WO2020009555A1 - 높은 점탄성 및 응집성을 동시에 갖는 히알루론산 필러 - Google Patents

높은 점탄성 및 응집성을 동시에 갖는 히알루론산 필러 Download PDF

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이충
김구연
김지선
정현태
이창현
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이화연
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Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid filler, and more particularly, to a hyaluronic acid filler having a high cohesion and a high elasticity of a bi-facial hyaluronic acid filler and a method for preparing the same. It is about.
  • tissue of human skin is maintained by extracellular matrix including proteins such as collagen and elastin and glycosaminoglycans.
  • soft tissue Tissue enhancers such as enhancers
  • Such augmentation may be performed surgically through plastic surgery, or by injecting biological tissue or synthetic polymer chemicals into the corresponding site to increase and expand the volume of soft tissue, thereby restoring and correcting its shape in a non-surgical manner.
  • it is similar to skin tissue and is inserted into specific area to expand soft tissue to expand the volume of cheeks, lips, chest, hips, etc. cosmetically, and it is used for wrinkle improvement or contour correction through reduction of fine wrinkles and deep wrinkles of skin.
  • the resulting material is called soft tissue augmentation material and is commonly called dermal filler.
  • dermal filler The first generation of dermal fillers developed in connection with these fillers is Cosdom, which uses Zyderm, Zyplast and human collagen, which are derived from animals, that is, extracted from animal proteins such as cows and pigs. There are products such as (Cosmoderm) or Cosmoplast, but they have been rarely performed recently because of the short duration of the effect and the hassle of performing skin sensitization tests one month before the procedure.
  • the second generation filler is a hyaluronic acid (also referred to as 'HA') filler, which is composed of polysaccharides N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid, which are longer in duration than collagen fillers and are similar to human components. Less side effects such as reaction, easy to procedure and removal, it is possible to maintain the skin moisture, volume and elasticity by attracting water has suitable advantages as a filler for skin.
  • 'HA' hyaluronic acid
  • hyaluronic acid itself has a short half-life of only a few hours in the human body, which has a limitation in application, and studies have been conducted to increase half-life (persistence in the body) through crosslinking.
  • US Pat. No. 4,582,865 discloses a hyaluronic acid derivative crosslinked using divinylsulfone (DVS) as a crosslinking agent, its hydrogel form being marketed under the trade name Hylaform®, and US Pat. No. 5,827,937 are multifunctional.
  • DVDS divinylsulfone
  • a method for preparing a hyaluronic derivative crosslinked product using an epoxy compound as a crosslinking agent is disclosed, and a hyaluronic acid crosslinked product prepared by using 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) as a crosslinking agent is a multifunctional epoxy compound.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • Restylane® in the form of a hydrogel, is approved worldwide by the US FDA and is available worldwide as a filler for tissue enhancement.
  • Such crosslinked hyaluronic acid fillers include fillers made of a single phase (monophasic HA fillers) and isomers made of biphasic HA fillers (biphasic HA fillers). Since monophasic hyaluronic acid fillers are prepared using a homogeneous liquid containing crosslinked hyaluronic acid, they generally have low elasticity and high cohesion. Accordingly, when the mono-facial hyaluronic acid filler is injected into the skin, it is unlikely to deviate from the injected site, but it does not maintain the injected form for a long time and the shape retention period is only about 2 months after the procedure. have.
  • Bi-phase hyaluronic acid fillers are generally made of crosslinked hyaluronic acid particles alone or by mixing a non-crosslinked non-crosslinked hyaluronic acid (untreated non-crosslinked hyaluronic acid, linear HA), and thus generally have high elasticity and cohesion. Is low. Accordingly, when the biphasic HA filler is injected into the skin, it may maintain its shape for a long time, but there is a high possibility of leaving the injected site.
  • a representative example of such a biphasic HA filler is the aforementioned Restylane® from Galderma.
  • the mono-faced HA filler and the bi-faced HA filler have advantages and disadvantages, respectively.
  • An example in which the fillers are mixed to have all the characteristics of the conventional mono-faced hyaluronic acid filler and bi-facet hyaluronic acid filler In this case, however, the advantages of the mono-phase hyaluronic acid filler and the bi-phase hyaluronic acid filler are both reduced and are not suitable as a filler. Therefore, there is a need for a filler that can maintain a long shape while having a low possibility of leaving the injected site.
  • the present invention has been proposed to solve the above problems, and the advantages of the mono- and HA-filled fillers, that is, a filler having both high viscoelasticity and cohesiveness; It is an object of the present invention to provide a filler that can be maintained and injected into human skin and can be used for wrinkle improvement and shape formation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing such a filler.
  • the present inventors have been devised to solve the above problems of the prior art, and when the hyaluronic acid meets the conditions such as specific molecular weight and degree of crosslinking, the high cohesiveness of the monophasic filler and the high viscoelasticity of the biphasic filler are simultaneously.
  • the present invention was completed by confirming that it can be easily made into a desired form when injected into the skin and can be maintained for a desired period.
  • the present invention is a hyaluronic acid filler having high viscoelasticity and cohesive force, which exhibits both the characteristics of the mono and bi phase fillers, the prefilled syringes filled with the fillers, and the number of tissues including the fillers.
  • a dose biomaterial and a method for tissue repair or wrinkle improvement comprising injecting the same into a living tissue.
  • Hyaluronic acid included in the filler of the present invention is a biopolymer material in which repeating units composed of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are linearly connected, It is widely used in fluids, joint synovial fluid, chicken crest, etc., and has excellent biocompatibility, so it is widely used in medical and medical applications such as ophthalmic surgical aids, joint function improving agents, drug delivery substances, eye drops, and antiwrinkle agents. .
  • hyaluronic acid included in the filler of the present invention may mean a salt thereof in addition to hyaluronic acid.
  • the salt of hyaluronic acid includes, for example, both inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate and cobalt hyaluronic acid, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronic acid.
  • inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate and cobalt hyaluronic acid
  • organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronic acid.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the hyaluronic acid or a salt thereof may be crosslinked by a suitable crosslinking agent.
  • the crosslinked hyaluronic acid derivative may be prepared by crosslinking the hyaluronic acid itself or a salt thereof using a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent In order to bridge
  • the aqueous alkali solution may be NaOH, KOH, preferably NaOH aqueous solution, but is not limited thereto. In this case, NaOH aqueous solution may be used in a concentration of 0.1N to 0.5N.
  • the crosslinked hyaluronic acid included in the filler of the present invention exhibits high viscoelasticity and cohesiveness even with low concentrations and small amounts of crosslinking agents.
  • the concentration of the crosslinking agent may be 1 to 10 mol% relative to 1 mol of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid, which are unit units in the hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the crosslinking agent may be varied as a compound including two or more epoxy functional groups, and preferred examples thereof include butanediol diglycidyl ether (BDDE) and ethylene glycol diglycidyl (ethylene glycol diglycidyl).
  • ether EGDGE
  • hexanediol diglycidyl ether (1,6-hexanediol diglycidyl ether)
  • propylene glycol diglycidyl ether polypropylene glycol diglycidyl ether
  • the term "Degree of modification” refers to N-acetyl- in the unit unit of hyaluronic acid included in the polymer hyaluronic acid (N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) + D-glucuronic acid). It means the degree of crosslinking calculated by the numerical value (n) indicating the number of moles of the crosslinking agent (for example, BDDE) that is bound to the entire hyaluronic acid molecule relative to the number of moles of D-glucosamine, and can be represented by Equation 1 below. .
  • such a strain is characterized by exhibiting a range of 1 to 7, preferably 3 to 5, through crosslinking with such a crosslinking agent.
  • crosslinking ratio refers to the mole ratio of the crosslinked crosslinking agent to the number of moles of the total crosslinking agent, and may be represented by Equation 2 below.
  • the present invention in particular, it is characterized by showing a range of 0.1 to 0.2, preferably 0.14 to 0.17 through crosslinking.
