WO2022149924A1 - 가교제 및 폴리올을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러 - Google Patents

가교제 및 폴리올을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러 Download PDF

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acid hydrogel
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이충
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Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid hydrogel cross-linked using a polyol together with a cross-linking agent and a filler comprising the same.
  • the filler developed for wrinkle improvement widely uses hyaluronic acid, a natural polymer with high biocompatibility.
  • hyaluronic acid hydrogel form cross-linked using various cross-linking agents is currently used as a filler.
  • the crosslinking agent is generally highly toxic, it is difficult to use a large amount in terms of stability.
  • the cross-linked hydrogel has a low cross-linking rate, there is a disadvantage that decomposition occurs quickly by hyaluronic acid degrading enzymes or reactive oxygen species (radicals), so it was difficult to increase both stability and durability in the body.
  • the inventors of the present invention when crosslinking hyaluronic acid using a polyol such as a sugar alcohol together with a conventionally used crosslinking agent, hyaluronic acid degrading enzyme, reactive oxygen species (The present invention was completed by confirming that not only stability against radicals) and/or heat was excellently improved, but also toxicity was remarkably reduced due to the use of a small amount of a crosslinking agent, thereby making it possible to manufacture a filler with high biocompatibility.
  • an object of the present invention is to provide a cross-linked hyaluronic acid hydrogel and a filler composition comprising the same, which reduce toxicity during cross-linking to have high safety and high durability in the body.
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel and the cross-linked hyaluronic acid comprising the present invention hyaluronic acid or a salt thereof, a cross-linking agent and a polyol, wherein the hyaluronic acid or a salt thereof is cross-linked with the cross-linking agent and the polyol
  • a filler comprising ronic acid hydrogel may be provided.
  • the filler is for soft tissue injection, for example, for skin injection, and the filler has a peeling property, for example, filling of biological tissue, wrinkles due to filling of wrinkles (filling wrinkle) It can be used as a filler application, such as for improvement, remodeling of the face or contour correction, or to restore or increase the volume of soft tissue.
  • the polyol may be a sugar alcohol.
  • the cross-linked hyaluronic acid comprising the steps of mixing hyaluronic acid or a salt thereof with a polyol and a solution of a crosslinking agent and an aqueous alkali solution in a mixture of the hyaluronic acid or a salt thereof and a polyol and reacting
  • a method for preparing a ronic acid hydrogel may be provided.
  • a prefilled syringe filled with a filler including the cross-linked hyaluronic acid may be provided.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is prepared by using a polyol together with a cross-linking agent, resistance due to hyaluronic acid degrading enzyme, active oxygen species in the body and storage temperature is increased. Therefore, the filler containing such a cross-linked hyaluronic acid hydrogel has excellent durability in the body while exhibiting high safety due to increased stability within the storage period and reduced toxicity, and is excellent in soft tissue repair or volume expansion and wrinkle improvement effects.
  • Example 1 is a graph comparing in vitro enzyme resistance results of cross-linked hyaluronic acid hydrogels cross-linked using the cross-linking agent and mannitol of Example 1-1 according to the present invention with those of Comparative Examples 2 to 4.
  • Example 2 is a graph comparing the in vitro radical resistance results of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked using the cross-linking agent and mannitol of Example 1-1 according to the present invention with those of Comparative Examples 2 to 4.
  • Example 3 is a graph comparing the in vitro heat resistance results of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked using the cross-linking agent and mannitol of Example 1-1 according to the present invention with those of Comparative Examples 2 to 4.
  • Example 4 is a graph comparing the in vivo biocompatibility test results of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked using the cross-linking agent and mannitol of Example 1-1 according to the present invention with those of Comparative Examples 2 to 4.
  • Hyaluronic acid contained in the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of the present invention is a disaccharide repeating unit composed of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid is linearly linked.
  • a biopolymer material it is abundantly present in the vitreous humor of the eye, synovial fluid of the joint, chicken leg, etc., and because it has excellent biocompatibility, it is used in medical and It is widely used for medical and cosmetic applications.
  • the hyaluronic acid contained in the hyaluronic acid hydrogel according to the present invention may mean hyaluronic acid or a salt of hyaluronic acid.
  • the salt of hyaluronic acid includes, for example, inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronate. to be, but is not limited thereto.
  • the weight average molecular weight of the hyaluronic acid used in the crosslinking reaction may be 1,000,000 Da or more, 1,500,000 Da or more, 2,000,000 Da or more, 2,300,000 Da or more, or 2,500,000 Da or more, for example, 1,000,000 to 1,500,000 Da, 1,000,000 to 2,000,000 Da, 1,000,000 to 3,000,000 Da, 1,000,000 to 4,000,000 Da, 1,500,000 to 2,000,000 Da, 1,500,000 to 3,000,000 Da, 1,500,000 to 4,000,000 Da, 2,000,000 to 4,000,000 Da, 2,300,000 to 4,000,000 Da, 2,000,000 to 3,700,000 Da, 2,200,000 to 3,700,000 Da, or 2,500,000 to 3,500,000 Da.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is characterized in that the hyaluronic acid or a salt thereof is cross-linked using a cross-linking agent and a polyol.
  • crosslinked refers to an intermolecular bond that binds individual polymer molecules, or monomer chains, into a more stable structure such as a gel.
  • a crosslinked polymer has at least one intermolecular bond linking at least one individual polymer molecule to another.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is characterized in that the hyaluronic acid or a salt thereof is cross-linked using a cross-linking agent and a polyol, unlike a conventional hyaluronic acid hydrogel cross-linked only with a cross-linking agent.
  • crosslinking agent refers to any compound capable of inducing crosslinking between hyaluronic acid chains, and in the present invention, the crosslinking agent can be used without limitation any crosslinking agent capable of crosslinking hyaluronic acid or a salt thereof, for example, two or a compound containing more epoxy functional groups.
  • Preferred examples of the crosslinking agent include endogeneous polyamines, aldehydes, carbodiimides, and divinylsulfones as non-epoxy crosslinking agents.
  • epoxy crosslinking agents include butanediol diglycidyl ether (1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE), and hexanediol diglycidyl ether (1,6).
  • the polyol for crosslinking hyaluronic acid or an acceptable salt thereof together with the crosslinking agent is linked with the crosslinking agent to crosslink hyaluronic acid or an acceptable salt thereof.
  • the polyol refers to an organic molecule containing two or more free hydroxyl groups, and may be a polyol having 2 to 20 carbon atoms, more specifically, a sugar alcohol.
  • Polyols suitable for the present invention are saturated or unsaturated, linear, branched, having, on their alkyl chain, at least two -OH functions, for example at least 3 -OH functions, and more specifically at least 4 -OH functions. It may be a topographic or cyclic alkyl-bearing compound.
  • Non-limiting examples of polyols include: glycerin, 1,3-propanediol, isoprene glycol, pentylene glycol, hexylene glycol; glycols such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, diethylene glycol and dipropylene glycol; 2 to 6 repeat units of polyglycerols such as diglycerol, erythritol, arabitol, adonitol, sorbitol, mannitol, xylitol, dulcitol, glucose, fructose, xylose, trehalose, maltose, saccharose and lactose; and derivatives thereof such as, for example, methylglucoside phosphate and mixtures thereof.
  • glycols such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, diethylene glycol and dipropylene glycol
  • 2 to 6 repeat units of polyglycerols such as dig
  • the polyol may be selected from the group consisting of mannitol, sorbitol and xylitol.
  • the -OH functional group reacts with the reactive oxygen species to make the reactive oxygen species inactive, thereby suppressing the decomposition of the filler by the active oxygen species.
  • hyaluronic acid or an acceptable salt thereof may be linked with a crosslinking agent and a polyol as follows.
  • the hydroxyl group of hyaluronic acid or an acceptable salt thereof is connected to one of the epoxide groups at both ends of the crosslinking agent, and the epoxide group at the other terminal of the crosslinking agent is connected to the hydroxyl group of the polyol to form a hyaluronic acid-crosslinking agent-polyol.
  • the other hydroxyl group of the polyol is continuously linked to the hydroxyl group of the new hyaluronic acid or an acceptable salt thereof as follows, and eventually a cross-linked hyaluronic acid hydrogel is prepared.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention has a degree of modification (MoD) in the range of from about 3 to about 100, preferably from about 3 to about 80, more preferably from about 3 to about 50.
  • MoD degree of modification
  • Modification degree refers to the molar ratio of the total crosslinking agent bound to hyaluronic acid with respect to the number of moles of hyaluronic acid as a whole unit, and may be expressed as Equation 1 below.
  • Modification degree (MoD) number of moles of crosslinking agent bound to hyaluronic acid / number of moles of unit hyaluronic acid
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is, based on the total weight of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel, from about 10 mg/g to about 40 mg/g, preferably from about 15 mg/g to about 35 mg/g, even more Preferably, it may contain from about 20 mg/g to about 30 mg/g of total hyaluronic acid.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention exhibits the effect of replacing the decomposition of hyaluronic acid by reactive oxygen species in which polyol chemically bonded to hyaluronic acid or a salt thereof, and the mechanism of decomposition by binding of hyaluronic acid degrading enzyme is structurally
  • a filler containing a cross-linked hyaluronic acid hydrogel into the human body, it exhibits an effect of inhibiting the decomposition of the filler, thereby increasing the durability after injection into the body.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel can be degraded by breaking the relatively weak ⁇ -1-4-glycosidic bond between the hyaluronic acid molecules by heat as well as the enzymes described above.
  • the polyol has thermal stability to inhibit thermal decomposition of hyaluronic acid and has an advantage during storage, so it is very useful as a filler.
  • the present invention relates to a method for producing the cross-linked hyaluronic acid hydrogel using a cross-linking agent and a polyol.
