WO2012146031A1

WO2012146031A1 - 透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶及制备方法

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Publication number: WO2012146031A1
Application number: PCT/CN2011/084096
Authority: WO
Inventors: 简军; 李睿智
Original assignee: 北京爱美客生物科技有限公司
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-11-01
Also published as: US20130217872A1

Description

透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶及制备方法

技术领域

本发明涉及一种透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶及制备方法，它是采用双环氧化物交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 或 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE) 合成透明质酸一羟丙基甲基纤维素交联复合改性凝胶。本发明具有反应条件简单，交联剂利用率高且残留量低，凝胶的热稳定性较高、生物相容性好等优点。背景技术

透明质酸（Hyaluronic acid、 HA) 又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖， 1934年美国哥伦比亚大学眼科教授 Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子 (Natural moisturizing factor, NMF, 例如： 2%的纯透明质酸水溶液能牢固地保持 98 %水分。透明质酸是一种多功能基质，透明质酸（玻尿酸） HA广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。而透明质酸凝胶用于皮下注射，可瞬间深层保湿、增加皮肤弹性与张力，有助恢复肌肤正常油水平衡，改善干燥及松弛皮肤。

羟丙基甲基纤维素别名为羟丙甲纤维素；纤维素羟丙基甲基醚； Hypromellose , Cellulose(HPMC) o 在药品中不提供热量，为安全的药用辅料。其在药剂学领域中片剂、缓释与控释剂、眼部给药系统、混悬型液体制剂、凝胶和软膏有广泛应用。

目前国内市场上流行的皮下注射级的各类透明质酸凝胶，在皮下的停留时间都在一年左右，而在体外用透明质酸酶进行酶解的作用下，在两小时之内便可被完全降解。

当以 1,2,7,8-二环氧辛烷 (DEO) 作为交联剂时，由于 1,2,7,8-二环氧辛烷 (DEO) 的碳链较长，分子极性较小，使得 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 在水中的溶解度非常小，（一般不超过 1%，质量分数），这也导致了其在水相中与透明质酸和羟丙基甲基纤维素的交联活性比能与水混溶的 1， 4-丁二醇双縮水甘油醚（BDDE)要差。一般实验中都是利用了其在水中微弱的溶解度来制备的较低交联度（<10% )的复合凝胶；若将交联剂的用量增加两倍以上，由于存在大量未能溶解进入水相的交联剂，存在于油相中的交联剂就不能与水相中的透明质酸和羟丙基甲基纤维素充分反应而造成交联剂的利用率很低（<20% )，无法得到预期高交联度的复合凝胶。

采用 1,2,7,8-二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，将透明质酸的羟基和羧基都交联起来，提高了透明质酸分子的稳定性，有效地防止了透明质酸酶和自由基对透明质酸的降解作用，明显地提高了透明质酸在皮肤内的停留时间，具有量好的作为皮肤填充剂应有的疗效。但是，依据化学材料安全评估报告（Material Safety Data Sheets, 简称 MSDS)， 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 对皮肤具有刺激性甚至毒性。在透明质酸交联反应完全结束后，此交联剂必须被清除，达到安全的含量范围内以避免残留的交联剂对皮肤造成不良的影响。发明内容

本发明的目的在于提供一种透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶，该复合凝胶具有较高的热稳定性、生物相容性等优点，可以得到体外抗酶降解性强的改性的透明质酸凝胶，在医药、外科手术、化妆品方面有着广泛的用途,为进一步开发注射美容和整形产品奠定了基础。

本发明的目的另一目的是提供一种透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶的制备方法。在强碱性环境下，采用双环氧化物交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)或者 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE), 将透明质酸与羟丙基甲基纤维素醚化交联反应交联而制得非水溶性的透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合改性物。本发明方法简单，容易操作，成本低廉，安全可靠。

