JP2023503896A - スルフヒドリル変性高分子化合物のヒドロゲル及びその調製方法並びに用途 - Google Patents

スルフヒドリル変性高分子化合物のヒドロゲル及びその調製方法並びに用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、スルフヒドリル変性高分子化合物のヒドロゲル及びその調製方法並びに用途に関する。本発明は、新規構造のスルフヒドリル変性高分子化合物を採用し、それをアクリロイル化高分子化合物及び/又はアクリロイル低分子架橋剤と組み合わせてヒドロゲルを形成する。前記スルフヒドリル変性高分子化合物は、生理学的条件下で前記アクリロイル化高分子化合物及び/又はアクリロイル低分子架橋剤と架橋してヒドロゲルを形成することができる。また、形成されたヒドロゲルの造形効果及び代謝耐性・分解耐性に関連する物理的性質、化学的性質も従来技術に比べて明らかな優位性を有する。具体的には、その代謝耐性・分解耐性は従来技術のヒドロゲルより明らかに優れ、更に、スルフヒドリル-ビニル架橋反応が迅速であるという特性により、前記2つの化合物によって形成されたヒドロゲルシステムは、体内に注射された後、迅速にイン・サイチュゲル化することができる。本発明のヒドロゲルは、生物医学、医療美容と形成外科及び化粧品などの分野への適用に一層有利である。

Description

発明の詳細な説明
本願は、2019年11月18日に中国国家知識産権局に提出した出願番号が201911130069.5で、発明名称が「スルフヒドリル変性高分子化合物のヒドロゲル及びその調製方法並びに用途」である先行出願の優先権を主張し、当該先行出願の全文は引用により本願に組み込まれる。
〔技術分野〕
本発明は、生体材料分野に属し、具体的にはスルフヒドリル変性高分子化合物のヒドロゲル及びその調製方法並びに用途に関する。
〔背景技術〕
生体医用材料（Biomedical Materials）は生体材料（Biomaterials）とも略称され、生体に対して病理組織や臓器を診断、治療、修復又は交換したり、その機能を強化したりするために用いられる新規なハイテク材料である。組織工学の肝心な技術の一つは、生体材料で優れた生体適合性を有すると共に体に分解されて吸収される細胞足場を調製することである。ゲル状態は固体と液体の中間状態であり、ヒドロゲルとは、水中で膨潤し、溶解せずに大量の水分を保持できる、親水性架橋三次元ポリマーネットワークを指し、その水分含有量が90%以上に達することができる。ヒドロゲルは理想的な生体材料であり、それ自体又は簡単な変性によって天然の細胞外マトリックスと類似する十分な物理的及び化学的性質を有することができると同時に、酸素ガス、栄養物質、細胞代謝物及び水溶性金属イオンに対して良好な透過性を示している。ヒドロゲルを調製するための親水性高分子は、その由来に応じて天然高分子と合成高分子に分類される。その中で、天然高分子にはコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、多糖類などが含まれ、合成高分子には合成ポリペプチド、ポリエチレングリコール（PEG）及びその誘導体、ポリメチルメタクリレート（PMMA）及びその誘導体、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）及びその誘導体などが含まれる。近年、注射可能なイン・サイチュ（in situ）架橋ヒドロゲルもますます注目を集めている。注射可能なイン・サイチュ架橋ヒドロゲルは、注射前に流動可能な液体状態を呈し、標的位置に注射された後、標的位置の形状に完全に一致するコロイドを形成できるという特徴を有する。このような注射可能な特性によって、操作プロセスを簡単且つ便利にするだけでなく、患者への移植手術による痛みを回避し、手術の外傷を大幅に軽減することができる。
前記天然高分子の中で、ヒアルロン酸（Hyaluronic acid, HA）はその優れた特性によって、研究者の注目を集めている。天然ヒアルロン酸は、D-グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンの交互単位で構成される天然ヘテロ多糖類である。その後、数十年の研究により、ヒアルロン酸がヒトや他の脊椎動物の結合組織に広く存在することが分かった。例えば、細胞間隙、運動関節組織、臍帯、皮膚、軟骨、血管壁、滑液及び鶏冠などの組織や臓器には、いずれもヒアルロン酸が含まれる。ヒアルロン酸は線状高分子多糖類に属し、構造には二糖繰り返し単位が含まれ、繰り返し単位におけるD-グルクロン酸はβ-1,3グリコシド結合を介してN-アセチルグルコサミンに接続され、数万もの二糖繰り返し単位はβ-1,4グリコシド結合を介して接続され、高分子直鎖全体及び線形構造が形成される。人体の生理学的状態では、ヒアルロン酸は通常、ナトリウム塩の形式で存在する。その中で、ヒアルロン酸ナトリウム及びそのゲルは、整形外科、婦人科及び形成外科などの分野で広く適用され、眼科用製剤の担体としても使用でき、直接眼科用製剤として眼科手術に使用することもできる。即ち、ヒアルロン酸ナトリウム製品は、眼科手術においても重要な用途がある。ヒアルロン酸ナトリウムは、関節の滑液と軟骨の重要な構成成分でもある。関節内のヒアルロン酸ナトリウムの含有量を増やすことで、関節の滑液の粘度と潤滑機能を高め、軟骨を保護し、関節の治癒と再生を促進し、痛みを緩和し、関節の可動性を向上させるなどの作用を発揮することができる。文献の報告によると、大量の動物実験と臨床応用によって、産婦人科手術によって引き起こされる付着の予防と軽減の面で、ヒアルロン酸及びそのナトリウム塩が安全で効果的な理想的物質であることが示されている。その中で、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液は非ニュートン流体であり、粘弾性とレオロジー性が良好である。一般的には、低濃度のヒアルロン酸溶液は主に粘性を示し、高濃度のヒアルロン酸溶液は主に弾性を示すため、実際の必要に応じてその濃度を調整することができる。
天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩は、適用分野が広く、様々な明確な適用の利点があるが、天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩は明確な欠点もある。まず、天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩は、体内での半減期が短く、生体内での分解時間が一般的に7日以内である。半減期が短い主な理由は、天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩の平均分子量が小さく、且つ流動性が良く、組織内に分散しやすく、吸収・代謝されやすいためであり、溶液状態では低粘度であると直接現れる。次に、天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩には、安定性が低く、分解しやすいという欠点がある。第三、天然ヒアルロン酸又はそのナトリウム塩には、親水性が高すぎるという欠点がある。
他の天然高分子化合物も、ヒアルロン酸と類似する問題がある。天然高分子化合物を調製するためのヒドロゲルは、一定の程度で機械的強度が低いなどの問題を解決することができる。従来の研究において、理想的な物理的と機械的特性及び生分解速度を備える天然高分子化合物のヒドロゲルを得るために、化学架橋の方法はヒドロゲルの調製プロセスに広く適用されている。化学架橋反応において、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基など化学活性の高い官能基がよく適用されている。よく使用される化学架橋剤は一般的に、ジアミン、ジヒドラジン、ジアルデヒド、ジオールなどの二官能基を含むが、これらの架橋剤は通常、細胞毒性を有するため、残留した場合、ヒドロゲル材料の生体適合性に影響を与える。架橋反応における追加の化学物質の添加により引き起こされる細胞毒性を回避するために、新規な化学架橋高分子ヒドロゲルを研究する必要がある。同時に、現代医学では、低侵襲治療効果を達成するために、生体材料は使用時に一定の可塑性と制御性を備える必要がある。ヒアルロン酸を例にとると、従来技術において、ヒアルロン酸を主原料として調製されたヒドロゲルは、以下の明らかな欠点又は技術的偏見がある。一、エポキシ基を含む低分子架橋はヒアルロン酸の架橋反応に適用され、有毒なエポキシ低分子架橋剤が架橋ヒアルロン酸に残留されるため、このような架橋ヒアルロン酸がヒドロゲルに調製された後、有害反応又は毒性作用が必然的に発生し、ヒアルロン酸のヒドロゲルの応用が制限されている。二、架橋反応により化学的変性後のヒアルロン酸から架橋ヒアルロン酸が得られ、それにより調製されたヒドロゲルは高価であり、かつ構造の修飾・変換されていないヒアルロン酸から架橋により調製されたヒドロゲルに比べて、粘度、保水性、造形効果などにおいて改善があるが、格段の改善がない。三、従来技術において、架橋反応によりヒアルロン酸から架橋ヒアルロン酸を生成する反応は、特定の反応条件を必要とするか又は反応条件が過酷であり、生理学的状態下でイン・サイチュ架橋を達成することができず、事前架橋と事前充填の形のみで製品を実現することができ、製品の適用範囲及び対応する治療対象又は美容対象のコンプライアンスに大きな影響を与えている。
近年、スルフヒドリル変性高分子化合物は、架橋によりヒドロゲルを形成しやすく、抗酸化できるなどの特徴を有するため、研究者の注目を集めている。従来の生体適合性高分子のスルフヒドリル化変性プロセスは、一般的に、遊離スルフヒドリル基を導入する化学的変性プロセスを指す。通常、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基のような多糖類、タンパク質及び合成高分子の側鎖基は、適切な化学反応により遊離スルフヒドリル基を導入することができる。依然としてヒアルロン酸を例にとると、従来技術において、化学反応によりヒアルロン酸に遊離スルフヒドリル基を導入した後に得られたスルフヒドリル化ヒアルロン酸の特徴をまとめると、天然ヒアルロン酸に比べて、物理的及び化学的特性又は生体適合性などにおいてある程度の改善や向上があるが、以下の欠点を克服するには十分ではない。1、自己架橋又は他の物質との架橋の反応速度が遅く、通常、架橋反応を加速するために低分子酸化剤を添加する必要がある。2、スルフヒドリル変性後の新しいヒアルロン酸化合物は、架橋によりヒドロゲルを形成した後、その物理的及び化学的特性と生体適合性などの肝心な指標は、既存の市販品又は製品に比べて、実質的な優位性又は区別するための十分な技術的特徴を備えておらず、主に、粘度、代謝持続性及び造形効果に反映されている。3、スルフヒドリル化ヒアルロン酸、従来技術における合成調製方法は、いずれも高毒性又は高コストの欠点がある。上記の理由は、既存のスルフヒドリル化ヒアルロン酸の合成調製技術の工業生産・調製及びより広い応用に影響を与える根本的な原因である。また、従来技術において、架橋反応によりスルフヒドリル化ヒアルロン酸から調製されたヒドロゲルは、以下の欠点又は技術的偏見がある。1、従来技術において、架橋反応により化学的変性後のヒアルロン酸から架橋ヒアルロン酸が得られ、それにより調製されたヒドロゲルは、架橋により天然ヒアルロン酸から調製されたヒドロゲルに比べて、より高価である。2、従来技術において、架橋反応により化学的変性後のヒアルロン酸から架橋ヒアルロン酸が得られ、それにより調製されたヒドロゲルは、架橋により天然ヒアルロン酸から調製されたヒドロゲルに比べて、粘度、保水性、造形効果などにおいて改善があるが、格段の改善がない。3、従来技術において、ヒアルロン酸の化学的変性がある程度制御不能である。この制御不能性は、その架橋ヒアルロン酸の品質に影響を与え、更に対応するヒドロゲルの品質が大きな範囲で変動してしまい、異なるバッチ間でのヒドロゲル製品の治療作用又は美容や形成作用の一貫性を実現することができず、ヒドロゲルが適応分野でより大きな役割を発揮できなくなることにも繋がる。
〔発明の概要〕
上記問題を解決するために、本発明の目的は、新規構造のスルフヒドリル変性高分子化合物と、アクリロイル化高分子化合物、アクリロイル基を含む低分子架橋剤の少なくとも1種とのゲル化によって生成された新規構造を有するヒドロゲルを提供することである。具体的には、本発明は、新規構造のスルフヒドリル変性高分子化合物を採用し、それをアクリロイル化高分子化合物及び/又はアクリロイル基を含む低分子架橋剤と組み合わせてヒドロゲルを形成する。前記スルフヒドリル変性高分子化合物は、生理学的条件下で前記アクリロイル化高分子化合物及び/又はアクリロイル基を含む低分子架橋剤と架橋してヒドロゲルを形成することができる。また、形成されたヒドロゲルの造形効果及び代謝耐性・分解耐性に関連する物理的性質、化学的性質も従来技術に比べて明らかな優位性を有する。具体的には、その代謝耐性・分解耐性は従来技術のヒドロゲルより明らかに優れ、更に、スルフヒドリル-ビニル架橋反応が迅速であるという特性により、前記2つの化合物によって形成されたヒドロゲルシステムは、体内に注射された後、迅速にイン・サイチュゲル化することができる。これに基づいて、本発明のヒドロゲルは、生物医学、医療美容と形成外科及び化粧品などの分野への適用に一層有利である。
本発明のもう1つの目的は、上記ヒドロゲルの調製方法を提供することである。当該方法は、以下の利点を有する:架橋反応は、毒性の高いエポキシ系低分子架橋剤及び触媒の添加を必要とせず、精製プロセスにおける毒性物質の残留の可能性を根本的に回避し、光や加熱などの触媒条件を必要とせず、架橋反応の程度が制御可能であり、架橋反応のコストが適切であり、かつ従来技術より優れている。
本発明の第1態様は、ヒドロゲルを提供する。当該ヒドロゲルの化学構造は新規があり、スルフヒドリル変性高分子化合物を含むシステムのゲル化によって調製して得られ、
前記スルフヒドリル変性高分子化合物は、下記シリーズ化合物であるシリーズスルフヒドリル変性高分子化合物のうちの少なくとも1種であり、
前記シリーズスルフヒドリル変性高分子化合物は、その変性された高分子化合物の構造に-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含み、
Figure 2023503896000002
前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OH及び/又はアクリレート基及び/又はアクリルアミド基及び/又はアクリロイル基の一部又は全ては、末端基が下記基である側鎖を形成するように修飾され、
Figure 2023503896000003
上記基において、*は結合点を表し、R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、R2とR3は、相同又は相異であり、互いに独立して水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、R4は、ポリスルフヒドリル化合物断片であり、
前記システムには、更に、
C1.アクリロイル化高分子化合物、
C2.アクリロイル基を含む低分子架橋剤、の少なくとも1種を含む。
本発明の第2態様は、上記ヒドロゲルの調製方法を提供する。
この調製方法は、
（i）前記スルフヒドリル変性高分子化合物、及び
（ii）物質C1と物質C2の少なくとも1種
を含むシステムをゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製するステップを含む。
本発明の第3態様は、生物医学、医療美容と形成外科、及び化粧品などの分野に適用される上記ヒドロゲルの用途を提供する。
〔本発明の有益な効果〕
本発明は、新規構造を有するスルフヒドリル化変性高分子化合物を原料として、架橋反応により得られた新規構造を有するヒドロゲルを提供し、かつ当該ヒドロゲルは従来技術におけるヒドロゲル（例えば、従来技術においてヒアルロン酸又は変性ヒアルロン酸を出発原料として、かつ架橋反応により得られたヒドロゲル）に比べると、物理的及び化学的性質、造形効果及び代謝耐性・分解耐性などの面において、予想外の技術的優位性を有する。
本発明のヒドロゲルは、以下の利点を有する。1、高分子化合物に対する化合物構造の修飾と変換プロセス、及び、その後の架橋反応プロセスのいずれにおいても、有毒なエポキシ系低分子架橋剤が使用されず、当該ヒドロゲル製品はより安全であるという利点を有する。2、本発明のヒドロゲル製品は、従来技術におけるヒドロゲル（例えば、既存の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル）に比べると、粘度、保水性、造形効果などにより優れるという技術的優位性を有する。3、本発明のヒドロゲルは、任意の触媒も添加することなく、架橋反応を実現することができ、反応条件がより実現しやすく、従来技術における高分子化合物の架橋反応条件より優れ、従来技術における変性高分子化合物の架橋条件よりも優れる。4、初めて、真の意味で生理学的条件下でのイン・サイチュ架橋を実現し、架橋反応の終点が制御可能であり、その制御可能性が、体外での架橋反応に反映されるだけでなく、動物又はヒトの体内での架橋反応にも反映される。大量の動物試験により、動物の体内又は体外に関係なく、当該架橋反応の反応終点が単一で、かつ安定し、再現可能であることが証明されている。5、実験と研究により、本発明のシリーズヒドロゲルは、室温と加速安定性試験の条件下で、安定性により優れ、分解に耐え、動物の体内でより優れた代謝耐性を有するなどが示されている。
本発明は、真の意味で生理学的条件下でのイン・サイチュ架橋を実現し、即ち、室温と常圧の条件下で、架橋反応を完了させることができ、又は、動物又はヒトの組織に注射された後、依然として組織内で架橋反応を実現することができる。このように、ヒドロゲル製品の分解耐性・代謝耐性を明らかに向上させ、ヒドロゲル注射剤製品の使用効果を明らかに向上させる。更に、本発明の独自の技術により、体外での架橋又は混合段階の前に動物又はヒトに注入されたヒドロゲル製品の架橋度の制御可能性を実現することができ、即ち、動物又はヒトに注入された後に架橋反応の終点を制御できる架橋反応を実現することができ、製品自体の安全性と治療作用が保証される。