  • the method for producing a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention comprises the steps of: (i) mixing hyaluronic acid or a salt thereof with a polyol; And (ii) a solution in which a crosslinking agent and an aqueous alkali solution are mixed in a mixture of the hyaluronic acid or its salt and polyol and reacted.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid or a salt thereof may be 1,000,000 Da or more, 1,500,000 Da or more, 2,000,000 Da or more, 2,300,000 Da or more, or 2,500,000 Da or more, for example, 1,000,000 to 1,500,000 Da, 1,000,000 to 2,000,000 Da, 1,000,000 to 3,000,000 Da, 1,000,000 to 4,000,000 Da, 1,500,000 to 2,000,000 Da, 1,500,000 to 3,000,000 Da, 1,500,000 to 4,000,000 Da, 2,000,000 to 4,000,000 Da, 2,300,000 to 4,000,000 Da, 2,000,000 to 3,700,000 Da, 2,200,000 to 3,700,000 Da, or 2,500,000 to 3,500,000 Da.
  • the concentration of the polyol used in the preparation method may be 5 to 100 mol%, 10 to 100 mol%, 10 to 90 mol%, or 10 to 80 mol% with respect to hyaluronic acid or a salt thereof, but is not limited thereto and reaction conditions It can be appropriately adjusted according to
  • the aqueous alkali solution may be used without limitation as an aqueous alkali solution suitable for crosslinking of hyaluronic acid, for example, NaOH, KOH, NaHCO 3 , LiOH or a combination thereof, preferably NaOH.
  • the concentration of the aqueous alkali solution may be 0.1 to 0.5N, but is not limited thereto.
  • the concentration of the aqueous alkali solution used in the preparation method may be 5 to 100 mol%, 10 to 100 mol%, 10 to 90 mol%, or 10 to 80 mol% with respect to hyaluronic acid or a salt thereof, but is not limited thereto, depending on the reaction conditions It can be adjusted accordingly.
  • the crosslinking reaction can be carried out by mixing a mixture of hyaluronic acid or a salt thereof and a polyol, and a crosslinking agent and an aqueous alkali solution to homogeneously mix the mixture and then maintaining the mixture for a certain period of time.
  • the temperature during the crosslinking reaction may be carried out at room temperature or higher, preferably at a temperature range of 25 to 65°C or 27 to 55°C for 1 to 22 hours or 2 to 20 hours.
  • the total reaction concentration ie, the ratio of the combined weight of hyaluronic acid and polyol to the total weight of hyaluronic acid, polyol and solvent
  • the total reaction concentration is 5 to 30% (w/w), or 10 to 30% (w/w).
  • 10 mol% of mannitol, sorbitol, or xylitol compared to hyaluronic acid is mixed with hyaluronic acid, and a solution of NaOH solution and 1,4-BDDE is mixed and maintained at 30 to 50 ° C. for 2 hours. After washing/neutralizing/swelling the cross-linked gel, it was pulverized using a mesh network and then sterilized to prepare a material.
  • the present invention relates to a filler comprising the cross-linked hyaluronic acid hydrogel.
  • the filler may include 0.5 to 10% by weight, preferably 1 to 5% by weight of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel, based on the total weight of the filler.
  • the filler comprising the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention may further include an anesthetic to reduce the pain of the patient during injection as well as the cross-linked hyaluronic acid hydrogel.
  • the anesthetic agent includes at least one anesthetic known in the art, preferably a local anesthetic, and the concentration of the at least one anesthetic agent is an amount effective to relieve pain experienced upon injection of the composition.
  • the anesthetic include ambucaine, amolanone, amylocaine, benoxinate, benzocaine, betoxycaine, biphenamine ), bupivacaine, butacaine, butamben, butanilicaine, butethamine, butoxycaine, carticaine, chloroprocaine (chloroprocaine), cocaethylene, cocaine, cyclomethycaine, dibucaine, dimethysoquin, dimethocaine, diferodon , dycyclonine, ecgonidine, ecgonine, ethyl chloride, etidocaine, beta-eucaine, euprocin , fenalcomine, formocaine, hexylcaine,
  • the concentration of the anesthetic agent included in the filler is from about 0.1 wt% to about 1.0 wt%, for example, from about 0.2 wt% to about 1.0 wt% of the total weight of the filler It may be about 0.5% by weight. Preferably, it may be 0.3% by weight.
  • the concentration of the anesthetic agent in the filler according to the present invention may be therapeutically effective, which means a concentration suitable to provide advantages in terms of convenience and patient compliance without being harmful to the patient.
  • the filler according to the present invention may further include a buffer, and the buffer may be used without limitation as long as it is used in the preparation of the hyaluronic acid hydrogel.
  • buffers include citric acid, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, acetic acid, diethyl barbituric acid, sodium acetate, TAPS (tris(hydroxymethyl)methylamino)propane.
  • Sulfonic acid may include a buffer containing at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the content of the components included in the buffer may be appropriately adjusted, but may preferably be included at a concentration of 0.3 to 2.0 g/L with respect to the buffer.
  • the filler according to the present invention may further include an isotonic agent, and such an isotonic agent may be used without limitation as long as it is used in the preparation of the filler, and may be included in the buffer.
  • an isotonic agent sodium chloride may be used, but is not limited thereto.
  • the content of the isotonic agent may be appropriately adjusted as necessary, for example, 7.0 to 9.0 g/L may be included with respect to the buffer, but is not limited thereto.
  • a buffer solution containing sodium chloride, sodium monohydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate was used in water for injection.
  • the filler comprising the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention may further include acceptable components that may be included in the preparation of the filler in addition to the above components.
  • the filler including the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention has the advantage that the storage period can be significantly increased compared to the conventional hyaluronic acid filler formulation due to high thermal stability.
  • it is highly resistant to degradation by hyaluronic acid degrading enzymes and reactive oxygen species (radicals), so it can significantly increase the duration after injection into the human body. Since it exhibits very excellent properties in terms of biocompatibility and toxicity, it can be very usefully used for cosmetic or therapeutic purposes.
  • the filler comprising the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is wrinkle improvement through filling of biological tissue, filling of wrinkles, remodeling of the face, or It can be used to repair or increase the volume of soft tissues such as lips, nose, buttocks, cheeks or chest.
  • the filler including the hyaluronic acid hydrogel may be administered in a dosage form suitable for this use, preferably an injection, more preferably a pre-filled injection (prefilled syringe).
  • the present invention relates to a method for producing a filler comprising the cross-linked hyaluronic acid hydrogel as described above, comprising the following steps:
  • step (c) coarsely pulverizing the hyaluronic acid hydrogel prepared in step (b);
  • step (d) washing and swelling the pulverized hyaluronic acid hydrogel prepared in step (b) using a buffer;
  • step (e) grinding the washed and swollen hyaluronic acid hydrogel in step (d).
  • the steps (a) and (b) are a step of preparing a cross-linked hyaluronic acid hydrogel by cross-linking hyaluronic acid or a salt thereof in an aqueous alkali solution using a cross-linking agent and a polyol, wherein the hyaluronic acid or a salt thereof, a cross-linking agent, Regarding the polyol and the cross-linked hyaluronic acid hydrogel, those mentioned in the cross-linked hyaluronic acid hydrogel and its preparation method can be equally applied.
  • the grinding process may use a grinding process of various hyaluronic acid hydrogels.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared after the reaction is obtained in the form of a cake (or a cylinder), and it can be divided into a half moon shape, for example, into 6 divisions using a cutting machine such as a jigdu.
  • the crushing process may be performed by passing the gel divided as described above (preferably twice or more) using a coarse crusher having a constant blade interval.
  • the buffer may further include an anesthetic.
  • the buffer may be used without limitation as long as it is used in the preparation of the hyaluronic acid hydrogel. Examples of such preferred buffers include citric acid, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, acetic acid, diethyl barbituric acid, sodium acetate, TAPS (tris(hydroxymethyl)methylamino)propane.
  • washing and swelling may be repeated once or twice or more. When washing and swelling are complete, the washing solution can be removed.
  • the step (e) is a step of pulverizing the washed and swollen hydrogel, and this pulverization may be performed by various pulverization methods, but is preferably extrusion pulverization.
  • the cross-linked hydrogel filler prepared after step (e) may be subjected to a process such as sterilization and/or defoaming. It can be metered filled, sealed, and sterilized in an appropriate container, for example, a syringe or the like.
  • Example 1-1 Preparation of a cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked with mannitol and a cross-linking agent according to the present invention
  • sodium hyaluronic acid salt having an average molecular weight of 3 million Da
  • sodium hydroxide sodium hydroxide
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • hyaluronic acid 1 g was weighed, mannitol of 10 mol% based on the weight of hyaluronic acid was weighed, and then put into a mixer barrel and mixed.
  • a 0.25 N aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) is weighed so that the total reaction concentration is 10% (w/w) based on the weight of hyaluronic acid, and 100 mol% of 1,4 based on the weight of hyaluronic acid -Butanediol diglycidyl ether (BDDE) was added and mixed.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the mixture in the container into a mixer container in which hyaluronic acid and mannitol are mixed, mix using a mixer, put the mixer container in a constant temperature water bath, and crosslinking while maintaining at 50°C for 2 hours complete Thereafter, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel obtained after the reaction is coarsely pulverized to a predetermined size, and a buffer solution (sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L) , sodium chloride 7g/L, lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection) was used to wash and swell 6 times for 1 hour each .
  • a buffer solution sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention was prepared by sterilizing the hyaluronic acid hydrogel whose content correction was completed by heat treatment at a temperature of 121° C. or higher for at least 10 minutes.
  • Example 1-2 Preparation of a cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked with mannitol and a cross-linking agent according to the present invention
  • sodium hyaluronic acid salt having an average molecular weight of 3 million Da
  • sodium hydroxide sodium hydroxide
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • hyaluronic acid 2 g was weighed, mannitol of 10 mol% based on the weight of hyaluronic acid was weighed, and then put into a mixer barrel and mixed.
