EA001500B1

EA001500B1 - Способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, композиции указанного геля и применение композиций

Info

Publication number: EA001500B1
Application number: EA199800133A
Authority: EA
Inventors: Бенгт Огеруп
Original assignee: К Мед Аб
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2001-04-23
Also published as: BR9609534B1; CN1083849C; CN1190974A; GR3037065T3; CZ290755B6; JPH11509256A; BR9609534A; HU220257B; ATE204000T1; PL188071B1; KR100314488B1; AU700215B2; US5827937A; NO315274B1; DE839159T1; DK0839159T3; EA199800133A1; HUP9901714A3; SK6198A3; WO1997004012A1

Abstract

Предложен способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, включающий приготовление водного раствора растворимого в воде поперечно-сшиваемого полисахарида; инициирование поперечного сшивания указанного полисахарида в присутствии полифункционального агента, обеспечение стерического затруднения реакции поперечного сшивания до ее завершения перед стадией гелеобразования с получением активированного полисахарида и продолжение реакции поперечного сшивания активированного полисахарида путем повторного обеспечения стерически незатрудненных условий для ее осуществления с завершением реакции поперечного сшивания вплоть до формирования композиции вязкоупругого геля. В изобретении также разработаны композиции геля и применение разработанных композиций в качестве лекарственного или профилактического средства.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям биологически совместимого полисахаридного геля, а более конкретно, к новому способу поперечного сшивания таких композиций, в результате которого получают гель с новой структурой. Новая структура придает улучшенные свойства известным ранее композициям геля, а также открывает возможность для новых применений указанных композиций, как самих по себе, так и дополнительно содержащих активные ингредиенты.

Предшествующий уровень техники

Связывающие воду гели широко используются в биологии и медицине. Обычно их получают путем поперечного сшивания полимеров в бесконечные сетки. Как правило для получения биологически совместимых полимеров необходимо использовать низкую степень поперечного сшивания. Однако часто для обеспечения соответствующей активности используемых ингредиентов требуется использовать более плотный гель, и в этом случае биологическая совместимость часто теряется.

Другим ценным свойством связывающих воду гелей или гидрогелей является то, что в них могут быть заключены пептиды и биологически активные вещества большего размера для образования композиции с замедленным высвобождением. Однако при обеспечении достаточного времени удерживания активного ингредиента возникают практические проблемы, поскольку обычно активный ингредиент высвобождается с той же скоростью, с которой он растворяется или включается в упомянутую композицию. Более того, если такой гель уплотняют при попытке удержать активный ингредиент в течение более долгого времени, он быстро разбухает в животной ткани, где существует свободный доступ воды.

Одним из наиболее широко использующихся биологически совместимых полимеров для использования в медицине является гиалуроновая кислота. Поскольку она присутствует в аналогичных композициях в любом живом организме, она обладает минимальной побочной реакцией и обеспечивает широкий диапазон возможных медицинских применений. Как следствие этого, она является объектом многих попыток модификации. Так, ее поперечно сшивают с агентами, такими как альдегиды, эпоксиды, полиазиридильные соединения и дивинилсульфон (ЬаигеШ с1 а1, Ас1а С Ист. Беаи. 18 (1964) Νο 1, р. 274; Европейский патент 0161887В1; Европейский патент 0265116А2 и патент США 4716154).

В заявке УО 87/07898 описывается взаимодействие полисахарида с полифункциональным эпоксидом, удаление избытка указанного эпоксида и, наконец, высушивание указанного полисахарида для поперечного сшивания в пленку, порошкообразный материал или подоб ный сухой продукт. Однако в этом источнике не было предложено сначала разбавлять активированный полисахарид, а затем повторно концентрировать его до желаемой плотности или консистенции, которая является по существу постоянной.

В патенте США 5128326 описан ряд модифицированных гиалуроновых кислот для использования в качестве депо лекарственных средств. Описанные способы доставки препаратов на основе геля основаны на диффузии активного ингредиента внутрь геля, а затем высвобождение его с той же постоянной скоростью диффузии. В противоположность этому настоящее изобретение предусматривает растворение активного ингредиента с последующим концентрированием композиции геля до полного отсутствия диффузии, или очень медленной диффузии указанного активного ингредиента.

