WO2004046200A1

WO2004046200A1 - 薬物徐放担体

Info

Publication number: WO2004046200A1
Application number: PCT/JP2003/014906
Authority: WO
Inventors: Sei Kwang Hahn; Teruo Nakamura; Tsuyoshi Shimoboji
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2002-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2004-06-03
Also published as: EP1564220A4; US20060110458A1; JP4636883B2; AU2003284634A1; EP1564220A1; US7816316B2; JPWO2004046200A1

Abstract

　本発明の目的は、タンパク質またはペプチドの生物活性を阻害せずに高封入率で封入でき、完全に生分解性で安全なタンパク質またはペプチドの徐放担体を提供することである。本発明により、タンパク質またはペプチド共存下の溶液中で、ヒアルロン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結合含有化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とする徐放担体の製造方法が提供される。本発明の製造方法により、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらを効率よく封入することができる。

Description

明細書

薬物徐放担体技術分野

本発明は、タンパク質またはペプチドを徐放するヒアルロン酸八イド口ゲル薬物徐放担体に関する。背景技術

近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。

薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤は、製剤調製時または徐放中の、タンパク質またはペプチドの変性あるいは凝集による回収率低下が、実用化への大きな障害となっている。ポリ乳酸—ポリグリコール酸共重合体 (PLG A) 等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、 pHの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている (J. Pha rm. Sc i. 第 88巻、第 166— 173頁、 1999年、および J. Mi c r oenc ap s u l a t i on 第 15巻、第 699— 713頁、 1998年を参照のこと）。一方、こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っていない。また、安全性の面からは、徐放基材として用いる素材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならず、タンパク質またはべプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放型製剤は現在のところ実現していない。

ヒアルロン酸 (HA) は、 1934年、 K. Mey e rによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細マトリックスの主成分として古くから知られている。 HAは、 D—グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが β (1→3) グリコシド結合により連結された二糖単位から成るダルコサ」ドグリカンの一種である（式（VI) ) 。

ΗΑは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料 (B i oma t e r i a 1) である。近年、微生物による高分子量 HAの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。

ヒアルロン酸を基材に用いた架橋方法、ヒアルロン酸ゲルからのタンパク質やぺプチド薬物の徐放も多数報告されている。 HAを化学架橋でゲル化させる方法としては、カルポジイミド法（国際公開第 94/02517号パンフレツトを参照のこと）、ジビニルスルフォン法（特開昭 61- 138601号公報を参照のこと）、グリシジルエーテル法（特開平 5— 140201号公報を参照のこと）等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはべプチドを導入する方法では、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、 i n s i tu架橋を行うと、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうした i _n s i tu架橋により、ヒアルロン酸誘導体ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤についての報告されている（例えば、米国特許第 582 7937号明細書を参照のこと）。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でヒアルロン酸を i n s i t u架橋すると、回収率の点で問題がある。例えば、ヒドラジド基（HZ) を導入したヒアルロン酸誘導体 (H A-HZ) を N—ハイドロキシスクシンイミド（NHS) からなる架橋剤で架橋する方法（国際公開 9 5 / 1 5 1 6 8号パンフレツトを参照のこと）が報告されているが、生理条件下での i n s i t u架橋を目的としているため、 p H 7 . 4〜p H 8 . 5で架橋形成反応を行っているが、本発明者らによる検討では、この方法で得られるヒアルロン酸誘導体ゲルからの、夕ンパク質またはべプチドの回収率は低い。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にァミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残つた変性した夕ンパク質またはべプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であり、タンパク質またはペプチドを反応させずにヒアルロン酸を化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール

(P E G) を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（国際公開第 0 0 / 4 4 8 0 8号パンフレツトを参照のこと）、生分解性でないポリェチレンダリコールの断片が残存する問題がある。発明の開示

上述した如く、タンパク質またはペプチドの存在下でその生物活性を維持したまま i n s i t u で化学架橋し、八イド口ゲル中にタンパク質ペプチドを封入することで、高封入率、高回収率、安全性を満たす生分角军性ゲル調製方法、これを用いた夕ンパク質またはべプチド徐放製剤は知られていない。

本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、タンパク質またはべプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合を有する化合物で化学架橋、ハイド口ゲル化することで、タンパク質またはペプチドの生物活性を維持したままこれらを効率よく封入でき、生分解性で安全な夕ンパク質またはぺプチド徐放担体となることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明の一つの側面によれば、夕ンパク質またはべプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結合を有する化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とした薬物徐放担体が提供される。

本発明の一つの側面によれば、

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する、 N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジル基またはァミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、メルカプト基を導入する工程、

を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。

当該製造方法において、工程（a) により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（I) ：

(式中、 X。は、 — O—、または一 N (-R_x) —であり、

Riは、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝 —ェ。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 — ₆アルケニル基、直鎖または

直鎖または分枝アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂〇Hであり、

は、一 — 一 Y₂_NH— R₂、または一 NH— R₂であり、

Yiは、単結合、 — N (― R₃) CO—、 — N (― R₃) ―、 —CO—、または ― CH₂C〇一であり、

Y₂は、単結合、一 CON (― R₄) —、または— N (― R₄) —であり、は、直鎖または分枝 Ci—i。アルキレン基、直鎖または分枝 Ci— i。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂、 R₃および R₄は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 Ci- アルキル基、直鎖または分枝 C^— i。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。

また式（I) 中、ポリアルキレンオキサイド基とは、一（CH (— R) CH₂ 〇） _n-OH (式中、 Rは水素原子、または — ₅アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1〜20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1〜20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（I) において、好ましくは X。は、一 N (-R,) 一である。式 ( I) において、好ましくは 1^は、水素原子である。式（I) において、好ましくはは、 ―丫 — Qi— Y₂— NH— R₂である。式（I) において、好ましくはは、単結合、または、 —N (— R₃) —である。式（I) において、好ましくは Y₂は、単結合である。式（I) において、好ましくはは、直鎖または分枝 — ₄アルキレン基である。式（I) において、好ましくは R₂および R。は、水素原子である。当該製造方法において、工程（b) により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（I I) ：

(II)

(式中、 X₂は、 — — Qi— Υ₂— N (― R₂) — Y₃— Q₂— SH、または一 N (一 R₂) — Y₃ - Q₂— SHであり、

0、 Rい i _a2> R_a3、 R_a4、 K_a5, _a6、い Y2、 Qi、 R2、あよび R₄は、上記式 (I) で定義したとおりであり、

Y₃は、単結合、一 CO—、一 C₆H₄—、一 C〇₂—、一 S〇₂_、 -CH₂-

CH (OH) 一、一 C (=NH) 一、 -PO (OH) 一 O -、一 CSNH -、または— CONH—であり、

Q₂は、直鎖または分枝 ^— i。アルキレン基、直鎖または分枝 C^— i。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）