  • the hyaluronic acid filler according to the present invention has the MOD and CrR ranges so that the properties of the mono- and bi-phase fillers can be synergistically exhibited simultaneously.
  • the molecular weight of the crosslinked hyaluronic acid may be 2,500,000 Da or more, preferably 2,500,000 to 3,500,000 Da.
  • the term elasticity means a property as a solid when a force is applied to an object, that is, a shape changes when a force is applied, but a property returns to its original shape when the force is removed.
  • This elasticity is represented by a storage modulus (G '), and the unit is Pascal (Pa).
  • the term viscosity as used herein, also means the appearance of a flow with viscosity that is a liquid, that is, resistance to flow. This viscosity can be expressed as loss modulus (G "), and the unit is Pascal (Pa).
  • viscoelasticity used in the present invention means that the elastic deformation and viscosity at the same time when the force is applied to the object, the crosslinked hyaluronic acid hydrogel included in the filler such as the present invention All of them are elastic and viscoelastic. This viscoelasticity can be evaluated as a complex viscosity that can reflect both storage modulus (G ') and loss modulus (G "), and the unit is centipoise (cP).
  • cohesivity used in the present invention is an attractive force (adhesive force) that is acting between the filler particles, thereby causing the filler particles to aggregate.
  • the cohesion force can be measured indirectly by compression test, and the resistance force during compression is measured at a constant speed after loading on a rheometer.
  • the unit is gf (gram force).
  • monophasic hyaluronic acid fillers exhibit a cohesive gel form (Cohesive gel) has a high cohesion but low viscoelasticity.
  • An example is Allergan's Juvederm®.
  • the biphasic type hyaluronic acid filler exhibits a particle form and has high viscoelasticity but low cohesive force.
  • Galderma's Restyane® An example of this is Galderma's Restyane®.
  • the hyaluronic acid filler in the form of a mono paper and the hyaluronic acid filler in the form of a bi-face have their advantages and disadvantages.
  • the hyaluronic acid filler according to the present invention is characterized by having high viscoelasticity and cohesiveness, thereby simultaneously having the characteristics of the mono phase filler and the bi phase filler.
  • the hyaluronic acid filler according to the present invention exhibits a complex viscosity (viscoelasticity) of at least 6 ⁇ 10 4 , preferably 60,000 to 130,000 cP at an angular velocity of 1 Hz as measured by a Rheometer, and is at least 400 Pa, preferably 400 to The storage modulus G 'of 800 Pa is shown, and the cohesive force of 30 gf or more, preferably 30 to 60 gf is shown.
  • the hyaluronic acid particles preferably cross-linked hyaluronic acid particles in the hyaluronic acid filler according to the present invention may exhibit a variety of shapes, but may preferably have a spherical shape.
  • the average diameter of such particles may be 300 to 400 ⁇ m.
  • the hyaluronic acid filler according to the invention may comprise 1 to 3% by weight of hyaluronic acid relative to the total filler weight.
  • the hyaluronic acid filler according to the present invention may further include water, anesthetics or a combination thereof as well as the hyaluronic acid.
  • the anesthetic agent includes one or more anesthetics, preferably local anesthetics, known in the art, and the concentration of one or more such anesthetics is an amount effective to alleviate the pain experienced upon injection of the composition.
  • anesthetics include ambucaine, amalanone, amylocaine, amylocaine, benoxinate, benzocaine, benzocaine, beoxycaine, and biphenamine.
  • the concentration of the anesthetic agent included in the filler may be about 0.1% to about 1.0% by weight, for example, about 0.2% to about 0.5% by weight of the composition. have.
  • concentrations of anesthetics in the fillers described herein can be therapeutically effective, meaning those concentrations that are suitable to provide advantages in terms of ease of procedure and patient compliance without being harmful to the patient.
  • the filler according to the present invention may further include a buffer, and the buffer may be used without limitation as long as it is used in the preparation of the hyaluronic acid hydrogel.
  • buffers are citric acid, sodium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, acetic acid, diethyl barbituric acid, sodium acetate, TAPS (tris (hydroxymethyl) methylamino) propane Sulfonic acid), Bicine (2-bis (2-hydroxyethyl) amino) acetic acid), Tris (tris (hydroxymethyl) ammoniummethane), Tricine (N- (2-hydroxy-1,1-bis (hydroxy) Methyl) ethyl) glycine), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), TES (2-[[1,3-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) propane- 2-yl] amino] methanesulfonic acid) and PIPES (piperazin
  • the filler according to the present invention may further include an isotonic agent, and this isotonic agent may be used without limitation as long as it is used in the preparation of hyaluronic acid hydrogel, and may be included in a buffer.
  • an isotonic agent sodium chloride may be used, but is not limited thereto.
  • the content of the tonicity agent may be appropriately adjusted as necessary, and may include, for example, 7.0 to 9.0 g / L with respect to the buffer, but is not limited thereto.
  • a buffer containing sodium chloride, sodium dihydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate in the water for injection was used.
  • composition according to the present invention may further comprise, in addition to the above ingredients, acceptable ingredients that may be included in the preparation of the filler.
  • the present invention is characterized in that almost no residual crosslinking agent in the hyaluronic acid filler having high viscoelasticity and cohesiveness is included and the residual crosslinking agent is preferably 0.5 ppm or less, which is a detection limit.
  • the high viscoelasticity and cohesive hyaluronic acid filler according to the present invention can be very useful for cosmetic or therapeutic purposes by this characteristic elastic property, cohesive force.
  • a hyaluronic acid filler is a biomaterial for tissue repair, wrinkle filling through filling of biological tissue, filling wrinkles, remodeling of the face or lips, nose It may be used to repair or increase the volume of soft tissues such as, hips, cheeks or chest.
  • the hyaluronic acid filler may be administered in a dosage form suitable for this use, and may preferably be an injection.
  • the present invention relates to a method for preparing a hyaluronic acid filler having such high viscoelasticity and cohesiveness, comprising the following steps:
  • step (b) grinding the hyaluronic acid hydrogel prepared in step (a);
  • step (d) washing and swelling the pulverized hyaluronic acid hydrogel prepared in step (b) using the buffer prepared in step (c);
  • step (e) milling the hyaluronic acid hydrogel washed and swollen in step (d);
  • step (f) sterilizing after filling the syringe with the hydrogel prepared in step (e).
  • the step (a) is a step of crosslinking the hyaluronic acid or a salt thereof in an aqueous alkali solution using a crosslinking agent to prepare a crosslinked hyaluronic acid hydrogel, the hyaluronic acid or a salt thereof, a crosslinking agent, a crosslinked hyaluronic acid hydro
  • a crosslinking agent to prepare a crosslinked hyaluronic acid hydrogel, the hyaluronic acid or a salt thereof, a crosslinking agent, a crosslinked hyaluronic acid hydro
  • the aqueous alkali solution can be used without limitation, known as an aqueous alkali solution for preparing a hyaluronic acid hydrogel, for example, may be NaOH, KOH, NaHCO 3 , LiOH or a combination thereof, preferably NaOH.
  • the concentration of the aqueous alkali solution may be 0.1 to 0.5N, but is not limited thereto. Most preferably 0.25N.
  • the hyaluronic acid hydrogel of the filler according to the present invention was confirmed to have the best physical properties after crosslinking under 0.25N NaOH basicity.
  • the concentration of hyaluronic acid or salts thereof is 10 to 25% by weight as the weight ratio of hyaluronic acid or salts thereof to the total weight of hyaluronic acid or salts and alkaline aqueous solution mixture
  • the concentration of the crosslinking agent is unit unit 1 of the hyaluronic acid or salt thereof added. 1 to 10 mol% relative to mole.
  • the step (a) may be performed by mixing, stirring and homogeneously mixing hyaluronic acid or a salt thereof with a crosslinking agent and an aqueous alkali solution.
