-图70)。在全身麻醉的情况下拍摄X射线照片。胶原海绵不是射线不透明的；因此它易于在2D X射线上鉴别缺损位点中的新骨。
4周后监测的X射线显示与阴性对照相比，在所有治疗情况下有大量新骨填充缺损位点(图70)。
8周后监测的X射线显示所有治疗均实现骨连接，但是在阴性对照中未实现(图71)。有趣地，单独递送HS3所产生的骨连接与BMP2的情况一样好，由于已达到最大，因此HS3结合BMP2不会加速该作用。
微CT分析。在第4和8周，用μCT扫描仪(Skyscan 1076；Skyscan，比利时)扫描收获的尺骨。以35μm的分辨率和68mm的扫描宽度进行扫描。扫描仪设置为电压104kV，电流98μA。使用锥束CT-重建A Sasov软件(Skyscan)，将所获得的各向同性片层数据转换为2D图像。对于该重建来说，骨的上下阈值假定为315和543豪恩斯菲尔德单位。然后，使用用于定量的相关CTAn软件(Skyscan)和Mimics 11.1软件(Materialise，比利时)分析并重建数据以产生3D图像。对于所有的样品，将所关心的圆柱形区域(ROI，相对于缺损位点同心定位)和总片层数(对应于缺损的长度)保持恒定。通过对总含骨量、皮层骨(桡骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配预定阈值来测量ROI内新形成骨的总体积。将数据报告为骨体积/总体积(％)-参见图72。
4和8周后，处理组中总体积的百分比骨体积(BV/TV)的微CT定量确认单独使用HS3的效果与FDA批准的BMP2的效果显著可比较(图72)。
扭力测试。在术后8周将兔处死，取出兔的尺骨，包裹在PBS渗透的纱布中以保持水分，并且在-20℃冷冻直至进行扭力测试。融化后，将尺骨末端放入盛放在定制塑料块中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair，Heraeus Kulzer)中，并使其固化从而能够稳定固定。随后，将尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II测试系统(MTS，Eden Prairie，MN)中。在测试之前，轻轻地除去聚合物块和纱布。然后，对每个样本测试扭转破损并记录所得的扭转角位移曲线。所使用的转速为每秒1度直至达到35度，并且以100Hz采集数据。对每个样本记录刚度、最大转矩和破损角度，其中将刚度测量为扭转角位移曲线的直线部分的斜率(M.Bostrom，J.M.Lane，E.Tomin，M.Browne，W.Berberian，T.Turek，J.Smith，J.Wozney，T.Schildhauer.Use of bone morphogenetic protein-2in the rabbit ulnarnon-union model.Clin Orthop Relat Res 1996；327：272-282)。
统计分析。以三次重复获得定量数据，并报告为平均值±标准偏差。使用学生氏t检验(GraphPad software)进行统计分析，认为p-值小于0.05为显著。
对照、BMP2和HS治疗的尺骨中评价的刚度和最大转矩的定量。对于治疗组，刚度和最大转矩均得到显著改善。显著地，单独使用HS3的治疗在第8周时导致产生了类似于BMP2治疗的机械性质和完整的骨(图73)。
Figure IDA0000060318480000011
Figure IDA0000060318480000031
Figure IDA0000060318480000041

Claims (53)

1.硫酸类肝素HS/BMP2。
2.分离的或基本纯化形式的HS/BMP2。
3.根据权利要求1或2所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2能够结合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求3所述的HS/BMP2，其结合至SEQ ID NO：1的KD小于100μM。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2为N-硫酸化的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2为6-O-硫酸化的。
7.一种获得权利要求1至6中任一项所述的HS/BMP2或者分离的或基本纯化形式的HS/BMP2的方法，包括：
(i)提供固体载体，其具有附着于所述载体上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的肝素结合结构域；
(ii)使所述多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触从而使得能够形成多肽-糖胺聚糖复合物；
(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与所述混合物的其余部分分开；
(iv)使糖胺聚糖从所述多肽-糖胺聚糖复合物解离；
(v)收集解离的所述糖胺聚糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述包含糖胺聚糖的混合物获自成骨细胞细胞外基质材料。
9.一种组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的HS/BMP2和BMP2蛋白。
10.一种药物组合物或药剂，包含根据权利要求1至8中任一项所述的HS/BMP2。
11.根据权利要求10所述的药物组合物或药剂，其用于治疗方法中，所述方法包括断骨的修复和/或再生。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物或药剂，还包含BMP2蛋白。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物或药剂，其中，所述药物组合物或药剂还包含间充质干细胞。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的HS/BMP2，用于医疗方法中。