本発明は、前記ヒドロゲルの調製方法を更に提供する。当該方法は、室温と常圧下で反応を完了させることができ、当該反応条件は穏やかで、かつ実現しやすく、生理学的条件下でのイン・サイチュ架橋ヒドロゲルの調製を実現する技術的基礎である。
〔図面の簡単な説明〕
〔図1〕調製例5の反応方程式である。
〔図2〕調製例6の反応方程式である。
〔図3〕調製例7の反応方程式である。
〔図4〕調製例8の反応方程式である。
〔図5〕調製例15の反応方程式である。
〔図6〕調製例16の反応方程式である。
〔図7〕調製例17の反応方程式である。
〔図8〕調製例18の反応方程式である。
〔図9〕調製例19の反応方程式である。
〔図10〕調製例20の反応方程式である。
〔図11〕ヒドロゲルサンプルの細胞生体適合性実験である。
〔図12〕ヒドロゲルサンプルの体内造形と支持効果（高さ）である。
〔図13〕ヒドロゲルサンプルの体内造形と支持効果（底面積）である。
〔図14〕ヒドロゲルサンプルの体内分解実験である。
〔図15〕HA-A1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図16〕HA-A2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図17〕HA-MA1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図18〕HA-MA2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図19〕CHS-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図20〕CHS-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図21〕Gelatin-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図22〕Gelatin-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図23〕CTS-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図24〕CTS-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図25〕HA-A1-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図26〕HA-A2-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図27〕HA-MA1-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図28〕HA-MA2-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図29〕CHS-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図30〕CHS-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図31〕Gelatin-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図32〕Gelatin-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図33〕CTS-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図34〕CTS-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図35〕PHEMA-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図36〕PHEMA-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図37〕PVA-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図38〕PVA-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図39〕PHEMA-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図40〕PHEMA-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図41〕PVA-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図42〕PVA-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図43〕HB-PEG-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図44〕HA-A1-SH2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図45〕HA-A1-SH3の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図46〕HA-A2-SH2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図47〕HA-A2-SH3の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図48〕HA-A2-SH4の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図49〕HA-A2-SH5の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図50〕HA-A2-SH6の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図51〕HA-A2-SH7の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図52〕HA-A2-SH8の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図53〕HA-MA1-SH5の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図54〕HA-MA1-SH6の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図55〕HA-MA2-SH7の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図56〕HA-MA2-SH8の構造式とその1H-NMRスペクトルである。
〔図57〕調製例25の反応方程式である。
〔図58〕調製例26の反応方程式である。
〔図59〕調製例27の反応方程式である。
〔図60〕調製例28の反応方程式である。
〔図61〕調製例29の反応方程式である（そのうち、i=10～90%、j=10～90%、i2+i3=i、j2+j3=j、h=j、i+j=100%、k1=1～1000）。
〔図62〕調製例30の反応方程式である。
〔図63〕調製例31の反応方程式である。
〔図64〕調製例32の反応方程式である。
〔図65〕調製例33の反応方程式である。
〔図66〕調製例34の反応方程式である。
〔図67〕調製例35の反応方程式である。
〔図68〕調製例36の反応方程式である。
〔図69〕調製例37の反応方程式である。
〔図70〕調製例38の反応方程式である。
〔図71〕調製例39の反応方程式である。
〔図72〕調製例40の反応方程式である。
〔図73〕調製例41の反応方程式である。
〔図74〕調製例42の反応方程式である。
〔発明を実施するための形態〕
［スルフヒドリル変性高分子化合物］
前述したように、本発明のゲル化されるシステムにおいて、以下に示すシリーズ化合物であるシリーズスルフヒドリル変性高分子化合物のうちの少なくとも1種を使用する必要がある：
前記シリーズスルフヒドリル変性高分子化合物は、変性された高分子化合物の構造に-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含み、
Figure 2023503896000004
そのうち、前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OH及び/又はアクリレート基及び/又はアクリルアミド基及び/又はアクリロイル基の一部又は全ては、末端基が下記基である側鎖を形成するように修飾され、
Figure 2023503896000005
上記基において、*は結合点を表し、
R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、具体的には、前記ハロゲン、脂肪族基、芳香族基は後述の更なる定義を満たし、好ましくは、R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基から選ばれ、また好ましくは、R1は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基など）から選ばれ、
R2とR3は、相同又は相異であり、互いに独立して水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、具体的には、前記ハロゲン、脂肪族基、芳香族基は後述の更なる定義を満たし、
R4は、ポリスルフヒドリル化合物断片である。
具体的な一実施形態において、前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OH及び/又はアクリレート基及び/又はアクリルアミド基及び/又はアクリロイル基の一部又は全ては、以下の構造の少なくとも1種を形成するように修飾され、
Figure 2023503896000006
上記構造において、Rは、
Figure 2023503896000007
ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれ、*は結合点を表し、1*は、Rの左側の基との結合点を表し、2*は、Rの右側の基との結合点を表し、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じである。
そのうち、前記-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種は、高分子化合物の主鎖に直接結合されてもよく、R’基により高分子化合物の主鎖に結合されてもよく、前記R’は、ヘテロ原子を含む基、ヒドロカルビレン基、アリレン基又は下記結合基であってもよく、
Figure 2023503896000008
上記式において、R”はヒドロカルビレン基又はアリレン基であり、n’は1～1000の整数であり、*は結合点を表す。
そのうち、前記ヘテロ原子を含む基は、エステル基、アミド残基又はヒドラジド残基を含むが、これらに限定されない。具体的には、前記エステル基、アミド残基又はヒドラジド残基は後述の更なる定義を満たす。
そのうち、前記変性された高分子化合物は、キトサン系（具体的には、キトサン、グリコールキトサン、カルボキシメチルキトサンなどであってよい）、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びアルギン酸塩などのうちの少なくとも1種である天然ムコ多糖ポリマー；ゼラチン、フィブリン及び血清タンパク質などのタンパク質；及び/又は、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート（例えば、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなど）及び超分岐ポリエチレングリコールなどのうちの少なくとも1種である合成ポリマーを含む。
そのうち、Ellman法により検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量は0.01～30 mmol/gであり、例えば0.1～10.0 mmol/g、また例えば0.3～5.0 mmol/g、更に例えば0.5～3.0 mmol/gである。
そのうち、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の分子量は、基本的に、変性前の高分子化合物の分子量と変わらない。
例えば、本発明のスルフヒドリル変性高分子化合物は、以下の構造の少なくとも1種を含み、
Figure 2023503896000009
Figure 2023503896000010
Figure 2023503896000011
上記構造において、Aは、前記構造に-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基の少なくとも1つを含む変性された高分子化合物の断片であり、R、R’、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、（n2+n3）/（n1+n2+n3）はアクリロイル化度を表し、n3/（n1+n2+n3）はスルフヒドリル化度を表し、上記のEllman法により検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する；前記n1は0であってもよいが、0の場合、アクリロイル化度を限定する必要がなく、n3/（n2+n3）のみがスルフヒドリル化度を表し、上記のEllman法により検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する；前記n2は0であってもよいが、0の場合、n3/（n1+n3）はアクリロイル化度を表すと共に、スルフヒドリル化度を表し、上記のEllmanにより検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する。
具体的には、前記Aは以下に示される構造であってもよい：
Figure 2023503896000012
上記各構造において、*は主鎖繰り返し単位の間の結合点を表し、**は-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基と上記断片との間の結合点、又は、R’基による上記断片との間の結合点を表す。
前記Aは、下記Gelatin-A、Gelatin-MA、CTS-A、CTS-MA、PHEMA-A、PHEMA-MA、HB-PEG、PVA-A、PVA-MA、CHS-A又はCHS-MAポリマーにおける、アクリロイル含有側鎖を除去した後の残りの断片又は繰り返し単位であってもよい：
Figure 2023503896000013
説明すべきであることは、Gelatin-A、Gelatin-MA、CTS-A、CTS-MA、PHEMA-A、PHEMA-MA、HB-PEG、PVA-A、PVA-MA、CHS-A又はCHS-MAはそれぞれ上記構造を有するポリマー名称の略語であり、その中のアルファベットは別々に分けられた後に本発明の他の部分に現れるアルファベットの意味と関係がない。
本発明において、特に明記しない限り、n、n’、n1、n2、n3、n4、n5、n6、m1、m2、i、j、k1、hはいずれも構造式における繰り返し単位の数である。その値の範囲は当分野で知られている通常の範囲に属する。
本発明の具体的な一実施形態において、前記シリーズスルフヒドリル変性高分子化合物は、具体的には、下記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸シリーズ化合物である：
スルフヒドリル変性ヒアルロン酸シリーズ化合物において、前記ヒアルロン酸の繰り返し単位の側鎖に含まれる-COOH及び/又は-OHの一部又は全ては、末端基が下記基である側鎖を形成するように修飾され、
Figure 2023503896000014
上記基において、*は結合点を表し、
R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、具体的には、前記ハロゲン、脂肪族基、芳香族基は後述の更なる定義を満たし、好ましくは、R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基から選ばれ、また好ましくは、R1は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル基（例えば、メチル基、エチル基など）から選ばれ、
R2とR3は、相同又は相異であり、互いに独立して水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、具体的には、前記ハロゲン、脂肪族基、芳香族基は後述の更なる定義を満たし、
R4は、ポリスルフヒドリル化合物断片である。
具体的な一実施形態において、前記末端基は、R基により-COOH及び/又は-OHに結合され、又は、-COOH及び/又は-OHに直接結合されて以下の構造の少なくとも1種である側鎖が形成され、
Figure 2023503896000015
上記a構造、b構造、c構造及びd構造において、Rは、
Figure 2023503896000016
ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれ、*は結合点を表し、1*は、Rの左側の基との結合点を表し、2*は、Rの右側の基との結合点を表し、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じである。
そのうち、前記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸の分子量は、5,000～20,000,000ダルトンの範囲である。前記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸の分子量は、変性前と変性後に明らかな変化がなく、又は、分子量はほとんど変化しない。
そのうち、Ellman法により検出された前記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸のスルフヒドリル基の含有量は0.01～30 mmol/gであり、例えば0.1～10.0 mmol/g、また例えば0.3～5.0 mmol/g、更に例えば0.5～3.0 mmol/gである。
