NO315274B1

NO315274B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en polysakkaridgel- blanding, polysakkaridgel-blandinger, samt anvendelser derav

Info

Publication number: NO315274B1
Application number: NO19980213A
Authority: NO
Inventors: Bengt Aagerup
Original assignee: Q Med Ab
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1998-01-16
Publication date: 2003-08-11
Also published as: PL324608A1; DK0839159T3; JP3094074B2; AU700215B2; CA2226488C; MX9800484A; JPH11509256A; CZ290755B6; BRPI9609534B8; ATE204000T1; US5827937A; BR9609534A; KR19990029034A; ES2161368T3; KR100314488B1; TR199800072T1; EA001500B1; DE839159T1; DE69614391T2; HUP9901714A3

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører området biofolikelige polysakkaridgel-blandinger, og nærmere bestemt en ny fremgangsmåte for tverrbinding av slike blandinger, hvorved det oppnår en ny gelstruktur. Den nye struktur gir forbedrede egenskaper til de tidligere kjente gelblandinger, og muliggjør dessuten nye anvendelser av nevnte blandinger, både som sådanne og inneholdende aktive bestanddeler.

Vannbindende geler har bred anvendelse på det biomedisinske området. De fremstilles vanligvis ved kjemisk tverrbinding av polymerer til ubegrensede nettverk. Ved anvendelse av bioforlikelige polymerer må det generelt anvendes en lav grad av tverrbinding for å bibeholde nevnte bioforiikeligehet. Ofte kreves det imidlertid en tettere gel for å gi den riktige effekt av de anvendte aktive bestanddeler, og i et slikt tilfelle vil bioforlikeligheten ofte gå tapt.

En annen verdifull egenskap hos vannbindende geler, eller hydrogeler, er at peptider og større biologisk aktive substanser kan innesluttes deri under dannelse av en blanding med forlenget frigivning. Praktiske problemer er imidlertid blitt involvert i å oppnå en tilstrekkelig vedlikeholdstid forden aktive bestanddel, siden den aktive bestanddel vanligvis blir frigitt med den samme hastighet hvormed den ble løst eller innesluttet i den refererte blanding. Dersom en slik gel ble fortettet i et forsøk på å beholde den aktive bestanddel i lengre tid, ville den dessuten svelle hurtig i et animalsk vev hvor det er fri tilgang på vann.

En av de mest utbredt anvendte bioforlikelige polymerer for medisinsk anvendelse er hyaluronsyre. Siden den er tilstede i identisk sammensetning i hver levende organisme, gir den et minimum av reaksjoner og tillater avanserte medisinske anvendelser. Som konsekvens derav har den vært gjenstand for mange modifikasjonsforsøk. Den er således blitt tverrbundet med midler slik som aldehyder, epoksyder, poiyaziridylforbindelser og divinylsulfon (Laurent et al., Acta Chem. Scand 18 (1964) No. 1, side 274; EP 0 161 887B1; EP 0 265 116A2; og US 4.716.154).

I WO87/07898 er det beskrevet en reaksjon av et polysakkarid med et polyfunksjonelt epoksyd, fjerning av overskudd av nevnte epoksyd og endelig en tørkeoperasjon for å tverrbinde nevnte polysakkarid til en film, et pulverisert materiale eller et lignende tørt produkt. Det er imidlertid ingen antydning deri om å fortynne det aktiverte polysakkarid og deretter rekonsentrere det samme til den ønskede tetthet eller konsistens som deretter i alt vesentlig blir permanent.

US 5.128.326 beskriver flere modifiserte hyaluronsyrer for anvendelse som depot-farmasøytika. De beskrevne fremgangsmåter for "fylling" av gelpreparatene er alle basert på diffusjon av den aktive bestanddel inn i gelen og deretter en frigjøring derav med den samme diffusjonskonstant. I motsetning til dette skal den fore-liggende oppfinnelse medføre en oppløsning av den aktive bestanddel etterfulgt av en fortetting eller konsentrering av gelblandingen inntil ingen eller en svært ubetydelig diffusjon av nevnte aktive bestanddel finner sted.

US 5.399.351 beskriver blandinger av gel og polymerløsninger, idet nevnte løsninger blir anvendt til å forbedre gelens rheologiske egenskaper. Også i dette tilfelle er det imidlertid beskrevet reversibelt komprimerte geler, hvilket kan utledes fra f.eks. spalte 6, linjene 53-58.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det uventet blitt funnet at polysakkaridgel-blandinger med en ny struktur og derved nye fremragende egenskaper kan oppnås ved anvendelse av en ny teknikk for tverrbinding derav. Nevnte nye tverrbindingsteknikk muliggjør en smidig kontroll av strukturen og egenskapene til den fremstilte polysakkaridgel-blanding, hvilket i sin tur gjør det mulig å skreddersy den endelige sammensetning for de tilsiktede formål.

