CN103080301A - 包含血管周干细胞和nell-1蛋白的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的实施例提供一种纯化的血管周干细胞（PSC）或诱导性多能干细胞（iPS）群，以及不含所述干细胞的干细胞上清液，包含这些中任一者的组合物及其使用和制备方法。

Description

包含血管周干细胞和NELL-1蛋白的组合物

技术领域

本发明大体上涉及包含血管周干细胞或诱导性多能干细胞的组合物及其使用和制备方法。

背景技术

再生医学是产生活的功能性组织以修复或替换因损伤或先天性缺损而引起的组织或器官功能丧失的方法。此领域通过刺激先前不可修复的器官来使其愈合，从而为体内受损组织和器官的再生提供了广阔的前景。再生医学也使科学家们能够在身体无法自身愈合时于实验室中生长组织和器官，并且安全地将其植入。重要的是，再生医学有可能解决与需要器官移植救命的患者数量相比较，可从捐赠获得的器官短缺的问题，并且有可能解决器官移植物排斥的问题，因为器官的细胞将会匹配患者的细胞（马森C（MasonC）,杜尼尔P（DunnillP）(2008年1月).“再生医学简明定义（Abriefdefinitionofregenerativemedicine）”.再生医学（RegenerativeMedicine）3(1):1-5）。再生医学的基础是干细胞生长成各种组织或器官的能力。胚胎干（ES）细胞是能够在细胞培养中增殖并分化成多种展现专能特性的谱系限制性细胞群的多能细胞（奥德瑞克（Odorico）等人,干细胞（StemCells）19:193-204(2001)）。归因于这些特征，ES细胞，包括人ES细胞，可以变为执行多种功能的极为特殊的细胞类型。

尽管hESC为再生医学提供了广阔的前景，但例如长期暴露于培养基中的动物产品、畸胎瘤形成和可能需要免疫抑制等障碍仍为临床上hESC的使用提出了重大的安全性问题。

以下的实施例将解决上述问题和需求。

发明内容

在本发明一个方面中，提供一种纯化的血管周干细胞（perivascularstemcells）（PSC）或诱导性多能干细胞（iPS）群，所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和任选的CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-（周细胞）或CD146-CD34+CD45-（外膜细胞）。一小组PSC或iPS（asubsetofthePSCoriPS）被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。

在本发明另一方面中，提供一种包含干细胞上清液（asupernatantofstemcell）的组合物，所述干细胞上清液包含营养因子，这些营养因子刺激所需细胞的形成或所需祖细胞的募集，从而形成组织或器官，并且所述上清液包含干细胞培养基并且不含所述干细胞。在所述组合物的一些实施例中，所述干细胞被CD146、CD45、CD34和任选的CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-（周细胞）或CD146-CD34+CD45-（外膜细胞）的PSC或iPS。一小组PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。所述上清液可以是液体，或半固体，或固体制剂。在一些实施例中，上清液是粉末。在一些实施例中，所述组合物另外包含药学上可接受的载剂。

在本发明另一方面中，提供一种组合物，所述组合物包含纯化的PSC或iPS群和任选的诱导剂，所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和任选的CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-（周细胞）或CD146-CD34+CD45-（外膜细胞），并且所述诱导剂促进PSC或iPS分化成所需的细胞或祖细胞，从而形成组织或器官。一小组PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。在一些实施例中，所述组合物另外包含赋形剂或药学上可接受的载剂。所述组合物可以配制成任何合乎需要的制剂。在一些实施例中，所述组合物被配制成台架（scaffold）、骨移植物、软骨移植物、植入物或在植入式装置上的涂层。植入式装置的一个实例是可再吸收性或不可再吸收性支架或缝线。在一些实施例中，所述诱导剂是Nell-1肽。

在本发明另一方面中，提供一种治疗或改善医学病况的方法。所述方法包含对受检者（subject）投予：

纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群，

包含纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群的组合物，或

包含干细胞上清液的组合物，所述干细胞上清液不含所述干细胞，

其中所述医学病况与损伤或患病的组织或器官或者以其它方式受疾病或病原体损害的组织或器官有关。

在所述方法的一些实施例中，所述医学病况与损伤或患病的组织或器官有关。举例来说，所述医学病况可以是CNS（中枢神经系统）疾病；PNS（周围神经系统）疾病；皮肤瘢痕；纤维化；肿瘤；软骨损伤、缺损或疾病；骨损伤、缺损或疾病；心脏病；肾病；运动损伤；呼吸道疾病；或糖尿病。在一些实施例中，所述医学病况是以下各项中的一种：阿尔茨海默氏病（Alzheimer'sdisease）、帕金森氏病（Parkinson'sdisease）、肝纤维化、乳癌、骨质疏松症、心脏病发作、心脏缺血、肾缺血、中风、脑缺血、脊髓损伤、半月板撕裂、哮喘、肺病或I型糖尿病。疾病的其它实例包括国际疾病分类（InternationalClassificationofDiseases，ICD）和当代操作术语集（CurrentProceduralTerminology，CPT）版本中所列的所有病况。

在所述方法的一些实施例中，所述组合物是根据上文或下文所公开的本发明任一实施例所述。

在所述方法的一些实施例中，所述组织或器官是本发明组合物的实施例中所述的任何组织或器官。

在本发明另一方面中，提供一种制造组合物的方法。所述方法包含：

提供纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群或者不含所述干细胞的干细胞上清液，和

形成包含所述纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群或者所述干细胞上清液的组合物。

在所述方法的一些实施例中，所述组合物是根据上文或下文所公开的本发明任一实施例所述。

附图说明

图1A-1H绘示周细胞MSC。所有人类周细胞都表达CD146（A，绿色；内皮CD34为红色；B，红色；CD34为绿色）、NG2（C，绿色；内皮VE-钙粘素为红色）和PDGF-Rβ（D，红色；内皮范威氏因子（endothelialvonWillebrandfactor，vWF）为绿色）。E：周细胞是通过荧光活化的细胞分选术（fluorescenceactivatedcellsorting，FACS）作为CD45-CD56-CD146+CD34-细胞来纯化（红色栅格）。在成骨培养基中培养21天的周细胞：F，冯库萨染色法（vonKossastaining）；矿物沉积物呈黑色。G，茜素红染色法；钙沉积物被染成红色。H：将在BMP2存在下包埋在Gelfoam海绵中的周细胞植入SCID-NOD小鼠肌袋中。植入后第30天时进行X射线分析；

图2A-2F绘示外膜MSC。(A,B)周细胞是从脂肪组织（红色）以及CD146-CD34^hi细胞（绿色）分选，同时被赋予干细胞潜能。(C)CD146-CD34^high细胞进一步细分成CD31+细胞和CD31-细胞，仅后者产生MSC。分选的CD146-CD34^highCD31-细胞(x)未混有内皮细胞或周细胞（D）。(E)CD146-CD34^hiCD31-细胞（箭头）都位于较大血管的外膜中（CD34呈红色）。(F)纯化的外膜MSC在体外成骨（茜素红染色）；

图3A-3F绘示狗周细胞。胎盘(A)用作犬周细胞源。vWF+内皮细胞被CD146+周细胞包围(B)。与人类细胞一样，犬周细胞是作为CD146+CD34-细胞被分选（C中的栅格；与图1E相比较），共表达CD90(D)和CD44(E)，并且是在长期培养中产生(F)；

图4绘示大鼠股骨的2周的显微CT切片。200μgNELL-1/TCP或生理盐水/TCP（对照物）通过环钻术缺损注射到大鼠股骨中；

图5绘示NELL-1增加人PSC矿化作用。PSC在存在或不存在300ng/mlNELL-1情况下培养9天，随后用二甲酚橙荧光色素染色；

图6绘示PSC+NELL-1在

上的体外矿化作用。将100μl的

±300ng/mlNELL-1或载有2.5×10⁵PSC±300ng/mlNELL-1的放入插入式24孔板中，在成骨条件下保持12天。使用倒置（顶图）或体视（底图）荧光显微术评估矿化作用（茜素红）。

图7绘示植入的人PSC的生物发光图像。SCID小鼠（每组中n=4）经肌肉内植入100μl总体积的

±2.5×10⁵PSC±15或300μgNELL-1/TCP。在不含PSC的对照物中未检测到荧光素酶；

图8绘示有关在植入后4周时PSC+NELL-1的结果。SCID小鼠植入100μl体积的

±2.5×10⁵PSC±NELL-1/TCP。相对于

(D)，观察到在PSC+NELL-1组中大量新骨形成(A)（显微CT中的红色区域），同时骨涎蛋白（BSP）染色增加（箭头），以及

粒子和髓隙形成的骨稳固作用（H&E，箭头）。观察到在仅含的组中稀少的细胞结构和低活性骨形成(D)。=P<0.05高于仅含

的组(D)；=P<0.05低于仅含

的组(D)。

图9绘示有关在PSC+NELL-1移植物中血管生成的结果。按照图8对SCID小鼠进行植入。1周(A-C)和2周(D-F)试样的免疫染色显示相对于

，在PSC组中内皮vWF增加（A、B—红色箭头）并且VEGF显著增加（D、E—黄色箭头）。抗人类MHCI(H300)染色在PSC组中也增加，表明PSC持续存在（图中未示）。

图10绘示有关针对结合内皮细胞培养（接触共培养）的纯化PSC的成骨分化实验的体外研究的结果。

图11绘示有关在SCID小鼠股部肌袋中进行植入后所评估的细胞命运/存活率、血管生成和骨生成的体内研究的结果。

图12绘示当添加Nell-1时显示周细胞增殖/存活率增加的实验的结果。

图13绘示当添加Nell-1时显示周细胞的VEGF表达增加的实验的结果。

具体实施方式

在本发明一个方面中，提供一种纯化的血管周干细胞（PSC）或诱导性多能干细胞（iPS）群，所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和任选的CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-（周细胞）或CD146-CD34+CD45-（外膜细胞）。一小组PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。

在本发明另一方面中，提供一种干细胞上清液。所述上清液包含营养因子，这些营养因子刺激组织或器官的形成。所述上清液包含干细胞培养基，并且不含所述干细胞。在一些实施例中，所述干细胞是PSC，例如周细胞或外膜细胞。上清液可以呈液体形式使用，或可以是干燥的，由此能以粉末形式使用。在一些实施例中，所述上清液可以包括载剂或赋形剂。

在本发明另一方面中，提供一种组合物，所述组合物包含纯化的PSC或iPS群。在一些实施例中，所述组合物可以任选地包括诱导剂。所述组合物可以另外包括赋形剂或载剂。在一些实施例中，所述载剂是药学上可接受的载剂。在一些实施例中，所述组合物可以被配制成台架、骨移植物、软骨移植物、植入物，或在植入式装置上的涂层，例如涂在内腔表面和/或支架的内腔表面上的涂层。

在本发明另一方面中，提供一种治疗或改善医学病况的方法。所述方法包含对受检者投予本文中所公开的纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群、干细胞上清液或组合物。所述医学病况与损伤或患病的组织或器官或者以其它方式受疾病或病原体损害的组织或器官有关。在一些实施例中，所述医学病况是任何损伤或患病的组织或器官。

在一些实施例中，PSC或iPS可以经过诱导以分化成为成纤维细胞或祖细胞，并且上清液可以促进成纤维细胞或祖细胞的形成，从而治疗、预防或改善受检者（例如哺乳动物）的瘢痕病况，例如纤维化。或者，PSC或iPS可以排出化学物质，并且上清液包括化学物质，从而治疗、预防或改善受检者（例如哺乳动物）的瘢痕病况，例如纤维化。

在一些实施例中，PSC或iPS可以经过诱导以分化成肌细胞、脂肪细胞、腱细胞或者结缔组织细胞或祖细胞，并且上清液可以促进肌细胞、脂肪细胞、腱细胞或者结缔组织细胞或祖细胞的形成，从而治疗、预防或改善哺乳动物体内有关肌肉、脂肪、腱、结缔组织等的病况。这些组合物在这一方面中的特殊应用包括例如乳房组织再生、腱或结缔组织再生等。