例えば、本発明のスルフヒドリル変性ヒアルロン酸は、以下の構造の少なくとも1種を含み、
Figure 2023503896000017
上記構造において、R、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、（n2+n3）/（n1+n2+n3）はアクリロイル化度を表し、n3/（n1+n2+n3）はスルフヒドリル化度を表し、上記のEllman法により検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する；前記n1は0であってもよいが、0の場合、アクリロイル化度を限定する必要がなく、n3/（n2+n3）のみがスルフヒドリル化度を表し、上記のEllman法により検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する；前記n2は0であってもよいが、0の場合、n3/（n1+n3）はアクリロイル化度を表すと共に、スルフヒドリル化度を表し、上記のEllmanにより検出された前記スルフヒドリル変性高分子化合物のスルフヒドリル基の含有量に対応する；
前記A1は以下のとおりであり、
Figure 2023503896000018
前記A2は以下の構造のうちの1種であり、
Figure 2023503896000019
A1とA2構造における*は、COOH又はOHへの結合点を表す。
具体的には、前記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸は、下記構造のうちの少なくとも1種を有するが、下記構造に限定されない：
Figure 2023503896000020
Figure 2023503896000021
Figure 2023503896000022
Figure 2023503896000023
Figure 2023503896000024
Figure 2023503896000025
Figure 2023503896000026
Figure 2023503896000027
上記構造式において、n1、n2及びn3の定義は上記と同じである。
前述したように、R4は、ポリスルフヒドリル化合物断片であり、例えば、前記-S-R4-SH断片は、下記ポリスルフヒドリル化合物により導入することができるが、これらに限定されず、
Figure 2023503896000028
そのうち、n4=2～30の整数、例えばn=2、3、4、5又は6などであり、n5=1～30の整数、例えば1、2、3、4、5などであり、n6=1～30の整数、例えば1、2、3、4、5などであり、
4-arm-PEG-SHは4つのスルフヒドリル基を含むPEGポリマーを表し、6-arm-PEG-SHは6つのスルフヒドリル基を含むPEGポリマーを表し、8-arm-PEG-SHは8つのスルフヒドリル基を含むPEGポリマーを表し、前記PEGはポリエチレングリコールの略語である。
［用語及び定義］
前述したように、R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、R2とR3は、相同又は相異であり、互いに独立して水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれる。
前述したように、前記Rは、ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれてもよい。
前述したように、前記R’は、ヘテロ原子を含む基、ヒドロカルビレン基、アリレン基などから選ばれてもよい。
前述したように、前記R”は、ヒドロカルビレン基、アリレン基などから選ばれてもよい。
前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
前記脂肪族基は、例えば直鎖又は分岐鎖飽和/不飽和脂肪族基であり、具体的にはアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であってもよい。
本発明において、単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「ヒドロカルビル基」は、例えば直鎖又は分岐鎖飽和/不飽和脂肪族基であり、具体的にはアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であってもよい。
本発明において、単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「アルキル基」は、1～20個、好ましくは1～6個の炭素原子を有する分岐鎖と直鎖飽和脂肪族ヒドロカルビル基を含むことを意図する。例えば、「C1-6アルキル基」は、1、2、3、4、5又は6個の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖アルキル基を表す。アルキル基の例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基を含むが、これらに限定されない。
本発明において、単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「アルケニル基」は、2～20個、好ましくは2～6個の炭素原子（炭素原子の具体的な数が提供された場合、その具体的な数を指す）を有するアルケニル基又はアルケン含有の分岐鎖と直鎖脂肪族ヒドロカルビル基を含むことを意図する。例えば、「C2-6アルケニル基」は、2、3、4、5又は6個の炭素原子を有するアルケニル基を表す。アルケニル基の例は、ビニル基、アリル基、1-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基、2-メチルブト-2-エニル基、3-メチルブト-1-エニル基、1-ペンテニル基、3-ペンテニル基及び4-ヘキセニル基を含むが、これらに限定されない。
本発明において、単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「アルキニル基」は、2～20個、好ましくは2～6個の炭素原子（炭素原子の具体的な数が提供された場合、その具体的な数を指す）を有するアルキニル基又はアルキン含有の分岐鎖と直鎖脂肪族ヒドロカルビル基を含むことを意図する。例えば、エチニル基、プロピニル基（例えば1-プロピニル基、2-プロピニル基）、3-ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基及び1-メチルペント-2-イニルである。
前記芳香族基は、5～20個の炭素原子からなる芳香環構造を指す。例えば、5、6、7及び8個の炭素原子を含む芳香環構造は、フェニル基などの単環式芳香族基であってもよく、8、9、10、11、12、13又は14個の炭素原子を含む環構造は、ナフチル基などの多環式であってもよい。芳香環は、1つ又は複数の環位置において置換基で置換することができ、前記置換基は、トリル基などのアルキル基、ハロゲンなどである。「アリール基」という用語は、また、2つ以上の炭素が2つの隣接する環によって共有される2つ以上の環を有する多環式環系を含み（前記環は「縮合環」である）、そのうち、少なくとも1つの環は芳香族であり、他の環は例えば、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、アリール基及び/又は複素環基であってもよい。多環の例は、2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキサン及び2,3-ジヒドロ-1-ベンゾフランを含むが、これらに限定されない。
本発明に記載の「ヒドロカルビレン基」は、上記「ヒドロカルビル基」から1つの水素を除去した後の基である。
本発明に記載の「アリレン基」は、上記「アリール基」から1つの水素を除去した後の基である。
本発明に記載の「アルキレン基」は、上記「アルキル基」から1つの水素を除去した後の基である。
本発明に記載の単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「アミド基」はRa-C（=O）-NH-基を指し、そのうち、Raは、非置換又は任意選択的に1つ又は複数のRbで置換されたアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基などから選ばれ、Rbは、非置換又は任意選択的に1つ又は複数のRb1で置換されたハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ニトロ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、複素環基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、カルボキシル基、エステル基、ヒドラジノ基、アシル基、スルフィニル基、スルホニル基及びホスホリル基などから選ばれ、各々のRb1は、互いに独立してハロゲン、ヒドロキシル基、アルキル基及びアリール基から選ばれる。
本発明に記載の単独で、或いは、サフィックス又はプレフィックスとして使用される「ヒドラジド基」はRa-C（=O）-NH-NH-基を指し、そのうち、Raの定義は上記と同じである。
本発明に記載の「アミド残基」は、上記「アミド基」から1つの水素を除去した後の基である。
本発明に記載の「ヒドラジド残基」は、上記「ヒドラジド基」から1つの水素を除去した後の基である。
本発明で使用される「シクロアルキル基」という用語は、特定の数の炭素原子を有する飽和環基を含むことを意図する。これらの用語は、縮合又は架橋の多環式環系を含み得る。シクロアルキル基は、その環構造に3～40個の炭素原子を有する。一実施形態において、シクロアルキル基は、その環構造に3、4、5又は6個の炭素原子を有する。例えば、「C3-6シクロアルキル基」は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基などの基を表す。
本発明で使用される「シクロアルケニル基」という用語は、特定の数の炭素原子を有する少なくとも1つのアルケニル基含有の環基を含むことを意図する。これらの用語は、縮合又は架橋の多環式環系を含み得る。シクロアルケニル基は、その環構造に3～40個の炭素原子を有する。一実施形態において、シクロアルケニル基は、その環構造に3、4、5又は6個の炭素原子を有する。例えば、「C3-6シクロアルケニル基」は、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基又はシクロヘキセニル基などの基を表す。
本発明で使用される「シクロアルキニル基」という用語は、特定の数の炭素原子を有する少なくとも1つのアルキニル基含有の環基を含むことを意図する。これらの用語は、縮合又は架橋の多環式環系を含み得る。シクロアルキニル基は、その環構造に6～40個の炭素原子を有する。一実施形態において、シクロアルキニル基は、その環構造に6個の炭素原子を有する。例えば、「C3-6シクロアルキニル基」は、シクロプロピニル基、シクロブチニル基、シクロペンチニル基又はシクロヘキシニル基などの基を表す。
本発明で使用される「ヘテロアリール基」は、少なくとも1つの環ヘテロ原子（例えば、硫黄、酸素又は窒素）を有するヘテロ芳香族複素環を指す。ヘテロアリール基には、単環式環系と多環式環系（例えば2、3又は4個の縮合環を有する）が含まれる。ヘテロアリール基の例は、ピリジル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、フリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、チエニル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、インドリル基、ピロリル基、オキサゾリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ベンゾチアゾリル基、イソキサゾリル基、ピラゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、インダゾリル基、1,2,4-チアジアゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾチエニル基、プリニル基、カルバゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、アザベンゾオキサゾリル基、イミダゾチアゾリル基、ベンゾ［1,4］ジオキシリル基、ベンゾ［1,3］ジオキソリル基などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、3～40個の炭素原子を有し、他の実施形態において、3～20個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、3～14個、4～14個、3～7個又は5～6個の環形成原子を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、1～4個、1～3個又は1～2個のヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、1個のヘテロ原子を有する。
本発明で使用される「複素環基」という用語は、3～20個の原子を含む飽和、不飽和又は一部飽和の単環式、二環式又は三環式の環を指し、そのうち、1、2、3、4又は5個の環原子は窒素、硫黄、酸素又はリンから選ばれ、特に明記しない限り、炭素又は窒素により結合可能であり、そのうち-CH2-基は任意選択的に-C（O）-で置換される。逆の説明がない限り、環窒素原子又は環硫黄原子は、N-オキシド又はS-オキシドを形成するように任意選択的に酸化され、又は環窒素原子は任意選択的に四級化され、そのうち、環内の-NHは任意選択的にアセチル基、ホルミル基、メチル基又はメチルスルホニル基で置換され、且つ、環は任意選択的に1つ又は複数のハロゲンで置換される。理解すべきであることは、複素環基におけるS原子とO原子の総数が1を超えた場合、これらのヘテロ原子は互いに隣接していない。前記複素環基が二環式又は三環式の環である場合、少なくとも1つの環がヘテロ芳香族ではないという前提で、少なくとも1つの環は任意選択的にヘテロ芳香環又は芳香環であってもよい。前記複素環基が単環式の環である場合、芳香族であってはならない。複素環基の例は、ピペリジニル基、N-アセチルピペリジニル基、N-メチルピペリジニル基、N-ホルミルピペラジニル基、N-メタンスルホニルピペラジニル基、ホモピペラジニル基、ピペラジニル基、アゼチジンアルキル基、オキセタニル基、モルホリニル基、テトラヒドロイソキノリニル基、テトラヒドロキノリニル基、インドリニル基、テトラヒドロピラニル基、ジヒドロ-2H-ピラニル基、テトラヒドロフリル基、テトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロチオピラン-1-オキシド、テトラヒドロチオピラン-1,1-ジオキシド、1H-ピリジン-2-オン及び2,5-ジオキソイミダゾリジニル基を含むが、これらに限定されない。
本発明で使用される「アシル基」という用語は、Ra-C（=O）-基を指し、そのうち、Raの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「スルフィニル基」という用語は、Ra-S（=O）-基を指し、そのうち、Raの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「スルホニル基」という用語は、Ra-S（=O）2-基を指し、そのうち、Raの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「ホスホリル基」という用語は、Rc-P（=O）（Rd）-基を指し、そのうち、RcとRdは、相同又は相異であり、互いに独立して非置換又は任意選択的に1つ又は複数のRbで置換されたアルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アルキニル基、シクロアルキニル基、複素環基、アリール基、ヘテロアリール基などの基から選ばれ、Rbの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「ヒドラジノ基」という用語は、-NHNHRa基を指し、Raの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「アミド基」という用語は、-NHRa基又は-N（Ra）2基を指し、Raの定義は上記と同じである。
本発明で使用される「アミノ基」という用語は、-NH2基を指す。
本発明で使用される「カルボキシル基」という用語は、-COOH基を指す。
本発明で使用される「エステル基」という用語は、Ra-C（=O）-O-基又はRa-O-C（=O）-基を指し、そのうち、Raの定義は上記と同じである。
［スルフヒドリル変性高分子化合物の調製方法］
前述したように、本発明は、上記スルフヒドリル変性高分子化合物の調製方法を提供し、この調製方法は、
1）構造に-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種を含む高分子化合物のアクリロイル化ステップ、即ち、高分子化合物の構造に含まれる-COOH、-NH2、-OHの少なくとも1種を直接又は間接に下記基に結合し、
Figure 2023503896000029
（R1、R2及びR3の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す）
又は、構造に上記式aに示されるアクリレート基、上記式bに示されるアクリルアミド基、上記式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物を直接に反応原料とするステップと、
2）ステップ1）で得られた高分子化合物の少なくとも1種をポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHと反応させ（R4の定義は上記と同じである）、前記スルフヒドリル変性高分子化合物を調製するステップと、を含む。
本発明の具体的な一実施形態において、前記方法は、