  • a 0.25 N aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) is weighed so that the total reaction concentration is 15% (w/w) based on the weight of hyaluronic acid, and 5 mol% of 1,4 based on the weight of hyaluronic acid -Butanediol diglycidyl ether (BDDE) was added and mixed.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the mixture in the container into a mixer barrel in which hyaluronic acid and mannitol are mixed, mix using a mixer, and then put the mixer barrel in a constant temperature water bath and maintain at 30° C. for 19 hours to crosslinking. complete Thereafter, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel obtained after the reaction is coarsely pulverized to a predetermined size, and a buffer solution (sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L) , sodium chloride 7g/L, lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection) was used to wash and swell once for 2 hours and twice for 1 hour .
  • a buffer solution sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention was prepared by sterilizing the hyaluronic acid hydrogel whose content correction was completed by heat treatment at a temperature of 121° C. or higher for at least 10 minutes.
  • Example 2 Preparation of cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked with sorbitol and cross-linking agent according to the present invention
  • sodium hyaluronic acid salt having an average molecular weight of 3 million Da
  • sodium hydroxide sodium hydroxide
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • sorbitol a crosslinking agent
  • sodium hydroxide sodium hydroxide
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • hyaluronic acid 2 g was weighed, sorbitol of 10 mol% based on the weight of hyaluronic acid was weighed, and then put into a mixer barrel and mixed.
  • a 0.25 N aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) is weighed so that the total reaction concentration is 15% (w/w) based on the weight of hyaluronic acid, and 5 mol% of 1,4 based on the weight of hyaluronic acid -Butanediol diglycidyl ether (BDDE) was added and mixed.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the mixture in the container into a mixer container in which hyaluronic acid and sorbitol are mixed, mix using a mixer, put the mixer barrel in a constant temperature water bath, and crosslinking while maintaining at 30°C for 19 hours complete Thereafter, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel obtained after the reaction is coarsely pulverized to a predetermined size, and a buffer solution (sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L) , sodium chloride 7g/L, lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection) was used to wash and swell once for 2 hours and twice for 1 hour .
  • a buffer solution sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention was prepared by sterilizing the hyaluronic acid hydrogel whose content was corrected by heat treatment at a temperature of 121° C. or more for 10 minutes or more.
  • Example 3 Preparation of cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked with xylitol and cross-linking agent according to the present invention
  • sodium hyaluronic acid salt having an average molecular weight of 3 million Da, sodium hydroxide, BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether) as a crosslinking agent, and xylitol were respectively weighed.
  • hyaluronic acid 2 g was weighed, and after weighing 10 mol% of xylitol relative to the weight of hyaluronic acid, it was put into a mixer barrel and mixed.
  • a 0.25 N aqueous solution of sodium hydroxide (NaOH) is weighed so that the total reaction concentration is 15% (w/w) based on the weight of hyaluronic acid, and 5 mol% of 1,4 based on the weight of hyaluronic acid -Butanediol diglycidyl ether (BDDE) was added and mixed.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the mixture in the container into a mixer container in which hyaluronic acid and xylitol are mixed, mix using a mixer, put the mixer container in a constant temperature water bath, and crosslinking while maintaining at 30°C for 19 hours complete Thereafter, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel obtained after the reaction is coarsely pulverized to a predetermined size, and a buffer solution (sodium monohydrogen phosphate hydrate (decahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L) , sodium chloride 7g/L, lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection) was used to wash and swell once for 2 hours and twice for 1 hour .
  • a buffer solution sodium monohydrogen phosphate hydrate (decahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention was prepared by sterilizing the hyaluronic acid hydrogel whose content correction was completed by heat treatment at a temperature of 121° C. or higher for at least 10 minutes.
  • Comparative Example 1 Preparation of a cross-linked hyaluronic acid hydrogel cross-linked with a cross-linking agent according to a conventional method
  • sodium hyaluronic acid salt having an average molecular weight of 3 million Da, sodium hydroxide, and BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether) as a crosslinking agent were respectively weighed.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel obtained after the reaction is coarsely pulverized to a predetermined size, and a buffer solution (sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L) , sodium chloride 7g/L, lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection) was used to wash and swell once for 2 hours and twice for 1 hour .
  • a buffer solution sodium monohydrogen phosphate hydrate (dodecahydrate) 1.26 g/L, sodium dihydrogen phosphate hydrate (monohydrate) 0.46 g/L
  • sodium chloride 7g/L sodium chloride 7g/L
  • lidocaine hydrochloride 3g/L lidocaine hydrochloride 3g/L in a 500ml bottle container containing water for injection
  • a cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention was prepared by sterilizing the hyaluronic acid hydrogel whose content was corrected by heat treatment at a temperature of 121° C. or more for 10 minutes or more.
  • Test equipment Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
  • the cross-linked hyaluronic acid (HA) hydrogel When the cross-linked hyaluronic acid (HA) hydrogel is injected into the body, the cross-linked hyaluronic acid hydrogel is subjected to a direct decomposition attack by hyaluronidase to be decomposed.
  • hyaluronidase By directly injecting hyaluronidase into the sample, it is possible to check the degradation tendency and measure the resistance to the enzyme.
  • the enzyme resistance test was performed in situ according to the following method using a rheometer.
  • %50 Hase (min) The higher the residual ratio of the complex viscosity, the higher the resistance to the enzyme. Based on the measurement results, %50 Hase (min) was calculated and the results are shown in Table 2.
  • the %50 Hase (minutes) means the time it takes for the complex viscosity of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel to decrease to a level of 50% compared to the initial physical properties due to the decomposition of the enzyme. That is, the greater the value of %50 Hase (min), the higher the resistance of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel.
  • Examples 1 to 3 of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel containing the sugar alcohol according to the present invention had %50 Hase (minutes) of 42 minutes, 45 minutes, and 41 minutes, respectively, whereas the conventional method In the case of Comparative Example 1, which is a cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared by
  • the enzyme resistance test was performed in situ using a rheometer according to the following method.
  • Example 1-1 After the cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared in Example 1-1 and the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of Comparative Examples 2 to 4 were ground and finally sterilized, 1 g of the sterilized sample was weighed into a 50 mL tube, and then 500 unit/mL 10uL of hyaluronidase prepared by The sample mixed with the enzyme was loaded into a rheometer, the temperature was set to 37°C, and the complex viscosity of the sample was measured in real time for 6 hours. Based on the measurement result, %50 Hase (min) was calculated and the result is shown in FIG. 1 .
  • Example 1-1 of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention has a %50 Hase (minute) of about 32 minutes, whereas a commercially available cross-linked hyaluronic acid hydrogel is comparative.
  • %50 Hase (min) of about 10, 4 and 6 minutes, respectively.
  • %50 H 2 O 2 means the time it takes for the complex viscosity of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel to decrease to a level of 50% compared to the initial physical properties (complex viscosity) due to decomposition by active oxygen species (radicals). That is, the higher the value of %50 H 2 O 2 (min), the higher the resistance of the hydrogel of cross-linked hyaluronic acid to reactive oxygen species (radical).
  • Example 1 of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention is a commercially available cross-linked hyaluronic acid hydrogel, whereas % 50 H 2 O 2 (minutes) is about 32 minutes.
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of Example 1-1 according to the present invention exhibited %50 H 2 O 2 (minutes) of about 5, 7.5 and 18 minutes, respectively, at least three times higher enzyme resistance. was confirmed.
  • Enzyme resistance experiment to measure the resistance to degradation induced by peroxy radicals of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel containing sugar alcohols prepared in Examples 1-2, 2 and 3 and the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of Comparative Example 1 In the same way, it was measured by the following method in real time using a rheometer.
  • %50 H 2 O 2 (min) was calculated from the results and shown in Table 3.
  • %50 H 2 O 2 (minutes) means the time it takes for the complex viscosity of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel to decrease to a level of 50% compared to the initial physical properties (complex viscosity) due to decomposition by active oxygen species (radicals). That is, the higher the value of %50 H 2 O 2 (min), the higher the resistance of the hydrogel of cross-linked hyaluronic acid to reactive oxygen species (radical).
  • Examples 1-2, 2 and 3 of the cross-linked hyaluronic acid hydrogel containing the sugar alcohol according to the present invention had % 50 H 2 O 2 (minutes) of 16.5 minutes, 18.4 minutes, and In contrast to 17.6 minutes, Comparative Example 1, which is a cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared by a conventional method, showed % 50 H 2 O 2 (minutes) of 14.6 minutes, so that the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention has relatively high radical resistance It was confirmed that the
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared in Example 1-1 and the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of Comparative Examples 2 to 4 were stored under severe conditions (55° C. ⁇ 2° C., 75% RH ⁇ 5% RH) for 4 weeks.
  • the complex viscosity at 0.02 Hz was measured using a rheometer, and the residual ratio (%) of the complex viscosity was calculated and the results are shown in FIG. 3 (unit: cP).
  • the complex viscosity residual rate (%) represents the ratio of the current complex viscosity to the initial complex viscosity, and the larger the value, the better the stability of the physical properties (complex viscosity).
  • the cross-linked hyaluronic acid hydrogel of Example 1-1 according to the present invention has a residual ratio of complex viscosity of about 93% or more, compared to the cross-linked hyaluronic acid of Comparative Examples 1 to 3, remaining (maintained) and
  • Comparative Examples 2 to 4 show a low complex viscosity residual ratio, it can be confirmed that the cross-linked hyaluronic acid hydrogel according to the present invention exhibits very good stability to heat.
  • the skin reaction results were evaluated by the irritation index.
  • the irritation index is an evaluation value for the tissue reaction of the substance when administered to an animal, and the higher the value, the lower the biocompatibility. Severely irritant of 9.0 to 15.0 was evaluated as >15.0, and the results are shown in FIG. 4 .