  • the temperature at the time of the crosslinking reaction may be carried out at room temperature or higher, preferably 25 to 40 ° C. for 15 to 22 hours.
  • the grinding process of step (b) may use a variety of known grinding process of hyaluronic acid hydrogel.
  • the crosslinked gel prepared after the reaction can be obtained in the form of a cake, and this can be divided into half moon shape using a cutter such as small bean or the like, for example, divided into six. Thereafter, using a coarse grinder having a constant blade spacing may be passed through the gel divided as described above (preferably two or more times) to perform the grinding process.
  • Step (c) is to prepare a buffer used for washing and swelling the crosslinked hyaluronic acid hydrogel pulverized in step (b),
  • the buffer can be prepared according to known buffer preparation methods.
  • the buffer may further include an anesthetic.
  • the buffer was prepared by dissolving sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate hydrate, sodium chloride and lidocaine hydrochloride in a buffer tank containing water for injection.
  • the buffer may be used without limitation as long as it is used for the preparation of hyaluronic acid hydrogel.
  • preferred buffers are citric acid, sodium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, acetic acid, diethyl barbituric acid, sodium acetate, TAPS (tris (hydroxymethyl) methylamino) propane Sulfonic acid), Bicine (2-bis (2-hydroxyethyl) amino) acetic acid), Tris (tris (hydroxymethyl) ammoniummethane), Tricine (N- (2-hydroxy-1,1-bis (hydroxy) Methyl) ethyl) glycine), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), TES (2-[[1,3-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) propane- 2-yl] amino] methanesulfonic acid) and PIPES (piperazin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) include but
  • step (d) is the step of washing and swelling the crosslinked hyaluronic acid hydrogel pulverized in step (b) with the buffer prepared in step (c), which step (d) is repeated one or more times May be Once the washing and swelling are complete, the wash liquor can be removed.
  • Step (e) is a step of pulverizing the washed and swollen hydrogel, and this pulverization may be performed by various grinding methods, but preferably, extrusion grinding.
  • a known filling and sterilization method may be used to fill and sterilize the hydrogel prepared after step (e) in a syringe.
  • a known filling and sterilization method may be used to fill and sterilize the hydrogel prepared after step (e) in a syringe.
  • an autoclave or the like may be used, but the present invention is not limited thereto, and a method used for sterilization of the filler may be appropriately selected and used.
  • the filler according to the present invention has the following effects.
  • the filler having the advantages of both mono-facet hyaluronic acid fillers and bi-facet hyaluronic acid fillers, that is, high viscoelasticity and cohesiveness, it is possible to maintain the shape for a long time with a low possibility of escape from the injected site, cheeks, lips, It may be useful as a filler for improving wrinkles or contouring by enlarging the repair or volume of soft tissues such as breasts, hips, etc., and reducing fine lines and deep wrinkles of the skin.
  • Sodium hyaluronate, sodium hydroxide, BDDE (1,4-Butandiol Diglycidyl Ether) having a molecular weight of 2.5MDa to 3.5MDa were weighed.
  • the concentration of sodium hyaluronate was 15 wt%
  • the mol% of BDDE was 4 mol% relative to 1 mol of sodium hyaluronate unit unit (ie, N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid).
  • NaOH sodium hydroxide
  • the weighed sodium hyaluronate, 0.25N sodium hydroxide solution and BDDE (1,4-Butandiol Diglycidyl Ether) were mixed in a mixer barrel and mixed homogeneously, and the mixer barrel was placed in a constant temperature water bath at a temperature of 30 ° C. overnight. Complete the crosslinking reaction. Thereafter, the crosslinked hyaluronic acid hydrogel was pulverized.
  • the salt and anesthetics were injected into the water at the concentration of 1.26 g / L sodium monohydrogen phosphate (deuthydrate), 0.46 g / L sodium dihydrogen phosphate monohydrate (monohydrate), 7 g / L sodium chloride, and 3 g / L lidocaine hydrochloride.
  • a buffer solution was prepared by dissolving in a buffer tank.
  • Some of the buffer solution as a primary buffer solution was transferred to a washing tank (Washing Tank) through a 0.22 ⁇ m filter, and the previously prepared coarsely pulverized hyaluronic acid gel was transferred to a washing tank containing the primary buffer solution and stirred.
  • the hyaluronic acid gel was first washed and swelled and then the rinsing liquid was removed when the swelling was completed.
  • the secondary buffer solution was transferred to a washing tank through a 0.22 ⁇ m filter, followed by stirring to secondary wash and swell the hyaluronic acid gel. The washing solution was removed when the washing and swelling were completed.
  • the third buffer solution was transferred to a washing tank through a suitable 0.22 ⁇ m filter, followed by stirring to wash and swell the hyaluronic acid gel in a tertiary manner, and the washing solution was removed as the washing and swelling were completed.
  • the hyaluronic acid gel was crushed and transferred to an extruder tank to weigh the gel to reach the target weight. Buffer solution was added to the primary content correction. After completion of the first content correction, the hyaluronic acid gel was extruded and ground in an extruder tank. Thereafter, the pulverized hyaluronic acid gel was transferred to a sterile tank and homogenized, and then the content was measured and a second solution was performed by adding a buffer solution. The hyaluronic acid gel, the content correction of which has been completed, was heat-treated at a temperature of 121 ° C.
  • degassing was carried out by stirring the hyaluronic acid gel under reduced pressure before filling it. After that, the hyaluronic acid gel was vacuum-filled to each syringe by a predetermined filling amount, and at the same time, rubber-stopping was performed in a rubber field. The filled syringe was steam sterilized for at least 8 minutes at a temperature of 121 ° C. or higher in the final sterilizer.
  • Sodium hyaluronate, sodium hydroxide, BDDE (1,4-Butandiol Diglycidyl Ether) having a molecular weight of 2.5MDa to 3.5MDa were weighed.
  • the concentration of sodium hyaluronate was 16wt%, and the mol% of BDDE was 4mol% compared to 1 mol of sodium hyaluronate unit unit.
  • an aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) at 0.25 N concentration was prepared and filtered.
  • the weighed sodium hyaluronate, 0.25N aqueous sodium hydroxide solution and BDDE (1,4-Butandiol Diglycidyl Ether) were mixed in a mixer barrel and mixed homogeneously, and the mixer barrel was placed in a constant temperature water bath at 30 ° C. overnight. Complete the crosslinking reaction. Thereafter, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel was pulverized.
  • the salt and anesthetics were injected into the water at the concentration of 1.26 g / L sodium monohydrogen phosphate (deuthydrate), 0.46 g / L sodium dihydrogen phosphate monohydrate (monohydrate), 7 g / L sodium chloride, and 3 g / L lidocaine hydrochloride.
  • a buffer solution was prepared by dissolving in a buffer tank.
  • Some of the buffer solution as a primary buffer solution was transferred to a washing tank (Washing Tank) through a 0.22 ⁇ m filter, and the previously prepared coarsely pulverized hyaluronic acid gel was transferred to a washing tank containing the primary buffer solution and stirred.
  • the hyaluronic acid gel was first washed and swelled and then the rinsing liquid was removed when the swelling was completed.
  • the secondary buffer solution was transferred to a washing tank through a 0.22 ⁇ m filter, followed by stirring to secondary wash and swell the hyaluronic acid gel.
  • the washing solution was removed when the washing and swelling were completed.
  • the third buffer solution was transferred to a washing tank through a suitable 0.22 ⁇ m filter, followed by stirring to wash and swell the hyaluronic acid gel in a third manner, and the washing solution was removed as the washing and swelling were completed.
  • the hyaluronic acid gel was pulverized and transferred to an extruder tank to weigh the gel to reach the target weight. Buffer solution was added to the primary content correction. After completion of the first content correction, the hyaluronic acid gel was extruded and ground in an extruder tank. Thereafter, the pulverized hyaluronic acid gel was transferred to a sterile tank, homogenized, and then the content was measured and a second solution was performed by adding a buffer solution. The hyaluronic acid gel, the content correction of which was completed, was heat-treated at a temperature of 121 ° C.
