JP7145909B2 - ヘパラン硫酸 - Google Patents
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Description
あり;FNに結合する強力なヘパリン結合変異体は、特に非常に荷電しており、7~8のN-硫酸化二糖が必要であり、そして通常よりもより大きなドメインを伴う(>14残基)、(Falcone DJ, Salisbury BGJ. フィブロネクチンは、低密度リポタンパク質-ヘパリン-コラーゲン複合体のマクロファージ取り込みを刺激する Arteriosclerosis. 1988;8:263-73.;Mahalingam Y, Gallagher JT, Couchman JR. フィブロネクチンのヘパリン結合(HepII)ドメインへの細胞接着反応は、特定の特性を持つヘパラン硫酸を必要とする。 J Biol Chem. 2007;282:3221-30)。しかし、HSは、非硫酸化NAドメインによって分離された非常に硫酸化されたNSドメインを有することがこうした硫酸化ヘパリンとは異なり;こうした性質は、ヘパリンの副作用を伴わずに、タンパク質に選択的に結合するためのユニークな配置を提供する(Gandhi NS, Mancera RL. グリコサミノグリカンの構造およびタンパク質とのその相互作用。Chem Biol Drug Des. 2008;72:455-82.)
。
酵素切断によって解明可能である(Venkataraman G, Shriver Z, Raman R, Sasisekharan
R. 複雑な多糖の配列決定。Science. 1999;286:537-42.;Desai UR, Wang HM, Linhardt RJ. フラボバクテリウム・ヘパリヌム(Flavobacterium-heparinum)由来のヘパリン
・リアーゼに関する特異性研究 Biochemistry. 1993;32:8140-5.;Shriver Z, Sundaram
M, Venkataraman G, Fareed J, Linhardt R, Biemann K.ら ヘパリナーゼによるヘパリンにおけるアンチトロンビンIII結合部位の切断および低分子量ヘパリンの生成におけるその関与。Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:10365-70)。3つすべてのヘパリナーゼを組み合わせて用いると、ヘパリンまたはHSの90%より高い脱重合が可能である(Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Tsegenidis T, Hjerpe A. ヘパリンおよびヘ
パラン硫酸における二糖組成を決定するためのイオン対高性能液体クロマトグラフィ。J Chromatogr A. 1997;765:169-79.;Vynios DH, Karamanos NK, Tsiganos CP. グリコサ
ミノグリカンの分析における進歩:結合組織の生理学的および病的状態の評価のための適用。 J Chromatogr B. 2002;781:21-38.)。生じる二糖混合物を、既知の二糖標準との比較によって、PAGE(Hampson IN, Gallagher JT. ポリアクリルアミド-ゲル電気泳
動による放射標識グリコサミノグリカン・オリゴ糖の分離 Biochem J. 1984;221:697-705.)、SAX-HPLC(Skidmore M AA, Yates EおよびTurnbull JE. HPLCおよびMS分離のための発色団、蛍光およびマスタグでのヘパラン硫酸糖の標識。Methods in Molecular biology. 2009;534:157-69.)、または高感度キャピラリー電気泳動(CE)(Lamari F, Militsopoulou M, Gioldassi X, Karamanos NK. キャピラリー電気泳動:プ
ロテオグリカン中のグリカン部分の単糖、二糖およびオリゴ糖構成要素分析のための優れた小型ツール。Fresenius J Anal Chem. 2001;371:157-67.;Karamanos NK, Vanky P, Tzanakakis GN, Hjerpe A. ヘパリンおよびヘパラン硫酸二糖を性質決定する高性能キャ
ピラリー電気泳動法。Electrophoresis. 1996;17:391-5.;Sudhalter J, Folkman J, Svahn CM, Bergendal K, Damore PA. ヘパリンによる酸性線維芽細胞増殖因子の増強における、サイズ、硫酸化、および抗凝固活性の重要性 J Biol Chem. 1989;264:6892-7.;Militsopoulou M, Lamari FN, Hjerpe A, Karamanos NK. 紫外およびレーザー誘導蛍光検出を用いたキャピラリーゾーン電気泳動による2-アミノアクリドン誘導体としての12のヘパリンおよびヘパラン硫酸由来二糖の決定。Electrophoresis. 2002;23:1104-9)によ
って分析することも可能である。
(i)支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがRKDLGWKWIHEPKGYHのアミノ酸配列を有するヘパリン結合ドメインを含み;
(ii)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペプチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ;
(iii)混合物の残りからポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体を分配し;
(iv)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集する
工程を含むことも可能である。
パラン硫酸は、ブタまたはウシ腸粘膜、腎臓または肺由来である。
本発明の1つの側面において、上述の側面にしたがった、HS16を含む医薬組成物または薬剤を提供する。医薬組成物または薬剤は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含むことも可能である。
組織(軟骨、骨、腱、靱帯、皮膚、角膜)の修復および/または再生の方法を含むことも可能である。こうした修復および/または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。
植する工程を含む前記方法を提供する。
本発明の別の側面において、in vitroの細胞培養におけるHS16の使用を提供する。本発明の関連する側面において、in vitroの結合組織増殖におけるHS16の使用を提供する。本発明の別の関連する側面において、in vitroで結合組織を増殖させるための方法であって、外因性に添加されたHS16と接触させて間葉系幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
(i)間葉系幹細胞が組織を形成するために十分な期間、該細胞を、HS16と接触させて、in vitroで培養し;
(ii)前記組織を収集し;
(iii)傷害または疾患の部位で、前記組織を患者の体内に移植して、患者において、組織を修復、置換または再生する
工程を含む、前記方法を提供する。
本発明のいくつかの側面において、in vitroで幹細胞を培養する方法であって、ヘパラン硫酸HS16と接触させて、in vitroで幹細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。HS16は、好ましくは外因性であり、そして単離され、そして補充物として、例えば培地の一部として、培養に添加される。
角膜)の修復および/または再生の方法を含むことも可能である。修復および/または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。キットは、医学的治療法を提供するため、HS16、TGFβ1タンパク質および/または間葉系幹細胞を別個に、連続してまたは同時に投与するための使用説明書とともに提供されることも可能である。
(i)HS16;および
(ii)TGFβ1;
(iii)間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物を提供する。医学的治療法は、in vivoの創傷治癒、
結合組織の修復および/または再生の方法を含むことも可能である。修復および/または再生は、哺乳動物またはヒトにおけるものであることも可能である。産物は、場合によって、共投与のための組み合わせ調製物として配合されることも可能である。
増殖因子の安定性を、半減期、すなわち所定の組成物中の増殖因子の半分が分解され、そして/またはその活性を失うために掛かる時間の量に関して、測定することも可能である。増殖因子は、好ましくは、タンパク質増殖因子、より好ましくはTGFβ1である。HS16は、TGFβ1半減期を維持し、そして延長するよう作用する。該方法は、単離HS16を増殖因子(例えばTGFβ1)とin vitroで、例えば増殖因子(例えばTGFβ1)組成物の調製、その保存または輸送の一部として、接触させる工程を含むことも可能である。あるいは、該方法は、例えば、増殖因子(例えばTGFβ1)[組織中に天然に存在するかまたは組織に外因性に添加されたもの]が存在する組織に、単離HS16を投与することによって、in vivoで、単離HS16を増殖因子(例えばTGFβ1)と接
触させる工程を含むことも可能である。該方法はまた、外因性増殖因子(例えばTGFβ1)を組織に添加する工程を含むことも可能である。
図面の簡単な説明
本発明の原理を例示する態様および実験は、ここで、付随する図に関連して論じられるであろう。
に用いられる。
本発明は、HS16と呼ばれるヘパラン硫酸分子のクラスに関する。HS16分子は、TGFβ1のヘパリン結合ドメインに対応するポリペプチドに結合する、1またはそれより多いグリコサミノグリカン(GAG)を含有する化合物の混合物を濃縮する方法によって得られうる。特に、HS16分子は、アミノ酸配列RKDLGWKWIHEPKGYHを含むかまたは該配列からなる、TGFβ1のヘパラン結合ドメインに結合する、ヘパラン硫酸に関して濃縮することによって得られうる。濃縮プロセスを用いて、HS16を単離することも可能である。
本明細書記載の方法論によって得られうることに加えて、HS16はまた、機能的にそして構造的に定義されることも可能である。
GAGを各ウェル中に固定し、そして次いで、製造者の指示にしたがって、TGF-β1に曝露する。簡潔には、3つ組ウェルをまず、標準アッセイ緩衝液(SAB:100mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、0.2%v/v Tween20、pH7.2)中の5μg/mlのヘパリン、HSPM、HS16陽性またはHS16陰性でプレコーティングし、そして次いで、室温で一晩インキュベーションする。プレートを次に、SABで3回、注意深く洗浄し、250μlのブロッキング溶液(0.4%w/v魚皮ゼラチン、Sigma-Aldrich、SAB中)でブロッキングし、そして37℃で1時間インキュベーションする。次いで、TGF-β1を100、200、または400ng/mlの濃度で、ブロッキング溶液中に溶解した。プレートをSABで3回洗浄し、そしてタンパク質の各希釈物(200μl)を3つ組ウェルに分配し、そして37℃で2時間インキュベーションし、SABでリンスし、そしてブロッキング溶液中、200μlの750ng/mlモノクローナルマウス抗TGF-β1抗体(MAB2401、R&D Systems)を添加した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベーションし、SABで洗浄し、そしてブロッキング溶液中、200μlの1μg/mlポリクローナルヤ
ギ抗マウスビオチン化抗体(ab6788、Abcam)を添加した。再び、プレートを37℃で1時間インキュベーションし、SABで洗浄し、そしてブロッキング溶液中、200μlの220ng/ml ExtrAvidin AP(Sigma-Aldrich)を添加し
、37℃で30分間インキュベーションし、そして次いでSABでリンスする。最後に、200μlの現像試薬(SigmaFAST p-ニトロフェニルリン酸、Sigma-Aldrich)を添加し、37℃で40分間インキュベーションし、そして1時間以内に405nm
で読み取る。
連続添加することによって、HS試料を二糖およびオリゴ糖に消化する。乾燥HS試料を消化緩衝液(500μl;50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)中に再溶解し、そしてヘパリン・リアーゼI(5μl;5mIU)を各試料に添加する。回転ホイール(9rpm)上で穏やかに混合しながら試料をインキュベーションする(37℃、2時間)。ヘパリン・リアーゼIII(5μl;5mIU)を消化物に添加し、そしてさらに1時間(上述のように)インキュベーションする。ヘパリン・リアーゼII(5μl;5mIU)を添加し、そして消化物を上述のように18時間インキュベーションする。最後に、3つのヘパリン・リアーゼすべてのアリコット(5μl;5mIU)を同時に添加し、そして消化物をさらに24時間インキュベーションする。加熱(100℃、5分間)によって酵素消化を終結させる。すべての3つのHS試料を2つ組で消化する。
HS16を同定するため、本発明者らは、ヘパリン結合ドメインを有する特定のポリペプチドへの結合を示すグリコサミノグリカン分子を濃縮する工程を伴う方法を用いた。次いで、単離GAG混合物および/または分子を同定し、そしてこれらが、ヘパリン結合ドメインを含有するタンパク質を発現している細胞および組織の増殖および分化を調節する能力に関して試験することも可能である。これによって、in vitroおよびin vivoの両方
で、細胞および組織の増殖および分化に対する特定のGAG糖配列の影響の制御された分析が可能になる。この方法論は、本明細書に援用されるPCT/GB2009/000469(WO2010/030244)に記載される。本発明者らは、TGFβ1に高い結合を有するGAGを単離し、そして特徴付けるために、この方法論をTGFβ1に適用した。
(i)支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含み;
(ii)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペプチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ;
(iii)混合物の残りからポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体を分配し;
(iv)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集する
工程を含む、前記方法を提供した。
(i)支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがヘパリン結合ドメインを含み;
(ii)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、ポリペ
プチド分子を、グリコサミノグリカンを含む混合物と接触させ;
(iii)混合物の残りからポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体を分配し;
(iv)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカンを解離させ;
(v)解離したグリコサミノグリカンを収集し;
(vi)ヘパリン結合ドメインのアミノ酸配列を含有するタンパク質が存在する細胞または組織に、収集したグリコサミノグリカンを添加し;
(vii)細胞の増殖、細胞の分化、1またはそれより多いタンパク質マーカーの発現の1またはそれより多くを測定する
工程を含む、前記方法を提供した。
て用いることも可能である。組み合わせると、これらの技術は、GAGの定義構造特性を提供することも可能である。
効果を意味すると理解される。本発明の好ましい態様において、用語「増強効果」は、第一の実体が第二の実体に対して有する効果であって、単数または複数の別のプロセスにおける第二の実体の強度を増加させる、前記効果を意味すると理解される。本発明のさらなる好ましい態様において、増強効果は、ヘパリン結合因子に対する単離GAGの効果を意味すると理解され、前記効果は、前記ヘパリン結合因子の強度を増加させる。
に現れる形から修飾されていることも可能である。