  • the irritation index of Comparative Examples 5 and 6 is about 18 and 8, respectively, whereas the irritation index of Example 1 shows an irritation index value of about 5, compared with commercially available fillers for improving wrinkles. or a similar level, so it was confirmed that it exhibits appropriate biocompatibility as a filler injected into the body.

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Abstract

본원 발명은 가교제 및 폴리올을 이용하여, 가교시의 독성을 저감시켜 안전성이 높으면서도 높은 체내 지속성을 갖도록 하는 가교 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

Description

가교제 및 폴리올을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러
본원 발명은 가교제와 함께 폴리올을 사용하여 가교된 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러에 관한 것이다.
주름 개선을 위해 개발된 필러는 생체적합성이 높은 천연고분자인 히알루론산을 널리 사용한다. 히알루론산의 체내 지속기간을 늘리기 위해서 현재 다양한 가교제를 이용하여 가교된 히알루론산 하이드로겔 형태를 필러에 사용한다. 그러나 가교제는 일반적으로 독성이 높기 때문에 안정성 측면에서 많은 양을 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 가교 하이드로겔이라 하더라도 가교율이 낮은 경우에는 히알루론산 분해효소나 활성산소종(라디컬) 등에 의해 분해가 빠르게 일어난다는 단점이 있어 안정성과 체내 지속성을 모두 높이기에는 어려움이 있었다.
본원 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 종래 사용되는 가교제와 함께 당알코올과 같은 폴리올을 사용하여 히알루론산을 가교시키는 경우, 히알루론산 분해효소, 활성산소종(라디컬) 및/또는 열에 대한 안정성이 탁월하게 향상될 뿐 아니라 적은 양의 가교제를 사용함으로 인해 독성이 현저하게 저감되어 생체적합성이 높은 필러를 제조할 수 있다는 점을 확인하여 본원 발명을 완성하였다.
따라서, 본원 발명은 가교시의 독성을 저감시켜 안전성이 높으면서도 높은 체내 지속성을 갖도록 하는 가교 히알루론산 하이드로겔 및 이를 포함하는 필러용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원 발명의 일 측면에 따르면, 본원 발명히알루론산 또는 이의 염, 가교제 및 폴리올을 포함하며, 상기 히알루론산 또는 이의 염이 상기 가교제 및 폴리올로 가교된 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 하이드로겔 및 상기 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러가 제공될 수 있다.
본원 발명의 일 측면에 따르면, 상기 필러는 연조직 주입용, 예를 들면 피부주입용이며, 상기 필러는 필링 특성, 예를 들면 생물학적 조직의 필링(filling), 주름의 필링(filling wrinkle)에 의한 주름개선, 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 윤곽 교정, 또는 연조직의 용적(volume) 수복 또는 증가와 같은 필러 용도로서 사용될 수 있다.
본원 발명의 일 측면에 따르면 상기 폴리올은 당알코올일 수 있다.
본원 발명의 일 측면에 따르면, 히알루론산 또는 이의 염을 폴리올과 혼합하는 단계 및 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합한 용액을 상기 히알루론산 또는 이의 염 및 폴리올의 혼합물에 넣고 반응시키는 단계를 포함하는 상기 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조방법이 제공될 수 있다.
본원 발명의 일 측면에 따르면, 상기 가교 히알루론산을 포함하는 필러가 충진된 프리필드시린지가 제공될 수 있다.
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔은 가교제와 함께 폴리올을 함께 사용하여 제조됨으로 인해 히알루론산 분해효소, 체내 활성산소종 및 보관온도에 의한 저항성이 증가한다. 따라서, 이러한 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는 보관 기간 내 안정성이 증가되고, 독성이 저감되어 높은 안전성을 나타내면서 탁월한 체내 지속성을 가지는 바, 연조직의 수복 또는 부피 확대 및 주름개선 효과가 우수하다.
도 1은 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교제 및 만니톨을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 인 비트로 효소 저항성 결과를 비교예 2 내지 4와 비교한 그래프이다.
도 2는 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교제 및 만니톨을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 인 비트로 라디칼 저항성 결과를 비교예 2 내지 4와 비교한 그래프이다.
도 3은 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교제 및 만니톨을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 인 비트로 열 저항성 결과를 비교예 2 내지 4와 비교한 그래프이다.
도 4는 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교제 및 만니톨을 사용하여 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 인 비보 생체적합성 시험 결과를 비교예 2 내지 4와 비교한 그래프이다.
이하, 본원 발명을 상세하게 설명한다.
본원 발명의 가교 히알루론산 하이드로겔에 함유된 히알루론산(이하, 'HA'라고도 함)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 이당류 반복 단위(disaccharide unit)가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다.
구체적으로 본원 발명에 따른 히알루론산 하이드로겔에 함유된 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산의 염을 의미할 수 있다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원 발명에서, 상기 가교반응에 사용된 히알루론산의 중량평균 분자량은 1,000,000 Da 이상, 1,500,000 Da 이상, 2,000,000 Da 이상, 2,300,000 Da 이상, 또는 2,500,000 Da 이상일 수 있으며, 예를 들면, 1,000,000 내지 1,500,000 Da, 1,000,000 내지 2,000,000 Da, 1,000,000 내지 3,000,000 Da, 1,000,000 내지 4,000,000 Da, 1,500,000 내지 2,000,000 Da, 1,500,000 내지 3,000,000 Da, 1,500,000 내지 4,000,000 Da, 2,000,000 내지 4,000,000 Da, 2,300,000 내지 4,000,000 Da, 2,000,000 내지 3,700,000 Da, 2,200,000 내지 3,700,000 Da, 또는 2,500,000 내지 3,500,000 Da 이다.
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔은 상기 히알루론산 또는 이의 염을 가교제 및 폴리올을 사용하여 가교결합된 것임을 특징으로 한다.
본원 발명에서 사용되는 용어 "가교된(crosslinked)"은 개별 폴리머 분자, 또는 모노머 사슬을 겔(gel)과 같은 더욱 안정한 구조로 결합시키는 분자간 결합을 의미한다. 이와 같이, 가교된 폴리머는 최소 하나의 개별 폴리머 분자를 또 다른 것에 연결시키는 최소 하나의 분자간 결합을 가진다.
본원 발명에 따른 가교된 히알루론산 하이드로겔은 종래 가교제만으로 가교된 히알루론산 하이드로겔과는 달리, 상기 히알루론산 또는 이의 염을 가교제 및 폴리올을 사용하여 가교되는 것을 특징으로 한다.
용어 “가교제”는 히알루론산 사슬 사이에 가교를 유도할 수 있는 임의의 화합물을 의미하며, 본원 발명에서 상기 가교제는 히알루론산 또는 이의 염을 가교시킬 수 있는 것은 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있다. 가교제의 바람직한 예로 비-에폭시 가교제로서 내인성(endogeneous) 폴리아민, 알데히드, 카보디이미드, 디비닐설폰을 들 수 있다. 또한 에폭시 가교제로는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 바이에폭사이드계인 1,4-부탄디올글리시딜에테르가 낮은 독성을 갖는다는 면에서 특히 바람직하다.
상기 가교제와 함께 히알루론산 또는 이의 허용가능한 염을 가교시키는 폴리올은 가교제와 연결되어 히알루론산 또는 이의 허용가능한 염을 가교시킨다. 이러한 폴리올은 자유 하이드록시기를 2 이상 포함하는 유기 분자를 의미하는 것으로, 탄소 원자 2 내지 20개를 갖는 폴리올, 더욱 구체적으로 당알코올일 수 있다. 본원 발명에 적합한 폴리올은, 그의 알킬 사슬 상에, 적어도 2개의 -OH 관능기, 예를 들어 3개 이상의 -OH 관능기, 및 보다 구체적으로 4개 이상의 -OH 관능기를 갖는, 포화 또는 불포화, 선형, 분지형 또는 고리형 알킬 함유(alkyl-bearing) 화합물일 수 있다. 폴리올의 비제한적인 예는 다음과 같다: 글리세린, 1,3-프로판디올, 이소프렌 글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌 글리콜; 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜 및 디프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 2 내지 6 반복 단위의 폴리글리세롤, 예컨대 디글리세롤, 에리스리톨, 아라비톨, 아도니톨, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 둘시톨, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 트레할로스, 말토스, 사카로스 및 락토스; 및 예컨대 메틸글루코사이드 포스페이트와 같은 이들의 유도체 및 이들의 혼합물. 보다 구체적으로, 상기 폴리올은 만니톨, 솔비톨 및 자일리톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 본원 발명에서 폴리올은 상기 -OH 관능기가 활성산소종과 반응하여 활성산소종을 비활성상태로 만들 수 있어, 활성산소종에 의한 필러 분해를 억제할 수 있다.
구체적인 일 예로서, 히알루론산 또는 이의 허용가능한 염은 가교제 및 폴리올과 다음과 같이 연결될 수 있다.
Figure PCTKR2022000338-appb-img-000001
즉, 히알루론산 또는 이의 허용가능한 염의 하이드록시기와 가교제 양 말단의 에폭사이드기 중 하나와 연결되며, 가교제 다른 말단의 에폭사이드기와 폴리올의 하이드록시기가 연결되어 히알루론산-가교제-폴리올의 형태가 된다. 나아가, 상기 폴리올의 다른 하이드록시기가 새로운 히알루론산 또는 이의 허용가능한 염의 하이드록시기와 아래와 같이 계속적으로 연결되어 결국 가교 히알루론산 하이드로겔이 제조된다.
Figure PCTKR2022000338-appb-img-000002
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔은 약 3 내지 약 100, 바람직하게는 약 3 내지 약 80, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 50 범위의 변형도 (MoD, Modification degree) 를 갖는다.
또한, 본원 발명에서 용어 "변형도 (Modification degree, MoD)”는 전체 단위 히알루론산의 몰수에 대한 히알루론산에 결합된 총 가교제의 몰비를 의미하는 것으로, 하기 수학식 1과 같이 나타내어질 수 있다.