1）構造に-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種を含む高分子化合物のアクリロイル化ステップ、即ち、高分子化合物の構造に含まれる-COOH、-NH2、-OHの少なくとも1つを-R-基により下記基に結合するか、又は、直接に下記基に結合し、
Figure 2023503896000030
（R、R1、R2及びR3の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す）
又は、構造に式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物を直接に反応原料とするステップと、
2）ステップ1）で得られた高分子化合物の少なくとも1種をポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHと反応させ（R4の定義は上記と同じである）、前記スルフヒドリル変性高分子化合物を調製するステップと、を含む。
本発明の具体的な一実施形態において、上記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸の調製方法を提供し、この調製方法は、
1）ヒアルロン酸のアクリロイル化ステップ、即ち、ヒアルロン酸の繰り返し単位の側鎖に含まれる-COOH、-OHの少なくとも1種を直接又は間接に下記基に結合するステップと、
Figure 2023503896000031
（R1、R2及びR3の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す）
2）アクリロイル化されたヒアルロン酸をポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHと反応させ（R4の定義は上記と同じである）、前記スルフヒドリル変性ヒアルロン酸を調製するステップと、を含む。
具体的には、前記ステップ1）はヒアルロン酸のアクリロイル化ステップであり、ヒアルロン酸の繰り返し単位の側鎖に含まれる-COOH、-OHの少なくとも1種をR基により前記末端基に結合し、又は、直接に前記末端基に結合して以下の構造の少なくとも1種である側鎖を形成することである：
Figure 2023503896000032
上記a構造、b構造、c構造及びd構造において、R、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す。
ステップ1）において、前記アクリロイル化ステップは、変性される高分子化合物とアクリレート化合物との反応により実現されてもよく、変性される高分子化合物と塩化アクリロイル化合物又は無水アクリル酸化合物との反応により実現されてもよい。
前記アクリレート化合物は、アクリル酸アルキルエステル化合物、アクリル酸アリールエステル化合物、アクリル酸多価アルコールエステル化合物のうちの1種又は複数種であってもよい。
前記アクリル酸多価アルコールエステル化合物における多価アルコールは、例えばトリオールであり、具体的には、グリセリン、ブタントリオール、ペンタトリオールなどであってもよい。
ステップ1）において、前記アクリロイル化ステップは、通常の反応ステップであってもよく、従来の通常の条件で実施すればよい。通常、塩化アクリロイル及びその誘導体又は無水アクリル酸及びその誘導体と-OH、-NH2のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物との反応によって得られる。また、グリシジルアクリレート及びその誘導体と-COOH、-OH、-NH2のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物との反応によって得られてもよい。
ステップ1）において、前記アクリロイル化ステップは、上記以外の方法により式cの構造を含む高分子化合物を合成する、型破りの反応ステップであってもよい。
ステップ2）において、ポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHとの反応は溶媒中で行われる。前記溶媒は例えば水又は有機溶媒であり、更に脱イオン水又はジメチルホルムアミドである。
ステップ2）において、ポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHとの反応は、低温から高温の条件下で行われる。例えば、反応温度は0～80℃であり、更に10～70℃であってもよく、例えば室温下で反応してもよい。
ステップ2）において、ポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHとの反応の反応時間は0.1～100時間である。
ステップ2）において、ポリスルフヒドリル化合物HS-R4-SHとの反応のpH範囲は-1～15である。例えば、反応のpHは6～8であってもよく、また例えば7である。
そのうち、ステップ2）の反応生成物に対する後処理ステップを更に含む。
そのうち、前記後処理ステップは透析法を使用する。具体的には、反応後の溶液を透析バッグ（例えば、分子量カットオフが2 kDa以上の透析バッグ）に入れ、塩酸溶液（例えば、pH=4）で数日間透析し（例えば1～10日、また例えば5日など）、任意選択的に水を数回（例えば、2回以上など）交換し（例えば、水を毎日又は隔日交換）、最後に透析バッグ内の溶液を収集し、乾燥（例えば、凍結乾燥）後に固体又は粘性液体、即ち前記スルフヒドリル変性高分子化合物を得る。
本発明の方法において、ポリスルフヒドリル化合物のスルフヒドリル基とアクリロイル基の炭素-炭素二重結合のマイケル付加反応により前記スルフヒドリル変性高分子化合物を調製することを初めて提案し、この方法はスルフヒドリル化度が高く、スルフヒドリル化反応の条件が穏やかで（室温、水溶液中で行うことができる）、汚染がなく、調製されたスルフヒドリル変性高分子化合物の純度が高く、医療、美容、医学などの分野での更なる使用に特に適する。
［アクリロイル化高分子化合物］
前述したように、本発明のゲル化されるシステムにおいて、物質C1であるアクリロイル化高分子化合物を更に含んでもよく、本発明のアクリロイル化高分子化合物は、
1）構造に-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種を含む高分子化合物のアクリロイル化化合物、即ち、前記高分子化合物の構造に含まれる-COOH、-NH2、-OHの少なくとも1種を直接又は間接に下記基に的に結合して形成されたアクリロイル化化合物、
Figure 2023503896000033
（R1、R2及びR3の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す）
2）構造に式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物、の少なくとも1種から選ばれてもよい。
上記1）の物質において、前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OHの一部又は全ては、以下の構造の少なくとも1種を形成するように修飾され、
Figure 2023503896000034
上記構造において、Rは、
Figure 2023503896000035
ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれ、*は結合点を表し、1*は、Rの左側の基との結合点を表し、2*は、Rの右側の基との結合点を表し、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じである。
上記1）の物質において、前記-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種は、高分子化合物の主鎖に直接結合されてもよく、R’基により高分子化合物の主鎖に結合されてもよく、前記R’は、ヘテロ原子を含む基、ヒドロカルビレン基、アリレン基又は下記結合基であってもよく、
Figure 2023503896000036
上記式において、R”はヒドロカルビレン基又はアリレン基であり、n’は1～1000の整数であり、*は結合点を表す。
そのうち、前記ヘテロ原子を含む基は、エステル基、アミド残基又はヒドラジド残基を含むが、これらに限定されない。具体的には、前記エステル基、アミド残基又はヒドラジド残基は本明細書の更なる定義を満たす。
上記1）の物質において、前記アクリロイル化される高分子化合物は、キトサン系（具体的には、キトサン、グリコールキトサン、カルボキシメチルキトサンなどであってよい）、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びアルギン酸塩などのうちの少なくとも1種である天然ムコ多糖ポリマー；ゼラチン、フィブリン及び血清タンパク質などのタンパク質；及び/又は、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート（例えば、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレートなど）及び超分岐ポリエチレングリコールなどのうちの少なくとも1種である合成ポリマーを含む。
上記1）の物質において、アクリロイル化化合物は以下の構造の少なくとも1種を含み、
Figure 2023503896000037
Figure 2023503896000038
上記構造において、Aは、前記構造に少なくとも1つの-COOH、-NH2、-OHを含むアクリロイル化される化合物の断片であり、R、R’、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、m2/（m1+m2）はアクリロイル化度を表す。
具体的には、前記Aは以下に示される構造であってもよい：
Figure 2023503896000039
 上記各構造において、*は主鎖繰り返し単位の間の結合点を表し、**は-COOH、-NH2、-OHと上記断片との間の結合点、又は、R’基により上記断片との間の結合点を表す。
上記2）の物質は、下記Gelatin-A、Gelatin-MA、CTS-A、CTS-MA、PHEMA-A、PHEMA-MA、HB-PEG、PVA-A、PVA-MA、CHS-A又はCHS-MAポリマーのうちの1種であってもよい：
Figure 2023503896000040
説明すべきであることは、Gelatin-A、Gelatin-MA、CTS-A、CTS-MA、PHEMA-A、PHEMA-MA、HB-PEG、PVA-A、PVA-MA、CHS-A又はCHS-MAはそれぞれ上記構造を有するポリマー名称の略語であり、その中のアルファベットは別々に分けられた後に本発明の他の部分に現れるアルファベットの意味と関係がない。
［低分子架橋剤］
前述したように、本発明のゲル化されるシステムにおいて、物質C2である、アクリロイル基を含む低分子架橋剤を含んでもよい。当該低分子架橋剤は、アクリロイル基を含む低分子化合物又はアクリロイル基を含むオリゴマーを含むが、これらに限定されず、具体的には、エチレングリコールジアクリレートEGDA、ポリエチレングリコールジアクリレートPEGDA、トリメチロールプロパントリアクリレートTMPTA、ペンタエリスリトールトリアクリレートPTA、ペンタエリスリトールテトラアクリレートPTTA、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートDTTAなどから選ばれてもよい。
［ヒドロゲル］
前述したように、本発明はヒドロゲルを提供し、当該ヒドロゲルは、
（i）上記スルフヒドリル変性高分子化合物、及び
（ii）物質C1と物質C2の少なくとも1種
を含むシステムのゲル化により調製して得られる。
本発明の具体的な一実施形態において、ヒドロゲルは、上記スルフヒドリル変性高分子化合物と上記アクリロイル化高分子化合物とのゲル化により調製して得られる。
そのうち、スルフヒドリル変性高分子化合物はアクリロイル化高分子化合物と十分に接触した後に架橋反応が発生し、混合システムの粘度が直ちに増加し、最終的に均一なゲルシステムが形成される。
本発明の具体的な一実施形態において、ヒドロゲルは、上記スルフヒドリル変性高分子化合物と上記低分子架橋剤とのゲル化により調製して得られる。
そのうち、スルフヒドリル変性高分子化合物は低分子架橋剤と十分に接触した後に架橋反応が発生し、混合システムの粘度が直ちに増加し、最終的に均一なゲルシステムが形成される。
本発明の具体的な一実施形態において、ヒドロゲルは、上記スルフヒドリル変性高分子化合物と上記アクリロイル化高分子化合物及び上記低分子架橋剤とのゲル化により調製して得られる。
そのうち、スルフヒドリル変性高分子化合物はアクリロイル化高分子化合物及び上記低分子架橋剤と十分に接触した後に架橋反応が発生し、混合システムの粘度が直ちに増加し、最終的に均一なゲルシステムが形成される。
そのうち、前記ヒドロゲルは、下記特徴的な構造単位を含む：
Figure 2023503896000041
上記単位において、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す。
そのうち、前記スルフヒドリル変性高分子化合物と前記アクリロイル化高分子化合物との用量比（質量部で、合計1部）は、0.01：0.99～0.99：0.01である。例えば、0.1：0.9～0.9：0.1であってもよく、例えば、0.01：0.99、0.1：0.9、0.15：0.85、0.2：0.8、0.3：0.7、0.4：0.6、0.5：0.5、0.6：0.4、0.7：0.3、0.8：0.2、0.85：0.15、0.9：0.1、0.99：0.01又は上記範囲内の任意の比率である。
そのうち、前記スルフヒドリル変性高分子化合物と前記低分子架橋剤との用量比（質量部で、合計1部）は、0.01：0.99～0.99：0.01である。例えば、0.1：0.9～0.9：0.1であってもよく、例えば、0.01：0.99、0.1：0.9、0.15：0.85、0.2：0.8、0.3：0.7、0.4：0.6、0.5：0.5、0.6：0.4、0.7：0.3、0.8：0.2、0.85：0.15、0.9：0.1、0.99：0.01又は上記範囲内の任意の比率である。
そのうち、前記スルフヒドリル変性高分子化合物と前記アクリロイル化高分子化合物及び低分子架橋剤との用量比（質量部で、合計1部）は、0.01：0.99～0.99：0.01である。例えば、0.1：0.9～0.9：0.1であってもよく、例えば、0.01：0.99、0.1：0.9、0.15：0.85、0.2：0.8、0.3：0.7、0.4：0.6、0.5：0.5、0.6：0.4、0.7：0.3、0.8：0.2、0.85：0.15、0.9：0.1、0.99：0.01又は上記範囲内の任意の比率である。そのうち、アクリロイル化高分子化合物と低分子架橋剤は任意の比率で混合されてもよい。
本発明のヒドロゲルは、スルフヒドリル変性高分子化合物のチオール基（-SH）と物質C1及び/又は物質C2の炭素-炭素二重結合がチオール基と炭素-炭素二重結合の加成反応により形成した安定的な架橋材料であり、当該架橋材料（即ち、ヒドロゲル）の機械的特性に優れ、良好な物理的安定性と機械的強度を有する。また、体内での代謝速度が制御可能である。C1とC2の2つの物質が同時にシステムに導入される場合、C2（低分子架橋剤）は、前記スルフヒドリル変性高分子化合物とC1（アクリロイル化高分子化合物）との架橋反応に関与することができ、即ち三者は共同架橋して安定的な架橋材料を形成する。同時に、様々な適用目的を達成するために、物質C1は物理的混合によってゲルシステムに添加されてもよい。前記スルフヒドリル変性高分子化合物は、前記C1（アクリロイル化高分子化合物）及び/又はC2（低分子架橋剤）と組み合わせて相互補完することによって、優れた性質を備えた三次元足場材料が得られ、大部分の組織工学の応用要件を満たすことができる。
本発明の具体的な一実施形態において、前記システムには、他の生体機能材料（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、アルギン酸ナトリウムなど）、薬物、成長因子又は細胞懸濁液などのうちの少なくとも1種を更に添加してもよい。他の生体機能材料の添加により、本発明のヒドロゲルに追加の作用と効果をもたらすことができる。例えば、変性されていないヒアルロン酸の導入により、ヒドロゲルの創傷治癒を促進する作用を高めることができ、コラーゲン又はゼラチンの導入により、ヒドロゲルシステムが生体の軟組織構成により似ているようになり、コンドロイチン硫酸の導入により、ヒドロゲルシステムの軟骨修復を促進する作用を高めることができ、キトサンなどの正に帯電した生体材料の導入により、ヒドロゲルの抗菌作用を高めることができ、アルギン酸ナトリウムの導入により、ヒドロゲルシステムの機械的強度を増加させることができる。
［ヒドロゲルの調製］
前述したように、本発明は、上記ヒドロゲルの調製方法を提供し、
この調製方法は、
（i）前記スルフヒドリル変性高分子化合物、及び
（ii）物質C1と物質C2の少なくとも1種
を含むシステムをゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製するステップを含む。
具体的な一実施形態において、前記方法は、
（a）前記スルフヒドリル変性高分子化合物、
（b）C1.前記アクリロイル化高分子化合物、C2.アクリロイル基を含む低分子架橋剤、の少なくとも1種、
（c）他の生体機能材料、薬物、成長因子及び細胞懸濁液からの任意選択的な少なくとも1種
を含むシステムをゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製するステップを含む。
具体的には、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液、前記アクリロイル化高分子化合物の溶液、前記低分子架橋剤の溶液及び任意選択的な他の生体機能材料、薬物、成長因子又は細胞懸濁液のうちの少なくとも1種の溶液をそれぞれ配合し、混合し、ゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製する。また、前記他の生体機能材料、薬物、成長因子又は細胞懸濁液のうちの少なくとも1種は、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液又は前記アクリロイル化高分子化合物の溶液又は前記低分子架橋剤の溶液に直接添加することによって導入されてもよい。
