CN103739743A - 糖胺聚糖的分离和鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖胺聚糖的分离和鉴定。本发明公开了能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的分离和鉴定，以及分离的糖胺聚糖在组织的生长和/或发育中的应用。具体地，本发明提供一种分离能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的硫酸乙酰肝素的方法，包括：提供具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中该肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，该附加氨基酸的数量为1-20个；将肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖混合物接触，以容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物；将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来；从该肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素；收集解离的硫酸乙酰肝素。

Description

糖胺聚糖的分离和鉴定

本申请是申请日为2009年2月19日的题为“糖胺聚糖的分离和鉴定”的中国专利申请No.200980144772.X的分案申请

技术领域

本发明涉及能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的分离和鉴定，以及分离的所述糖胺聚糖在组织的生长和/或发育中的应用。

背景技术

糖胺聚糖（GAG）是负责实施和调节大量的基本细胞功能的复杂的碳水化合物大分子。

GAG与数百种已知的肝素结合生长和粘附因子一起调节或介导许多信号系统。认为生长因子与GAG结合，以各种不同的作用，如通过保护其免受蛋白质降解而增长其半寿命，在细胞表面调节这些细胞因子的定位，介导分子相互作用和稳定配体-受体复合物，来调节它们的各种活性。

已经鉴定的肝素结合生长因子数目一直在增加，已经增加至已知的数百种了，其中大多数都是通过肝素亲合色谱进行纯化的。它们包括大量的成纤维细胞生长因子（FGF）家族，PDGF和多效生长因子以此至细胞因子的TGF-β超家族。该后者细胞因子的家族涵盖了骨诱导的骨形态形成蛋白质（BMP）子家族，因此因为其诱导异位骨形成的能力而得名。

GAG和生长因子的相互作用的性质和效应仍不清楚。尽管FGF2和在肝素中发现的特殊糖化物序列之间的相互作用已经证实是高亲合性的，但是这一般仍然不清楚其它生长因子和乙酰肝素（heparan）之间的关联是否涉及蛋白质生长因子上的氨基酸序列抗原决定基和GAG中嵌埋的糖化物序列之间的高亲合性或特异性结合相互作用，或这种关联是否由GAG和蛋白质生长因子之间的较低亲合力、非特异性相互作用介导。

如果GAG和驻留于、或分泌到、胞外基质中的蛋白质之间的相互作用是特异性的，则结合配对体需要进行鉴定才能弄清楚这些相互作用并理解如何可以使用或调节这些相互作用而提供新的治疗。

因此，产生的关键问题是，是否存在嵌埋于GAG分子链中的与生长因子多肽骨架中的主要氨基酸序列匹配的糖化物序列，而以绝对的，或至少相对的特异性控制其结合以及生物活性。

发明内容

我们已经发明了一种回答这个问题的方法，其涉及富集显示结合至具有肝素结合域的特殊多肽的糖胺聚糖分子。然后分离的GAG混合物和/或分子能够被识别并对其调节细胞生长与分化和组织表达含肝素结合域的蛋白质的能力进行测试。对于第一次，这能受控分析特定GAG糖化物序列对细胞和组织具体的生长和分化的影响，体外和体内均可。

因此，本发明的第一方面提供了一种分离能够结合至具有肝素/乙酰肝素结合域的蛋白质的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：

（i）提供一种具有附着至支持物的多肽分子的固体支持物，其中所述多肽含有肝素结合域；

（ii）将所述多肽分子与含糖胺聚糖的混合物接触而使之可以形成多肽-糖胺聚糖复合物；

（iii）从所述混合物的剩余物中分离多肽-糖胺聚糖复合物；

（iv）从所述多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；

（v）收集所述解离的糖胺聚糖。

本发明另一方面，分离的糖胺聚糖通过其调节细胞或组织的生长或分化的能力而进行鉴定。本发明提供了一种鉴定能够刺刺激或抑制细胞和/或组织生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：

（i）提供一种具有附着至支持物的多肽分子的固体支持物，其中所述多肽含有肝素结合域；

（ii）将所述多肽分子与含糖胺聚糖的混合物接触而使之可以形成多肽-糖胺聚糖复合物；

（iii）从所述混合物的剩余物中分离多肽-糖胺聚糖复合物；

（iv）从所述多肽-糖胺聚糖复合物解离糖胺聚糖；

（v）收集所述解离的糖胺聚糖；

（vi）将所述收集的糖胺聚糖加入细胞或组织中，其中存在含所述肝素结合域的氨基酸序列的蛋白质；

（vii）测定以下一种或多种：细胞增殖，细胞分化，一个或多个蛋白质标记物的表达。

在本发明的实施方式中，含GAG的混合物可以包含合成的糖胺聚糖。然而，在优选的实施方式中，使用了获自细胞或组织的GAG。例如，该混合物可以包含胞外基质，其中这种胞外基质材料通过原位活体组织刮片（即，直接从由获得的人或动物身体中的组织中获得）或通过对已经从人或动物的身体提取的组织（活的或死的）进行刮片而获得。另外，胞外基质物质可以获自培养基中生长的细胞。胞外基质物质可以获自结缔组织或结缔组织细胞，例如骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱。

GAG组分可以从组织或细胞样品提取或通过本领域内对于技术人员众所周知的系列常规分离步骤（例如，阴离子交换色谱）提取。

GAG混合物可以包含不同类型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。在优选的实施方式中，与固体支持物接触的GAG混合物富含这些类型的糖胺聚糖中的一种，最优选硫酸乙酰肝素。富含硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素或硫酸葡聚糖的GAG部分可以通过对GAG混合物实施柱色谱分离而获得，例如弱、中或强阴离子交换色谱，以及强高压液相色谱（SAX-HPLC）以选择合适的部分。

收集的GAG可以进行进一步分析而鉴别GAG，例如测定GAG的组成或序列，或测定GAG的结构特性。GAG结构典型地是高度复杂的，而考虑到当前可以利用的分析技术，在大多数情况下不可能精确检测GAG的序列结构。

然而，所收集的GAG分子可以进行部分或完全糖化物消化（例如，通过亚硝酸的化学消化或采用裂解酶如肝素酶III的酶消化）而产生都属于GAG的特性和诊断特征的糖化物片断。具体而言，消化产生二糖（或四糖）可以用于测定所获得的每一二糖的百分数，二糖可能提供GAG特征二糖“指纹”。

GAG的硫酸化形式也能够进行检测而用于确定GAG结构。例如，对于硫酸乙酰肝素，在氨基糖和C2、C3和C6位置的硫酸化形式可以用于表征硫酸乙酰肝素。

二糖的分析，四糖的分析和硫酸化的分析能够结合其它分析技术如每一种都提供GAG的独特光谱的HPLC、质谱和NMR进行使用。这些技术组合起来可以提供GAG的明确结构表征。

GAG和肝素结合域之间高亲合力的结合相互作用表明，GAG将含有有助于高亲合力结合的相互作用的特异性糖化物序列。其它步骤可以包括确定参与结合相互作用的GAG的完整或部分糖化物序列，或GAG的关键部分。

在一个实施方式中，GAG-多肽复合物可以采用裂解糖胺聚糖链的试剂，例如裂解酶进行处理。裂解酶处理可以切开并未参与与多肽的结合相互作用的结合GAG部分。参与与多肽结合相互作用的GAG部分可以免受裂解酶作用。在除去裂解酶之后，例如，在冲洗步骤之后，保持结合至多肽的GAG分子代表多肽的特异性结合配体（“GAG配体”）。由于较短的GAG分子的较低复杂性，GAG配体的解离和收集之后，能够期望进行GAG配体的较高程度的结构表征。例如，任何糖化物序列（即，包含于GAG配体中单糖的主要（线性）序列）、硫酸化方式、二糖和/或四糖消化分析、NMR谱图、质谱图和HPLC谱图的组合可以提供GAG配体的高水平结构表征。

在本发明的一方面，提供的GAG具有BMP2的高结合亲合性。更优选GAG是硫酸乙酰肝素（HS）。HS从通过以下本发明的方法获自成骨细胞的胞外基质的GAG混合物分离出来，其中包含BMP2的肝素结合域（SEQ ID NO:1）的多肽连接至固体支持物而可以形成GAG-多肽复合物。GAG组分从GAG-多肽复合物解离导致分离出本文中称之为“HS/BMP2”的独特HS。

因此，本发明一方面提供了HS/BMP2。HS/BMP2可以以独立的或纯化的形式提供。在另一方面提供了包含HS/BMP2的培养基。

在本发明的另一方面，提供了一种包含HS/BMP2的药物组合物或药物，可选地与药用载体、佐剂或稀释剂组合。在一些实施方式中，药物组合物或药物可以进一步包含BMP2蛋白质。提供的包含HS/BMP2的药物组合物或药物用于预防或治疗损伤或疾病。本发明也提供了HS/BMP2在预防或治疗损伤或疾病的药物生产中的应用。

在本发明的其他方面，提供了在其需要这种治疗的患者中预防或治疗损伤或疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的HS/BMP2。给予的HS/BMP2可以配制于合适的药物组合物或药物中并可以进一步包含药用载体、佐剂或稀释剂。可选地，这种药物组合物或药物也可以包含BMP2蛋白质。

本发明另一方面提供了促进或抑制骨生成（骨骼细胞和/或骨骼组织的形成）的方法，包括给予骨前体细胞或骨干细胞HS/BMP2。

本发明另一方面提供了促进或抑制软骨组织的形成（软骨发生）的方法，包括给予软骨前体细胞或软骨干细胞HS/BMP2。

刺激或抑制骨生成或软骨组织的形成的方法可以通过将骨骼或软骨前体或干细胞与HS/BMP2接触，可选地，在外加的BMP2蛋白质的存在下而体外实施。前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在组织形成受促进时，可以收集形成的组织而用于移植入人体或动物患者中。

因此，本发明一方面，提供了其中所述结缔组织通过在HS/BMP2（即，外源HS/BMP2）的存在下，可选地在BMP2（即，外源BMP2）的存在下体外培养间充质干细胞而获得的结缔组织。这种结缔组织可以是骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱。

采用HS/BMP2预防或治疗疾病可以涉及到组织，尤其是结缔组织如骨骼、软骨、肌肉、脂肪、韧带或肌腱的修复、再生或替代。

在具有这些组织中的一种受损的患者中，给予受损的位置HS/BMP2可以用于刺激该位置的组织生长、增殖和/或分化。例如，刺激给药位置处存在或附近的间充质干细胞，优选在该位置也存在BMP2时，可以导致间充质干细胞增殖和分化成合适的结缔组织，由此提供受损组织的替代/再生和损伤治疗。

可替换地，可以收集由接触HS/BMP2的间充质干细胞体外培养获得的结缔组织并移植于在损伤或疾病位置而替代受损或恶化的组织。受损或恶化的组织可选地首先从损伤或疾病位置切除。

另一方面，可以提供一种包含干细胞，优选间充质干细胞，和HS/BMP2的药物组合物。在损伤、疾病或恶化的位置给药，例如注射该组合物提供了该位置处的组织再生。

因此，HS/BMP2适用于通过向需要治疗的患者直接施用HS/BMP2，可选地组合BMP2和/或干细胞而实施的体内伤口愈合，包括组织修复、再生和/或代替（例如疤痕组织或断裂骨骼的愈合）。HS/BMP2也适用于体外产生适用于植入需要组织修复、再生和/或代替的患者的组织。

优选实施方式的说明

本发明涉及GAG，尤其涉及富集包含结合至对应于结合肝素/乙酰肝素）的蛋白质的肝素结合域的多肽（“肝素结合因子”）的一种或多种GAG的化合物的混合物的方法。这种富集导致GAG分离，无论是作为含不同GAG的混合物或结构或功能上相同（或基本相同）的GAG的种群。富集的混合物优选对肝素结合因子具有调节作用。

本发明也涉及富含一种或多种对肝素/乙酰肝素结合因子具有调节作用的GAG的化合物的混合物，以及使用这种混合物的方法。

本发明也涉及增强（例如，激动）BMP-2活性和由此刺激干细胞增殖和骨骼形成能力的GAG分子。

正如本文中所用术语“富集”、“浓缩”、“富含”等都是描述一种处理（或状态），其中混合物的相对组成被（或已经）按照这种方式改变以使该混合物中的一种或多种成分的分数升高，而同时该混合物中的一种或多种不同的成分的分数降低。

通过富集而分离的GAG可以是纯的，即基本上仅仅含有一种类型的GAG，或可以仍然是一种不同类型的GAG的混合物，该混合物相对于起始混合物具有较高比例的结合于肝素结合域的特殊GAG。

通过本发明鉴定的GAG优选是当与其中表达或包含含肝素结合域的蛋白质的细胞或组织接触时表现出功能效应的GAG。这种功能效应可以是调节或强化效应。

这种功能效应可以是促进（刺激）或抑制某些类型的细胞增殖或从一种细胞类型向另一种分化，或一种或多种蛋白质标记的表达。例如，GAG可以促进细胞增殖，即细胞数量增加，或促进干细胞向特异化细胞类型的分化（例如，结缔组织中的间充质干细胞），促进或抑制指示细胞的多能性或分化状态的蛋白质标记的表达（例如，这些标记如碱性磷酸酶活性，检测RUNX2、成骨相关转录因子（osterix）、胶原I，II，IV，VII，X、骨桥蛋白质、骨钙素、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白质-α（C/EBPα）、脂肪细胞脂质结合蛋白质（ALBP）、碱性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白2、（BSPII）、胶原2a1（Coll2a）和SOX9）。

正如本文中所用术语“调节效应”应该理解为是指第一种物质对第二种物质具有的效应，其中第二种物质在另一过程或多个过程中的正常功能通过第一种物质的存在而改变。在本发明优选的实施方式中，调节效应可以是激动性的或拮抗性的。

调节效应可以是强化效应。术语“强化效应”应该理解为是指提高效能的效应。在本发明优选的实施方式中，术语“强化效应”是指第一种物质对第二种物质所具有的效应，其效应提高了第二种物质在另一过程或多个过程中的效能。在本发明其他的优选实施方式中，强化效应应该理解为是指分离的GAG对肝素结合因子的效应，其中所述效应提高了所述肝素结合因子的效能。

在本发明优选的实施方式中，强化效应是肝素结合因子的生物利用度提高。在本发明优选的实施方式中，强化效应是BMP2的生物利用度提高。测定肝素结合因子生物利用度提高的方法是通过检测肝素结合因子局部浓度的升高。

在本发明另一实施方式中，强化效应是保护肝素结合因子不受降解作用。在本发明尤其优选的实施方式中，强化效应是保护BMP-2不受降解作用。检测肝素结合因子降解减少的一种方法是通过测定肝素结合因子的半衰期提高。