[수학식 1]
변형도(Modification degree, MoD) = 히알루론산에 결합된 가교제의 몰수 / 단위 히알루론산의 몰수
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔은, 가교 히알루론산 하이드로겔의 총 중량에 대하여 약 10 mg/g 내지 약 40 mg/g, 바람직하게는 약 15 mg/g 내지 약 35 mg/g, 더욱 더 바람직하게는 약 20 mg/g 내지 약 30 mg/g의 총 히알루론산을 포함할 수 있다.
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔은 히알루론산 또는 이의 염과 화학적으로 결합된 폴리올이 활성산소종에 의한 히알루론산의 분해를 대체하는 효과를 나타내며, 히알루론산 분해효소가 결합하여 분해하는 기작을 구조적으로 방해하여, 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러를 인체 내에 주입하는 경우 필러의 분해가 억제되는 효과를 나타내어 체내 주입 후에 지속성이 증가된다는 장점을 갖는다. 또한 가교 히알루론산 하이드로겔은 상기와 같은 효소뿐만 아니라 열에 의해서도 히알루론산 분자 사이의 화학적 결합이 상대적으로 약한 β-1-4-글리코시드 결합(β-1-4-glycosidic bond)이 끊어져 분해될 수 있는데, 본원 발명에 따르면 폴리올이 이러한 히알루론산의 열분해를 억제하는 열안정성을 가져 저장시 장점을 가지므로 필러로서 매우 유용하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본원 발명은 가교제 및 폴리올을 사용하는 상기 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조방법은, (i) 히알루론산 또는 이의 염을 폴리올과 혼합하는 단계; 및 (ii) 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합한 용액을 상기 히알루론산 또는 이의 염 및 폴리올의 혼합물에 넣고 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법에서, 히알루론산 또는 이의 염, 가교제, 폴리올에 관한 사항은 달리 언급이 없는 한 상기 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 것을 동일하게 적용할 수 있다.
또한 히알루론산 또는 이의 염의 중량 평균 분자량이 1,000,000 Da 이상, 1,500,000 Da 이상, 2,000,000 Da 이상, 2,300,000 Da 이상, 또는 2,500,000 Da 이상일 수 있으며, 예를 들면, 1,000,000 내지 1,500,000 Da, 1,000,000 내지 2,000,000 Da, 1,000,000 내지 3,000,000 Da, 1,000,000 내지 4,000,000 Da, 1,500,000 내지 2,000,000 Da, 1,500,000 내지 3,000,000 Da, 1,500,000 내지 4,000,000 Da, 2,000,000 내지 4,000,000 Da, 2,300,000 내지 4,000,000 Da, 2,000,000 내지 3,700,000 Da, 2,200,000 내지 3,700,000 Da, 또는 2,500,000 내지 3,500,000 Da 이다.
한편, 상기 제조방법에서 사용되는 폴리올의 농도는 히알루론산 또는 이의 염에 대해 5 내지 100 mol%, 10 내지 100mol%, 10 내지 90mol% 또는 10 내지 80mol%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 반응 조건에 따라 적절히 조절가능하다.
또한, 상기 알칼리 수용액은 히알루론산의 가교에 적합한 알칼리 수용액으로 알려진 것은 제한없이 사용가능한데, 예를 들어, NaOH, KOH, NaHCO3, LiOH 또는 이들의 조합일 수 있고, 바람직하게는 NaOH일 수 있다. 이러한 알칼리 수용액의 농도는 0.1 내지 0.5N일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제조방법에서 사용되는 알칼리 수용액의 농도는 히알루론산 또는 이의 염에 대해 5 내지 100 mol%, 10 내지 100mol%, 10 내지 90mol% 또는 10 내지 80mol%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 반응 조건에 따라 적절히 조절가능하다.
가교제 및/또는 폴리올의 농도가 상기 범위를 초과하는 고농도로 사용되는 경우, 탄성이 지나치게 높은 필러가 수득되고, 농도가 상기 범위 미만인 경우 탄성이 지나치게 낮아 적절한 점탄성을 나타낼 수 없다. 가교 반응은 구체적으로 히알루론산 또는 이의 염과 폴리올의 혼합물, 그리고 가교제 및 알칼리 수용액을 교반하여 균질하게 혼합한후 이를 일정 시간 유지시킴으로써 반응시킬 수 있다. 가교 반응시의 온도는 상온 이상, 바람직하게는 25 내지 65℃ 또는 27 내지 55℃의 온도 범위에서 1 내지 22 시간 또는 2 내지 20시간 수행될 수 있다.
본원 발명에 따른 제조방법에서 전체 반응 농도(즉, 히알루론산, 폴리올 및 용매의 총 중량에 대한 히알루론산 및 폴리올의 합산 중량의 비)는 5 내지 30% (w/w), 또는 10 내지 30% (w/w)이다.
본원 발명의 구체적인 일 실시예에서는 히알루론산 대비 10mol%의 만니톨, 솔비톨 또는 자일리톨을 히알루론산과 혼합하고, NaOH 용액과 1,4-BDDE를 혼합한 용액을 섞고 30 내지 50℃에서 2시간 유지 후, 가교겔을 세척/중화/팽윤시킨 후, 메시망을 이용하여 분쇄를 한 후 멸균하여 물질을 제조하였다.
또 다른 양태에서, 본원 발명은 상기 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러에 관한 것이다.
상기 필러는 전체 필러 중량 대비 0.5 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%의 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함할 수 있다.
또한, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는 상기 가교 히알루론산 하이드로겔뿐만 아니라 주입시 환자의 고통을 감소시키기 위하여 마취제를 더 포함할 수 있다.
상기 마취제로는 당업계에 공지인 마취제, 바람직하게 국소 마취제를 1종 이상 포함하는 것이고, 이러한 하나 이상의 마취제의 농도는 조성물의 주사시 경험하게 되는 통증을 완화시키는 데 효과적인 양이다. 상기 마취제의 예로는 암부카인(ambucaine), 아몰라논(amolanone), 아밀로카인(amylocaine), 베녹시네이트(benoxinate), 벤조카인(benzocaine), 베톡시카인(betoxycaine), 비페나민(biphenamine), 부피바카인(bupivacaine), 부타카인(butacaine), 부탐벤(butamben), 부타닐리카인(butanilicaine), 부테타민(butethamine), 부톡시카인(butoxycaine), 카르티카인(carticaine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 코카에틸렌(cocaethylene), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 다이부카인(dibucaine), 다이메티소퀸(dimethysoquin), 다이메토카인(dimethocaine), 디페로돈(diperodon), 다이사이클로닌(dycyclonine, 에크고니딘(ecgonidine), 에크고닌(ecgonine), 에틸 클로라이드(ethyl chloride), 에티도카인(etidocaine), 베타-유카인(beta-eucaine), 유프로신(euprocin), 페날코민(fenalcomine), 포르모카인(formocaine), 헥실카인(hexylcaine), 하이드록시테트라카인(hydroxytetracaine), 아이소부틸 p-아미노벤조에이트 (isobutyl paminobenzoate), 류시노카인 메실레이트(leucinocaine mesylate), 레복사드롤(levoxadrol), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 메프릴카인(meprylcaine), 메타부톡시카인(metabutoxycaine), 메틸 클로라이드(methyl chloride), 미르테카인(myrtecaine), 나에파인(naepaine), 옥타카인(octacaine), 오르소카인(orthocaine), 옥세타자인(oxethazaine), 파레톡시카인(parethoxycaine), 페나카인(phenacaine), 페놀(phenol), 피페로카인(piperocaine), 피리도카인(piridocaine), 폴리도카놀(polidocanol), 프라목신(pramoxine), 프릴로카인(prilocaine), 프로카인(procaine), 프로파노카인(propanocaine), 프로파라카인(proparacaine), 프로피오카인(propipocaine), 프로록시카인(propoxycaine), 슈도코카인(psuedococaine), 피로카인(pyrrocaine), 로피바카인(ropivacaine), 살리실 알코올(salicyl alcohol), 테트라카인(tetracaine), 톨릴카인(tolycaine), 트리메카인(trimecaine), 졸라민(zolamine), 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 마취제는 리도카인, 예들 들어, 리도카인 염산염의 형태일 수 있다.
본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러에 있어서, 상기 필러에 포함되는 마취제의 농도는 필러 전체 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 1.0 중량%, 예를 들어, 조성물의 약 0.2중량% 내지 약 0.5중량%일 수 있다. 바람직하게는 0.3 중량%일 수 있다.
본원 발명에 따른 필러 중의 마취제의 농도는 치료학적으로 효과적일 수 있으며, 이는 환자에게 유해하지 않으면서 시술의 편의성과 환자의 순응도 측면에서 이점을 제공하기에 적합한 농도를 의미한다.
또한 본원 발명에 따른 필러는 완충액을 더 포함할 수 있고, 완충액은 히알루론산 하이드로겔의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 바람직한 완충액의 예로는 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N′-비스(2-에탄술폰산)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 완충액을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 완충액 중에 포함되는 상기 성분들의 함량은 적절히 조절될 수 있으나, 바람직하게는 완충액에 대해 0.3 내지 2.0g/L의 농도로 포함될 수 있다.
또한 본원 발명에 따른 필러는 등장화제를 더 포함할 수 있고, 이러한 등장화제는 필러의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 완충액에 포함될 수 있다. 바람직한 등장화제로서, 염화나트륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 등장화제의 함량은 필요에 따라 적절히 조절될 수 있고, 예를 들어 완충액에 대해 7.0 내지 9.0g/L 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 발명에 따른 일 실시예에서는 주사용수에 염화나트륨, 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 완충액을 사용하였다.
추가적인 양태로서, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는 상기 성분 외에도, 필러의 제조에 포함될 수 있는 허용가능한 성분들을 더 포함할 수 있다.