在一些实施例中，PSC或iPS可以排出抗肿瘤化学物质或因子，并且上清液包含抗肿瘤化学物质或因子，从而治疗、预防或改善哺乳动物的肿瘤病况（例如癌症）。

在一些实施例中，PSC或iPS可以经过诱导以分化成血液细胞或祖细胞，并且上清液可以促进血液细胞或祖细胞的形成，从而治疗、预防或改善哺乳动物的血液病况。

在一些实施例中，PSC或iPS和上清液可以与软骨诱导剂（chondroinductiveagent）一起使用。软骨诱导剂以治疗有效量引起PSC或iPS分化成软骨细胞或祖细胞谱系，从而产生软骨。或者，软骨诱导剂可以是一种化学或生物试剂，以治疗有效量增进PSC或iPS的存活性或植入，其中PSC或iPS提供营养因子以刺激软骨产生，从而治疗、延缓或改善软骨病况。

PSC可以是人PSC或动物PSC，并且可以是自体PSC、同种异体移植物PSC或异种移植物PSC。iPS可以是人iPS或动物iPS，并且可以是自体iPS、同种异体移植物iPS或异种移植物iPS。PSC或iPS的密度可以为每毫升（每1毫升体积组合物）约1×10⁴到约1×10⁸个。在一些实施例中，接种密度可以为每毫升约1×10⁴到约1×10⁶个、约1×10⁴到约1×10⁵个、约1×10⁵到约1×10⁷个、约1×10⁵到约1×10⁶个、约1×10⁶到约1×10⁷个或约1×10⁷到约1×10⁸个。接种密度的实例可以是例如每毫升0.5×10⁴、1×10⁴、0.5×10⁵、1×10⁵、0.5×10⁶、1×10⁶、0.5×10⁷、1×10⁷或1×10⁸个。

在一些实施例中，术语PSC可以是周细胞或外膜细胞。

所述组合物可以配制成不同的制剂。在一些实施例中，所述组合物可以是台架。台架可以包括一种或一种以上赋形剂。在一些实施例中，台架可以包括多个孔，这些孔可以装载PSC或iPS。在一些实施例中，可以将例如NELL-1蛋白等试剂包埋在台架的主体中，并且将PSC或iPS接种于台架中的各个孔中。在一些实施例中，所述组合物可以是生物可降解或生物稳定性的。

在本发明另一方面中，提供一种植入式装置。所述植入式装置包含以上各种实施例的组合物。

如本文所用，术语“组织”和“器官”如以下所述：

在任何上述组合物中，将由干细胞形成的组织可以是上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织，这些组织通常是由三个初级胚层发育而成：中胚层、外胚层和内胚层。中胚层—发育成上皮组织、结缔组织和肌肉组织。外胚层—发育成神经组织和上皮组织。内胚层—发育成上皮组织。

上皮组织是由细胞排列成具有一个或一个以上层的连续薄片而构成，具有顶表面和基底表面。基底膜是细胞的基底表面与下伏的结缔组织之间的连接。存在两种上皮组织类型：(1)被覆上皮与衬里上皮，和(2)腺上皮。细胞层的数量与顶层中细胞的形状可以对上皮进行分类：(1)单层上皮—一个细胞层；(2)复层上皮—两个或两个以上细胞层；(3)假复层柱状上皮—上皮组织的细胞都锚定于基底膜但并非所有细胞都到达顶部表面的情形；以及(4)腺上皮—(i)内分泌：将激素直接释放到血流中，和(ii)外分泌—分泌到导管中。

结缔组织含有许多不同的细胞类型，包括：成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞和脂肪细胞。结缔组织基质是由两种材料构成：基质物质（groundsubstance）—蛋白质和多糖；纤维—网状纤维、胶原纤维和弹性纤维。结缔组织可以进一步分类为：(1)疏松结缔组织—在明胶基质中含纤维和许多细胞类型，见于皮肤以及周围血管、神经和器官中；(2)致密结缔组织—平行的胶原蛋白纤维与成纤维细胞束，见于腱和韧带中；以及(3)软骨—软骨是由包埋在基质糖蛋白中的胶原纤维和弹性纤维以及称为腱细胞的细胞构成，见于小间隙中。此外，软骨具有三种亚型：(1)透明软骨—最脆弱、含量最丰富的类型，见于长骨的末端以及如耳和鼻等结构处；(2)弹力软骨—维持形状，分支弹性纤维使其与透明软骨相区分；和(3)纤维软骨—最强健的类型，具有致密的胶原蛋白和极少基质，见于骨盆、颅骨和椎间盘中。

肌肉组织分为3个种类：(1)骨骼肌—随意肌，有条纹，条纹垂直于肌肉纤维，并且主要见于附着于骨；(2)心肌—非随意肌，有条纹、分支且具有间盘；和(3)平滑肌—非随意肌，无条纹，呈梭状并且见于血管和胃肠道中。

神经组织由中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）中的两种细胞类型组成：(1)神经元—将刺激转化成电脉冲传送到脑部的细胞，和(2)神经胶—支持细胞。神经元是由细胞体、轴突和树突构成，具有三种亚型：(1)运动神经元—将来自CNS的脉冲运载到肌肉和腺体；(2)中间神经元—解读来自感觉神经元的输入并将最终反应传送到运动神经元；和(3)感觉神经元—接收来自环境的信息并传送到CNS。同时，神经胶是由CNS中的星形细胞、少突神经胶质细胞、室管膜细胞和小胶质细胞以及PNS中的雪旺细胞（Schwanncell）和卫星细胞构成。

在4个主要组织类型后，器官是接下来的体内组织水平。器官是一种含有至少两种不同类型组织的结构，这些不同类型的组织一起作用以达到共同的目的。器官系统包含两种或两种以上不同的器官，这些器官一起作用以提供共同功能。体内有10个主要的器官系统：骨骼系统（例如，骨、软骨、腱和韧带）、肌肉系统（例如骨骼肌和平滑肌）、循环系统（例如心脏、血管和血液）、神经系统（例如脑、脊髓和周围神经）、呼吸系统（例如鼻、气管和肺）、消化系统（例如口、食管、胃、小肠和大肠）、排泄系统（例如肾、输尿管、膀胱和尿道）、内分泌系统（例如，下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺和肾上腺）、生殖系统（例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、储精囊和阴茎）以及淋巴/免疫系统（例如，淋巴结和淋巴管、淋巴、白细胞、T细胞和B细胞）。其它组织/器官/复杂结构包括（但不限于）皮肤、肝、基质、半月板、牙周组织、视网膜、角膜、眼、面部器官、肢体或其它身体部分。

如本文所用，术语组织或器官应意指哺乳动物受检者体内的任何组织或器官。所述组织或器官可以是例如任何面部器官（例如，鼻、面部皮肤、唇、视网膜或耳）、肢体、动脉、静脉、脂肪，或任何内部器官，例如口腔组织或器官（牙齿组织、牙周组织、舌、牙齿）、脑、心脏器官或组织（例如，心脏、心瓣膜、动脉和静脉）、肺组织或器官（例如，肺或气管，或支气管）、胃肠组织或器官、乳房、胰腺、肝、泌尿道、脊髓、骨髓、肾、半月板、膀胱或皮肤。在一些其它实施例中，所述组织可以是骨、软骨、肌肉、髓、腱或韧带，或者结缔组织。

如本文所用，术语“营养因子”是指由干细胞分泌的任何养分或因子。所述营养因子可以是例如免疫调节因子，例如TNF-α、IL-12、IL-10、IL-4、IgGCXCR4、IgMCXCR5、IgACR7、IFN-γ、HGF、TGF-β1、防止或减少瘢痕形成的因子、促进血管生成的因子、细胞保护或抗细胞凋亡因子、有丝分裂因子、促进组织再生的因子或例如透明质酸等细胞基质材料。

如本文所用，术语“治疗有效量”意指使PSC分化成软骨细胞或祖细胞以实现软骨再生，或增进PSC或iPS的存活性或植入（其中PSC或iPS提供营养因子以刺激软骨产生，从而治疗、延缓或改善软骨病况）所需的软骨诱导剂（例如NELL-1因子）的剂量。

如本文所用，术语“诱导剂”是指促进分化成或形成所需细胞或组织的局部或全身用物质或条件。所述物质的实例可以是细胞或组织、小分子、生物模拟物或动态台架（例如，施加机械力，http://www.ibridgenetwork.org/ucm/dynamic-scaffolds-to-promote-cell- differentiation）的全身或局部产物，或者促进生长/分化的条件（例如口服维生素D或L-谷氨酰胺补充，http://www.springerlink.com/content/a34m95177w5vn8tl/）或其组合（例如，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19831634），这些在本领域中得到充分证明。举例来说，血管生成诱导剂包括生长因子（ECGF1、FGF1、FGF13、FGF2、FGFBP1、FIGF、GRN、GRP、HGF、KITLG、LEP、MDK、PDGFB、PDGFD、PGF、PROK1、TGFA、VEGFA）、细胞因子和趋化因子（BMP2、CCL15、CCL2、CSF3、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IL10、IL6、IL8、PPBP、PTN、TNF）（参看例如http://www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/HTML/PAHS-024A.html），以及其它血管生成正调控因子（AGGF1、AMOT、ANG、ANGPT1、BTG1、EDIL3、EREG、FST、RHOB、RUNX1）。另外，血管生成抑制剂包括细胞因子、趋化因子和生长因子（CXCL10、CXCL2、IFNG、IL12A、IL12B、IL17F、PF4、TGFB1）和其它血管生成负调控因子（ANGPT2、ANGPTL1、BAH、CD55、CD59、CHGA、COL18A1、COL4A3、FNl、IFNA1、IFNB1、KLK3、MLLT7、NPPB、NPR1、PLG、PRL、RNH1、SERPINC1、SERPINE1、SERPINF1、SPINK5、STAB1、THBS1、TIE1、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TNNI2、TNNI3）。

软骨生成诱导剂的实例包括分泌蛋白的TGF-β超家族，例如转化生长因子-β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）（例如，GDF5、GDF6、GDF7、BMP2、BMP4和BMP7）、甲状旁腺激素相关蛋白、刺猬家族蛋白（Hedgehogfamilyprotein）、脂质修饰的Wnt糖蛋白的哺乳动物家族、成纤维细胞生长因子家族以及血管内皮生长因子（VEGF）（参看例如，康尼伯格（Kronenberg）等人,CSH专论（CSHMonographs）,第53卷(2009):骨骼系统（TheSkeletalSystem））。骨诱导剂的实例包括BMP、TGF-β、成纤维细胞生长因子（FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、VEGF、血管生成素、血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子、甲状旁腺激素（相关蛋白）（PTH/PTHrP）和白细胞介素（IL），以及富血小板血浆（PRP）分离物（参看例如，科姆潘（Kempen）等人,组织工程：第B部分（TissueEngineering:PartB）,2010,16(6):551-566；诺斯（Nauth）等人,创伤骨科杂志（JOrthopTrauma）,2010;24:543-546）。

如本文所用，术语“软骨诱导剂”是指有效促进软骨形成或增进PSC或iPS的存活性或植入，其中PSC或iPS提供营养因子以刺激软骨产生，从而治疗、延缓或改善软骨病况的化学或生物试剂。软骨诱导剂的一个实例是NELL-1蛋白。如本文所用，术语生物试剂是指有关DNA或氨基酸的任何物质，并且可以是例如细胞、细胞因子、基因疗法、质粒，或者蛋白质或肽等。