在本发明的另一实施方式中，强化效应是将肝素结合因子与细胞受体隔绝。在本发明的另一实施方式中，强化效应是稳定配体-受体的相互作用。

强化效应（例如，生长或分化的调节）可以通过使用合适的分析法进行检测。例如，HS对BMP-2的稳定性所具有的效应可以通过ELISA进行检测。HS对BMP-2活性所具有的效应可以测定SMAD1、5或8中的一种或多种的活化/表达，或测定一种或多种成骨标记基因如Runx2、碱性磷酸酶、成骨相关转录因子（osterix）、骨钙素和BSP1的表达，或使用染色如茜素红和冯库萨（von Kossa）染色而测定矿化作用的水平。

正如本文中所用“接触”的过程涉及使两种或多种分开的物质物理上彼此靠近。“接触”过程涉及使两种或多种分开的物质靠近一段时间，而在某些条件下，足以容许那些两种或多种离散存在物中的部分在分子水平上相互作用。优选地，正如本文中所用，“接触”的过程涉及使含有一种或多种GAG的化合物的混合物与对应于肝素结合因子的肝素结合域的多肽彼此附近。“接触”的过程的实例包括混合、溶解、膨胀、冲洗。在优选的实施方式中，GAG混合物和多肽的“接触”足以形成复合物，该复合物可以是表现出相互之间的高亲合性的GAG和多肽之间的共价键，但优选是非共价键。

这种多肽可以包含具有肝素结合域的所选蛋白质的全长或接近全长的一级氨基酸序列。由于在较长的多肽中可能出现的折叠导致掩蔽肝素结合域与GAG混合物接触，因此这种多肽优选是短的。优选地，这种多肽具有包含肝素结合域并且可选地在肽的N-和C-端中一端或两端包含一种或多种氨基酸的氨基酸序列。这些附加的肽使连接子（linker）或连接分子（attachment molecule）能够加入到这些多肽中，而这对将多肽连接至固体支持物是必需的。

在优选的实施方式中，除了肝素结合域中氨基酸的数量之外，多肽含有1～20个，更优选1～10个，更加优选1～5个附加氨基酸。在一些实施方式中，肝素结合域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80%，更优选至少90%，更加优选至少95%。

为了将多肽附着到固体支持物的表面上，优选对这些多肽进行改性以包含分子标签，而固体支持物表面经过改性而引入具有对该分子标签具有高亲合力的对应分子探针，即分子标签和探针形成结合对。在优选的实施方式中，这种标签和/或探针选自以下任意之一：抗体、细胞受体、配体、生物素、这些结构的任何片段或衍生物、前述的任何组合、或能够设计或构造探针而与之结合或另外通过特异性联合的任何其它结构。适于作为标签和探针使用的优选结合对是生物素和抗生物素蛋白。

这种多肽优选衍生自感兴趣的蛋白质。对于“衍生自”是指多肽因为其含有感兴趣蛋白质中存在的肝素结合域的氨基酸序列而被选择、挑选或制备。在一些实施方式中，肝素结合域的氨基酸序列可以由感兴趣的蛋白质中所显示出的序列进行改变，例如，为了研究肝素结合域序列中的变化对GAG结合的影响，。

感兴趣的蛋白质可以是任何结合肝素的蛋白质，而因此具有肝素结合域。优选的蛋白质包括那些表达于胞外基质中，尤其是在结缔组织的胞外基质（例如，骨骼、软骨、肌肉、肌腱、韧带、脂肪）中的蛋白质。

优选蛋白质及其肝素结合域列于下表：

本领域的技术人员应该理解，在具体的多肽的氨基酸序列中的小变化可能容许维持那部分的固有功能。也应该理解，在肽中的某些氨基酸残基用其它属于等构和/或等电的氨基酸残基取代，可以维持或改进未取代的肽的某些性质。这些变化也涵盖在本发明的范围内。例如，氨基酸丙氨酸有时可以被氨基酸甘氨酸取代（并且反之亦然）而同时维持该肽的一种或多种性质。术语“等构”是指两种存在物之间的空间类似性。两种在中等高温下等构的残基的实例是异丙基和叔丁基。术语“等电”是指两种存在物之间的电性相似性，一个实例是两种存在物具有相同、或相似的功能，pKa。

在本发明的实施方式中，对应于肝素结合域的多肽可以是合成的或重组的。

固体支持物可以是任何具有分子可以通过共价或非共价键直接或间接连接的表面的底物。固体支持物可以包括任何能够对连接至表面的探针提供物理支持的底物材料。其可以是基质支持物。这种材料一般能够耐受与探针连接至表面以及实施分析期间遇到的任何后续处理、处置或加工处理相关的条件。这些材料可以是天然的、合成的或天然材料改性的。固体支持物可以是塑料物质（包括聚合物如，例如，聚(氯乙烯）、环烯烃共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯）、聚四氟乙烯（PTFE或

）、尼龙、聚(丁酸乙烯酯））等，可以单独使用或结合其它材料使用。其它刚性材料都可以考虑，如玻璃，其包括二氧化硅并进一步包括，例如，作为生物质玻璃（Bioglass）购买的玻璃。其它可以使用的材料包括多孔材料，如例如，可控多孔玻璃珠。也可以考虑任何本领域已知的能够具有一种或多种在其表面上引入官能团，如氨基、羧基、巯基或羟基中的任何官能团的其它材料。

优选的固体支持物包括具有将多肽固定于柱子表面上的柱子。表面可以是柱子的壁，和/或可以是通过填充柱子中间空间的珠子提供的。

多肽可以固定于固体支持物上。涵盖于本发明的范围内的固定方法的实例包括：吸附、共价结合、诱捕和膜截留。在本发明优选的实施方式中，多肽和基质之间的相互作用基本上是永久性的。在本发明进一步优选的实施方式中，肽和基质之间的相互作用适宜地对于离子交换色谱呈惰性。在优选的实施方式中，多肽连接至固体支持物表面。应该理解，本领域的技术人员具有很多的选择，对两种存在物彼此进行化学和/或物理连接。这些选择都包括在本发明的范围内。在本发明优选的实施方式中，多肽通过生物素与抗生蛋白链菌素的相互作用而吸附于固体支持物。在这个具体实施方式的代表性实例中，生物素分子共价结合于多肽，因此生物素-多肽偶联物结合至抗生蛋白链菌素，其由此共价结合至固体支持物。在本发明另一实施方式中，间隔子（spacer）和连接子部分（linker moiety）可以用于连接生物素分子与多肽，和/或抗生蛋白链菌素与基质。

通过将GAG混合物与固体支持物接触，就能够形成GAG-多肽复合物。通过从固体支持物除去混合物的剩余物，例如通过冲洗固体支持物而洗脱未结合的物质，而从混合物的剩余物中进行分配。在使用柱子作为固体支持物的情况下，GAG混合物的未结合组分能够从柱子洗脱而留下结合至柱子的GAG-多肽复合物。

在本发明中，应该理解，某些寡糖以非特异性方式可以与多肽发生相互作用。在某些实施方式中，与多肽以非特异性方式发生相互作用的寡糖可以包含在富集一种或多种调节肝素结合因子的效应的GAG的化合物的混合物之内，或排除于富集一种或多种调节肝素结合因子的效应的GAG的化合物的混合物之外。非特异性相互作用的实例是在合适尺寸和/或成形的分子袋中的暂时截留。另外应该理解，这些寡糖可以比与肽根本不发生相互作用的那些寡糖洗脱更慢。而且，应该理解，非特异性结合的化合物不会像那些以特异性方式结合（例如，通过离子相互作用）的化合物那样需要相同的外部刺激物的输入才能洗脱。本发明能够将寡糖混合物分离成混合物的以下那些组分：以特异性方式结合至多肽；以非特异性方式结合至多肽的那些；和并未结合至多肽的那些。这些命名可操作地对每一GAG-肽对进行定义。

通过改变其中发生GAG和多肽结合的固体支持物的表面上表现出的这些条件（例如盐浓度），就能够选择出对肝素结合域具有最高亲合性和/或特异性的GAG。

因此，可以获得对感兴趣的蛋白质和/或感兴趣的蛋白质的肝素结合域具有高结合亲合性的GAG。结合亲合性（K_d）可以选自以下的一种：小于10μm，小于1μM，小于100nM，小于10nM，小于1nM，小于100pM。

通过本发明的方法获得的GAG可以适用于体外和/或体内的应用范围。GAG可以提供用于体外细胞或组织培养中、或体内细胞或组织中刺激或抑制细胞或组织生长和/或增殖和/或分化。

GAG可以以这种目的的制剂提供。例如，可以提供含有通过本发明的方法获得的GAG的培养基。

在通过本发明的方法获得的GAG存在下，可以收集由体外细胞或组织培养获得细胞或组织并移植到需要治疗的人或动物患者中。因此，可以提供移植细胞和/或组织的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）在体外与通过本发明的方法获得的GAG接触培养细胞和/或组织；

（b）收集这些细胞和/或组织；

（c）将这些细胞和/或组织植入需要治疗的人或动物主体中。

细胞可在（a）部分中与GAG接触培养一段足够长的时间而容许细胞或组织生长、增殖或分化。例如，这个时间段可以选自：至少5天，至少10天，至少20天，至少30天或至少40天。

在另一实施方式中，GAG可以经配制而用于医学治疗方法，包括预防或治疗损伤或疾病。可以提供包含GAG和药用稀释剂、载体或佐剂的药物组合物或药物。这种药物组合物或药物可以提供用于预防或治疗损伤或疾病。本发明也提供了通过本发明的方法获得的GAG在生产预防或治疗损伤或疾病的药物中的应用。可选地，根据本发明的药物组合物和药物也可以包含具有GAG结合的肝素结合域的感兴趣蛋白质。在其它实施方式中，药物组合物和药物可以进一步包含干细胞，例如间充质干细胞。

损伤或疾病的治疗可以包括细胞或组织，如结缔组织（例如，骨骼、软骨、肌肉、脂肪、肌腱或韧带）的修复、再生或替换。对于组织修复，含有GAG的药物组合物或药物可以直接给药至伤痛或病患的位置而刺激新组织的生长、增殖和/或分化，以完成创伤的修复或治愈或缓解（例如，提供对症状的缓解）疾病的病状。组织的修复或再生可以通过在药物组合物或药物中组合干细胞而改善。

对于组织替换，在细胞和/或组织体外培养期间，GAG可以与细胞和/或组织接触而产生用于移植到患者伤痛或病患位置的细胞和/或组织。细胞或组织的移植能够用于通过替换受伤或患病的组织而实现患者中受伤或病患的组织修复。这可能涉及到受伤/患病组织的切除和通过与经本发明的方法获得的GAG接触进行细胞和/或组织培养而制备的新组织的移植。

根据本发明的药物组合物和药物因此可以包含以下中的一种：

（a）通过本发明的方法获得的GAG；

（b）通过本发明的方法获得的GAG与干细胞组合；

（c）通过本发明方法获得的GAG与包含GAG结合的肝素结合域的蛋白质组合；

（d）通过本发明方法获得的GAG与干细胞和包含GAG结合的肝素结合域的蛋白质组合；

（e）通过与本发明方法获得的GAG接触的细胞或组织培养获得的组织或细胞。

根据本发明的方法分离的GAG可以用于身体组织的修复或再生，尤其是骨骼再生、神经再生、骨骼组织的构建、心血管伤口的修复和胚胎和成熟干细胞的扩增和自我更新。因此，这种GAG可以用于预防或治疗大量的病患和伤痛，包括骨关节炎、软骨替换、任何类型的骨骼断裂（例如，腰间盘融合处理、长骨骼断裂、颅骨缺损）、临界或不愈合（non-union）骨骼缺损再生。

根据本发明的GAG在组织的修复、再生或替换中的用途可以涉及在伤口愈合，例如加速伤口愈合、疤痕或骨骼组织的愈合和组织移植中的用途。

另一方面，本发明提供了一种包含通过本发明方法分离的GAG的生物学支架。在一些实施方式中，本发明的生物支架可以用于整形外科（骨科）、血管、皮肤和角膜应用。通过本发明提供的生物支架包括延缓药物递送的器件、组织阀、组织阀瓣叶、药物洗脱支架、血管移植、伤口愈合或皮肤移植和矫形假肢，如骨骼、韧带、肌腱、软骨和肌肉。在本发明优选实施方式中，生物学支架是导管，其中所述内（和/或外）表面包含一种或多种连接到导管上的GAG化合物。

另一方面，本发明提供了一种或多种通过本发明方法分离而适用于作为佐剂的GAG。在本发明尤其优选的方面中，这种佐剂是一种免疫佐剂。

另一方面，本发明提供了包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物的药用制剂，所述混合物富集了调节肝素结合因子的GAG。

另一方面，本发明提供了包含以下用于独立地、同时地或按序给予的物质的药用制剂：

（i）含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集了调节肝素结合因子的GAG；和

（ii）肝素结合因子。在优选的实施方式中，这种制剂包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集了调节肝素结合因子的GAG和在紧密混合物中的肝素结合因子，并同时向需要治疗的患者给药。在本发明另一实施方式中，该制剂包含含有一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集了调节BMP-2的GAG和在紧密混合物中的BMP-2，并同时向需要治疗的患者给药。

本发明另一方面，提供了适用于组织修复，或再生的试剂盒，所述试剂盒包含（i）预定量的对具有肝素结合域的蛋白质具有高亲合力的GAG和（ii）预定量的具有所述肝素结合域的蛋白质。

在优选的实施方式中，GAG是HS/BMP2而具有所述肝素结合域的蛋白质是BMP2。

本发明富集的混合物的化合物能够向主体作为其药用盐给药。例如，本发明的富集混合物的化合物的基础盐包括但不限于，与药用阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵形成的那些盐。本发明包括在其范围内的阳离子盐，例如钠或钾盐。

应该理解，本发明富集混合物的化合物含有羧酸基团，能够以可给药的前药形式递送，其中所述酸部分被酯化（而具有-CO₂R'形式）。术语“前药”尤其涉及体内-OR'基团转化成-OH基团，或由其变成羧酸阴离子。因此，本发明的前药可以发生作用而增强药物吸收和/或药物递送至细胞。前药的体内转化可以通过细胞酶如脂肪酶和酯酶或化学裂解如体内酯水解完成。

根据本发明诸多方面的药物和药物组合物可以经过配制而用于通过许多途径给药，包括但不限于，在病患或伤痛位置注射。这种药物和组合物可以配制成流体或固体形式。流体制剂可以配制用于通过注射给药至人体或动物体的所选定区域。

给药优选按照“治疗有效剂量”，这是指足以显示出对个体有效的剂量。实际给药剂量，以及给药的速率和时间过程，将取决于所治疗的伤痛或病患的性质和严重度。治疗的处方，例如剂量等的确定，是一般从业医师和其它医疗医生的职责，典型地需要考虑所治疗的疾病、个体患者的症状、递送位置、给药方法和其它医师已知的因素。以上提及的技术和方案的实例能够在文献Remington's Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins中找到。