Nærmere bestemt vil et formål ifølge den foreliggende oppfinnelse være å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av en tverrbundet polysakkaridgel-blanding, slik at bioforlikeligheten av denne kan beholdes til tross for en høy grad av tverrbinding eller polymerisering.

Et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe en polysakkaridgel-blanding med viskoelastiske egenskaper, til tross for at den er tverrbundet i betydelig grad.

Ytterligere et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe en polysakkaridgel-blanding som er mer eller mindre irreversibelt fortettet eller konsentrert, dvs. som ikke vil svelle betydelig eller bare i begrenset grad når den bringes i kontakt med vann.

Ytterligere et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe en polysakkaridgel-blanding som inkorporerer en biologisk aktiv substans for anvendelse som en blanding med forlenget frigivning eller som en depotblanding.

Et annet formål ifølge denne forbindelse er å tilveiebringe polysakkaridgel-blandinger inneholdende flere forskjellige biologisk aktive substanser for anvendelse som medisinske eller profylaktiske blandinger for ulike formål.

Ytterligere et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe anvendelser av de refererte blandinger for fremstilling av medisinske eller profylaktiske blandinger så vel som for administrering til pattedyr, spesielt mennesker.

Ytterligere et annet formål ifølge denne oppfinnelse er å tilveiebringe en delvis tverrbundet aktivert polysakkaridgel-blanding som oppnådd som mellomprodukt i den ovenfor nevnte fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse, hvilket mellomprodukt kan være endelig tverrbundet in situ på hvilket som helst ønsket sted.

Disse og ytterligere formål ifølge denne oppfinnelse vil bli klargjort ved den

mer detaljerte beskrivelse derav presentert nedenfor.

Ifølge et aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en fremgangsmåte for fremstilling av en tverrbundet bioforlikelig polysakkaridgel-blanding hvilken fremgangsmåte omfatter: - å danne en vandig løsning av et vannløselig, tverrbindbart polysakkarid;

å initiere en tverrbinding av nevnte polysakkarid i nærvær av et

polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel for dette;

å sterisk hindre tverrbindingsreaksjonen fra å bli avsluttet før geleringen forekommer, slik at det derved oppnås et aktivert polysakkarid; og

i - å innføre på nytt sterisk uhindrede betingelser for nevnte aktiverte polysakkarid for således å avslutte tverrbindingen derav opp til en viskoelastisk gel.

Med andre ord innebærer den nye fremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelse en tverrbinding av et vannløselig, tverrbindbart polysakkarid i minst to trinn, hvor tverrbindingsreaksjonen blir avsluttet før geleringen initieres, idet nevnte avslutning gjennomføres ved sterisk hindring av nevnte tverrbindingsreaksjon. Tverrbindingsreaksjonen fortsettes deretter i et andre trinn ved på nytt å innføre sterisk uhindrede betingelser.

For det første er det således uventet blitt funnet at det ved nevnte steriske

i hindring blir oppnådd et aktivert polysakkarid, slik at tverrbindingen eller polymeriseringen av dette kan fortsettes utelukkende ved på nytt å innføre sterisk uhindrede betingelser. For det annet er det også uventet blitt funnet at polysakkaridgel-blandingen oppnådd derved ikke vil danne den kompakte, tette struktur som ville blitt oppnådd forutsatt gjennomføring av den tilsvarende tverr-

bindingsreaksjon i et enkelt trinn til en fullstendig tverrbundet gel, men heller en viskoelastisk gel. Som nevnt ovenfor vil dessuten den nye gelstruktur oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse, representere en i alt vesentlig irreversibel gelstruktur som ikke sveller i noen betydelig grad i kontakt med vann eller hvilket som helst annet vandig medium. Generelt betyr dette at nevnte resvelling er mindre enn 10 volum% basert på volumet oppnådd fra den krevede fremgangsmåte.

Selv om oppfinnelsen ikke er bundet av noen bestemt teori, kan det være at den nye strukturen oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse, er en kombinasjon av tverrbinding mellom eksisterende polymerkjeder og forlengelser av eksisterende kjeder heller enn et svært tett nettverk som gir en svært stiv struktur. Det som kan antyde en slik mekanisme er det faktum at det kan oppnås et viskoelastisk produkt ved denne oppfinnelse.