  • degassing was performed by stirring the hyaluronic acid gel under reduced pressure before charging it. Thereafter, the hyaluronic acid gel was vacuum-filled to each syringe by a predetermined amount of charge, and then, in a rubber field, the gel was stoppered. The filled syringe was steam sterilized for 10 minutes or more at a temperature of 121 ° C. or higher in the final sterilizer.
  • Examples 1 and 2 were analyzed using a rheometer (rheometer).
  • rheometer rheometer
  • viscoelastic properties of commercially available filler formulations were also analyzed and compared.
  • the commercially available filler formulation and analysis conditions are as follows.
  • Test equipment Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
  • Test Equipment Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
  • Table 1 shows the results of storage elastic modulus (G '), complex viscosity ( ⁇ *), and compression force (Compression force) for each frequency under the above analysis conditions.
  • Examples 1 and 2 according to the present invention is determined to exhibit excellent viscoelasticity compared to Comparative Examples 1 to 6. Furthermore, in the case of the cohesiveness, despite the characteristics of the monophasic filler and the biphasic filler at the same time, it exhibits excellent compression resistance when compared to Comparative Examples 5 and 6, which are monophasic fillers. Further, considering both viscoelasticity and cohesiveness, it can be seen that Examples 1 and 2 according to the present invention exhibit excellent physical properties compared to Comparative Examples 1 to 6.
  • Test equipment Laser diffraction particle size analyzer (Malvern Ltd., Mastersizer 3000)
  • Test equipment FT-NMR System (Jeol Ltd., ECA500 / ECZ400S),
  • the hyaluronic acid fillers of Examples 1 and 2 according to the present invention can be seen to exhibit a low strain despite the excellent physical properties as confirmed above, that is, when preparing the filler Even if a small amount of crosslinking agent is used, it is possible to provide a filler exhibiting excellent physical properties, which means that it is very biocompatible.

Abstract

본 발명에 따른 히알루론산 필러는 개선된 높은 점탄성적 유동 특성을 나타내어, 모노 페이직 히알루론산 필러와 바이 페이직 히알루론산 필러의 장점을 함께 가지므로 피부에 주입시 이동 가능성이 낮으면서도 형태를 오래 유지하여, 주름개선, 볼, 가슴, 코, 입술 및 엉덩이 등과 같은 연조직의 수복 또는 부피를 확대시키고, 윤곽 교정에 사용시 탁월하며, 제조 과정에서 가교제를 작게 사용하더라도 인체 내 지속시간이 증가되고 부작용이 작다.

Description

높은 점탄성 및 응집성을 동시에 갖는 히알루론산 필러
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2018년 7월 6일자 한국특허출원 제 10-2018-0078989호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 히알루론산 필러에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 모노 페이직 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 필러의 높은 응집성과 바이 페이직 히알루론산 필러의 높은 탄성을 동시에 갖춘 히알루론산 필러 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인체 피부의 조직은 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질과 글리코스아미노글리칸을 포함하는 세포외기질에 의해 그 구조를 유지하고 있는데, 외부의 충격, 질병 또는 노화 등에 의한 연조직의 결손이 발생하는 경우, 연조직 증강과 같은 조직 증강을 의학 및 미용 목적으로 사용하여 왔다. 이러한 증강은 성형수술을 통해 외과적으로 이루어지거나, 해당 부위에 생체 조직이나 합성 고분자 화학물질을 주입하여 연조직의 부피를 증대, 확장함으로써 비외과적인 방법으로 그 형태를 복원, 교정하여 왔다. 이때 피부조직과 유사한 성분으로 특정부위에 삽입되어 연부조직을 확장시킴으로써 미용상으로 볼, 입술, 가슴, 엉덩이 등의 부피를 확대시키고, 피부의 잔주름 및 깊은 주름의 감소를 통한 주름개선이나 윤곽교정 등에 사용되는 물질을 연부조직 확장제(soft tissue augmentation material)라 하는데 일반적으로 피부용 필러(dermal filler)라고 한다. 이러한 필러와 관련하여 최초로 개발된 1세대 피부용 필러로는 동물 유래, 즉, 소나 돼지 등의 동물성 단백질을 추출하여 제조한 자이덤(Zyderm), 자이플라스트(Zyplast)와 인체 콜라겐을 사용하는 코스모덤(Cosmoderm) 또는 코스모플라스트(Cosmoplast) 등의 제품이 있으나, 효과의 지속시간이 짧고 시술 한달 전에 피부과민반응검사를 해야 하는 번거로움 때문에 최근에는 거의 시술되고 있지 않다.
2세대 필러는 히알루론산(이하, 'HA'라고도 함) 필러로 콜라겐 필러보다 효과 지속시간이 길고 인체구성성분과 유사한 다당류인 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 피부과민반응 등의 부작용이 적고, 시술 및 제거가 용이하며, 물을 끌어당겨 피부 수분 유지, 볼륨 및 탄력성 유지가 가능하여 피부용 필러로서 적합한 장점을 갖는다.
그러나, 히알루론산 그 자체는 인체 내에서 수 시간에 불과한 짧은 반감기를 나타내어 적용에 한계가 있어, 가교 결합을 통해 반감기(체내 지속성)를 증대시키려는 연구가 진행되어 왔다. 예컨대, 미국 특허 제4,582,865호는 디비닐술폰(DVS)을 가교제로 사용하여 가교된 히알루론산 유도체를 개시하고 있으며, 이의 하이드로겔 형태가 Hylaform®이라는 상품명으로 시판되고 있고, 미국특허 제5,827,937호는 다기능에폭시화합물을 가교제로 사용하여 히알루론 유도체 가교물을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 이중 다기능에폭시화합물로서 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)를 가교제로 사용하여 제조한 히알루론산 가교물의 하이드로겔 형태인 Restylane®은 미국 FDA의 승인을 받아 조직증강용 충전제로서 세계적으로 시판되고 있다.
이와 같은 가교된 히알루론산 필러에는 단일상으로 만들어진 필러(모노 페이직 HA 필러, monophasic HA filler)와, 이성상으로 만들어진 필러(바이 페이직 HA 필러, biphasic HA filler)가 있다. 모노페이직 히알루론산 필러는 가교된 히알루론산을 포함하는 균질액을 사용하여 제조되므로, 일반적으로 탄성도가 낮고 응집력이 높다. 이에 따라, 모노 페이직 히알루론산 필러는 피부에 주입될 경우, 주입된 부위에서 이탈할 가능성은 낮으나 주입된 형태를 오래 유지하지 못하고 모양(형태) 유지 기간이 시술 후 2개월 정도에 불과하다는 문제점이 있다.
바이 페이직 히알루론산 필러는 가교된 히알루론산 입자체를 단독으로 또는 액상에 가까운 비가교된 히알루론산(미처리 비가교 결합된 히알루론산, linear HA)를 혼합하여 제조하므로, 일반적으로 탄성도가 높고 응집력이 낮다. 이에 따라, 바이 페이직 HA 필러는 피부에 주입될 경우, 형태를 오래 유지할 수 있지만 주입된 부위에서 이탈할 가능성이 높다는 문제점이 있다. 이러한 바이 페이직 HA 필러의 대표적인 예가 상기 언급한 레스틸렌(Restylane®, 갈더마사 제품)이다.
이와 같이, 모노 페이직 HA 필러와 바이 페이직 HA 필러는 각각 장, 단점을 갖고 있는데, 종래 모노 페이직 히알루론산 필러와 바이 페이직 히알루론산 필러의 특성을 모두 가질 수 있도록 상기 필러들을 혼합한 예가 존재하나, 이와 같은 경우 오히려 모노 페이직 히알루론산 필러 및 바이 페이직 히알루론산 필러의 장점이 모두 동반하여 감소하여 필러로서 적절하지 않다. 따라서, 주입된 부위에서 이탈할 가능성이 낮으면서도 형태를 오래 유지할 수 있는 필러가 필요한 실정이다.