이러한 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는 열에 관한 안정성이 높아 종래 히알루론산 필러 제제에 비해 보관 기간이 탁월하게 증가될 수 있는 장점을 갖는다. 또한 히알루론산 분해 효소, 활성산소종(라디컬)에 의한 분해에 대해 저항성이 높아 인체 내에 주입 후 지속기간을 탁월하게 증대시킬 수 있다. 생체적합성 및 독성면에서 매우 탁월한 특성을 나타내는바, 미용 또는 치료적 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는, 생물학적 조직의 필링(filling), 주름의 필링(filling wrinkle)을 통한 주름개선, 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 입술, 코, 엉덩이, 볼 또는 가슴과 같은 연조직의 용적(volume)의 수복 또는 증가 등에 사용될 수 있다. 상기 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러는 이러한 용도에 알맞은 투여형태로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사제, 더욱 바람직하게는 사전충전형 주사제(프리필드 시린지)일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본원 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기와 같은 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 히알루론산 또는 이의 염을 폴리올과 혼합하는 단계;
(b) 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합한 용액을 상기 히알루론산 또는 이의 염 및 폴리올의 혼합물에 넣고 반응시켜 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 제조된 히알루론산 하이드로겔을 조분쇄하는 단계;
(d) 상기 단계 (b)에서 제조된 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 완충액을 사용하여 세척 및 팽윤시키는 단계; 및
(e) 단계 (d)에서 세척 및 팽윤된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계.
상기 단계 (a) 및 (b)는 히알루론산 또는 이의 염을 가교제와 폴리올을 사용하여 알칼리 수용액 상에서 가교 반응시켜 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계로서, 상기 히알루론산 또는 이의 염, 가교제, 폴리올, 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 사항은 상기 가교 히알루론산 하이드로겔 및 그 제조방법에서 언급된 것을 동일하게 적용할 수 있다.
상기 분쇄 공정(단계 (c))는 다양한 히알루론산 하이드로겔의 분쇄 공정을 이용할 수 있다. 일 실시예에서. 반응 후에 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔은 케잌(또는 원기둥)과 같은 형태로 얻어지고 이것을 작두 등과 같은 절단기를 이용하여 반달모양으로 분할, 예를 들어 6분할 할 수 있다. 이후에 일정한 칼날의 간격을 갖는 조분쇄기를 사용하여 상기와 같이 분할된 젤을 통과(바람직하게는 2회 이상)시켜 분쇄 공정을 수행할 수 있다.
상기 단계 (d)에서 사용되는 공지의 완충액 제조방법에 따라 제조할 수 있다. 또한 상기 완충액에는 추가적으로 마취제를 더 포함시킬 수 있다. 상기 완충액은 히알루론산 하이드로겔의 제조에 사용되는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 바람직한 완충액의 예로는 구연산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 아세트산, 디에틸 바비투르산(diethyl barbituric acid), 아세트산 나트륨(sodium acetate), TAPS(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판술폰산), Bicine(2-비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산), 트리스(트리스(하이드록시메틸)암모늄메탄), Tricine(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글라이신), HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), TES (2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]메탄술폰산) 및 PIPES (피페라진-N,N′-비스(2-에탄술폰산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 세척 및 팽윤은 1회 또는 2회 이상 반복될 수도 있다. 세척 및 팽윤이 완료되면 세척액을 제거할 수 있다.
상기 단계 (e)는 세척 및 팽윤된 하이드로겔을 분쇄하는 단계이며, 이러한 분쇄는 다양한 분쇄방법에 의해 수행될 수 있으나, 바람직하게는 압출 분쇄이다.
추가적인 양태로서, 상기 단계 (e) 이후에 제조된 가교 하이드로겔 필러는 멸균 및/또는 탈포 등의 공정을 거칠 수 있고. 적절한 용기, 예를 들어 시린지 등에 정량 충진, 밀봉 및 멸균될 수 있다.
이하, 본원 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본원 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본원 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본원 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본원 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실시예]
실시예 1-1: 본원 발명에 따른 만니톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조 (1)
본원 발명에 따른 만니톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하기 위하여, 다음의 공정을 실시하였다.
구체적으로, 300만Da의 평균분자량을 갖는 히알루론산 소듐염, 수산화나트륨, 가교제로서 BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether), 그리고 만니톨을 각각 칭량하였다.
히알루론산 1g을 칭량하고, 히알루론산 중량 대비 10mol%의 만니톨을 칭량한 후 믹서(mixer) 통에 넣고 혼합하였다. 별도의 용기(50mL 튜브)에 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 전체 반응 농도가 히알루론산 중량 대비 10% (w/w)가 되도록 칭량하여 넣고, 히알루론산 중량 대비 100mol%의 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)를 넣어 혼합하였다. 용기에 들어있는 혼합물을 히알루론산과 만니톨이 혼합 되어있는 믹서(mixer)통에 투입하고 믹서를 이용하여 혼합한 후, 믹서통을 항온 수조에 넣고 50℃에서 2시간 유지하면서 가교 결합(crosslinking)을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝나 수득된 가교 히알루론산 하이드로겔을 일정 크기로 조분쇄하고, 완충용액(인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인 염산염 3g/L을 주사용수가 담긴 500ml 보틀 용기에서 용해시켜 조제된 완충용액)을 이용하여 1시간씩 6회 세척 및 팽윤 시켰다. 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄한 뒤 250ml 보틀 용기로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 250ml 보틀 용기에서 히알루론산 하이드로겔을 압출하며 메시망을 이용하여 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 250ml 보틀 용기로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 열처리하여 멸균시켜 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 1-2: 본원 발명에 따른 만니톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조 (2)
본원 발명에 따른 만니톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하기 위하여, 다음의 공정을 실시하였다.
구체적으로, 300만Da의 평균분자량을 갖는 히알루론산 소듐염, 수산화나트륨, 가교제로서 BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether), 그리고 만니톨을 각각 칭량하였다.
히알루론산 2g을 칭량하고, 히알루론산 중량 대비 10mol%의 만니톨을 칭량한 후 믹서(mixer) 통에 넣고 혼합하였다. 별도의 용기(50mL 튜브)에 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 전체 반응 농도가 히알루론산 중량 대비 15% (w/w)가 되도록 칭량하여 넣고, 히알루론산 중량 대비 5mol%의 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)를 넣어 혼합하였다. 용기에 들어있는 혼합물을 히알루론산과 만니톨이 혼합 되어있는 믹서(mixer)통에 투입하고 믹서를 이용하여 혼합한 후, 믹서통을 항온 수조에 넣고 30℃에서 19시간 유지하면서 가교 결합(crosslinking)을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝나 수득된 가교 히알루론산 하이드로겔을 일정 크기로 조분쇄하고, 완충용액(인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인 염산염 3g/L을 주사용수가 담긴 500ml 보틀 용기에서 용해시켜 조제된 완충용액)을 이용하여 2시간동안 1회, 1시간동안 2회 세척 및 팽윤 시켰다. 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄한 뒤 150ml 보틀 용기로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 150ml 보틀 용기에서 히알루론산 하이드로겔을 압출하며 메시망을 이용하여 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 150ml 보틀 용기로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 열처리하여 멸균시켜 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 2: 본원 발명에 따른 솔비톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조
본원 발명에 따른 솔비톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하기 위하여, 다음의 공정을 실시하였다.
구체적으로, 300만Da의 평균분자량을 갖는 히알루론산 소듐염, 수산화나트륨, 가교제로서 BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether), 그리고 솔비톨을 각각 칭량하였다.
히알루론산 2g을 칭량하고, 히알루론산 중량 대비 10mol%의 솔비톨을 칭량한 후 믹서(mixer) 통에 넣고 혼합하였다. 별도의 용기(50mL 튜브)에 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 전체 반응 농도가 히알루론산 중량 대비 15% (w/w)가 되도록 칭량하여 넣고, 히알루론산 중량 대비 5mol%의 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)를 넣어 혼합하였다. 용기에 들어있는 혼합물을 히알루론산과 솔비톨이 혼합 되어있는 믹서(mixer)통에 투입하고 믹서를 이용하여 혼합한 후, 믹서통을 항온 수조에 넣고 30℃에서 19시간 유지하면서 가교 결합(crosslinking)을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝나 수득된 가교 히알루론산 하이드로겔을 일정 크기로 조분쇄하고, 완충용액(인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인 염산염 3g/L을 주사용수가 담긴 500ml 보틀 용기에서 용해시켜 조제된 완충용액)을 이용하여 2시간동안 1회, 1시간동안 2회 세척 및 팽윤 시켰다. 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄한 뒤 150ml 보틀 용기로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 150ml 보틀 용기에서 히알루론산 하이드로겔을 압출하며 메시망을 이용하여 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 150ml 보틀 용기로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 열처리하여 멸균시켜 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 3: 본원 발명에 따른 자일리톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조
본원 발명에 따른 자일리톨 및 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하기 위하여, 다음의 공정을 실시하였다.
구체적으로, 300만Da의 평균분자량을 갖는 히알루론산 소듐염, 수산화나트륨, 가교제로서 BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether), 그리고 자일리톨을 각각 칭량하였다.