さらに、式（I I) において、好ましくは X₀は、一 N (― R 一である。式（I I) において、好ましくは 1^は、水素原子である。式（I I) において、好ましくは X₂は、一ェ一 Qi— Ys— N (— R₂) —Y₃— Q₂— SHである。式 (I I) において、好ましくはは、単結合、または、一 N (— R₃) —である。式（I I) において、好ましくは Y₂は、単結合である。式（I I) において、好ましくはは、直鎖または分枝 — ₄アルキレン基である。式（I I) において、好ましくは R₂および R₃は、水素原子である。式（I I) において、好ましくは Y₃は、一 CO—である。式（I I) において、好ましくは Q₂は、直鎖または分枝アルキレン基である。

本発明の別の側面によれば、有機溶媒中において、ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、メルカプト基を含む置換基を有する N—置換アミド基に変換するする工程を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。

当該製造方法において、生成するメルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（I I a) ：

(式中、 X。は、一 O—、または一 N (-R,) —であり、

Riは、 7j<素原子、直鎖または分枝 Ci— i。アルキル基、直鎖または分枝じェ。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 (：ト ₆アルキル基、直鎖または分枝 _₆アルケニル基、直鎖または分枝 C — ₆アルキエル基、直鎖または分枝アルキル力ルポエル基、直鎖または分枝 C ₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂OHであり、

X_2aは、一 Y — Qi— Y₂— Q₃— Y₃— Q₂— SH、または一 N (— R₂) — Y₃— Q₂— SHであり、は、単結合、一 N (― R₃) CO—、 -N (-R₃) ―、 -CO-, または — CH₂C〇一であり、

Y₂、 Υ₃は、それぞれ独立して、単結合、一〇—、一S―、一SO―、 -S 0₂—、一 N (— R₄) —、一C00—、一〇C〇_、 -CON (一 R₄) —、一 N (― R₄) CO—、または一 N (― R₄) CON (一 R₅) —であり、

Qい Q₂および Q₃は、それぞれ独立して、直鎖または分枝。アルキレン基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂、 R₃、 R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 Ci— ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。

また式（I I a) 中、ポリアルキレンオキサイド基とは、一 (CH (― R) C H₂0) _n-OH (式中、 Rは水素原子、または — ₅アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1〜20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1〜20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（I I a) において、好ましくは X₀は、一 N (-R_x) 一である。式（I I a) において、好ましくは 1^は、水素原子である。式（I I a) において、好ましくは X_2aは、一 Y — Qi— Y₂— Q₃— Y₃— Q₂— SHである。式 (I I a) において、好ましくはは、単結合、または、一 N (― R₃) —である。式（I I a) において、好ましくは Y₂は、単結合である。式（I I a) において、好ましくは Y₃は、単結合である。式（I I a) において、好ましくは Qい Q₂および Q₃は、直鎖または分枝アルキレン基である。式（I I a) において、好ましくは R₂および R ₃は、水素原子である。式（I I a) において、好ましくは Y₃は、一CO—である。本発明の別の側面によれば、上記方法により作製された、メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体が提供される。

さらに、該メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式

(I I I) ：

(式中、 R_alは、水酸基、直鎖または分枝 — 6アルキル基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ基、直鎖または分枝アルコキシ基であり、あるいはナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムィオン、リチウムイオンもしくは置換されていてもよいアンモニゥムイオンからなる群から選ばれる陽イオンとカルボン酸塩を形成していてもよく、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — ₆アルキル基、直鎖または分枝 (^_₆アルケニル基、直鎖または分枝 C^-eアルキニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキルカルボ二ル基、直鎖または分枝 —6アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂OHである。）

で示される繰り返し構造 Aと、上記式（I I) または（I I a) で示される繰り返し構造 Bを含み、上記繰り返し構造 Aと Bの存在比率は、好ましくは 95 ： 5 〜： 10 ： 90、より好ましくは、 90 : 10〜10 : 90、更に好ましくは、 8 0 ： 20〜20 ： 80である。

本発明のさらに別の側面によれば、 (a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する N—置換アミド基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジル基またはァミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、不飽和結合を有する基を導入する工程、

の工程を含む、上記不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法が提供される。

当該製造方法において、工程（a) により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、上記式 (I) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。

当該製造方法において、工程 (b) により生成するヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（I V)

(式中、 X。は、一〇_ または— N (-R,) —であり、

X₃は、一 — 一 Y₂— N (_R₂) — Y₃— Q₄、または一 N (_R₂) — Y₃ - Q₄であり、

は、水素原子、直鎖または分枝 ^ ₀アルキル基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2 R_a3 R_a4 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝アルキニル基、直鎖または分枝アルキルカルボニル基、直鎖または分枝 Cト ₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C アルキニルカルポニル基、または— S0₂OHであり、

は、単結合、 — N (― R₃) CO—、一 N (-R₃) 一、一 CO—、または、一 CH₂C〇一であり、

Y₂は、単結合、 -CON (一 R₄) —、または一 N (-R₄) 一であり、

Y₃は、単結合、一 CO—、 -N (― R₅) CO_、 -N (一 R₅) —、または、一 CH₂C〇一であり、

は、直鎖または分枝 Ci— アルキレン基、直鎖または分枝ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステ^/基であり、

R₂、 R₃、 R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 (：丄。アルキル基、直鎖または分枝 ( 。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

Q₄は、直鎖もしくは分枝 C₂_₁₀アルケニル基、または、直鎖もしくは分枝 C

2- ₀アルキニル基である。）

また式 (IV) 中、ポリアルキレンオキサイド基とは、 - (CH (― R) CH ₂0) _n-OH (式中、 Rは水素原子、または ₅アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1〜20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1〜20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（IV) において、好ましくは X₀は、一 N (-R_x) 一である。式（IV) において、好ましくは 1^は、水素原子である。式（IV) において、好ましくは X₃は、 ― Yi— — Y₂— N (-R₂) — Y₃— Q₄である。式（I V) において、好ましくはは、単結合、 -N (― R₃) CO—、または、一 N (— R₃) —であり、さらに好ましくは、一N (— R₃) C〇一である。式 (IV) において、好ましくは Y₂は、単結合、 -CON (一 R₃) —であり、さらに好ましくは一 CON (— R₃) —である。式（IV) において、好ましくは Y₃は単結合、一C〇一、または、一N (-R₃) 一であり、さらに好ましくは、一 C〇—である。式（IV) において、好ましくはは、直鎖または分枝アルキレン基である。式（IV) において、好ましくは R₂および R₃は、水素原子である。式（IV) において、好ましくは Q₄は、直鎖または分枝 C₂_ ₁₀アルケニル基である。