当業者によって、特定のポリペプチドのアミノ酸配列の小さな変動は、その部分の生得的な機能が維持されることを可能にしうることが理解される。ペプチド内の特定のアミノ酸残基の、等比体積のおよび/または等電子数の他のアミノ酸残基での置換が、未置換ペプチドの特定の特性を維持するかまたは改善するかいずれかでありうることもまた理解される。これらの変動もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸アラニンは、ときに、ペプチドの1またはそれより多くの特性を維持しながら、アミノ酸グリシンに置換可能である(そしてその逆も可能である)。用語「等比体積」は、2つの実体間の空間的類似性を指す。中程度に上昇した温度で等比体積である部分の2つの例は、イソプロピルおよびtert-ブチル基である。用語「等電子数」は、2つの実体間の電子類似性を指し、この1例は、2つの実体が同じまたは類似のpKaの官能性を所持する場合である。
固体支持体は、分子が、直接または間接的に、共有または比共有結合のいずれかを通じて付着可能である表面を有する任意の支持体であることも可能である。固体支持体には、表面に付着するプローブに物理的支持を提供することが可能な任意の支持材料が含まれることも可能である。これはマトリックス支持体であることも可能である。材料は、一般的に、表面へのプローブの付着に関連する条件、およびアッセイ実行中に遭遇するいかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングにも耐えることが可能である。材料は、天然存在、合成、または天然存在材料の修飾であることも可能である。固体支持体は、プラスチック材料(ポリマー、例えばポリ(塩化ビニル)、シクロ-オレフィン・コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4-メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFEまたはテフロン(登録商標))、ナイロン、ポリ(酪酸ビニル))等であることも可能であり、これら自体を用いるかまたは他の材料と組み合わせて用いることも可能である。さらなる剛性材料を考慮することも可能であり、例えばシリカを含むガラス、そしてさらに、例えばバイオガラスとして入手可能なガラスが含まれる。使用可能な他の材料には、多孔性材料、例えば制御孔ガラスビーズが含まれる。例えば表面上に取り込まれた、1またはそれより多い官能基、例えばアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基を有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の材料もまた意図される。
この配置の代表的な例では、ビオチン分子が、ポリペプチドに共有結合し、ビオチン-ポリペプチドコンジュゲートがストレプトアビジンに結合すると、ストレプトアビジンは次に、固体支持体に共有結合している。別の配置において、スペーサーまたはリンカー部分を用いて、ビオチン分子とポリペプチドを、そして/またはストレプトアビジンとマトリックスを連結することも可能である。
囲の適用に有用である可能性もある。in vitroの細胞または組織培養、あるいはin vivo
の細胞または組織のいずれかにおいて、細胞または組織成長および/または増殖および/または分化の刺激または阻害に使用するために、HS16を提供することも可能である。
HS16の存在下で、in vitroの細胞または組織培養から得られる細胞または組織を収集し、そして治療が必要なヒトまたは動物患者内に移植することも可能である。したがって、細胞および/または組織の移植法であって:
(a)in vitroで、HS16と接触させて、細胞および/または組織を培養し;
(b)細胞および/または組織を収集し;
(c)治療が必要なヒトまたは動物被験体内に細胞および/または組織を移植する
工程を含む、前記方法を提供することも可能である。
可能にするために十分な期間、細胞を培養することも可能である。例えば、期間を:少なくとも5日間、少なくとも10日間、少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間から選択することも可能である。
(a)HS16;
(b)幹細胞と組み合わせたHS16;
(c)HS16によって結合されるヘパリン結合ドメイン(例えばRKDLGWKWIHEPKGYH)を含有するタンパク質と組み合わせたHS16;
(d)幹細胞およびHS16によって結合されるヘパリン結合ドメイン(例えばRKDLGWKWIHEPKGYH)を含有するタンパク質と組み合わせたHS16;
(e)HS16と接触させた細胞または組織の培養から得られる組織または細胞
の1つを含むことも可能である。
加速、瘢痕または骨組織の治癒および組織移植における使用を伴うことも可能である。
いくつかの側面において、本発明は、HS16の投与を含む、美容的治療に関する。「美容的」は、本明細書において、非療法的である。美容的治療を用いて、皮膚の外見および/またはテクスチャーを改善することも可能である。
治癒または皮膚移植片、および整形外科装具、例えば骨、靱帯、腱、および軟骨が含まれる。
胞への薬剤吸着および/または薬剤送達を増進するよう作用することも可能である。プロドラッグのin vivo変換は、細胞性酵素、例えばリパーゼおよびエステラーゼによって、
または化学的切断、例えばin vivoエステル加水分解によって促進されることも可能であ
る。
HS16と接触させる細胞には、幹細胞が含まれる。
HS16を、幹細胞の増殖および/または分化、ならびに/あるいは幹細胞の系譜拘束に用いることも可能である。
ら得られるかまたはこれに由来することも可能である。
間葉系幹細胞(MSC)は、元来、骨髄から単離され、そして全部で104~105の骨髄単核細胞(BMMNC)のうちのわずか1つとして存在する(Friedensteinら 1966)。これらの細胞は、CFU-F(コロニー形成単位線維芽細胞)集団をダビングする(dubbed)、単細胞前駆体に由来するコロニーを産生することが可能である。MSCは、現在、脂肪組織(GimbleおよびGuilak 2003;Zukら 2001)、臍帯血(Biebackら 2004;Ericesら 2000;Goodwinら 2001;Koglerら 2004;Wagnerら 2005)および筋肉(Jiangら 2002)を含む、多くの他の組織において同定されてきている。
彼らは、ヒトMSCを定義するために、3つの基準:プラスチックへの接着、特定の表面
抗原発現および多分化能分化潜在能力を提唱する。特に、彼らは、「まず、MSCは、組織培養フラスコを用いた標準培養条件下で維持された際、プラスチック接着性であるはずである。第二に、≧95%のMSC集団は、フローサイトメトリーによって測定された際、CD105、CD73およびCD90を発現していなければならない。さらに、これらの細胞は、CD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19およびHLAクラスII(HLA-DR)の発現を欠いていなければならない(≦2%陽性)。第三に、細胞は、標準的なin vitro分化条件下で、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞に分化可能でなければならない」と述べた。
D90およびCD105の発現を増進したことを報告し、そしてCD49a+クローンが、ソーティングされていない細胞に比較して、脂肪、骨および軟骨への多系譜分化を容易に経ることを立証し、間葉系幹細胞の濃縮のためのアルファ-1インテグリン(CD49a)選択の使用を支持し、そして骨髄単核幹細胞の異種プールから最も多分化能である細胞を選択するための戦略を提供した(Riderら J. Mol. Hist(2007)38:449-458)。Rider
らはまた、CFU-F細胞がCD49aの発現と関連し、CD49a発現CFU-F細胞がまたSTRO-1も同時発現し、そしてCD49aを用いて、ヒトに加えてラットおよびマウスからMSCを単離することも可能であり、該分子が濃縮のための保存されたマーカーでありうることを示すことも報告した。
、いわゆるSTRO-1+明の濃縮における表面マーカーSTRO-1に結合するモノクローナル抗体の使用も記載する。
本明細書において、用語「グリコサミノグリカン」および「GAG」は交換可能に用いられ、そしてオリゴ糖を含む分子の大きなコレクションを指すと理解され、ここで1またはそれより多いこれらの結合した糖は、アミノ置換基、またはその誘導体を所持する。GAGの例は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸およびヘパラン硫酸である。
ヘパラン硫酸(HS)
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、プロテオグリカンの非常に多様な下位群に相当し、そしてタンパク質主鎖に共有結合したヘパラン硫酸グリコサミノグリカン側鎖で構成される。コアタンパク質は3つの主要な型:パールカンとして知られる分泌型、グリピカンとして知られる形質膜に係留された型、およびシンデカンとして知られる膜貫通型で存在する。これらは、哺乳動物細胞表面および大部分の細胞外マトリックスの普遍的な構成要素である。アグリン、またはアミロイド前駆体タンパク質などの他のタンパク質があり、この際、HS鎖は、より一般的に見られないコアに付着している可能性もある。
に、ヘパラン硫酸は、より少ないNおよびO-硫酸基およびより多いN-アセチル基を含有する。ヘパラン硫酸側鎖は、四糖連結(-グルクロノシル-β-(1→3)-ガラクトシル-β-(1→3)-ガラクトシル-β-(1→4)-キシロシル-β-1-O-(セリン))領域を通じて、コアタンパク質のセリン残基に連結される。
および805)が、単一供給源から単離されたヘパラン硫酸グリコサミノグリカン種は、生物学的活性が多様でありうる。Brickmanら, 1998, Glycobiology 8, 463に示されるように、神経上皮細胞から得られるヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの2つの別個のプールは、分裂促進状態に応じて、FGF-1またはFGF-2のいずれかを特異的に活性化しうる。同様に、ヘパラン硫酸(HS)がFGF-1またはFGF-2のいずれかと相互作用する能力が、WO 96/23003に記載される。この特許出願によると、FGF-1と相互作用しうるそれぞれのHSは、約11日~約13日胚のネズミ細胞から得ることが可能であり、一方、FGF-2と相互作用可能なHSは、約8日~約10日胚で得られうる。
に提供され、こうした説明は本発明の範囲を限定しない。
亜硝酸に基づくヘパラン硫酸の脱重合は、完了した際には、炭水化物鎖の個々の二糖への最終的な分解を導く。
ヘパリナーゼIIIは、グルクロニド結合で糖鎖を切断する。一連のヘパリナーゼ酵素(I、IIおよびIII)は、各々、特定の硫酸化認識部位で、特定のヘパラン硫酸配列を脱重合することによって、各々、相対的に特異的な活性を示す。ヘパリナーゼIは、HS鎖に沿ってNS領域でHS鎖を切断する。これは、硫酸化ドメインの破壊を導く。ヘパリナーゼIIIは、NAドメインでHSを脱重合し、炭水化物鎖の個々の硫酸化ドメインへの分離を生じる。ヘパリナーゼIIは、主に、HS鎖のNA/NS「肩」ドメインにおいて切断し、このドメインは多様な硫酸化パターンが見られる箇所である。注:ヘパリンポリマーの反復二糖主鎖は、アミノ酸グルコサミンに連結されたウロン酸である。「NS」は、C2、C6およびC3の他の基の硫酸化を可能にする、アミノ基上の硫酸基を所持するアミノ糖を意味する。「NA」は、アミノ基が硫酸化されておらず、そしてアセチル化されたままであることを示す。
本発明の別の側面において、軟骨組織形成(軟骨形成)を促進する方法であって、HS16を軟骨前駆細胞または軟骨幹細胞に投与する工程を含む、前記方法を提供する。
組織を収集し、そしてヒトまたは動物患者内への移植に用いることも可能である。
これらの組織の1つの悪化を有する患者において、悪化部位へのHS16の投与を用いて、その部位の組織の成長、増殖および/または分化を刺激することも可能である。例えば、投与部位にまたはその近傍に存在する間葉系幹細胞の刺激は、好ましくはTGFβ1もまたその部位に存在した場合に、間葉系幹細胞の増殖および適切な結合組織への分化を導き、それによって損傷を受けた組織の置換/再生ならびに傷害の治療を提供することも可能である。
の治癒)に有用である。HS16はまた、組織修復、再生および/または置換が必要な患者への移植に適した組織のin vitro生成にも有用である。
いくつかの側面において、本発明は、関節破壊、軟骨分解、軟骨組織への損傷あるいは軟骨組織の喪失または変性を治療するかまたは防止するための、HS16の療法的使用(ヒトおよび/または獣医学的)に関する。
受ける関節は、膝関節、股関節および手足の関節であるが、他の関節もまた影響を受ける可能性もある。
0=(正常な)健康な軟骨;
1=軟骨が柔らかいスポットまたは水疱を有する
2=軟骨中に重大でない裂傷が見える
3=病変が深い凹部を有する(軟骨層の50%より深い)
4=軟骨裂傷が根底にある(軟骨下)の骨を曝露する
等級2/3の軟骨欠損は、原線維状の(fibrillated)または切り刻まれた外見を有し
うる。軟骨への損傷はまた、Pritzkerら, Osteoarthritis Cartilage 2006 14(1):13-29に記載される変形性関節症研究協会国際(OARSI)等級付けシステムにしたがって、組織病理学によって評価することも可能である。
いくつかの側面において、本発明は、骨折を治療するためのHS16の療法的使用(ヒトおよび/または獣医学的)に関する。
折れるかまたは削り取られる、骨に対する損傷または傷害が含まれる。骨が折れることは骨の不連続を指す。骨折は、物理的衝撃または機械的ストレス、あるいは骨粗鬆症または変形性関節症などの医学的状態によって引き起こされうる。
大部分の被験体において、骨治癒(骨折治癒)は自然に生じ、そして傷害後に開始される。出血は、通常、凝固、ならびに白血球および線維芽細胞の誘因を導き、その後、コラーゲン繊維が産生される。この後、骨マトリックス(カルシウムヒドロキシアパタイト)沈着(ミネラル化)がコラーゲンマトリックスを骨に変換する。未成熟再生骨は、典型的には成熟骨よりも弱く、そして未成熟骨は、時間を掛けて、リモデリングプロセスを経て、成熟「層状」骨を産生する。完全骨治癒プロセスにはかなりの時間が掛かり、典型的には数ヶ月要する。
本発明を限定するわけではないが、HS16の一次作用は、創傷部位内の、該部位に隣接する、または該部位内に遊走が誘導された細胞に対するものであることも可能であり、そして該作用は、間葉系幹細胞、骨幹細胞、プレ骨芽細胞または骨芽細胞、あるいは創傷床内に見られるかまたは遊走が誘導される任意の補助または血管原性細胞に対するものであることも可能である。
HS16の投与は、好ましくは、骨折を取り巻く組織に対するものである。これには、骨折が起きた骨組織への直接の投与も含まれうる。投与は、骨または骨折を取り巻く結合組織に対するもの、あるいは骨の近傍であり、そして骨に供給する血管系(例えば血管)であることも可能である。投与は、傷害部位に対して直接であってもよいし、そして初期創傷治癒によって形成される仮骨に対してであってもよい。本発明記載の薬剤および医薬組成物は、多くの経路による投与用に配合されることも可能である。最も好ましくは、HS16は、注射用の流体または液体型で配合される。
本発明の医薬組成物および薬剤は、HS16でコーティングされ、そして/または含浸されるバイオマテリアルの形を取ることも可能である。バイオマテリアルから移植物または装具を形成することも可能である。こうした移植物または装具を外科的に移植して、組織再生、組織再構築、および/または組織リモデリングを補助することも可能である。
をバイオマテリアルの構成的構成要素と、例えば重合中に混合するか、またはバイオマテリアル内にHS16を吸着させることによって、バイオマテリアルを形成する工程を含むことも可能である。コーティングは、バイオマテリアル表面上へのHS16の吸着を含むことも可能である。
ン酸ナトリウムの液体フィルム、キトサン、または適切な架橋剤、例えばカルシウム塩を含む他の多糖、ポリアクリル酸、ヘパリンによって形成することも可能である。あるいは、ゲルとして足場を形成し、コラーゲンまたはアルギン酸によって組み立て、当業者に知られる周知の確立された方法を用いて架橋することも可能である。
46, 1461-1467)。臨床的に許容されうるコラーゲンスポンジは、マトリックスの一例であり、そして当該技術分野に周知である(例えばIntegra Life Sciencesのもの)。
線維芽細胞増殖因子フィブリン複合体:コラーゲンに基づく材料へのin vitroおよびin vivo適用。 Biomaterials. 1994;15(9):665-672.)。