Som anvendt heri skal betegnelsen "sterisk hindring av tverrbindingsreaksjonen" tolkes i bred forstand, dvs. at det ikke nødvendigvis behøver å være en fullstendig hindring, men i mange tilfeller heller en delvis hindring av den reaksjon det refereres til. Det vil si at det som er viktig er at tverrbindingshastigheten blir vesentlig redusert for å gjøre det mulig at den endelige tverrbindingsreaksjon finner sted med nye reaksjonssteder involvert.

På lignende måte skal betegnelsen "på nytt å innføre sterisk uhindrede betingelser" også forstås i bred forstand, hvilket vanligvis betyr at nevnte sterisk uhindrede betingelser ikke nødvendigvis behøver å være nøyaktig de samme steriske betingelser som ble anvendt ved initiering av tverrbindingsreaksjonen. Det som generelt er av viktighet er således at nevnte sterisk uhindrede betingelser gjør det mulig at det finner sted hurtigere reaksjoner enn ved nevnte sterisk hindrede betingelser.

Den steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen bør være oppnåelig på forskjellige måter, men en foretrukket utførelse av oppfinnelsen i dette henseende er representert ved det tilfelle hvor den steriske hindring omfatter fortynning av det vandige medium som tverrbindingsreaksjonen gjennomføres i, for å oppnå en lavere konsentrasjon av polysakkaridet i nevnte medium.

På nytt å innføre sterisk uhindrede betingelser bør også være mulig på forskjellige måter, men en foretrukket utførelse i dette henseende er det tilfelle som omfatter fordampning av det vandige medium som tverrbindingsreaksjonen gjennomføres i, for å oppnå en høyere konsentrasjon av polysakkaridet i nevnte medium. En annen foretrukket utførelse i dette henseende er representert ved det tilfelle som omfatter dialyse av det vandige medium som tverrbindingsreaksjonen gjennomføres i.

Ifølge en foretrukket utførelse av denne oppfinnelse blir den steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen oppnådd før tverrbindingsmidlet er forbrukt. Dette vil i sin tur vanligvis også bety at gjeninnføringen av sterisk uhindrede betingelser blir initiert i nærvær av nevnte ikke-forbrukte tverrbindingsmiddel.

Den steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen kan vanligvis startes eller gjennomføres innenfor området 50-90% av den totale geleringstid som anvendes i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, idet det også blir tatt hensyn til passende elastisitet eller konsistens for den tilsiktede anvendelse av blandingen.

Denne oppfinningsidé bør være anvendbar på hvilket som helst bioforlikelig polysakkarid som er tverrbindbart og løselig i et vandig medium. Betegnelsen "vannløselig" bør således tolkes i bred forstand, idet rent vann ikke nødvendigvis blir krevet. Det vil si at vandig løsning betyr hvilken som helst løsning hvori vann er hovedkomponenten. En foretrukket undergruppe av polysakkarider i forbindelse med denne oppfinnelse er imidlertid et glukosaminglukan, som hyaluronsyre er et spesielt interessant eksempel på.

Det tverrbindingsmiddel som skal anvendes i forbindelse med denne oppfinnelse, er hvilket som helst tidligere kjent tverrbindingsmiddel som er anvendelig i forbindelse med polysakkarider, idet det tas hensyn til å sikre at kravene til bioforiikelighet er tilfredsstilt. Fortrinnsvis velges imidlertid tverrbindingsmidlet fra gruppen bestående av aldehyder, epoksyder, polyaziridylforbindelser, glycidyletere og divinylsulfoner. Av disse representerer glycidyletere en spesielt foretrukket gruppe, hvorav 1,4-butandiol-diglycidyleter kan refereres til som et foretrukket eksempel. I denne forbindelse bør det også nevnes at "polyfunksjonell" skal inkludere difunksjonell.

Den initiale tverrbindingsreaksjon i nærvær av et polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel kan gjennomføres ved varierende pH-verdier, primært avhengig av hvorvidt eter- eller ester-reaksjoner skal befordres. Fortrinnsvis betyr dette at nevnte tverrbindingsreaksjon blir gjennomført ved en alkalisk pH, spesielt over pH 9, f.eks. i området pH 9-12, når eterdannelse skal befordres. Når esterdannelse skal befordres, blir nevnte tverrbindingsreaksjon fortrinnsvis gjennomført ved sur pH, spesielt ved pH 2-6.