本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により作製された、不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体が提供される。

さらに、該不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは上記式（I I I) で示される繰り返し構造 Aと上記式 (IV) で示される繰り返し構造 Cを含み、上記繰り返し構造 Aと Cの存在比率は、 95 ： 5〜； L 0 ： 90、好ましくは、 90 : 10〜10 : 90、更に好ましくは、 80 : 20〜2 0 : 80である。

本発明のさらに別の側面によれば、上記不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合含有化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が提供され、また、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体を、不飽和結^"有化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が提供される。

該化学架橋されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、式（V) ：

(式中、 X₀は、一 O—、または一 N (— I 一であり、は、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 C^— ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 — ₆アルケニル基、直鎖または分枝アルキニル基、直鎖または分枝アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂〇Hであり、

X₄は、 _Y — C^—Ys— X₅— Y₃— Q₂— S—L、または一N (— R₂) — Y₃ - Q₂ - S— Lであり、

X₅は、 _Q₃—または一 N (— R₂) —であり、

は、単結合、一 N (― R₃) CO—、一 N (~R₃) 一、一CO—、または — CH₂C〇一であり、

Y₂は、単結合、一 Ο—、一S—、一 SO—、一 S0₂—、一 N (― R₄) —、一 COO—、一 OC〇一、一CON (— R₄) —、 -N (-R₄) CO—、または一 N (-R₄) CON (― R₅) —であり、

Y₃は、単結合、一 CO—、一 C₆H₄—、一 C〇₂—、一 S〇₂—、 -CH₂- CH (OH) 一、一 C (=NH) 一、 -PO (OH) 一 O—、一 CSNH—、または一 CONH—であり、

Q_l, Q₂および Q₃は、それぞれ独立して、直鎖または分枝 C — アルキレン基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂および R₃は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 Ci- アルキル基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

Lは、他の繰り返し構造の Lと一緒になつて分子内または分子間架橋を形成する、場合によっては主鎖の末端または途中に Zい Z₂、 Z₃、 ∑₄ぉょび2₅を含んでいてもよい、直鎖または分枝 C 。アルキレン基、直鎖または分枝アルケニレン基、またはポリエチレンオキサイド基であり、

Zい Z₂、 Z₃、 Z₄および Z₅は、それぞれ独立して、一 0—、 — S—、 -S 〇一、 — S〇₂ -、一 N (- R₄) -、 -CH (一 R₆) -、一 C (-R₆) (一 R₇) 一、一CO—、一 C〇〇一、一〇C〇一、 -CON (一 R₄) —、 _N (― R₄) CO—、または一 N (― R₄) CON (一 R₅) —であり、

R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₆および R₇は、それぞれ独立して、水酸基、

シ基、ハロゲン原子、力ルポキシル基、アミド基、またはエステル基である。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有する、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体である。

また式（V) 中、ポリアルキレンオキサイド基とは、一 (CH (-R) CH₂ O) _n— OH (式中、 Rは水素原子、またはアルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、またはポリプロピレンォキサイド基であり、また好ましくは nは、 1〜20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1〜20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（V) において、好ましくは X₀は、一 N (― R 一である。式 (V) において、好ましくは 1^は、水素原子である。式（V) において、好ましくは X₄は、一 Yi— Qi— Ya— X₅— Y₃— Q₂— S— Lである。式（V) において、好ましくは X₅は、 ― N (— R₂) —である。式（V) において、好ましくはは、単結合、 ― N (— R₃) CO—、または、 —N (― R₃) —であり、さらに好ましくは、 _N (-R₃) CO—である。式（V) において、好ましくは Y₂は、単結合、 -CON (-R₃) 一であり、さらに好ましくは一 CON (― R₃) —である。式（V) において、好ましくは Y₃は単結合、一 CO—、または、一 N (― R₃) —であり、さらに好ましくは、一CO—である。式 (V) において、好ましくはは、直鎖または分枝アルキレン基である。式（V) において、好ましくは R₂および R₃は、水素原子である。式（V) において、好ましくは Q₂および Q₃は、直鎖または分枝アルキレン基である。式（V) において、好ましくは Lは、一つまたはそれ以上の水酸基、カルボキシル基、直鎖または分枝アルキル基で置換されていてもよい、直鎖または分枝 — 4アルキレン基であり、さらに好ましくは直鎖または分枝 (^ アルキレノ基。、ある。

さらに、該化学架橋されたヒアルロン酸誘導体は、好ましくは上記式 (I I I) で示される繰り返し構造 Aと上記式 (V) で示される繰り返し構造 Dを含み、上記繰り返し構造 Aと Dの存在比率は、好ましくは 95 ： 5〜10 : 90、より好ましくは、 90 : 10〜10 : 90、更に好ましくは、 80 : 20〜20 ： 8 0である。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2のゲルを 2mLの PBS中、 37 °Cでインキュベートし、経時的に 20 O Lサンプリングし、 RP— HP LCでバッファ一中に放出された E P〇を定量した結果の 1例を示す図である。

図 2は、本発明のヒアルロン酸誘導体を含む溶液をラットの皮下へ注入した状態および回収されたゲルの 1例を示す写真である。発明を実施するための好ましい形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明の薬物徐放担体は、夕ンパク質またはべプチド共存下の溶液中でヒアル口ン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有ィ匕合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結 ^有ィ匕合物で化学架橋、ハイドロゲレイ匕することを特徴とする。

本発明の薬物徐放担体は、以下のような優れた特徴を有している。

1. 完全生分解性、生体に対する安全性を付与できる。 2. HAに架橋可能な官能基をグラフトすることで、架橋点間距離を非常に小さく（ダルクロン酸当たり 3 3モル％グラフトで約 3 nm) することが可能であり、長期徐放を実現する上で有利である。

3. 高架橋密度である。

4. タンパク質の変性を防ぐことができる。

化学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。

架橋時の p Hは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに不飽和結合とメルカプト基の選択的反応を優先させ、タンパク質またはべプチド含有アミノ基との反応を防ぐ p Hが好ましい。そのような p Hは当業者が ¾g 選択することが可能であるが、例えば p H 3. 0〜9. 0、好ましくは p H 6. 0〜8. 5である。

ヒアルロン酸に導入、あるいは架橋剤に含まれる不飽和結合は、 C一 C 2重結合または C一 C 3重結合のほか、 C = 0結合、 —C = N—結合であってもよい。不飽和結合を有する基としては、特に限定されないが、例えば、メタクリル基、アクリル基、マレイミド基、ビニルスルフォン基、ァセチレンカルポニル基等が挙げられる。

ヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入した場合に用いられる架橋剤としては、不飽和結合と求核付加反応で反応するメルカプト基を 2つ以上同一分子に含むィヒ合物が用いられる。例えば、ジチオトレイトール（D TT) 、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システィンを 2つ以上含むぺプチド等が挙げられる。

ヒアルロン酸にメルカプト基を導入した場合に用いられる架橋剤としては、メルカプト基と求核付加反応で反応する不飽和結合を有する基を 2つ以上同一分子に含む化合物が用いられる。例えば、エチレングリコールジメタクリレート、ェチレンビスアクリルアミド、トリスー 2—マレイミドエチルァミン、 1 , 8—ビスマレイミドトリエチレングリコール、 1， 4一ビスマレイミジル一 2 , 3—ジヒドロキシブタンなどを挙げることができる。また、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為に塩基性化合物を添加することが好ましい。用いる塩基性化合物としては特に限定されるものではないが、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの水酸化物、アンモニア水、ピリジン、トリェチルァミン、エチレンジァミン、エタノールァミン、ジェタノ一ルァミン、トリエタノールァミン等のアミン類が挙げられ、好ましくはァミン類が用いられ、さらに好ましくは、トリエタノールァミンが用いられる。この際好ましい濃度としては、 10〜2 O zLZmLである。

また、架橋反応終了後、未反応のメルカプト基が長時間残存しているとタンパク質の変性を促すため、ゲル調製後は速やかに未反応のメルカプト基を洗い流したり、ョード酢酸等のメルカプト基と選択的に反応する化合物を添加する等して、未反応のメルカプト基を^ ¾することが好ましい。また、架橋剤の片末端のみがヒアルロン酸誘導体にグラフトされ、反応性を有するメルカプト基が残存し、これがタンパク質の変性に繋がる可能性があるため、このフリ一なメルカプト基を除去する意味でもメルカプト基と選択的に反応する化合物を添加することが好ましい。

不飽和結合を有する基を導入したヒアルロン酸誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、メタクリル酸グリシジルェ一テルや、無水メタクリル酸等を H Aの水酸基に直接反応させる方法 (J. B i ome d. Ma t. Re s. 5 4、 115— 121、 2001) では高い導入率は得難い。これは、ヒアルロン酸が水溶液中で水素結合、疎水性相互作用による高次構造を形成し、ヒドロキシル基、カルボン酸基等の官能基の反応性が低いためと考えられる。タンパク質やペプチドの徐放期間を延ばすには、高い架橋密度が望ましい。このためには、グルクロン酸部分の力ルポキシル基に置換基を導入するのが望ましい。例えば、ヒアルロン酸を 3級アンモニゥム塩にして、ジメチルスルホキシド（DM SO) 等の極性有機溶媒に溶解し、 1—ェチル— 3— (3—ジメチルァミノプロピル）力ルポジイミド（EDC) 等のカップリング剤存在下、不飽和結合を有するァミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。不飽和結合を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、ァリルァミン、ジァリルァミン、 4ーァミノ一 1ーブテン、アクリルヒドラジド、メタクリルヒドラジド等を挙げることができる。

また上述の高い架橋密度を実現できるという点において、アミノ基ゃヒドラジド基を導入し、その後、このアミノ基ゃヒドラジド基に不飽和結合を有する基を導入する方法が好ましい。

例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) 、あるいはェチレンジアミン等の 2価のヒドラジドまたはァミノ基含有化合物とを、 ED C等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾されたヒアルロン酸誘導体 (H A-H Z) 、またはアミノ基修飾されたヒアルロン酸誘導体（HA—アミノ基）を合成し、これに無水メタクリル酸を反応させる方法などが挙げられる。

メルカプト基導入ヒアルロン酸誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、ヒアルロン酸を 3級アンモニゥム塩にして、ジメチルスルホキシド（DM S O) 等の極性有機溶媒に溶解し、 1—ェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド (ED O 等のカップリング剤存在下、メルカプト基を有するアミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。

メルカプト基を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、 2—アミノエタン一 1ーチオール、 3—ァミノプロパン一 1—チオール、チォグリコ一ル酸ヒドラジド、などを挙げることができる。

また高い架橋密度を実現できるというの理由で、まずアミノ基ゃヒドラジド基を導入し、その後このアミノ基ゃヒドラジド基にメルカプト基を導入する方法が好ましい。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（A DH) 、あるいはエチレンジァミン等の 2価のヒドラジドまたはアミノ基含有化合物とを 1一ェチル _ 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド（E D C) 等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾されたヒアルロン酸誘導体 (H A-H Z) 、またはアミノ基修飾されたヒアルロン酸誘導体（HA—アミノ基）を合成し、これに例えば N—スクシ二ミジル一 3— [ 2—ピリジルジチォ] プルピオネイト（S P D P) を反応させ、 D TT等の還元剤で還元、メルカプト基とする方法などが挙げられる。

ヒドラジド基のヒアルロン酸誘導体における導入率は特に制限されないが、通常、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸当たり 5 モル％以上が好ましく、 1 0モル％以上が特に好ましい。

ァミノ基のヒアルロン酸誘導体における導入率は、流動性のないゲルを得るために H Aのグルクロン酸当たり 5モル％以上、好ましくは 1 0モル％以上である。不飽和結合を有する基のヒアルロン酸誘導体への導入率は、特に限定されないが、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸当たり 5 モル％以上が好ましく、 1 0モル％以上が特に好ましい。

メルカプト基のヒアルロン酸誘導体における導入率は、特に限定されないが、流動性のないゲルを得るためにヒアルロン酸のダルク口ン酸当たり 5モル％以上、好ましくは 1 0モ^ /%以上である。

ヒアルロン酸に不飽和結合を有する基を導入後、メルカプト基で架橋する場合、メルカプト基の、不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が ¾選択することが可能であるが、夕ンパク質およびべプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和結合を有する基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基：不飽和結合 = 3 ： 1〜1 ： 1が好ましい。更に好ましくは、 2 ： 1 - 1 . 5 ： 1である。

ヒアルロン酸にメルカプト基を導入後、不飽和結合を有する基で架橋する場合、不飽和結合を有する基のメルカプト基に対する比率は特に限定されず、当業者が ¾!：選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和結合を有する基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、不飽和結合：メルカプト基 = 3 ： 1〜1 ： 1が好ましい。更に好ましくは、 2 ： 1〜1 . 5 ： 1である。