び生物活性 Biomaterials 28(2007)2127-2136)は、ポリカプロラクトンマイクロカプセ
ルからのHSの長期局在送達を記載する。
バイオマテリアルに、さらなる細胞を補充してもよい。例えば、バイオマテリアルに幹細胞、例えば間葉系幹細胞、より好ましくはヒト間葉系幹細胞を「植え付けて」(または同時に合成して)もよい。
、例えばブタ、ヒツジもしくはウシであることも可能である。被験体はオスまたはメスであることも可能である。被験体は患者であることも可能である。
る。用語「in vitro」は、培養中の細胞を用いた方法を含むよう意図され、一方、用語「in vivo」は、損なわれていない多細胞生物を用いた方法を含むよう意図される。
HS16(好ましくは単離HS16)を含む培地は、任意の種類のものであることも可能であるが、好ましくは液体またはゲルであり、そして他の栄養素および増殖因子(例えばTGFβ1、FGF-2)を含有することも可能である。培地を、液体またはゲルに再構成するため、乾燥型、例えば粉末または凍結乾燥型で調製することも可能である。HS16は、好ましくは、非微量で存在するであろう。例えば、培地中のHS16の濃度は、約1ng/ml培地~約1000ng/ml培地の間の範囲であることも可能である。好ましくは、培地中のHS16の濃度は、約500ng/mlまたはそれ未満、より好ましくは250ng/mlまたはそれ未満、100ng/mlまたはそれ未満、90ng/mlまたはそれ未満、80ng/mlまたはそれ未満、70ng/mlまたはそれ未満、60ng/mlまたはそれ未満、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満、10ng/mlまたはそれ未満、あるいは5ng/mlまたはそれ未満の1つである。
in vitroおよびin vivo使用の両方において、HS16を約500ng/mlまたはそ
れ未満、より好ましくは250ng/mlまたはそれ未満、100ng/mlまたはそれ未満、90ng/mlまたはそれ未満、80ng/mlまたはそれ未満、70ng/mlまたはそれ未満、60ng/mlまたはそれ未満、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満、10ng/mlまたはそれ未満、5ng/mlまたはそれ未満;あるいは約100mgまたはそれ未満、50mgまたはそれ未満、40mgまたはそれ未満、30mgまたはそれ未満、20mgまたはそれ未満、10mgまたはそれ未満、5mgまたはそれ未満、4mgまたはそれ未満、3mgまたはそれ未満、2mgまたはそれ未満、あるいは1mgまたはそれ未満;あるいは約0.3~5μg/ml、0.3~4、0.3~3、0.3~2.5、0.3~2、0.3~1.5、0.3~1.0、0.3~0.9、0.3~0.8、0.3~0.7、0.3~0.6、0.3~0.5、0.3~0.4、1~2、1~1.75、1~1.5、1~1.25、1.25~2、1.5~2、または1.75~2μg/mlの1つの濃度または投薬量で用いることも可能である。
HS16を単独で投与することも可能であるが、限定されるわけではないが、薬学的にまたは美容的に許容されうるキャリアー、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、安定化剤、可溶化剤、界面活性剤(例えば湿潤剤)、マスキング剤、着色剤、フレーバー剤、および甘味剤を含む、当業者に周知の1またはそれより多い他の薬学的または美容的に許容されうる成分とともに、HSXを含む薬学的または美容的配合物(例えば組成物、調製物、薬剤)として提示することが好ましい。
およびHandbook of Pharmaceutical Excipients,第2版,1994に見出されうる。
経口投与(例えば摂取による)に適した配合物には、液体、溶液(例えば水性、非水性)、懸濁物(例えば水性、非水性)、エマルジョン(例えば水中油、油中水)、エリキシル、シロップ、舐剤、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、カシェー、ピル、アンプル、ボーラスが含まれる。
び油、ならびにパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング、デポ、およびリザーバーが含まれる。
まれる。典型的には、液体中の活性化合物の濃度は、約1ng/ml~約10μg/ml、例えば約10ng/ml~約1μg/mlである。配合物を単位用量または多数回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中で、提示することも可能であるし、そして使用直前に、無菌液体キャリアー、例えば注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することも可能である。即時注射溶液および懸濁物を、無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することも可能である。
本明細書において、TGFβ1は、トランスフォーミング増殖因子ベータ・スーパーファミリーのメンバーである、トランスフォーミング増殖因子1を指す。
in vitroおよびin vivo使用の両方において、TGFβ1をHS16と組み合わせて用
いることも可能である。本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性HS16を培養に添加する。TGFβ1の適切な濃度または投薬量には、約500ng/mlまたはそれ未満、より好ましくは250ng/mlまたはそれ未満、100ng/mlまたはそれ未満、90ng/mlまたはそれ未満、80ng/mlまたはそれ未満、70ng/mlまたはそれ未満、60ng/mlまたはそれ未満、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満、10ng/mlまたはそれ未満、5ng/mlまたはそれ未満;あるいは約100mgまたはそれ未満、50mgまたはそれ未満、40mgまたはそれ未満、30mgまたはそれ未満、20mgまたはそれ未満、10mgまたはそれ未満、5mgまたはそれ未満、4mgまたはそれ未満、3mgまたはそれ未満、2mgまたはそれ未満、あるいは1mgまたはそれ未満;あるいは約0.1~5ng/ml、0.1~0.2、0.1~0.3、0.1~0.4、0.1~0.5、0.1~0.6、0.1~0.7、0.1~0.8、0.1~0.9、0.1~1.0、0.1~1.5、0.1~0.2.0、0.1~2.5、0.1~3.0、0.1~3.5、0.1~4.0、0.1~4.5、0.1~5.0ng/mlの1つが含まれる
いくつかの態様において、HS16のin vitroおよびin vivoの使用は、外因性TGF
β1の添加を排除する。例えば、本発明のいくつかの細胞培養法において、外因性TGFβ1は培養に添加されない。
本明細書で用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは見なされないものとする。
背景:ヘパリンは、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)に結合し、そしてそのシグナル伝達を増強することが可能である。
同定した。
結論:TGF-β1シグナル増強に影響を及ぼす、TGF-β1とヘパリン/HSの相互作用のための定義される構造的要件がある。
要約
トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)は、ヒト間葉系幹細胞(hMSC)による軟骨形成開始を含めていくつかの生理学的プロセスに関連づけられてきている、ヘパリン結合タンパク質である。本明細書において、本発明者らは、ヘパリンがTGF-β1に結合して、そしてhMSCに関してTGF-β1シグナル伝達を増強することが可能であることを示す。この増強は、TGF-β受容体を通じたTGF-β1経路の調節を通じて起こり、そして初期軟骨形成遺伝子の上方制御を導く。分子相互作用および細胞に基づくアッセイはまた、長さ18~22糖(dp18~22)であり、そして2-O-硫酸化を欠くヘパリン鎖がTGF-β1の結合に最適であることもまた立証した。構造プロテオミクスを通じたTGF-β1およびヘパリンの間の相互作用の照合は、ヘパリン結合に関与するTGF-β1上の新規リジン残基の同定を可能にした。この情報を元に、本発明者らは、TGF-β1に対して増加したアフィニティを有するブタ粘膜ヘパラン硫酸(HS)の下位分画を単離した。このTGF-β1結合性HSは、元来の出発HSに比較して、TGF-β1および潜在TGF-β1両方によりよく結合し、そしてその活性を増強することが可能であった。この研究はまず、TGF-β1とヘパリンの相互作用のための構造的要件に関して報告する最初のものである。これはまた、軟骨修復のために、TGF-β1シグナル伝達を調節するHSに基づく戦略の開発の基礎を構築し、ここで、外因性タンパク質用量を減少させるかまたは省くことも可能である。
グリコサミノグリカン(GAG)ヘパラン硫酸(HS)1およびヘパリンは、構造的に関連する直鎖多糖であり、多数の細胞外タンパク質および増殖因子に結合し、そしてその機能を調節することが知られる(1)。トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)は、強力なヘパリン結合性増殖因子(2~5)であり、線維症(6、7)、皮膚治癒(8)、癌転移(9、10)および軟骨形成(11~15)において役割を果たすことが示されてきている。TGF-β1がヒト間葉系幹細胞(hMSC)の軟骨形成分化を駆動し、そして軟骨表現型を維持する能力は、軟骨修復戦略の発展において、TGF-β1を特に関心が持たれるものにしている(13、15~18)。
ている。理想的な療法は、外因性TGF-β1適用を伴わずに、TGF-β1シグナル伝達を増進するように働くであろう。
ヒトMSC単離および細胞培養
初代hMSC(Lonza)は、以前記載されるように、プラスチック接着によって若い健
康な成人ドナーの骨髄単核細胞から単離され、そして特徴付けられた(30、31)。接着細胞を、10%ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを補充したDMEM-低グルコース(1000mg/l、DMEM-LG)からなる基本培地中で維持し、そして加湿大気中、37℃および5%CO2の標準条件下で培養した。培地を3日ごとに取り替えた。75~80%集密に到達した際、細胞を0.125%トリプシン/Versene(pH7.0)で剥離させ、
そして同じ培養条件下で3,000細胞/cm2の密度で再プレーティングした。すべての実験を第5継代で行った。
Zhangら(32)に記載されるように、修飾微量培養系を用いて、軟骨形成分化を行った。簡潔には、第4継代のhMSCを採取し、そして化学的に定義された軟骨形成培地(PT-3003、Lonza)中に、2x107細胞/mlで再懸濁した。次いで、12
.5μlの小滴を24ウェルプレート中の各ウェルの中央に植え付け、そして37℃で2時間接着させ、その後、10ng/mlのTGF-β1(100-21C、PeproTech)
のみ(培地)またはTGF-β1と10μg/mlのヘパリン(Sigma-Aldrich)(培地
+Hep)のいずれかを補った500μlの軟骨形成培地を各ウェルに添加した。細胞小滴は、24時間後に球状の塊に合体し、そして微量を第3日に採取した。
Hernaizら(33)によって報告されるプロトコルに基づいて、ビオチン化ヘパリンを
調製した。簡潔には、1mlの水中で20mgのヘパリンを濾過滅菌し(0.22μm)し、そして20μlのジメチルスルホキシド(DMSO)中の8.6μmolのN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチン(NHS-ビオチン)(Pierce)と4℃で2時間インキュベーションした。次いで、ビオチン化ヘパリンを徹底的に透析し(7000 MWCO)、未反応ビオチンを除去した。Biacore T100(GE Healthcare)上の固定ウィザードを
用いて、ビオチン化ヘパリンのストレプトアビジン(SA)センサーチップ(GE Healthcare)上への固定を行い、ターゲット固定レベルはおよそ40反応単位(RU)であった
。HBS-EP流動緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、3.0mM
EDTA、0.05%(v/v)Tween20、pH7.4)を固定に用いた。
)中で希釈した一連のTGF-β1タンパク質試料(50~800nM最終濃度)を調製
することによって、TGF-β1-ヘパリン相互作用を達成した。競合結合実験のため、HBS-EP-0.1中の最終濃度200nMのTGF-β1を、5または10μgの以下のGAGの1つのいずれかと混合した:ヘパリン(Hep);サイズ分画ヘパリン(重合の度合いdp4、6、8、10、12、14、16、18、20、22および24)(Iduron);選択的脱硫酸化ヘパリン(2-O-脱硫酸化、6-O-脱硫酸化およびN-脱硫酸化)(Iduron);HSPM(HO-03103、Celsus Laboratories);アフィニ
ティ単離TGF-β1結合性HS(HS16陽性);またはTGF-β1非結合性HS(HS16陰性)。次いで、試料溶液を、ヘパリン・コーティングチップ上に、30μl/分の流速で120s注入し、HBS-EP-0.1を続いて、チップ上にさらに1200s通過させて、TGF-β1の解離を監視した。解離後、チップのセンサー表面を、30μl/分で60秒間、2M NaClを注射して2回洗浄し、再生した。時間の関数として反応を25℃で測定した(センソグラム)。各条件の最大結合反応を、TGF-β1のみから得られる反応に対して規準化した。
TGF-β1がヘパリンに結合する能力を決定するため、本発明者らは、捕捉支持体として、正荷電GAG結合プレート(Iduron)を利用した。GAGを各ウェルに固定し、そして次いで、製造者の支持にしたがって、TGF-β1に曝露した。簡潔には、3つ組ウェルをまず、標準アッセイ緩衝液(SAB:100mM NaCl、50mM酢酸ナトリウム、0.2%v/v Tween20、pH7.2)中で調製した5μg/mlの全長ヘパリン、サイズ分画ヘパリン(dp14、16、18、20、22および24)、または選択的に脱硫酸化(de3ed)したヘパリンでプレコーティングし、そして次いで室温で一晩インキュベーションした。プレートを次に、SABで3回注意深く洗浄し、250μlのブロッキング溶液(0.4%w/v魚皮ゼラチン、Sigma-Aldrich、SAB中)
でブロッキングし、そして37℃で1時間インキュベーションした。次いで、TGF-β1を100、200、または400ng/mlの濃度でブロッキング溶液中に溶解した。プレートをSABで3回洗浄し、そしてタンパク質の各希釈(200μl)を3つ組ウェル内に分配し、そして37℃で2時間インキュベーションし、SABでリンスし、そして200μlの750ng/mlモノクローナルマウス抗TGF-β1抗体(MAB2401、R&D Systems)をブロッキング溶液中に添加した。次いで、プレートを37℃で1時
間インキュベーションし、SABで洗浄し、そして200μlの1μg/mlのポリクローナル・ヤギ抗マウスビオチン化抗体(ab6788、Abcam)をブロッキング溶液中に
添加した。再び、プレートを37℃で1時間インキュベーションし、SABで洗浄し、そして200μlの220ng/ml ExtrAvidin AP(Sigma-Aldrich)をブロッキング溶液中に添加し、37℃で30分間インキュベーションし、そして次いでSABでリンスした。最後に、200μlの現像試薬(SigmaFAST p-ニトロフェニルリン酸、Sigma-Aldrich)を添加し、37℃で40分間インキュベーションし、そして1時間以内に405nmで読み取った。
以前記載されるように(34、35)、7500 Fast Real PCR システム(ソフトウェア
バージョン1.4、Applied Biosystems)上で、DSFを行った。ヘパリン(25μM)を含みまたは含まず、TGF-β1(2.5μM)を試験した。TGF-β1の融解を促進するため、10mMのジチオスレイトール(DTT)を反応混合物に添加した。先に記載されるように(34)実験を行った。Origin 7(OriginLab社)を用いて、融解曲線の
一次導関数を計算して、多様な条件下でTGF-β1の融解温度を決定した。実験を3つ組で行ったが、明確にするため、本明細書に提示するデータでは、複製物の平均のみを示す。