Et interessant aspekt ifølge denne oppfinnelse representeres ved det tilfelle hvor den fremstilte tverrbundne polysakkaridgel-blanding blir anvendt slik at oppfinnelsen muliggjør fremstilling av en viskoelastisk blanding. En slik viskoelastisk blanding er f.eks. anvendelig ved øyekirurgi, som substitutt for synovialt fluid, som øyedråper osv., og som det er blitt referert til ovenfor kan den foreliggende oppfinnelse gjøre det mulig å skreddersy de viskoelastiske egenskaper for slike anvendelser. Ved anvendelse av den steriske teknologi ifølge den foreliggende oppfinnelse er det således mulig å oppnå kjedeforlengelser, kjedeforgreninger, tverrbindinger osv. på en mer kontrollert måte enn ved de tidligere anvendte teknikker med mer eller mindre vilkårlige koblingssteder.

Gjennom det faktum at gelene oppnådd ifølge denne oppfinnelse ikke vil beholde sitt originale volum i nærvær av et vandig medium, vil de nye produkter heller ikke forårsake noen interfererende eller negative volumeffekter i disse eller andre medisinske anvendelser.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse er det også mulig å inkludere i polysakkaridgel-blandingen hvilken som helst biologisk aktiv substans, for hvilken en polysakkaridgelbærer er ønsket eller akseptert. I denne sammenheng vil fortynningskonsentrasjonsteknikken anvendt i den krevede fremgangsmåte, muliggjøre inkludering av nevnte biologisk aktive substans før polysakkaridet blir underkastet sterisk uhindrede betingelser. Det vil si at selv om sterisk uhindrede betingelser vanligvis betyr en konsentreringsoperasjon, vil en slik operasjon bety at den biologisk aktive substans vil være tilstede i en fase som er mer kompakt enn når nevnte substans ble inkludert i nevnte bærer. Med andre ord kan den biologisk aktive substans beholdes mye lenger sammenlignet med tidligere kjente geltverrbindingsreaksjoner. Derved kan det oppnås en bedre forlenget frigivningsprofil for den aktive substans.

I forbindelse med inkorporering av den biologisk aktive substans i blandingen blir det fortrinnsvis gjennomført en justering av betingelsene til fysiologisk pH og saltbetingelser for å ha et preparat klart for medisinsk anvendelse. En slik fysiologisk justering blir foretrukket også med hensyn til reaksjonsbetingelsene, ettersom det andre trinn i fremgangsmåten er blitt funnet å foregå vel under slike betingelser.

Oppfinnelsen bør ikke begrenses på noen som helst måte med hensyn til den biologisk aktive substans sammenlignet med anvendelse av nevnte substans i tidligere tilfeller. Med andre ord bør den tilstand som skal behandles, være avgjørende for den spesifikke substans som skal utvelges.

Interessante substanser i forbindelse med denne oppfinnelse kan imidlertid velges fra gruppen bestående av hormoner, cytokiner, vaksiner, celler og vevsforsterkende substanser. Den unike kombinasjon av egenskaper for den nye gelblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse vil således gjøre den ekstremt fordelaktig i forbindelse med disse substanser, dvs. først og fremst takket være utmerkede depotegenskaper eller forlenget frigivningsegenskaper og ikke-svellende egenskaper.

En interessant gruppe av biologisk aktive substanser er således vevsforsterkende substanser ettersom en polysakkaridgel er en fordelaktig bærer for disse. Ytterligere detaljer vedrørende slike produkter kan finnes i W094/21299. Nærmere bestemt vil en foretrukket vevsforsterkende substans omfatte en polymer valgt fra collagen, stivelse, dekstranomer, polylaktid og kopolymerer derav, og poly-p-hydroksybutyrat og kopolymerer derav.

I forbindelse med hormoner vil erytropoietin og kalsitonin være spesielt foretrukket.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse vil også muliggjøre inkorporering av den biologisk aktive substans ved kjemisk reaksjon med polysakkaridgelstrukturen, eller tverrbindingsmidlet for denne, forutsatt at nevnte aktive substans inneholder funksjonelle grupper som er reaktive dermed. Unike egenskaper eller kombinasjoner av egenskaper kan derved oppnås som i et slikt tilfelle, f.eks. vil frigivningshastigheten av den aktive bestanddel bli bestemt ved nedbrytningen eller dekomponeringen av polymernettverket heller enn ved oppløsnings- eller migreringshastigheten for den refererte substans fra gelnettverket.