HA誘導体と薬理作用を持つタンパク質、ペプチドとからなるハイドロゲルの調製方法としては、例えば、 HA誘導体とタンパク質またはペプチドをリン酸緩衝生理食塩水に溶解した後、ここに架橋剤を加えて均一分散させ室温、または 4°Cで反応させればよい。本架橋方法は比較的反応速度が遅いため、より均一に HAを架橋、均一なゲルを調製できる利点がある。これは徐放性能の安定化、長期化に有効である。

本発明に用いられるヒアル口ン酸は、どのようにして得られたヒアル口ン酸でもよく、動物纖から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、ヒアルロン酸にさらなる処理を行ってもよい。

本発明の HAには、様々な方法で修飾された修飾 HAや、ナトリウム、力リウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。 HAは力ルポキシル基とハイドロキシル基が修飾されることが多いが、本発明において修飾 H Aはどの部分が修飾されていてもよい。修飾 H Aは特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化された H A (国際公開第 95Z25751号パンフレット）、 N—硫酸化された HA (国際公開第 98Z45335号パンフレット）、エステル化された HA (欧州特許出願公開第 0216453号明細書、国際公開第 98/08876号パンフレツト、欧州特許出願公開第 034174 5号明細書）、過沃素酸酸化された HA、アミド修飾された HAなどを挙げることができる。

本発明に用いられるヒアル口ン酸の分子量は特に限定されず、いかなる分子量のヒアルロン酸でも使用することが可能であるが、通常 5000〜 350万ダルトン、好ましくは 1万〜 200万ダルトンのヒアルロン酸を用いることができる。薬効を持つタンパク質、ペプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロポェチン（EPO) 、ダラニュロサイトコロニ一刺激因子（G—CSF) 、インタ一フエロン一 α、 β、 τ、 (INF— 、 β、 r) 、トロンポポェチン

(TPO) 、シリアリーニューロトロフイクファクター（CNTF) 、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（TNFbp) 、インターロイキン一 10 (I L— 10) 、 FMS類似チロシン力イネ一ス（F l t— 3) 、成長ホルモン (GH) 、インシュリン、ィンシュリン類似成長因子一 1 (I GF-1) 、血小板由来成長因子（PDFG) 、インタ一ロイキン一 1レセプ夕一アンタゴニスト（I L— 1 r a) 、ブレイン由来ニューロトロフイクファクター（BDN F) 、ケラチノサイト成長因子（KGF) 、幹細胞因子（SCF) 、メガカリオサイト成長分化因子（MGDF) 、ォステオプロテゲリン（OPG) 、レブチン、副甲状腺ホルモン（PTH) 、塩基性フイブロブラスト成長因子（b— FGF) 、骨形成タンパク質（BMP) 、ダル力ゴン様ペプチド一 1 (GLP— 1) 、抗体、ダイアポディ一等が挙げられる。

本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、特に限定されないが、例えば、ハイド口ゾルまたはオルガノゾルであってもよく、好ましくはハイドロゾルである。

本発明の徐放担体は、 1種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。インジェクション可能な微粒子状にするためには、例えば、ゲル化後に乾燥、凍結粉碎する方法、ェマルジヨン法で微粒子状のゲルを調製した後、乾燥させる方法、スプレードライ法や、超臨界溶液法などの乾燥微粒:子調製法、また、本組成物を架橋反応終了前に溶液状態で投与、体内で架橋させる方法など、既知の方法を採用することができる。実施例

EPO封入ヒアルロン酸 (HA) 誘導体ハイド口ゲルの調製

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

NMR測定は、核磁気共鳴装置 JNM-ECA500 (日本電子株式会社製）を用いて重水を溶媒に用いて測定した。また置換基の導入率の決定は、導入した置換基特有のピークとヒアル口ン酸由来のピークの積分比より決定した。逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（RP— HPLC) 分析は、 W a t e r s 600 Sコントローラ、 717 p 1 u sオートサンプラー、 486紫外光吸収測定器 (Wa t e r s社製）を用い、以下の測定条件より行った。

カラム： C 4 (粒子径 5 urn, サイズ 4. 6X250 mm)

移動相： A：水/ァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸 =400/100/1,

B：水 Zァセトニトリル/トリフルォロ酢酸 = 100/400/1 流速： lmL/分、移動相 A/B=65/35〜0Z100のグラジェント溶出

カラム温度：室温付近

サンプル温度： 4°C

検出波長： UV 280nm

解析ソフト： M i 1 1 e n i um32 V e r. 3. 21

実施例 1

〔実施例 1— 1〕ヒドラジド基（HZ) が導入されたヒアルロン酸 (HA- HZ) の合成

分子量 1. 9 X 10⁵タレトンのヒアリレロン酸 (HA) (電気化学工業株式会社製） 2001118を0： 5%濃度で蒸留水に溶解し、 5N續でpHを4. 7〜 4. 8に調製した。 1一ェチル一3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド（EDC) とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を、 HA : EDC : AD H=l ： 0. 3 : 40 (バッチ 1— 1) 、 1 : 1 : 40 (バッチ 1— 2) 、 1 ： 5 : 40 ひッチ 1一 3) モル比になるよう添加し、 5N塩酸で pHを 4. 7〜 4. 8に保ちながら室温で攪拌下 2時間反応させた。 l O OmM塩化ナトリウム溶液、 25%エタノール溶液で透析（スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWC O) ： 12 k— 14 kタレトン）し、凍結乾燥して標題の HA— H Zを得た。得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、それぞれ、 HAのカルボン酸の 26% (バッチ 1— 1) 、 46% (バッチ 1— 2) 、 69% (パッチ 1一 3) が HZ化されていた（HAおよび HA— HZの N—ァセチル基、 2. 1 ppm (3H) 、 HA— HZのアジピン酸由来部分のメチレン基、 1. 7 ppm, 2. 4 ppm (各 2H) を比較）。

〔実施例 1— 2〕メタクリル基 (MA) が導入されたヒアルロン酸 (HA- MA) の合成

実施例 1— 1のバッチ 1〜3の HA— HZ、各々 90mgを 0. 45mLの 1 0 OmMリン酸バッファ一 pH8に溶かし（HA—HZ2%w/v) 、 0. 54 mLの無水メタクリル酸を加え、室温で攪拌下 1日反応させた。エタノールで沈殿、洗浄し、乾燥させた。また、得られた HA— MA中の MA導入率をプロトン NMR法で定量した結果を表 1に示す。（HAおよび HA— MAの N—ァセチル基、 2. 1 ppm (3H) 、 HA— MAのメタクリル基のビニルプロトン、 5. 5-6. 0 ppm (2H) を比較）。