ヒトMSCを基本培地中、6ウェルプレート中で、10,000細胞/cm2の密度で、24時間培養した。次いで、TGF-β1処理を1ng/mlもしくは5ng/ml単独、または10μg/mlもしくは40μg/mlの全長ヘパリン、あるいは1ng/mlのTGF-β1と10μg/mlサイズ分画または選択的脱硫酸化ヘパリン、HSPM、HS16+またはHS16-のいずれかの存在下で調製し、そして室温で10分間インキュベーションした後、細胞に添加した。潜在TGF-β1(LTGF-β1)処理を、同様に3.3ng/ml単独または10μg/mlの上述の多様なGAGとともに調製した。阻害剤研究のため、TGF-β1で処理する前に、細胞を10μM SB431542(Sigma-Aldrich)またはDMSOと30分間前処理した。次いで、細胞を多様なTG
F-β1処理に1、6または24時間供し、そして2xLaemmli緩衝液中で溶解した後、4~12% SDS-PAGEゲル上で分離した。次いで、試料を、SMAD2/3(#3102、Cell Signaling)、リン酸化SMAD2(pSMAD2、#3108、Cell Signaling)、リン酸化SMAD3(pSMAD3、#9520、Cell Signaling)およびアクチン(MAB1501R、Millipore)に対する抗体でイムノブロッティング
した。Quantity Oneソフトウェア(バージョン4.6.6、Bio-Rad)を用いて、濃度測
定を行った。
製造者のプロトコルにしたがって、TRIZOL試薬(In vitrogen、Life Technologies)を用いて、軟骨形成微量ペレットから総RNAを単離した。製造者の指示にしたがい、42℃のインキュベーションを1時間ではなく2時間行って、SuperScript(登録商標
)VILOTM cDNA合成キット(In vitrogen、Life Technologies)を用いて、
1μg RNAに対して、逆転写を行った。各qPCRは、最終体積20μl中、40ng cDNA、遺伝子あたり1μlのTaqMan(登録商標)プライマー-プローブ混合物、および10μl Taqman(登録商標)Fast普遍的PCRマスター混合物(Applied Biosystems、Life Technologies)を含有した。熱周期条件は、95℃で20
秒間であり、その後、45周期の95℃3秒間および60℃30秒間が続いた。各qPCRを2つ組で実行し、そして遺伝子発現をHPRT1発現に対して規準化して、ΔCt値を得た。生物学的3つ組の平均値を取った。ヘパリンを含まない培地中で培養した軟骨形成微量ペレットを、対照(ΔΔCt)として用いた。各プライマーセットの相対発現レベルを2-ΔΔCt法によって倍変化として表した(36)。以下のTaqMan(登録商標)プライマー-プローブアッセイ(Applied Biosystems、Life Technologies)を用い
た:HPRT1(アッセイID:Hs01003267_m1)、SOX9(アッセイID:Hs00165814_m1)およびCOMP(アッセイID:Hs00164359_m1)。
1nmolのTGF-β1タンパク質および0.1%(w/v)RapiGestTM
SF界面活性剤(Waters社)を用いてミニカラムからタンパク質を溶出したことを除いて、FGF-2に関してOriらに記載されるように(37)、「保護および標識」アプローチによって、TGF-β1上のヘパリン結合部位を同定した。消化およびビオチン化ペプチドをC18 Zip Tip(Millipore)上で精製し、そして次いでタンデム質量分析(MS)によって分析した。EASY-nLC(Proxeon)を用いて、最高2μgのビオ
チン化ペプチドをLTQ Velos装置(Thermo)内に注入した。PicoFritTMカラム(HALO、C18、90Å、2.7μm、75μm(ID)x100mm長)(New Objectives)上で、60分間の直線勾配(0.1%ギ酸中、2~40%(v/v)アセトニトリル)を用いて、ペプチドを分離した。二重圧力線形イオントラップ中でサーベイMSスキャンを獲得する、TOP-10戦略を用いて、データ獲得を行った。MSスキャン範囲は310~1400m/zであり、AGFターゲット3e4および最大注入時間10msであった。1000を越えるイオン強度および1を除く荷電状態の10の最も強力なイオ
ンが、4e4の最大AGFターゲット値まで、最大100msで連続して単離され、そして30%の規準化衝突エネルギーを用いて、衝突誘起解離(CID)によって断片化された。500の排除リストサイズ、1つの反復カウント、45秒の反復期間、30秒の排除期間ならびに1.0低および1.5高の質量幅で、動的排除リストを適用した。失効を無効にした。
Science)を用いたデータ分析を行った。20より高いMascotスコアを有するビオチン化ペプチドを手動で検証した。
TGF-β1由来ペプチド(配列RKDLGWKWIHEPKGYH-AHX-K(ビオチン)[AHX=6-アミノヘキサン酸];[配列番号7])のヘパリン結合能を決定するため、0.5mgのペプチドを、1mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で再構成した。次いで、ニトロセルロースディスク(6mm直径)を1mlの再構成ペプチド中で一定に振盪しながら室温で1時間インキュベーションすることによって、ペプチドをニトロセルロースディスク上に吸着させた。PBSのみの中でインキュベーションしたディスクを陰性対照として使用した。吸着後、真空オーブン中、80℃および-10mmHg(-10 in Hg)でディスクを45分間乾燥させ、PBSで3回洗浄し、そして次いで、1mlの0.1μCi/ml 3H-ヘパリンと、一定に振盪しながら室温で16時間インキュベーションした。次いで、ディスクをPBSで4回洗浄し、そして結合した3H-ヘパリンの量をシンチレーションカウンターで測定した。
上述のTGF-β1ペプチド配列を用いて、先に記載されるように(29)、HS16陽性の単離を行った。
Healthcare、英国バッキンガムシャー)にカップリングさせ、これを次いで、商業的に
入手可能なブタ粘膜HS(HSPM、Celsus Laboratories Inc、米国オハイオ州)を用
いたアフィニティクロマトグラフィに用いた。HSPMを低塩緩衝液(20mMリン酸、150mM NaCl、pH7.2)中、1mg/mLで溶解し、流速0.2mL/分で装填し、そして232nmのベースライン吸光度(A232)がゼロに到達するまで、同じ緩衝液でカラムを洗浄した。結合したHSは、高塩緩衝液(20mMリン酸、1.5M
NaCl、pH7.2)の単一工程で溶出し、ピーク分画をA232で監視し、収集し、そして低塩緩衝液で、カラムを再平衡化した。溶出(HV16陽性)およびフロースルー(HS16陰性)ピークを別個に収集し、凍結乾燥し、HiPrepTM26/10脱塩カラム(GE Healthcare、英国バッキンガムシャー)上で、流速10mL/分で脱塩し
、再び凍結乾燥し、そして-20℃で保存した。
HSPM、HS16陽性およびHS16陰性試料をプールし、そしてD2O中で3回交換し(乾燥粉末のD2O(0.5~1mL)中での溶解、および完全な凍結乾燥までのフリーズドライを3回経過)、そして乾燥重量を決定した。D2O溶液として5mmチューブ中、30℃でNMR分析を行い、そしてこれには、内部標準としてtBuOH(0.2mg/mL)が含まれた。包括的データセットの最適濃度は、HS調製がおよそ3mg/
mLであったことを除いて、~15mg/mL(1H)であった。プロトン(500MHz)NMRスペクトルを3チャネルBruker AvanceIII500上で記録した。プローブはBr
uker2チャネル5mmブロードバンド核プローブ(31P-109Ag)であり、アクティブシールド50G/cm Z軸パルスフィールド勾配を装備した。NMRスペクトルは、必要に応じて位相修正され、そしてtBuOH(1H δ 1.24ppm;13C(メチル)δ 30.29ppm)を参照した。シグナルの割り当ては、Guerriniら(38)によって報告されるものに基づいた。
HSPM、HS16陽性およびHS16陰性試料における多糖鎖のサイズ分布を調べるため、80Vで30分間プレ泳動して、残渣過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を除去した、12%非変性PAGEゲル上で、各2μgのGAGを泳動した。Tris-グリシン緩衝液(25mM Tris、192mMグリシン)で1xに希釈した、4x電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)緩衝液(40mM
Tris-HCl、pH8.0、40%(v/v)超純粋グリセロール、0.4%(v/v)NP40および400mM KCl)で、最終体積25μL中で試料を調製した。分子量ラダーおよびBSAを分子量マーカーとして用いる一方、ヘパリンをアルシアンブルー染色の陽性対照として用いた。次いで、ゲルを2%(v/v)酢酸中の0.5%(w/v)アルシアンブルーで45分間染色し、2%(v/v)酢酸中で15分間脱染色し、そしてMilliQ水中で一晩洗浄して、過剰な染色を取り除いた。続いて、ゲルを銀染色して、タンパク質マーカーを可視化し、そしてアルシアンブルー染色GAGのコントラストを増進させた。
Waters 2410屈折率モニター(レンジ64)を伴うWaters 2690 Allianceシステム上で
、直列にTSKゲルG4000PWXL(7.8mmx30cm)およびTSKゲルG3000PWXL(7.8mmx30cm)(TOSOH社)を用いて、HPLC-SEC-RIクロマトグラムを得た。RIからの定量化のため、dn/dcを0.129に設定した(39)。試料を注入し(50μg)、そして0.5ml/分の流速、室温で、50mM酢酸アンモニウムで溶出させた。データを収集し、そしてDAWN Astraソフトウェア(バージョン4.73.04、Wyatt Technologies社)を用いて分析した。分子量(MW)標準の溶出体積は、同じ条件下で流動させたヘパリンオリゴ糖(IduronおよびDextra Laboratories)の溶出体積に基づいた。これらのカラムの流動時間は、どちらの場合も10
0分であった。すべてのGAG試料は、水中で1mg/mlの濃度であった。
HSPM、HS16陽性およびHS16陰性試料を水(1100μl)に可溶化し、そして濾過して(Minisart RC15、0.2μmシリンジフィルター装置、Sartorius Stedim
、#17761)、いかなる粒子状物質も除去した。さらなるクリーンアップ工程として、濾過溶液を、遠心分離(4000rpm、1時間、15℃)によって、2000 MWCO膜(Vivaspin 2、Hydrosart、Sartorius Stedim、#VS02H91、2000 M
WCO HY膜、2mL限外濾過スピンカラム)に通過させた。残余分を水(3x1ml)で洗浄し、フィルターから回収し、そして凍結乾燥した。精製HS試料を水に可溶化し(1mg/ml)、そして各凍結乾燥試料のアリコット(2x~1ml)を分析のために採取した。Brickmanらの方法(40)に基づくが、いくつかの修飾を伴い、ヘパリン・リアーゼ酵素(ヘパリン・リアーゼI、IIおよびIII、Ibex Technologies)の連続添
加によって、HS試料を二糖およびオリゴ糖まで消化した。乾燥HS試料を消化緩衝液(500μl;50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)中に再溶解し、そしてヘパリン・リアーゼI(5μl;5mIU)を各試料に添加した。試料を回転ホイール上で穏
やかに混合しながら(9rpm)インキュベーションした(37℃2時間)。ヘパリン・リアーゼIII(5μl;5mIU)を消化物に添加し、そしてさらに1時間(上述のように)インキュベーションした。ヘパリン・リアーゼII(5μl;5mIU)を添加し、そして消化物を上述のように18時間インキュベーションした。最後に、3つすべてのヘパリン・リアーゼのアリコット(5μl;5mIU)を同時に添加し、そして消化物をさらに24時間インキュベーションした。酵素消化を加熱(100℃、5分間)によって終結させた。すべての3つのHS試料を2つ組で消化し、そしてUV検出(232nm)を伴うHPLCによって分析した。
2つのSuperdexTMペプチド10/300GLカラム(300x10mm、GE
Healthcare)を、Waters 2410屈折率検出装置(レンジ64)を備えたWaters 2690 Allianceシステム上で連続して直列で用いて、HPLC-SECクロマトグラムを得た。RIからの定量化のためのdn/dcを0.129に設定した(39)。試料(2mg/ml)を注入し(50μl;100μg)、そして室温で50mM酢酸アンモニウム(0.5ml/分)で溶出させた。同じ条件下で、ヘパリンオリゴ糖標準(IduronおよびDextra Laboratories)を流動させた。これらのカラムの流動時間は120分間であった。データ
を収集し、そしてDAWN Astraソフトウェア(バージョン4.73.04、Wyatt Technologies社)を用いて分析した。
細菌ヘパリナーゼによる高品質ブタヘパリンの消化から得られる12の二糖標準をIduronから購入した。二糖を水に溶解する(1mg/ml)ことによって、各二糖標準のストック溶液を調製した。二糖標準の検量線を決定するため、各20μg/mlの二糖を含有する標準混合物をストック溶液から調製した。この12の二糖標準混合物から、20、10、5、2.5、1.25、0.625および0.3125μg/mlの各二糖を含有する希釈シリーズを調製した。HSPM、HS16陽性およびHS16陰性消化物(2mg/ml)を水に希釈して、100μg/ml溶液を得て、そして次いで、親水性PTFE使い捨てシリンジフィルター装置(0.2μm、13mm、Advantec)を用いて濾過した。HPLC分離条件は、Skidmoreら(41)のものに基づいた。232nmで監視するAgilent 1260 MWD VL検出装置を伴うAgilent 1260 Infinity液体クロマトグラフィシステム(Agilent Technologies)上で、分析を行った。HS由来二糖を、ガードカラムを含むProPacTM PA1カラム(Thermo Scientific、4mmx250mm)上で
分離した。バイナリ溶媒系を用いて勾配溶出を行った。溶出液AはpH3.5の水(HClを用いて調整)であり、そして溶出液BはpH3.5の2M NaCl(HClで調整)であった。勾配プログラムは以下の通りであった:0~1分、100%A、次いで、1~32分、0~35%B、次いで、32~37分、35~65%B、次いで、47~57分、100%B、次いで、57~60分、100%A。注入体積は50μlであった。カラムを流速1.0ml/分で溶出させ、そして40℃で維持した。HS消化物中に存在する二糖は、12の二糖標準混合物において、二糖の溶出時間との比較によって、溶出時間から同定された。HS16+およびHS16-消化物を2つ組消化物あたり2回注入し(全部で4回注入)、一方、HSPM試料を2つ組消化物あたり1回注入した(全部で2回注入)。
多様なGAGがTGF-β1をタンパク質分解消化から保護する能力を決定するため、TGF-β1(100ng)を、PBS中、10μgのHep、HSPM、HS16陽性またはHS16陰性とともに、あるいは単独のいずれかでプレインキュベーションした。0.5mUのプラスミンをTGF-β1試料に添加し、そしてこれらを37℃で1.5時間インキュベーションすることによって、プラスミン消化を実行した。続いて、試料を4
~12%SDS-PAGEゲル上で泳動し、そして銀染色によって視覚化した。すべての試料をPBS中で10μlの最終体積に構成した。
BMP-2活性に対するHS16陽性の影響を決定するため、C2C12マウス筋芽細胞を完全C2C12培地(DMEM-LG、10%(v/v)FCS、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン)中、20,000細胞/cm2で2つ組で植え付け、そして24時間付着させた。次いで、完全培地を、100ng/mL
BMP-2および/または5μg/mL HS16陽性、HS3陽性またはHSPMを含むまたは含まない処理培地(DMEM-LG、5%(v/v)FCS、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン)と交換し、そして細胞を3日間インキュベーションした。次いで、総細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem、Merck Millipore、米国マサチューセッツ州)を含有するRIPA緩衝液中に収
集し、そしてBCAタンパク質アッセイキット(ThermoFisher Scientific)を用いて、
タンパク質含量を決定した。5μgのタンパク質とp-ニトロフェニルリン酸(Sigma-Aldrich)とともに37℃で1時間インキュベーションし、そして405nmでの吸光度の