本发明提供的透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶是以透明质酸、羟丙基甲基纤维素为原料，在双环氧化物交联剂存在下制成，透明质酸单体与羟丙基甲基纤维素的质量比中，羟丙基甲基纤维素的质量分数为 1%~50%，具体制备方法分为：

方法一：将透明质酸与羟丙基甲基纤维素溶液按照比例混合，搅拌反应后向溶液中加入强碱使溶液呈强碱性，混合均匀后，再向反应体系中加入亲水或憎水双环氧交联剂，搅拌下反应后用酸调溶液为中性，用丙酮使体系固化脱水，产物经有机溶剂（无水乙醇或丙酮）洗涤，真空干燥，复溶解。

方法二：将季铵碱溶液与羟丙基甲基纤维素溶液混合均匀后，按比例加入透明质酸干粉，混合均匀后向体系中加入憎水双环氧化物交联剂，搅拌下反应后用酸调溶液为酸性，真空浓縮使羧基参与交联反应，然后用碱性乙醇溶液中和脱水，真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶。

所述的憎水双环氧化物交联剂为长链烷烃类双环氧化合物，如 1,2,7,8-二环氧辛烷 (DEO) 等，亲水双环氧化物为醚类双环氧化物，如 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE) 等。

所述的双环氧化物交联剂与透明质酸单体的质量比： HA:交联剂 =1:0.01~3

本发明提供的透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶的制备步骤：

方法一具体步骤如下：

1 ) 按计量比将透明质酸与羟丙基甲基纤维素溶液均匀混合，搅拌反应 16-18h;

2) 加入氢氧化钠溶液呈强碱性（pH=13) 后，再向反应体系中加入双环氧化物交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 或者 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE), 搅拌均匀，室温下反应 24-36h;

3)用盐酸调 pH=5-6，用丙酮使体系固化脱水，产物经无水乙醇或丙酮洗涤干净， 50。C 真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再用中性磷酸缓冲液（PBS ) 复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶；

此方法适用于采用 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE) 作为交联剂制备各种交联度 ( 1 ~300 ) 的复合凝胶，与采用 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 作为交联剂制备低交联度 (<10 ) 的复合凝胶。

方法二具体步骤如下：适用于采用 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 作为交联剂制备高交联度（10%~300% ) 的羟基与羧基双交联的复合凝胶：

1 )按计量比将强碱性季铵碱（可选用：四丁基氢氧化铵或辛基三甲基氢氧化铵）溶液 (pH=13 )、羟丙基甲基纤维素溶液与透明质酸干粉均匀混合，搅拌反应 16-18h;

2)向反应体系中加入交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)搅拌均匀，室温下反应 24-36h，使透明质酸的羟基先与交联剂反应；

3 ) 用盐酸调 pH=5-6，真空浓縮除水使羧基参与交联反应，用 pH=8~9 的乙醇溶液

(20-40%, 质量）中和盐酸并使凝胶脱水，真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再用中性磷酸缓冲液（PBS ) 复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶。

HA与 DEO质量比为 1:0.2-1:3，季铵碱的用量占反应体系总质量的 0.5-30% 。

真空浓縮条件：为 30-35°C， O.lMPa;

真空干燥条件：为 50-60°C， 0.08-0.09MPa的条件下干燥 10-12h。

所述的季铵碱可用两种方法来合成：

1 )氧化法，该方法是将单质银与^化季铵盐水溶液充分混合，再加入双氧水作为氧化剂，在室温下就可以快速的合成季铵碱水溶液，过滤除去卤化银沉淀后即可用来溶解透明质酸，该方法用料少，不引入杂质离子与有机溶剂，沉淀卤化银可以回收再利用，操作简单方便环保；所述的季胺盐优选为：四丁基溴化铵。