如本文所用，术语“NELL-1蛋白”、“NELL-1肽”与“NELL-1因子”有时可互换使用。

如本文所用，术语“医学病况”、“疾病”与“病症”可互换使用。

如本文所用，术语“运动损伤（sportinjury）”与“运动损伤（sportsinjury）”可互换使用并且是指软组织或器官或者骨骼组织或器官的损伤或病况，例如神经组织、肌肉组织、骨或软骨损伤。在一些实施例中，这些损伤或病况可以是肌肉、腱、旋转肌群（rotatorcuff）的损伤或病况，或者运动医学的任何事件，例如http://www.childrensmemorial.org/depts/sportsmedicine/healthtopics.aspx和http://www. reportsnreports.com/reports/25322-us-market-for-orthopedic-soft-tissue-and-sports-medicine -2010.html中描述的这些事件。

基于细胞的疗法

已经充分证明，基于细胞的疗法能通过细胞再生有效治疗或改善病症（参看例如，阿诺德I.卡普兰（ArnoldI.Caplan）,人类疾病的治疗：使用成人间充质干细胞的基于细胞的疗法（TreatmentofHumanDiseases:Cell-basedTherapiesusingAdultMesenchymalStemCells）",新泽西生物材料与再生医学专题论集（NJSympBiomat&Regen.Med.）,2008年10月8日）。以上公开的各种实施例的PSC、iPS或上清液可以用于治疗或改善任何所述病症。

可以用本文中公开的各种实施例的PSC、iPS、组合物或上清液治疗或改善的医学病况可以是有关损伤或患病器官或组织的任何病况。这些器官或组织如上文所述。

在一些实施例中，医学病况是中枢神经系统（CNS）疾病。所述CNS疾病可以涉及脊髓或脑，并且可以由外伤、感染、退化、结构缺损、肿瘤或自体免疫障碍引起。所述CNS疾病的实例包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、脑炎、脑膜炎、热带痉挛性轻截瘫、蛛网膜囊肿、亨廷顿氏病（Huntington'sdisease）、闭锁综合症、图雷特氏病（Tourette'sdisease）和多发性硬化。

在一些实施例中，医学病况与组织中瘢痕形成有关。所述医学病况可以是例如皮肤瘢痕或纤维化。

在一些实施例中，医学病况与哺乳动物体内的肌肉、脂肪、腱、结缔组织等有关。这些组合物在这一方面中的特殊应用包括例如乳房组织再生、腱或结缔组织再生等。

在一些实施例中，医学病况与哺乳动物体内的肿瘤病况（例如癌症）有关。

在一些实施例中，医学病况与哺乳动物体内的血液病况（例如白血病）有关。

在一些实施例中，医学病况与软骨损伤、缺损或疾病有关。

在一些实施例中，医学病况可以是骨相关病况，例如骨损伤。在一些实施例中，骨相关病况可以是与骨再生、肌肉骨骼损伤、骨修复或骨质疏松症有关的任何病况。骨修复可以通过对需要治疗的受检者提供成骨干细胞、骨诱导表面和/或骨诱导生长因子来实现。举例来说，以上或以下描述的本发明的实施例可用于(1)腰椎融合术，如（例如）自体骨移植物代替单次应用腰椎融合术；或(2)胫骨骨折修复以治疗已经用髓内钉固定来稳定的急性、开放性胫骨干骨折。

在一些实施例中，医学病况可以是心脏病。所述心脏病可以是例如心脏缺血。

在一些实施例中，医学病况可以是肾病。所述肾病可以是例如肾缺血。

在一些实施例中，医学病况可以是脑部病况。所述脑部病况可以是例如中风或脑缺血。

在一些实施例中，医学病况可以是脊柱病况。所述脊柱病况可以是例如脊髓损伤。

在一些实施例中，医学病况可以是运动损伤病况。所述运动损伤病况可以是例如半月板撕裂。

其它示范性医学病况包括例如哮喘或其它呼吸道疾病、I型糖尿病，以及国际疾病分类（ICD）和当代操作术语集（CPT）版本中所列的病况。

在一些实施例中，基于细胞的疗法是软骨再生。软骨再生可以使用间充质干细胞（MSC）技术实现。使用间充质干细胞的各种软骨再生方法已有所报导（参看例如，厄马苏K.（Uematsu,K.）,生物材料（Biomaterials）.26(20):4273-9(2005)）并且评述于陈（Chen）等人,自然风湿病学临床应用（NATURECLINICALPRACTICERHEUMATOLOGY）2(7)::373-382(2006)；盖勒J.（Galle,J.）等人,当今医药化学（CurrentMedicinalChemistry）,第17卷,11月21日,2010年7月,第2274-2291页(18)）中。据报导，PSC是MSC的血管周祖先（参看例如，克里斯安（Crisan）等人,细胞—干细胞（CellStemCell）3:301-33(2008)；科斯利（Corselli）等人,动脉粥样硬化、血栓与血管生物学（ArteriosclerThrombVaseBiol）30:1104-1109(2010)）。

使用PSC而非MSC进行软骨再生的益处是多方面的。大多数的细胞扩增或培养程序是基于使用胎牛血清（FBS），它有发生异体免疫（xenoimmunization）[例如非人类免疫原性唾液酸（Neu5Gc）]以及传播已知（例如传播牛海绵状脑病的朊病毒）和未知病原体的风险。另外，不管培养基如何，离体培养增加了微生物或颗粒污染的风险以及遗传不稳定性（达锡尔J.A.（Dahl,J.A.）等人,在自体血清或胎牛血清中扩增的人骨髓间充质干细胞的遗传和表观遗传不稳定性（Geneticandepigeneticinstabilityofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsexpandedinautologousserumorfetalbovineserum）.国际发育生物学杂志（IntJDevBiol）52,1033-42(2008)）。从安全性的观点看，使用新鲜采集和分选的PSC优于培养的MSC（例如ASC），因为它降低了致免疫、感染和致肿瘤的风险。

PSC的使用优于MSC的其它益处在于：1]自然组织定位、表型和发育潜能的精确表征（MSC追溯性地来源于原代、异源细胞培养物）和2]改良的营养效力（已经确定，PSC的肝素结合表皮生长因子分泌量是经典来源的脂肪组织和脐血MSC的10到20倍并且碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的分泌量是经典来源的脂肪组织和脐血MSC的3到7倍（陈C.W.（Chen,C.W）.等人,细胞因子和生长因子评述（CytokinesandGrowthFactorsReviews）,20(5):429-434(2009)））。因此，从FDA管理观点看，使用PSC将有助于产物身份、纯度、无菌性、安全性和效力的论证。

在一些实施例中，基于细胞的疗法提供一种针对运动损伤或病况的疗法。所述损伤或病况可以是软组织或器官或者骨骼组织或器官的损伤或病况，例如神经组织、肌肉组织、骨或软骨损伤。在一些实施例中，这些损伤或病况可以是肌肉、腱、旋转肌群的损伤或病况，或者运动医学的任何事件，例如http://www.childrensmemorial.org/depts/sportsmedicine/healthtopics.aspx和http://www. reportsnreports.com/reports/25322-us-market-for-orthopedic-soft-tissue-and-sports-medicine -2010.html中描述的这些事件。在一些实施例中，所述基于细胞的疗法是前/后十字韧带（ACL/PCL）重建、ACL/PCL固定、软骨修复、半月板软骨修复、旋转肌群修复、肩盂唇修复、旋转肌群移植物增强，或者神经导管修复或再生。

PSC和iPS

如本文所用，术语血管周干细胞（PSC）应涵盖周细胞和外膜细胞。

PSC的分离已得到充分证明。举例来说，在美国申请案第11/746979号中，周细胞是由皮奥特（Peault）和哈沃德（Huard）从各种组织分离。从各种组织分离外膜细胞已得到充分证明（数据未显示）。

已经从基本上所有测试的组织分离出PSC，包括骨骼肌、胰腺、胎盘、脂肪、脑、心脏、皮肤、肺、眼、内脏、骨髓、脐带或牙齿。在一些实施例中，可以通过荧光活化细胞分选术（FACS）从脂肪组织的基质血管部分中纯化出数量足以实现临床功效的自体PSC，无需离体扩增。以下描述从人骨骼肌组织分离周细胞PSC的实例：

周细胞的分离.简单点说，从脂肪和大血管结构分离骨骼肌，随后切成小片。然后在含有DMEM（高糖；吉博公司（Gibco））、20%FBS（吉博公司）、1%青霉素-链霉素（PS）（吉博公司）并且补充有I型、II型和IV型胶原蛋白酶各0.5mg/ml的培养基中培育肌肉（例如，在37℃下45分钟）。过滤所得到的细胞悬浮液以去除所有碎片。冲洗后，根据针对CD146、NG2（在血管形态发生期间与周细胞有关的蛋白聚糖）和PDGF-R13的正表达以及造血（CD45）、内皮（CD34）和生肌（CD56）细胞标记物的不存在对细胞进行FACS分选。利用FACS，经由碘化丙啶染色来排除死亡的细胞。接种分选的周细胞（例如，接种2×10⁴个细胞/平方厘米于内皮细胞生长培养基2（EGM-2，坎贝斯生物科技公司（CambrexBioscience））中）并培养（例如，在涂有0.2%明胶（卡尔生物化学公司（Calbiochem））的板中37℃下保持2周）。一周一次对周细胞进行胰蛋白酶化并培养（例如，以1:3稀释（从第1代到第5代）随后1:10稀释（第5代以后））。除第1代外，所有周细胞都培养在未涂覆的烧瓶中（例如，在DMEM/FBS/PS增殖培养基中），以维持其初始表型。第9代与第11代之间的周细胞用于所有测试。

外膜PSC的分离是由实例1中所述的程序例示说明。

iPS的形成已得到充分证明（参看例如，冲田K（Okita,K）等人,自然（Nature）448(7151):313-7(2007)；马赫拉力N（MaheraliN）等人,细胞—干细胞,1:55-70(2007)；和韦尼格M（Wernig,M）等人;自然,448(7151):318-24(2007)）。形成和分选iPS的示范性分步程序详细描述于帕克（Park）等人,自然—实验手册（NatureProtocols）,2008,3(7):1180-1186中，其教导内容以全文引用的方式并入本文中。

NELL-1因子

如本文所用，“NELL-1因子”包括任何哺乳动物来源（例如人类、鼠类、大鼠等）的野生型（即，天然存在的）Nell1蛋白。用于本发明中的示范性NELL-1因子包括人类NELL-1蛋白（SEQIDNO:1）、鼠类NELL-1蛋白（SEQIDNO:2）和大鼠NELL-1蛋白（SEQIDNO:3）。

如本文所用，“NELL-1因子”还包括野生型NELL-1蛋白的功能性衍生物。“功能性衍生物”是指经过修饰的NELL-1蛋白，这种蛋白质与野生型NELL-1蛋白相比具有一个或一个以上氨基酸取代、缺失或插入，并且实质上保留了野生型NELL-1蛋白的活性。“实质上”意指至少50%、至少75%或甚至至少85%的野生型NELL-1蛋白的活性。根据本发明，为了使功能性衍生物实质上保留野生型NELL-1蛋白的活性或功能，所述功能性NELL-1衍生物与野生型NELL-1蛋白共有至少75%、至少85%、至少95%或甚至99%的序列一致性。

NELL-1蛋白的结构已得到表征（参看例如，库洛达（Kuroda）等人,1999a；库洛达等人,1999b,德赛（Desai）等人,2006）。举例来说，鼠类NELL-1蛋白（SEQIDNO:4）是具有810个氨基酸的蛋白质，具有分泌信号肽（氨基酸1到16）、N末端类TSP模块（氨基酸29到213）、层粘蛋白G区（氨基酸86到210）、范威氏因子C结构域（氨基酸273到331和699到749）以及Ca²⁺结合类EGF结构域（氨基酸549到586）。