変化を読み取ることによって、ALP活性を測定した。RIPA緩衝液単独および1μL(10,000U/mL)のウシ腸ホスファターゼ(New England Biolabs Ltd、カナダ
・オンタリオ州)を、それぞれ陰性および陽性対照として用いた。各試料を2つ組で読み取って、処理群あたり総数4の読み取りを得た。
hMSCのヘパリナーゼ処理
TGF-β1シグナル伝達に対する内因性HSの影響を評価するため、hMSCを、12ウェルプレート中の基本培地中、7,500細胞/cm2の密度で植え付け、そして一晩付着させた。次いで、ヘパリナーゼI、IIおよびIII(各1.2mIU/mL)の組み合わせを各ウェル中の培地に添加し、そして24時間インキュベーションした。次いで、細胞をTGF-β1処理に6時間曝露し、1ng/mLまたは5ng/mL単独のいずれかで調製するか、あるいは10μg/mLまたは40μg/mLの全長ヘパリンいずれかとともに室温で10分間プレインキュベーションし、そして次いで2xLaemmli緩衝液中、イムノブロッティングのために溶解した。処理を血清不含培地(100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを補充したDMEM-LG)中で調製して、新鮮な血清を細胞に添加した際に見られるpSMADのバックグラウンドレベル増加を回避した。
ヘパリナーゼ処理がhMSCから内因性HS鎖を有効に取り除いたことを確実にするため、細胞を基本培地中、3,500細胞/cm2の密度で、8ウェルチャンバースライド中に植え付けた。細胞を一晩付着させた後、各ウェルに直接添加されるヘパリナーゼI、IIおよびIII(各1.2mIU/mL)の組み合わせで24時間処理した。続いて、細胞をPBS中、4%(w/v)パラホルムアルデヒド中で室温で10分間固定し、PBS中の3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)で、室温で30分間ブロッキングし、そして次いで、抗HS 10E4抗体(0.3%(w/v)BSA-PBS中で1:25希釈)(AMS Biotechnology、英国アビングドン)と室温で3時間インキュベーション
した。次いで、細胞を抗マウスIgM-FITC抗体(0.3%(w/v)BSAPBS中で1:500希釈)(BD Pharmingen TM、Becton, Dickinson and Company、米国ニュ
ージャージー州)と室温で45分間インキュベーションし、そしてHoechst 33342(PB
S中2μg/mL)(Life Technologies)で室温で10分間核染色した。Olympu
s IX-81上で試料を画像化した。
ヘパリンはTGF-β1に結合し、そしてその活性を増強する
TGF-β1シグナル伝達に対するヘパリンの影響を決定するため、本発明者らはまず、ヘパリンがTGF-β1に結合可能であることを確実にすることを目指した。SPRおよびGAG結合プレートアッセイはどちらも、TGF-β1が、96ウェルプレート中に固定された(図1A)か、またはビオチン化され、そしてBiacore SAチップに固定された(図1B)か、それぞれいずれかのヘパリンに、用量依存性方式で結合したことを立証した。本発明者らのデータは、TGF-β1が~0.475μMのおよそのKdでヘパリンに結合することを示す(図1B)。ヘパリンへのこの結合が、DSFによって決定されるような増進された熱安定性をTGF-β1に与えた(図2A)。TGF-β1ホモ二量体は、4つの鎖内および1つの鎖間の9つのジスルフィド結合を含み、これは、高い度合いの熱安定性を与える。これによって、TGF-β1単独で観察される66℃の高い融解温度が立証された(データ未提示)。TGF-β1へのヘパリンの結合が、新規非共有分子内結合の導入を通じて、熱安定性をさらに増加させるという仮定を本発明者らが試験する際、該タンパク質の融解温度を、アッセイが検出可能であるレベルに減少させることが必要となった。これは、10mMのDTTを反応に添加して、これがタンパク質内のジスルフィド結合を減少させ、それによって熱安定性を低下させることを通じて達成された。これは、66℃から44℃のTGF-β1の融解温度のシフトを生じた。ヘパリンを添加した際、TGF-β1の融解温度に相当するピークが右にシフトすることが見出され、そしてタンパク質の融解温度は47.5℃に増加した。
ータによって、受容体レベルでのTGF-β1活性の阻害は、ヘパリンのTGF-β1増強効果を無効にし、やはりヘパリンはTGF-β1活性に対するその効果を、TGF-β1シグナル伝達の調節を通じて発揮することが暗示された。
本発明者らは次に、TGF-β1に結合するために必要なヘパリンの最小限の長さを決定することを試みた。可溶性サイズ分画ヘパリン断片(dp4~dp24)がTGF-β1のヘパリン・コーティングSAチップへの結合を競合的に阻害する能力は、その長さに比例して増加する(図3A)。このTGF-β1結合能の増加は、dp18以降はプラトーに達するようであり、未分画全長ヘパリン(Hep)に関して見られるものと類似の競合レベルであった。GAG-結合プレートアッセイから得られる結果もまた、ヘパリン鎖の長さが14(dp14)から24(dp24)糖単位に増加するにつれて、ヘパリンへのTGF-β1結合が改善されることを示した(図3B)。dp14より短い(すなわちdp4~12)ヘパリン鎖は、TGF-β1に有効に結合することができなかった(データ未提示)。多様な長さのヘパリン断片およびTGF-β1で処理した、処理後1時間のpSMAD2およびpSMAD3レベルのウェスタンブロット分析によって、pSMADシグナル両方の飽和が示された(データ未提示)。しかし、処理6時間後では、本発明者らは、多様な(dp14~24)ヘパリン断片の増強活性の長さ依存性増加が観察されることを予期し、未分画ヘパリン(Hep)およびTGF-β1で処理した細胞において観察されるものよりもなお低いとしても、dp24-TGF-β1の組み合わせで、最大のpSMADシグナルであろうことが期待された。その代わりに、本発明者らは、TGF-β1およびdp18~dp22の間のヘパリン断片で処理した細胞が、未分画ヘパリンおよびTGF-β1で処理した細胞において観察されるものより高いpSMADレベルを示すことを観察し、シグナルのピークはdp20-TGF-β1の組み合わせだった(図3C)。これによって、ヘパリン鎖の長さが、TGF-β1シグナルを増強する能力に、かなりの影響を発揮することが示唆される。
ヘパリン-タンパク質相互作用が主にイオン性の性質であることを考慮して、本発明者らは、次に、ヘパリンおよびTGF-β1の間の相互作用に対して、ヘパリン中の多様な硫酸基が有する影響を調べることにした。Biacore競合アッセイによって、ヘパリンから
の2-O硫酸基の喪失(2-O-脱)は、固定されたヘパリンへのTGF-β1結合を競合阻害する能力に最小限の影響しか持たないことが示された(図4A)。6-O硫酸基の喪失(6-O-脱)は、およそ40%のTGF-β1結合能の喪失を導き、一方、N-硫酸基の喪失は、TGF-β1に結合するヘパリンの能力を無効にした。対照的に、GAG結合プレートアッセイは、ヘパリンからの2-O硫酸基の除去(2-O-脱)が、完全に硫酸化された全長ヘパリン(Hep)に比較して、約60%、TGF-β1結合を減少させることを立証した。6-O硫酸基の除去(6-O-脱)は、TGF-β1の能力をおよそ80%減少させ、そしてN-硫酸化の欠如(N-脱)は、やはりTGF-β1結合を本質的に無効にした。興味深いことに、細胞培養中で試験した際、得た結果は、多様なヘパリン長を評価する際に見られたものと同様に多様であった。本発明者らは、6時間の2-O脱硫酸化ヘパリン(2-O)で処理した細胞のpSMADレベルでは、完全に硫酸化されたヘパリンに比較して減少が見られると予期したが、その代わり、本発明者らは、ヘパリン処理細胞で見られるものよりも高いレベルまでの増加を観察し(図4C)、2-O-脱硫酸化ヘパリンが、完全に硫酸化されたヘパリンよりもさらによりTGF-β1シグナル伝達を増強することが示唆された。同様に、6-O-硫酸化(6-O)の除去もまた、ヘパリン処理細胞で見られるものに比較してpSMADレベルの安定化をもたらした。しかし、N-硫酸化(N)の喪失は、ヘパリン処理細胞のものに比較して、pSMADレベルの増加を導かなかった。
ヘパリンは、多くの感受性増殖因子に存在する塩基性残基の立体配置と相互作用することが知られるため、本発明者らの次の目的は、TGF-β1内の実際のヘパリン結合部位(単数または複数)を同定することであった。TGF-β1上の推定上のヘパリン結合部位を同定する以前の研究は、線形タンパク質配列中に存在するヘパリン結合モチーフの同定を通じてこれを行った(2、4)。しかし、こうしたアプローチは、タンパク質の完全3次元(3D)コンホメーション性質を考慮に入れることができず、そしてしたがって、タンパク質の三次構造からしか明らかになりえないヘパリン結合部位を同定することができない。こうしたものとして、本発明者らは、Oriらによって開発された保護および標識戦略(37)を使用して、こうした3D部位がTGF-β1内に存在するかどうかを調べることにした。本発明者らの分析は、TGF-β1のヘパリンへの結合に関与するようである8つのリジン(K13、K26、K31、K37、K60、K95、K97およびK110)を同定した(図5A、表1)。これらの8つのうち、7つはMS/MS配列決定に基づいて、高いレベルの信頼性を持つと同定された。残りのリジンK60は、中程度のレベルの信頼性を持つと同定され、ヘパリンと該リジンとの相互作用は断続的であり、そしてヘパリンへのTGF-β1の結合に必須ではない可能性が示唆され、したがって、Lyonらに提唱される現在のモデル(2)をやはり裏付けた。
ヘパリン-TGF-β1の相互作用の構造的特徴および要件が同定されたため、本発明者らの次の目的は、商業的に入手可能なHSPM調製物を構成する異種プールからHSのTGF-β1結合性分画を単離することであった。これを行うため、本発明者らはまず、TGF-β1から得られるヘパリン結合性ペプチドを設計し(図6A)、そして3H-ヘパリンに結合する能力を試験した(図6B)。次いで、TGF-β1ペプチドを用いて、本発明者らのHSアフィニティ単離プラットホームを用い、Muraliらに先に記載されるように(29)、HSのTGF-β1結合集団を単離した。カラムに結合しないHSは、HS16陰性と称され、一方、カラムから1.5M NaClで溶出したTGF-β1結合性HSは、HS16陽性と称された(図6C)。
タンデム質量分析によって標識ペプチドを同定し、そしてMascot検索バージョン2.3(Matrix Science)によって分析した。ここで、ヘパリン結合部位に関与するペプチドの要約および標識位を提供する。
次いで、プロトンNMR、HPLC-SEC-RIおよび二糖組成分析を行って、HSPM、HS16陽性およびHS16陰性の間に何らかの体系的な相違があるかどうかを決定した。3つのHS試料のNMR分析によって、いくつかのわずかな相違が明らかになり(矢印、図7A)、一方、SECのクロマトグラムは、HS16陽性が主に、HSPMおよびHS16陰性に見られるものよりも恒常的に長いHS鎖で構成されることを示した(図7B)。
数のタンパク質に結合する能力を説明する。所定のタンパク質に関するHS調製物の相対的特異性を増進するため、この変動を減少させることが必要である。本発明者らは、3つのHS試料内の多糖鎖のサイズ分布を調べた。3つの試料およびヘパリンを非変性PAGEによって分離すると、HS16陽性が、HS16陰性およびHSPMに比較して、主に
、より長いHS鎖で構成されることが示された。HSよりも比較的より均質であるヘパリンを用いて、HS調製物中に高い不均一性が存在することがわかった。これらの知見を検証するため、サイズ排除クロマトグラフィ(HPLC-SEC-RI)を行った。SEC由来のクロマトグラムは、HS16陽性が、およそdp8から>dp26までのHSPMの多分散のサブセットからなることを示した(図7B)。しかし、HS16陽性集団では、より長い鎖長(>dp26)のHSが濃縮されており、これは、非変性PAGEからの本発明者らのデータおよびTGF-β1に結合するヘパリンに関する長さ要件に関する本発明者らの知見を確証する。
HS試料をヘパリン・リアーゼI、IIおよびIIで消化して、そして生じた二糖をHPLCを通じて分離した。既知の二糖標準のものと溶出時間を比較することによって二糖を同定し、そして各HS試料における比率をいくつかの検量線を用いて計算した。
HS16陰性およびHSPMと比較したHS16陽性の組成の相違を考慮して、本発明者らは次に、これらの相違が何らかの機能的結果を生じるかどうかを調べることにした。これらのHS分画が、Biacore競合アッセイにおいて、TGF-β1に結合する能力を調べると、HS16陽性は、HS16陰性またはHSPMよりも、はるかにより高いアフィニティでTGF-β1に結合可能であることが示された(図8A)。HS16陽性は、TGF-β1由来ペプチドを用いて単離されたため、該タンパク質上の塩基性残基を糖がマスキングする能力を評価することが重要であった。これを行うため、本発明者らは、糖(Hep、HSPM、HS16陽性、およびHS16陰性)とTGF-β1をあらかじめ結合させ、そしてこれらをプラスミン消化に供した。プラスミンが、リジンおよびアルギニン残基のカルボキシル面を優先的に切断することを考慮して、本発明者らは、糖がTGF-β1にある程度の特異性を持って結合するのであれば、これはタンパク質にプラスミンからのある程度の保護を与えるであろうと判断した。プラスミン消化産物の銀染色は、HS16陽性(TGF-β1+HS16陽性)が、ヘパリン(TGF-β1+Hep)を含めて、試験した他のいずれの糖よりもプラスミン消化からTGF-β1をよりよく保護可能であることを明らかにした(図8B)。in vitro系において、HS16陽性は、hMSCにおいて、pSMAD2およびpSMAD3を通じて、ヘパリンと類似の程度ま
でTGF-β1シグナル伝達を増強することが可能であった(図8C)。興味深いことに、HSPMおよびHS16陰性は類似の反応を引き出すことができず、HS16陽性は、HSPMおよびHS16陰性の両方と、組成的にそして機能的に異なるという本発明者らの先の知見が裏付けられた。
られる不活性型で見られ、そしてHS16陽性は、HSPMのプールから単離されたため、本発明者らは、次に、HS16陽性がLTGF-β1に対して有しうる影響を調べることにした。本発明者らのデータは、再び、HS16陽性が、ヘパリン(Hep)、HSPMおよびHS16陰性よりもより有意にLTGF-β1誘導性pSMADシグナルを増強することが可能であることを立証した(図10A)。総合すると、本発明者らのデータは、HS16陽性単離体が、HSPM出発物質および非結合性HS16陰性と比較して、TGF-β1に、より優れて結合し、そしてそれによって駆動されるシグナル伝達を増強することが可能であることを示す。また、HS16陽性は、HSPM出発材料および非結合性HS16陰性に比較して、生理学的により大量のLTGF-β1によって駆動されるシグナル伝達を増強することが可能であった。
ヘパリン-TGF-β1相互作用の生物学的影響を調べるため、初代hMSCを単離する必要があった。商業的に入手可能な骨髄細胞(Lonza)を購入し、そしてプラスチック
接着を通じてhMSCを単離した。0継代の細胞を続いて拡大し、そしてバイアルあたり1x106細胞のバッチで凍結させた。Dominiciら[多分化能間葉系間質細胞を定義するための最小限の基準。細胞療法国際会議意見書。Cytotherapy, 2006.8(4):p.315-317]によって記載されるように、第5継代でMSC表面マーカー発現に関して、FACSによって細胞をスクリーニングした。95%より多い単離hMSCがCD73、CD90およびCD105を発現し、一方、CD14、CD19、CD34、CD45およびHLA-DRは発現しなかった。単離細胞はまた、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞にin vitroで分化することも可能であった。したがって、プラスチック接着によって単離された細胞は、hMSCの最小限の基準特性を満たすと考えられた。
初代hMSCを単離したため、本発明者らは次に、ヘパリンおよびTGF-β1の間の相互作用が、TGF-β1シグナル伝達に対する細胞反応に影響を及ぼすかどうかを決定し、これは、SMAD2およびSMAD3の下流リン酸化によって測定された。ヘパリンは、初代ラットおよびウシ平滑筋細胞(SMC)ならびにCCL64ミンク肺上皮細胞株において、TGF-β1の影響を増強するが、初代ヒト伏在静脈(SMC)においては増強しないことが示されてきている[McCaffrey, T.A.ら, トランスフォーミング増殖因
子ベータ活性は、トランスフォーミング増殖因子ベータ/アルファ2-マクログロブリン不活性複合体の解離を通じて、ヘパリンによって増強される。 J. Cell Biol, 1989. 109(1):p.441-44;McCaffrey, T.A.ら, ヘパリンおよびフコイダンによるトランスフォー