+ - °C + - I

R R₂R₃R₄N X + Ag + H₂0₂ ► R^R^N OH + AgXj

X=C1， Br; Rl， R2， R3， R4为四个相同或不相同的脂肪烃基或芳烃基。

可选的季胺盐为四丁基溴化铵。

2) 乙醇法，用钠盐在乙醇中的溶解度突降而沉淀来制备季铵碱的：先将卤化季胺盐与氢氧化钠分别溶解于 90%乙醇中，再将两种溶液混合搅拌，过滤掉卤化钠沉淀后得到季铵碱的醇溶液，经过真空浓縮后可以得到高浓度的季铵碱溶液。此法最大的优点就是可以制备高浓度的季铵碱。所述的季胺盐优选为：三甲基辛基氯化铵。 + _ EtOH

RiR₂R₃R₄N X + NaOH RiR₂R₃R₄N OH + NaX ,

25 °C

X=C1， Br; Rl， R2， R3， R4分别为四个相同或不相同的脂肪烃基或芳烃基。

可选季胺盐为三甲基辛基氯化铵。

为了制备高交联度的复合凝胶，本发明在反应过程中添加了季铵碱作为催化剂，该催化剂可以起到碱催化剂以及相转移催化剂的双重作用，增加了 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 在水中的溶解度（>20%，质量分数），同时让其能够均匀地溶解在水相中，进一步增大 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的利用率（>90% )，使高交联度（>20% ) 的交联透明质酸得以合成。

本发明的反应过程：

透明质酸（HA)与羟丙基甲基纤维素（HPMC)在交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 存 4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE), 则与此反应类似。

1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE) 1,2,7,8-二环氧辛烷 (DEO)

1. NaOH or 季接碱

2. HC1

采用单纯季铵碱相比季胺盐与氢氧化钠组合的好处在于：单纯的季铵碱的离子强度要低于季胺盐与氢氧化钠组合，由于粒子强度的增大会影响到透明质酸的溶解性能，而造成透明质酸会在局部浓度过大，而导致了交联反应的局部交联不均匀，影响了凝胶的性状与交联剂的利用率。因此，综合上述考虑，采用季铵碱作为相转移催化剂与碱催化剂的结合体，使得交联的均匀度更好，且交联剂的利用率更高。

本发明还进一步提供了一种透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶的纯化方法即除去交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷的方法，采用高压蒸汽空法去除交联透明质酸产品中 1,2,7,8-二环氧辛烷，达到安全的含量范围内，确保交联透明质酸产品的安全性。除去交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷的方法包括如下步骤：

1 )将复合凝胶的水凝胶溶液用酸 pH值调整至 7-8，放置滚床上滚动 18-24h，至达到透明质酸吸水平衡。

2) 用透气非透菌纸封住瓶口，置于高压灭菌锅中，加热至沸腾后，关掉高压灭菌锅上的放气阀门。

3 ) 当气压升至 0.12MPa，温度升至 105 °C时，打开放气阀放气，至压力降至 O.lMPa, 温度降至 ioo°c时关掉放气阀门。

4) 重复步骤 3)，让温度压力上升至之前的读数，如此反复 4-5次，即可达到去除交联透明质酸中交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的目的。

所述的水凝胶浓度为 15-35mg/mL，优选浓度为 20mg/mL。

步骤 3 ) 至步骤 4) 的高压时间为 25-35min，优选 30min。

本发明采用 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 作为透明质酸的交联剂，在透明质酸交联反应之前将透明质酸加入到季铵碱溶液中，将透明质酸的羟基和羧基都交联起来，提高了透明质酸分子的稳定性，有效地防止了透明质酸酶和自由基对透明质酸的降解作用。本发明反应条件简单，以季铵碱作为碱催化剂与相转移催化剂的结合体，增加了 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 在水中的溶解度（>20%，质量分数），同时让其能够均匀地溶解在透明质酸的溶液中，进一步增大 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的利用率（>90% )，交联剂利用率高，使高交联度（>20% ) 的交联透明质酸得以合成。先碱后酸再减压浓縮的方法，合成羟基与羧基双交联且交联度高，稳定性强，并且高生物相容性的透明质酸凝胶或者透明质酸膜。本发明凝胶的热稳定性较好，无菌无毒无热原，生物相容性等优点。本发明所制得的交联透明质酸凝胶，用气相色谱检测 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的残留量，其残留值均低于气相色谱的检出限，说明了交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)在交联反应中的利用率很高。本发明明显地提高了透明质酸在皮肤内的停留时间，具有良好的作为皮肤填充剂应有的疗效。本发明利用溶液聚合的方法，以注射级的透明质酸与羟丙基甲基纤维素为原料，使用