そのうち、ヒドロゲル調製プロセスにおいて、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液を前記アクリロイル化高分子化合物の溶液及び/又は前記低分子架橋剤の溶液に加えてもよく、前記アクリロイル化高分子化合物の溶液及び/又は前記低分子架橋剤の溶液を前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液に加えてもよい。具体的には、2つの溶液は、通常の注射器で混合されてもよく、二重針注射器で混合されてもよく、他の方法で混合されてもよい。
そのうち、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液の質量体積濃度は0.1%～95%であり、例えば1%～90%であり、また例えば0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%であってもよい。前記溶液に酸、アルカリ又は緩衝溶液を添加することによって、pH=7.4に調節することができる。前記緩衝溶液はリン酸塩緩衝液であってもよい。
そのうち、前記アクリロイル化高分子化合物の溶液の質量体積濃度は0.1%～95%であり、例えば1%～90%であり、また例えば0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%であってもよい。前記溶液に酸、アルカリ又は緩衝溶液を添加することによって、pH=7.4に調節することができる。前記緩衝溶液はリン酸塩緩衝液であってもよい。
そのうち、前記低分子架橋剤の溶液の質量体積濃度は0.1%～95%であり、例えば1%～90%であり、また例えば0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%であってもよい。前記溶液に酸、アルカリ又は緩衝溶液を添加することによって、pH=7.4に調節することができる。前記緩衝溶液はリン酸塩緩衝液であってもよい。
そのうち、2つの溶液は任意の比率で混合されてもよく、例えば等体積で混合されてもよい。
［ヒドロゲルの応用］
ヒドロゲルは親水性ポリマーセグメントを架橋することによって形成された水中で膨潤できる三次元空間グリッドであることが知られている。ゲル化プロセスは、ポリマーセグメントの物理的絡み合い、静電相互作用、共有化学架橋、可逆化学架橋、超分子化学架橋、及び親水性疎水性架橋などを含む様々な反応メカニズムによって実現することができる。近年、ヒドロゲル機能に関する研究の深まりに伴って、ヒドロゲルは、薬物送達システムの調製、軟組織創傷用の修復被覆材、骨修復用の足場材料、眼科手術における支持用の粘弾剤、手術後の組織癒着を防止するための材料、及び3Dバイオプリンティング用の足場材料などの医学分野で広く適用されている。これは、組織工学及び再生医療分野の研究の焦点になっている。
本発明のヒドロゲルは、生物医学、医療美容と形成外科、及び化粧品などの分野に特に適用される。具体的には、薬物送達システムの調製、軟組織創傷用の修復被覆材、骨修復用の足場材料、眼科手術における支持用の粘弾剤、手術後の組織癒着を防止するための材料、及び3Dバイオプリンティング用の足場材料などに適用可能である。
本願のヒドロゲルは、真の意味で生理学的条件下でのイン・サイチュ架橋を実現し、即ち、室温と常圧の条件下で、架橋反応を完了させることができ、又は、動物又はヒトの組織に注射された後、依然として組織内で架橋反応を実現することができる。このように、ヒドロゲル製品の分解耐性・代謝耐性を明らかに向上させ、ヒドロゲル注射剤製品の使用効果を明らかに向上させる。更に、本発明の独自の技術により、体外での架橋又は混合段階の前に動物又はヒトに注入されたヒドロゲル製品の架橋度の制御可能性を実現することができ、即ち、動物又はヒトに注入された後に架橋反応の終点を制御できる架橋反応を実現することができ、製品自体の安全性と治療作用が保証される。
以下、具体的な実施例に合わせて本発明を更に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の請求範囲を制限するものではない。また、本発明により開示された内容を読んだ後、当業者は、本発明に対して様々な変更や修正を行うことができ、これらの同等の形態も本発明により限定された請求範囲に含まれることを理解されたい。
本発明において、前記1H-NMRスペクトルは、Varian 400 MHz核磁気共鳴装置によって測定され、テスト温度は摂氏25度、緩和時間は1秒間、走査回数は8回である。具体的には、8～10 mgの検出対象物を採取し、750 μLの重水に溶解させ、得られたサンプル溶液について1H-NMRスペクトルを測定する。
本発明の貯蔵弾性率は、ヒドロゲルのレオロジー機械的特性に基づいて測定される。具体的には、検出機器はTA-DHR2レオメータであり、検出プローブは20 mmの平行板プローブであり、検出温度：25℃、せん断周波数：1 Hz、せん断ひずみ：1%である。
「GBT 16886.5-2017医療機器生物学的評価+パート5+インビトロ細胞毒性試験」の基準を参照して、本発明の高分子化合物の細胞活性と生体適合性を測定する。具体的には、下記MTT法は代謝活性によって細胞の生存率を測定する検出方法である。黄色の水溶液MTT［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide］は生細胞内で代謝的に還元され、青紫色の不溶性ホルマザンを生成する。生細胞の数は、ホルマザンがアルコールに溶解した後に光度計で測定された色度に関連している。
調製例1 アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A1と略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのヒアルロン酸（華熙福瑞達社から購入され、その重量平均分子量は約300 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド、12 mLのトリエチルアミン、14 mLのグリシジルアクリレートを加える。室温で均一且つ透明になるまで撹拌した後、48時間撹拌し続ける。300 mLのアセトンを加え、大量の白色沈殿物が生成された。遠心分離により得られた沈殿物を100 mLの脱イオン水に溶解させ、無色透明溶液を得る。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に921 mgの白色綿状固体であるHA-A1を得て、収率は92.1%である。
HA-A1の構造式は図15を参照する。図15は模式図に過ぎず、前記ヒアルロン酸の一部の繰り返し単位におけるCOOHがグリシジルアクリレートによりエステル化されたことを表し、即ち、そのうちm2/（m1+m2）はアクリロイル化度を表し、m1+m2=nであり、nは変性されていないヒアルロン酸の繰り返し単位の数である。以下の調製例と実施例における構造式の意味は調製例1と同じであり、繰り返して説明しない。
HA-A1の1H-NMRスペクトルは図15を参照し、6～6.5 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例2 アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2と略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのヒアルロン酸（華熙福瑞達社から購入され、その重量平均分子量は約400 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド、6.3 gの無水アクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。300 mLのアセトンを加え、大量の白色沈殿物が生成された。遠心分離により得られた沈殿物を100 mLの脱イオン水に溶解させ、無色透明溶液を得る。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に789 mgの白色綿状固体であるHA-A2を得て、収率は78.9%である。
HA-A2の構造式は図16を参照する。
HA-A2の1H-NMRスペクトルは図16を参照し、5.8～6.4 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例3 メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA1と略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのヒアルロン酸（華熙福瑞達社から購入され、その重量平均分子量は約400 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド（Sigma）、12 mLのトリエチルアミン（Sigma）、15 mLのグリシジルメタクリレートを加える。室温で均一且つ透明になるまで撹拌した後、48時間撹拌し続ける。300 mLのアセトン（Sigma）を加え、大量の白色沈殿物が生成された。遠心分離により得られた沈殿物を100 mLの脱イオン水に溶解させ、無色溶液を得る。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に859 mgの白色綿状固体であるHA-MA1を得て、収率は85.9%である。
HA-MA1の構造式は図17を参照する。
HA-MA1の1H-NMRスペクトルは図17を参照し、5.8～6.2 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例4 メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA2と略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのヒアルロン酸（華熙福瑞達社から購入され、その重量平均分子量は約400 kDa）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。更に7.7 gの無水メタクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。200 mLのアセトン（Sigma）を加え、大量の白色沈殿物が生成された。遠心分離により得られた沈殿物を100 mLの脱イオン水に溶解させ、無色透明溶液を得る。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に846 mgの白色綿状固体であるHA-MA2を得て、収率は84.6%である。
HA-MA2の構造式は図18を参照する。
HA-MA2の1H-NMRスペクトルは図18を参照し、5.8～6.2 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例5 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A1-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例1の方法により調製された1 gのHA-A1、0.3 gのジチオスレイトール（VWR社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に842 mgの白色綿状固体であるHA-A1-SH1を得て、収率は84.2%である。
HA-A1-SH1の反応方程式は図1に示され、その構造式は図1と図25を参照する。
HA-A1-SH1の1H-NMRスペクトルは図25を参照し、2.3～2.8 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例6 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.3 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に827 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH1を得て、収率は82.7%である。
HA-A2-SH1の反応方程式は図2に示され、その構造式は図2と図26を参照する。
HA-A2-SH1の1H-NMRスペクトルは図26を参照し、2.6～2.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例7 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA1-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例3の方法により調製された1 gのHA-MA1、0.3 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に約854 mgの白色綿状固体を得る。即ち、HA-MA1-SH1を得て、収率は85.4%である。
HA-MA1-SH1の反応方程式は図3に示され、その構造式は図3と図27を参照する。
HA-MA1-SH1の1H-NMRスペクトルは図27を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例8 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA2-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例4の方法により調製された1 gのHA-MA2、0.3 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に約833 mgの白色綿状固体を得る。即ち、HA-MA2-SH1を得て、収率は83.3%である。
HA-MA2-SH1の反応方程式は図4に示され、その構造式は図4と図28を参照する。
HA-MA2-SH1の1H-NMRスペクトルは図28を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例9 アクリレートにより修飾されたコンドロイチン硫酸（CHS-Aと略称）の合成
200 mLのビーカーに1.2 gのコンドロイチン硫酸（その重量平均分子量は約80 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド、5.4 gの無水アクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に781 mgの淡黄色綿状固体であるCHS-Aを得て、収率は65.1%である。
CHS-Aの構造式は図19を参照する。
CHS-Aの1H-NMRスペクトル図19を参照し、6.0～6.5 ppmの間にあるアクリル官能基のNMRピークが確認され、この基がコンドロイチン硫酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例10 メタクリレートにより修飾されたコンドロイチン硫酸（CHS-MAと略称）の合成
200 mLのビーカーに1.2 gのコンドロイチン硫酸（その重量平均分子量は約90 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に6.5 gの無水メタクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に776 mgの淡黄色綿状固体であるCHS-MAを得て、収率は64.7%である。
CHS-MAの構造式は図20を参照する。
CHS-MAの1H-NMRスペクトル図20を参照し、6.0～6.5 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がコンドロイチン硫酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例11 アクリレートにより修飾されたゼラチン（Gelatin-Aと略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのゼラチン（強度は300 Blooms）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に10 gの無水アクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に781 mgの淡黄色綿状固体であるGelatin-Aを得て、収率は78.1%である。
Gelatin-Aの簡略化した構造式は図21を参照する（その中の波線はゼラチンの主鎖を表す）。
Gelatin-Aの1H-NMRスペクトルは図21を参照し、6.0～6.5 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がゼラチンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例12 メタクリレートにより修飾されたゼラチン（Gelatin-MAと略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのゼラチン（強度は300 Blooms）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に10 gの無水メタクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に824 mgの淡黄色綿状固体であるGelatin-MAを得て、収率は82.4%である。
Gelatin-MAの簡略化した構造式は図22を参照する（その中の波線はゼラチンの主鎖を表す）。