ミング増殖因子β活性の保護。 J. Cell Physiol, 1994. 159(1):p.51-59]。本発明者らはしたがって、hMSCにおいてTGF-β1活性をヘパリンが増強するならば、効果は、TGF-β1のみからのpSMAD2およびpSMAD3シグナルが収まり始めてからしか見られないと推測した。したがって、本発明者らの最初のTGF-β1投薬実験のために選択した時点は、6、12、24および48時間であった。第5継代の細胞をある範囲のTGF-β1用量で処理し、そして総細胞溶解物を、処理の6、12、24および48時間後に収集した。次いで、溶解物試料を4~12%(w/v勾配)SDS-PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にトランスファーし、そしてホスホ-SMAD2(pSMAD2)(138D4、Cell Signaling Technology)、ホスホ-SMAD3(
pSMAD3)(C25A9、Cell Signaling Technology)、総SMAD2/3(Cell
Signaling Technology)およびアクチン(クローンC4、Merck Millipore)に関して、
ウェスタンブロットによって探査した。本発明者らの結果は、TGF-β1を含まなくても(0ng/mL)、低いバックグラウンドレベルのpSMAD2およびpSMAD3シグナル伝達があることを示した。1ng/mLでは、pSMAD2シグナルは、処理6時間後、非常に強力であり、そして12時間後以降、収まり始めた。pSMAD3シグナルは、より低い強度ではあるが、pSMAD2シグナルのものを反映した。5ng/mLおよび10ng/mLのTGF-β1両方で、pSMAD2シグナルは、試験したすべての時点で飽和したままであるようであったが、pSMAD3シグナルは、24時間までにバックグラウンドに戻った。したがって、すべての続く実験では、6時間の時点を選択した。
1~100μg/mLの間であると報告しているため、本発明者らは、この範囲内の用量を選択した。1ng/mLのTGF-β1で処理し、10μg/mLのヘパリンとプレインキュベーションした細胞は、TGF-β1のみの同じ用量で処理した細胞と比較して、より強いpSMAD2およびpSMAD3シグナルを維持した(図3.12)。より高い用量のヘパリン(40μg/mL)は、1ng/mLのTGF-β1で同じ効果を誘発することができなかった。5ng/mLのTGF-β1とプレインキュベーションした際、どちらの用量のヘパリンも、増殖因子のみで得られるものを超えるpSMADシグナルを増進することはできなかった。総合すると、本発明者らの結果は、ヘパリンは、TGF-β1によって産生されるpSMADシグナルを増進するのではなく延長することを示唆する。
HS16陽性がTGF-β1シグナル伝達を増進することが示されたため、TGF-βスーパーファミリーの他のメンバーの活性を同様に増進させうるかどうかを決定することに関心が持たれた。本発明者らのグループは、以前、BMP-2の活性を増進するHS分画であるHS3陽性のアフィニティ単離を報告した[Murali, S.ら, 骨修復のためのアフィニティ選択ヘパラン硫酸。 Biomaterials, 2013. 34(22):p.5594-5605;WO201
0/030244]。2つのタンパク質の間の構造的類似性は、HS16陽性およびHS3陽性の組成の比較を正当化した(図12)。HS3陽性およびHS16陽性はどちらも、類似の量のΔUA-GlcNAc、ΔUA-GlcNSおよびΔUA,2S-GlcNSの類似の量を含有することが見出されており、一方、HS16陽性は、HS3陽性よりも、より多くのΔUA-GlcNAc,6S、ΔUA-GlcNS,6SおよびΔUA,
2S-GlcNS,6Sを、そしてより少ないΔUA,2S-GlcNAcを含有することが見出された。HS3陽性の組成は、キャピラリー電気泳動(CE)によって決定されるが、HS16陽性およびHSPMのものは、HPLCによって決定されず、したがって、ΔUA,2S-GlcNAc,6S二糖は、あとの2つの試料では検出されなかったことに注目しなければならない。この二糖を検出できないことは、HS変異体の組成プロファイルを改変すると議論される可能性もあるが、CE法を用いたHSPMの以前の分析は、ΔUA,2S-GlcNAc,6S二糖を含まずにHPLCで得られたものと類似の組成プロファイルを生じた。
本研究において、本発明者らは、ヘパリンがTGF-β1に結合可能であり、そして結合する際に、該増殖因子の熱安定性を増進させることを示した。この安定化は、hMSCにおいて、TGF-β1シグナル伝達活性の半減期を延長するようである。軟骨形成分化条件下で、このヘパリン仲介性増強は、初期軟骨形成遺伝子の発現を増進させた。本発明者らの知見は、この軟骨形成遺伝子発現に対するヘパリンの増強効果が、ヘパリンがTGF-β1シグナル伝達経路を通じて作用する結果として起こり、そしてTGF-β1に最適に結合し、そしてそのシグナルを増強するためには、18~22糖の間の長さのGAG鎖が必要であるというアイディアを支持する。三元TGF-β1リガンド受容体複合体を調べると、より長いヘパリン鎖は、複合体形成中にII型TGF-β受容体(TβRII)とTGF-β1の結合に干渉しうることが示された(43)。2-O硫酸化の喪失、およびより低い度合いの6-O硫酸化は、結合アフィニティの減少にも関わらず、ヘパリンがTGF-β1シグナルを増強する能力を事実上改善する。ヘパリン鎖の長さの影響に関する本発明者らの先の知見と併せて、これらの結果は、HSの現在の「糖暗号」仮説(44~47)の説得力がある証拠を提供し、そして結合力および生物活性の間に非線形の関係があるというアイディア(48)を補強する。本発明者らはまた、ヘパリン結合に関与するTGF-β1単量体上の新規残基として、K13を同定した。このデータに導かれて、本発明者らはブタ粘膜調製物から得られる不均一混合物から、TGF-β1に優先的に結合するHS集団(HS16陽性)を単離することにした。HS16陽性の特徴付けによって、これがHSPMおよびHS16陰性とは組成的に異なり、そしてこの相違によってhMSCにおいてTGF-β1およびLTGF-β1両方によりよく結合し、そしてそのシグナル伝達を増強することが可能になることが立証された。
研究において、TGF-βキャリアーまたは足場材料のいずれかとしての使用につながっている(49、50)。いくつかの研究によって、ヘパリンは、ネズミMSCの軟骨形成誘導中、増殖因子の放出を制御するために利用されてきている(51)。しかし、この糖は、組織修復または増殖因子調節のための療法剤として広く採用されてはいないようであり、これは制御されない出血および血小板減少症のリスクのため(52)ばかりではなく、ヘパリンの過剰硫酸化は、集団的にヘパリン・インタラクトームまたはヘパラノームとして知られる、200を超える異なる細胞外タンパク質への乱雑な結合を可能にすることを意味するためである(53、54)。これは、増殖因子産生および局在を容易に制御することが不可能であるin vivo系において、ヘパリンが、ターゲティングされた増殖因子
調節のために用いられるために十分な特異性を持たないことを示す。にもかかわらず、本発明者らのin vitroデータによって、ヘパリンを用いて、hMSC軟骨形成分化中、TGF-β1活性を延長することが可能であることが示され、これらの生得的な限界が克服可能であるならば、実現されるであろう療法的潜在能力があることを示唆する。
の影響を調節することも可能である。興味深いことに、ヘパリンは、LTGF-β1の活性化を阻害することが報告されている(56)が、HS16陽性は阻害しない。これは、正常および改変された生理学的状態中の細胞による、TGF-β1結合性HSのin vivo
合成に関して、興味深い問題を生じさせる。
の生成または放出のいずれかにHSが関与しているかどうか、そしてそれはどのようにかは興味深い問題である。
プチド構造予測のためのオンラインリソース。 Nucleic Acids Research, 2009. 37(補
遺2):p.W498-W503;Maupetit, J., P. Derreumaux,およびP. Tuffery,大規模デノボペプチドおよびミニタンパク質構造予測のための迅速法。 Journal of Computational Chemistry, 2010. 31(4):p.726-738;および216. Thevenet, P.ら,PEP-FOLD:直鎖お
よびジスルフィド結合環状ペプチド両方に関する更新されたデノボ構造予測サーバー。Nucleic Acids Research, 2012. 40(W1):p.W288-W293]を用いた、HS16陽性単離に用いられるTGF-β1ペプチドの構造予測は、TGF-β1の天然構造とはマッチしない。これは、本発明者らのペプチドに基づくアフィニティ精製を駆動する機構に疑念を生じさせ、これは、ペプチドの単一ストレッチは、TGF-β1ヘパリン結合性ドメインの空間組成を再構築可能であるとは想像しにくいためである。ペプチドおよびHSの間の相互作用は、主に、イオン性相互作用によって駆動されると議論することも可能であり、これはペプチド-ヘパリン相互作用に関してはほぼ間違いなく真実である(本発明者らのグループによる未公表データ)が、異なるタンパク質(BMP-2)由来のペプチドの使用は、単離HS分画のプロファイルを改変するため、この場合には当てはまらないようである。
存在することが提唱されてきている:-X-BX-X-B-X-X-B-X-X-B-X-[McCaffrey, T.A., D.J. Falcone,およびB. Du,トランスフォーミング増殖因子-β1はヘパリン結合性タンパク質である:推定上のヘパリン結合性領域の同定およびTGF-β1に多様なアフィニティを持つヘパリンの単離。 J. Cell Physiol, 1992. 152(2):p.430-440]。興味深いことに、PaceおよびScholtz[Nick Pace, C.およびJ. Martin Scholtz,ペプチドおよびタンパク質の実験的研究に基づくらせん傾向スケール。 Biophysical Journal, 1998. 75(1):p.422-427]は、塩基性残基が、溶液中でαらせんを形成する高い傾向を有することを報告した。これらの提唱されるモチーフ中の塩基性残基の組成およびαらせんのもの(回転あたり3.6アミノ酸残基)を考慮すると、これらのモチーフが、溶液中でらせん構造を採用し、その塩基性残基が同じ平面に沿って配置されることが見出されたのは驚くべきことではない。これが真実であれば、こうした構成は、ペプチドに、ある程度の選択性を与える可能性もある。
主な形であるため、これは、HSの合成、およびTGF-β1シグナル伝達において、HSが果たす生理学的役割に関する興味深い疑問を提示する。LTGFの潜在関連ペプチド(LAP)部分は、LTGF-β1複合体においてTGF-β1を捕捉するような方式で、安定と見なされる構造を有するが、分子の2つの領域は、アンフォールディング可能である[Shi, M.ら 潜在TGF-β構造および活性化。 Nature, 2011. 474(7351):p.343-349]。これらの領域のコンホメーションが、機械的に完全開放された際、活性TGF-
β1はLAPから放出される[Buscemi, L.ら,潜在TGF-β1複合体の単一分子機構
。 Curr Biol, 2011. 21(24);p.2046-2054]。両方のドメインのこの同時アンフォールディングは、完全TGF-β1放出に必要な全か無かのスナップ機構であり、LAPがLTGF-結合タンパク質-1(LTBP-1)に結合した際にのみ可能である。LAPおよびLTBP-1の両方がヘパリンと相互作用すると報告されてきていることに注目することが興味深い[Lee, M.J.,ヘパリンは潜在トランスフォーミング増殖因子-β1の活性
化を阻害する。Pharmacology, 2013. 92(5-6):p.238-244;Chen, Q.ら, 潜在TGF-
β結合性タンパク質-1の集合を調節することによる、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)の制御におけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの潜在的な役割。 J. B
iol Chem, 2007. 282(36):p.26418-26430;およびParsi, M.K.ら,LTBP-2は多数のヘパリン/ヘパラン硫酸結合部位を有する。Matrix Biology, 2010. 29(5):p.393-401]
。証拠によって、in vivoで合成されるHSは、LTGF-β1を活性化し始める可能性
もあることが示唆されるが、この機械力の生成または放出のいずれかにHSが関与しているかどうか、そしてそれはどのようにかは核心に関連する問題である。
Mancera,骨形成タンパク質(BMP)におけるヘパリン結合部位の予測。 Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics, 2012. 1824(12):p.1374-1381]に
よって、会合がヘパリンとTGF-β1のものとは有意に異なることが示唆され、このことは、HS16陽性およびHS3陽性の組成の相違を説明し、そしてTGF-βスーパーファミリー内のヘパリン/HS結合部位の多様性をほのめかす[Rider, C.C., TGF
-βサイトカインスーパーファミリーにおけるヘパリン/ヘパラン硫酸結合。 Biochem Soc Trans, 2006. 34(Pt3):p.458-460]。HSPMに比較して、HS16陽性が、BMP
-2駆動性ALP発現を増強する能力に観察される中程度の増加は、HS16陽性における硫酸化HS鎖が濃縮されて、HSPMよりヘパリンに類似しているか、またはHS16陽性およびHS3陽性調製物におけるHS鎖の組成が重なっているかどちらかに起因しうる。
ラン硫酸ドメイン組成および硫酸化は、FGF2誘導性細胞シグナル伝達を調節する。 J
Biol Chem, 2010]、そして結合力および生物活性の間の非線形関係を補強する[Rudd, T.R.ら,多様なHSおよび非GAG類似体によって、FGFにおいて、匹敵する安定化、
構造変化および活性が誘導可能である:配列-活性関係の暗示。 Org Biomol Chem, 2010. 8(23):p.5390-5397.]。解答されないままである主な疑問の1つは、所定のHS鎖が所定のタンパク質と相互作用するために必要なストリンジェンシーレベルである。GAG構成を解読する改善されたコンピュータツールの開発が、この努力を補助するであろうと期待される[Spencer, J.L.ら,グリコサミノグリカン構成を解読するためのコンピュータ
アプローチ PLoS ONE, 2010. 5(2):p.e9389]。
の影響
序論
関節軟骨は、長骨の端に見られる組織であり、関節において、衝撃吸収剤および潤滑剤の両方として働く。無血管性であるため、関節軟骨によって維持される傷害はしばしば治癒に失敗する。軟骨修復戦略の開発に関する現在の研究は、活性化されたバイオマテリアルの使用または細胞への誘導性の合図の提供を通じて、内因性または移植された細胞のいずれかからの反応を刺激することに焦点を置いている[145. Guo, X.ら, ウサギモデルにおける、骨髄間葉系幹細胞を被包する生物分解性ヒドロゲル複合体での骨軟骨欠損の修復。 Acta Biomaterialia, 2010. 6(1):p.39-47;Chu, C.R., M. Szczodry,およびS. Bruno,軟骨再生および修復のための動物モデル。 Tissue Engineering Part B: Reviews, 2009. 16(1):p.105-115;Fritz, J.ら, 膝における関節軟骨欠損-基礎、療法および結果。 Injury, 2008. 39(1,補遺):p.50-57;Hunziker, E.B.,関節軟骨修復:基礎科学および臨床的進展。現在の状態および展望の概説。 Osteoarthritis Cartilage, 2
002. 10(6):p.432-463;Gille, J.ら,関節軟骨欠損の治療のための、微小破壊を通じた
、細胞含有および細胞不含マトリックス誘導性軟骨形成:ヒツジにおける組織学的および
生物学的研究。 Cartilage, 2010. 1(1):p.29-42;Haleem, A.M.ら,関節軟骨欠損治療において、血小板リッチ・フィブリン接着剤上に移植されたヒト培養拡大自己骨髄間葉系幹細胞の臨床的使用。 Cartilage, 2010. 1(4):p.253-261;Moran, C.J.ら,関節軟骨の回
復。 J Bone Joint Surg Am, 2014. 96(4):p.336-344;Danisovic, L.u.ら,関節軟骨の