NELL-1蛋白的分泌信号肽结构域是所述蛋白质中通常参与将蛋白质运输到细胞器中的氨基酸序列，在所述细胞器中，所述蛋白质被加工以分泌到细胞外部。N末端类TSP模块一般与肝素结合有关，范威氏因子C结构域一般涉及NELL-1的寡聚合。NELL-1蛋白的层粘蛋白G结构域一般涉及NELL-1蛋白粘附到特定细胞类型或其它细胞外基质蛋白。这些结构域与其搭配物的相互作用一般与例如分化、粘附、细胞信号传导或调节特定细胞-细胞相互作用以促进细胞增殖和分化等过程有关。NELL-1的Ca²⁺结合类EGF结构域结合蛋白激酶Cβ，它通常涉及生长和分化中的细胞信号传导路径。

NELL-1蛋白的氨基酸序列高度保守，尤其是在哺乳动物物种中。举例来说，鼠类NELL-1蛋白与人类NELL-1蛋白（SEQIDNO:1）共有约93%序列一致性，而人类NELL-1蛋白又与大鼠NELL-1蛋白（SEQIDNO:2）共有约90%序列一致性。本领域技术人员可以使用任何众所周知的分子克隆技术，同时考虑NELL-1的功能性结构域（例如，分泌信号肽序列、N末端类TSP模块、层粘蛋白G区、范威氏因子C结构域）来产生具有一个或一个以上氨基酸取代、缺失或插入的NELL-1衍生物。参看例如，当代分子克隆实验手册（CurrentProtocolsinMolecularCloning）（奥苏贝尔（Ausubel）等人,约翰威立公司（JohnWiley&Sons）,纽约（NewYork））。

NELL-1功能性衍生物的最小长度通常为至少约10个氨基酸残基长，更通常为至少约20个氨基酸残基长，甚至为至少约30个氨基酸残基长，并且更通常为至少约40个氨基酸残基长。如上文所陈述，野生型NELL-1蛋白为大致约810个氨基酸残基长。NELL-1功能性衍生物可以为至多约810个氨基酸残基长。举例来说，NELL-1功能性衍生物可以至多约820、805、800、790、780、750、600、650、600、550个等氨基酸残基长。

一旦制得NELL-1蛋白衍生物，就可以对这种蛋白质进行测试，以确定这种衍生物是否实质上保留了野生型NELL-1蛋白的活性或功能。举例来说，可以测试NELL-1衍生物结合PKCβ的能力。用于评估NELL-1与PKCβ的结合的适合分析描述于例如库洛达等人(1999b)中。举例来说，可以通过使用酵母双杂交系统来分析蛋白质-蛋白质相互作用。简单点说，可以将经过修饰的NELL-1蛋白与GAL4活化结构域融合，并且可以将PKC的调控结构域与GAL4DNA结合结构域融合。可以检测酵母细胞中β-半乳糖苷酶的活性。

此外，还可以测试NELL-1衍生物刺激软骨细胞谱系中的前体细胞向成熟软骨细胞分化的能力。可以从细胞方面（组织学）和分子方面（心脏特异性蛋白质或细胞外基质材料的表达）评估软骨细胞的成熟度。另外，作为一项替代性分析，可以通过检测后期分子骨标记物的表达或矿化作用（即，钙沉积物）来测试NELL-1衍生物驱使成骨细胞前体成为成熟骨细胞的能力。通过在一个或一个以上分析（例如上文所述的分析）中比较NELL-1衍生物的活性与野生型NELL-1蛋白的活性，应该能够确定这种衍生物是否实质上保留了野生型NELL-1蛋白的活性或功能。

NELL-1蛋白或其功能性衍生物可以由本领域中众所周知的方法制备。一种此类方法包括分离或合成编码NELL-1蛋白的DNA，并通过任选地在重组载体中、适合宿主细胞（包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞）中表达所述DNA来产生重组蛋白。所述适用于合成DNA的方法例如卡瑟斯（Caruthers）等人,1985.科学（Science）230:281-285以及DNA结构，A部分：DNA的合成和物理分析（DNAStructure,PartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNA）,李雷D.M.J.（Lilley,D.M.J.）和达哈伯格J.E.）（Dahlberg,J.E.）(编),酶学方法（MethodsEnzymoL）,211,学术出版有限公司（AcademicPress,Inc.）,纽约(1992)所述。

术语“治疗有效量”意指使PSC分化成软骨细胞或祖细胞以实现软骨再生，从而治疗、延缓或改善软骨病况所需的剂量。精确剂量取决于软骨细胞类型、所治疗的疾病状态或病况，以及其它临床因素，例如受检者的体重和状况、受检者对疗法的反应、制剂类型和投药途径。作为一个一般原则，供投予成年人的NELL-1组合物（即，包括NELL-1蛋白或核酸）的适合剂量在每公斤体重约0.001mg到约20mg范围内。在一些实施例中，供投予成年人的NELL-1组合物的适合剂量是在每公斤体重约0.01mg到约5mg范围内。然而，治疗有效并且无害的精确剂量可以由本领域技术人员决定。

NELL-1蛋白和所述蛋白质的制备方法已经描述于美国申请案第10/544,553号、第11/392,294号、第11/713,366号和第11/594,510号以及美国专利第7,052,856号中。这些申请案和专利的教导内容以引用的方式并入本文中。

制剂和载剂

本文公开的组合物可以配制成不同的制剂。所述组合物可以包括获得所需制剂的材料和载剂。举例来说，组合物可以包括可注射或可模制材料，这种材料可以在预定的放置时间段内设置。所述预定时间段可以为例如10分钟、30分钟、1小时、2小时等。

在一些实施例中，所述组合物可以包括化学凝胶，这种凝胶包括因pH、离子环境和溶剂浓度改变而形成的主键。这些化学凝胶的实例可以为（但不限于）多糖，例如壳聚糖、壳聚糖加离子盐（例如β-甘油磷酸盐、海藻酸盐加Ba²⁺、Sr²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）、胶原蛋白、纤维蛋白、血浆或其组合。

在一些实施例中，组合物可以包括物理凝胶，这种凝胶包括因温度改变而形成的副键。这些物理凝胶的实例可以为（但不限于）海藻酸盐、聚(乙二醇)-聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚(乙二醇)（PEG-PLGA-PEG）三嵌段共聚物、琼脂糖和纤维素。在一些实施例中，可以用于本文所述的组合物中的物理凝胶可以包括在高剪切下呈液态而在低剪切下胶凝成固态的物理凝胶。这些物理凝胶的实例包括（但不限于）透明质酸或聚氧化乙烯。物理凝胶可以使预先形成的材料具有预定的尺寸和形状。

在一些实施例中，本文所述的组合物可以包括对刺激起反应而降解或释放活性剂的材料。所述刺激的一些实例是机械刺激、光、温度改变、pH改变、离子强度改变或电磁场。所述材料是本领域中已知的。这些材料的一些实例为壳聚糖、海藻酸盐、普朗尼克（pluronics）、甲基纤维素、透明质酸和聚氧化乙烯。其它实例描述于布兰德F（BrandlF）,索莫F（SommerF）,乔普费奇A（GoepferichA）.“用于组织工程的水凝胶的合理设计：物理因素对细胞行为的影响（Rationaldesignofhydrogelsfortissueengineering:Impactofphysicalfactorsoncellbehavior）”,生物材料（Biomaterials）.电子版2006年9月29日中。

在一些实施例中，本文所述的组合物（包括上文所述的任何凝胶）可以另外包括交联剂，以进一步定制降解动力学和受控释放。或者，在一些实施例中，本文所述的组合物可以包括互穿相复合材料或互穿网络（interpenetratingnetwork，IPN），包括上述任何凝胶。交联剂的一些实例包括（但不限于）常用交联剂（聚氧化烯、二甲基丙烯酸亚乙酯、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、亚甲基双(4-苯基异氰酸酯)、二甲基丙烯酸亚乙酯、二乙烯苯、甲基丙烯酸烯丙酯、羰基二咪唑、磺酰氯、氯代碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺酯、环氧化物、芳基卤化物、磺基琥珀酰亚胺酯和顺丁烯二酰亚胺）；基于PEG的交联剂（例如，MAL-dPEGx-NHS-酯、MAL-dPEGx酸、双-MAL-dPEGx等）以及光/光照活化的交联剂、基于N-羟基琥珀酰亚胺的交联剂、二赖氨酸、三赖氨酸和四赖氨酸。

本文所述的组合物可以包括载剂。载剂可以是聚合物载剂或非聚合物载剂。在一些实施例中，载剂可以是生物可降解的，例如可通过酶促或水解机制降解。载剂的实例包括（但不限于）合成可吸收聚合物，例如（但不限于）聚(α-羟基酸)，例如聚(L-丙交酯)（PLLA）、聚(D,L-丙交酯)（PDLLA）、聚乙交酯（PGA）、聚(丙交酯-共-乙交酯)（PLGA）、聚(-己内酯)、聚(碳酸三甲酯)、聚(对二氧杂环己酮)、聚(-己内酯-共-甘醇酸酯)、聚(乙交酯-共-碳酸三甲酯)聚(D,L-丙交酯-共-碳酸三甲酯)、聚芳基化物（polyarylate）、聚羟基丁酸酯（PHB）、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、丙烯-共-反丁烯二酸酯、聚内酯、聚酯、聚碳酸酯、聚阴离子型聚合物、聚酸酐、聚酯-酰胺、聚(氨基酸)、均聚多肽、聚(磷腈)、poly(glaxanone)、多糖和聚(原酸酯)、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚糖醛酸、聚丙烯酸、聚烷酸酯；其共聚物和混合物，以及任何衍生物和修饰。参看例如，美国专利4,563,489和PCT国际申请案第WO/03024316号，以引用的方式并入本文中。载剂的其它实例包括纤维素类聚合物，例如（但不限于）烷基纤维素、羟基烷基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和其阳离子盐。载剂的其它实例包括合成和天然生物陶瓷，例如（但不限于）碳酸钙、磷酸钙、磷灰石、生物活性玻璃材料和珊瑚源性磷灰石。参看例如，美国专利申请案2002187104；PCT国际申请案WO/9731661；和PCT国际申请案WO/0071083，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，载剂可以另外涂覆组合物，包括来源于溶胶-凝胶技术或来自浸渍技术的生物玻璃和或磷灰石，例如（但不限于）钙和磷酸盐浓度为天然血清浓度的约1.5倍到7倍并且通过各种手段调整成在约15到65摄氏度下pH范围为约2.8-7.8的溶液的模拟体液。参看例如，美国专利6,426,114和6,013,591；以及PCT国际申请案WO/9117965，以引用的方式并入本文中。

载剂的其它实例包括胶原蛋白（例如Collastat、Helistat胶原蛋白海绵）、透明质烷（hyaluronan）、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐和明胶。参看例如，PCT国际申请案WO/9505846；WO/02085422，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，载剂可以包括肝素结合剂；包括（但不限于）类肝素聚合物，例如硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸肝素、岩藻聚糖、海藻酸盐或其衍生物；以及具有增加肝素亲和力的氨基酸修饰的肽片段。参看例如，生物化学杂志（JournalofBiologicalChemistry）(2003),278(44),第43229-43235页，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，组合物可以呈液体、固体或凝胶形式。

在一个实施例中，基质可以包括呈可流动凝胶形式的载剂。所选凝胶可以为可注射的，例如可经由注射器注射到需要形成软骨的部位。凝胶可以是一种化学凝胶，这种化学凝胶可以是通过主键形成并受pH、离子团和/或溶剂浓度控制的化学凝胶。凝胶还可以是一种物理凝胶，这种物理凝胶可以通过副键形成并受温度和粘度控制。凝胶的实例包括（但不限于）普朗尼克、明胶、透明质烷、胶原蛋白、聚丙交酯-聚乙二醇溶液和偶联物、壳聚糖、壳聚糖与b-甘油磷酸（BST-凝胶）、海藻酸盐、琼脂糖、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚丙交酯/乙交酯于N-甲基-2-吡咯烷酮中。参看例如，解剖学记录（AnatomicalRecord）(2001),263(4),342-349，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，载剂可以是可光聚合的，例如通过用至少约250nm波长的电磁辐射聚合。可光聚合的聚合物的实例包括聚乙烯(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物、反丁烯二酸亚丙酯-共-乙二醇、聚乙烯醇衍生物、PEG-共-聚(-羟基酸)二丙烯酸酯大分子单体，以及改性多糖，例如透明质酸衍生物和葡聚糖甲基丙烯酸酯。参看例如，美国专利5,410,016，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，组合物可以包括温度敏感性载剂。实例包括由N-异丙基丙烯酰胺（NiPAM），或具有降低的下临界溶液温度（lowercriticalsolutiontemperature，LCST）并通过并入甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺增进肽（例如NELL-1）结合的改性的NiPAM；或甲基丙烯酸烷酯，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷酯制成的载剂（参看例如，WO/2001070288；美国专利5,124,151，二者以引用的方式并入本文中）。