1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)或者 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE)作为交联剂，由于羟丙基甲基纤维素的热稳定性，可以使透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶在保证透明质酸原有的化学特性没有明显改变的前提下而具备了更好的稳定性，可以抵抗住 125°C的高温，

0.5h的分解率仅不到 1%; 而在常温强酸性（pH=l ) 或者强碱性（pH=13) 的条件下， 10h 内凝胶的降解率均不超过 10%，具有较好的耐酸碱性能，而在体外高浓度（300ii/ml)透明质酸酶的作用下，可在 10h之内降解率不超过 2%。

本发明为透明质酸的改性提供了新的途径，用本发明方法制备的复合改性物具有较高的热稳定性、生物相容性等优点，可以得到体外抗酶降解性强的改性的透明质酸凝胶，在医药、外科手术、化妆品方面有着广泛的用途，为进一步开发注射美容和整形产品奠定了基础。本发明方法简单，容易操作，成本低廉，安全可靠。附图说明

图 1 本发明与透明质酸原料的 FTIR对比谱图。

图 2 本发明与透明质酸原料的 ¹³C NMR对比谱图。

图 3 本发明复合凝胶体外酶解分子量变化的 GPC谱图。

图 4 交联透明质酸的体外酶解分子量变化的 GPC谱图。

图 5 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 标准样的顶空法气相色谱图,

图 6 经高压蒸汽后交联透明质酸的顶空法气相色谱图。具体实 Sfe^式

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明。

实施例 1 :

季铵碱的制备反应实施例 1-a: 氧化法合成季铵碱

此反应中的卤化季铵盐选用的是四丁基溴化铵（TBAB)。

将 6.44g四丁基溴化铵溶解于 100ml水中，加入 2.5g单质银粉，在 25 V电磁搅拌中迅速分散均匀后，缓慢滴加 30% 的双氧水 10ml，继续在此条件下反应 6h。停止电磁搅拌，取 lml左右上层清液，用硝酸中和后滴加几滴硝酸银，若此时无淡黄色溴化银沉淀出现，则可确定氧化反应完全。反应液在过滤除去溴化银沉淀后即可用来溶解透明质酸，参与交联反应。

反应中的副产物溴化银可在分解后循环使用。

实施例 1-b: 乙醇法合成季铵碱

此反应中的卤化季铵盐选用的是辛基三甲基氯化铵（OTMAC)。

将 4.18g辛基三甲基氯化铵溶解于 100ml 90%的乙醇中，再加入到 100ml溶解了 0.8g

NaOH的 90%的乙醇中，于 25 °C电磁搅拌中迅速混合，并在此条件下反应 12-18h。过滤除去 NaCl沉淀，于 35-40°C，真空度为 0.09MPa的条件下浓縮，得到高浓度的季铵碱溶液，乙醇含量不超过 5%。

实施例 2:

以 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 为交联剂制备高交联度的透明质酸（HA) -羟丙基甲基纤维素（HPMC) 复合凝胶