En modifisering av sistnevnte teknikk ifølge denne oppfinnelse betyr at de funksjonellse grupper av den aktive substans kan ha vært for-reagert med et tverrbindingsmiddel for polysakkaridet. Fortrinnsvis anvendes det samme tverrbindingsmiddel som er anvendt ved tverrbindingen av polysakkaridet.

Siden fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny polysakkaridgel-blanding eller struktur, blir et annet trekk ifølge denne oppfinnelse representert ved den nye fremstilte tverrbundne bioforlikelige polysakkaridgel-blandingen som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 1-22. Et ytterligere trekk ifølge foreliggende oppfinnelse er en delvis tverrbundet bioforligelig aktivert polysakkaridgel-blanding som oppnådd ved en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-22, kjennetegnet ved at den er oppnådd før fortsettelsen av tverrbindingen av det aktiverte polysakkarid ved gjeninnføring av nevnte sterisk uhindrede betingelser for tverrbindingsreaksjonen.

Uttrykt på en annen måte skal den foreliggende oppfinnelse også tilveiebringe en tverrbundet bioforlikelig polysakkaridgel-blanding som er oppnåelig ved tverr-binding av et tverrbindbart polysakkarid med et polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel for dette i to trinn, idet det første tverrbindingstrinn blir avsluttet før geleringen foregår, ved en sterisk hindring av tverrbindingsreaksjonen, og det andre tverrbindingstrinn blir initiert ved på nytt å innføre sterisk uhindrede betingelser for nevnte tverrbindingsreaksjon for å fortsette samme opp til en viskoelastisk gel.

Alle de trekk som er blitt presentert som foretrukne eller interessante trekk i forbindelse med den krevede fremgangsmåte er anvendbare også på nevnte polysakkaridgel-blanding perse og behøver ikke gjentas enda en gang.

Ytterligere et annet aspekt av denne oppfinnelse er representert ved det tilfelle hvor det oppnås et mellomprodukt ved å utsette sluttrinnet av tverrbindingsreaksjonen med sterisk uhindrede betingelser til et senere trinn eller sted, f.eks. ved den endelige anvendelse av blandingen. Det er således blitt funnet at mellomproduktet oppnådd etter den steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen har en slik stabilitet at avslutningen av tverrbindingsreaksjonen kan gjennomføres på et senere stadium.

Oppfinnelsen vedrører også blandingen definert ovenfor for anvendelse som en medisinsk eller profylaktisk blanding.

Et annet aspekt ifølge denne oppfinnelse er anvendelsen av nevnte blanding for fremstilling av en medisinsk eller profylaktisk blanding for hvilken som helst av de ovenfor nevnte spesifikke medisinske eller terapeutiske formål, idet vevsforsterkning og hormonbehandling av et pattedyr, spesielt et menneske, er foretrukne anvendelser.

EKSEMPLER

Oppfinnelsen skal nå eksemplifiseres ved følgende illustrerende eksempler.

EKSEMPEL 1

Aktivering av polymeren

a. Under alkaliske betingelser

Polysakkarid i form av 10 g hyaluronsyre fremstilt ved fermentering av Streptococcus ble løst i 100 ml av 1% NaOH pH >9. Tverrbindingsmiddel i form av 1,4-butandiol-diglycidyleter ble tilsatt til en konsentrasjon på 0,2%.

Løsningen ble inkubert ved 40°C i 4 timer.

b. Under sure betingelser

Eksperimentet ble gjennomført som i 1a, men ved sur pH på ca. 2-6 ved tilsetning av 1% eddiksyre til løsningen istedenfor NaOH ifølge 1a.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av en viskoelastisk gel

Inkubatene ifølge 1a og 1b ble fortynnet til et volum som var to ganger det volum som til slutt var ønsket, eller ca. 0,5-1% og ble nøytralisert. Gelen ble deretter rotasjonsinndampet til en viskoelastisk gel.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av en gel inneholdende dekstranomerpartikler

Inkubatene ifølge 1a og 1b ble fortynnet til en styrke på 1%, og 20 g tørre dekstranomerpartikler (Sephadex®25, Pharmacia) ble blandet med løsningen, idet partiklene ble omsluttet ved tverrbindingen av hyaluronsyrepolymer på noen få minutter som en konsekvens av konsentreringen av hyaluronsyre som er ledsaget av en vannabsorpsjon av dekstranomerperlene.