Gelatin-MAの1H-NMRスペクトルは図22を参照し、5.7～6.2 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がゼラチンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例13 アクリレートにより修飾されたグリコールキトサン（CTS-Aと略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのグリコールキトサン（その重量平均分子量は約250 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド、8 mLのトリエチルアミン（Sigma）、13 mLのグリシジルアクリレートを加える。室温で均一且つ透明になるまで撹拌した後、48時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に694 mgの淡黄色綿状固体であるCTS-Aを得て、収率は69.4%である。
CTS-Aの構造式は図23を参照する。
CTS-Aの1H-NMRスペクトルは図23を参照し、5.8～6.4 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がグリコールキトサンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例14 メタクリレートにより修飾されたグリコールキトサン（CTS-MAと略称）の合成
200 mLのビーカーに1 gのグリコールキトサン（その重量平均分子量は約200 kDa）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミド、8 mLのトリエチルアミン（Sigma）、13 mLのグリシジルメタクリレートを加える。室温で均一且つ透明になるまで撹拌した後、48時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に726 mgの淡黄色綿状固体であるCTS-MAを得て、収率は72.6%である。
CTS-MAの構造式は図24を参照する。
CTS-MAの1H-NMRスペクトルは図24を参照し、5.7～6.2 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がグリコールキトサンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例15 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたコンドロイチン硫酸（CHS-A-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例9の方法により調製された1 gのCHS-A、0.25 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に629 mgの淡黄色綿状固体であるCHS-A-SH1を得て、収率は62.9%である。
CHS-A-SH1の反応方程式は図5に示され、その構造式は図5と図29を参照する。
CHS-A-SH1の1H-NMRスペクトルは図29を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がコンドロイチン硫酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例16 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたコンドロイチン硫酸（CHS-MA-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例10の方法により調製された1 gのCHS-MA、0.25 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に642 mgの淡黄色綿状固体であるCHS-MA-SH1を得て、収率は64.2%である。
CHS-MA-SH1の反応方程式は図6に示され、その構造式は図6と図30を参照する。
CHS-MA-SH1の1H-NMRスペクトルは図30を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がコンドロイチン硫酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例17 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたゼラチン（Gelatin-A-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例11の方法により調製された1 gのGelatin-A、0.19 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に763 mgの淡黄色綿状固体であるGelatin-A-SH1を得て、収率は76.3%である。
Gelatin-A-SH1の反応方程式は図7に示され、その構造式は図7と図31を参照する。
Gelatin-A-SH1の1H-NMRスペクトルは図31を参照し、2.6～2.8 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例18 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたゼラチン（Gelatin-MA-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例12の方法により調製された1 gのGelatin-MA、0.19 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に787 mgの淡黄色綿状固体であるGelatin-MA-SH1を得て、収率は78.7%である。
Gelatin-MA-SH1の反応方程式は図8に示され、その構造式は図8と図32を参照する。
Gelatin-MA-SH1の1H-NMRスペクトルは図32を参照し、2.6～2.7 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例19 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたグリコールキトサン（CTS-A-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例13の方法により調製された1 gのCTS-A、0.25 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に602 mgの淡黄色綿状固体であるCTS-A-SH1を得て、収率は60.2%である。
CTS-A-SH1の反応方程式は図9に示され、その構造式は図9と図33を参照する。
CTS-A-SH1の1H-NMRスペクトルは図33を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がグリコールキトサンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例20 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたキトサン（CTS-MA-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例14の方法により調製された1 gのCTS-MA、0.25 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に643 mgの白色綿状固体であるCTS-MA-SH1を得て、収率は64.3%である。
CTS-MA-SH1の反応方程式は図10に示され、その構造式は図10と図34を参照する。
CTS-MA-SH1の1H-NMRスペクトルは図34を参照し、2.5～2.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がキトサンの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例21 アクリレートにより修飾されたポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA-Aと略称）の合成
200 mLのビーカーに2 gのポリヒドロキシエチルメタクリレート（Mv=20 kDa、Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に16.5 gの無水アクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ2 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.42 gの白色固体であるPHEMA-Aを得て、収率は71.0%である。
PHEMA-Aの構造式は図35を参照する。
PHEMA-Aの1H-NMRスペクトルは図35を参照し、5.9～6.4 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がポリヒドロキシエチルメタクリレートの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例22 メタクリレートにより修飾されたポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA-MAと略称）の合成
200 mLのビーカーに2 gのポリヒドロキシエチルメタクリレート（Mv=20 kDa、Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に16.8 gの無水メタクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ2 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.48 gの白色固体であるPHEMA-MAを得て、収率は74.0%である。
PHEMA-MAの構造式は図36を参照する。
PHEMA-MAの1H-NMRスペクトルは図36を参照し、5.7～6.3 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がポリヒドロキシエチルメタクリレートの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例23 アクリレートにより修飾されたポリビニルアルコール（PVA-Aと略称）の合成
200 mLのビーカーに2 gのポリビニルアルコール（Mw=61 kDa、Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に13 gの無水アクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.57 gの白色固体であるPVA-Aを得て、収率は78.5%である。
PVA-Aの構造式は図37を参照する。
PVA-Aの1H-NMRスペクトルは図37を参照し、6.0～6.5 ppmの間にあるアクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がポリビニルアルコールの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例24 メタクリレートにより修飾されたポリビニルアルコール（PVA-MAと略称）の合成
200 mLのビーカーに2 gのポリビニルアルコール（Mw=61 kDa、Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、更に13.4 gの無水メタクリル酸を加え、撹拌して溶解させる。1 mol/ＬのNaOHで溶液のpHを8±0.5に維持し、24時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ3.5 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 Lの脱イオン水で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.51 gの白色固体であるPVA-MAを得て、収率は75.5%である。
PVA-MAの構造式は図38を参照する。
PVA-MAの1H-NMRスペクトルは図38を参照し、5.7～6.3 ppmの間にあるメタクリル官能基に属するNMRピークが確認され、この基がポリビニルアルコールの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例25 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA-A-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例21の方法により調製された2 gのPHEMA-A、0.42 gのジチオスレイトール（VWR）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ2 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.67 gの白色固体であるPHEMA-A-SH1を得て、収率は83.5%である。
PHEMA-A-SH1の反応方程式は図57に示され、その構造式は図57と図39を参照する。
PHEMA-A-SH1の1H-NMRスペクトルは図39を参照し、2.6～2.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がポリヒドロキシエチルメタクリレートの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例26 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA-MA-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例22の方法により調製された2 gのPHEMA-MA、0.41 gのジチオスレイトール（VWR）、50 mLの脱イオン水、50 mLのジメチルホルムアミドを加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ2 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に1.62 gの白色固体であるPHEMA-MA-SH1を得て、収率は81%である。
PHEMA-MA-SH1の反応方程式は図58に示され、その構造式は図58と図40を参照する。
PHEMA-MA-SH1の1H-NMRスペクトルは図40を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がポリヒドロキシエチルメタクリレートの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例27 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたポリビニルアルコール（PVA-A-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例23の方法により調製された1 gのPVA-A、100 mLの脱イオン水を加え、PVA-Aが完全に溶解するまで溶液を加熱して撹拌する。次に溶液に0.47 gのジチオスレイトール（VWR）を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に737 mgの白色固体であるPVA-A-SH1を得て、収率は73.7%である。
PVA-A-SH1の反応方程式は図59に示され、その構造式は図59と図41を参照する。
PVA-A-SH1の1H-NMRスペクトルは図41を参照し、2.6～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がポリビニルアルコールの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例28 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたポリビニルアルコール（PVA-MA-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例24の方法により調製された1 gのPVA-MA、100 mLの脱イオン水を加え、PVA-MAが完全に溶解するまで溶液を加熱して撹拌する。次に溶液に0.47 gのジチオスレイトール（VWR）を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に718 mgの白色固体であるPVA-MA-SH1を得て、収率は71.8%である。
PVA-MA-SH1の反応方程式は図60に示され、その構造式は図60と図42を参照する。
PVA-MA-SH1の1H-NMRスペクトルは図42を参照し、2.5～3.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がポリビニルアルコールの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
実施例29 スルフヒドリルにより修飾された超分岐PEGポリマー（HB-PEG-SH1と略称）の合成
200 mLのビーカーに5 gの超分岐PEGであるHB-PEG（Mw=20 kDa、Blafar Ltdから購入）、0.86 gのジチオスレイトール（VWR）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させる。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ2 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に3.84 gの無色粘性液体であるHB-PEG-SH1を得て、収率は76.8%である。
HB-PEG-SH1の反応方程式は図61に示され、その構造式は図61と図43を参照する。