В патенте США 5399351 описаны смеси геля и полимерных растворов, при этом указанные растворы используют для улучшения реологических свойств геля. Однако и в этом случае, также рассмотрены обратимо сжимаемые гели, как следует, например, из колонки 6, строки 53-58.

Сущность изобретения

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что композиции полисахаридного геля, имеющие новую структуру, и поэтому новые, выдающиеся свойства, могут быть получены с помощью нового способа их поперечного сшивания. Предложенный способ поперечного сшивания позволяет легко регулировать структуру и свойства получаемой композиции полисахаридного геля, в свою очередь, обеспечивает получение конечной композиции с желаемыми свойствами.

Более конкретно, одной из целей настоящего изобретения является разработка способа получения поперечно-сшитого полисахаридного геля, биологически совместимого несмотря на высокую степень поперечного сшивания или полимеризации.

Другой целью настоящего изобретения является разработка композиции полисахаридного геля с вязкоэластичными свойствами вместо геля, поперечно-сшитого в достаточной степени.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка композиции полисахаридного геля, более или менее необратимо уплотненного или концентрированного, то есть, который по существу не набухает или набухает только в ограниченной степени при контакте с водой.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка композиции полисахаридного геля, включающей биологически активное вещество в качестве композиции с замедленным высвобождением или композиции депо.

Другой целью настоящего изобретения является разработка композиций полисахаридного геля, включающих несколько биологически активных веществ в качестве лекарственных или профилактических композиций для различных целей.

Еще одной целью настоящего изобретения является указание применений композиций, упоминаемых здесь, для получения лекарственных или профилактических композиций, а также для введения млекопитающим и в частности людям.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка композиции частично поперечно-сшитого активированного полисахаридного геля, получаемого в качестве промежуточного вещества указанным выше способом по настоящему изобретению, причем указанное промежуточное соединение может быть поперечно сшито ίη δίΐιι в любом желаемом месте.

Эти и другие цели настоящего изобретения станут понятными с помощью более подробного описания, представленного ниже.

Раскрытие сущности изобретения

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения разработан способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, включающий стадии:

приготовление водного раствора растворимого в воде поперечно-сшиваемого полисахарида;

инициирование реакции поперечного сшивания указанного полисахарида в присутствии полифункционального агента, обеспечивающего сшивание полисахарида; обеспечение затруднения реакции поперечного сшивания до ее завершения перед стадией гелеобразования с получением активированного полисахарида и продолжение реакции поперечного сшивания активированного полисахарида путем повторного обеспечения стерически незатрудненных условий для ее осуществления с завершением реакции поперечного сшивания вплоть до формирования композиции вязкоупругого геля.

Другими словами, новый способ по настоящему изобретению включает поперечное сшивание растворимого в воде поперечносшиваемого полисахарида, по крайней мере, в две стадии, причем реакция поперечного сшивания прерывается перед тем, как инициируется гелеобразование, а прерывание осуществляют путем стерического затруднения реакции поперечного сшивания. Реакция поперечного сшивания затем продолжается на второй стадии путем повторного обеспечения стерически незатрудненных условий.

Таким образом, заявителем неожиданно было обнаружено, что в условиях стерического затруднения удается получить активированный полисахарид, причем его поперечное сшивание или полимеризация могут быть продолжены при повторном обеспечении стерически незатрудненных условий. Кроме этого также неожиданно было обнаружено, что композиция полисахаридного геля, полученная с помощью разработанного способа, не образует компактную, плотную структуру, которая образуется при проведении реакции поперечного сшивания в одну стадию до полностью поперечносшитого геля, т. е. при проведении реакции в две стадии скорее образуется вязкоупругий гель. Более того, как указано выше, новая структура геля, получаемая по настоящему изобретению, представляет собой по существу необратимую структуру геля, которая не набухает до какой-либо заметной степени при контакте с водой или любой другой водной средой. Обычно это обозначает, что повторное набухание составляет менее чем 10% по объему, по отношению к объему геля, полученного согласно предложенному способу.