在一个实施例中，其中载剂可以具有一个表面，此表面用可以经由受体介导的机制促进细胞-基质附着的细胞粘附分子、粘附肽和粘附肽类似物和/或可以经由非受体介导的机制促进粘附的分子部分修饰和/或固定，从而结合于例如（但不限于）聚阳离子型聚氨基酸肽（例如聚赖氨酸）、聚阴离子型聚氨基酸肽、Mefp类粘附分子和其它富含DOPA的肽（例如聚赖氨酸-DOPA）、多糖和蛋白聚糖。参看例如，WO/2004005421；WO/2003008376；WO/9734016，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，载剂可以包括各种天然存在的基质或其组分，例如失活的软骨基质、去矿物质的骨基质，或来源于同种异体移植物、异种移植物，或者来源于原核生物界、原生生物界、真菌界、植物界或动物界的任何其它天然存在材料的其它组分。

在一个实施例中，载剂可以包括一种或一种以上螯合剂，例如（但不限于）胶原蛋白、明胶、透明质酸、海藻酸盐、聚(乙二醇)、烷基纤维素（包括羟基烷基纤维素），包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基-甲基纤维素和羧甲基纤维素、血液、纤维蛋白、聚氧化乙烯、半水合硫酸钙、磷灰石、羧基乙烯基聚合物和聚(乙烯醇)。参看例如，美国专利6,620,406，以引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，载剂可以包括表面活性剂，以促进NELL-1肽在载剂材料内稳定和/或分布，例如（但不限于）聚氧酯（例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或普朗尼克F-68）。

在一个实施例中，载剂可以包括缓冲剂，例如（但不限于）甘氨酸、盐酸谷氨酸、氯化钠、胍、肝素、盐酸谷氨酸、乙酸、琥珀酸、聚山梨醇酯、硫酸葡聚糖、蔗糖和氨基酸。参看例如，美国专利5,385,887，以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，载剂可以包括例如上文所列材料等材料的组合。举例来说，载剂可以是PLGA/胶原蛋白载剂膜。所述膜可以浸泡在包括NELL-1肽的溶液中。

植入物可以包括成形为支架、网格、钉、螺钉、板或假关节形状的基质。植入物可以包括可再吸收的基质，例如包括胶原蛋白的基质。

所述组合物也可以包括用以形成药物组合物的可接受的载剂。可接受的载剂可以含有生理学上可接受的化合物，这种化合物用于例如使所述组合物稳定，或者增加或减少试剂的吸收。生理学上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，例如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；减少抗有丝分裂剂的清除或水解的组合物；或者赋形剂，或其它稳定剂和/或缓冲剂。

其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂（特别适用于防止微生物生长或作用）。各种防腐剂为众所周知的并且包括例如酚和抗坏血酸。本领域技术人员应理解，载剂（包括生理学上可接受的化合物）的选择取决于例如投药途径。

所述组合物可以根据投药方法以多种单位剂型投予。举例来说，适合的单位剂型可以包括粉剂，或者可注射或可模制的糊剂或悬浮液。

本发明的组合物可以包含药学上可接受的载剂，例如用于水溶性肽的水性载剂。可以使用多种载剂，例如缓冲生理盐水等。这些溶液是无菌的，并且一般不含不合需要的物质。这些组合物可以通过常规、众所周知的灭菌技术来灭菌。所述组合物可以视需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。

这些制剂中的NELL-1肽的浓度可以变化极大，并且主要基于流体体积、粘度、体重等，根据所选特定投药模式和患者的需求来选择。

所述组合物可以包括呈各种群体密度的PSC。PSC的密度可以为每毫升（每1毫升体积组合物）约1×10⁴到约1×10⁸个。在一些实施例中，接种密度可以为每毫升约1×10⁴到约1×10⁶个、约1×10⁴到约1×10⁵个、约1×10⁵到约1×10⁷个、约1×10⁵到约1×10⁶个、约1×10⁶到约1×10⁷个或约1×10⁷到约1×10⁸个。接种密度的实例可以是例如每毫升0.5×10⁴、1×10⁴、0.5×10⁵、1×10⁵、0.5×10⁶、1×10⁶、0.5×10⁷、1×10⁷或1×10⁸个。

所述制剂可以呈任何剂型。在一些实施例中，它为粉末制剂。在一些实施例中，它为液体制剂。在一些实施例中，它为半固体/半液体制剂，例如凝胶剂或糊剂。在一些实施例中，所述制剂是植入式装置，例如骨植入物。在一些实施例中，所述制剂是一种台架。

NELL-1的剂量方案可以由所涉及的临床指征以及各种患者变量（例如体重、年龄、性别）和临床表现（例如损伤程度、损伤部位等）决定。一般说来，NELL-1是呈足以使PSC分化成软骨（例如软骨细胞或血管细胞）或祖细胞从而实现软骨再生（例如心肌再生或心血管再生）的浓度。

NELL-1的剂量可以根据本领域中已知的方法，基于试剂类型、疾病以及例如年龄和性别等其它因素来确定。

在一个实施例中，NELL-1因子的剂量可以用每单位面积组合物或每单位重量组合物的量来描述。在利用或不利用特定载剂或台架的情况下，NELL-1的剂量范围一般为0.001pg/mm²到1pg/mm²，或更优选为0.001ng/mm²到1ng/mm²，或更优选为0.001μg/mm²到1μg/mm²，或更优选为0.001mg/mm²到1mg/mm²，或更优选为0.001g/mm²到1g/mm²。在另一实施例中，在利用或不利用特定载剂或台架的情况下，NELL-1的剂量范围一般为0.001pg/ml到1pg/ml，或更优选为0.001ng/ml到1ng/ml，或更优选为0.001μg/ml到1μg/ml，或更优选为0.001mg/ml到1mg/ml，或更优选为0.001g/ml到100g/ml。在另一实施例中，在利用或不利用特定载剂或台架的情况下，NELL-1的剂量范围一般为0.001pg/kg到1pg/kg，或更优选为0.001ng/kg到1ng/kg，或更优选为0.001μg/kg到1μg/kg，或更优选为0.001mg/kg到1mg/kg，或更优选为0.001gm/kg到1gm/kg，更优选为0.001kg/kg到1kg/kg。

在一些实施例中，NELL-1的剂量可以用每公斤体重的量来描述。举例来说，对于投予成年人，NELL-1的剂量范围可以为每公斤体重约0.1μg到约100mg。在一些实施例中，供投予成年人的NELL-1组合物的适合剂量是在每公斤体重约0.001mg到约20mg范围内。在一些实施例中，供投予成年人的NELL-1组合物的适合剂量是在每公斤体重约0.005mg到约10mg范围内。在一些实施例中，供投予成年人的NELL-1组合物的适合剂量是在每公斤体重约0.01mg到约5mg范围内。在一些实施例中，供投予成年人的NELL-1组合物的适合剂量是在每公斤体重约0.05mg到约1.0mg范围内。然而，治疗有效并且无害的精确剂量可以由本领域技术人员决定。

此外，应了解，所有剂量都可以是连续给予或分成按照指定时间段给予的剂量。时间段的实例包括（但不限于）每1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时或72小时，或者每周、2周、4周，或每个月、2个月、4个月等等。

装置

所述组合物可以配制成呈任何所需形式的可注射或植入式装置。一些示范性装置可以用于间盘髓核置换、膝半月板置换、腕部三角纤维软骨置换、颞下颌关节置换、关节软骨置换，并且可以由以下各物组成：具有预成形的形状和用以锚定下层骨的连接特征的多孔台架；可以通过手工操作再成形并通过施加光而固化成新形状的具有预成形的形状的粘性凝胶；或者可以原位聚合的低粘度液体。举例来说，所述组合物可以配制成单一混合物（singlemixture）（或简单混合物）以形成软骨。

在一些实施例中，组合物可以配制成含有经过特殊设计的组织特异性层的单一装置，例如可能需要具有用以锚定于硬组织的骨层，接着是紧邻骨层的软骨层。

在一些实施例中，组合物可以配制成允许多种组织形成和自组装的单一混合物，例如具有两亲官能团的聚合物或单体可以自组装成宏观结构。

在包括本文所述组合物的装置具有细胞的一些实施例中，所述装置可以经历预植入刺激。举例来说，所述装置可以放在具有受控制的机械性刺激（频率、占空比、振幅等）的机械生物反应器中；据报导，频率在0.01Hz到10,000Hz范围内，占空比高于10%；并且振幅在0.1-100%应变范围内具有增强的细胞功能。在一些实施例中，本文所述的装置可以放在具有受控制的微流体流量和剪切应力的机械生物反应器中，所述剪切应力是在至少一个流动路径或通道具有小于1mm的一个尺寸的时候产生。在一些实施例中，本文所述的装置可以在细胞采集后立即经由直接植入而植入人体中。

在一些实施例中，本文提供的组合物可以形成以下任何装置实例，这些实例将说明而不应解释为限制所主张的发明：

含有NELL-1蛋白的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射/植入椎间盘中以促进软骨形成；

浸透NELL-1因子的盘髓核置换装置，这种装置可以设计成置换椎间盘的内部部分（髓核）或者椎间盘的内部和外部部分；

含有NELL-1蛋白的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射到各种关节间隙（例如膝、颞下颌关节、腕）中，或者通过关节镜或开放式地植入各种关节间隙中；

含有NELL-1蛋白的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射/植入椎间盘中以促进软骨形成；

浸透NELL-1蛋白的盘髓核置换装置，这种装置被设计成置换椎间盘的内部部分（髓核）或者椎间盘的内部和外部部分；

含有NELL-1因子或蛋白质的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射到各种关节间隙（例如膝、颞下颌关节、腕）中，或者通过关节镜或开放式地植入各种关节间隙中；

含有NELL-1蛋白的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射/植入椎间盘中以促进软骨形成；

浸透NELL-1蛋白的盘髓核置换装置，这种装置可以设计成置换椎间盘的内部部分（髓核）或者椎间盘的内部和外部部分；

本发明的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射到各种关节间隙（例如膝、颞下颌关节、腕）中，或者通过关节镜或开放式地植入各种关节间隙中；

本发明的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射/植入椎间盘中以促进软骨形成；

浸透NELL-1蛋白的盘髓核置换装置，这种装置被设计成置换椎间盘的内部部分（髓核）或者椎间盘的内部和外部部分；

本发明的可注射/植入式装置，这种装置可以直接注射到各种关节间隙（例如膝、颞下颌关节、腕）中，或者通过关节镜或开放式地植入各种关节间隙中。

在一些实施例中，所述装置是ACL/PCL固定装置；或用于软骨修复、半月板软骨修复、旋转肌群修复、肩盂唇修复的装置；旋转肌群移植物增强装置；或者神经导管修复的装置。

在一些实施例中，所述装置是用本发明的PSC或iPS接种的缝线，或以其它方式包括本发明的PSC或iPS的缝线。在一些实施例中，所述缝线可以包含本发明的组合物。所述缝线可以是可再吸收的或不可再吸收的（参看例如，姚（Yao）等人,手外科学杂志（JHandSurg.）,2011,36A:252-258）。