在本说明书中，待治疗的患者可以是任何动物或人。患者可以是非人哺乳动物，但是优选人类患者。患者可以是男性或女性。

根据本发明的方法可以如所示在体外或体内实施。术语“体外”预想涵盖在培养基培养细胞的过程，而术语“体内”预想涵盖采用完整的多细胞生物的过程。

干细胞

与通过本发明的方法获得的GAG接触的细胞包括干细胞。

本文中培养和描述的干细胞可以是任何类型的干细胞。它们可以是全能性的或多能性（多潜能性）的。它们可以是源自任何组织的胚胎或成熟干细胞，可以是造血干细胞、神经干细胞或间充质干细胞。优选它们是成熟干细胞。更优选它们是成年间充质干细胞，例如，能够分化成结缔组织和/或骨骼细胞如软骨细胞、成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。干细胞可以获自任何动物或人，例如非人动物，例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物（包括源自任何啮齿类的动物的细胞）、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物或其它非人脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人。可选地它们是非人的。

在本说明书中，干细胞是指任何具有能够分裂（即自更新）和保留全能性或多能性（多潜能性），并且如果需要能长成特化细胞的能力的细胞类型。

本发明中培养的干细胞可以获自或衍生于现有的培养基或直接来自任何成年的、胚胎的或胎儿组织，包括血液、骨髓、皮肤、上皮细胞或脐带（通常被遗弃的组织）。

干细胞的多能性可以通过使用合适的分析而确定。这种分析可以包括检测一种或多种多潜能的标记，例如碱性磷酸酶活性、RUNX2、成骨相关转录因子（osterix）、胶原I、II、IV、，VII、X、骨桥蛋白、骨钙素、BSPII、SOX9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增强子结合蛋白质-α（C/EBPα）、脂肪细胞脂质结合蛋白（ALBP）、碱性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白2、（BSPII）、胶原2a1（Coll2a）和SOX9的检测。

间充质干细胞或人体骨髓间质干细胞定义为具有再生软骨、骨骼、肌肉、肌腱、韧带和脂肪的能力的多能性（多潜能性）祖细胞。这些原始祖细胞出生后存在并展示出干细胞的特性，即低发生率和广泛的再生潜能。这些性质结合其发育可塑性，在间充质干细胞替换受损的组织的潜在用途中已经激起了巨大的兴趣。实际上，能够培养间充质干细胞而扩充其数目，随后移植到受伤位置或在支架内/上接种之后而产生合适的组织构架。

因此，对于骨骼、肌肉、肌腱和韧带修复的其它方法是合适的祖细胞如骨祖细胞的选择、扩增和调节，在骨骼的情况下结合传导或引入支架并审慎选择特异性组织生长因子而支撑和引导再生。

人体骨髓间充质干细胞能够采用选择性的标记进行分离和检测，如STRO-I从指示其骨髓再增的潜能的CD34+部分进行分离和检测。这些细胞表面标记仅仅发现于间充质干细胞的细胞表面并属于细胞多能性的指示。

在本发明的另一方面，提供了包含用本发明任何方法产生的干细胞，或其片段或产物的药物组合物。这种药物组合物适于医药治疗的方法。合适的药物组合物可以进一步包含药用载体、佐剂或稀释剂。

在本发明的另一方面，通过本发明的任何方法产生的干细胞可以用于医药治疗的方法中，优选地，所提供的医药治疗方法包括向需要这种治疗的个体给予治疗有效剂量的所述药物或药物组合物。

通过根据本发明的培养方法和技术获得的干细胞可以用于分化成适用于医药治疗的方法的另一种细胞类型。因此，分化的细胞类型可以来源于通过本文中描述的培养方法和技术获得的干细胞或者可以认为是其产品，并且该干细胞随后能够分化。可以提供包括所述分化细胞的药物组合物，可选地连同包括药用载体、佐剂或稀释剂。这种药物组合物可以适用于医药治疗的方法。

糖胺聚糖

本文中所用术语“糖胺聚糖”和“GAG”可以互换使用，应该理解为是指包含寡糖的分子大聚集体，其中一种或多种那些结合的糖化物含有氨基取代基，或其衍生物。GAG的实例有硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸皮肤素、透明质酸和硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素是本发明优选的实施方式。

正如本文中所使用的术语“GAG”也扩展涵盖那些属于GAG结合体（conjugate）的分子。GAG结合体的实例有蛋白质糖胺聚糖（PGAG，蛋白质多糖），其中肽组分共价结合至寡糖组分。

在本发明中，应该理解，还有大量的GAG化合物源，包括天然的、合成的或半合成的。优选的GAG源是生物组织。优选的GAG源是干细胞。尤其优选的GAG源是能够分化成对应于将成为治疗主体的组织的细胞的干细胞。例如，GAG能够源于适用于骨骼再生或骨骼组织构建的前成骨细胞。在本发明尤其优选的实施方式中，GAG可以源自永生细胞系。在本发明另外的优选实施方式中，GAG可以源自生长于生物反应器中的永生细胞系。GAG的另一优选源是合成来源的。在这方面，GAG可以获自商购可获得的原料通过本领域技术人员已知的或可以设计的技术合成加工成更复杂的化学形式。这种商购获得的起始原料的实例是葡糖胺。另一优选的GAG源是半合成源。在这方面，天然起始原料的合成加工涉及许多所需材料的复杂性，通过本领域技术人员已知的或可以设想的技术合成进行合成加工。这种天然起始材料的实例有壳聚糖和葡聚糖，而这类型可以将起始材料加工成适用于本发明的GAG混合物的合成步骤的实例，有酰胺键水解，氧化和硫酸化。所需结构的GAG的半合成路径的另一实例包括相关GAG的合成互变而获得适用于本发明的GAG。

硫酸乙酰肝素（HS）

在本发明优选的方面，糖胺聚糖或蛋白多糖优选是硫酸乙酰肝素。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）表示高度多样化的蛋白多糖的一个子群并由共价连接至蛋白质骨架的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖侧链构成。核蛋白存在三种主要形式：已知为基底膜蛋白聚糖的分泌形式，连接于质膜的已知为磷脂酰肌醇蛋白聚糖的形式，和已知为多配体蛋白聚糖的跨膜形式。它们是哺乳动物细胞表面和大多数胞外基质的广泛存在的组分。还有其它蛋白质如聚集蛋白，或淀粉样蛋白前体蛋白，其中HS链可以连接至更不常见的核。

“硫酸乙酰肝素”（“硫酸乙酰肝素”或“HS”）首先在高尔基体中以由D-葡萄糖醛酸（GIcA）和N-乙酰-D-葡糖胺（GicNAc）的串联重复序列构成的多糖合成。新合成的多糖可以随后按照以下步骤按顺序改性：GIcNAc的N-去乙酰化/N-硫酸化，GicAC5差向异构化成艾杜糖醛酸（IdoA），IdoA和GicA的C2O-硫酸化，N-磺基葡糖胺（GIcNS）的C6的O-硫酸化和GIcNS的C3的随机O-硫酸化。HS的N-去乙酰化/N-硫酸化、2-O-、6-O-和3-O-硫酸化分别通过HS的N-去乙酰酶/N-磺基转移酶（HSNDST）、HS2-O-磺基转移酶（HS2ST），HS6-O-磺基转移酶（HS6ST）和HS3-O-磺基转移酶的特异性作用而介导。在每一改性步骤中，仅仅部分潜在的底物被改性，导致相当多的序列多样性。这种HS的结构复杂性使之很难确定其序列并理解HS结构和功能之间的关系。

硫酸乙酰肝素侧链由交替排列的D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸和D-葡糖胺，经由（1->4）糖苷键连接组成。葡糖胺经常是N-乙酰化的或N-硫酸化的，而糖醛酸和葡糖胺二者都可以另外进行O-硫酸化。特定的HSPG对于特定的结合伴侣的特异性通过连接至葡糖胺和糖醛酸的羧基、乙酰基和磺酸基的特异性方式产生。相比于肝素，硫酸乙酰肝素包含较少的N-和O-磺酸基和更多的N-乙酰基。硫酸乙酰肝素侧链通过四糖连接（-葡糖醛酰基-β-（1→3）-半乳糖基-β-（1→3）-半乳糖基-β-（1→4）-木糖苷-β-1-O-（丝氨酸））区域连接至核蛋白的丝氨酸残基。

硫酸乙酰肝素链和核蛋白可以进行一系列的修饰，可以最终影响其生物学活性。HS的复杂性被认为是超越了核酸的复杂性（Lindahl et al，1998，J.Biol.Chem.273，24979；Sugahara and Kitagawa，2000，Curr.Opin.Struct.Biol.10，518）。在HS种类中的变化源自通过含N-乙酰化葡萄糖胺的二糖非硫酸化区域分隔开的糖残基非随机的高度硫酸化序列的合成。N-乙酰葡萄糖胺最初转化成N-磺基葡萄糖胺产生了一个其它改性的中心，包括葡萄糖醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸和在葡萄糖胺或艾杜糖醛酸上的O-硫酸化的复合模式。另外，在非改性的低硫酸化N-乙酰化序列中，己糖醛酸酯（hexuronate）残基仍为葡萄糖醛酸，而在高度硫酸化的N-硫酸化区域中，C-5差向异构体艾杜糖醛酸占优势。这就限制了潜在的二糖变体在任何给定的链中的可能数目，但不是每个的丰度。大多数修饰出现在N-硫酸化区域，或直接与之邻近，而使成熟链中存在通过低硫酸化的域分隔开的高硫酸化的区域（Brickman et al.（1998），J.Biol.Chem.273（8），4350-4359，以其全文结合于此作为参考）。

据认为，高度可变的硫酸化乙酰肝素链在大量的细胞外配体活动的调节中发挥关键作用，包括调节和将生长和粘附因子呈递到细胞，经由自分泌、近分泌和旁分泌反馈循环的复杂组合，如此控制胞内信号传递并由此发生干细胞分化。例如，即使硫酸乙酰肝素糖胺聚糖可以从遗传上进行描述（Alberts et al.（1989）Garland Publishing，Inc，New York&London，pp.804和805），但是从一种来源分离的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖种类可能在生物学活性上是不同的。正如在文献Brickman et al，1998，Glycobiology8，463中所示，由神经上皮细胞获得的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的两种分离的集合，取决于促有丝分裂的状态，能够特异性地活化FGF-1或FGF-2。类似地，硫酸乙酰肝素（HS）与FGF-1或FGF-2相互作用的能力描述于WO96/23003中。根据该专利申请，各个能够与FGF-1相互作用的HS可获自约11至约13的胚胎天数的鼠细胞，而能够与FGF-2发生相互作用的HS可以在约8至约10的胚胎天数获得。

正如以上的描述，HS结构是高度复杂的而在HS之间是变化的。实际上，在HS结构中的变化被认为对于每种HS在促进细胞生长和引导细胞分化的不同活性方面产生了重要作用。结构复杂性被认为超越了核酸，尽管HS结构可以表征为在当前具有特异性的和唯一的硫酸化模式的重复二糖单元的序列，但是还没有相当于核酸测序的确定HS序列结构的标准测序技术。在没有确定明确的HS序列结构的简单方法的情况下，由本领域内技术人员通过许多分析技术进行HS分子阳性识别和结构表征。这些包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量测定中的一种或组合。这些分析技术是众所周知的并由本领域的技术人员使用。

对于由HS生产二-和四-糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂解酶消化。实施这种消化的技术的一种方式的描述列在下面，仅仅通过举例的方式，这种描述并非限制本发明的范围。

亚硝酸消化

基于亚硝酸的硫酸乙酰肝素的解聚作用当完成之时使碳水化合物链最终降解成其单个二糖组分。

例如，亚硝酸可以通过独立地在冰上冷却250μL的0.5M H₂SO₄和0.5M Ba(NO₂)₂15min。在冷却之后，将H₂SO₄和Ba(NO₂)₂混合并在离心除去硫酸钡沉淀之前进行涡旋搅动。向悬浮在20μL的H₂O中的GAG样品中加入125μL的HNO₂，并在25℃下偶尔混合地孵育15min前涡旋搅拌。在培养之后，向样品中加入1M Na₂CO₃而调节其pH至6。接着，向样品中加入100μL的在0.1M NaOH中的0.25M NaBH₄溶液并将该混合物加热至50℃保持20min。随后混合物冷却至25℃并加入冰乙酸酸化而调节样品pH至3。该混合物随后用10M的NaOH中和并通过冻干降低体积。最终样品经过Bio-Gel P-2柱而分离出二-和四糖以确认降解度。

裂解酶消化

肝素化作用III在葡糖苷酸连接处裂解糖链。系列肝素酶（I、II和III）每一种都通过在特定的硫酸化识别位点解聚某些硫酸乙酰肝素序列而表现出相对特异性活性。肝素酶I沿着HS链的NS区域裂解HS链。这导致硫酸化域的解体。肝素酶III以NA域解聚HS，导致碳水化合物链分解成单个硫酸化域。肝素酶II主要在HS链的NA/NS“肩”区切裂，其中发现硫酸化模式改变。注意：乙酰肝素聚合物的重复二糖骨架是连接至氨基糖葡糖胺的糖醛酸。“NS”是指氨基糖承载硫酸酯键到氨基上，这能够使其它基团在C2、C6和C3处发生硫酸化。“NA”表明氨基并未被硫酸化而保持着乙酰化。

例如，对于在NA区域采用肝素酶III进行解聚，酶和冻干HS样品都在含20mM Tris-HCl，0.1mg/mL BSA和4mM CaCl₂的pH7.5的缓冲溶液中制备。仅仅是举例，肝素酶III可以以5mU/1μg HS的量加入并在37℃下孵育16h之后，通过加热至70℃约5min而停止反应。

二-和四糖可以通过柱色谱进行洗脱。

肝素结合域

Cardin和Weintraub（Molecular Modeling of Protein-GlycosaminoglycanInteractions，Arteriosclerosis Vol.9No.1Jan/Feb1989p.21-32），其全文结合于本文中作为参考，描述了多肽肝素结合域的共有序列。这种共有序列具有两个或三个水性残基（hydropathic residues）分隔开的二-或三-碱性残基，两个或三个水性残基由一个或多个碱性残基终止。两种特定的共有序列确定为：XBBXBX[SEQ ID NO:15]和XBBBXXBX[SEQ ID NO:16]，其中B是碱性残基（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）而X是水性残基（例如，丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸）。肝素结合域据报道在氨基酸Asn、Ser、Ala、Gly、lle、Leu和Tyr中是充足的而氨基酸Cys、Glu、Asp、Met、Phe和Trp出现率较低。

这种共有序列可以用于研究蛋白或多肽氨基酸序列而确定可以合成并测试根据本发明的GAG结合的候选肝素结合域氨基酸序列。

WO2005/014619A2也公开了多种肝素结合肽。WO2005/014619A2的内容以其全文结合于本文中作为参考。

含肝素结合域的蛋白质

以下蛋白已知含有肝素结合域，而衍生于这些蛋白的氨基酸序列的多肽可以用于鉴定根据本发明的GAG。

有丝分裂原/形态发生素/趋化因子

成纤维细胞生长因子（FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9）以及FGF受体FGFR1、FGFR2、FGFR3；HGF（肝细胞生长因子）；VEGF（脉管内皮生长因子）；活化素；BMP（骨骼形态形成蛋白，例如BMP-2、BMP-4）；TGF-β（转化生长因子）；PDGFs（血小板衍生的生长因子）；OPG（护骨素）；HB-GAM（肝素结合生长相关的分子）；多效生长因子；GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子）；干扰素-χ；NT4/5（神经营养素）；GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）；Wnts Hedgehogs。