본 발명은 상기 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 모노 페이직 HA 필러와 바이 페이직 HA 필러의 장점으로 높은 점탄성 및 응집성을 모두 갖는 필러 즉, 주입된 부위에서 이탈할 가능성이 낮으면서도 형태를 오래 유지할 수 있고, 인체 피부에 주입되어 주름 개선 및 모양 형성에 사용될 수 있는 필러를 제공하고자 하는 목적을 갖고 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 필러를 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 출원인은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 히알루론산이 특정 분자량 및 가교도 등의 조건을 만족하는 경우 모노 페이직 필러의 높은 응집력과 바이 페이직 필러의 높은 점탄성을 동시에 갖게 되며, 이에 따라, 피부 등에 주입시 원하는 형태로 만들기 용이하고 원하는 기간 동안 지속될 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 높은 점탄성 및 응집력을 가져 모노 페이직 필러 및 바이 페이직 필러의 특징을 모두 나타내는 히알루론산 필러, 상기 필러가 충진된 프리필드시린지, 상기 필러를 포함하는 조직수복용 생체재료 및 이를 생체 조직 내에 주입하는 단계를 포함하는 조직수복 방법 또는 주름 개선 방법에 관한 것이다.
본 발명의 필러에 포함되는 히알루론산(이하, 'HA'라고도 함)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다. 구체적으로 본 발명의 필러에 포함되는 히알루론산은 히알루론산 외에도 이의 염을 의미할 수 있다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 바람직하게, 상기 히알루론산 또는 이의 염은 적절한 가교제에 의해 가교결합된 것일 수 있다.
가교된 히알루론산 유도체는 상기와 같은 히알루론산 자체 또는 이의 염을 가교제를 사용하여 가교시켜 제조할 수 있다. 가교를 위해서는, 알칼리 수용액 하에서 가교제를 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 알칼리 수용액으로는 NaOH, KOH, 바람직하게는 NaOH 수용액을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 NaOH 수용액의 경우 0.1N 내지 0.5N의 농도로 사용할 수 있다. 본 발명의 필러에 포함되는 가교된 히알루론산은 특히 낮은 농도 및 적은 양의 가교제를 사용하여도 높은 점탄성 및 응집성을 나타낸다. 상기 가교제의 농도는 상기 히알루론산 또는 이의 염 중의 단위유닛인 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산 1몰 대비 1 내지 10mol%일 수 있다.
상기 가교제는 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있으며, 바람직한 예로 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 바이에폭사이드계인 1,4-부탄디올글리시딜에테르가 낮은 독성을 갖는다는 면에서 특히 바람직하다.
본 발명에서 용어 "변형률"(Degree of modification, MOD)는 고분자 히알루론산에 포함되어있는 히알루론산의 단위 유닛(N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)+D-글루쿠론산) 중의 N-아세틸-D-글루코사민의 몰수 대비 히알루론산 분자 전체에 결합되어 있는 가교제(예를 들어 BDDE)의 몰수를 나타낸 수치(n)로 산출되는 가교된 정도를 의미하는 것으로, 하기와 같은 수학식 1로 나타낼 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2019008374-appb-I000001
본 발명에서는 특히, 이러한 변형률이 상기와 같은 가교제에 의한 가교를 통해 1 내지 7의 범위, 바람직하게는 3 내지 5 의 범위를 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 용어 "가교율(Crosslinking ratio, CrR)"은 전체 가교제의 몰수에 대한 가교된 가교제의 몰비를 의미하는 것으로, 하기 수학식 2와 같이 나타내어질 수 있다.
[수학식 2]
Figure PCTKR2019008374-appb-I000002
본 발명에서는 특히, 가교를 통해 0.1 내지 0.2의 범위, 바람직하게는 0.14 내지 0.17 의 범위를 나타내는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 히알루론산 필러는 상기 MOD 및 CrR 범위를 가져 모노 페이직 및 바이페이직 필러의 특성을 동시에 상승적으로 나타낼 수 있다는 특징을 갖는다.
본 발명에서, 상기 가교된 히알루론산의 분자량은 2,500,000 Da 이상, 바람직하게는 2,500,000 내지 3,500,000 Da일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 탄성(Elasticity)은 물체에 힘을 가했을 때 고체로서의 성질, 즉, 힘을 가하면 형태가 바뀌지만 힘을 제거하면 원래 형태로 되돌아오는 성질을 의미한다. 이러한 탄성은 저장탄성계수(G': elastic modulus, storage modulus)로 나타내며, 단위는 파스칼(Pascal, Pa)이다. 또한 본 발명에서 사용되는 용어 점성(Viscosity)은 액체로서의 성질, 즉, 흐름에 대한 저항인 점성을 지닌 흐름이 나타나는 것을 의미한다. 이러한 점성은 손실 탄성 계수(G": viscous modulus, loss modulus)로 나타낼 수 있고, 단위는 파스칼(Pascal, Pa)이다.
본 발명에서 사용되는 용어 점탄성(Viscoelasticity)는 물체에 힘을 가했을 때, 이러한 탄성변형과 점성을 동시에 갖는 것을 의미하며, 본 발명과 같은 필러에 포함되는 가교된 히알루론산 하이드로겔의 경우 이와 같이 점성과 탄성이 모두 나타나 점탄성을 가지고 있다. 이러한 점탄성은 저장탄성계수(G')와 손실탄성계수(G")를 모두 반영할 수 있는 복소 점도(Complex viscosity)로 평가할 수 있고 단위는 센티포와즈(Centipoise, cP)이다.
본 발명에서 사용되는 용어 응집력(Cohesivity)은 필러 입자들 사이에서 작용하고 있는 인력(부착력)으로 이에 의해 필러 입자들이 뭉치게 할 수 있다. 이러한 응집력이 높을수록 필러를 주입한 조직을 지탱할 수 있는 힘이 커지게 된다. 일반적으로 응집력은 압축시험으로 간접적으로 측정 가능하며, 레오미터(Rheometer)에 로딩한 후 일정 속도로 압축시의 저항력을 측정하며, 단위는 gf(gram force)이다.
일반적으로, 모노 페이직 형태의 히알루론산 필러는 응집성 있는 겔 형태(Cohesive gel)을 나타내어 응집력은 높으나 점탄성이 낮다. 이러한 예로는 알러간사의 쥬비덤(Juvederm®)이 있다. 또한, 바이 페이직 형태의 히알루론산 필러는 입자 형태를 나타내어 점탄성은 높으나 응집력이 낮다는 특징을 갖는다. 이러한 예로는 갈더마사의 레스틸렌(Restyane®)이 있다.