细胞接种

所述制剂可以呈适于接种PSC或iPS群的任何合乎需要的形式。在制剂是台架或植入物的一些实施例中，制剂可以为多孔的，以便接种PSC或iPS。制剂中的孔可以具有能够容纳接种密度的PSC或iPS的体积。

PSC或IPS的接种可以通过充分确立的细胞接种程序实现（参看例如，安达勒（Undale）等人,梅奥诊所学报（MayoClinProc）,84(1):893-902(2009)；坎森达（Cancedda）等人,生物材料,28:4240-4250(2007)；和马卡西（Marcacci）等人,组织工程（TissueEngineering）,13(5):947-955)(2007)）并且可以根据组合物的剂型而变化。举例来说，对于液体制剂，接种可以通过将群体放到制剂中来容易地实现。接种多孔植入物或台架的实例描述于何伟（WeiHe）等人,基于周细胞的人组织工程化的血管移植物（Pericyte-BasedHumanTissueEngineeredVascularGrafts）,生物材料,31(32):8235-8244(2010)。

PSC或iPS的接种密度可以在每毫升（每1毫升体积组合物）约1×10⁴到约1×10⁸个间变动。在一些实施例中，接种密度可以为每毫升约1×10⁴到约1×10⁶个、约1×10⁴到约1×10⁵个、约1×10⁵到约1×10⁷个、约1×10⁵到约1×10⁶个、约1×10⁶到约1×10⁷个或约1×10⁷到约1×10⁸个。接种密度的实例可以是例如每毫升0.5×10⁴、1×10⁴、0.5×10⁵、1×10⁵、0.5×10⁶、1×10⁶、0.5×10⁷、1×10⁷或1×10⁸个。

以下描述在台架中接种PSC或iPS的实例：

接种PSC.将hPSC悬浮液经由索勒提（Soletti）等人,生物材料,27(28):4863-70(2006)所述的真空旋转接种装置接种到ES-TIPSPEUU台架中。简单点说，将台架连接到气密性腔室内部的两个共轴不锈钢三通。将所述腔室连接到室内真空（housevacuum）以维持恒定负压（-130mmHg），从而诱导细胞悬浮液跨台架的透壁流动。注射泵将细胞悬浮液（1×10⁶个细胞/毫升）以2.5mL/min输注到手动旋转的台架中，以在不到2分钟内达到每个台架3×10⁶个细胞，从而产生具有均匀分布的细胞的台架。经过接种的台架立即进行静置培养，保持3小时，这足以供细胞附着（参看例如，索勒提等人,生物材料,29(7):825-33(2008)）。随后将台架转移到含200mL培养基的旋转瓶中，以15rpm搅拌培养2天，之后，将其植入大鼠体内。

接种后立即在SEM下观察台架。在2天的动态培养后进一步评估经过接种的台架的组织学（H&E）、细胞分布（F-肌动蛋白和核染色）和附着（SEM）。对于F-肌动蛋白染色，对冷冻切片进行渗透（0.1%Triton），保持30分钟，阻断（2%BSA）30分钟，随后与偶联Alexa488的鬼笔环肽（phalloidin）（1:500，西格玛公司（Sigma））一起培育1小时。

实例

以下陈述的实例将说明本发明的实施例。所有参数和数据都不限制本发明实施例的范围。

一般方法

通过营养因子产量和成骨分化来评价体外功效；通过遗传稳定性评价体外安全性；通过成像、外科病理学、组织学、免疫组织化学和细胞跟踪研究来评价体内功效和安全性。

应注意，如实例中所用，术语“最佳化的”或“opt”用于指出在指定条件下获得一个或一个以上较佳结果的一个或一个以上实施例。这些术语决不应解释为本发明的优选实施例或最佳模式。

讨论

在本文所述的研究中，已经开发出一种基于成体血管周干细胞的PSC+NELL-1组合产品，这种产品超出了当前骨再生疗法的功效和安全性。这些研究显示，当与NELL-1组合时，脂肪来源的PSC是用于骨再生的更安全并且更有效的干细胞。

研究人员已经将两种截然不同的人血管周细胞群标记并纯化至均质：微血管周细胞（CD146+CD34-CD45-CD31-）和外膜细胞（CD146-CD34+CD45-CD31-）。这些细胞，无论是刚分离的还是经过长期培养的，都不能与常规MSC相区分，因此统称为术语血管周干细胞或PSC（克里斯安M.（Crisan,M.）等人,细胞—干细胞,3,301-13(2008)）。PSC在培养中以及在体内稳固地形成骨、主动地迁移、刺激血管生成并分泌各种各样的生长因子（克里斯安,2008；陈,2009）。研究人员已经证实，无需培养物扩增就可以从脂肪组织纯化出足量的PSC（数据未显示）。重要的是，研究人员已经确定，这一PSC纯化方案能够从目前所测试的所有人类组织中分离所有的专能干细胞群，不含内皮细胞。概括起来，PSC优于MSC的优势包括：1—无需培养（可以降低致免疫、感染和遗传不稳定性的风险（盖德S.C.（Gad,S.C.）制药手册：管理和质量（Pharmaceuticalmanufacturinghandbook:regulationsandquality）,p.(约翰威立公司,新泽西州霍博肯（Hoboken,N.J.）,2008)；达哈尔J.A.（Dahl,J.A.）等人,国际发育生物学杂志,52,1033-42(2008)））；2—自然组织定位、表型和发育潜能的精确表征（相反，MSC仅追溯性地来源于原代、异源细胞培养物）和3—改良的营养效力（已经确定，PSC的肝素结合表皮生长因子（heparinbindingepidermalgrowthfactor，HB-EGF）分泌量是经典来源的脂肪组织和脐血MSC的10到20倍并且碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，FGF）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的分泌量是经典来源的脂肪组织和脐血MSC的3到7倍（陈,2009））。因此，从FDA管理观点看，使用PSC可以有助于产物身份、纯度和效力的一致性论证。

NELL-1被用于在骨诱导环境中提供PSC或iPS以促进可预测的骨生长。NELL-1在各种小动物（参看例如，柯旺CM.（Cowan,CM.）等人,骨与矿物质研究杂志（JBoneMinerRes）22,918-30(2007)）以及绵羊（鲁S.（Lu,S.）等人,骨与矿物质研究杂志,22,S171(2007)）和非人类灵长类动物的椎体间融合模型中可再现地诱导骨再生。NELL-1的高骨特异性部分地来源于其直接受Runx2调控，而Runx2是成骨细胞分化的主导控制基因（特隆T.（Truong,T.）等人,骨与矿物质研究杂志,22,7-18(2007)）。NELL-1特异性地抑制脂肪生成和过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ，PPARγ）信号传导，同时促进骨髓MSC中β-钙结合蛋白依赖性Wnt信号传导（阿格鲁T.（Aghaloo,T.）等人,分子疗法（MolTher）15,1872-80(2007)），使得此生长因子适合于老年或骨质疏松的个体，其中骨髓干细胞的成脂分化导致骨损失的发病（参看例如，杜奎G.（Duque,G.）,风湿病学新见（CurrOpinRheumatol）20,429-34(2008)）。以下研究显示了对于促进骨生成来说，在培养中以及在体内NELL-1对纯化的PSC的有效作用。

骨诱导研究

1.有关hPSC安全性/功效与hSVF细胞安全性/功效的比较研究

这些研究显示，当与NELL-1组合时，脂肪来源的PSC是用于骨再生的更安全并且更有效的干细胞源。这些研究证实，就细胞活力、纯度、干细胞含量、营养因子产量、成骨分化、维持遗传稳定性（致肿瘤性）、命运/存活率、血管生成和骨生成来说，人类PSC至少与全组织基质（在这一情形中为脂肪组织SVF）和常规体外来源的MSC同样有效，并且可能优于全组织基质和常规体外来源的MSC。

方法和技术

1-将脂肪组织来源的PSC（即，通过FACS分选的混合但未在体外扩增的周细胞和外膜细胞）与以下各物相比较：2-未经过培养的总基质血管部分（SVF；即，总脂肪，较少脂肪细胞）、3-维持在培养中的与1相同的PSC群以及4-以常规方式从SVF的原代长期培养物获得的ASC（脂肪组织源性干细胞），全部都来自同一个人的抽脂样品。在第1、4、8和14代后，测试所有经过培养的细胞。为确保可再现性，用来自不同供体的数份抽脂样品执行类似研究，这些供体的年龄（年轻对年老）、性别、样品的解剖学位置和体重指数都受到控制。这些测试显示，NELL-1有利地影响PSC存活/增殖和分化（数据未显示），这一点得到了图10和11中的实例的进一步支持。

按照方案（克里斯安M.等人,干细胞生物学实验指南（CurrProtocStemCellBiol）第2章2B21-2B213单元(2008)）分离出脂肪抽吸物SVF和PSC。在SVF中以及在经过培养的ASC和PSC细胞群中定量周细胞（CD146+NG2+PDGF-RP+CD34-CD31-CD45-）和外膜细胞（CD146-NG2-PDGF-RP-CD34+CD31-CD45-）的相对百分含量。也测量在SVF和ASC细胞部分中内皮细胞（CD34+CD31+CD45-）的数量，因为这些细胞可以抑制PSC分化。从脂肪抽吸物回收的PSC和SVF部分的初始活力是用DAPI染色和流式细胞术分析测定。通过比较由PSC（预培养或未培养的）、SVF和ASC的FACS结果，以及内皮、造血和成纤维细胞谱系标记物的实时PCR（RT-PCR）分析来评估细胞纯度。与间充质干细胞含量的估算相同，低密度接种SVF和PSC以测试并定量其产生克隆成纤维细胞（CFU-F）和成骨细胞（CFU-OB）集落的能力。为评价MSC祖先随时间的维持性，如所述（皮特格M.F.（Pittenger,M.F.）等人,科学,284,143-7(1999)）对经过培养的PSC以及经过培养的SFC源性ASC执行CFU-F和CFU-OB分析。使用每孔数种蛋白质的多元夹层ELISA分析（这种分析允许进行定量测量），通过化学发光来测量经过培养的细胞的营养因子（HB-EGF、VEGF、FGF和PDGF-BB）产生情况（陈,2009）。在第一代就已存在显著可测量的量的这些生长因子（陈,2009），这为我们提供了由未经过培养的PSC和总SVF分泌的生长因子的近似值，如与长期培养的PSC和ASC相比较。对于成骨分化，在抗坏血酸和β-甘油磷酸存在下培养PSC（预培养或未培养的）、SVF和ASC。通过实时PCR（Runx2、Osterix、骨桥蛋白和骨钙素）（阿格鲁T.等人,美国病理学杂志（AmJPathol）169,903-15(2006)）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）表达和茜素红染色（柯旺CM.等人,骨与矿物质研究杂志22,918-30(2007)）定量地检测成骨细胞分化。

使用纯化的PSC而非总SVF部分作为治疗性成骨细胞源的另一原因是内皮细胞负调控例如ASC或BMSC等MSC的分化潜能（雷佳谢卡G.（Rajashekhar,G.）等人,干细胞（StemCells）26,2674-81(2008)；莫瑞T.（Meury,T.）等人,细胞生物化学杂志（JCellBiochem）98,992-1006(2006)）（以及我们未公开的结果）。为确定并证明这些结果，对与从相同脂肪组织样品分选的内皮细胞（E）结合培养（接触共培养）的纯化的PSC重复相同的成骨分化实验（图10）。