De oppnådde viskoelastiske geler var stabile, autospaltbare og injiserbare ved hjelp av tynne hypodermiske nåler.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av en gel for anvendelse som depotmedisin inneholdende erytropoietin (EPO)

Inkubatet oppnådd i eksempel 1a ble fortynnet til en styrke på 1%, og pH ble justert ved tilsetning av en citratbuffer ifølge produsentens instruksjoner (Ortho Biotech Inc., Raritan, USA) for god stabilitet i vandig løsning. 5 x 106 IU av EPO ble tilsatt under omrøring. Etter inndamping av løsningen til 1/4 av volumet var polymeren blitt tverrbundet til en depoblanding, og en mengde på 20 000 IU av EPO/ml ble gjenvunnet.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av en gel for anvendelse som depotpreparat inneholdende kalsitonin

Kalsitonin fra laks 100 lU/ml (Miacalcic® Sandoz) ble blandet sammen med 2% av polymerløsning fremstilt ifølge eksempel 1 b, og løsningen ble konsentert til 5% (250 IU/ml) ved rotasjonsinndamping. En hest med kronisk halting i høyre forben ble behandlet med en injeksjon på 2 ml s.c. pr. uke i løpet av to uker. I de seks følgende uker deretter var nevnte hest fri fra smerter. Serum-kalsiumnivået ble nedsatt med bare 12%.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av en gel inneholdende heparin for frigivning på forlenget måte

I en fortynnet aktivert polymer ifølge eksempel 4 ble heparin løst i en mengde på 5% av polymeren. Den oppnådde blanding ble ekvilibrert i 1 time, hvorpå den ble inndampet til 1/4 av volumet. En koagulasjonsinhiberende frigivning derav ble bemerket i løpet av 16 dagers inkubering i fysiologisk saltløsning.

EKSEMPEL 7

Fremstilling av en gel

med kovalent bundet heparin i en sterisk kontrollert stilling

Aktivert polymer ifølge eksempel 1 ble utfelt i metanol under kraftig omrøring. Den oppnådde fintrådede utfelling ble tørket i løpet av natten. Meparin ble aktivert ifølge eksempel 1. Etter nevnte inkubering (4 timer ved 40°C) ble polymerutfellingen blandet med den aktiverte heparinløsning. Blandingen ble inkubert i løpet av natten, og påfølgende dag ble gelløsningen nøytralisert, partikularisert og vasket fri for reaktantrester.

Den dannede gel var i stand til å binde vekstfaktor, bl.a. basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), men viste ingen som helst inhibering av koaguleringen av helblod.

EKSEMPEL 8

Fremstilling av en gel inneholdende positivt ladede grupper av kitosan

Inkubering av en blanding av 7,5 g hyaluronsyrepolymer og 2,.5 g kitosan (se Cure® Protan) ble gjennomført ifølge eksempel 1. Etter oppløsning og nøytralisering ble det oppnådd en kopolymerisert viskoelastisk løsning. Nevnte løsning hadde hel bred el sesbeford rende egenskaper etter å ha vært påført på et sår som var sent til og heles.

EKSEMPEL 9

Fremstilling av en gel som er blitt sterisk koblet

7,5 g hyaluronsyre ble aktivert ifølge eksempel 1a. På samme måte ble aktivert 2,5 g dekstran. Hyaluronsyren ble utfelt i metanol, og utfellingen ble deretter blandet med 500 ml av en fortynnet aktivert 0,5% dekstranløsning. Etter omrøring og justering av pH og saltkonsentrasjon ble det oppnådd en viskoelastisk løsning. 5 ml av nevnte løsning ble infusert i en Achilles-senekjede som gjentatt viste betennelse i form av sårhet og "knirking". Etter fire uker hadde nevnte Achilles-seneproblemer forsvunnet.

EKSEMPEL 10

Fremstilling av en gel for anvendelse som medisinsk depot inneholdende

GMCSF

Produktet ble fremstilt ifølge eksempel 5, men istedenfor kalsitonin ble tilsatt granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor, GMCSF (Leucomax®) 1 mg/g polymer.

EKSEMPEL 11

Fremstilling av gel inneholdende drepte virus type influensa A2

Fremstillingen ble gjennomført som i eksempel 4, men istedenfor EPO ble tilsatt 40 960 HAU drepte hest-influensavirus pr. 100 ml fortynnet aktiv 1 % polymerløsning. Etter konsentrering 4 ganger inneholdt preparatet 1600 HAU pr ml. Ved vaksinering av mer enn 100 hester i forbindelse med en epidemisk influensa ble preparatet funnet å være høyst effektivt med hensyn til beskyttelse mot infeksjon, og denne beskyttelse ble holdt i lang tid (mer enn 6måneder).