将实施例 1中任意一种方法得到的季铵碱高浓度溶液，稀释配成浓度为 O.lmol/L的季铵碱溶液，取 lOOmL, 加入 8g透明质酸钠与 2g羟丙基甲基纤维素，搅拌 12-14h，搅拌至溶液完全透明后，再向反应体系中加入 3mL 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO), 迅速搅拌均匀，在 25 °C下反应 24h。反应用 2mol/L盐酸终止，调至 pH=5左右，同时在 40°C， O.lMPa的真空度条件下蒸馏去除反应体系中的水，当蒸馏出的水达到 50mL 时停止减压蒸馏。用 200mL NaOH浓度为 0.01%。的 50%乙醇溶液浸泡 3次，中和凝胶的盐酸并使凝胶脱水。将中和后的凝胶转入真空干燥箱中，于 50°C 0.08~0.09MPa的条件下干燥 10h，再用中性磷酸缓冲液（PBS )复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合改性凝胶，理论交联度 30%。

实施例 2-a: 溶胀度测试

取实施例 2中的 lg透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶干粉，放置在 200mL中性磷酸缓冲液中， 72h后达到溶胀吸水平衡（凝胶的重量不再随时间的变化而变化），过滤后取出凝胶，得凝胶重量为 50g。则此凝胶吸水率为 50:1。

实施例 2-b: 体外抗酶解测试

取浓度均为 20mg/mL实施例 2中的透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶与单纯交联透明质酸（见对比例）各 0.5mL于比色管中，加入透明质酸酶 1500单位，加水 2mL稀释，放置在 37°C恒温水浴振荡器中，从稀释后起计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取 50μί上清液，取出的上清液置于冰箱迅速冷却至 5°C，取 5h之内的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱（GPC) 检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成。酶解结果如附图 3，附图 4所示，本发明的复合凝胶在前一小时内的分子量均为透明质酸酶的分子量， lh后分子量增大并出现一个峰值，在 5h内未能降解完全；而交联透明质酸的分子量呈线性下降趋势，并在 90min左右降解完全。说明本发明的复合凝胶具有很强的抗透明质酸酶解的能力。

实施例 2-c: 热稳定性测试

精确称量实施例 2中已经达到吸水溶胀平衡的透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合改性凝胶 5.00g，加水 100ml, 于 80°C烤箱中密封恒温 24h，冷却至室温后过滤取出凝胶，称量凝胶质量为 4.99g，说明此凝胶的降解率不超过 0.2%。再取该凝胶 5.00g，置于高压灭菌锅中，直接加热至 125 °C，并密封保持 0.5h，冷却至室温后过去取出凝胶，称量凝胶质量为 4.96g，说明凝胶在此条件下降解率不超过 1% ; 在此温度下密封保持 2h，冷却至室温后过去取出凝胶，称量凝胶质量为 3.78g，说明凝胶在此条件下降解率不超过 25%。说明本发明的复合凝胶有很好的热稳定性能。

实施例 2-d: FTIR光谱， solid ¹³C NMR谱检测

取实施例 2中的凝胶粉末作为样品，与纯透明质酸进行 FTIR, solid ¹³C NMR检测对比（见附图 1，附图 2)，从图中可以清楚看到交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)的特征峰，说明交联剂成功地参与交联反应；除交联剂的特征峰外，透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶与透明质酸原料在图谱中的基本没有区别。说明透明质酸原有的特征官能团在透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合改性物中并没有明显的改变。所以此复合改性物在保证透明质酸原有的化学性质与安全性能的同时，又提高了透明质酸的抗酶解性能与热稳定性，具有非常好的实用价值。

实施例 2-e: 残留交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的去除与检测

将实施例 2中的复合凝胶干粉按照 20mg/mL的浓度配成水凝胶，并且将 pH值用盐酸调整至 7~8，放置滚床上滚动 20h，至达到透明质酸吸水平衡。用透气非透菌纸封住瓶口，置于高压灭菌锅中，加热至沸腾后，关掉高压灭菌锅上的放气阀门，当气压升至 0.12MPa，温度升至 105 °C时，打开放气阀放气，至压力降至 O.lMPa, 温度降至 100 °C时关掉放气阀门，让温度压力上升至之前的水平，如此反复放气 4-5次，高压时间在 30min左右，即可达到去除交联透明质酸中交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的目的。