为分析致肿瘤潜能，首先在以各种密度接种于增殖培养基中的软质琼脂中后，分析细胞的锚定非依赖性生长。在接种后第2周和第3周对集落进行计数。同时，将来自不同群体的待分析细胞接种于一片Gelfoam上，并植入SCID小鼠后肢的骨骼肌袋中。通过身体触诊来监测动物的肿瘤形成，最终处死动物并分析肿瘤的存在（郑B.（Zheng,B.）等人,自然—生物技术（NatBiotechnol）25,1025-34(2007)）。另外，对固定的中期染色体分析在研究时所有细胞群的核型以检测可能发生的异常（托拉J.（Tolar,J）.等人,干细胞,25,371-9(2007)）。在植入SCID小鼠股部肌袋中后，评估细胞命运/存活率、血管生成和骨生成（图11，表2）。对细胞进行标记[使用慢病毒荧光素酶或绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）]，接种于无细胞同种异体移植骨的台架±300μgNELL-1上，并从两侧植入小鼠股二头肌中（总体积=100微升/侧）。除非另作规定，否则在此方案中的所有体内研究都利用在具有确定组成和孔隙度的200-300μmβ-磷酸三钙载体粒子（β-tricalciumphosphatecarrierparticle，β-TCP）冻干的NELL-1以获得增强的生物化学稳定性（当在室温下储存时保持生物活性长达3个月）和生物效率（李W.（Li,W.）等人,组织工程（TissueEng）,16(9):2861-2870(2010)）。测试从限定的脂肪抽吸物体积（1ml）或限定的细胞数量（2.5×10⁵个）分离的两种细胞。使用生物发光成像（bioluminescenceimaging，BLI）和荧光素酶免疫染色（短期：1-8周）以及GFP/组织学（长期：3个月）来追踪人类细胞持久性和迁移。hPSC介导的血管向内生长和骨形成是通过组织学（苏木素-伊红）、组织形态测定术（马森三色染色（Massontrichrome））和免疫染色（vWF、VEGF、BSP、OCN和Ｉ类人MHＣ）评估。定量骨体积／组织体积、骨表面积/体积、矿化密度以及骨小梁厚度、数量和分离（波拉（Borah,B.）等人,骨与矿物质研究杂志,15,1786-1797(2000)）是通过高分辨率显微CT（SkyScan^TM；比利时孔蒂赫（Kontich,Belgium））来评估，并且分析是使用Skyscan^TMCT分析软件执行（张X.（Zhang,X.）等人,临床研究杂志（JClinInvest）110,861-70.(2002)）。

如果在一些实施例中，需要定量评估PSC相对于ASC的发育潜能，那么可以如以前所执行的（郑,2007）在体外测试分化成肌管。示范性细胞接种密度（2.5×10⁵个/100μl）和NELL-1剂量（100-300μg；1.0-3.0mg/ml）与测试数据中所用的相同，证实成功的细胞存活、骨形成和血管向内生长（数据未显示）。研究人员也已经测定，100mlSVF得到约2.3×10⁷个细胞，其中约24%（约1.2×10⁷个细胞）为PSC（表1）。因此，使用“1ml”作为“限定的脂肪抽吸物体积”是在用以提供足够细胞数量（约10⁵个）供骨生成的范围内。必要时，在一些实施例中，可以改变限定的体积、细胞数量或NELL-1剂量以进一步增进骨形成。

2.有关在啮齿动物骨形成中hPSC+NELL-1制剂的研究

基于安全性和功效终点，另外在正常和受损[例如卵巢切除的（OVX）]骨再生模型中，比较hPSC+NELL-1制剂与

胶原蛋白海绵（

骨移植物）和黄金标准物“自体”骨移植物的安全性和功效。这些研究显示，hPSC+NELL-1产物的功效和安全性优于BMP2或自体骨移植物，或与BMP2或自体骨移植物相同。

方法和技术

对于治疗产品的最初制剂，执行有关hPSC密度（PSC^OPT）和NELL-1剂量（NELL-1^OPT）的系统性研究。首先，在存在或不存在NELL-1（300μg总剂量；3.0mg/ml）情况下，将三种密度的标记荧光素酶的hPSC以生物相容性载剂植入SCID小鼠中（表3）。

评估在各种密度下NELL-1对hPSC持久性、hPSC介导的血管向内生长和骨形成的影响。展现最佳BLI信号和骨生长的hPSC密度指定为hPSC ^OPT 。其次，研究人员在无胸腺大鼠SF模型中测试了3.0mg/ml最大浓度以及1.5mg/ml和0.75mg/ml的标记GFP的hPSC^OPT，发现在4周时与基于非细胞的NELL-1正常融合（表4）。

在hPSC存在下展现最佳血管形成和骨生长的NELL-1剂量指定为NELL-1^OPT。在正常或OVX（勒罗瓦斯P.P.（Lelovas,P.P.）等人,比较医学（CompMed）58,424-30(2008)）骨骼成熟的无胸腺大鼠中，将用于脊柱融合功效的最佳制剂（PSC^OPT+NELL-1^OPT）与BMP2/胶原蛋白（

骨移植物）和新鲜的大鼠骨移植物直接相比较（表5）。由于同源的无胸腺大鼠不可得，故使用了异源的无胸腺供体。

如上文所述，通过成像、外科病理学、组织学、免疫组织化学和细胞跟踪研究来评价功效和安全性。也执行生物医学测试。通过ELISA检测抗鼠类抗体（来自FACS）或抗NELL-1抗体。针对成骨细胞标记物、成软骨细胞标记物和成脂细胞标记物（例如RUNX2、SOX9、胶原蛋白II和X，或PPARγ）执行免疫染色。由于OVX和BMP2都促进破骨细胞形成（艾瑞K.（Irie,K.）等人,骨与矿物质研究杂志,21,363-9(2003)），故执行耐酒石酸盐酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP）染色来评估破骨细胞活性（一个潜在的安全性问题，因为过度的破骨细胞活性会引起脊椎下沉）。利用双重x射线吸收法（dualx-rayabsorptiometry，DEXA）评估OVX动物中骨矿物的损失。

在一些实施例中，可以改变细胞接种密度和NELL-1剂量来实现hPSC骨诱导作用。示范性hPSC密度为2.5×10⁴到10⁶个/100μl并且在公开报导的范围内，表明在较大植入物体积和/或扩散距离下在绵羊（参看例如，康E.（Kon,E.）等人,生物医用材料研究杂志（JBiomedMaterRes）49,328-37(2000)）、山羊（朱L.（Zhu,L.）等人,组织工程,12,423-33(2006)）和人类（马卡西M.等人,组织工程,13,947-55(2007)）中成功地实现MSC介导的骨形成。对于NELL-1剂量，与0.15mg/ml相比较，3.0mg/ml或1.0mg/ml的NELL-1在SCID小鼠肌袋中分别更有效地刺激hPSC存活骨形成（图7和8）。同时，在3个月时，基于非细胞的NELL-1在1.7mg/ml剂量（400μl；总剂量=680μg）下诱导非人类灵长类动物脊柱椎间融合（未显示）。NELL-1制剂的一个实例，即在β-TCP载剂上冻干的NELL-1，在最初24小时中提供40%的突然释放，随后在两周内提供45%的缓慢释放（李,2010），并且在大鼠、绵羊和NHP模型中成功地诱导脊柱融合。然而，基于非细胞的NELL-1依赖于NELL-1从台架扩散或细胞迁移到台架以与NELL-1接触。在本发明中，由于hPSC与NELL-1较为接近，故不需要最初的NELL-1突然释放，并且融合可以利用非突然释放的载剂和较低的NELL-1剂量实现。

3.有关在骨形成中cPSC+NELL-1与BMP2或自体骨移植物功效的比较的研究

这些研究显示，cPSC+NELL-1产物的功效和安全性优于BMP2或自体骨移植物，或与BMP2或自体骨移植物相同。

方法和技术

将先前在绵羊和猴脊柱研究中使用的人类装置植入犬脊柱融合模型中。使用BMP2（麦克凯W.（McKay,W.）,科学评估：加快组合医疗装置的产品开发（Science-basedassessment:Acceleratingproductdevelopmentofcombinationmedicaldevices）,NMAB有关生物医学工程材料和应用的会议（NMABRoundtableonBiomedicalEngineeringMaterialsandApplications）(华盛顿特区（Washington,DC）,2003)）和NELL-1实现融合存在种族特异性剂量增加。由于狗和绵羊具有类似的剂量范围，故使用在绵羊中有效的0.6mg/mlNELL-1剂量。在狗体内0.6mg/ml基于非细胞的NELL-1+无细胞同种异体骨移植物载体的脊柱融合功效（每只动物2个腰椎植入物；N=6NELL-1并且N=6无NELL-1对照植入物）可作为对照。可以测试在两种不同NELL-1剂量下高于hPSC^OPT密度5倍和低于hPSC^OPT密度5倍的标记GFP的cPSC以及生理盐水对照（每组N=4，总计N=36个植入物）。随后可以测试标记GFP的cPSC^OPT+NELL-l^OPT以及BMP2

骨移植物）和自体骨（每组N=6；总计N=18个植入物）。

4.骨诱导研究的实例

分离1-血管周干细胞

研究人员已经在多个人类器官中预见性地鉴别了血管周细胞，并且显示这些细胞是间充质祖细胞，将在培养中产生MSC（克里斯安,2008；克里斯安M.等人,细胞生物学方法（MethodsCellBiol）86,295-309(2008)）。周细胞可以分化成软骨、脂肪、骨骼肌和骨细胞（图1A-1G），而且还分泌多种生长因子，这可能部分地解释了其稳固的再生潜能（陈,2009）。然而，发现非周细胞的细胞（图1E中红色栅格的外部）也包括MSC祖细胞。进一步的分配揭露，此MSC潜能限于CD34(高)CD31-（非内皮）细胞内（图2C），都见于动脉和静脉的外膜中（图2E）。分选的外膜MSC在培养中分化成软骨、骨（图2F）和脂肪细胞，并且在注射到SCID小鼠肌肉中后分化成肌纤维。

概括起来，两类血管周细胞，即周细胞和外膜细胞，统一命名为血管周干细胞（PSC），说明了在所测试的所有人类组织中MSC的来源。PSC自然地表达MSC标记物，具有专能性，并且在培养时展现常规MSC的形状、生长特征、迁移特性、发育潜能和功能，包括免疫调节和造血支持。重要的是，PSC含有产生MSC的全部潜能。

针对用于表征人PSC的标记物的数种抗体（vWF、CD34、CD44、CD90、CD146和NG2）与犬同系物交叉反应。研究人员已经在狗胎盘中表征了周细胞；FACS纯化和这些细胞的培养揭露出类似于人周细胞特征的特征（图3A-3F）。

来自脂肪抽吸物的PSC产率

来自人抽脂术基质血管部分（SVF）的PSC产率数据与通过CFU-F分析所评估的公开的脂肪源性干细胞（ASC）产率一致（约10⁶个干细胞/100ml）（参看例如，莫里盖E.（Meliga,E.）等人,细胞移植（CellTransplant）16,963-70(2007)）（表1）。在大型动物和人类中，在2.5×10⁵到10⁷个/毫升范围内的BMSC接种密度成功地再生骨（参看例如，朱（Zhu）,2006；马卡西M.等人,组织工程,13,947-55(2007)）。利用2L的典型美容抽脂体积（弗雷瑟J.K.（Fraser,J.K.）等人,分子生物学方法（MethodsMolBiol）449,59-67(2008)），每100毫升含有至少10⁶个有活力PSC，无需培养，可容易地获得临床上相关的PSC数量。值得注意的是，细胞活力在PSC中高于总SVF群体。因此，分选的PSC应优于总SVF植入物，因为排除了所有的无活力细胞。

NELL-1，一种骨特异性、骨诱导性生长因子

基于非细胞的骨再生：NELL-1+同种异体移植物在各种小动物中（参看例如，阿格鲁,2006）以及在绵羊（鲁S.等人,骨与矿物质研究杂志,22,S171(2007)）和猴的脊柱椎间融合中可再现地诱导骨再生（未显示）。在绵羊中，NELL-1在同种异体骨移植物台架中达到与BMP2（