EKSEMPEL 12

Fremstilling av en frisk gel inneholdende en levende cellesuspensjon

En 5 ml fibroblastkultur ble blandet med 100 ml av en nøytralisert løsning ifølge eksempel 1a. Blandingen ble oksygenert og tørket til det halve volum. En viskoelastisk løsning inneholdende levende celler ble oppnådd.

EKSEMPEL 13

Fremstilling av en tykk mikronisert gel inneholdende små peptider

Til en aktivert nøytralisert gel ifølge eksempel 1 a ble tilsatt 5 ml av et peptid med 12 aminosyrer. Gelen ble inndampet under omrøring til 10% og ble oppslemmet i mineralolje. Etter tilsetning av metanol ble de tørre gelpartikler filtrert fra og vasket rene for oljerester.

EKSEMPEL 14

Fremstilling av en gel inneholdende den tykke mikroniserte gel med små peptider ifølge eksempel 13

Til en 1% løsning av nøytralisert polymer aktivert ifølge eksempel 1a ble tilsatt mikrokulene fra eksempel 13. Gelen ble deretter inndampet til halvparten av sitt volum. En homogen injiserbar og stabil gel inneholdende fint dispergerte mikrokuler ble dannet.

EKSEMPEL 15

Fremstilling av en gel innholdende sfæriske polymetylmetakrylat (PMMA) perler med en størrelse på 40 -120 nm

Til 5 g av en polymer fortynnet til 1% og nøytralisert og aktivert ifølge eksempel 1a ble tilsatt 100 mg av kuler av polymetylakrylat (PMMA). Inndamping til 3% polymergel ga en stabil injiserbar viskoelastisk gel.

EKSEMPEL 16

Fremstilling av en gel inneholdende PMMA-fragmenter på 500 nm og som var blitt tilsatt hydrofobt antigen

Hemagglutinin-antigen fremstilt fra A2-virus ifølge eksempel 11 ble absorbert ved hydrofob interaksjon på 500 nm PMMA-partikler. Nevnte partikler ble tilsatt til 1% løsning ifølge eksempel 15, og en reduksjon til halvparten av volumet ble gjennomført. Det ble dannet en stabil homogen viskoelastisk gel som var anvendelig som vaksine med høy adjuvanseffekt.

EKSEMPEL 17

En sammenligning mellom graden av resvelling ved fri tilgjengelighet av vann mellom konvensjonelt fremstilte geler og geler fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse

Hyaluronsyregeler fremstilt ifølge Laurent et al. 1963 og ifølge eksemplene 1 og 2 ovenfor ble tørket til halvparten av sine svellevolumer. Deretter ble de innført på nytt i sine opprinnelige løsninger. De tidligere kjente geler svellet til sitt opprinnelige volum, mens gelblandingene ifølge de foreliggende eksempler 1 og 2 svellet bare marginalt (10%).

EKSEMPEL 18

Sammenligning mellom biologisk aktivitet av EPO kopolymerisert med hyaluronsyre til en gel og gelen ifølge eksempel 1 hvori EPO var blitt innesluttet ved konsentrering av nevnte gel

Fire pasienter under behandling med Eprex® (CILAG) for sin anemi forårsaket av kronisk uremi ble behandlet i to måneder med en dose hver måned ifølge følgende regime:

Dosen ble valgt som den totale dose pr. måned som vanligvis ble krevet av pasienten for å opprettholde hemoglobinnivået. Serumnivået av EPO ble analysert med regulære mellomrom ved hjelp av en immunokjemisk metode.

RESULTATER

En vanlig fremgangsmåte til å uttrykke virkemåten av depotpreparater er å beregne kurvearealet {enheter av EPO x dager). Denne studie gir også bio-tilgjengeligheten i form av hemoglobinnivå i blod som 0 = opprettholdt, + = øket og

- = redusert.