拮抗剂

Noggin，Chordin，Sclerostin，CTGF（结缔组织生长因子），卵泡抑素，GremLin。

粘附糖蛋白

纤维连接蛋白，玻连蛋白，昆布氨酸，胶原蛋白，血小板反应蛋白，肌腱蛋白，温韦伯氏因子，NCAM（神经细胞粘附分子），N-钙粘素。

酶

脂蛋白脂肪分解酵素，肝脂肪酶，水解磷脂酶，载脂蛋白B，载脂蛋白E。

丝氨酸蛋白酶抑制剂

抗凝血酶III，肝素共因子II，蛋白酶微管连接蛋白

其它因子

超氧岐化酶，弹性蛋白酶，血小板因子4，N-CAM，转录因子，DNA拓扑异构酶，RNA聚合酶，肿瘤坏死因子。

本发明包括本文中描述的方方面面和优选特征的组合，除非这些组合是明显不可能的或明确规避的。

本文中所用的章节标题仅仅是为了组织的目的，而不能解释为是为了限制所描述的主题。

本发明的各方面和各实施方式现在将通过举例的方式，并参照附图进行说明。其它方面和实施方式对于本领域的那些技术人员将是显而易见的。所有本文中提及的文献都结合于本文中作为参考。

附图说明

举例说明本发明原理的实施方式和实验现在将参照附图进行讨论，其中：

图1.采用8M脲/CHAPS缓冲溶液破坏的MX样品的阴离子交换色谱图。大的GAG峰是在1M NaCl洗脱之后观察的。

图2.MX源的GAG纯化期间该脱盐系统的代表性色谱图。最初的峰（12～18min）表示全长GAG链。传导性峰和碎片峰（19～30min）表示盐和GAG碎片洗脱。

图3.载入到未衍生化的Hi-Trap抗生蛋白链菌素柱的tGAG（2.5mg）。所有的GAG都过柱洗脱，表明GAG与柱之间没有“背景”结合。

图4.用tGAG（25mg）预培养BMP2-HBP（1mg）30min。洗脱曲线分布显示了连同tGAG样品一起过柱出来的肽（280nm）。

图5.载入到Hi-Trap柱的BMP2-HBP（1mg）。280nm的吸光度水平指示该肽即使在高盐条件下仍保持连接至柱；因此存在生物素化肽与抗生蛋白链菌素连接子的成功结合。

图6.用25mg的tGAG装载的BMP2-HBP（1mg）结合柱。色谱图（232nm）清楚地显示出在流过以及一些GAG结合至BMP2-HBP床的两种情况下的柱子过载。

图7.由前一实验（图6）的GAG（过柱）部分的再运用。存在明显的GAG+洗脱峰表明所有可利用的BMP2-HBP结合位置都已经饱和，导致在流过的柱中出现大比例的敏感GAG。

图8.用tGAG（6mg）装载的BMP2-HBP（2mg）结合柱。色谱图（232nm）显然地显示柱子没有过载，而存在对于BMP2-HBP具有相对亲合性的GAG亚群。

图9.来自前一次过柱（图8）的GAG-（流出物）再次过柱。不存在GAG+洗脱峰表明可用的BMP2-HBP结合位点在前次过柱中都没有饱和，容许在单次过柱中有效提取GAG+糖。

图10.分离的全长GAG+部分（2mg）的再运用显示出在肝素酶III消化之前对于BMP2-HBP（2mg）柱亲合性没变化。对BMP2-HBP柱的GAG-部分的再运用也显示出随着所有存在的GAG都基本上在如图9中过柱流出，亲合性没变化。

图11.在载入到BMP2-HBP（2mg）柱之前用肝素酶III消化的GAG-部分（1mg）。色谱图（232nm）清楚显示没有GAG样品保持结合至该柱子，而在流出物中存在。这表明全长GAG链中没有任何GAG+域。

图12.在载入到BMP2-HBP（2mg）柱之前用肝素酶3消化的GAG-部分（2mg）。色谱图（232nm）证实GAG+样品被柱子截留，间接表明全长GAG+链上所有域都对BMP2-HBP具有相对亲合性。相比于相同干重的GAG+（图10），吸收峰的增加，表明了肝素酶3处理的效率。

图13.采用排阻限为1.5kDa～20kDa的Biogel P10柱分离全长GAG+链。色谱图显示大部分的样品链都具有超过20kDa的总分子量。

图14.用亚硝酸处理全长GAG+糖链20min，以特征地降解硫酸乙酰肝素种类。由Biogel P10型号的柱产生的色谱图，显示出所有GAG+链相比于图13几乎完全降解，表明GAG+分离的链主要由硫酸乙酰肝素组成。

图15.载入到BMP2-HBP（2mg）柱的软骨素-4-硫酸酯（6mg）。色谱图清楚地图解说明了相当大比例的GAG链对该肽具有亲合性，因为它们在GAG+样品类似的盐浓度下洗脱。

图16.载入到BMP2-HBP（2mg）柱的软骨素-6-硫酸酯（6mg）。色谱图表明很少有C6S GAG链对该肽柱具有任何亲合性。

图17.载入到BMP2-HBP（2mg）亲合柱的硫酸皮肤素（6mg）。色谱图表明很少有DS GAG链对该肽具有任何亲合性，而仅仅小比例的GAG在与GAG+样品类似的盐浓度下洗脱。

图18.载入到BMP2-HBP（2mg）柱的牛硫酸乙酰肝素（2.5mg）。色谱图（232nm）表明仅仅小部分的GAG结合至该柱子。

图19.载入到BMP2-HBP（2mg）柱的肝素-LMW（50mg）。色谱图（232nm）表明几乎没有GAG结合至该肽。

图20.载入到BMP2-HBP（2mg）柱的肝素-HMW（28mg）。色谱图（232nm）表明几乎没有GAG结合至该肽。

图21.采用肝素酶I预消化的肝素-HMW（25mg）被载入到BMP2-HBP（2mg）柱。色谱图（232nm）表明很少有GAG片段结合至该肽。

图22.色谱图显示了通过亲和色谱的分离BMP-2肽特异性HS的步骤。

图23.色谱图显示了通过亲和色谱的BMP-2肽特异性HS（GAG+）的洗脱。

图24.色谱图显示了通过亲和色谱的BMP-2肽非特异性HS（GAG-）的洗脱。

图25.色谱图显示了在Superdex75柱上在尺寸排阻色谱下σ-HS（H9902）标准物的洗脱。

图26.色谱图显示了在Superdex75柱上在尺寸排阻色谱下BMP-2肽特异性HS（GAG+）的洗脱。

图27.曲线图显示了响应对照介质，100ng/mL BMP2和300ng/mLBMP2，在C2C12细胞中成骨相关转录因子（osterix）的表达。

图28.曲线图显示了响应对照介质，100ng/mL BMP2和300ng/mLBMP2，在C2C12细胞中骨钙素的表达。

图29.曲线图显示了响应对照介质，100ng/mL BMP2和300ng/mLBMP2，在C2C12细胞中Runx2的表达。

图30.曲线图显示了响应对照介质，BMP-2，阴性GAG（GAG-），阳性GAG（GAG+），总HS和肝素（Hep），通过定量PCR在C2C12细胞中测定碱性磷酸酶的表达。

图31.曲线图显示了响应对照介质，BMP-2，阴性GAG（GAG-）+BMP-2，阳性GAG（GAG+），总HS和肝素（Hep）通过定量PCR在C2C12细胞中测定的成骨相关转录因子（osterix）的表达。

图32.曲线图显示了响应对照介质，BMP-2，阴性GAG（GAG-）+BMP-2，阳性GAG（GAG+）+BMP-2，总HS和肝素（Hep）通过定量PCR在C2C12细胞中测定的BspII的表达。

图33.曲线图显示了响应对照介质，BMP-2，阴性GAG（GAG-）+BMP-2，阳性GAG（GAG+）+BMP-2，总HS和肝素（Hep）通过定量PCR在C2C12细胞中测定的Runx2的表达。

图34.曲线图显示了响应从MC3T3-E1细胞中分离出来的BMP和GAG+（+BMP-2），在C2C12细胞中的骨钙素的表达。

具体实施方式

本发明的一个或多个实施方式的细节以举例的方式在以下附加的描述中给出，包括了本发明人实施本发明而设计的最佳实施方式的具体细节。很明显，对于本领域的技术人员而言，可以实施本发明，而不会限于这些具体的细节。

我们研究了GAG增强骨形态形成蛋白2（BMP2）的活性的趋势。BMP2对于小鼠肌源细胞系C2C12的高度骨诱导活性已经进行充分的表征。在该细胞系和体内两种情况下的研究已经表明了糖胺聚糖在调节该活性的作用。

对肝素的BMP2亲合性类似地进行了充分表征。许多研究已经实施而需要检测BMP2和GAG之间的动态相互作用。一些研究已经提出，相互作用是抑制性的，而因此引起细胞因子与受体发生隔离或引导其与许多抑制子结合，抑制子如noggin已经类似地显示出对肝素具有亲合性。其它发现表明BMP2和GAG之间的相互作用是一种维持需要信号传递的细胞周围细胞因子的局部浓度，以使其分化成造骨细胞系的相互作用。

这些发现也暗示了这种结合作用起到显著延长同型二聚体半衰期的作用，以容许其在ECM中保持更长时间的活性。正如对于大多数系统的情况，这种相互作用的实际作用可能是一些或所有以上相互作用的混合作用。

尽管许多研究已经提供了对于BMP2与模型糖之间所具有的相互作用的证据，但是BMP2肝素结合肽（BMP2-HBP）、位于每一BMP2单体的N-端氨基酸序列（QAKHKQRKRLKSSCKRHP[SEQ ID NO:1]）和合适的糖胺聚糖之间的特异性相互作用所受的关注相对较少。所产生的关键问题是是否存在嵌埋于控制绝对特异性或至少是相对特异性的结合作用的HS链中的互补糖化物序列。

我们试图分离出能够通过直接与细胞因子发生相互作用而调节BMP2活性的序列特异性糖胺聚糖。

实施例1

材料和方法

缓冲溶液的制备

所有对于GAG提取和分析的的缓冲溶液制备都对质量有严格的关注。缓冲溶液的pH维持在正确的水平且所有缓冲溶液应该进行过滤和脱气是至关重要的，以防止柱子不被沉淀或气泡堵塞。具体而言，气泡的形成能够导致柱子严重损坏，而且在密封的预制备柱中，会导致其不可使用。

所有的所用缓冲溶液都采用无Ca²⁺或Mg²⁺（150mM NaCl）的1×PBS过滤，或两次蒸馏（ddH₂O）而制备最终的溶液。

裂解缓冲液

由PBS（150mM NaCI）加上1%CHAPS、8M脲和0.02%NaN₃组成8M脲/CHAPS裂解缓冲液，以防止存储期间微生物生长的污染。这种溶液用于裂解基质（MX）样品，因此不脱气或过滤。

PGAG阴离子交换低盐（250mM）缓冲溶液

低盐PGAG阴离子交换缓冲溶液包含PBS（150mM NaCl）和附加的100mM NaCl。缓冲溶液用NaOH和0.02%NaN₃平衡至pH7.3。随后该溶液在负压下脱气并恒定搅拌直至没有气泡释放后才通过0.4μm过滤器过滤。

PGAG阴离子交换高盐（1M）缓冲溶液

高盐PGAG阴离子交换缓冲溶液包含PBS（150mM NaCl）和附加的850mM NaCl。缓冲溶液用加入NaOH和0.02%NaN₃平衡至pH7.3。随后该溶液在负压下脱气并在通过0.4μm过滤器过滤之前恒定搅拌。

链霉蛋白酶/神经氨酸酶PGAG重溶缓冲溶液

这种缓冲溶液用于在阴离子交换之后重溶脱盐的PGAG样品以制备它们用于结合核蛋白的酶消化。其包含25mM乙酸钠（CH₃COOHNa）。采用冰乙酸（CH₃COOH）平衡缓冲溶液至pH5.0。链霉蛋白酶和神经氨 酸酶都根据厂商说明书进行重溶。

GAG亲和色谱低盐（150mM）缓冲溶液

低盐GAG阴离子交换缓冲溶液采用PBS（150mM NaCl）制备而不加入任何盐。这种缓冲溶液用NaOH和0.02%NaN₃平衡至pH7.3。该溶液在负压下脱气并在通过0.4μm过滤器过滤之前恒定搅拌直至没有气泡释放。

GAG亲和色谱高盐（1M）缓冲溶液

高盐GAG阴离子交换缓冲溶液采用PBS（150mM NaCl）和外加850mM NaCl制备。这种缓冲溶液用NaOH和0.02%NaN₃平衡至pH7.3，随后该溶液脱气并通过0.4μm过滤器过滤。

脱盐溶液

脱盐溶液采用0.02%NaN₃平衡至pH7.0的ddH₂O制备。溶液随后脱气并过滤。

样品制备

基质样品采用裂解缓冲溶液（8M脲/CHAPS）裂解，随后在该缓冲溶液中刮去培养基表面并在37℃下搅拌过夜而确保最大裂解。样品随后在5000g下离心30min并通过在制备经过阴离子交换色谱的PGAG提取的0.4μm过滤器进行净化。

柱制备和用法

在分离和表征GAG中适于每一系列步骤的各种类型的柱子的选择和制备，对于实验方案的成功是至关重要的。在每一步中柱子被细心平衡和清洗是很关键的。

阴离子交换柱

由于适于GAG提取的相对大量的MX底物，以及放置于该柱子系统上的高负载，有必要手工填充和制备大的阴离子交换柱，尤其是对于本研究更是如此。Capto Q阴离子交换珠（Pharmacia）填充至Pharmacia XK26柱（Pharmacia）中并生产具有每次运行500mLMX溶解产物的最大负载容量。

使用之前柱子和所有的缓冲溶液都平衡至室温30min，然后将柱子在PGAG阴离子交换低盐（250mM）缓冲溶液进行冲洗和平衡30min直至所有的吸收度通道都保持稳定。净化的细胞溶解产物随后通过柱子，该柱子再次用500mL低盐缓冲溶液漂洗而除去任何非特异性结合碎片。PGAG随后采用250mL PGAG阴离子交换高盐（1M）缓冲溶液洗脱并在脱盐之前进行冻干。随后柱子在低盐缓冲溶液中漂洗，重新在4℃下进行储存。

脱盐方案

PGAG/GAG分离后，有必要去除洗脱柱子期间在样品中累积的高量盐。对此步骤，所有样品实验组的洗脱样品都进行合并并载入到4×Pharmacia HiPrepTM26/10脱盐柱中。在使用之前，柱子和所有溶液都平衡至室温30min，然后在脱盐溶液中冲洗和平衡柱30min直至所有的吸收度通道都达到稳定。冻干的样品在脱盐溶液中在产生清澈溶液的最小可能体积下进行重溶。该柱子的这种组合容许载入量高达60mL的样品。这些从柱子首先洗脱的部分被冻干并保持进一步分离或细胞培养应用。柱子随后在脱盐溶液中漂洗并重新在4℃进行储存。