Хотя настоящее изобретение не связано с какой-либо теорией, возможно, что новая структура, получаемая по настоящему изобретению, является скорее сочетанием поперечного сшивания между существующими полимерными цепями и удлинения существующих цепей, чем очень плотной сеткой, дающей жесткую структуру. Подтверждением подобного механизма служит, вероятно, возможность получения по настоящему изобретению вязкоупругого продукта.

Термин стерическое затруднение реакции поперечного сшивания, как он здесь используется, должен интерпретироваться в широком смысле, то есть это не должно быть полное затруднение, но во многих случаях упоминается скорее частичное затруднение реакции. То есть, важным является то, что скорость поперечного сшивания существенно уменьшается, что обеспечивает вовлечение новых реакционных центров при конечной стадии поперечного сшивания.

Подобно этому, термин введение стерически незатрудненных условий также должен интерпретироваться широко, что обычно означает, что стерически незатрудненные условия не обязательно должны быть теми же, что и при инициации реакции поперечного сшивания. Таким образом, важным является то, что скорость реакции в стерически незатрудненных условиях выше, чем в стерически затрудненных условиях.

Стерическое затруднение реакции поперечного сшивания может быть обеспечено разными способами, однако, предпочтительным вариантом для настоящего изобретения является разбавление водной среды, в которой проводят реакцию поперечного сшивания, для получения более низкой концентрации полисахарида.

Для повторного обеспечения стерически незатрудненных условий также могут быть использованы разные способы, однако, предпоч5 тительным вариантом для настоящего изобретения является выпаривание водной среды, в которой осуществляют реакцию поперечного сшивания для получения более высокой концентрации полисахарида. Другой предпочтительный вариант включает диализ водной среды, в которой производят реакцию поперечного сшивания.

По предпочтительному варианту настоящего изобретения стерическое затруднение реакции поперечного сшивания проводят до полного израсходования агента для поперечного сшивания. Это, в свою очередь, обычно означает, что повторное введение стерически незатрудненных условий инициируется в присутствии неизрасходованного агента для поперечного сшивания.

Стерическое затруднение реакции поперечного сшивания может быть введено в пределах 50-90% от общего времени гелеобразования, используемого в способе по настоящему изобретению, при этом также необходимо принять во внимание соответствующую эластичность или консистенцию предполагаемой для использования композиции.

Настоящее изобретение должно быть применимо к любому биологически совместимому полисахариду, который является поперечносшиваемым и растворимым в водной среде. Таким образом, термин водорастворимый должен интерпретироваться в широком смысле, то есть чистая вода необязательно является необходимой. То есть водный раствор означает любой раствор, где вода является главным компонентом. Предпочтительной подгруппой полисахаридов по настоящему изобретению являются глюкозаминоглюканы, из которых гиалуроновая кислота является наиболее перспективной.

Агент для поперечного сшивания, который может быть использован по настоящему изобретению, является любым ранее известным агентом для поперечного сшивания, пригодным для полисахаридов, при этом следует принять во внимание необходимость соблюдения биологической совместимости. Предпочтительно, однако, агент для поперечного сшивания выбирают из группы, содержащей альдегиды, эпоксиды, полиазиридильные соединения, глицидиловые эфиры и дивинилсульфоны. Из них глицидиловые эфиры являются особенно предпочтительными, из них 1,4-бутандиолдиглицидилэфир может быть упомянут как наиболее предпочтительный вариант. В этой связи нужно также отметить, что полифункциональный включает бифункциональный.

Первоначальную реакцию поперечного сшивания в присутствии полифункционального агента для поперечного сшивания можно проводить при различных значениях рН, в зависимости от того, должны ли образовываться простые или сложные эфиры. Предпочтительно это означает, что реакцию поперечного сшивания проводят при щелочных рН, в частности, при рН выше 9, например, в пределах рН 9-12 при образовании простого эфира. При образовании сложных эфиров реакцию поперечного сшивания предпочтительно проводят при кислых рН, предпочтительно при рН 2-6.