히알루론산 2g을 칭량하고, 히알루론산 중량 대비 10mol%의 자일리톨을 칭량한 후 믹서(mixer) 통에 넣고 혼합하였다. 별도의 용기(50mL 튜브)에 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 전체 반응 농도가 히알루론산 중량 대비 15% (w/w)가 되도록 칭량하여 넣고, 히알루론산 중량 대비 5mol%의 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)를 넣어 혼합하였다. 용기에 들어있는 혼합물을 히알루론산과 자일리톨이 혼합 되어있는 믹서(mixer)통에 투입하고 믹서를 이용하여 혼합한 후, 믹서통을 항온 수조에 넣고 30℃에서 19시간 유지하면서 가교 결합(crosslinking)을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝나 수득된 가교 히알루론산 하이드로겔을 일정 크기로 조분쇄하고, 완충용액(인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인 염산염 3g/L을 주사용수가 담긴 500ml 보틀 용기에서 용해시켜 조제된 완충용액)을 이용하여 2시간동안 1회, 1시간동안 2회 세척 및 팽윤 시켰다. 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄한 뒤 150ml 보틀 용기로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 150ml 보틀 용기에서 히알루론산 하이드로겔을 압출하며 메시망을 이용하여 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 150ml 보틀 용기로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 열처리하여 멸균시켜 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
비교예 1: 종래 방법에 따른 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조
종래 방법에 따른 가교제로 가교된 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하기 위하여, 다음의 공정을 실시하였다.
구체적으로, 300만Da의 평균분자량을 갖는 히알루론산 소듐염, 수산화나트륨, 가교제로서 BDDE (1,4-butanediol diglycidyl ether)을 각각 칭량하였다.
히알루론산 2g을 칭량하고, 별도의 용기(50mL 튜브)에 0.25N 농도의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 전체 반응 농도가 히알루론산 중량 대비 15% (w/w)가 되도록 칭량하여 넣고, 히알루론산 중량 대비 5mol%의 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)를 넣어 혼합하였다. 용기에 들어있는 혼합물을 히알루론산이 들어있는 믹서(mixer)통에 투입하고 믹서를 이용하여 혼합한 후, 믹서통을 항온 수조에 넣고 30℃에서 19시간 유지하면서 가교 결합(crosslinking)을 완료시킨다. 이후, 반응이 끝나 수득된 가교 히알루론산 하이드로겔을 일정 크기로 조분쇄하고, 완충용액(인산일수소나트륨수화물(십이수화물) 1.26g/L, 인산이수소나트륨수화물(일수화물) 0.46g/L, 염화나트륨 7g/L, 리도카인 염산염 3g/L을 주사용수가 담긴 500ml 보틀 용기에서 용해시켜 조제된 완충용액)을 이용하여 2시간동안 1회, 1시간동안 2회 세척 및 팽윤 시켰다. 세척 및 팽윤이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄한 뒤 150ml 보틀 용기로 옮겨 무게를 재고 겔 무게가 목표무게에 도달하도록 완충용액을 넣어 1차 함량 보정을 하였다. 1차 함량 보정이 완료되면 150ml 보틀 용기에서 히알루론산 하이드로겔을 압출하며 메시망을 이용하여 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 150ml 보틀 용기로 이송하고 균질화를 시킨 후 함량을 측정하고 완충용액을 투입하여 2차 함량보정을 실시하였다. 함량 보정이 완료된 히알루론산 하이드로겔을 121℃ 이상의 온도에서, 10분 이상 열처리하여 멸균시켜 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
비교예 2,3,4,5, 6 및 7
시중에서 판매중인 주름개선용 필러 A, B, C, D, E 및 F를 각각 비교예 2 내지 7로 하여 시험하였다.
[비교예 2-7의 필러]
A: 쥬비덤 볼루마 리도카인 (Juvederm voluma lidocaine), 앨러간 (Allergan)사
B: 레스틸렌 리도카인 (Restylane lidocaine), 갈더마 (Galderma) 사
C: 이브아르 볼륨에스 (YVOIRE volume s), LG화학
D: 엘란쎄 (Ellanse), 싱클레어 (Sinclair)사
E: 클레비엘 (Cleviel), 파마리서치프러덕트 (Pharma Research Products) 사
F: 이브아르 클래식플러스 (YVOIRE classic plus), LG화학
실험예 1: 본원 발명에 의해 제조한 가교 히알루론산 하이드로겔의 점탄성 특성 조사
제조된 실시예 1-2, 2 및 3 및 비교예 1의 유동학적 특성 규명을 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 분석하였다. 분석 조건은 다음과 같다.
<분석조건>
진동 회전형 레오미터(Oscillatory and Rotational Rheometer)의 분석조건
복소점도(η*) 시험의 경우
(1) 시험장비 : Rheometer (Anton Paar Ltd., MCR301)
(2) Frequency: 1 Hz
(3) Temperature: 25 ℃
(4) Strain: 4 %
(5) Measuring geometry: 25 mm plate
(9) Measuring gap: 1.0 mm
분석 결과는 표 1에 나타내었다.
시료 복소점도 (x104 cP)
실시예 1-2 380
실시예 2 381
실시예 3 410
비교예 1 370
각 시료의 복소점도 분석 결과, 당알콜인 만니톨, 솔비톨 및 자일리톨을 사용하여 제조한 가교 히알루론산 하이드로겔인 실시예 1-2, 2 및 3의 복소점도가 가교제만 사용하여 제조한 비교예 1보다 높은 것으로 확인되었다.
실험예 2-1: 생체 외( In vitro ) 효소 저항성 조사 (1)
가교된 히알루론산(HA) 하이드로겔이 체내에 주입될 경우, 이 가교된 히알루론산하이드로겔은 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 의한 직접적인 분해 공격을 받아 분해가 이루어지게 된다. 샘플에 히알루로니다아제를 직접 투입하여 그 분해 경향성을 확인하고 효소에 대한 저항성을 측정할 수가 있다. 구체적으로 효소저항성 시험은 레오미터를 사용하여 다음의 방법에 따라 in situ로 진행되었다.
실시예 1-2, 2 및 3에 의해 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1의 가교 히알루론산 하이드로겔을 각각 분쇄 후 최종 멸균한 후, 멸균된 시료 1g을 50mL 튜브에 칭량한 후, 500unit/mL로 제조한 히알루로니다아제 200uL를 넣고 섞어주었다. 효소와 혼합한 시료를 레오미터에 로딩하고 37℃로 온도를 설정한 후 실시간으로 시료의 복소점도를 측정하였다. 히알루로니다아제 저항성이 높을수록 복소점도 초기값 대비 복소점도의 잔존율이 높다. 복소점도의 잔존율이 높을수록 효소에 대한 저항성이 높음을 의미한다. 상기 측정결과에 기초하여 %50 Hase (분)을 계산하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 상기 %50 Hase (분)은 가교 히알루론산 하이드로겔의 복소점도가 효소의 분해로 인해 초기 물성대비 50% 수준으로 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 즉 %50 Hase(분)의 값이 클수록 가교 히알루론산의 하이드로겔의 저항성이 높음을 의미한다.
시료 %50 Hase (분)
실시예 1-2 42
실시예 2 45
실시예 3 41
비교예 1 33
표 2에서도 확인되는 바와 같이, 본원 발명에 따른 당알콜이 포함된 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 실시예 1 내지 3은 %50 Hase(분)이 각각 42분, 45분 및 41분임에 반해, 종래 방법으로 제조한 가교 히알루론산 하이드로겔인 비교예 1의 경우 33분의 %50 Hase(분)를 나타내어 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔이 상대적으로 높은 효소 저항성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 2-2: 생체 외( In vitro ) 효소 저항성 조사 (2)
효소저항성 시험은 레오미터를 사용하여 다음의 방법에 따라 in situ로 진행되었다.
실시예 1-1에 의해 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 2 내지 4의 가교 히알루론산 하이드로겔을 각각 분쇄 후 최종 멸균한 후, 멸균된 시료 1g을 50mL 튜브에 칭량한 후, 500unit/mL로 제조한 히알루로니다아제 10uL를 넣고 섞어주었다. 효소와 혼합한 시료를 레오미터에 로딩하고 37℃로 온도를 설정한 후 6시간동안 실시간으로 시료의 복소점도를 측정하였다. 상기 측정결과에 기초하여 %50 Hase (분)을 계산하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서도 확인되는 바와 같이, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 실시예 1-1은 %50 Hase(분)이 약 32 분 정도임에 반해, 시판되고 있는 가교 히알루론산 하이드로겔인 비교예 2 내지 4의 경우 각각 10, 4 및 6분 정도의 %50 Hase(분)를 나타내어 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔이 세배 이상 높은 효소 저항성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3-1: 생체 외( In vitro ) 라디칼 저항성 조사 (1)
실시예 1-1에 의해 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 2 내지 4의 가교 히알루론산 하이드로겔의 퍼옥시 라디칼에 의해 유도되는 분해에 대한 저항성을 측정하고자 효소 저항성 실험과 마찬가지로 레오미터를 이용하여 실시간으로 하기와 같은 방법에 의해 측정하였다.
멸균된 시료 1g을 50mL 튜브에 칭량한 후, 1몰 과산화수소 (H2O2) 10uL와 1몰 아스코빅산 (ascorbic acid) 10uL를 넣고 섞어주었다. 혼합한 시료를 레오미터에 로딩하고 37℃로 온도를 설정한 후 6시간동안 실시간으로 시료의 복소점도를 측정하였다. 상기 결과로부터 %50 H2O2(분)을 계산하여 도 2에 나타내었다. %50 H2O2(분)은 가교 히알루론산 하이드로겔의 복소점도가 활성산소종(라디칼)에 의한 분해로 인해 초기 물성(복소점도) 대비 50% 수준으로 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 즉 %50 H2O2 (분)의 값이 클수록 활성산소종(라디칼)에 대한 가교 히알루론산의 하이드로겔의 저항성이 높음을 의미한다.
도 2에서도 확인되는 바와 같이, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 실시예 1은 %50 H2O2(분)이 약 32 분 정도임에 반해, 시판되고 있는 가교 히알루론산 하이드로겔인 비교예 2 내지 4의 경우 각각 5, 7.5 및 18분 정도의 %50 H2O2(분)를 나타내어 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교 히알루론산 하이드로겔이 세배 이상 높은 효소 저항성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3-2: 생체 외( In vitro ) 라디칼 저항성 조사 (2)
실시예 1-2, 2 및 3에 의해 제조된 당알콜이 포함된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1 의 가교 히알루론산 하이드로겔의 퍼옥시 라디칼에 의해 유도되는 분해에 대한 저항성을 측정하고자 효소 저항성 실험과 마찬가지로 레오미터를 이용하여 실시간으로 하기와 같은 방법에 의해 측정하였다.