BMP2-HBP柱制备

具有对BMP2相对亲合性的GAG的分离采用BMP2-HBP柱完成。约2mg生物素化的BMP2-HBP在1mL的GAG亲和色谱低盐（150mM）缓冲溶液进行制备。该用量载入至HiTrap抗生蛋白链菌素HP柱（Pharmacia）中并容许结合至柱子5min。随后该柱子在无GAG存在下进行一个完整的运行循环。将柱子在13mL低盐缓冲溶液中以0.5mL/min的流速冲洗，然后以10mL GAG高盐缓冲溶液以1mL/min的流速进行冲洗。最后，柱子用10mL低盐缓冲溶液漂洗。在该过程期间，仔细监控数据而确保观察不到肽的洗脱或柱子的降解。

GAG+样品的分离

一旦制备BMP2-HBP柱，对其在正常运行条件下的稳定性进行测试，就可以用于分离来自tGAG（总GAG）样品的GAG+链。tGAG样品（6mg）在3mL GAG亲合性低盐（150mM）缓冲溶液中制备并注入到载入柱子上的静态池中。在使用之前，BMP2-HBP柱子和所有缓冲溶液都平衡至室温30min，然后在低盐缓冲溶液中冲洗和平衡30min直至所有的吸收度通道都达到稳定。随后样品以0.5mL/min载入到柱子中并将柱子和样品以0.5mL/min在10mL低盐缓冲溶液中漂洗。剩余的GAG+样品随后通过用10mL高盐（1M）缓冲溶液洗脱回收并冻干以脱盐。柱子随后在10mL低盐缓冲溶液中漂洗并在4℃保存。

链霉蛋白酶/神经氨酸酶处理

为了从其核蛋白中分离出GAG链，它们采用链霉蛋白酶和神经氨酸 酶进行消化。冻干的PGAG样品再悬浮于最低体积的25mM乙酸钠（pH5.0）中并通过经过0.4μm注射过滤器过滤而净化。总样品体积按照500μL等分试样分散于10mL玻璃管。加入500μL的1mg/mL神经氨酸酶并在37℃下孵育4h。在孵育之后，向每一样品中加入5mL的100mM Tris-乙酸盐（pH8.0）。向每一样品中额外加入1.2mL的10mg/mL的链霉蛋白酶，该酶重溶在500mM Tris-乙酸盐、50mM乙酸钙（pH8.0）中，并在36℃下孵育24h。在处理之后，所有体积合并并通过离心和过滤制备以用于阴离子交换处理。

GAG消化方案

GAG的分析，包括其硫酸化域的尺寸和相对硫酸化水平，通过使用已建立的包括通过亚硝酸或裂解酶降解的方案进行实施。

亚硝酸消化

硫酸乙酰肝素基于亚硝酸的解聚，当完成之时导致碳水化合物链最终降解成其单个二糖组分。亚硝酸通过将250μL的0.5M H₂SO₄和0.5MBa(NO₂)₂分别冷却于冰上15min而进行制备。冷却之后，Ba(NO₂)₂和H₂SO₄合并并在涡旋搅拌之后离心除去硫酸钡沉淀。向再悬浮于20μL H₂O中的GAG样品中加入125μL的HNO₂，并在涡旋搅拌之后，于25℃下孵育15min并偶尔进行混合。孵育之后，向样品中加入1M的Na₂CO₃而使之pH为6。接着向样品中加入100μL的在0.1M NaOH中的0.25M NaBH₄而该混合物加热至50℃保持20min。随后该混合物冷却至25℃并用冰乙酸在通风橱内酸化至pH3.0。然后混合物用10M NaOH中和并随后通过冻干降低体积。最终样品在Bio-Gel P-2柱上过柱而分离出二-和四糖以确证降解。

肝素酶III消化

肝素酶III是在葡萄糖醛酸连接处裂解糖链的酶。系列肝素酶（I，II和III）的每一种都通过在特定的硫酸化识别位置解聚某些硫酸乙酰肝素序列而展示相对的特异活性。肝素酶I以沿着该链在NS区域裂解HS链。这导致认为是承担HS大多数生物学活性的硫酸化域的解体。肝素酶III在NA域解聚HS，导致碳水化合物链分解成单个硫酸化域。最后，肝素酶II主要在HS链的NA/NS“肩”域切裂，其中发现硫酸化模式改变。

为了分离潜在活性的域，我们集中于GAG+NA区域的解聚。酶和冻干HS样品都在含20mM Tris-HCl，0.1mg/mL BSA和4mM CaCl₂的pH7.5的缓冲溶液中制备。加入每一样品的肝素酶III的浓度通过样品中HS组分的相对量进行控制。我们的分析，经过亚硝酸解聚，表明GAG+样品主要包含HS；由此，该酶以5mU/1μg的HS进行使用。样品在37℃下培养16h之后，通过加热至70℃保持5min而停止。样品随后施用于合适的柱系统以进行进一步的分析。

细胞培养

GAG生产

为了分离代表发育的成骨细胞的GAG种类，MC3T3细胞在成骨条件下生长8天。细胞组分通过在0.02M氢氧化铵（NH₄OH）稀溶液中于25℃孵育5min而除去。在5min之后，NH₄OH通过将培养基表面颠倒而除去。处理后的培养基容许在层流通风橱中过夜干燥。第二天所处理的培养基用灭菌PBS冲洗3次并容许在层流橱中干燥。制备的基质培养基随后在无菌条件下于4℃储存直至通过用裂解缓冲溶液和阴离子交换色谱处理而释放原始蛋白聚糖。

BMP2-特异性GAG生物活性

C2C12成肌细胞用在补充了10%FCS的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中以1.3×10⁴细胞/cm²铺板后，每48h传代培养一次，最大到15代。成骨分化以2×10⁴细胞/cm²在补充了5%FCS的DMEM中进行诱导，标识对rhBMP2具有阳性或阴性亲合性的重组人骨形态形成蛋白-2（rhBMP2）和糖胺聚糖部分的浓度（分别为GAG+和GAG-）。rhBMP2和GAG部分在25℃下再培养30min之后加入其对应的C2C12培养基。培养基容许在这些条件下生长5天，在mRNA样品提取和准备RQ-PCR分析之前，每一条件的培养基每48h进行更换。对于骨钙素表达的实时PCR采用ABI Prism

序列检测系统（PerkinElmer Life Sciences）进行实施。引物和探针都采用Primer Express软件（v2.1，PE Applied Biosystems）进行设计。靶探针重新设计而引入LNA碱基并用BHQ-1（Sigma-Proligo）标记。核糖体亚单元基因18S（VIC/TAMRA）用作外源对照，而每一条件包括三次重复，每一测试一式三份地进行。原始PCR数据采用ABI序列检测器软件进行分析。靶基因表达值标准化至18S表达之后计算相关表达单元（REU）。

结果

阴离子交换色谱

为了成功地从MX样品提取GAG，有必要除去其它可能污染样品的基质蛋白。由于GAG构成ECM中的大多数带负电的分子，因此采用阴离子交换色谱完成最为有效。

样品采用8M脲/CHAPS缓冲溶液进行裂解并载入到阴离子交换柱。不需要的蛋白和ECM碎片都从柱子中冲洗掉而带负电荷的GAG用1MNaCl洗脱。典型的色谱图（图1）清楚地显示出大量的未附着碎片流出，并从MX制备中干净而紧密地洗脱了大量的GAG。因此，不仅该结果证实了通过该方法能够纯化GAG，而且也证明用NH₄OH处理之后在ECM中大量的GAG被保留。

脱盐

实际上用于在各种处理阶段纯化和分析GAG的所有色谱方法都需要用高盐缓冲溶液进行洗脱。由于高盐条件干扰基于亲合性的色谱，就有必要在每一处理阶段之后进行样品脱盐。这个过程一般采用尺寸排阻色谱完成。在这些条件下，较大分子如GAG，在小分子包括盐和小GAG碎片之前从柱出来。在获得结果色谱图（图2）后，从污染盐中分离GAG，其也用于证实GAG链在处理过程中保持完好。

BMP2-HBP柱系统

柱子制备

由于在用商购获得试剂组装BMP2生长因子柱中涉及到的难以承受的成本问题，我们用已知的BMP2肝素结合域（BMP2-HBP）的生物素化进行制备。这种肽固定于Hi-Trap抗生蛋白链菌素HP柱（1mL）上，以通过特异性肝素结合域肽的亲合性特异性地保留GAG链。

首先我们通过将总GAG（tGAG）部分过无BMP2-HBP的柱床而检测任何GAG可能对于裸抗生蛋白链菌素柱具有的背景亲合性（图3）。我们的结果证实，我们源自tGAG样品的MX没有对抗生蛋白链菌素柱的内在亲合性。我们进一步研究了将tGAG暴露于BMP2-HBP而分离具有特异性亲合性的链的两种独立方法。该肽采用25mg的tGAG预孵育30min后载入到抗生蛋白链菌素柱，或者首先载入，然后将tGAG跑过柱床。

采用BMP2-HBP预孵育tGAG表现出肽完全不能与柱子结合（图4），更不用说介导任何特异性GAG的分离。当该肽单独载入柱子时，然而，其与柱子的结合是绝对的，没有有效地肽洗脱，即使在1M的盐条件下也是如此（图5）。这种高亲合性结合作用表明生物素-抗生蛋白链菌素结合作用正确发挥作用，而表明当与tGAG一起载入时，由于空间位阻作用，而存在结合至柱子的可能抑制作用。

柱子负载容量

由于tGAG可能对于BMP2-HBP具有相对亲合性的比例是未知的，则我们首先寻求标准化每次过柱进行分离而载入到肽柱的tGAG量。Hi-Trap柱通过固定1mg对BMP2肝素结合位置具有特异性亲合作用的tGAG提取的BMP2-HBP而制备。要是柱子稳定性随时间而减弱则该用量要进行选择而最大化可用于未来实验的可用肽量。不稳定性对于肽柱是显著的问题，相应地会影响其一致性。最初试图在1mg BMP2-HBP结合的柱上载入25mg的tGAG，导致了明显过载，这通过232nm处的吸光度观察流出物就可观察到（图6）。尽管观察到显著的洗脱峰，但对HBP具有亲合性的tGAG由于过载而在流出物中损失。这通过将流出物再次通过该肽柱而进行检测（图7）。这导致了显著的GAG+（洗脱）峰，表明先前的过柱已经使该柱子饱和。

进一步优化作用使我们常规地地向2mg BMP2-HBP柱载入不超过6mg的tGAG。如通过流出物峰（图8）和缺少阳性结合部分（图9）所证实的，这抑制了柱子过载。这些来自单个过程中的每一样品组对BMP-HBP具有亲合性的tGAG提取，容许我们由此更有效地分离GAG+和GAG-部分。

GAG域分析

GAG+链特异性

随着标准化的方案建立，我们能够可重复地分离GAG+部分用于进一步分析。

给定介导对蛋白结合特异性的硫酸乙酰肝素的域结构，可能结合至柱子的多域GAG链实际上由大比例很少或几乎没有对BMP2的特异亲合性的链构成。类似地，显示出GAG-的链实际上含有对BMP2-HBP一定亲合性的域。为了检测这些可能性，有必要将GAG链打碎成其组分域进行更广泛的检测。

酶肝素酶III（肝素酶I）主要在这些侧接高度硫酸化的区域中切割HS链，由此释放结合敏感生长因子（在这种情况下是BMP2-HBP）的高度带电的蛋白结合域。GAG+和GAG-部分暴露于肝素酶消化作用，但是没有哪一部分显示出其对于BMP2-HBP的亲合性发生任何变化（图10）。

两种全长GAG+和GAG-部分的肝素酶III消化随后进行，而两种消化的样品组随后载入到BMP2-HBP柱中而评价保留亲合性。

肝素酶消化的效能通过酶消化之后等于干重样品的相对吸光度的升高而被确证，正如在图10和图12中所示。由于在232nm处检测GAG链是由糖链自身，具体而言是不饱和键的经肝素酶III沿着糖链长度的任何切割，产生HS片段的不饱和键，导致吸光度增加。

有意思的是，全长GAG-链的肝素酶消化没有产生任何对BMP2-HBP具有显著亲合性的部分（图11）。然而，全长GAG+样品的消化类似地都未产生对BMP2-HBP缺乏亲合性的组分（图12）。该结果间接表明全长BMP结合的GAG链产生含有对HBP具有特异性亲合性的域重复。另外，HBP并不能以在这些低限条件下变化的亲合性而产生GAG+域之间的充分鉴别。

GAG+组合物

全长GAG+的大小

为了测定源自BMP2-HBP柱的GAG+部分的组成，我们首先检测其平均尺寸。这就确保我们实际上分离出合理长度的GAG链，而不是未承载任何特异性亲合性的小片段。尽管任何大小的GAG链由于其相对刚性的类杆构象而有问题，但是能够作出一组调用Stake半径和表观球度的假设。

全长GAG+样品载入到排阻限为20kDa～1.5kDa的Biogel P10凝胶过滤柱（1cm×120cm）上。在232nm下测定的吸光度表明大比例的GAG+分子具有大于20kDa的总表观尺寸（图13）。

据称，糖链必须长于约10～14圈才能增强对有丝分裂原的FGF家族的显著生物活性。根据表观分子量，14个全硫酸化的二糖链对应于约8.7kDa。由于在GAG+样品中发现的大多数链显示出表观分子量>20kDa，则认为它们具有的与BMP2-HBP的相互作用具有一些特异性亲合性，并非一般非特异性相互作用的结果是合理的。

GAG+糖种类

还有5种关键的糖胺聚糖糖家族：透明质素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。在这5种之中，仅仅硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素具有产生能够编码与具体细胞因子如BMP2的特异性相互作用的可变硫酸化域的能力。采用BMP2-HBP柱分离的这类型的糖种类的鉴定对于本研究是至关重要的，而采用诊断化学和酶降解组合进行确定。具体而言，硫酸乙酰肝素，这种与BMP2相互作用的主要GAG候选物之一，能够在亚硝酸存在下完全降解成其二糖组分。

因此，我们的HBP-保留的GAG样品用亚硝酸孵育20min后，在BiogelP10尺寸柱上进行分离。所得的色谱图的检测显示出所有的GAG+糖样品几乎完全降解，这通过在232nm和226nm处的吸光度进行测定（图14）。

该结果强烈地表明，对BMP2-HBP特异性分离的全长糖链主要包含硫酸乙酰肝素，因为其它糖链并不受亚硝酸解聚作用的影响。

尽管几乎所有GAG+链能够按照这种方式降解，但是小峰仍然在较高分子量（>20kDa）下观察到。认为这都是由硫酸软骨素构成，其中CS-B（硫酸皮肤素）和CS-E（软骨素-4,6-硫酸酯）证实了类似于硫酸乙酰肝素的硫酸化作用的复杂性。