HB-PEG-SH1の1H-NMRスペクトルは図43を参照し、2.5～2.6 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基が超分岐PEGポリマーの構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例30 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A1-SH2と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例1の方法により調製された1 gのHA-A1、0.42 gの1,4-ブタンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に852 mgの白色綿状固体であるHA-A1-SH2を得て、収率は85.2%である。
HA-A1-SH2の反応方程式は図62に示され、その構造式は図62と図44を参照する。
HA-A1-SH2の1H-NMRスペクトルは図44を参照し、1.6～1.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例31 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A1-SH3と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例1の方法により調製された1 gのHA-A1、0.43 gの2-アミノ-1,4-ブタンジチオール塩酸塩（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に843 mgの白色綿状固体であるHA-A1-SH3を得て、収率は84.3%である。
HA-A1-SH3の反応方程式は図63に示され、その構造式は図63と図45を参照する。
HA-A1-SH3の1H-NMRスペクトルは図45を参照し、3.0～3.2 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例32 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH2と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.42 gの1,4-ブタンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に827 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH2を得て、収率は82.7%である。
HA-A2-SH2の反応方程式は図64に示され、その構造式は図64と図46を参照する。
HA-A2-SH2の1H-NMRスペクトルは図46を参照し、1.6～1.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例33 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH3と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.43 gの2-アミノ-1,4-ブタンジチオール塩酸塩（Sigma）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に833 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH3を得て、収率は83.3%である。
HA-A2-SH3の反応方程式は図65に示され、その構造式は図65と図47を参照する。
HA-A2-SH3の1H-NMRスペクトルは図47を参照し、3.0～3.2 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例34 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH4と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.38 gの1,3-プロパンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に814 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH4を得て、収率は81.4%である。
HA-A2-SH4の反応方程式は図66に示され、その構造式は図66と図48を参照する。
HA-A2-SH4の1H-NMRスペクトルは図48を参照し、2.5～2.8 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例35 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH5と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.52 gの1,3-ベンゼンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に836 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH5を得て、収率は83.6%である。
HA-A2-SH5の反応方程式は図67に示され、その構造式は図67と図49を参照する。
HA-A2-SH5の1H-NMRスペクトルは図49を参照し、6.9～7.4 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例36 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH6と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.52 gの1,4-ベンゼンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に831 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH6を得て、収率は83.1%である。
HA-A2-SH6の反応方程式は図68に示され、その構造式は図68と図50を参照する。
HA-A2-SH6の1H-NMRスペクトルは図50を参照し、6.8～7.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例37 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH7と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.96 gのメルカプトポリエチレングリコール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に894 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH7を得て、収率は89.4%である。
HA-A2-SH7の反応方程式は図69に示され、その構造式は図69と図51を参照する。
HA-A2-SH7の1H-NMRスペクトルは図51を参照し、3.6 ppmにあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例38 スルフヒドリル-アクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-A2-SH8と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例2の方法により調製された1 gのHA-A2、0.74 gのトリメチロールプロパン-トリス（3-メルカプトプロピオネート）（Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水及び50 mLのジメチルホルムアミドを加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に785 mgの白色綿状固体であるHA-A2-SH8を得て、収率は78.5%である。
HA-A2-SH8の反応方程式は図70に示され、その構造式は図70と図52を参照する。
HA-A2-SH8の1H-NMRスペクトルは図52を参照し、0.8～1.0 ppm、1.5 ppm、2.6～2.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例39 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA1-SH5と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例3の方法により調製された1 gのHA-MA1、0.50 gの1,3-ベンゼンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に828 mgの白色綿状固体であるHA-MA1-SH5を得て、収率は82.8%である。
HA-MA1-SH5の反応方程式は図71に示され、その構造式は図71と図53を参照する。
HA-MA1-SH5の1H-NMRスペクトルは図53を参照し、6.9～7.4 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例40 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA1-SH6と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例3の方法により調製された1 gのHA-MA1、0.50 gの1,4-ベンゼンジチオール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に833 mgの白色綿状固体であるHA-MA1-SH6を得て、収率は83.3%である。
HA-MA1-SH6の反応方程式は図72に示され、その構造式は図72と図54を参照する。
HA-MA1-SH6の1H-NMRスペクトルは図54を参照し、6.9～7.0 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例41 スルフヒドリル-メタクリレートにより修飾されたヒアルロン酸（HA-MA2-SH7と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例4の方法により調製された1 gのHA-MA2、0.92 gのメルカプトポリエチレングリコール（Sigma社から購入）、100 mLの脱イオン水を加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に876 mgの白色綿状固体であるHA-MA2-SH7を得て、収率は87.6%である。
HA-MA2-SH7の反応方程式は図73に示され、その構造式は図73と図55を参照する。
HA-MA2-SH7の1H-NMRスペクトルは図55を参照し、3.6 ppmにあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
調製例42 スルフヒドリル-メタクリレート2により修飾されたヒアルロン酸（HA-MA2-SH8と略称）の合成
200 mLのビーカーに調製例4の方法により調製された1 gのHA-MA2、0.68 gのトリメチロールプロパン-トリス（3-メルカプトプロピオネート）（Sigma社から購入）、50 mLの脱イオン水及び50 mLのジメチルホルムアミドを加え、室温で撹拌して溶解させ、透明溶液を得る。得られた透明溶液を12時間撹拌し続ける。上記溶液を透析バッグ（分子量カットオフ8 kDa、Spectrumlabs）に入れ、5 LのpH=4の塩酸溶液で5日間透析し、1日2回水を交換する。最後に透析バッグ内の溶液を収集し、凍結乾燥後に825 mgの白色綿状固体であるHA-MA2-SH8を得て、収率は82.5%である。
HA-MA2-SH8の反応方程式は図74に示され、その構造式は図74と図56を参照する。
HA-MA2-SH8の1H-NMRスペクトルは図56を参照し、0.8～1.0 ppm、1.5 ppm、2.6～2.9 ppmの間にあるスルフヒドリル側鎖に属するNMRピークが確認され、スルフヒドリル基がヒアルロン酸の構造に順調にグラフトされたことが証明される。
実施例1 チオール-ビニル架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルの調製
調製例1、2、9、11、13で調製されたいずれか1種のアクリロイル化高分子化合物又はエチレングリコールジアクリレート（EGDA）10 mgを1 mLのリン酸塩緩衝溶液（pH=7.4）に溶解させ、質量体積濃度が1%のシリーズ溶液Aを得る。
調製例5～8、15～20で調製されたいずれか1種のスルフヒドリル変性高分子化合物10 mgを1 mLのリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解させ、質量体積濃度が1%のシリーズ溶液Bを得る。
上記いずれか1種の溶液Aといずれか1種の溶液Bとを等体積で均一に混合し、2つの高分子化合物間の生理学的イン・サイチュ架橋反応が直ちに発生し、溶液の粘度は混合時間の経過につれて徐々に増加し、最終的にヒドロゲルを形成する。
実施例1における各ヒドロゲルは以下の特徴的な構造単位を含む：
Figure 2023503896000042
そのうち、R1、R2及びR3の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す。
各群のヒドロゲルのゲル化時間は表1に示される。
Figure 2023503896000043
実施例2 ヒドロゲルの貯蔵弾性率の検出
実施例1で調製された2 mLのヒドロゲルの混合溶液を円筒型モールドに入れ、室温で24時間架橋した後に取り出して架橋サンプルの貯蔵弾性率を測定し、各群のサンプルについて3回検出する。検出機器はTA-DHR2レオメータであり、検出プローブは20 mmの平行板プローブであり、検出温度：25℃、せん断周波数：1Hzである。テスト結果は表2に示される。
Figure 2023503896000044
実施例3 ヒドロゲルの保水性テスト
本実施例1で調製されたヒドロゲルを、事前に重量が秤量された20 mLのガラス瓶に入れ、質量減算法によりヒドロゲルの質量を得て、m0として記録する。ガラス瓶を37℃のシェーカーに入れ、一定の時間間隔で質量を秤量し、ヒドロゲルのリアルタイムの質量を得て、mtとして記録する。ヒドロゲルの保水能力は、次の式により計算される：
保水率（%）=mt/m0×100%
保水率の結果は表3を参照する。
Figure 2023503896000045
実施例4 ヒドロゲルの体外分解テスト
分解安定性テスト：温度37±0.1℃、相対湿度65%±5%の実験条件下で、実施例1で調製されたヒドロゲルに10 mlのPBS溶液を添加する。初期時点でのヒドロゲルの重量をm0として記録し、分解実験開始後の1、4、8、16週間でヒドロゲルの重量を秤量し、mtとして記録する。ヒドロゲルの分解率は次の式により計算される：
分解率（%）=（m0-mt）/m0×100%
ヒドロゲルの体外分解テストの結果は表4を参照する。
Figure 2023503896000046
実施例5 ヒドロゲルの細胞活性実験
「GBT 16886.5-2017医療機器生物学的評価+パート5+インビトロ細胞毒性試験」の基準を参照して、本発明のHA-SHの細胞活性と生体適合性を測定する。具体的には、以下のMTT法を使用する。MTT法はMTT比色法とも呼ばれ、細胞の生存と増殖の検出方法である。検出原理は、生細胞のミトコンドリアにあるコハク酸デヒドロゲナーゼが外因性MTTを水不溶性の青紫色結晶ホルマザン（Formazan）に還元して細胞内に沈着させることができるが、死んだ細胞にはそのような機能がないことである。ジメチルスルホキシド（DMSO）は細胞内のホルマザンを溶解させることができ、酵素結合免疫測定計により490 nmの波長での光吸収値を測定することで、生細胞の数を間接的に反映することができる。細胞数の特定の範囲内で、MTT結晶形成の量は細胞の数に比例する。具体的な試験プロセスと結果は以下のとおりである。
調製例1で調製されたHA-A1の溶液（濃度10 mg/mL、溶媒はリン酸塩緩衝溶液で、pH=7.4）を溶液Aとし、使用に備える。
調製例5で調製されたHA-A1-SH1の溶液（濃度10 mg/mL、溶媒はリン酸塩緩衝溶液で、pH=7.4）を溶液Bとし、使用に備える。
ダルベッコ改良イーグル培地、10%のウシ胎児血清及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン溶液を使用した細胞培養液を調製する。従来の方法でL929細胞を培養し、細胞がほぼコンフルエントになった後、細胞を消化して細胞懸濁液を得る。
溶液A、溶液B及び細胞懸濁液の3つの成分を均一に混合し、50 μLの体積の細胞/ヒドロゲル複合システムを調製し、細胞の最終濃度は1×106 cell/mLである。このシステムを24ウェル細胞培養プレートに置き、各ウェルに1 mLの細胞培養液を加えて培養し、そのうち、プレートの底にある同じ数の細胞を陰性対照群とする。サンプルは、5%のCO2、37℃、＞90%の湿度条件下で、細胞インキュベータで24時間培養する。MTT法により様々なヒドロゲルサンプルにおける細胞の生存状態を検出し、ヒドロゲル群の細胞活性を陰性対照群の細胞活性と比較する。陰性対照群は100%活性である。培養液を除去し、100 μLのMTTを各試験ウェルに加え、4時間インキュベートし続ける。次に、MTT溶液を廃棄し、各ウェルに200 μLのDMSO溶液を加え、均一に振とうした後、マイクロプレートリーダーで490 nmでの吸光度を測定する。テストの結果は図11を参照する。MTT実験での細胞生存率の結果が70%未満の材料は、潜在的な細胞毒性があると見なされる。結果により、本発明のヒドロゲルにおける細胞生存率はいずれも70%以上であることが示され、材料には明らかな細胞毒性がなく、生体適合性が良好であることが示された。
実施例6 ヒドロゲルの造形と支持効果の動物実験
C57BL/6マウスに麻酔をかけた後、背中の毛を取り除き、従来の方法で消毒し、120 μLの実施例1に記載の方法で調製されたHA-A1とHA-A1-SH1溶液、HA-A2とHA-A2-SH1溶液（濃度がそれぞれ10 mg/mLである）、即ち、それぞれ12 mgの各材料を、1.2 mLのPBS（リン酸塩緩衝生理食塩水）溶液に溶解させ、均一に振とうし、試験用サンプルを得て、使用に備える。注射器で当該試験用サンプルをそれぞれ120 μL吸引し、均一に混合し、得られたヒドロゲル前駆体溶液を24G針によりマウスの背中の皮下部位に注射する。同じ方法で同じ体積の生理食塩水をマウスの背中の皮下に注射する。