Один из интересных аспектов настоящего изобретения предполагает самостоятельное использование полученной композиции поперечно-сшитого полисахаридного геля, поскольку настоящее изобретение обеспечивает получение вязкоупругой композиции. Такая вязкоупругая композиция пригодна, например, для использования в глазной хирургии, в качестве заменителя синовиальной жидкости, в виде глазных капель и тому подобное, и, как было отмечено выше, настоящее изобретение позволяет варьировать вязкоупругие свойства для таких применений. Таким образом, применение стерической технологии по настоящему изобретению позволяет получить удлинение цепей, разветвление цепей, поперечное сшивание и тому подобное, в более контролируемых условиях, чем с помощью ранее известных технологий с более или менее рандомизированным расположением центров сшивания.

Более того, благодаря тому, что гели, полученные по настоящему изобретению, не сохраняют свой исходный объем в присутствии водной среды, новые продукты не оказывают никакого неблагоприятного влияния или отрицательных объемных эффектов при этих или других медицинских применениях.

По настоящему изобретению является также возможным включение в композиции полисахаридного геля любого биологически активного вещества, для которого является желательным или приемлемым носитель из полисахаридного геля. В этой связи технология разбавления - концентрирования, используемая в способе по настоящему изобретению, обеспечивает включение биологически активных веществ перед обеспечением вторых стерически незатрудненных условий. То есть хотя стерически незатрудненные условия обычно означают концентрирование, эта операция также предполагает, что биологически активное вещество будет присутствовать в более компактной фазе, чем во время включения указанного вещества в носитель. Другими словами, биологически активное вещество может удерживаться гораздо дольше по сравнению с ранее известными способами поперечного сшивания геля. Тем самым может быть получен лучший временной профиль замедленного высвобождения для активного вещества.

В связи с включением биологически активного вещества в композицию желательно также обеспечить физиологические значения рН и солевых условий для получения препарата, готового для медицинского применения. Такое одновременное установление физиологических условий является предпочтительным, особенно если оказывается, что вторая стадия процесса хорошо протекает в этих условиях.

Настоящее изобретение не должно ограничиваться в каком-либо отношении, касающемся биологически активного вещества, по сравнению с использованием этого вещества в ранее известных случаях. Другими словами, состояние, подлежащее лечению, должно быть решающим для конкретного вещества, которое необходимо выбрать.

Однако интересующие вещества по настоящему изобретению могут быть выбраны из группы, включающей гормоны, цитокины, вакцины, клетки и вещества для наращивания тканей. Таким образом, уникальное сочетание свойств новой композиции геля по настоящему изобретению обеспечивает ей исключительные преимущества в сочетании с этими веществами, то есть, прежде всего, благодаря выдающимся свойствам депо или замедленного высвобождения и свойствам ненабухания.

Так, одной из интересных групп биологически активных соединений являются вещества для наращивания тканей, поскольку полисахаридный гель как носитель обладает для них рядом преимуществ. Дополнительные детали относительно этих продуктов можно найти в заявке \νϋ 94/21299. Более конкретно, предпочтительное вещество для наращивания тканей представляет собой полимер, выбранный из коллагена, крахмала, декстраномера, полилактида и его сополимеров, и полигидроксибутирата и его сополимеров.

В связи с гормонами особенно предпочтительными являются эритропоэтин и кальцитонин.

Способ по настоящему изобретению также обеспечивает ковалентное связывание биологически активного вещества со структурой полисахаридного геля или с агентом для поперечного сшивания с помощью химической реакции при условии, что биологически активное вещество содержит функциональные группы, которые могут реагировать с ними. Тем самым могут быть получены уникальные свойства или сочетания свойств, поскольку в этом случае, например, скорость высвобождения активного ингредиента будет определяться скорее деградацией или разложением полимерной сетки, чем растворением или скоростью миграции таких веществ из сетки геля.

Модификация последней технологии по настоящему изобретению означает, что функциональные группы активного вещества могут предварительно взаимодействовать с агентом для поперечного сшивания полисахарида. Предпочтительно используют тот же самый агент для поперечного сшивания, что и при поперечном сшивании полисахарида.

Поскольку способ по настоящему изобретению обеспечивает получение новой компози ции или структуры полисахаридного геля, другой аспект настоящего изобретения представлен полученной новой композицией полисахаридного геля. В этом отношении область действия изобретения включает не только композицию полисахаридного геля, каким-либо образом полученную с помощью указанного способа, но также любую композицию полисахаридного геля, которую можно получить с помощью подобной технологии.