앞서 살펴본 바와 같이, 모노 페이직 형태의 히알루론산 필러와 바이 페이직 형태의 히알루론산 필러는 각각의 장단점을 가지고 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 필러는 높은 점탄성과 응집성을 갖고, 이에 따라 모노 페이직 필러의 특성과 바이 페이직 필러의 특성을 동시에 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 히알루론산 필러는 Rheometer로 측정시 1Hz의 각속도에서 6×104 이상, 바람직하게는 60,000 내지 130,000 cP의 복소점도(점탄성)을 나타내며, 400 Pa 이상, 바람직하게는 400 내지 800 Pa의 저장탄성계수 G'를 나타내고, 30 gf 이상, 바람직하게는 30 내지 60 gf의 응집력을 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 히알루론산 필러 중의 히알루론산 입자, 바람직하게는 가교 결합된 히알루론산의 입자는 여러 가지 형상을 나타낼 수 있으나 바람직하게는 구(球) 형상일 수 있다. 또한, 이러한 입자의 평균 직경은 300 내지 400μm일 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 히알루론산 필러는 전체 필러 중량 대비 1 내지 3 중량%의 히알루론산을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 히알루론산 필러는 상기 히알루론산뿐만 아니라 물, 마취제 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 마취제로는 당업계에 공지인 마취제, 바람직하게 국소 마취제를 1종 이상 포함하는 것이고, 이러한 하나 이상의 마취제의 농도는 조성물의 주사시 경험하게 되는 통증을 완화시키는 데 효과적인 양이다. 상기 마취제의 예로는 암부카인(ambucaine), 아몰라논(amolanone), 아밀로카인(amylocaine), 베녹시네이트(benoxinate), 벤조카인(benzocaine), 베톡시카인(betoxycaine), 비페나민(biphenamine), 부피바카인(bupivacaine), 부타카인(butacaine), 부탐벤(butamben), 부타닐리카인(butanilicaine), 부테타민(butethamine), 부톡시카인(butoxycaine), 카르티카인(carticaine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 코카에틸렌(cocaethylene), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 다이부카인(dibucaine), 다이메티소퀸(dimethysoquin), 다이메토카인(dimethocaine), 디페로돈(diperodon), 다이사이클로닌(dycyclonine, 에크고니딘(ecgonidine), 에크고닌(ecgonine), 에틸 클로라이드(ethyl chloride), 에티도카인(etidocaine), 베타-유카인(beta-eucaine), 유프로신(euprocin), 페날코민(fenalcomine), 포르모카인(formocaine), 헥실카인(hexylcaine), 하이드록시테트라카인(hydroxytetracaine), 아이소부틸 p-아미노벤조에이트(isobutyl paminobenzoate), 류시노카인 메실레이트(leucinocaine mesylate), 레복사드롤(levoxadrol), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 메프릴카인(meprylcaine), 메타부톡시카인(metabutoxycaine), 메틸 클로라이드(methyl chloride), 미르테카인(myrtecaine), 나에파인(naepaine), 옥타카인(octacaine), 오르소카인(orthocaine), 옥세타자인(oxethazaine), 파레톡시카인(parethoxycaine), 페나카인(phenacaine), 페놀(phenol), 피페로카인(piperocaine), 피리도카인(piridocaine), 폴리도카놀(polidocanol), 프라목신(pramoxine), 프릴로카인(prilocaine), 프로카인(procaine), 프로파노카인(propanocaine), 프로파라카인(proparacaine), 프로피오카인(propipocaine), 프로록시카인(propoxycaine), 슈도코카인(psuedococaine), 피로카인(pyrrocaine), 로피바카인(ropivacaine), 살리실 알코올(salicyl alcohol), 테트라카인(tetracaine), 톨릴카인(tolycaine), 트리메카인(trimecaine), 졸라민(zolamine), 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 마취제는 리도카인, 예들 들어, 리도카인 염산염의 형태일 수 있다.
본 명세서에 따른 히알루론산 필러에 있어서, 상기 필러에 포함되는 마취제의 농도는 필러 전체 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 1.0 중량%, 예를 들어, 조성물의 약 0.2중량% 내지 약 0.5 중량%일 수 있다.
본 명세서에 기재된 필러 중의 마취제의 농도는 치료학적으로 효과적일 수 있으며, 이는 환자에게 유해하지 않으면서 시술의 편의성과 환자의 순응도 측면에서 이점을 제공하기에 적합한 농도를 의미한다.
또한 본 발명에 따른 필러는 완충액을 더 포함할 수 있고, 완충액은 히알루론산 하이드로겔의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 바람직한 완충액의 예로는 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N' -비스(2-에탄술폰산)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 완충액을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 완충액 중에 포함되는 상기 성분들의 함량은 적절히 조절될 수 있으나, 바람직하게는 완충액에 대해 0.3 내지 2.0g/L의 농도로 포함될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 필러는 등장화제를 더 포함할 수 있고, 이러한 등장화제는 히알루론산 하이드로겔의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 완충액에 포함될 수 있다. 바람직한 등장화제로서, 염화나트륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 등장화제의 함량은 필요에 따라 적절히 조절될 수 있고, 예를 들어 완충액에 대해 7.0 내지 9.0g/L 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 실시예에서는 주사용수에 염화나트륨, 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 완충액을 사용하였다.
추가적인 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 상기 성분 외에도, 필러의 제조에 포함될 수 있는 허용가능한 성분들을 더 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 높은 점탄성 및 응집성을 갖는 히알루론산 필러 중의 잔류 가교제는 거의 포함되지 않는 것을 특징으로 하며 잔류 가교제가 바람직하게는 검출 한계인 0.5 ppm 이하이다.
이러한 본 발명에 따른 높은 점탄성 및 응집성을 갖는 히알루론산 필러는 본 특징적인 탄성적 성질, 응집력에 의해, 미용 또는 치료적 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 구체적인 예시로서, 이러한 히알루론산 필러는, 조직수복용 생체재료로서, 생물학적 조직의 필링(filling), 주름의 필링(filling wrinkle)을 통한 주름개선, 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 입술, 코, 엉덩이, 볼 또는 가슴과 같은 연조직의 용적(volume)의 수복 또는 증가 등에 사용될 수 있다. 상기 히알루론산 필러는 이러한 용도에 알맞은 투여형태로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사제일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기와 같은 높은 점탄성 및 응집성을 갖는 히알루론산 필러의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 히알루론산 또는 이의 염, 가교제 및 알칼리 수용액에 넣고 교반 후 반응시켜 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계;
(c) 완충액을 제조하는 단계;
(d) 상기 단계 (b)에서 제조된 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 상기 단계 (c)에서 제조된 완충액을 사용하여 세척 및 팽윤시키는 단계;
(e) 단계 (d)에서 세척 및 팽윤된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 제조된 하이드로겔을 시린지에 충전후 멸균하는 단계.
상기 단계 (a)는 히알루론산 또는 이의 염을 가교제를 사용하여 알칼리 수용액 상에서 가교 반응시켜 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계로서, 상기 히알루론산 또는 이의 염, 가교제, 가교결합된 히알루론산 하이드로겔에 관한 사항은 상기 히알루론산 필러에서 언급된 것을 동일하게 적용할 수 있다.
상기 알칼리 수용액은 히알루론산 하이드로겔의 제조에 적합한 알칼리 수용액으로 알려진 것은 제한없이 사용가능한데, 예를 들어, NaOH, KOH, NaHCO3, LiOH 또는 이들의 조합일 수 있고, 바람직하게는 NaOH일 수 있다. 이러한 알칼리 수용액의 농도는 0.1 내지 0.5N일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 0.25N일 수 있다. 본 발명에 따른 필러의 히알루론산 하이드로겔은 0.25N NaOH 염기성 하에서 가교시킨 후 가장 좋은 물성을 가짐을 확인하였다.
또한 히알루론산 또는 이의 염의 농도는 히알루론산 또는 이의 염 및 알칼리수용액 혼합물의 전체 중량 대비 히알루론산 또는 이의 염의 중량 비율로서 10 내지 25 중량%이고, 가교제의 농도는 상기 투입된 히알루론산 또는 이의 염의 단위 유닛 1몰 대비 1 내지 10 mol%이다. 가교제 농도가 상기 범위를 초과하는 고농도로 사용되는 경우, 탄성이 지나치게 높은 필러가 수득되고, 농도가 상기 범위 미만인 경우 탄성이 지나치게 낮아 적절한 점탄성을 나타낼 수 없다. 구체적으로, 상기 단계 (a)는 히알루론산 또는 이의 염과 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합, 교반하여 균질하게 혼합함으로써 수행될 수 있다. 가교 반응시의 온도는 상온 이상, 바람직하게는 25 내지 40℃의 온도 범위에서 15 내지 22 시간 수행될 수 있다.
상기 단계 (b)의 분쇄 공정은 공지된 다양한 히알루론산 하이드로겔의 분쇄 공정을 이용할 수 있다. 일 실시예에서. 반응 후에 제조된 가교젤은 케익과 같은 형태로 얻어지고 이것을 작두 등과 같은 절단기를 이용하여 반달모양으로 분할, 예를 들어 6분할 할 수 있다. 이후에 일정한 칼날의 간격을 갖는 조분쇄기를 사용하여 상기와 같이 분할된 젤을 통과(바람직하게는 2회 이상)시켜 분쇄 공정을 수행할 수 있다.