注射前、注射直後、4週目、8週目、12週目に隆起部位の写真を取り、ノギスで測定し、詳細に記録する。ヒドロゲルの造形効果は、様々な注射サンプルが動物の体内に注入された後の三次元形態の維持と変化を比較することによって、評価される。注射部位の隆起の高さが高く、底部の面積が小さいほど、造形と支持効果が高いと表明される。結果は図12と図13を参照する。データによって、本発明のヒドロゲルは動物の体内に注入された後に特定の形態を維持可能な支持体を形成し、注射物の形態の安定性がよく維持できることが示された。
実施例7 ヒドロゲルの造形効果の動物実験
C57BL/6マウスに麻酔をかけた後、背中の毛を取り除き、従来の方法で消毒し、120 μLの実施例1に記載の方法で調製されたHA-A1とHA-A1-SH1溶液、HA-A2とHA-A2-SH1溶液（濃度がそれぞれ10 mg/mLである）、即ち、それぞれ12 mgの各材料を、1.2 mLのPBS溶液に溶解させ、均一に振とうし、試験用サンプルを得て、使用に備える。注射器で当該試験用サンプルをそれぞれ120 μL吸引し、均一に混合し、得られたヒドロゲル前駆体溶液を24G針によりマウスの背中の皮下部位に注射する。注射の60分後に1匹のマウスを安楽死させ、マウス皮下でのヒドロゲルのイン・サイチュ形成状況及び形態を観察する。従来の方法で残りの動物を飼育し続け、注射後の4週目、8週目、12週目に注射部位の写真を取り、ゲル体積の変化を観察して記録する。同じ方法で同じ体積の生理食塩水をマウスの背中の皮下に注射する。
ヒドロゲル前駆体混合溶液をマウスの背中の皮下に注射した後、注射部位に円形の隆起が見られた。注射の60分後に、マウスの皮下に形成されたヒドロゲルが透明かつ完全な半球形であることが観察された。結果により、混合前駆体溶液は迅速に架橋反応し、注射後にヒドロゲルがイン・サイチュ形成され、特定の形態が維持されていることが示された。注射の12週後、動物の背中の皮下に依然として明らかな隆起が観察できる。皮膚組織を切り開いてヒドロゲルとその周辺組織の局所的な状態を観察すると、ヒドロゲルの形態が良好であり、周辺組織に炎症、感染、壊死などの異常が見られなかった。ヒドロゲルを取り出した後、観察して秤量し、ヒドロゲルは完全な半球形が維持され、秤量後に重量が僅かに小さくなっただけである（結果は図14を参照）ことが示され、明らかなゲルの断片化や崩壊などが見られなかった。
結果により、本発明のヒドロゲルは分解耐性とゲル安定性の維持における性能に優れていることが示された。
以上、本発明の実施形態について説明した。しかし、本発明は、上記実施形態に限定されない。本発明の精神と原則において行われた修正、等価置換や改良などは、いずれも本発明の請求範囲内に含まれるべきである。
調製例5の反応方程式である。 調製例6の反応方程式である。 調製例7の反応方程式である。 調製例8の反応方程式である。 調製例15の反応方程式である。 調製例16の反応方程式である。 調製例17の反応方程式である。 調製例18の反応方程式である。 調製例19の反応方程式である。 調製例20の反応方程式である。 ヒドロゲルサンプルの細胞生体適合性実験である。 ヒドロゲルサンプルの体内造形と支持効果（高さ）である。 ヒドロゲルサンプルの体内造形と支持効果（底面積）である。 ヒドロゲルサンプルの体内分解実験である。 HA-A1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CHS-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CHS-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 Gelatin-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 Gelatin-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CTS-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CTS-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A1-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA1-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA2-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CHS-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CHS-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 Gelatin-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 Gelatin-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CTS-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 CTS-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PHEMA-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PHEMA-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PVA-Aの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PVA-MAの構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PHEMA-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PHEMA-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PVA-A-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 PVA-MA-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HB-PEG-SH1の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A1-SH2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A1-SH3の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH2の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH3の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH4の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH5の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH6の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH7の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-A2-SH8の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA1-SH5の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA1-SH6の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA2-SH7の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 HA-MA2-SH8の構造式とその1H-NMRスペクトルである。 調製例25の反応方程式である。 調製例26の反応方程式である。 調製例27の反応方程式である。 調製例28の反応方程式である。 調製例29の反応方程式である（そのうち、i=10～90%、j=10～90%、i2+i3=i、j2+j3=j、h=j、i+j=100%、k1=1～1000）。 調製例30の反応方程式である。 調製例31の反応方程式である。 調製例32の反応方程式である。 調製例33の反応方程式である。 調製例34の反応方程式である。 調製例35の反応方程式である。 調製例36の反応方程式である。 調製例37の反応方程式である。 調製例38の反応方程式である。 調製例39の反応方程式である。 調製例40の反応方程式である。 調製例41の反応方程式である。 調製例42の反応方程式である。

Claims (10)

  1. スルフヒドリル変性高分子化合物を含むシステムのゲル化により調製して得られるヒドロゲルであって、
    前記スルフヒドリル変性高分子化合物は、下記シリーズ化合物であるシリーズスルフヒドリル変性高分子化合物のうちの少なくとも1種であり、
    前記シリーズスルフヒドリル変性高分子化合物は、その変性された高分子化合物の構造に-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含み、
    Figure 2023503896000047
    前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OH及び/又はアクリレート基及び/又はアクリルアミド基及び/又はアクリロイル基の一部又は全ては、末端基が下記基である側鎖を形成するように修飾され、
    Figure 2023503896000048
    上記基において、*は結合点を表し、R1は、水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、R2とR3は、相同又は相異であり、互いに独立して水素、ハロゲン、脂肪族基、芳香族基などから選ばれ、R4は、ポリスルフヒドリル化合物断片であり、
    前記システムには、更に、
    C1.アクリロイル化高分子化合物、
    C2.アクリロイル基を含む低分子架橋剤、の少なくとも1種を含む、
    ことを特徴とするヒドロゲル。
  2. 前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OH及び/又はアクリレート基及び/又はアクリルアミド基及び/又はアクリロイル基の一部又は全ては、以下の構造の少なくとも1種を形成するように修飾され、
    Figure 2023503896000049
    上記構造において、Rは、
    Figure 2023503896000050
    ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれ、*は結合点を表し、1*は、Rの左側の基との結合点を表し、2*は、Rの右側の基との結合点を表し、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲル。
  3. 前記-COOH、-NH2、-OH、式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種は、高分子化合物の主鎖に直接結合されてもよく、R’基により高分子化合物の主鎖に結合されてもよく、前記R’は、ヘテロ原子を含む基、ヒドロカルビレン基、アリレン基又は下記結合基であってもよく、
    Figure 2023503896000051
    上記式において、R”はヒドロカルビレン基又はアリレン基であり、n’は1～1000の整数であり、*は結合点を表す、
    ことを特徴とする請求項１又は２に記載のヒドロゲル。
  4. 前記アクリロイル化高分子化合物は、
    1）構造に-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種を含む高分子化合物のアクリロイル化化合物、即ち、前記高分子化合物の構造に含まれる-COOH、-NH2、-OHの少なくとも1種を直接又は間接に下記基に結合して形成されたアクリロイル化化合物、
    Figure 2023503896000052
    （R1、R2及びR3の定義は上記と同じである）
    2）構造に式aに示されるアクリレート基、式bに示されるアクリルアミド基、式cに示されるアクリロイル基のうちの少なくとも1種を含む高分子化合物、の少なくとも1種から選ばれる、
    ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
  5. 上記1）の物質において、前記-COOH及び/又は-NH2及び/又は-OHの一部又は全ては、以下の構造の少なくとも1種を形成するように修飾され、
    Figure 2023503896000053
    上記構造において、Rは、
    Figure 2023503896000054
    ヒドロカルビレン基、アリレン基、アミド残基、ヒドラジド残基などから選ばれ、*は結合点を表し、1*は、Rの左側の基との結合点を表し、2*は、Rの右側の基との結合点を表し、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じである、
    ことを特徴とする請求項４に記載のヒドロゲル。
  6. 上記1）の物質において、前記-COOH、-NH2、-OHのうちの少なくとも1種は、高分子化合物の主鎖に直接結合されてもよく、R’基により高分子化合物の主鎖に結合されてもよく、前記R’は、ヘテロ原子を含む基、ヒドロカルビレン基、アリレン基又は下記結合基であってもよく、
    Figure 2023503896000055
    上記式において、R”はヒドロカルビレン基又はアリレン基であり、n’は1～1000の整数であり、*は結合点を表す、
    ことを特徴とする請求項４又は５に記載のヒドロゲル。
  7. 前記物質C2である、アクリロイル基を含む低分子架橋剤は、アクリロイル基を含む低分子化合物又はアクリロイル基を含むオリゴマーを含むが、これらに限定されず、具体的には、エチレングリコールジアクリレートEGDA、ポリエチレングリコールジアクリレートPEGDA、トリメチロールプロパントリアクリレートTMPTA、ペンタエリスリトールトリアクリレートPTA、ペンタエリスリトールテトラアクリレートPTTA、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレートDTTAなどのうちの1種又は複数種から選ばれる、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
  8. 前記ヒドロゲルは、下記特徴的な構造単位を含み、
    Figure 2023503896000056
    上記単位において、R1、R2、R3及びR4の定義は上記と同じであり、*は結合点を表す、
    ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載のヒドロゲル。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のヒドロゲルの調製方法であって、
    この調製方法は、
    （i）前記スルフヒドリル変性高分子化合物、及び
    （ii）物質C1と物質C2の両方のうちの少なくとも1種
    を含むシステムをゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製するステップを含み、
    好ましくは、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液、前記アクリロイル化高分子化合物の溶液、前記低分子架橋剤の溶液及び任意選択的な他の生体機能材料、薬物、成長因子又は細胞懸濁液のうちの少なくとも1種の溶液をそれぞれ配合し、混合し、ゲル化することにより、前記ヒドロゲルを調製し、
    任意選択的に、前記他の生体機能材料、薬物、成長因子又は細胞懸濁液のうちの少なくとも1種は、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液又は前記アクリロイル化高分子化合物の溶液又は前記低分子架橋剤の溶液に直接添加することによって導入されてもよく、
    好ましくは、ヒドロゲル調製プロセスにおいて、前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液を前記アクリロイル化高分子化合物の溶液及び/又は前記低分子架橋剤の溶液に加えてもよく、前記アクリロイル化高分子化合物の溶液及び/又は前記低分子架橋剤の溶液を前記スルフヒドリル変性高分子化合物の溶液に加えてもよく、具体的には、2つの溶液は、通常の注射器で混合されてもよく、二重針注射器で混合されてもよく、他の方法で混合されてもよい、
    ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載のヒドロゲルの調製方法。
  10. 請求項１～８のいずれか１項に記載のヒドロゲルの用途であって、
    生物医学、医療美容と形成外科、及び化粧品などの分野に適用され、具体的には、薬物送達システムの調製、軟組織創傷用の修復被覆材、骨修復用の足場材料、眼科手術における支持用の粘弾剤、手術後の組織癒着を防止するための材料、及び3Dバイオプリンティング用の足場材料などに適用可能である、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載のヒドロゲルの用途。
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