KONKLUSJON

En inneslutting av EPO i et sammentrukket depot gir den høyest mulige frigivning under analysen. Forsøk på å gjennomføre geleringsreaksjonen i nærvær av EPO ødela hormonene, slik at det kunne registreres en svært lav frigivning.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en tverrbundet bioforlikelig polysakkaridgel-blanding, karakterisert ved: å danne en vandig løsning av et vannløselig, tverrbindbart polysakkarid; å initiere en tverrbinding av nevnte polysakkarid i nærvær av et polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel for dette; å sterisk hindre tverrbindingsreaksjonen fra å bli avsluttet før geleringen forekommer, slik at det derved oppnås et aktivert polysakkarid; og å innføre på nytt sterisk uhindrede betingelser for nevnte aktiverte polysakkarid for således å avslutte tverrbindingen derav opp til en viskoelastisk gel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polysakkaridet er valgt fra gruppen bestående av glukosaminglukaner.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte glukosaminglukan omfatter hyaluronsyre.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at tverrbindingsmidlet er valgt fra gruppen bestående av epoksyder, polyaziridylforbindelser og glycidyletere.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte glycidyletere omfatter 1,4-butandiol-diglycidyleter.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen omfatter fortynning av det vandige medium hvori tverrbindingsreaksjonen blir gjennomført, for å oppnå en lavere konsentrasjon av polysakkaridet i nevnte medium.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte innføring på nytt av sterisk uhindrede betingelser omfatter inndamping av det vandige medium hvori tverrbindingsreaksjonen blir gjennomført, for å oppnå en høyere konsentrasjon av polysakkaridet i nevnte medium.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -6, karakterisert ved at nevnte innføring på nytt av sterisk uhindrede betingelser omfatter dialysering av det vandige medium hvori tverrbindingsreaksjonen blir gjennomført.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den initiale tverrbindingsreaksjon i nærvær av et polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel blir gjennomført ved en alkalisk pH, slik at eter-tverrbindingsreaksjoner derved blir befordret.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte alkaliske pH er over pH 9.

11. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -8, karakterisert ved at den initiale tverrbindingsreaksjon i nærvær av et polyfunksjonelt tverrbindingsmiddel blir gjennomført ved sur pH, slik at ester-tverrbindingsreaksjoner derved blir befordret.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte sure pH er pH 2-6.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at nevnte steriske hindring av tverrbindingsreaksjonen blir gjennomført før nevnte tverrbindingsmiddel er blitt forbrukt.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at en biologisk aktiv substans er innesluttet inne i den tverrbundne polysakkaridgel-blanding under fremstillingen derav.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte biologiske substans er innesluttet ved fysiologisk pH og saltkonsentrasjons-betingelser.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 og 15, karakterisert ved at nevnte aktive substans er innesluttet inne i gelblandingen ved å løse eller dispergere samme i nevnte aktiverte polysakkarid før sistnevnte polysakkarid blir underkastet sterisk uhindrede betingelser.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 14-16, karakterisert ved at nevnte biologisk aktive substans er valgt fra gruppen bestående av hormoner, cytokiner, vaksiner, celle- og vevsforsterkende substanser.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte vevsforsterkende substans omfatter en polymer valgt fra kollagen, stivelse, dekstranomer, polylaktid og kopolymerer derav, og poly-B-hydroksybutyrat og kopolymerer derav.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte hormon er valgt fra gruppen bestående av erytropoietin og kalsitonin.

20. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 14-19, karakterisert ved at nevnte biologiske aktive substans inneholder funksjonelle grupper som er reaktive med polysakkaridet og er innesluttet inne i gelstrukturen ved kjemisk reaksjon med denne.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte biologisk aktive substans inneholdende funksjonelle grupper er blitt reagert på forhånd med et tverrbindingsmiddel for nevnte polysakkarid.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at nevnte tverrbindingsmiddel er det samme tverrbindingsmiddel som er anvendt ved tverrbindingen av polysakkaridet.

23. Tverrbundet bioforlikelig polysakkaridgelblanding, karakterisert ved at den er fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-22.

24. Delvis tverrbundet bioforlikelig aktivert polysakkaridgel-blanding som oppnådd ved en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 -22, karakterisert ved at den er oppnådd før fortsettelsen av tverrbindingen av det aktiverte polysakkarid ved gjeninnføring av nevnte sterisk uhindrede betingelser for tverrbindingsreaksjonen.

25. Blanding ifølge krav 23, for anvendelse som en medisinsk eller profylaktisk blanding.

26. Blanding ifølge krav 25, karakterisert ved at den er tilpasset som et depotpreparat.

27. Anvendelse av en blanding ifølge krav 23, for fremstilling av en medisinsk eller profylaktisk blanding for vevsforsterkning hos et pattedyr, spesielt hos et menneske.

28. Anvendelse ifølge krav 27, for fremstilling av en medisinsk eller profylaktisk depotblanding, spesielt for hormon-behandling av et pattedyr, spesielt av et menneske.