Изложенное другим образом настоящее изобретение также включает композицию поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, которая может быть получена в две стадии путем поперечного сшивания поперечно-сшиваемого полисахарида с помощью полифункционального агента для поперечного сшивания, при этом первая стадия поперечного сшивания завершается перед осуществлением гелеобразования, путем стерического затруднения реакции поперечного сшивания, а вторая стадия поперечного сшивания инициируется путем повторного введения незатрудненных условий для реакции поперечного сшивания для ее продолжения вплоть до образования вязкоупругого геля.

Все детали, рассмотренные как предпочтительные в сочетании со способом настоящего изобретения, могут быть применимы также к композиции полисахаридного геля как таковой и не требуют повторений.

Еще один аспект настоящего изобретения включает вариант, в котором промежуточный продукт получают путем переноса конечной стадии реакции поперечного сшивания со стерически незатрудненными условиями на более позднюю стадию, например, на конечное использование композиции. Таким образом, показано, что промежуточный продукт, получаемый после стерического затруднения реакции поперечного сшивания, обладает такой стабильностью, что реакция поперечного сшивания может быть осуществлена на более поздней стадии.

Настоящее изобретение также относится к указанной выше композиции для использования в качестве лекарственной или профилактической композиции.

Другим аспектом настоящего изобретения является использование указанной композиции для получения лекарственной или профилактической композиции для любой из указанных выше медицинских или терапевтических целей, наращивания ткани или лечения гормонами млекопитающих, в частности людей, что является предпочтительными применениями.

Наконец, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики млекопитающих, в частности людей, который включает введение композиции, указанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении.

Примеры

Ниже настоящее изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих далее не ограничивающих примеров.

Пример 1. Активация примера.

а. При щелочных условиях.

г гиалуроновой кислоты (полисахарид), полученной путем ферментации 81гер1ососи5, растворяют в 100 мл 1% ΝαΟΗ с рН>9. Добавляют 1,4-бутандиолдиглицидилэфира (агент для поперечного сшивания) до концентрации в 0,2% и инкубируют раствор при 40°С в течение 4 ч.

б. При кислых условиях.

Эксперимент проводят как в п. 1а, но при рН около 2-6, который устанавливают добавлением 1 % уксусной кислоты к раствору вместо ΝαΟΗ согласно п. 1а.

Пример 2. Получение вязкоупругого геля.

Инкубаты, полученные в пп.1а и 1б, разводят до объема, который составляет два конечных объема, или около 0,5-1% и нейтрализуют, а затем гель упаривают на роторном испарителе до получения вязкоупругого геля.

Пример 3. Получение геля, содержащего декстраномерные частицы.

Инкубаты, полученные в пп.1а и 1б, разбавляют до 1 % и раствор перемешивают с 20 г сухих декстраномерных частиц (8ерйабех® 25, Рйагтас1а), при этом через несколько минут частицы заключаются в гель за счет поперечного сшивания полимера гиалуроновой кислоты вследствие концентрирования гиалуроновой кислоты, которое достигается путем адсорбции воды шариками декстраномера.

Полученные вязкоупругие гели являются стабильными, устойчивыми при автоклавировании и могут вводиться с помощью инъекции тонкими иглами для подкожных инъекций.

Пример 4. Получение геля для использования в качестве лекарственного депо, содержащего эритропоэтин (ЕРО).

Инкубат, полученный в примере 1а, разбавляют до 1 %, и доводят рН добавлением цитратного буфера в соответствии с инструкциями производителя (Ог11ю Вю1ес11 1пс., Вагйаи И8А) для улучшения стабильности ЕРО в водном растворе. 5 х 10⁶ м.е. ЕРО добавляют при перемешивании. При упаривании раствора до 1/4 объема полимер поперечно сшивается с композицией депо, и получают 20000 м. е. ЕРО/мл.

Пример 5. Получение геля для использования в качестве препарата депо, содержащего кальцитонин.