対照バッチ 1 バッチ 2 バッチ 3

HZの導人率 0% 26¾ 46¾ 69¾ 歸導入率 4¾ 12¾ 17¾ 29¾

〔実施例 1-3] EP 0封入 HAMド口ゲル調製

実施例 1—2のバッチ 3の、 MAの導入率が 29%である HA—MAI lmg と、 £?〇100 8を0. 25mLのリン酸食塩水バッファー pH7. 4 (P BS) に溶かした（室温、 1時間攪拌）。これに、 3. 5 Lのトリエタノールァミン（TEA) 、 1 O Lのジチオトレイトール（DTT) 溶液（92. 55 mg/mL PBS) を加えた。室温で 3時間反応させるとゲルになった。このゲルを 400 mLの P B Sに対して 3時間透析し、未反応の D T Tを洗浄した。

実施例 2

実施例 1 - 3でゲル調製後透析せずに 10 2 Lのョ一ド酢酸溶液（223. 2 mg/niL PBS, DTTの 2倍モル）を加えたこと以外は実施例 1一 3と同様の方法で EPO封入 HAハイドロゲルを調製した。

実施例 3 ： in situ架橋 EPO封入 HAハイドロゲル

実施例 1一 2のバッチ 2の、 MAの導入率が 29%でぁるHA—MA22mg と、 £?0400 を0. 48mLのリン酸食塩水バッファー pH7. 4 (P BS) に溶かした（室温、 1時間攪拌）。これに、 3. 5 Lのトリエタノールァミン（TEA) 、 20 iLのジチオトレイトール（DTT) (92.55mg/ mL) を加えた。室温で 10分間攪拌した後、 lmLシリンジに詰め、 DTT添カロ 120分後、ラット皮下に 100 L投与（22ゲージ針使用）した。 4時間後に皮下からゲルを回収した。図 2にラットの皮下へ注入した状態および回収されたゲルの写真を示す。皮下で本組成の溶液は架橋、ゲル化することがわかる。比較例 1

実施例 1の E P〇封入 HAハイドロゲル調製において、 20 Lのジチォ卜レィトール（DTT) (92.55mg/mL) を加え、 pH8. 0の PBS中で反応させ、 TEAを加えなかったこと以外は実施例 1一 3と同様の方法で EPO 封入 HAハイドロゲルを調製した。

比較例 2

実施例 1の E P〇封入 HAハイド口ゲル調製において、 5 Lのジチォトレイトール（DTT) (92.55mg/mL) を加え、 pH8. 0の PBS中で反応させ、 TEAを加えなかったこと以外は実施例 1と同様の方法で EPO封入 H Aハイドロゲルを調製した。

比較例 3

実施例 1の E P O封入 HAハイド口ゲル調製において、 10 Lのジチォトレィトール（DTT) (92.55mg/mL) を加え、 pH8. 0の PBS中で反応させ、 TEAを加えなかったこと以外は実施例 1と同様の方法で EPO封入 HAハイド口ゲルを調製した。

試験例 1 ： EP O封入 H Aハイド口ゲルの E P O回収率測定

実施例 1、 2、および比較例 1〜 3のゲル（100 g/mL E P〇含有 0. 25mLゲル) に Hy a l u r on i da s e SD (生化学工業製) 0. 5ュニットを含む PBS pH7. 4を 0. 75mL加え、 25 °Cで 3時間、酵素処理を行い、ゲルを完全にさせた。酵素処理後の溶液 0. 15mLを、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP— HPLC) 測定を行い、 0. lmgZmLの EPO水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピ一クエリァ比から試料溶液中 E P〇濃度を算出した。添加した E P〇量 (0. lmg/ゲル 1個）に対して RP— HPLCより求めた EPO量を回収率として算出した。

ゲル化に要する時間、仕込みの E P〇に対するゲルから回収された E P〇の回収率を表 2に示す。表 2 サンプル反応時間 EPO回収率

実施例 1 3hrs 90%

実施例 2 3hrs 92%

比較例 1 5 hrs 75%

比較例 2 1 day 71%

比較例 3 o〜 / hrs 78%

試験例 2 ： BP O封入 HAヒドロゲル調製からの E P〇徐放

実施例 2のゲルを 2mLの PBS中、 37 でィンキュベ一トし、経時的に 200 Lサンプリングした。 RP— HPLCでバッファ一中に放出された EP Oを定量した。

ゲル調製直後にヒアルロニダーゼで分解、回収された E P Oを 100 %とした時のゲルからの EPO放出性を図 1に示す。尚、 12日後にヒアルロニダーゼを添加した。ゲル内の EPOは変性せず、 90%以上が徐放されることが分かる。上記実施例に例示された、ヒアルロン酸架橋方法を用いることで、タンパク質またはペプチドの生物活性を維持したままこれらを i n s i t u架橋し、ハイドロゲルの中に封入した夕ンパク質またはべプチド徐放製剤を調製することが可能である。

試験例 3 ： in s i tu架橋 E P O封入 HAハイド口ゲルからの E P〇徐放性能実施例 3の調製液を DTT添加後、室温で 150分間放置した後、 120 L をラット皮下に投与した。血清中の EPO濃度を EL I SAキット（Roche Diagnistics GmbH, Mannheim, Germany) で測定した。表 3に WinNonlin ver. 2.1 (Pharsight社)を用いてノンコンパ一トメントモデルで解析した平均滞留時間 (MRT) を示す。対象として、 EPO溶液、 EPO + HA (^？量 200万ダルトン、 1%濃度）溶液の MRTを示す。 EPO溶液の解析データは、文献値 (加藤基浩，遺伝子組換えヒト型エリスロポエチン（EPOCH) 皮下投与後の体内動態 (1) : 非標識 EPOCH単回投与時のラット、ィヌにおける動態；薬物動態， 8 [4] , 471-479, 1933) を基に投与量を補正したシミュレーションデータより算出した値を表 3に示す。本架橋ゲルからの E P〇放出期間が延長された。

表 3

MRT (日）

EPO溶液 0.675 EPO+HA溶液 0.924 in situ架橋 EPO封入 HA/、イド口ゲル 1.54

産業上の利用の可能性

本発明の薬物徐放担体は、タンパク質またはペプチドの生物活性を麟したままこれらを i n s i t u 化学架橋、 HAハイドロゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク質、ペプチドの徐放を可能にする。

Claims

請求の範囲

1 . 夕ンパク質またはべプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸に不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有ィ匕合物で、または、ヒアルロン酸にメルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体を不飽和結合を有する化合物で化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とした薬物徐放担体。

2. 以下の工程を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法：

( a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する、 N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジル基またはァミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、メルカプト基を導入する工程。

3. 以下の工程を含む、請求項 2記載の、メルカプト基が導入されたヒアル口ン酸誘導体の製造方法：

( a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、式（I ) ：

(式中、 X₀は、一〇一、または— N (― R —であり、は、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝 ( トェ。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝アルキニル基、直鎖または分枝 (^— 6アルキルカルボ二ル基、直鎖または分枝 C ₆アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂〇Hであり、

は、一 Y — Qi— Ys— NH— R₂、または一 NH— R₂であり、

は、単結合、 -N (一 R₃) CO—、一 N (― R₃) —、一C〇一、または一 CH₂CO—であり、

Y₂は、単結合、 -CON (― R₄) ―、または _N (_R₄) —であり、

は、直鎖または分枝 C^- アルキレン基、直鎖または分枝 C^- ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂、 R₃および R₄は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 ( _{1 0} アルキル基、直鎖または分枝 Ci— ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、 .