）组相当的融合，未出现利用BMP2所见到的囊肿形成（未显示）。

NELL-1抑制脂肪生成：在原代大鼠BMSC中，NELL-1显著地诱导主要成脂转录因子（摩尔曼E.J.（Moerman,E.J.）等人,衰老细胞（AgingCell）3,379-89(2004)）PPARγ和CCAAT/增强子结合蛋白的内源性表达和BMP2诱导性表达（未显示）。此外，在经过植入的山羊BMSC中，NELL-1明显诱导成骨细胞产生并抑制BMP2诱导的脂肪生成（阿格鲁T.等人,分子疗法（MolTher）15,1872-80(2007)）。

NELL-1对原位干细胞的影响：在大鼠椎体中，NELL-1显著地增加Stro-l+细胞（MSC相关骨髓基质细胞的数量（格罗索思S.（Gronthos,S.）等人,血液（Blood）84,4164-73(1994)））和骨涎蛋白（BSP，成骨细胞标记物）表达（未显示）。因此，直接将NELL-1/β-TCP载剂注射到大鼠股骨中使骨体积和髓密度增加（图4）。

NELL-1对体外PSC的影响：当在成骨条件下将NELL-1添加到PSC中时，1-显著地增加二甲酚橙吸收（矿化标记物）（图5）并且2-也显著地增加成骨细胞标记物RUNX2、osterix（OSX）和骨钙素（OCN）的mRNA水平，减少PPARγ，并增加VEGF（未显示）。因此，NELL-1有效地促进PSC的成骨和血管生成活性。

PSC+NELL-1开发候选物—与

Evolution^TM（

）的比较

是一种含有“有活力成体干细胞和骨祖细胞”的受FDA管理的冷冻保存的同种异体骨移植物（布诺E.M.（Bueno,E.M.）和葛洛瓦奇（Glowacki）,自然综述风湿病学期刊（NatRevRheumatol）5,685-97(2009)）。研究人员研究与用作PSC、NELL-1或PSC+NELL-1台架的相比较，单独

的成骨特性。当在成骨培养基中培养时，在

或

+NELL-1中观察到最少矿化，指明含有很少成骨细胞（图6）。相比之下，引入PSC增加矿化作用，而这又通过PSC+NELL-1进一步增加，指明最大矿化作用需要适合数量的适宜干细胞（PSC）和NELL-1（图6）。此外，将NELL-1施用于植入SCID小鼠肌肉中的标记荧光素酶的使荧光素酶强度显著增加（图7），由此NELL-1促进PSC存活和/或增殖。SCID小鼠植入组的组织学和显微CT检查揭露在

中骨形成最少，并且有趣的是，在组中也是（表明NELL-1对于体内PSC存活或活性确实很重要）（图8）。值得注意的是，在4周时，组以NELL-1剂量依赖性方式展现最多骨形成以及明显BSP表达（图8）。相对于

在1周时于肉芽组织中诱导显著增多的内皮vWF染色（未显示），并且在2周时明显增加VEGF表达，这一作用受NELL-1进一步增大（图9）。因此，PSC在NELL-1存在下具有血管生成、营养和成骨作用。4周时，经过标记的PSC在活性矿物沉积物区域中以及沿血管仍然可见（未显示）。概括起来，这些数据显示，i)PSC在适宜环境下发生矿化并且形成骨；ii)NELL-1是一种促进干细胞功能同时抑制脂肪生成的有效骨特异性、骨诱导性分子；iii)NELL-1增加PSC增殖和/或存活；以及iv)

形成的骨多于单独

或+PSC。总之，这些数据证实了PSC+NELL-1在促进骨形成和血管向内生长方面的可用性和功效。

概要

根据这些数据，研究人员已经开发出无需离体扩增，即由抽脂术提取适当数量的人PSC（hPSC）来支持基于细胞的组织工程的方法。研究人员已经证明了hPSC的身份、纯度和效力（克里斯安,2008；克里斯安M.等人,干细胞生物学实验指南第2章2B21-2B213单元(2008)），并且证实了hPSC^1-4的营养、免疫调节、造血支持、血管生成和成骨潜能（以及未公开的结果）。重要的是，研究人员显示，相对于单独hPSC或NELL-1，利用hPSC+NELL-1具有优良的骨形成功效。由于NELL-1目前正处于基于非细胞的腰椎融合适应症的前期IDE/IND阶段，故研究人员已经开发出cGMP顺应性NELL-1制造方法，并且详细说明了从510(k)批准的各种生物相容性骨再生材料获得的有关NELL-1骨诱导的作用模式数据和NELL-1释放数据。因此，相信在三年内开始IND启动的研究是符合现实的。这一提议中的七个子目标经过设计，以在开始IND启动的研究之前完成五个必要的重大事件（分散在9个月、18个月和36个月间进行）。

实例2.从脂肪抽吸术的抽出物分离外膜PSC

从脂肪抽吸术的抽出物分离SVF.

用等体积的PBS洗涤脂肪抽吸术的抽出物，并在400×g下离心10分钟。离心后，收集标本的顶层（代表含有SVF的组织部分），并再在PBS中洗涤。随后，通过添加等体积消化溶液（DMEM，胶原蛋白酶II1mg/ml，DNAse10μg/ml，1%青霉素-链霉素，3%BSA）酶促加工组织部分，并在搅动（250rpm）下，在37℃下培育45分钟。在添加含5mMEDTA的PBS后，酶消化停止，并使溶液滤过100μm细胞过滤器。在含5mMEDTA的PBS中洗涤2次并在400×g下离心10分钟后，丢弃含有脂肪细胞的上清液，并将离心块再悬浮于10ml红细胞溶解缓冲液中，在室温下保持10分钟。在含5mMEDTA的PBS中洗涤悬浮液，并在400×g下离心10分钟。将含有SVF的离心块再悬浮于含有10%FBS的DMEM中，随后进行细胞计数，培养并用特定抗体染色，以便经由FACS分选来纯化PBS。

SVF培养和CFU-F分析

通过将10⁷个未分级的SVF细胞接种到6孔板的每一孔中，来分离常规类MSC脂肪干细胞（ASC）。执行CFU-F分析，通过限制性稀释以10²到10⁶个细胞的递增密度接种于6孔板的每一孔中的总未分级SVF细胞来测定ASC的频率。培养2周后，用麦格吉（MayGrumwald）/吉姆萨（Giemsa）染料对板进行染色，并记下集落的数目。

检测脂肪抽吸来源的SVF内的PSC

将三十万个SVF细胞在100μlPBS中洗涤并且再悬浮，之后在DAPI（用于排除死亡细胞）和以下抗体存在下，在4℃下培养20分钟：CD45、CD34、CD31、CD146。随后，在PBS中洗涤并且再悬浮细胞，之后进行流式细胞术分析。排除死亡细胞和CD45+造血细胞后，PSC被鉴别为CD146+CD34-周细胞和CD34+CD31-CD146-外膜细胞。而内皮细胞则定义为CD34+CD146+CD31+细胞。使用相同染色程序，经由FACS分选来分离PSC。将纯化的PSC再悬浮于EGM2培养基中，并以每平方厘米2×10⁴个细胞的密度接种于涂有0.2%明胶的孔中。CFU-F分析是如上文所述执行。

实例3.有关周细胞和NELL-1的成骨研究

在SCID小鼠股部肌肉植入模型中执行有关周细胞和NELL-1因子的成骨能力的实验。结果显示于图12和13中。图12绘示当添加Nell-1时周细胞增殖/存活率增加。图13绘示当添加Nell-1时VEGF表达增加。

以上结果清楚地证明了周细胞和NELL-1的成骨能力。这些实验证实了NELL-1用于增进PSC或iPS的存活性和植入以及使PSC或iPS分化成为成骨细胞或祖细胞谱系从而产生骨组织的作用。

尽管已经显示和描述了本发明的特定实施例，但本领域技术人员将显而易见，在不偏离本发明的广泛方面的情况下可进行改变和修改。因此，在所附权利要求书的范围内拟涵盖在本发明的真实精神和范围内的所有这些改变和修改。

Claims (22)

1.一种纯化的血管周干细胞（PSC）或诱导性多能干细胞（iPS）群，所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和任选的CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-（周细胞）或CD146-CD34+CD45-（外膜细胞）。

2.根据权利要求1所述的PSC或iPS群，所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。

3.一种包含干细胞上清液的组合物，所述干细胞上清液包含营养因子，所述营养因子刺激所需细胞的形成或所需祖细胞的募集，从而形成组织或器官，其中所述上清液包含干细胞培养基，并且不含所述干细胞。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述干细胞是被CD146、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-（周细胞）或CD34+CD31-CD146-（外膜细胞）的PSC或iPS。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述PSC或iPS被CD146、CD45、CD34和CD31抗体鉴别为CD146+CD34-CD45-CD31-（微血管周细胞）或CD146-CD34+CD45-CD31-（外膜细胞）。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述上清液是以粉末形式提供。

7.根据权利要求4所述的组合物，另外包含药学上可接受的载剂。

8.一种组合物，包含权利要求1或2所述的纯化的PSC或iPS群和任选的诱导剂，其中所述诱导剂促进所述PSC或iPS分化成所需的细胞或祖细胞，从而形成组织或器官。

9.根据权利要求8所述的组合物，另外包含赋形剂或药学上可接受的载剂。

10.根据权利要求8所述的组合物，所述组合物被配制成台架、骨移植物、软骨移植物、植入物或在植入式装置上的涂层。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述植入式装置是支架或缝线。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中所述诱导剂是Nell-1肽。

13.根据权利要求3到12中任一权利要求所述的组合物，其中所述所需细胞是来自组织或器官的细胞。

14.根据权利要求3到12中任一权利要求所述的组合物，其中所述组织选自上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织，并且其中所述器官选自由以下各项组成的群组：骨骼器官、肌肉器官、循环器官、神经器官、呼吸器官、消化器官、排泄器官、内分泌器官、生殖器官、淋巴器官和免疫器官、皮肤、肝、基质、半月板、牙周组织、视网膜、角膜、眼、面部器官、肢体以及任何其它身体部分。

15.一种治疗或改善医学病况的方法，包含对受检者投予：

纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群，

包含纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群的组合物，或

包含干细胞上清液的组合物，所述上清液不含所述干细胞，

其中所述医学病况与损伤或患病的组织或器官或者以其它方式受疾病或病原体损害的组织或器官有关。

16.根据权利要求15所述的方法，所述医学病况与损伤或患病的组织或器官有关。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述医学病况选自由以下各项组成的群组：CNS（中枢神经系统）疾病；周围神经系统（PNS）疾病；皮肤瘢痕；纤维化；肿瘤；软骨损伤、缺损或疾病；骨损伤、缺损或疾病；心脏病；肾病；运动损伤或病况；呼吸道疾病；和糖尿病。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述医学病况选自由以下各项组成的群组：阿尔茨海默氏病（Alzheimer'sdisease）、帕金森氏病（Parkinson'sdisease）、肝纤维化、乳癌、骨质疏松症、心脏病发作、心脏缺血、肾缺血、中风、脑缺血、脊髓损伤、半月板撕裂、哮喘、肺病、I型糖尿病，以及国际疾病分类（ICD）和当代操作术语集（CPT）版本中所列的病况。

19.根据权利要求15所述的方法，其中组合物是根据权利要求3到12中任一权利要求所述。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述组织选自上皮组织、结缔组织、肌肉组织或神经组织，并且其中所述器官选自由以下各项组成的群组：骨骼器官、肌肉器官、循环器官、神经器官、呼吸器官、消化器官、排泄器官、内分泌器官、生殖器官、淋巴器官和免疫器官、皮肤、肝、基质、半月板、牙周组织、视网膜、角膜、眼、面部器官、肢体以及任何其它身体部分。

21.一种制造组合物的方法，包含：

提供纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群或者不含所述干细胞的干细胞上清液，和

形成包含所述纯化的血管周干细胞（PSC）或iPS群或者所述干细胞上清液的组合物。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物是根据权利要求3到12中任一权利要求所述。

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