GAG种类分析

BMP2-HBP特异性GAG（备选种类）

通过暴露于亚硝酸降解全长GAG+链清楚地显示出，大多数GAG+糖链由硫酸乙酰肝素糖种类构成（图14）。然而，GAG+样品的降解并未完全，这通过在高分子量区域的剩余峰就能够观察到。这些峰点的存在强烈指示其它糖链的种类的可能性，如鲨鱼软骨素（chrondroitin）或硫酸皮肤素。我们接着寻求通过首先检测各种商购获得的软骨素和皮肤素糖对于BMP2-HBP柱的亲合性，而检测其它两种糖类型可能对于该细胞因子具有的可能亲合性。

我们通过在每种情况下将6mg糖在用于从MC3T3基质样品中分离GAG+链的相同条件下载入到BMP2-HBP柱上，而测试了软骨素-4-硫酸酯（C4S）、软骨素-6-硫酸酯（C6S）和硫酸皮肤素（DS）。

图示说明每一三糖链类型的亲合性的色谱图表明，仅仅C4S（图5）对于肽具有任何显著的亲合性。这种对于C6S（图16）和DS（图17）样品观察到的对BMP2-HBP柱缺乏亲合性的亲合性一起考虑，似乎表明，C4S具有特定的潜在显著的与BMP2肝素结合位点的相互作用。

由于硫酸软骨素和BMP2之间的任何潜在的相互作用没有被充分表征，则这些结果会导致对柱色谱作为精确监控BMP2/乙酰肝素相互作用的合理性产生质疑。为了进一步探索相互作用的动态特异性，我们测试了几种商购可获得的糖种类对于柱子的亲合性。这些包括硫酸乙酰肝素、低分子量肝素（肝素-LMW）、高分子量肝素（肝素-HMW）和用肝素酶I处理的肝素-HMW。

有意思的是，这些商购获得的GAG种类没有任何一个显示出证实与该肽柱具有任何特异性相互作用。源自牛肾的硫酸乙酰肝素具有非常低的亲合性（图18），通过其不能阳性增加FGF2-介导的细胞增殖（数据未显示）而进一步证实了这种行为，与在HS2存在下观察到的相同。这种GAG样品结合至该柱子的能力的降低可能是由于其是以相对未硫酸化形式销售所致。

所测试的肝素样品没有一种显示出对该柱子的即使微小的亲合性。这对于BMP2本身尤其有意思的是有史以来首次采用肝素柱进行分离。为了证实这一结果，LMW（图19）和HMW（图20）肝素都进行了测试；两种都没有显示出任何对该柱子具有明显的亲合性。

正如我们总结的，相对少量的BMP2-HBP肽可能具有维持其对更大肝素分子的结合的困难，我们接着采用肝素酶I预消化肝素-HMW样品。这些更小肝素-HMW片段随后过BMP2-HBP柱；然而，这种处理并未显示出改善了任何肝素样品结合这种肽柱的能力（图21）。

由于传统上有通过肝素亲合性分离的BMP2，这种肽柱表现出不能与任何各种肝素制剂的任何特异性相互作用，多少有些出乎预料。然而，这可能是因为相互作用的“受体-配体”次序颠倒所致；在这种情况下BMP2-HBP代表固定的“受体”正好与代表“配体”的肝素相反，或BMP2-HBP或可溶性肝素的浓度有助于那种在流动/盐应力下迅速否定任何亲合性的解离状态。

结论

前成骨细胞衍生的ECM底物的使用为我们提供了模拟与成骨诱导作用有关的，天然分泌的ECM结合的GAG的有用模型。尽管许多先前的研究已经检测了这种天然相互作用具有调节BMP2活性的作用，这通常在细胞因子的水平上实施，而不是以研究生物调节GAG的序列特异性的观点实施的。

因此这里我们寻求研究天然分泌的GAG在MX底物中的可用度和用于引导序列特异性相互作用和调节BMP2诱导的对成骨谱系的C2C12成肌细胞功能的潜能。

阴离子交换

这种特殊标准和充分表征方案的使用为我们提供了对于从NH₄OH–处理的MX底物的GAG可接近性的结论性证据。开始我们的注意力主要围绕用于溶解ECM细胞组分的苛刻化学处理，而这也导致大多数GAG从ECM剥离。然而，在阴离子交换色谱中观察到的显著高亲合性峰清楚地说明了大量GAG保留于MX底物中。尽管这种特殊方法学并未容许鉴定各GAG种类，但是这的确提供了其存在于样品中的结论性证据，因为它们属于通过细胞分泌的大多数带负电分子。

BMP2-HBP柱系统

先前对于BMP2肝素结合肽的功能角色的研究为我们提供了一个研究BMP2与GAG具有的潜在特异性相互作用的有用工具。这个单链氨基酸，位于每一BMP2单体的N端，似乎仅负责介导对GAG的BMP2亲合性。

因此我们研究了BMP2分子作为在试图保持这些承载对细胞因子的相对亲合性的GAG链中配体“诱饵”的区域的用途。按照这种模式使用BMP2-HBP导致HS明显保留于肽柱（GAG+）。

柱子制备

采用N-端生物素化的HBP，我们制备了BMP2-HBP亲和色谱柱，并能够成功保留用于控制天然BMP2同型二聚体的候选物的GAG样品。初始制备这种柱子突出了一些有趣的问题。制备与tGAG预混的生物化BMP2-HBP显示出不能结合至该柱子。因为后面的测试表明当载入时BMP2-HBP易于连接至抗生蛋白链菌素柱，就其自身而言该结果表明GAG干涉该肽生物素化位点与抗生蛋白链菌素柱结合的能力。tGAG自身并未携带对于抗生蛋白链菌素的亲合性，表明可能通过位阻作用与BMP2-HBP的直接相互作用，是其原因。

柱子的优化

由于没有任何容许我们估算在我们的样品中GAG+糖的结合容量的直接信息，我们的肽柱子需要进行优化才能确保过量样品的载入不会导致柱子饱和并因此而损失样品。这最初涉及有意饱和柱子以测定已知量的BMP2-HBP的结合容量。即使采用大量的tGAG，该肽也能够保留大量的GAG+糖链。在这些条件下，少至1mg的BMP2-HBP都能够在两个循环中完全保留所有的GAG+链。因此，柱子看起来“刺激”了实际的BMP2生长因子柱并提供了提取GAG+样品的极度有效的方式。

肽基柱子对于特异性GAG分离的优化是大大依赖于所用蛋白的尺寸和各化学特性而变化的复杂程序。先前的研究，利用了FGF-1和2生长因子柱（Turnbull和Nurcombe，个人通讯），也显示出对连续柱子维护和短期活柱子寿命的显著需要。这些研究证明了采用肽柱子工作的吃力性以及正确优化这种方式的系统必须有的细心。不幸的是，尽管存在分析特异性蛋白-GAG相互作用的其它系统，但是这些一般都缺乏分离足够量的用于进一步分析GAG的能力，使之不适合用于我们预期的研究方法。

GAG域分析

GAG硫酸化模式，尤其是在硫酸乙酰肝素（HS）的情况下，经常集中于与少硫酸化的区域相互间隔的高硫酸化的域。这种将硫酸化位点分组成域是提供对GAG链的配体的特异性结合区域，容许单个糖分子潜在地结合各种不同的靶，并稳定这些之间的相互作用，这一点正如在FGF系统中所见。对于HS-配体相互作用，除这种提出的模型，还包括干扰素γ（IFNγ）和人硫酸乙酰肝素之间的相互作用。在这种情况下，GAG和IFNγ之间的相互作用导致了细胞因子的效能提高。保持与局部GAG解离的IFNγ迅速被加工处理成非活性形式，由此防止其扩散之后在不正确的区域产生信号传递。IFNγ也表现出四种独立的肝素结合域，每一种具有不同的序列，对于肝素结合蛋白这个发现并非异常。然而，仅仅两个在蛋白C端立即发现的域已经显示出介导INFγ肝素结合特性。重要的是，具有对于那些两个IFNγ肝素结合位置的特异性亲合性的HS序列分析与通常观察的HS-配体相互作用模型相比，揭示出有趣的差异。在这种情况下，发现HS负责IFNγ结合的序列主要由N-乙酰化区域构成，具有极少硫酸化作用。这个区域通过两个小的N-硫酸化区域侧接。这显著地不同于在FGF中观察的系统，其中NS域中的硫酸化模式负责介导FGF与HS之间的相互作用。近年来，这种类型的相互作用已经在许多其它系统，如PDGF、IL-8和内皮生长抑制素中观察到。这类型与HS的相互作用的发现，正如在这些细胞因子中所观察到的，可能能够解释在透明质素中观察到的生物活性，这种生物活性在沿着其链上的任何位点都没有硫酸化模式，并仍然具有介导这种因子如NF-KB的活性的能力。

这些观察到的配体和GAG，尤其是IFNγ之间的相互作用，显著不同于所提出的和我们观察到的HS和BMP2之间的相互作用模式。BMP2的单个N-端肝素结合域表现出没有二级结构并且看起来仅仅是基于电荷与HS发生相互作用。尽管结合这种肽序列的HS的深度序列分析并未实施，但是其需要在约300mM NaCl条件下洗脱的要求致使我们怀疑中度硫酸化的存在，由此将这种相互作用放置于传统介导特异性相互作用的硫酸化模式的模型中。

GAG+链特异性

硫酸化模式分配到为HS提供能够稳定蛋白质组学相互作用的能力的域中，也导致了重组长度和复杂性的GAG+糖链可能具有多个对于BMP2-HBP自身没有直接亲合性的可能性，因为其具有不同硫酸化序列。相反，一些被鉴定为对BMP2-HBP没有亲合性的全长糖链（GAG-）可能含有一些确实具有这种亲合性的隐避的域是可能的。

在近年来，许多报道已经出版，为这些复杂碳水化合物链中的“硫酸化代码”提供了强有力的证据。尽管这些“硫酸化代码”的细节仍然很难阐明，且长链硫酸化碳水化合物的测序仍是一个复杂费时的过程，已经提出了许多GAG和配体之间特异性相互作用的可能模式。尤其是一个观察结果已经使许多GAG-配体模型被表征；沿着许多类型的GAG，如硫酸乙酰化肝素的长度硫酸化作用被分组成离散区域，或“域”。有意思的是对于这种现象还没有观察到模板，而看起来主要是负责这个阶段的GAG合成的磺基转移酶的临时活性的结果。

在研究特异性GAG序列中尤其有用的工具是许多能够用于检测复杂碳水化合物链靶向解聚的肝素裂解酶，由此提供了对其结构的洞查。一种具体的乙酰肝素裂解酶，肝素酶III（肝素酶），在侧接可能出现在硫酸乙酰肝素链中的高度硫酸化域的位点切割硫酸肝素链。因此，采用这种酶，就有可能从全长糖链中释放出这些潜在的活性区域并且如果它们是作为单个域发挥其功能时则就可能经亲和色谱从对BMP2-HBP没有特异性亲合性的区域中将其分离出来。

这是很重要的，注意到，在GAG-配体相互作用的情况下，通过序列亲合性并非一定能保证生物活性。通过GAG在其与各种配体结合期间介导的活性模式，取决于系统，是显著不同的。在其中糖链负责经稳定四级蛋白结构而延长蛋白-蛋白间相互作用，如发现于FGF和其受体之间，以及HGF/SF和Met之间的相互作用的情况下，多重离散的硫酸化区域可能涉及于介导糖链的预期生物活性。在这种情况下，单个硫酸化域从全长碳水化合物链中分离出来，实际上可能导致糖生物活性的抑制作用，因为尽管每一“域片段”仍结合其预定靶但是其不可能介导合并的全长碳水化合物链的预定生物学效应。

有意思的是，正是这种GAG-配体相互作用的具体特性精确地产生出适用于调节BMP2活性的方法的这种模式。所提出对于BMP2生物活性的GAG调节模型涉及将细胞因子固定于ECM中的GAG或细胞表面上。在这种类型的系统中，应用对于BMP2的肝素结合域具有特异性的外源GAG，将会妨碍这种相互作用，增加了短期BMP2介导的信号传递，类似于在加入可溶性肝素期间观察到的效应。尽管还有一些迹象表明这种模式的相互作用将继续保护细胞因子免于蛋白水解作用，但是BMP2从其预定生物活性区域移位，长期具有负面影响细胞因子效率的可能。

对照测试我们全长GAG+和GAG-链产生了在其主要分离期间观察到的那些类似的情况。然而，用肝素酶III处理后的GAG+和GAG-链分析，给出了令人惊讶的结果。GAG+链的消化基于对BMP2-HBP的简单亲合性似乎并未产生可分离的片段。而且，全长GAG-链的消化并未导致从阴性糖链释放阳性域。可能是酶消化并未完全。然而，所得的色谱图清楚地显示当与全长GAG链比较时，在232nm处的吸光度大大提高。由于在232nm处糖胺聚糖的大比例吸光度是由如在酶解聚期间形成的不饱和键吸光所介导的，则这强烈地表明实际上酶消化是成功的。

这个结果暗含的意义多少有些不寻常。这个数据表明GAG链不仅仅是通过特异性地与BMP2发生相互作用的细胞合成的，而是在MC3T3细胞的情况下，这些糖链具有许多对BMP2代谢方面具有特异性的序列重复单元。BMP2是极度强效因子的事实，可以提供对这个观察结果的解释。BMP2对间充质祖细胞成骨诱导作用的影响的文献非常充分，这正是其诱导甚至更远离成骨谱系的细胞中异位骨形成的能力。鉴于这种效能，BMP2的异常信号传递已知对于伤愈和发育都具有有害的后果。许多前成骨细胞GAG上BMP2-HBP相互作用序列的重复单元被设计而确保最大结合，由此调节这些细胞因子诱导细胞命运变化的能力。相反，体内产生的极度低浓度的BMP2也可能要求这些类型的糖链生产以确保保持足够的局部浓度，通过体外诱导C2C12成肌细胞的成骨分化需要极高浓度的BMP2支持这一观察结果。

尤其有意思的是这个事实，即产生这种BMP2-结合域的重复，还没有阐明模板或时机。在单个糖链中序列特异性域的精度和可再现性（与采用相对其它配体的那些随机成簇这种域相反），强烈地表明这些细胞的确实际上具有引导特异性糖序列产生的能力。HS结构的当前理解间接表明在序列特异性区域的产生中碳水化合物链是逐渐合成后进行“编辑”的，而观察点也集中在一些酶“模版”方式，由此，特殊磺基转移酶以及其它相互作用的分子的局部浓度用于直接控制特异性糖序列的产生。我们当前对这种特异性合成模式的理解都主要是基于许多研究包括Lindahl et al.的抗凝血酶III和肝素之间的高亲合作用的文献以及那些Esko et al.的涉及改变GAG合成路径的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞突变体的研究而形成的。这些研究，尽管对GAG分析的方法明显不同，但是所有的都针对特异性GAG合成的高度保守系统，用于直接调节细胞因子和受体活性。重要的是，这些研究也起到了解释这种BMP2重复单元的潜在产生，这正如在我们的研究中所观察的结果。