(b) 上記ヒアルロン酸誘導体に、メルカプト基を導入し、式（I I) ：

(式中、 X₂は、一 Y_t— Qi— Ys— N (― R₂) — Y₃— Q₂— SH、または一 N (-R₂) — Y₃ - Q₂— SHであり、

X₀、 Rい R_a2、 Ra3、 Ra4、 R_a5、 R&6、 Yl、 Ql、 Κ·2、尺3および R₄は、上記式 (I) で定義したとおりであり、

Y₃は、単結合、一 CO_、一 C₆H₄ 、一 C0₂ -、一 S〇₂ -、一 CH₂— CH (OH) ―、 -C (=NH) 一、一 P〇 (OH) —〇一、一 CSNH—、または一 C〇NH_であり、

Q₂は、直鎖または分枝 Ci- アルキレン基、直鎖または分枝じト^ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程。

4. 有機溶媒中において、ヒアルロン酸の少なくとも以上のカルボキシル基を、メルカプト基を含む置換基を有する N—置換アミド基またはエステル基に変換するする工程を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法。

5. 有機溶媒中において、ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、メルカプト基を含む置換基を有する N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、式（I I a) ：

(式中、 X₀は、一 O -、または— N (-R_x) —であり、は、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝じトェ。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 -6アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 C — ₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 S0₂〇Hであり、

X_2aは、一 — — Y₂— Q₃— Y₃_Q₂— SH、または— N (— R₂) — Y₃— Q₂_SHであり、

は、単結合、 -N (― R₃) C〇一、 -N (― R₃) ―、一CO—、または _CH₂C〇—であり、

Υ₂、 Υ₃は、それぞれ独立して、単結合、一〇一、一 S―、一 SO—、一 S 0₂—、一 N (― R₄) ―、一 CO〇一、一 OC〇一、 -CON (-R₄) ―、 ― N (― R₄) CO—、または— N (― R₄) CON (― R₅) —であり、

Qい Q₂および Q₃は、それぞれ独立して、直鎖または分枝 Ci- アルキレン基、直鎖または分枝 - ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂、 R₃、 R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — 。アルキル基、直鎖または分枝 Ci— ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。 )

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程を含む、上記メルカプト基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法。

6. 請求項 2、 3、 4または 5に記載の方法により作製された、メルカプト基が導入されたヒアル口ン酸誘導体。

7. 上記式 (I I) (式中、 X。、 X₂、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 3で定義したとおりである。 ) 、または式 (I I a) (式中、 X₀、 X_2a、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 5で定義したとおりである。）で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有する、請求項 6に記載のヒアルロン酸誘導体。

8. ヒアルロン酸誘導体中のグルクロン酸当たりの、メルカプト基の導入率が 5モル％以上であることを特徵とする請求項 6または 7に記載のヒアルロン酸誘導体。

9. 式（I I I) ：

(式中、 R_alは、水酸基、直鎖または分枝 -6アルキル基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ基、または直鎖または分枝 Ci— eアルコキシ基であり、あるいはナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシゥムイオン、リチウムイオンもしくは置換されていてもよいアンモニゥムイオンからなる群から選ばれる陽イオンとカルボン酸塩を形成していてもよく、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 _₆アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝 (^_₆アルキニル基、直鎖または分枝 _₆アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 C i— 6アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 SO ₂〇Hである。）

で示される繰り返し構造 Aと上記式（I I) (式中、 X_n、 X₃、 R_a2、 R .a3、

R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 3で定義したとおりである。）または（I I a) (式中、 X。、 X_2a、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 5で定義したとおりである。）で示される繰り返し構造 Bを含み、

上記繰り返し構造 Aと Bの存在比率が、 9.5 ： 5〜10 ： 90であることを特徴とする、請求項 6、 7または 8に記載のヒアルロン酸誘導体。

10. 請求項 6、 7、 8または 9に記載のヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合含有化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアル口ン酸誘導体。

1 1. 以下の工程を含む、不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法：

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、ヒドラジル基またはアミノ基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジル基またはァミノ基が導入されたヒアルロン酸誘導体に、不飽和結合を有する基を導入する工程。

12. 以下の工程を含む、請求項 1 1に記載の、不飽和結合を有する基が導入されたヒアルロン酸誘導体の製造方法：

(a) 上記ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジル基またはアミノ基を含む置換基を有する N—置換アミド基またはエステル基に変換することにより、上記式 (I) (式中、 X₀、 Xい R a2、 R a3、 R a4、 R a 5、

R_a6は、請求項 3で定義したとおりである。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、

(b) 上記ヒアルロン酸誘導体に、不飽和結合を有する基を導入し、式（I V) ：

(式中、 X₀は、 — O—、または— N (― R —であり、 X₃は、一 — C^— Ys— N (— R₂) — Y₃_Q₄、または一 N (— R₂) — Y₃ - Q₄であり、

は、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝アルキニル基、直鎖または分枝アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルキニルカルポニル基、または—S0₂〇Hであり、

丫は、単結合、 -N (-R₃) CO—、 -N (― R₃) —、 —CO—、または、 _CH₂C〇一であり、

Y₂は、単結合、 -CON (_R₄) —、または一 N (-R₄) 一であり、 Y₃は、単結合、一C〇_、 -N (-R₅) CO—、 -N (一 R₅) ―、または、 ― CH₂CO—であり、

は、直鎖または分枝 — 。アルキレン基、直鎖または分枝 C - oヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₂、 R₃、 R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝。アルキル基、直鎖または分枝 C 。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