組織操作:細胞、足場および刺激因子。 Exp Biol Med, 2012. 237(1):p.10-17.]。TGF-β1は、MSCの軟骨形成分化を刺激し[Buxton, A.N.ら,軟骨形成因子に一時的に曝露すると、ヒドロゲルにおけるヒト間葉系幹細胞軟骨形成が調節される Tissue Eng Part A, 2011. 17(3-4):p.371-80;233.Bosnakovski, D.ら,ペレット培養系における
ウシ骨髄間葉系幹細胞の軟骨形成分化。 Experimental Hematology, 2004. 32(5):p.502-509;Ng, F.ら,PDGF、TGF-β、およびFGFシグナル伝達は、間葉系幹細胞(
MSC)の分化および増殖に重要である:転写プロファイリングは、脂肪形成、軟骨形成、および骨形成系譜へのMSCの分化において重要なマーカーおよびシグナル伝達経路を同定可能である。 Blood, 2008. 112(2):p.295-307.]、そして軟骨ECM分子の発現を
駆動する[Li, H.ら, II型コラーゲンとの比較分析は、初代TGFβ反応性遺伝子としての軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質を区別する。Osteoarthritis Cartilage, 2011. 19(10):p.1246-1253;Iqbal, J.ら, ウマ関節軟骨における、プロテオグリカン
合成に対するTGF-βの年齢関連効果。Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(2):p.467-471;Grimaud, E., D. Heymann,およびF. Redini,軟骨細胞代謝に対するTGF-β効果の最近の進歩:軟骨障害におけるTGF-βの潜在的な療法的役割。Cytokine Growth Factor Rev, 2002. 13(3):p.241-257;Serra, R.ら,マウス骨格組織における一部切除キナーゼ欠損性II型TGF-β受容体の発現は、末端軟骨細胞分化および変形性関節症を促進する。J Cell Biol, 1997. 139(2):p.541-552.;Blaney Davidson, E.ら,Sm
ad7の存在下で、TGFベータ誘導性軟骨修復は維持されるが、線維症はブロックされる。Arthritis Res Ther, 2006. 8(3):p.R65]能力のため、軟骨修復誘導に関する重要な作用因子として浮上してきている。こうしたものとして、今日までの大部分の研究は、内因性TGF-β1を単独でまたは他の増殖因子とともに使用して、hMSC軟骨形成分化を駆動してきた[Blaney Davidson, E.N., P.M. van der Kraan,およびW.B. van den Berg,TGF-βおよび変形性関節症。Osteoarthritis Cartilage, 2007. 15(6):p.597-604;Park, J.S.ら,ヘパリン結合性トランスフォーミング増殖因子β3は、ウサギ間葉系
幹細胞による新規軟骨形成を増進する。Transplantation, 2008. 85(4):p.589-596;Goepfert, Cら,間葉系幹細胞からの軟骨操作,Bioreactor Systems for Tissue Engineering
II中, C. Kasper, M. van Griensven,およびR. Portner監修 2010,Springer Berlin/Heidelberg,p.163-200;Mara, C.S.ら, ヒト間葉系臍帯血細胞からの、トランスフォ
ーミング増殖因子-β3およびインスリン様増殖因子-1による軟骨形成の制御。J Rheumatol. 2010. 37(7):p.1519-1526.]。
を誘発することを防止するために、治療部位に増速因子を局在させる必要もまたある[Jakowlew, S.,癌および転移におけるトランスフォーミング増殖因子β。Cancer Metastasis Rev, 2006. 25(3):p.435-457;Bakker, A.C.ら,ネズミ膝関節における活性TGF-ベータ-1の過剰発現:滑膜層依存性軟骨骨棘形成の証拠。Osteoarthritis Cartilage, 2001. 9(2):p.128-136;Yang, Y.-a.ら,可溶性TGF-βアンタゴニストに対する生涯の
曝露は、副作用を伴わずに、転移に対してマウスを保護する。J Clin Invest, 2002. 109(12):p.1607-1615.]。さらに、TGF-β1に対する感受性は、年齢とともに減少し[Blaney Davidson, E.N.ら,高齢マウスの軟骨におけるトランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の減少:損なわれた修復能における役割。Arthritis Res Ther, 2005. 7(6):p.R1338-R1347.]、したがって、適切なTGF-ベータ1投薬は、高齢患者に対して
さらにより多くのリスクを提示する。これらの困難に対処して、外因性増殖因子に対する必要性を減少させるか、または完全に除去し;治療部位に増殖因子をよりよく局在させ、そして増殖因子の送達を調節し;そして増殖因子に対する細胞感受性または増殖因子のシグナル伝達効率のいずれかをブーストする新規戦略が考慮されている。
逆転写および定量的PCR(qPCR)
製造者のプロトコルにしたがって、TRIZOL試薬(Life Technologies、米国カリ
フォルニア州)を用いて、軟骨形成微量ペレットから総RNAを単離した。1μg RNAに対して、製造者の指示にしたがい、SuperScript(登録商標)VILOTM cDNA合成キット(Life Technologies)を用いて、42℃でのインキュベーションを1時間ではなく2時
間行って、逆転写を行った。各qPCRは、40ng cDNA、遺伝子あたり1μLのTaqMan(登録商標)プライマー-プローブ混合物、および10μL Taqman(登録商標)迅速普遍的PCRマスター混合物(Life Technologies)を最終体積20μL中に
含有した。熱周期条件は、95℃で20秒間、その後、45周期の95℃1秒間および60℃20秒間が続いた。各qPCRを2つ組で実行し、そして遺伝子発現をHPRT1発現に対して規準化して、ΔCt値を得た。生物学的3つ組の平均値を取った。GAGもTGF-β1も含まない培地中で培養した軟骨形成微量ペレットを、対照(ΔΔCt)として用いた。各プライマーセットの相対発現レベルを2-ΔΔCt法によって倍変化として表した[Livak, K.J.およびT.D. Schmittgen,リアルタイム定量的PCRおよび2-ΔΔCT法を用いた相対的遺伝子発現データの分析。Methods, 2001. 25(4):p.402-408]。以下のTaqMan(登録商標)プライマー-プローブアッセイ(Life Technologies)を用いた
:
in vivo研究設計
22の骨格的に成熟したオス・ニュージーランドホワイト・ウサギ(平均年齢9ヶ月および体重3.9kg)をこの研究に用いた。すべてのウサギに、大腿滑車溝中、両側性骨軟骨欠損を与え、そして各欠損をランダムに、4つの処置群の1つに割り当てた:(1)ゲルのみ、(2)ゲル+HSPM、(3)ゲル+HS16陽性、および(4)ゲル+HS16陰性。すべての欠損に60μLのヒアルロン酸に基づくヒドロゲル(ゲル)(AuxiGelTM、Termira AB、スウェーデン・ストックホルム)[Bergman, K.ら,骨-組織形成のための注射可能細胞不含テンプレート。Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 91A(4):p.1111-1118]を、単独で、あるいは10μgのHSPM、HS16陽
性またはHS16陰性とともに投与した。術後の胃内容うっ滞から2匹のウサギが死亡し、そしてこれらは分析には含まれなかった。
この研究に用いた研究プロトコルは、施設動物飼育使用委員会、A*STARシンガポールによって認可され、そしてすべての適切な指針にしたがった。ケタミン(35mg/kg)およびキシラジン(5mg/kg)注射ならびにフェースマスクを通じたイソフルランの組み合わせからなる全身麻酔下、そして無菌条件下ですべての外科処置を行った。15~20mmの内側膝蓋近傍皮膚切開を作製し、そして膝蓋を横方向に脱臼させた。1つの全層で重大なサイズの骨軟骨欠損(直径4mm、深さ2mm)を各大腿滑車溝の中央に作製し、石灰化した軟骨を完全にデブリードマンした。続いて、整形外科ドリルを用いて、各欠損中に3つの微小破壊(直径0.8mm、深さ2mm)を作製し、そして手術ガーゼで直接圧を適用して、示す処置を適用する前に、すべての出血が止まることを確実にした。200μLピペットで処置を適用し、そし固化させた。ゲルキャリアが固化する間、すべての欠損に血液が満たされることを観察した。
)で密封した。予防的抗生物質(エンロフロキサシン、10mg/kg)および鎮痛剤(ブプレノルフィン、0.1mg/kg)を術後5日間、皮下投与した。12週後、鎮静の後に、すべてのウサギをペントバルビタール(150mg/kg)で安楽死させた。遠位大腿を採取し、そして組織学的および免疫組織化学的(IHC)分析のためにプロセシングする前に、巨視的に画像化した。
処置群を知らないブラインドの観察者が、関節の画像を調べ、そしてスコア付けした。巨視的スコア付けは、国際軟骨修復協会(ICRS)視覚的評価スケール(ICRS Iスコア付けシステム)に基づいた[Brittberg, M.およびL. Peterson,関節軟骨分類の序論 ICRS Newsletter, 1998. 1:p.5-8.]。
採取した遠位大腿骨頭を10%(v/v)中性緩衝ホルマリン(NBF)中、真空下で1週間固定し、そして室温で平均6~7日間、5%(v/v)ギ酸中で脱灰した。続いて、試料をパラフィン蝋中に包埋し、そして欠損中央を横断して切片作製した(5μm)。切片を脱パラフィン処理し、そしてマッソンの三色、アルシアンブルー(pH1、ニュートラルレッドで対比染色)およびサフラニン-Oで染色した。
Leica BondTM-IIIまたはLeica BondTM-Max自動染色装置(Leica Nussloch GmbH、ドイツ)のいずれかおよびBondTM Refine検
出キット(Leica)を用いて、IHC染色を行った。切片をBondTM脱ワックス溶液
(Leica)で脱パラフィン処理し、そしてプロテイナーゼK(20μg/mL)(Sigma-Aldrich)と室温で15分間インキュベーションすることによって、抗原回収を行った。3~4%(v/v)H2O2と15分間インキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、切片を10%(v/v)ヤギ血清中で30分間ブロッキングした後、BondTM一次抗体希釈剤(Leica)中で希釈した一次抗体(コラーゲンI型(1:1000)、Novus Biologicals、米国コロラド州、およ
びコラーゲンII型(1:2000)、Acris Antibodies, Inc.、米国カリフォルニア州)と室温で30分間インキュベーションした。BondTM Refine検出キットに記載されるように染色の検出を行い、そして核をヘマトキシリンで5分間対比染色した。すべての洗浄は、1xBondTM洗浄溶液(Leica)で行った。
処置群を知らないマスキングされた観察者が、染色切片の検査およびスコア付けを行った。スコア付けは、O’Driscoll[O’Driscoll, S.W., F.W. Keeley,およびR.B. Salter,連続受動的運動の影響下での関節表面における大きな全層欠損の生物学的表面再形成のための遊離自家骨膜の軟骨形成潜在能力。ウサギにおける実験的検査。J Bone Joint Surg Am, 1986. 68(7):p.1017-1035]およびICRS II[Mainil-Varlet, P.ら,ヒト軟骨修復の品質の評価のための新規組織学スコア付けシステム:ICRS II。The American Journal of Sports Medicine, 2010]スコア付けシステムに基づき、そして軟骨お
よび軟骨下空間内の各組織タイプ(すなわち骨性組織、線維性組織、線維軟骨、ハイブリッド軟骨および硝子軟骨)の割合を定量化することによって、組織充填を決定した。
in vitroのhMSCの軟骨形成分化に対するHS16陽性の影響
in vitroのhMSCの軟骨形成分化に対するHS16陽性の影響を評価するため、まず、TGF-β1単独の影響を確立する必要があった。修飾微量培養系を用いて、軟骨形成分化を行った[Zhang, Lら,ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成分化:微量およびペレット培養系の間の比較。Biotechnol Lett, 2010. 32(9):p.1339-1346.]。簡潔には、第4継代の
hMSCを採取し、そして化学的に定義された軟骨形成培地(PT-3003、Lonza、
米国メリーランド州)中に、2x107細胞/mLで再懸濁した。次いで、12.5μlの小滴を24ウェルプレート中の各ウェルの中央に植え付け、そして37℃で2時間接着させ、その後、1または10ng/mLのTGF-β1(100-21C、PeproTech)
のみ、あるいは5または10μg/mLのヘパリン(Sigma-Aldrich)、ブタ粘膜HS(
HSPM)(Celsus Laboratories)、HS16陽性またはHS16陰性のいずれかを補
った500μLの軟骨形成培地を各ウェルに添加した。細胞小滴は、24時間後に球状の塊に合体した。培地を3日ごとに交換し、そして微量を第3日、第7日、第14日、および第21日に採取した。
くのGAGを含有することが明らかになった。
組織操作のための間葉系幹細胞軟骨形成の転写組織分布。Tissue Eng Part A, 2010. 16(9):p.2699-708;Zaucke. F.ら,軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質(COMP)および
コラーゲンIXは、関節初代軟骨細胞の分化状態に関する高感度マーカーである。Biochem J, 2001. 358(1):p.17-24.]。本発明者らはまた、ヘパリンがTGF-β1の影響を増強する場合、10ng/mLの推奨される用量に反応したさらなる増加は、検出可能ではない可能性もあると判断した。したがって、推奨される用量と平行して、より低い用量のTGF-β1を用いた。本発明者らのデータは、5μg/mLのへパリンは、用いたTGF-β1の量に関わらず、SOX9発現レベルを有意に改変しないことを示す(図17A)。対照的に、10μg/mLのヘパリンはそれ自体、SOX9発現に影響を及ぼさないが、1ng/mLのTGF-β1とともに用いると、SOX9の発現を増加させることが可能であった。ヘパリンの同じ用量は、10ng/mLのTGF-β1とともに用いた際、SOX9発現にいかなる変化ももたらすことができず、TGF-β1シグナルがすでに飽和していることが示唆された。COMP発現の場合、ヘパリンのどちらの用量もそれ自体ではCOMPをわずかに減少させることが見出された(図17B)。しかし、1ng/mL TGF-β1と組み合わせて用いた際、ヘパリンは、COMP発現レベルを用量依存方式で増加させることが可能であった。10ng/mLのTGF-β1を伴うヘパリンのいずれの用量の使用も、COMP発現のさらなる増加を誘発しなかった。事実、より高い用量のヘパリンは、実際にCOMP発現レベルを減少させた。これは再び、10ng/mLのTGF-β1が、軟骨形成分化を経るhMSCの飽和用量であることを示唆する。10μg/mLのヘパリンを10ng/mLのTGF-β1とともに用いた場合に見られるCOMP発現の減少は、過剰なTGF-β1シグナルに反応した負のフィードバック機構の活性化を示唆する。
軟骨修復研究において、広範囲に使用されていることに基づき、そしてかつ若年期に観察される自発的な治癒を回避するため、骨格的に成熟した成体ニュージーランドホワイト・ウサギを本発明者らのin vivo試験に選択した。本発明者らは、大腿滑車溝に、全層骨
軟骨欠損を含むモデルにおいて、本発明者らの化合物を試験することを選択し、Reinholzら[Reinholz, G.G.ら,軟骨再構築のための動物モデル。Biomaterials, 2004. 25(9):p.1511-1521.]、ICRS[Hurtig, M.B.ら,軟骨修復のための前臨床研究:国際軟骨修復協会からの推奨。Cartilage, 2011. 2(2):p.137-152.]、および現在の病院における標準治療[Fritz, J.ら,膝関節軟骨欠損-基礎、療法および結果。Injury, 2008. 39(1,