멸균된 시료 1g을 50mL 튜브에 칭량한 후, 1몰 과산화수소 (H2O2) 10uL와 1몰 아스코빅산 (ascorbic acid) 10uL를 넣고 섞어주었다. 혼합한 시료를 레오미터에 로딩하고 37℃로 온도를 설정한 후 실시간으로 시료의 복소점도를 측정하였다. 상기 결과로부터 %50 H2O2 (분)을 계산하여 표 3에 나타내었다. %50 H2O2 (분)은 가교 히알루론산 하이드로겔의 복소점도가 활성산소종(라디칼)에 의한 분해로 인해 초기 물성(복소점도) 대비 50% 수준으로 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 즉 %50 H2O2 (분)의 값이 클수록 활성산소종(라디칼)에 대한 가교 히알루론산의 하이드로겔의 저항성이 높음을 의미한다.
시료 %50 H2O2 (분)
실시예 1-2 16.5
실시예 2 18.4
실시예 3 17.6
비교예 1 14.6
표 3에서도 확인되는 바와 같이, 본원 발명에 따른 당알콜이 포함된 가교 히알루론산 하이드로겔에 관한 실시예 1-2, 2 및 3은 %50 H2O2 (분)이 각각 16.5분, 18.4분 및 17.6분임에 반해, 종래 방법으로 제조한 가교 히알루론산 하이드로겔인 비교예 1의 경우 14.6분의 %50 H2O2 (분)를 나타내어 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔이 상대적으로 높은 라디칼 저항성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 4: 생체 외( In vitro ) 열 저항성 조사
실시예 1-1에 의해 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 2 내지 4의 가교 히알루론산 하이드로겔을 가혹조건 (55℃±2℃, 75% RH±5% RH)에서 4주 동안 보관하면서 레오미터를 사용하여 0.02Hz에서의 복소점도를 측정하여, 복소점도의 잔존율(%)를 계산하여 그 결과를 도 3에 나타내었다(단위: cP). 복소점도 잔존율(%)은 초기 복소점도 대비 현재 복소점도의 비를 나타내는 것으로 값이 클수록 물성(복소점도)의 안정성이 좋다는 것을 의미한다.
도 3에서 보듯이, 본원 발명에 따른 실시예 1-1의 가교된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1 내지 3의 가교된 히알루론산에 비해 복소점도의 잔존률이 약 93% 이상 잔존(유지)되고 있으나, 이에 반해 비교예 2 내지 4는 낮은 복소점도 잔존율을 나타내는바, 본원 발명에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔이 열에 대한 매우 우수한 안정성을 나타낸 것임을 확인할 수 있다.
실험예 5: 생체 내( In vivo ) 생체적합성 조사
실시예 1-1에 의해 제조된 가교 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 5 내지 7의 가교 히알루론산 하이드로겔의 생체적합성을 확인하고자 다음과 같은 시험을 수행하였다.
토끼(New Zealand White rabbit, 오리엔트바이오) 수컷을 이용해, 군당 6마리씩 피하에 시료를 0.3mL씩 투여하고 4주 후 부검하여 조직병리를 실시하였다. ISO10993-6 Annex E (Examples of evaluation of local biological effects after implantation)에 따라 실험하였다. 피부반응의 결과는 irritation index에 의해 평가하였다. Irritation index란 동물에 물질을 투여하는 경우 그 물질의 조직반응에 대한 평가값으로 값이 클수록 생체적합성이 떨어진다는 것을 의미하며, Non-irritant는 0.0~2.9, Slightly irritant는 3.0~8.9, Moderately irritant는 9.0~15.0 Severely irritant는 >15.0로 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 5 및 6의 irritation index가 각각 18 및 8 정도인데 반해, 실시예 1의 irritation index는 5 정도의 irritation index 수치를 나타내는바 시판되는 주름개선용 필러와 비교시 낮거나 유사한 수준을 나타내므로 체내에 주입하는 필러로서 적절한 생체적합성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (23)

  1. 히알루론산 또는 이의 염, 가교제 및 폴리올을 포함하며,
    상기 히알루론산 또는 이의 염이 상기 가교제 및 폴리올로 가교된 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산의 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸암모늄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  3. 제1항에 있어서, 평균 분자량이 1,000,000 내지 4,000,000 Da인 히알루론산 또는 그의 염을 가교시킨 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 내인성 폴리아민, 알데히드, 카보디이미드, 디비닐설폰, 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폴리올은 탄소 원자 2 내지 20개를 갖는 폴리올인 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리올은 글리세린, 1,3-프로판디올, 이소프렌 글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실렌 글리콜; 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 디글리세롤, 에리스리톨, 아라비톨, 아도니톨, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 둘시톨, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 트레할로스, 말토스, 사카로스, 락토스 및 메틸글루코사이드 포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  7. 제1항에 있어서, 0.1 내지 100의 변형도(Modification degree)를 갖는 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  8. 제1항에 있어서, 가교 히알루론산 하이드로겔의 총 중량에 대해 10mg/g 내지 35 mg/g의 총 히알루론산을 포함하는 것인, 가교 히알루론산 하이드로겔.
  9. (i) 히알루론산 또는 이의 염을 폴리올과 혼합하는 단계; 및
    (ii) 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합한 용액을 상기 히알루론산 또는 이의 염 및 폴리올의 혼합물에 넣고 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리올의 농도는 히알루론산 또는 이의 염에 대해 5 내지 100 mol%인 것인, 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 가교제의 농도는 히알루론산 또는 이의 염에 대해 5 내지 100 mol%인 것인, 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 전체 반응 농도는 히알루론산 중량 대비 5 내지 30% (w/w)인 것인, 제조방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 알칼리 수용액의 농도는 0.1 내지 0.5N인 것인, 제조방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 알칼리 수용액은 NaOH, KOH, NaHCO3, LiOH 또는 이들의 조합인 것인, 제조방법.
  15. 제1항 내지 제8항에 따른 가교 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 필러.
  16. 제15항에 있어서, 상기 필러는 피부주입용인, 필러.
  17. 제15항에 있어서, 상기 필러는 주름 개선, 연조직 수복 또는 부피 확대, 또는 윤곽 교정용인, 필러.
  18. 제15항에 있어서, 마취제를 더 포함하는 것인, 필러.
  19. 제18항에 있어서, 상기 마취제는 암부카인(ambucaine), 아몰라논(amolanone), 아밀로카인(amylocaine), 베녹시네이트(benoxinate), 벤조카인(benzocaine), 베톡시카인(betoxycaine), 비페나민(biphenamine), 부피바카인(bupivacaine), 부타카인(butacaine), 부탐벤(butamben), 부타닐리카인(butanilicaine), 부테타민(butethamine), 부톡시카인(butoxycaine), 카르티카인(carticaine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 코카에틸렌(cocaethylene), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 다이부카인(dibucaine), 다이메티소퀸(dimethysoquin), 다이메토카인(dimethocaine), 디페로돈(diperodon), 다이사이클로닌(dycyclonine, 에크고니딘(ecgonidine), 에크고닌(ecgonine), 에틸 클로라이드(ethyl chloride), 에티도카인(etidocaine), 베타-유카인(beta-eucaine), 유프로신(euprocin), 페날코민(fenalcomine), 포르모카인(formocaine), 헥실카인(hexylcaine), 하이드록시테트라카인(hydroxytetracaine), 아이소부틸 p-아미노벤조에이트 (isobutyl paminobenzoate), 류시노카인 메실레이트(leucinocaine mesylate), 레복사드롤(levoxadrol), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 메프릴카인(meprylcaine), 메타부톡시카인(metabutoxycaine), 메틸 클로라이드(methyl chloride), 미르테카인(myrtecaine), 나에파인(naepaine), 옥타카인(octacaine), 오르소카인(orthocaine), 옥세타자인(oxethazaine), 파레톡시카인(parethoxycaine), 페나카인(phenacaine), 페놀(phenol), 피페로카인(piperocaine), 피리도카인(piridocaine), 폴리도카놀(polidocanol), 프라목신(pramoxine), 프릴로카인(prilocaine), 프로카인(procaine), 프로파노카인(propanocaine), 프로파라카인(proparacaine), 프로피오카인(propipocaine), 프로록시카인(propoxycaine), 슈도코카인(psuedococaine), 피로카인(pyrrocaine), 로피바카인(ropivacaine), 살리실 알코올(salicyl alcohol), 테트라카인(tetracaine), 톨릴카인(tolycaine), 트리메카인(trimecaine), 졸라민(zolamine), 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 필러.
  20. 제15항에 있어서, 완충액 및 등장화제를 더 포함하는, 필러.
  21. 하기 단계를 포함하는, 제15항에 따른 필러의 제조방법:
    (a) 히알루론산 또는 이의 염을 폴리올과 혼합하는 단계;
    (b) 가교제 및 알칼리 수용액을 혼합한 용액을 상기 히알루론산 또는 이의 염 및 폴리올의 혼합물에 넣고 반응시켜 가교 히알루론산 하이드로겔을 제조하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 제조된 히알루론산 하이드로겔을 조분쇄하는 단계;
    (d) 상기 단계 (b)에서 제조된 분쇄된 히알루론산 하이드로겔을 완충액을 사용하여 세척 및 팽윤시키는 단계; 및
    (e) 단계 (d)에서 세척 및 팽윤된 히알루론산 하이드로겔을 분쇄하는 단계.
  22. 제15항의 필러가 충진된 프리필드시린지.
  23. 제15항의 필러를 주입하는 단계를 포함하는, 주름 개선, 연조직 수복 또는 부피 확대, 또는 윤곽 교정 방법.
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