GAG+组成

全长GAG+尺寸

单个GAG链对于FGF的生物活性与碳水化合物链长度紧密地相关。评价GAG生物活性的常用方法是分析更短的硫酸化域片段，并由此确定需要介导所观察活性的最短可能序列。

采用这种方法，我们首先测定全长GAG+糖链，并确定其尺寸上>20kDa，长度足以承载多个对BMP2具有亲合性的域。有意思的是，这个观察结果对早期用肝素酶3处理的GAG+样品显示出对BMP2具有特异性亲合性的碳水化合物链片段的多个重复单元的观察结果提供了支持，因为这种尺寸的可变硫酸化糖链具有承载许多硫酸化域的能力。

GAG+糖种类

对于能够编码与BMP2所观察的特异性相互作用而构建“糖组（glycome）”的5个糖胺聚糖类型的大多数而言，有必要阐明这些GAG类型中哪一个能够参与这个特异性结合作用。尽管对于这种相互作用的首选是硫酸乙酰肝素，但是类似的生长因子相互作用对于软骨素和硫酸皮肤素也已经证实。

硫酸乙酰肝素总体上能够用亚硝酸解聚成其二糖组分。这种特殊特性，肝素和硫酸角质素也具有，对于分析特异性GAG种类至关重要。在我们分析我们的GAG+样品的碳水化合物组分的情况下，由于亚硝酸的降解作用是硫酸乙酰肝素的诊断特性。这种可能性主要是由于相比于肝素或硫酸角质素经由硫酸化的硫酸乙酰肝素的更高程度的电荷模式。最后，这种电荷模式负责BMP2与HS的特异性相互作用。

我们利用了亚硝酸方案的分析表明指示GAG+样品组中大多数糖实际上是1,3-连接的，因此是硫酸乙酰肝素的GAG+样品发生完全降解。这个结果支持关于硫酸乙酰肝素细胞因子相互作用，尤其是BMP2表现出了与肝素和HS的相互作用的许多观察结果。

GAG种类分析

BMP2-HBP特异性GAG（备选种类）

在GAG+样品通过亚硝酸降解之后的观察到的小残余峰支持其它具有一些对BMP2特异性亲和性的硫酸化GAG可能在GAG+样品组中发现的可能性。鉴于我们当前对硫酸化作用在介导GAG和BMP2之间相互作用中的作用理解，软骨素和皮肤素是显示出对BMP2具有特异性相互作用的最可能的备选糖，正如在硫酸化模式中显示出的最高潜在的多样性的那些。

经常对于GAG分析采用的方法学包括检测关于GAG-配体相互作用的单个硫酸化位置的作用。这种分析方法提供了单个硫酸化位置在维持GAG链与其特异性靶之间的相互作用的重要性的指示。而且，因为仅仅GAG的不同种类具有对其它种类具有特异性的硫酸化模式的潜势，这能够有助于缩窄可能显示出对特异性配体具有亲合性的可能糖胺聚糖候选物的范围。

最后，我们检测了可变地硫酸化的CS链、C4S和C6S、以及标准DS具有的对BMP2-HBP的亲合性。有意思的是，具有任何对BMP2-HBP显著亲合性的仅仅有C4S。这个数据表明可能是4-O-硫酸化对于CS与BMP2-HBP发生相互作用是必需的。有意思的是，硫酸皮肤素显示出对BMP2-HBP没有亲合性。这个观察结果是有意义的，因为DS是证实类似于HS的硫酸化中多样性的仅有CS种类。而且，我们的观察结果指示出DS中GlcA至IdoA的差向异构化作用影响这种糖类型结合BMP2-HBP的能力。C4S和DS都能够携带4-O-硫酸化，然而相比于C4S仅仅少量DS保留于柱上。另外，这种亲合性的缺乏可能简单地是由于没有承载足够的有效介导与BMP2-HBP结合的4-O-硫酸化的这个特殊批次DS所致。有意思的是，这些特殊的观察结果看起来证实了BMP2和承载4-O-硫酸化作用的CS之间的相互作用。尽管先前的研究已经研究了CS-BMP2相互作用在药物递送系统中的用途，但是关于单个CS种类和BMP2之间的任何序列特异性相互作用知道的尚不多。然而，因为HS链由1,4-连接的二糖单元组成，则所观察的负责CS-BMP2相互作用的4-O-硫酸化作用在HS-BMP2相互作用中找到，这指向了在CS中并未发现的序列特异性相互作用。因此，有可能是亚硝酸处理后观察到的残余峰可能包含少量带有C4S或DS的4-O-硫酸化作用。

进一步的研究表明，商购的HS或肝素都没有保持对该肽柱的任何显著亲合性。用于这个分析中的HS从Sigma-Aldrich商购获得，源自牛肾。鉴于有关HS的组织特异性的所知，这种商购获得的HS，从牛肾源分离，可能具有可忽略的碳水化合物序列，需要碳水化合物序列特异性介导与BMP2的相互作用。类似地，LMW和HMW肝素都没有对肽柱显示任何亲合性。用于该分析的肝素也是购自Sigma-Aldrich，并衍生于猪肠粘膜。

尽管肝素与抗凝血酶III的相互作用已经进行了充分表征，而且尽管在易感分子的分离中其具有多功能作用，但是肝素与生长因子的相互作用由于其均一的硫酸化化作用而一般并未当作是特异性的。然而，鉴于肝素常规上用于分离BMP2，则令人惊讶的是肝素样品与肽柱的相互作用都未达到任何显著的程度。

对于这种肽柱与肝素之间缺乏相互作用的另一可能性是由于两分子之间的分子量的差异所致。连接至柱子的小BMP2-HBP可能很难维持其与较大的重度硫酸化肝素链的结合作用。然而，肝素酶切割的肝素不能结合至该柱子，似乎表明采用全长肝素对柱子的立体效应并不仅仅起到破坏糖和BMP2-HBP之间的潜在相互作用的效果。对于这种商购肝素不能与BMP2-HBP柱结合没有直接的显然理由，但是可以假设经间隔链从其结合的珠子进一步空间分离BMP2-HBP可能有助于改善这个问题。

总结

在本研究中，我们已经证明了使用亲和色谱能够分离一子类具有对BMP2-HBP的特异亲和性的糖胺聚糖，并已经显示出对产生可再现结果的该工艺过程的潜力。在我们这部分对于基于GAG和BMP2基质之间相互作用的研究，我们已经得到几个有关涉及介导这种结合作用及其结构的两种类型的GAG的观察结果。

我们的结果间接表明硫酸乙酰肝素介导BMP2对前成骨细胞ECM所具有的大部分亲合性，这种逐渐认识的相互作用负责调节BMP2的活性。而且，我们对于基于其对BMP2肝素结合位置的亲和性而分离的ECM-驻留的GAG可能结构的研究已经产生了令人惊讶的结果。

我们的数据表明，全长BMP2GAG+链并不是由对于BMP2具有特异性亲合性而被对此因子很少或没有亲合性的区域中断的单个域组成的。相反，我们的结果隐含表明，这些GAG+链包含了多个BMP2结合域重复单元。这个结果在多个水平上是令人惊讶的。首先，需要完成对全长>20kDa的碳水化合物链的这个观察结果所需的重复指向一些合成模板的模式的存在。实际上，尽管先前的研究已经不能推导用于组织特异性GAG链组装的模板，但是正是这种特异性存在的事实支持基于模板系统的存在。尽管对此过程还没有基因组模板被阐明，但是还是存在一些蛋白组学的，或许酶的模板的可能性。

其次，这种观察结果提供了一些关于BMP2与GAG之间相互作用的重要性的证据。沿着碳水化合物链长度的BMP2亲合性位点的多个重复单元可能需要确保BMP2最大结合至ECM。这种特殊结合作用已经证明显著地增长了该因子的半衰期，以及可能负责维持有效的局部浓度而维持信号传导。另外，一些研究已经提出了一种模型，BMP2由于与基于ECM的GAG相互作用而被限制了与其受体发生相互作用。在这种特殊的情况下，BMP2亲合性序列的重复将确保该因子的最大结合作用，由此降低了其与其受体相互作用的机会。

我们累积的结果表明，这种从ECM中分离GAG的系统是可行的而可能产生对BMP2具有特异性亲合性的GAG链。

该研究支持先前关于GAG与BMP2之间相互作用的发现。尽管通过加入外源GAG+体外防止BMP2与ECM结合似乎提高了BMP2信号传递并上调了成骨基因表达，相反的观察结果也已经报道。在这些研究中，体内检测经HBP的BMP2的调节作用显示出当ECM GAG结合增加时，在长期的骨生成中的独特改善作用。可能这种相互作用通过防止该因子从其原始活性的位点向外扩散而在维持局部浓度方面起到了重要作用。根据这些研究和我们自己的观察结果，我们认为，BMP2的活性是通过与GAG的结合进行正负调节的。负调节可以经由Katagiri及其同事提出的模型精确发生，由此BMP2保留于ECM中，而远离其受体，导致BMP2信号传导的下调。然而，需要通过该因子进行信号传导的细胞可以潜在地分泌各种重塑胞外糖链的酶，如硫酸化酶和肝素酶，才能“截掉”保留BMP2于ECM中的GAG，由此释放该因子而容许其进行信号传导，导致BMP2-ECM相互作用最终成为正向维持该细胞因子活性之一。另外，通过细胞表面GAG的负向调节BMP2，可以经由具有其缔合的BMP2分子的GAG链内在化作用完成，这由Jiao及其同事已经观察到。

这些现有研究，结合我们自己的观察，已经让我们总结出，BMP2与硫酸肝素之间序列特异性相互作用代表了具有正负调节BMP2信号传导能力的复杂控制机制。生理上这种相互作用负责实现对于有关胚胎发育、前体参与和伤口愈合的诸多方面的该效能细胞因子的环境依赖性响应。

实施例2-BMP2肽特异性HS的纯化

我们使用了源于成熟BMP-2序列而具有肝素结合性质的肽来鉴定新型结合该肽的HS。

成熟BMP-2氨基酸序列：

QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKWLKNYQDMWEGCGCR[SEQ ID NO:14]

肝素结合肽氨基酸序列：QAKHKQRKRLKSSCKRHP[SEQ ID NO:1]

为了复制肝素结合位点的自然表现，我们在其C-端对该肽进行生物素化并保持脯氨酸（P）而改善该肽一旦结合至抗生蛋白链菌素柱的柔性/可接近性。

BMP2肽特异性HS的分离

所用材料包括BMP2-肽结合的抗生蛋白链菌素柱、HiPrep脱盐柱（GEHealthcare）、20mM PBS+150mM NaCl（低盐缓冲溶液）、20mM PBS+1.5M NaCl（高盐缓冲溶液）、HPLC级水（Sigma）、Biologic-Duoflow色谱系统（Bio-Rad）和冻干机。

该柱子用低盐缓冲溶液平衡并将1mg Sigma HS（H9902）溶解于低盐缓冲溶液中，通过BMP2-抗生蛋白链菌素柱。未结合的培养基组分通过冲洗低盐缓冲溶液（20mM PBS、pH7.2、150mM NaCl）除去，直至流出物在232nm处吸光度几乎归零。结合至基质的HS用高盐缓冲溶液（20mM PBS、pH7.2、1.5M NaCl）洗脱。收集峰部分并冻干48h。

HS1mg应用于该柱子并用含有低（150mM）NaCl浓度的20mM PBS缓冲溶液冲洗。在用低盐缓冲溶液冲洗之后，结合的HS用含高（1.5M）NaCl浓度的20mM PBS缓冲溶液洗脱。收集代表剩余部分（在232nm处监控）的峰并进行进一步脱盐。

在冻干之后，获得6mg阳性HS（GAG+）和1.8mg阴性HS（GAG-）。

实施例3-BMP-2特异性硫酸乙酰肝素的评价

C2C12是正常展示肌源性分化而能够引导在第3代补充BMP2的成骨谱系的鼠间充质干细胞。第3代的C2C12细胞用1000g/L葡萄糖（低葡萄糖）、10%的FCS、1%的P/S维持于DMEM中而不采用L-谷氨酰胺（维持培养基）。

具有1000g/L葡萄糖（低葡萄糖）、5%的FCS、1%的P/S而无L-谷氨酰胺的DMEM用作分化培养基。

BMP-2对骨生成的影响

我们通过测定成骨标记（骨钙素，成骨相关转录因子（osterix），Runx2）的表达水平而评价外源BMP-2对骨生成的影响。

通过分析向细胞中加入不同量的（100ng/mL和300ng/mL）BMP-2的影响，我们观察到，与加入300ng/mL BMP-2相比，在具有100ng/mLBMP-2的细胞中，在第5天成骨相关转录因子（osterix）、骨钙素和Runx2表达显著降低（图27-29）。因此，我们选择了这个时间点用于未来测试，因为任何变化都应该易于观察。

材料和方法

使用了第3代的C2C12细胞。在第3代以1×10⁶个细胞/瓶将细胞保存于液氮中。一旦细胞从液氮中取出，我们加入500μL培养基，上下吸液而再冷冻细胞并立即加入15mL培养基。

培养基是具有1000g/L葡萄糖（低葡萄糖）、10%的FCS、1%的P/S而无L-谷氨酰胺的DMEM。处理培养基是具有1000g/L葡萄糖（低葡萄糖）、5%的FCS、1%的P/S而无L-谷氨酰胺的DMEM。

C2C12细胞容许生长至75%的汇合之后，在培养基中富集（正常下2～3天）。

细胞按照如下计数。培养基首先被吸取/弃除；加入15mLPBS，弃除PBS并加入3mL胰岛素，在37℃下培养5min而从烧瓶中提取细胞。加入9mL培养基中和胰岛素。使用GUAVA测定细胞数量而用于后续将细胞接种到实验孔板上。例如，对于3组12-孔板，30,000个细胞×36孔×3.7cm²=4,000,000个细胞。由原液稀释细胞并加入所需量的培养基进行细胞接种（每孔需要具有30,000个细胞的500μL培养基）。

为了制备BMP2原液，10μg rhBMP2（骨形态形成蛋白2）再悬浮于100μL的4mM HCl/0.1%BSA中。

使用了以下RNA提取方案。350μL的RA1缓冲溶液用于细胞裂解。细胞采用RA1在-80℃下冻干1天之后，细胞解冻并将溶解产物以11,000g过滤1min。滤出液与350μL的70%在1.5mL试管中的乙醇混合并以11,000g离心30s。加入350μL的MDB缓冲溶液并将混合物以11,000g离心1min。加入95μL的脱氧核糖核酸酶反应混合物并将混合物保持在室温至少15min。随后用200μL的RA2缓冲溶液冲洗（而使脱氧核糖核酸酶失活），并以11,000g离心30s。用600μL的RA3缓冲液冲洗，以11000g离心30秒。用250μL的RA3缓冲溶液冲洗，以11,000g离心2min。用60μL的无核糖核酸酶的H₂O洗脱RNA，以11,000g离心1min。采用超微分光光度计（Nanodrop）测定浓度（以ng/μL单位计）。