Кальцитонин лосося, 100 м.е./мл (М1аса1ас® 8аибох). смешивают с 2% раствором полимера, полученного в соответствии с примером 1б, и раствор концентрируют до 5% (250 м. е./мл) путем упаривания на роторном испарителе. Лошадь с хронической хромотой правой передней ноги лечат 2 мл подкожно в неделю в течение двух недель. В течение шести недель после лечения лошадь свободна от болей. Уровень кальция в сыворотке крови понижается только на 1 2%

Пример 6. Получение геля, содержащего гепарин, с замедленным высвобождением гепарина.

В разбавленном активированном полимере, полученном в примере 4, растворяют гепарин в количестве 5% от массы полимера. Полученную смесь уравновешивают в течение 1 ч, при этом ее упаривают до 1 /4 объема. Высвобождение из геля ингибирующую коагуляцию активности наблюдают в течение 1 6 дней инкубации полученного геля в физиологическом солевом растворе.

Пример 7. Получение геля с ковалентно связанным гепарином в стерически управляемом положении.

Активированный полимер, полученный в примере 1 , осаждают метанолом при энергичном перемешивании. Полученный мелкодисперсный осадок высушат в течение ночи. Гепарин активируют, как указано в примере 1 . После инкубации (4 ч при 40°С) осадок полимера смешивают с раствором активированного гепарина. Смесь инкубируют в течение ночи и в течение последующего дня, раствор геля нейтрализуют, осаждают и отмывают от остатков реагентов.

Полученный гель способен связывать фактор роста среди прочих, основной фактор роста фибробластов (ЬЕСЕ), но не вызывает никакого ингибирования коагуляции цельной крови.

Пример 8. Получение геля, содержащего положительно заряженные группы хитозана.

Смесь 7,5 г полимера гиалуроновой кислоты и 2,5 г хитозана (8ее Сиге® Рго!аи) инкубируют, как указано в примере 1 . После растворения и нейтрализации получают сополимеризованный вязкоэластичный раствор. При нанесении этого раствора на медленно заживающую рану наблюдается ускорение заживления ран.

Пример 9. Получение стерически сшитого геля.

7,5 г гиалуроновой кислоты активируют в соответствии с примером 1а. Так же активируют 2,5 г декстрана. Гиалуроновую кислоту осаждают метанолом, осадок смешивают с 500 мл разбавленного активированного 0,5% раствора декстрана. После перемешивания и доведения рН и концентрации соли получают вязкоупругий раствор. 5 мл этого раствора вводят внутрь ахиллесова сухожилия с повторяющимся воспалением в виде свищей и поскрипывания. Через четыре недели указанные симптомы ахиллесова сухожилия исчезают.

Пример 1 0. Получение геля для использования в качестве лекарственного депо, содержащего СМС8Е.

Продукт получают в соответствии с примером 5, но вместо кальцитонина добавляют гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор СМС8Г (Беисотах®), 1 мг/г полимера.

Пример 11. Получение геля, содержащего убитые вирусы гриппа типа А2.

Препарат получают как в примере 4, но вместо ЕРО добавляют 40 960 НАи убитого вируса гриппа лошади на 100 мл разбавленного активного 1 % раствора полимера. После уменьшения объема 4х-кратный препарат содержит 1 600 НАИ на мл. Этим препаратом вакцинируют более чем 100 лошадей в связи с эпидемией гриппа. При этом было обнаружено, что полученный препарат является высокоэффективным средством для защиты от инфекции, причем эта защита поддерживается в течение длительного времени (более чем 6 месяцев).

Пример 1 2. Получение свежего геля, содержащего суспензию живых клеток.

мл культуры фибробластов смешивают со 1 00 мл нейтрализованного раствора согласно примеру 1а. Смесь оксигенируют и высушивают до половины объема. Получают вязкоупругий раствор, содержащий живые клетки.

Пример 13. Получение микронных частиц плотного геля, содержащего короткие пептиды.

К активированному нейтрализованному гелю согласно примеру 1а добавляют 5 мг пептида, имеющего 12 аминокислот. Гель упаривают при перемешивании до 10% и суспендируют в минеральном масле. После добавления метанола сухие частицы геля отфильтровывают и полностью отмывают от остатков масла.

Пример 1 4. Получение геля, содержащего частицы плотного геля микронных размеров с короткими пептидами согласно примеру 13.