상기 단계 (c)는 단계 (b)에서 분쇄된 가교된 히알루론산 하이드로겔을 세척 및 팽윤시키는데 사용되는 완충액을 제조하는 단계로서, 상기 완충액은 공지의 완충액 제조방법에 따라 제조할 수 있다. 또한 상기 완충액에는 추가적으로 마취제를 더 포함시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시양태에서, 상기 완충액은 인산일수소나트륨수화물, 인산이수소나트륨수화물, 염화나트륨 및 리도카인 염산염을 주사용수가 담긴 버퍼 탱크에서 용해시켜 완충액을 조제하였다.
상기 완충액은 히알루론산 하이드로겔의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 바람직한 완충액의 예로는 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N' -비스(2-에탄술폰산)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 완충액을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (d)는 단계 (b)에서 분쇄된 가교된 히알루론산 하이드로겔을 상기 단계 (c)에서 제조된 완충액으로 세척 및 팽윤시키는 단계로서, 이러한 단계 (d)는 1회 또는 2회 이상 반복될 수도 있다. 세척 및 팽윤이 완료되면 세척액을 제거할 수 있다.
상기 단계 (e)는 세척 및 팽윤된 하이드로겔을 분쇄하는 단계이며, 이러한 분쇄는 다양한 분쇄방법에 의해 수행될 수 있으나, 바람직하게는 압출 분쇄이다.
또한 단계 (e) 이후에 제조된 하이드로겔을 시린지에 충전하고 멸균하기 위해서는 공지의 충전 및 멸균 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 멸균의 경우 오토클레이브 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 필러의 멸균에 사용되는 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 필러는 다음과 같은 효과를 가진다. 첫째, 모노 페이직 히알루론산 필러와 바이 페이직 히알루론산 필러의 장점을 모두 갖는 필러 즉, 높은 점탄성 및 응집성을 나타내어, 주입된 부위에서 이탈할 가능성이 낮으면서도 형태를 오래 유지할 수 있어 볼, 입술, 가슴, 엉덩이 등과 같은 연조직의 수복 또는 부피를 확대시키고, 피부의 잔주름 및 깊은 주름의 감소를 통한 주름개선이나 윤곽교정을 위한 필러로서 유용할 수 있다.
도 1은 실시예 1, 2, 및 비교예 1 내지 6 에 따른 히알루론산 필러의 저장탄성계수 및 압축시 저항력을 측정하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명에 따른 히알루론산 필러의 제조를 위하여, 다음과 같은 공정을 실시하였다.
2.5MDa 내지 3.5MDa의 분자량을 갖는 히알루론산나트륨, 수산화나트륨, BDDE(1,4-Butandiol Diglycidyl Ether)를 칭량하였다. 반응 시 히알루론산나트륨의 농도는 15wt%이며, BDDE의 mol%는 투입 된 히알루론산나트륨 단위 유닛(즉, N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산) 1몰 대비 4mol%이었다. 별도로, 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 조제하여 여과하였다. 상기 칭량한 히알루론산나트륨, 0.25N 수산화나트륨 수용액 및 BDDE(1,4-Butandiol Diglycidyl Ether)을 믹서(Mixer)통에 넣고 균질하게 혼합하였고, 이 믹서통을 항온수조에 넣고 30℃의 온도에서 밤새 가교반응을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝난 가교된 히알루론산 하이드로겔을 조분쇄하였다. 한편, 염과 마취제를 인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인염산염 3g/L 의 농도로 주사용수가 담긴 버퍼 탱크(Buffer Tank)에서 용해 시켜 완충용액을 조제하였다.
상기 완충용액 중 일부를 1차 완충용액으로 하여 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송하였고, 앞서 제조된 조분쇄된 히알루론산 겔을 1차 완충용액이 담긴 워싱 탱크에 이송 후 교반하여 히알루론산 겔을 1차 세척 및 팽윤시킨 후 팽윤이 완료되면 세척액을 제거하였다. 이후, 2차 완충용액을 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송한 후 교반하여 히알루론산 겔을 2차 세척 및 팽윤시킨다, 세척 및 팽윤이 완료되면 세척액을 제거하였다. 이후, 3차 완충용액을 적량 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송한 후 교반하여 히알루론산 겔을 3차 세척 및 팽윤시켰으며, 세척 및 팽윤이 완료되는대로 세척액을 제거하였다.
상기 3차 세척 및 팽윤 완료 후 세척액의 pH가 중성범위에 있는지 확인하였고, 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 겔을 분쇄한 뒤 압출 탱크(Extruder Tank)로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 압출 탱크(Extruder Tank)에서 히알루론산겔을 압출하며 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 겔을 멸균탱크로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 겔을 121℃ 이상의 온도에서, 1분 이상 열처리하였고, 이를 충전 전 히알루론산 겔을 교반하며 감압하여 탈포를 실시하였다. 이후 정해진 충전량만큼 히알루론산 겔을 각 시린지에 진공/충진과 동시에 고무전으로 밀전(Stoppering)하였다. 충전된 상태의 시린지를 최종멸균기에서 121℃ 이상의 온도에서, 8분 이상 증기멸균 하였다.
실시예 2: 본 발명에 따른 히알루론산 필러의 제조
본 발명에 따른 히알루론산 필러의 제조를 위하여, 다음과 같은 공정을 실시하였다.
2.5MDa 내지 3.5MDa의 분자량을 갖는 히알루론산나트륨, 수산화나트륨, BDDE(1,4-Butandiol Diglycidyl Ether)를 칭량하였다. 반응 시 히알루론산나트륨의 농도는 16wt%이며, BDDE의 mol%는 투입 된 히알루론산나트륨 단위 유닛 1몰 대비 4mol%이었다. 별도로, 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 조제하여 여과하였다. 상기 칭량한 히알루론산나트륨, 0.25N 수산화나트륨 수용액 및 BDDE(1,4-Butandiol Diglycidyl Ether)을 믹서(Mixer)통에 넣고 균질하게 혼합하였고, 이 믹서통을 항온수조에 넣고 30℃의 온도로 밤새 가교반응을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝난 가교된 히알루론산 하이드로 겔을 조분쇄하였다. 한편, 염과 마취제를 인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인염산염 3g/L 의 농도로 주사용수가 담긴 버퍼 탱크(Buffer Tank)에서 용해 시켜 완충용액을 조제하였다.
상기 완충용액 중 일부를 1차 완충용액으로 하여 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송하였고, 앞서 제조된 조분쇄된 히알루론산 겔을 1차 완충용액이 담긴 워싱 탱크에 이송 후 교반하여 히알루론산 겔을 1차 세척 및 팽윤시킨 후 팽윤이 완료되면 세척액을 제거하였다. 이후, 2차 완충용액을 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송한 후 교반하여 히알루론산 겔을 2차 세척 및 팽윤시킨다, 세척 및 팽윤이 완료되면 세척액을 제거하였다. 이후, 3차 완충용액을 적량 0.22㎛ 필터를 통해 워싱탱크(Washing Tank)로 이송한 후 교반하여 히알루론산겔을 3차 세척 및 팽윤시켰으며, 세척 및 팽윤이 완료되는대로 세척액을 제거하였다.
상기 3차 세척 및 팽윤 완료 후 세척액의 pH가 중성범위에 있는지 확인하였고, 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산겔을 분쇄한 뒤 압출 탱크(Extruder Tank)로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 압출 탱크(Extruder Tank)에서 히알루론산겔을 압출하며 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산겔을 멸균탱크로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산겔을 121℃ 이상의 온도에서, 1분 이상 열처리하였고, 이를 충전 전 히알루론산겔을 교반하며 감압하여 탈포를 실시하였다. 이후 정해진 충전량만큼 히알루론산겔을 각 시린지에 진공/충진과 동시에 고무전으로 밀전(Stoppering)하였다. 충전된 상태의 시린지를 최종멸균기에서 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 증기멸균 하였다.