RT（逆转录）实验按照如下实施。以下物质混合于PCR试管中：随机引物（0.1μL），DNTP（1μL），RNA（250/500ng），无核糖核酸酶的H₂O（总计达13μL的最终体积）。在65℃下孵育5min。在冰上孵育至少1min。收集内容物并在加入以下物质之前简单地离心：第1条链缓冲溶液（4μL），DTT（1μL），RnaseOUT（1μL），SSIII Reverse（1μL）。总计达20μL的最终体积。通过上下吸液而混合。在室温下孵育5min。在50℃下孵育60min。置于70℃15min而使反应失活。

逆转录实验隔天实施2次并将PCR产物收集在一起，稀释至最终浓度2.5ng/μL，用于后续实时PCR。

实时PCR采用

Fast Universal PCR master Mix（2X）（Applied Biosystem）进行实施。PCR master Mix（10μL），ABI probe（1μL），cDNA（1μL），ddH₂O（8μL）。GAPDH和β肌动蛋白用作相对于实验靶OSX（osterix）、OCN（骨钙素）和Runx2的对照基因。

BMP-2特异性HS GAG+对骨生成的影响

我们通过定量聚合物酶链反应（qPCR）测定成骨标记物（osterix、Runx2、碱性磷酸酶和Bspll）的表达水平，评价了在实施例2中分离的BMP-2特异性HS（GAG+）对骨生成的影响。准备一个时间段比较10天时间的标记表达，而将对照物与低和高剂量BMP-2比较，高剂量是诱导细胞分化的最佳条件。

材料和方法

细胞以30,000个细胞/cm²接种于维持培养基中并保持粘附过夜。接下来的天里，我们用以下物质将其转化为分化培养基：

·无添加剂

·100ng/mL BMP-2（阳性对照）

·100ng/mL BMP-2+30μg/mL-GAG（Neg GAGs）

·100ng/mL BMP-2+30μg/mL+GAG（Pos GAGs）

·100ng/mL BMP-2+30μg/mL肝素（Sigma#H3149）

·100ng/mL BMP-2+30μg/mL总硫酸乙酰肝素（Sigma#H9902–HS后分馏）

碳水化合物和BMP-2以最小可能的体积混合到一起并在室温下培养30min之后，将其加入培养基和细胞。

5天之后，RNA采用Macherey-Nagel试剂盒提取并实施逆转录。

正如图30～33中所示，源自猪粘膜的硫酸乙酰肝素（总HS）能够提高BMP-2活性（通过GAG+诱导的碱性磷酸酶、osterix、Bspll和Runx2表达提高所示），而这种活性包含于结合BMP2（Pos GAGs）的部分中。这意味着我们能够通过将其通过BMP-HBD肽柱而分离出商购HS的BMP增强部分。

实施例4

MC3T3-E1（s14）前成骨细胞（由胚胎的颅骨建立的鼠胚胎颅骨成纤维细胞系）每72h扩增于补充10%的FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素的αMEM培养基中，直至足够的细胞产生用于铺板。细胞通过以5×10⁴细胞/cm²铺于补充了10%的FCS、2mM L-谷氨酰胺、25mM抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸酯和青霉素/链霉素的αMEM培养基中而进行分化。培养基每72h进行更换持续8天，在该时间点，收集细胞和培养基。培养基保持并通过高速离心和通过0.4μm滤器过滤而澄清。采用细胞刮片和含PBS（150mM NaCL w/o Ca²⁺和Mg²⁺）、1%CHAPS、8M脲和0.02%NaN₃的提取缓冲溶液瓦解细胞层。

在所有阶段（除非另外指出），样品在载入柱系统之前，都进行净化。这个过程包括以5000g高速离心30min，并通过0.4μm注射过滤器过滤。样品在通过该柱系统之前，总是直接进行净化，而防止在不流动溶液中形成沉淀。

阴离子交换色谱用于从培养基和细胞层样品中分离蛋白糖胺聚糖（PGAG）部分。在每一种情况下，培养基或细胞层样品都以5mL/min的流速跑过采用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统（Biorad）上用Capto Q阴离子交换珠（Biorad）填充的Pharmacia XK26（56-1053-34）柱子。样品载入到低盐缓冲溶液中，该低盐缓冲溶液含PBS（150mM NaClw/o Ca²⁺和Mg²⁺）、100mM NaCl、0.02%NaN₃、pH7.3。样品在高盐缓冲溶液中洗脱，该高盐缓冲溶液含PBS（150mM NaCl w/o Ca²⁺和Mg²⁺）、850mM NaCl和0.02%NaN₃、pH7.3。收集相关部分并汇集在单个PGAG样品中，冻干以预备脱盐。

PGAG样品通过四个按序连接的Pharmacia HiPrep^TM26/10（17-5087-01）柱以10mL/min的流速在采用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统（Biorad）上脱盐。收集相关部分而汇集在单个样品组中，冻干以预备进一步处理。

在第四个步骤中，由脱盐过程获得的PGAG样品组进行链霉蛋白酶和神经氨糖酸苷酶处理，以消化核蛋白并随后释放GAG链。在这方面，冻干的PGAG样品再悬浮于最低体积的25mM乙酸钠（pH5.0）中并通过0.4μm注射过滤器过滤而澄清。总样品体积以500μL等分试样分散到10mL玻璃试管中。向该等分试样中加入500μL的1mg/mL神经氨糖酸苷酶之后该混合物在37℃下培养4h。培养之后，向每一样品中加入5mL的100mM Tris-乙酸盐（pH8.0）。另加1.2mL的10mg/mL链霉蛋白酶，重构于500mM Tris-乙酸盐和50mM乙酸钙中（pH8.0），加入到每一样品中之后，该混合物在36℃下培养24h。在该处理之后，所有体积都合并并通过离心和过滤而制备用于阴离子交换色谱。

在第5个步骤中，在蛋白切裂之后分离出的GAG样品通过以5mL/min的流速在采用QuadTec UV-Vis检测器的Biologic DuoFlow系统（Biorad）上用Capto Q阴离子交换珠（Biorad）填充的Pharmacia XK26（56-1053-34）柱子上洗脱。在这方面，样品载入含PBS（150mM NaCl w/o Ca²⁺和Mg²⁺）和0.02%NaN₃，pH7.3的低盐缓冲溶液中。样品在含PBS（150mM NaClw/o Ca²⁺和Mg²⁺）、850mM NaCl和0.02%NaN₃，pH7.3的高盐缓冲溶液中洗脱。收集相关部分，冻干并根据前述PGAG样品脱盐的方案进行脱盐。

N-端生物素化肽（1mg），对应于BMP-2的肝素结合域，含有由QAKHKQRKRLKSSCKRH[SEQ ID NO:17]表示的氨基酸序列，与含有PBS（150mM NaCl w/o Ca²⁺和Mg²⁺）的低盐缓冲溶液混合。该混合物通过用抗生蛋白链菌素-涂覆的树脂基质填充的柱子洗脱。随后柱子暴露于含PBS（150mM NaCl w/o Ca²⁺和Mg²⁺）、850mM NaCl和0.02%NaN₃，pH7.3的高盐缓冲溶液，确定是否在这种条件下肽已经牢固地结合至基质。从该柱子没有观察到大量肽的损失。柱子随后用低盐缓冲溶液冲洗，以预备样品载入。

GAG混合物（2mg），采用实施例1中概述的过程步骤分离出来，悬浮于低盐磷酸钠缓冲溶液（1mL）中，并载入到实施例2的肽柱上。样品用含PBS（150mM NaCl w/o Ca²⁺和Mg²⁺）的低盐缓冲溶液洗脱。在UV-Vis检测器迹线中观察到对应于具有可忽略的BMP-2亲合性的GAG的峰。负责产生该峰的柱子部分合并。这些部分已知为“GAG-”—负号表示缺乏对柱子的亲合性。当由UV-Vis检测器明显发现迹线已经变平至基线，且不再有另外的寡糖洗脱时，洗脱溶剂变成含PBS（150mM NaClw/o Ca²⁺和Mg²⁺）、850mM NaCl和0.02%NaN₃且pH7.3的高盐缓冲溶液。在洗脱溶剂的如此变化之后，在UV-Vis检测器迹线中，观察到对应于BMP-2特异性GAG的峰。合并负责产生该峰的柱子部分。这些部分已知为“GAG+”—正号表示存在对柱子的亲合性。在前成骨细胞的GAG化合物的情况下，GAG+部分占10%的总GAG混合物。

实施例5

加入BMP2具有明显确定的能力可诱导C2C12成肌细胞中的成骨分化。类似地，用肝素预培养BMP2已经证明二者都延长了细胞因子半衰期以及其体外的即时效能。本文中，我们检测了GAG+和GAG-部分体外通过BMP2增强C2C12细胞成骨诱导作用的能力。

源于实施例4的GAG+样品（0、10、100、1000ng/mL）在体外存在BMP-2（0、50、100ng/mL）的情况下，加入到C2C12中成肌细胞中。骨钙素基因相关表达的测定表明，GAG+样品能够以远低于当前疗法中所用BMP-2的水平（300ng/mL），加强BMP-2使骨钙素基因有效表达。该分析的结果（包括计算的p-值和误差）都以图形表示于图34中，其中对于每一“培养基条件”的实验条件如下：

1.对照细胞，没加入BMP-2，没加入GAG

2.BMP-2，50ng/mL

3.BMP-2，50ng/mL、GAG+，10ng/mL

4.BMP-2，50ng/mL、GAG+，100ng/mL

5.BMP-2，50ng/mL、GAG+，1000ng/mL

6.BMP-2，100ng/mL

7.BMP-2，100ng/mL、GAG+，10ng/mL

8.BMP-2，100ng/mL、GAG+，100ng/mL

9.BMP-2，100ng/mL、GAG+，1000ng/mL

有意思的是，尽管1000ng/mL的GAG+能够显著增强BMP2介导的骨钙素表达，但是加入浓度低于1000ng/mL的GAG+似乎逐渐抑制了该表达。另外，通过50ng/mL BMP2，加入足够的GAG+也能够促进骨钙素的诱导作用，超过了单独以100ng/mL BMP2的情况，显示出这种相互作用的效能。

这种基于细胞培养的分析证实，向C2C12成骨培养基中连同BMP2一起加入GAG+导致了骨钙素表达的显著上调，表明BMP2信号传导效率提高。这个结果支持GAG+链与BMP2的特异性结合作用，由此阻断了BMP2-HBP而防止其与基于基质的PGAG的结合作用。所得成骨基因表达的上调与采用肝素达到相似效果的先前研究中观察到的结果相当。有意思的是，加入浓度低于1000ng/mL的GAG+似乎对BMP2信号传导具有初始拮抗效应。

一个解释这个观察结果的可能假设是围绕结合一定数量的BMP2分子的给定数量的GAG+分子的能力进行的。在没有向培养系统中加入外源GAG+的条件下，大多数BMP2分子都将能够与ECM结合，由此远离其同源受体而不能立即开始信号传导。BMP2随后从ECM解离，无论自发地还是定向酶改变其结合的GAG链，具有诱导长期BMP2信号传导的能力。向该系统中加入大量的GAG+分子，正如在样品中补充1000ng/mL的GAG+的情况下，容许大多数BMP2分子保持在溶液中，在该溶液中，它们自由介导受体二聚并诱导下游信号传导。这些细胞因子/受体相互作用的过程可能需要特殊的浓度阈值才能维持信号传导的有效水平。在含有50ng/mL的BMP2的培养条件下，加入低浓度的GAG+容许部分可用的细胞因子保持可溶，同时剩余部分与ECM结合。在这些条件下，仅仅少量的BMP2保持可溶，但是由于其浓度低而在培养基中发生高度扩散，导致可忽略的信号传递。类似地，由于部分BMP2保持溶解，在ECM中发现的BMP2的量降低，导致通过直接细胞活性从ECM中释放的BMP2发生的信号传递降低。然而，在包含100ng/mL的BMP2的培养条件下，加入100ng/mL的GAG+，可溶性的基于ECM的BMP2的组合效应足以诱导类似于对照物水平的BMP2信号传导。然而，没有进行进一步的研究，在BMP2/GAG+信号传导中涉及的动力学仍然是未知的。未来利用表面等离子体共振的研究可能有助于诠释BMP2/GAG+相互作用的效能，并可能有助于理解这些观察结果。

实施例6

根据以下方法，采用乙酰肝素酶3切裂实施例4中的GAG+和GAG-糖链。GAG+和GAG-每一个都以4mg/mL浓度，采用乙酰肝素酶3（250mU酶/100μg寡糖）在37℃下独立地处理16小时。随后，该混合物在70℃下加热5分钟，而使乙酰肝素酶3失活。消化的GAG+和GAG-混合物每一个都独立地过肽柱。每一色谱过柱的UV-Vis检测器迹线表明，消化的材料如同未消化的材料都显示出对该柱子具有相同的亲合性。

Claims (7)

1.一种分离能够结合至具有肝素结合域的蛋白质的硫酸乙酰肝素的方法，所述方法包括：

（i）提供具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中所述肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，其中所述附加氨基酸的数量为1-20个；

（ii）将所述肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖混合物接触，以使容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物；

（iii）将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来；

（iv）从所述肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素；

（v）收集解离的所述硫酸乙酰肝素。

2.一种鉴定能够刺激或抑制细胞和/或组织的生长和/或分化的硫酸乙酰肝素的方法，所述方法包括：

（i）提供一种具有附着至支持物的肽分子的固体支持物，其中所述肽含有肝素结合域和可选的在N-和C-端中一端或两端的一种或多种附加氨基酸，其中所述附加氨基酸的数量为1-20个；

（ii）将所述肽分子与富含硫酸乙酰肝素的糖胺聚糖混合物接触，以使容许形成肽-硫酸乙酰肝素复合物；

（iii）将肽-硫酸乙酰肝素复合物从其余混合物分离出来；

（iv）从所述肽-硫酸乙酰肝素复合物解离硫酸乙酰肝素；

（v）收集解离的所述硫酸乙酰肝素；

（vi）将收集的所述硫酸乙酰肝素加入其中存在含所述肝素结合域的氨基酸序列的蛋白质的细胞或组织中；

（vii）测定以下一种或多种：细胞增殖、细胞分化、一种或多种蛋白质标记的表达。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括通过改变所述固体支持物的表面上存在的盐浓度，选择出对所述肝素结合域具有最高亲合性和/或特异性的硫酸乙酰肝素。

4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述方法包括获得对所述肽的结合亲和性小于1μM的硫酸乙酰肝素。

5.根据权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将收集的所述硫酸乙酰肝素进行进一步分析以便确定所述硫酸乙酰肝素的结构特性。

6.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述肽-硫酸乙酰肝素复合物与裂解酶接触。

7.一种通过权利要求1、2、3或4中任一项所述的方法获得的分离的硫酸乙酰肝素。

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