15.在根据权利要求14或15所述的医疗方法中使用的HS/BMP2，其中，所述医疗方法包括体内伤口愈合的方法。
16.在根据权利要求14或15所述的医疗方法中使用的HS/BMP2，其中，所述医疗方法包括结缔组织的修复和/或再生。
17.在根据权利要求14或15所述的医疗方法中使用的HS/BMP2，其中，所述医疗方法包括骨的修复和/或再生。
18.在根据权利要求14所述的医疗方法中使用的HS/BMP2，其中，所述治疗方法包括哺乳动物或人的骨的修复和/或再生。
19.根据权利要求1至8中任一项所述的HS/BMP2在制备用于哺乳动物或人的断骨修复和/或再生的药剂中的应用。
20.一种生物相容性植入物或假体，包含生物材料和HS/BMP2。
21.根据权利要求20所述的植入物或假体，其中，所述植入物或假体涂覆有HS/BMP2。
22.根据权利要求20所述的植入物或假体，其中，所述植入物或假体浸渍有HS/BMP2。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的植入物或假体，其中，所述植入物或假体还涂覆或浸渍有BMP2蛋白和/或间充质干细胞。
24.一种形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括用HS/BMP2涂覆或浸渍生物材料的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述方法还包括用BMP2蛋白和间充质干细胞中的一种或两种涂覆或浸渍所述生物材料。
26.一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者给予治疗有效量的HS/BMP2。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述方法包括向骨折周围的组织给予HS/BMP2。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中，HS/BMP2的给予包括将HS/BMP2注射至骨折周围的组织。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中，将所述HS/BMP2配制成包含HS/BMP2和药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物或药剂。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括向所述患者给予BMP2蛋白。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，将所述HS/BMP2和BMP2蛋白配制为包含HS/BMP2和BMP2蛋白以及药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括向所述患者给予间充质干细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，将HS/BMP2、BMP2蛋白和间充质干细胞中的至少两种配制为包含HS/BMP2、BMP2蛋白和间充质干细胞中的至少两种以及药用载体、佐剂或稀释剂的药物组合物。
34.一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括将生物相容性植入物或假体手术植入到在所述骨折部位处或骨折部位周围的所述患者组织中，所述植入物或假体包含生物材料和HS/BMP2。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假体涂覆有HS/BMP2。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假体浸渍有HS/BMP2。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中，所述植入物或假体还浸渍有BMP2蛋白和间充质干细胞中的一种或两种。
38.一种培养基，包含HS/BMP2。
39.HS/BMP2在体外细胞培养中的应用。
40.HS/BMP2在结缔组织体外生长中的应用。
41.一种用于结缔组织体外生长的方法，包括培养与外源添加的HS/BMP2接触的间充质干细胞。
42.一种促进骨生成的方法，所述方法包括将HS/BMP2施用至骨前体细胞或骨干细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述骨前体细胞或骨干细胞与HS/BMP2体外接触。
44.根据权利要求42所述的方法，其中，所述骨前体细胞或骨干细胞与HS/BMP2在体内接触。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中，所述骨前体细胞或骨干细胞与BMP2蛋白接触，同时与HS/BMP2接触。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中，所述骨前体细胞或骨干细胞为间充质干细胞。
47.一种在需要这种治疗的人或动物患者中骨组织修复、置换或再生的方法，所述方法包括：
(i)将与HS/BMP2接触的间充质干细胞体外培养足以使所述细胞形成骨组织的一段时间；
(ii)收集所述骨组织；
(iii)将所述骨组织在创伤或疾病部位植入到所述患者的身体中以修复、置换或再生所述患者的骨组织。
48.根据权利要求47所述的方法，还包括使所培养的间充质干细胞与外源BMP2蛋白接触。
49.一种骨组织，其是在存在HS/BMP2的情况下通过间充质干细胞的体外培养获得的。
50.根据权利要求49所述的骨组织，其中，所述间充质干细胞是在存在BMP2蛋白的情况下培养的。
51.一种培养间充质干细胞的方法，包括培养与HS/BMP2接触的间充质干细胞。
52.一种试剂盒，包含预定量的HS/BMP2和预定量的BMP2。
53.一种产品，用于在医疗方法中同时、单独或顺序使用，所述产品含有治疗有效量的以下物质：
(i)HS/BMP2；和以下中的之一或两者
(ii)BMP2蛋白；
(iii)间充质干细胞。
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