실험예 1: 본 발명에 의해 제조한 히알루론산 필러의 점탄성 특성 조사
제조된 실시예 1 및 2의 유동학적 특성 규명을 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 분석하였다. 본 발명의 필러와의 비교를 위해, 시판 중인 필러 제제의 점탄성 특성 또한 분석하여 비교하였다. 비교예로서 상기 시판 중인 필러 제제 및 분석 조건은 다음과 같다.
<비교예>
- 비교예 1: 벨로테로 인텐스 리도카인 (Belotero Intense Lidocaine)
- 비교예 2: 벨로테로 볼륨 리도카인 (Belotero Volume Lidocaine)
- 비교예 3: 스타일에이지 엘 리도카인 (Stylage L Lidocaine)
- 비교예 4: 스타일에이지 엑스엘 리도카인 (Stylage XL Lidocaine)
- 비교예 5: 쥬비덤 볼리프트 리도카인 (Juvederm Volift with Lidocaine)
- 비교예 6: 쥬비덤 볼류마 리도카인 (Juvederm Voluma with Lidocaine).
<분석조건>
진동 회전형 레오미터(Oscillatory and Rotational Rheometer)의 분석조건
저장탄성계수(G'), 복소점도(η*) 시험의 경우
(1) 시험장비 : Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
(2) Frequency: 1 Hz
(3) Temperature: 25 ℃
(4) Strain: 4 %
(5) Measuring geometry: 25 mm plate
(9) Measuring gap: 1.0 mm
압축시 저항력(Compression force)의 경우
(1) 시험장비: Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
(2) Gap: Initial position: 2.5 mm, Final position: 0.9 mm
(3) Speed: 0.8 mm/min
(4) Temperature: 25 ℃
(5) Measuring geometry: 25 mm plate
(9) Normal Force Measuring gap positon: 1.5 mm
위의 분석 조건으로 주파수별 저장탄성계수(G'), 복소점도(η*), 압축시저항력(Compression force)의 결과값을 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2019008374-appb-T000001
Figure PCTKR2019008374-appb-I000003
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2는 비교예 1 내지 6에 비해 우수한 점탄성을 나타내는 것으로 판단된다. 나아가, 응집성의 경우, 모노페이직 필러와 바이페이직 필러의 특성을 동시에 나타냄에도 불구하고, 모노페이직 필러인 비교예 5 및 6에 비해서 탁월한 압축시 저항력을 나타낸다. 나아가, 점탄성과 응집성을 모두 고려하면, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2가 비교예 1 내지 6에 비해 탁월한 물성을 나타냄을 알 수 있다.
실험예 2: 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로겔의 입도 분석
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 6의 히알루론산 하이드로겔의 입자크기와 분포도를 확인하기 위해 다음과 같은 시험을 수행하였다. 이러한 시험 결과를 표 2에 나타내었다.
<분석 조건>
레이저 회절 입도분석기 (Laser diffraction particle size analyzer)의 분석조건
(1) 시험장비: Laser diffraction particle size analyzer (Malvern Ltd., Mastersizer 3000)
(2) Dispersant: 0.9% NaCl solution
(3) Stirrer rpm: 1,000
(4) Laser obscuration: 5~25 %
Figure PCTKR2019008374-appb-T000002
실험예 3: 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로겔의 변형률(Degree of Modification) 분석
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 6의 히알루론산 하이드로겔의 변형률을 확인하기 위해 다음과 같은 조건으로 시험을 수행하였다. 이러한 시험 결과를 표 3에 나타내었다.
<분석 조건>
핵자기공명장치 (Nuclear Magnetic Resonance)의 분석조건
(1) 시험장비: FT-NMR System (Jeol Ltd., ECA500/ECZ400S),
(2) Pulse: 30°
(3) Scans: 512
(4) Relaxation time (delay): 5 s
(5) Temperature: 25 ℃
Figure PCTKR2019008374-appb-T000003
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 히알루론산 필러는 앞서 확인한 바와 같이 탁월한 물성을 나타냄에도 불구하고 낮은 변형률을 나타냄을 알 수 있으며, 이는 즉 필러의 제조시에 적은 양의 가교제를 사용하여도 우수한 물성을 나타내는 필러를 제공할 수 있어 매우 생체적합하다는 것을 의미한다.

Claims (25)

  1. 히알루론산, 이의 염 또는 가교된 히알루론산을 포함하며, 레오미터(Rheometer)로 측정시 1Hz의 각속도에서 6×104 cP이상의 복소점도를 갖고, 400 Pa 이상의 저장탄성계수 G'를 나타내고, 30 gf 이상의 응집력을 갖는, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  2. 제1항에 있어서, 상기 필러는 모노 페이직 및 바이 페이직 필러의 특성을 모두 갖는 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  3. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산은 가교된 히알루론산인 것인, 히알루론산하이드로겔 필러.
  4. 제2항에 있어서, 상기 가교된 히알루론산은 분자량이 2,500,000 Da 이상인 히알루론산을 가교시킨 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  6. 제5항에 있어서, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE)인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  7. 제1항에 있어서, 마취제를 더 포함하는 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  8. 제7항에 있어서, 상기 마취제는 리도카인 또는 그의 염인 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  9. 제1항에 있어서, 상기 필러는 피부주입용인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  10. 제1항에 있어서, 상기 필러는 조직수복용인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  11. 제1항에 있어서, 상기 필러는 주름 개선, 연조직 수복 또는 부피 확대, 또는 윤곽 교정용인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  12. 히알루론산, 이의 염 또는 가교된 히알루론산을 포함하며, 레오미터(Rheometer)로 측정시 1Hz의 각속도에서 6×104 cP이상의 복소점도를 갖고, 400 Pa 이상의 저장탄성계수 G'를 나타내고, 30 gf 이상의 응집력을 갖고, 히알루론산 또는 이의 염 중의 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산의 1몰 대비 1 내지 10mol% 농도의 가교제를 포함하는 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  13. 제12항에 있어서, 히알루론산 또는 이의 염 중의 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산 1몰 대비 1 내지 5mol% 농도의 가교제를 포함하는 것인, 히알루론산 하이드로겔 필러.
  14. 하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 필러의 제조방법:
    (a) 히알루론산 또는 이의 염, 가교제 및 알칼리 수용액에 넣고 교반하여 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계;
    (c) 완충액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 단계 (b)에서 제조된 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 상기 단계 (c)에서 제조된 완충액을 사용하여 세척 및 팽윤시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 세척 및 팽윤된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계; 및
    (f) 단계 (e)에서 제조된 하이드로겔을 시린지에 충전후 멸균하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 알칼리 수용액은 NaOH, KOH, NaHCO3, LiOH 또는 이들의 조합의 수용액인, 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 알칼리 수용액의 농도는 0.1N 내지 0.5N인, 제조방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르인 것인, 제조방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 이의 염의 농도는 히알루론산 또는 이의 염 및 알칼리수용액 혼합물의 전체 중량 대비 히알루론산 또는 이의 염의 중량 비율로서 10 내지 25 중량%인 것인, 제조방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 단계 (a)는 25 내지 40℃의 온도 범위에서 15 내지 22 시간 수행되는 것인, 제조방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 단계 (c)의 완충액은 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N' -비스(2-에탄술폰산)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 제조방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 완충액은 마취제 및 등장화제를 더 포함하는 것인, 제조방법.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로겔 필러가 충진된 프리필드시린지.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로겔 필러를 포함하는 조직수복용 생체재료.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로겔 필러를 주입하는 단계를 포함하는, 조직수복 방법.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 히알루론산 하이드로겔 필러를 주입하는 단계를 포함하는, 주름의 개선 방법.
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