用微量注射器抽取 2μί 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 置于顶空瓶中，加 10mL纯化水溶解作为储备液。密封后顶空瓶于 95°C恒温 40min后，取顶空气体 lmL，进样检测，得到气相色谱图（见附图 5)。

精密称取经高压蒸汽法处理过的复合凝胶 2g左右，置于顶空瓶中，加水 8mL。密封后顶空瓶于 95°C恒温 40min后，取顶空气体 lmL，进样检测，得到气相色谱图（见附图 6)。由附图 5，附图 6中对比可以看出，经过高压蒸汽处理后，复合凝胶中 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO)含量已经低于气相色谱的最低检出限，即低于 O.lppm, 保证了本发明的复合凝胶的安全性。实施例 3:

以 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE)为交联剂制备高交联度的透明质酸（HA) -羟丙基甲基纤维素（HPMC) 复合凝胶

将 8g透明质酸与 2g羟丙基甲基纤维素混合，加入蒸馏水 90ml， 25°C搅拌 18h，向反应体系中加入 2ml 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE), 继续搅拌 18h，再向溶液中加入 10 NaOH溶液 10mL，混合均匀后，迅速搅拌均匀，在 25°C下反应 14h。反应用 2mol/L盐酸终止，调至 pH=7左右即可，洗净后用 500ml丙酮使体系固化脱水，产品经有机溶剂（例如：无水乙醇、丙酮）洗涤，于 50°C真空干燥后，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再用中性磷酸缓冲液（PBS ) 复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合改性物凝胶。

对比例：合成交联透明质酸

取实施例 1中任意一种方法得到的季铵碱高浓度溶液，稀释配成浓度为 O.lmol/L的季铵碱溶液，取 lOOmL, 加入 10g透明质酸钠，搅拌 12-14h，搅拌至透明质酸钠完全溶解后，再向反应体系中加入 3mL 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO), 迅速搅拌均匀，在 25°C下反应 24小时。反应用 2mol/L盐酸终止，调至 pH=5左右，同时在 40°C， O.lMPa的真空度条件下蒸馏去除反应体系中的水，当蒸馏出的水达到 50mL时停止减压蒸馏。用 200mL NaOH浓度为 0.01%。的 50%乙醇溶液浸泡 3次，中和凝胶的盐酸并使凝胶脱水。将中和后的凝胶转入真空干燥箱中，于 50°C， 0.08~0.09MPa的条件下干燥 10h使凝胶固化定型，得到高交联的透明质酸凝胶，理论交联度 30%。

Claims

权利要求书

1、一种透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶，其特征在于它是以透明质酸、羟丙基甲基纤维素为原料，在双环氧化物交联剂存在下制成，具体制备方法为：将透明质酸与羟丙基甲基纤维素溶液按照比例混合，搅拌反应后向溶液中加入氢氧化钠溶液呈强碱性，混合均匀后，再向反应体系中加入双环氧化物交联剂，搅拌下反应后用酸调溶液为弱酸性，用丙酮使体系固化脱水，产物经有机溶剂洗涤，真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶；

2、根据权利要求 1 所述的交联复合凝胶，其特征在于所述的双环氧化物交联剂是 1,2,7,8-二环氧辛烷或者 1,4-丁二醇二縮水甘油醚。

3、根据权利要求 2所述的交联复合凝胶，其特征在于采用交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷制备高交联度复合凝胶时，采用的催化剂为四丁基氢氧化铵或辛基三甲基氢氧化铵等季胺碱催化剂。

4、根据权利要求 1所述的交联复合凝胶，其特征在于所述的羟丙基甲基纤维素的质量分数为 1%~50%。

5、根据权利要求 1所述的交联复合凝胶，其特征在于所述的双环氧化物交联剂与透明质酸单体的质量比： HA:交联剂 =1:0.05~3 。

6、一种权利要求 2所述的透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶的制备方法，其特征在于它包括的步骤：