Q₄は、直鎖もしくは分枝 C₂— ₁₀アルケニル基、または、直鎖もしくは分枝 C ₂_₁₀アルキニル基である。）

13. 請求項 11または 12に記載の方法により作製された、不飽和結合を有する基が導入されたヒアル口ン酸誘導体。

14. 上記式 (IV) (式中、 X。、 X₃、 R a2、 R_a3、 R a4、 R a5、 R_a6は、請求項 12で定義したとおりである。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有する、請求項 13に記載のヒアルロン酸誘導体。

15. ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たりの、不飽和結合を有する基の導入率が 5モル％以上であることを特徴とする請求項 13または 14に記載のヒアル Πン酸誘導体。

16. 上記式（I I I) (式中、 R_al、 R a2、 R a3、 R a4、 R a5、 R_a6は、請求項 9で定義したとおりである。 ) で示される繰り返し構造 Aと上記式 (I

V) (式中、 X₀、 X„ R £12、 R 33、 R_a4、 R ■_aa_R5,、 R ■_a a_R6は、請求項 3で定義したとおりである。 ) で示される繰り返し構造 Cを含み、

上記繰り返し構造 Aと Cの存在比率が、 95： 5〜； L 0 ： 90であることを特徴とする、請求項 13、 14または 15に記載のヒアルロン酸誘導体。

17. 請求項 13、 14, 15または 16に記載のヒアルロン酸誘導体を、メルカプト基を有する化合物で化学架橋して得られる、化学架橋されたヒアルロン

8. 式（V)

(式中、 X。は、 — O—、または _N (-R_x) 一であり、

は、水素原子、直鎖または分枝 Ci— ₆アルキル基、直鎖または分枝 (：ェ。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝アルケニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキニル基、直鎖または分枝 (^— 6アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルケエルカルポニル基、直鎖または分枝 C i一 ₆アルキニルカルポニル基、または— S〇₂OHであり、

X₄は、一 Yi— Qt— Ys— X₅— Y₃— Q₂— S— L、または _N (— R₂) — Y₃— Q₂— S— Lであり、

X₅は、一 Q₃—または一 N (_R₂) —であり、

は、単結合、 -N (一 R₃) CO—、 -N (一 R₃) —、 —CO―、または — CH₂CO—であり、

Y₂は、単結合、 _〇_、一 S—、一 S〇一、一 S0₂—、 -N (― R₄) ―、一 COO―、一〇C〇一、 -CON (- ₄) ―、一 N (- ₄) C〇_、または— N (-R₄) CON (_R₅) —であり、

Y₃は、単結合、一CO—、一 C₆H₄—、一 C〇₂—、一 S〇₂—、 -CH₂- CH (OH) 一、 -C (=NH) ―、一 P〇 (OH) — O—、一 CSNH—、または— C〇NH—であり、

Qい Q₂および Q₃は、それぞれ独立して、直鎖または分枝アルキレン基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

2ぉょび尺₃は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 i。アルキル基、直鎖または分枝 ^。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

Uま、他の繰り返し構造の Lと一緒になつて分子内または分子間架橋を形成する、場合によっては主鎖の末端または途中に Zい Z₂、 Z₃、 ∑₄ぉょび2₅を含んでいてもよい、直鎖または分枝 — ₁₀アルキレン基、直鎖または分枝 C - アルケニレン基、またはポリエチレンォキサイド基であり、

Zp Z₂、 Z₃、 2₄ぉょぴ ₅は、それぞれ独立して、一 O—、 ― S―、一 S O—、 —S〇₂—、 ― N (-R₄) ―、 -CH (一 R₆) —、 -C (-R₆) (一 R₇) 一、一 CO—、一 COO—、一〇CO—、 -CON (_R₄) —、一 N (— R₄) CO—、または— N (-R₄) CON (— R₅) —であり、

R₄および R₅は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 (：ト^アルキル基、直鎖または分枝 C ^。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、

R₆および R₇は、それぞれ独立して、水酸基、直鎖または分枝アルコキシ基、ハロゲン原子、力ルポキシル基、アミド基、またはエステル基である。）で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有する、請求項 10または 17に記載の化学架橋されたヒアルロン酸誘導体。

19. 上記式 (I I I) (式中、 R_aい R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 9で定義したとおりである。）で示される繰り返し構造 Aと上記式 (V) (式中、 X₀、 X₄、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 18で定義したとおりである。）で示される繰り返し構造 Dを含んで成り、

上記繰り返し構造 Aと Dの存在比率が、 95 ： 5〜10 ： 90であることを特徴とする、請求項 10、 17または 18に記載の化学架橋されたヒアルロン酸誘導体。

20. 請求項 6、 7、 8または 9に記載のヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合含有化合物で化学架橋することを特徴とする、化学架橋されたヒアルロン酸誘導体の製造方法。

21. タンパク質またはペプチド共存下の溶液中で、請求項 6、 7、 8または 9に記載のヒアルロン酸誘導体を、不飽和結合を有する化合物で化学架橋することを特徴とする、請求項 20に記載の化学架橋されたヒアルロン酸誘導体の製造方法。

22. 上記化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が、上記式 (V) (式中、 X₀、 X₄、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 18で定義したとおりである。）で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である、請求項 20または 21に記載の製造方法。

23. 請求項 13、 14， 15または 16に記載のヒアル口ン酸誘導体を、メルカプト基を有する化合物で化学架橋することを特徴とする、化学架橋されたヒアル口ン酸誘導体の製造方法。

24. タンパク質またはペプチド共存下の溶液中で、請求項 13、 14， 15 または 16に記載のヒアルロン酸誘導体を、メルカプト基を有する化合物で化学架橋することを特徴とする、請求項 23に記載の化学架橋されたヒアルロン酸誘導体の製造方法。

25. 上記化学架橋されたヒアルロン酸誘導体が、上記式 (V) (式中、 X。 X₄、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5、 R_a6は、請求項 18で定義したとおりである。 ) で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である、請求項 23または 24に記載の製造方法。

26. 請求項 10、 17、 18または 19に記載の化学架橋されたヒアル口ン酸誘導体を含む、ヒアル口ン酸誘導体ゲル。

27. 上記ヒアルロン酸誘導体ゲルがハイドロゲルである、請求項 26に記載のヒアル口ン酸誘導体ゲル。

28. タンパク質またはペプチドを含有することを特徴とする、請求項 26または 27に記載のヒアル口ン酸誘導体ゲル。

29. 請求項 10、 17、 18または 19に記載の化学架橋されたヒアル口ン酸誘導体を含む、薬物徐放担体。

30. 請求項 26、 27または 28に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルを含む、薬物徐放担体。

31. 請求項 26, 27または 28に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルを含む、薬剤組成物。

32. 請求項 1、 29または 30に記載の薬物徐放担体を含む、薬剤組成物。