К 1 % раствору нейтрализованного полимера, активированного согласно примеру 1а, добавляют микросферы из примера 13. Затем гель упаривают до половины его объема. Получают однородный, пригодный для инъекций и стабильный гель, содержащий мелкодисперсные микросферы.

Пример 15. Получение геля, содержащего сферические частицы полиметилметакрилата (ПММА), имеющие размер 40-120 мкм.

К 5 г полимера, разбавленного до 1%, нейтрализованного и активированного согласно примеру 1а, добавляют 1 00 мг сфер из полиметилметакрилата (ПММА). Упаривание полимерного геля до 3% дает стабильный вязкоупругий гель, пригодный для инъекций.

Пример 1 6. Получение геля, содержащего частицы ПММА размером 500 нм, содержащие гидрофобный антиген.

Антиген гемаглютимин, полученный из вирусов А2 согласно примеру 11, адсорбируют с помощью гидрофобных взаимодействий на 500 нм частицах ПММА. Полученные частицы добавляют к 1% раствору согласно примеру 15, и уменьшают объем до половины. Получают стабильный гомогенный вязкоупругий гель, который пригоден для использования в качестве вакцины, имеющей высокое поддерживающее действие.

Пример 17. Сравнение степени повторного набухания при свободном доступе воды гелей, полученных обычным образом, и гелей, полученных по настоящему изобретению.

Гели с гиалуроновой кислотой, полученные согласно Баигеп! е! а1 1963 и согласно примерам 1 и 2 высушивают до половины их объема после набухания.

Затем их повторно вводят в исходные растворы. Известные ранее гели набухают до их первоначального объема, при этом композиции гелей согласно настоящим примерам 1 и 2 набухают незначительно (1 0%).

Пример 18. Сравнение биологической активности ЕРО, сополимеризованного в гелях гиалуроновой кислотой, и геля согласно примеру 1 , в который ЕРО заключают путем концентрирования указанного геля.

Четверо пациентов, которых лечат Ергех® (СББАО) от их анемии, вызванной хронической уремией, лечат в течение двух месяцев по одной дозе в месяц согласно следующему режиму:

Пациент №	1	2	3	4
Доза, м.е.	60000	70000	70000	50000
Месяц 1	Депо, прямое гелеобразование	Депо, прямое гелеобразование	Контроль	Контроль
Месяц 2	Контроль	Контроль	Концентрированный	Концентрированный

Депо, прямое гелеобразование: Эпоксидное поперечное сшивание при благоприятных условиях, согласно примеру 11, в присутствии ЕРО.

Контроль: ЕРО растворяют в 4% гиалуроновой кислоте с МВ около 6 χ 10⁶ из петушиных гребешков, полученных согласно патенту США 4141973 (Неа1оп® Рйагтааа).

Концентрированный: ЕРО заключают в активированном геле, где гелеобразование происходит при концентрировании.

Дозу выбирают как общую дозу на месяц, в которой обычно нуждается пациент для поддержания уровня гемоглобина. Уровень ЕРО в сыворотке крови определяют через равные промежутки времени с помощью иммунохимических методов.

Результаты

Обычным способом оценки эффекта функционирования находящихся в депо препаратов является вычисление площади под кривой (единицы ЕРО χ дни). Это исследование также дает биологическую доступность в форме уровня гемоглобина в крови, как 0 = постоянный, + = увеличенный и - = пониженный.

Таблица

Пациент №/месяц	1/1	1/2	2/1	2/2	3/1	3/2	4/1	4/2
Площадь под кривой	41	424	57	534	224	952	567	656
Контроль гемоглобина	-	+	-	+	0	+	+	+

Выводы

Заключение ЕРО в депо с сокращенным объемом обеспечивает самое большое возможное высвобождение во время анализа. Попытки произвести реакцию гелеобразования в присутствии ЕРО разрушают гормоны так, что может регистрироваться очень низкое высвобождение.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, включающий следующие стадии:

приготовление водного раствора растворимого в воде поперечно-сшиваемого полисахарида;

инициирование реакции поперечного сшивания указанного полисахарида в присутствии полифункционального агента, обеспечивающего сшивание полисахарида;