補遺):p.50-57;Hunziker, E.B.,関節軟骨修復:基礎科学および臨床的進歩。現在の
状態および展望の概説。Osteoarthritis Cartilage, 2002. 10(6):p.432-463]に概略さ
れる指針に基づき、商業的に入手可能なヒアルロン酸に基づくヒドロゲル(AuxiGelTM、Termira AB)とともに、微小破壊を用いた[Bergman, K.ら,骨-組織形成のた
めの注射可能細胞不含テンプレート。Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 91A(4):p.1111-1118]。
因子β1およびプロテオグリカン断片の年齢および傷害依存性濃度。Osteoarthritis and
Cartilage, 1998. 6(1):p.10-18.]、一方、抗凝固骨髄吸引物中のレベルは、成体ウサギにおいて、190~881.8pg/mL(n=20)であることが見出された(Lim,
Z. X. H.、未公表データ)。別個の研究もまた、血小板活性化後、最大ナノグラムレベ
ルまでのTGF-β1の増加を報告しており[Coupes, B.M.ら,血漿トランスフォーミング増殖因子β1および血小板活性化:移植レシピエントにおける研究のための暗示。Nephrol Dial Transplant, 2001. 16(2):p.361-367]、そして創傷中に軟骨修復を刺激するた
めに十分なレベルのTGF-β1の存在を報告している[Shah, R.N.ら,軟骨再生のための自己組み立てナノファイバーの超分子設計。Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(8):p.3293-3298]。こうしたものとして、本発明者らの糖処理を伴う外因性TGF-β1の使用は排除された。
で有意な相違を示さなかった。軟骨および軟骨下空間の境界をまず同定し、画像化切片上にグリッドを重ね合わせ、そして次いで各組織学的空間に充填された空間の量を測定することによって、欠損の組織充填を決定した。組織充填に関して、ほぼすべての試料は、完全な軟骨下充填および高レベルの軟骨充填を示した。すべての処置群に関して組織充填スコア間に統計的な相違はなかった。すべての試料における軟骨下充填の中央値パーセントは同様であった。すべての3つの化合物(HSPM、HS16陰性およびHS16陽性)は、現在の臨床的標準治療処置である対照試料(ゲル)よりも高い中央値組織充填スコアを有した。
発明の態様
[態様1]ヘパラン硫酸HS16。
[態様2]単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸HS16。
[態様3]アミノ酸配列RKDLGWKWIHEPKGYH(配列番号1)を有するかまたは該配列からなるペプチドまたはポリペプチドに結合可能である、態様1または2に記載のヘパラン硫酸HS16。
[態様4]ヘパリン・リアーゼI、IIおよびIIIで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をHPLC分析に供した後、ヘパラン硫酸HS16が:
[表1]
を含む二糖組成を有する、態様1~3のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸HS16。
[態様5]ヘパリン・リアーゼI、IIおよびIIIで消化し、そして次いで、生じた二糖断片をHPLC分析に供した後、ヘパラン硫酸HS16が:
[表2]
を含む二糖組成を有する、態様1~3のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製されたヘパラン硫酸HS16。
[態様6](i)支持体に接着したポリペプチド分子を有する固体支持体を提供し、ここで、ポリペプチドがアミノ酸配列RKDLGWKWIHEPKGYHを有するヘパリン結合ドメインを含み;
(ii)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体が形成可能であるように、固体支持体を、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸調製物を含む混合物と接触させ;
(iii)混合物の残りからポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体を分配し;
(iv)ポリペプチド-グリコサミノグリカン複合体から、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸種を解離させ;
(v)解離したグリコサミノグリカン、好ましくは1またはそれより多いヘパラン硫酸種を収集する
工程を含む方法によって得られる、態様1~5のいずれか記載の単離されたまたは実質的に精製された型のヘパラン硫酸HS16。
[態様7]ポリペプチドがRKDLGWKWIHEPKGYH(配列番号1)より選択されるアミノ酸配列を有するか、または該配列からなる、態様6の方法。
[態様8]グリコサミノグリカンを含む混合物が、ブタ粘膜より得られるヘパラン硫酸調製物(HSPM)である、態様6または7の方法。
[態様9]態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16を含む組成物。
[態様10]増殖因子、好ましくはTGFβ1をさらに含む、態様9の組成物。
[態様11]態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16を含む化粧用組成物、医薬組成物または薬剤。
[態様12]TGFβ1タンパク質および/または間葉系幹細胞をさらに含む、態様11の医薬組成物または薬剤。
[態様13]医学的治療法において使用するための態様11または12の医薬組成物または薬剤。
[態様14]医学的治療法において使用するための態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16。
[態様15]医学的治療法がin vivoの創傷治癒法を含む、態様14記載のヘパラン硫酸HS16。
[態様16]医学的治療法が、組織、好ましくは結合組織の修復および/または再生を含む、態様14記載のヘパラン硫酸HS16。
[態様17]疾患、状態または組織に対する傷害の治療のための薬剤製造における態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16の使用であって、方法が、組織、好ましくは結合組織の修復および/または再生を含む、前記使用。
[態様18]患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、療法的有効量のヘパラン硫酸HS16を患者に投与し、組織、好ましくは結合組織の修復および/または再生を導く工程を含む、前記方法。
[態様19]組織の再生または修復が必要である、患者の体の創傷または位置にあるまたはそれを取り巻く組織にヘパラン硫酸HS16を投与する工程を含む、態様18の方法。
[態様20]患者にTGFβ1タンパク質を投与する工程をさらに含む、態様18または19の方法。
[態様21]患者において、疾患、状態または組織に対する傷害を治療する方法であって、バイオマテリアルおよび態様1~8のいずれかに記載のヘパラン硫酸HS16を含む、生体適合移植物または装具を、疾患、状態または傷害の部位のまたはそれを取り巻く組織内に、外科的に移植して、組織の修復および/または再生を導く工程を含む、前記方法。
[態様22]バイオマテリアルおよび態様1~8のいずれかに記載のヘパラン硫酸HS16を含む、生体適合移植物または装具。
[態様23]態様1~8のいずれかに記載のヘパラン硫酸HS16で、バイオマテリアルをコーティングするか、または含浸する工程を含む、生体適合移植物または装具を形成する方法。
[態様24]in vitroで、態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16と接触させて、幹細胞を培養する工程を含む、in vitroで幹細胞を培養する方法。
[態様25]態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16を含む培地。
[態様26]TGFβ1をさらに含む、態様25の培地。
[態様27]あらかじめ決定した量の態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16およびあらかじめ決定した量のTGFβ1を含む、キットオブパーツ(kit of parts)。
[態様28]医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の:
(i)態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16;および
(ii)TGFβ1タンパク質;
(iii)間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、産物。
[態様29]増殖因子、好ましくはTGFβ1の安定性を増加させる方法であって、増殖因子、好ましくはTGFβ1を、態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16と接触させる工程を含む、前記方法。
[態様30]被験体に、態様1~8のいずれか記載のヘパラン硫酸HS16を投与する工程を含む、美容法。
[態様31]血液由来産物およびあらかじめ決定した量のヘパラン硫酸HS16を含む調製物。
[態様32]血小板調製物である、態様31の調製物。
[態様33]生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料を、あらかじめ決定した量のヘパラン硫酸HS16と接触させる工程を含む、前記方法。
Claims (12)
- 増殖因子TGFβ1をさらに含む、請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物。
- 間葉系幹細胞をさらに含む、請求項3に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物。
- バイオマテリアルおよび請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物を含む、生体適合移植物または装具。
- 請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物で、バイオマテリアルをコーティングするか、または含浸する工程を含む、生体適合移植物または装具を形成する方法。
- in vitroで、請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物と接触させて、幹細胞を培養する工程を含む、in vitroで幹細胞を培養する方法。
- 請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物を含み、TGFβ1をさらに含んでもよい、培地。
- 医学的治療法において、同時に、別個にまたは連続して使用するための、療法的有効量の:
(i)請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物;および
(ii)TGFβ1タンパク質;
(iii)間葉系幹細胞、または線維芽細胞系譜の細胞
の一方または両方を含有する、医薬組成物。 - in vitroで増殖因子TGFβ1の安定性を増加させる方法であって、TGFβ1を、請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
- 血液由来産物およびあらかじめ決定した量の請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物を含む調製物。
- 生物学的材料を保存する方法であって、生物学的材料を、あらかじめ決定した量の請求項1または2に記載の単離されたまたは精製されたヘパラン硫酸組成物と接触させる工程を含む、前記方法。
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---|---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
BR112016025443A2 (pt) * | 2014-04-30 | 2017-12-12 | Agency Science Tech & Res | sulfatos de heparano |
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CN108508129B (zh) * | 2018-04-03 | 2020-11-27 | 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 | 一种肝素类药物生物效价的测定方法 |
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WO2024080183A1 (ja) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 糖鎖複合体、薬物担体、及びドラッグデリバリーシステム |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017522392A (ja) | 2014-04-30 | 2017-08-10 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | ヘパラン硫酸 |
Family Cites Families (11)
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---|---|---|---|---|
US5019087A (en) | 1986-10-06 | 1991-05-28 | American Biomaterials Corporation | Nerve regeneration conduit |
US5843442A (en) * | 1990-10-22 | 1998-12-01 | Corvas International, Inc. | Blood coagulation protein antagonists and uses therefor |
US5807982A (en) * | 1991-04-29 | 1998-09-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Affinity purified heparin |
WO1996023003A1 (en) | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Amrad Operations Pty. Ltd. | A therapeutic molecule |
WO2003077852A2 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | Tissuegene, Inc. | CARTILAGE REGENERATION USING CHONDROCYTE AND TGF-β |
ITTO20060282A1 (it) * | 2006-04-14 | 2007-10-15 | Univ Degli Studi Torino | Mezzo di coltura e composizione farmaceutica per la rigenerazione del tessuto cartilagineo relativo procedimento relativi usi e prodotti |
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Dermatologic Surgery,2006年,32,pp.618-625,DOI:10.1111/j.1524-4725.2006.32132.x |
Drug Delivery System,1999年,14(1),pp.43-50 |
Journal of Biomedical Materials Research Part A,2009年,pp.1139-1144,DOI:10.1002/jbm.a.32440 |
Journal of Cellular Physiology,1992年,152,pp.430-440 |
Journal of Cellular Physiology,1994年,159,pp.51-59 |
日歯周誌,2004年,46(2),pp.127-136 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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