2) 加入氢氧化钠溶液呈强碱性后，再向反应体系中加入双环氧化物交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷或者 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，搅拌均匀，室温下反应 24-36h;

3)用盐酸调 pH=5-6，用丙酮使体系固化脱水，产物经无水乙醇或丙酮洗涤干净， 50。C 真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再用中性磷酸缓冲液复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶。

7、一种权利要求 2所述的透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合凝胶的制备方法，其特征在于它包括的步骤：

1 ) 按计量比将强碱性季铵碱溶液，羟丙基甲基纤维素溶液与透明质酸干粉均匀混合，搅拌 16-18h;

2) 向反应体系中加入交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷搅拌均匀，室温下反应 18-36h;

3)用盐酸调 pH=5-6，真空浓縮除水使羧基参与交联反应，用 pH=8~9的乙醇溶液中和盐酸并使凝胶脱水，真空干燥，得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素凝胶粉末，再用中性磷酸缓冲液（PBS ) 复溶解得到透明质酸一羟丙基甲基纤维素复合凝胶。

8、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的季铵碱是四丁基氢氧化铵或辛基三甲基氢氧化铵。

9、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的透明质酸（HA) 与 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 质量比为 1:0.2-3。

10、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的真空浓縮条件为 30-35°C，0.1MPa;

11、根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于所述的真空干燥条件为 50-60°C， 0.08-0.09MPa的条件下干燥 10-12h。

12、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的乙醇溶液为质量浓度 20-40%。

13、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的季铵碱的用量占反应体系总质量的 0.5-30%。

14、根据权利要求 7所述的方法，其特征在于所述的季铵碱的制备方法是将单质银与卤化季胺盐水溶液充分混合，再加入双氧水作为氧化剂，在室温下快速合成季铵碱水溶液，过滤除去卤化银沉淀后即可：

+ - °C + - I

R R^N X + Ag + H₂0₂ ► R R₂R₃R₄N OH + AgXj

15、根据权利要求 14所述的方法，其特征在于：所述的季胺盐为四丁基溴化铵。

16、根据权利要求 Ί所述的方法，其特征在于：所述的季铵碱的的制备方法是乙醇法制备季铵碱，先将卤化季胺盐与氢氧化钠分别溶解于 90%乙醇中，再将两种溶液混合搅拌，过滤掉卤化钠沉淀后得到季铵碱的醇溶液，经过真空浓縮；

+ ― EtOH + 一 I

R!R₂R3R₄N X~ + NaOH ► R1R2R3R4 OH + NaX I

V "

17、根据权利要求 16所述的方法，其特征在于：所述的季胺盐为三甲基辛基氯化铵。

18、一种权利要求 7所述的方法制备的透明质酸与羟丙基甲基纤维素交联复合凝胶的纯化方法，其特征在于包括的步骤：

1 ) 将复合凝胶的水凝胶溶液用酸 pH值调整至 7-8，放置滚床上滚动 18-24h，至达到透明质酸吸水平衡；

2)用透气非透菌纸封住瓶口，置于高压灭菌锅中，加热至沸腾后，关掉高压灭菌锅上的放气阀门；

3 ) 当气压升至 0.12MPa，温度升至 105 °C时，打开放气阀放气，至压力降至 O.lMPa, 温度降至 10CTC时关掉放气阀门；

4)重复步骤 3)，让温度压力上升至之前的读数，如此反复 4-5次，即可达到去除交联透明质酸中交联剂 1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO) 的目的。

19、根据权利要求 18所述的方法，其特征在于：所述的水凝胶浓度为 15-35mg/mL，优选浓度为 20mg/mL。

20、根据权利要求 18所述的方法，其特征在于：步骤 3 ) 至步骤 4) 所述的高压时间为 25-35min。