обеспечение стерического затруднения реакции поперечного сшивания до ее завершения перед стадией гелеобразования с получением активированного полисахарида и продолжение реакции поперечного сшивания активированного полисахарида путем повторного обеспечения стерически незатрудненных условий для ее осуществления с завершением реакции поперечного сшивания вплоть до формирования композиции вязкоупругого геля.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полисахарид представляет собой глюкозаминоглюкан.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что глюкозаминоглюкан представляет собой гиалуроновую кислоту.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что агент для поперечного сшивания выбирают из группы, включающей эпоксиды, полиазиридильные соединения и глицидиловые эфиры.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный глицидиловый эфир представляет собой диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что обеспечение стерического затруднения реакции поперечного сшивания включает разбавление водного раствора поперечно-сшиваемого полисахарида с понижением его концентрации в указанном растворе.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что повторное обеспечение стерически незатрудненных условий для осуществления реакции поперечного сшивания включает упаривание поперечно-сшиваемого полисахарида с повышением его концентрации в указанном растворе.
8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что повторное обеспечение стериче ски незатрудненных условий для осуществления реакции поперечного сшивания включает диализ водного раствора поперечно-сшиваемого полисахарида.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что инициирование реакции поперечного сшивания в присутствии полифункционального агента проводят при щелочном значении рН, предпочтительно при рН выше 9, для облегчения реакции поперечного сшивания с образованием простых эфиров.
10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что инициирование реакции поперечного сшивания в присутствии полифункционального агента проводят при кислотном значении рН, предпочтительно при рН 2-6, для облегчения реакции поперечного сшивания с образованием сложных эфиров.
11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что стерическое затруднение реакции поперечного сшивания достигается до того, как указанный агент, обеспечивающий поперечное сшивание полисахарида, израсходуется.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что внутрь композиции поперечно-сшиваемого полисахаридного геля дополнительно заключают биологически активное вещество путем его растворения или диспергирования в активированном полисахариде перед обеспечением стерически незатрудненных условий для продолжения реакции сшивания указанного полисахарида, причем, введение биологически активного вещества, предпочтительно, проводят при физиологических условиях.
1 3. Способ по любому из пп. 1 -11, отличающийся тем, что клетки дополнительно заключают внутрь композиции поперечносшиваемого полисахаридного геля перед обеспечением стерически незатрудненных условий для продолжения реакции сшивания указанного полисахарида, причем введение клеток, предпочтительно, проводят при физиологических условиях.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанное биологически активное вещество выбрано из группы, включающей гормоны, цитокины, вакцины и вещества для наращивания тканей.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанное вещество для наращивания тканей представляет собой полимер, выбранный из группы, включающей коллаген, крахмал, декстраномер, полилактид и его сополимеры и полигидроксибутират и его сополимеры.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный гормон выбирают из группы, включающей эритропоэтин и кальцитонин.
17. Способ по любому из пп. 12-16, отличающийся тем, что указанное биологически активное вещество содержит функциональные группы, способные реагировать с полисахари дом и заключаемые внутрь композиции геля путем химической реакции с ним.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанное биологически активное вещество содержит функциональные группы, которые реагируют с агентом, обеспечивающим поперечное сшивание указанного полисахарида в процессе получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля.
19. Композиция частично поперечносшитого биологически совместимого активированного полисахаридного геля, полученного с помощью способа по любому из пп.1-18, который прерывают до стадии продолжения реакции поперечного сшивания активированного полисахарида за счет повторного введения стерически незатрудненных условий для ее осуществления, как указано в п. 1.
20. Композиция поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, полученная с помощью способа по любому из пп.1-18.
21. Композиция по п.20, полученная с помощью способа по любому из пп.2-11.
22. Композиция по любому из пп.20-21, полученная с помощью способа по любому из пп.12-18, содержащая биологически активное вещество.
23. Применение композиции по любому из пп.20-22 в качестве лекарственного или профилактического препарата.
24. Применение композиции по п.23 в качестве депо для медицинского или профилактического препарата.
25. Применение композиции по любому из пп.23-24 для получения лекарственного или профилактического препарата для гормонального лечения или наращивания тканей млекопитающего, в частности человека.