WO2004050712A1

WO2004050712A1 - 薬物徐放担体

Info

Publication number: WO2004050712A1
Application number: PCT/JP2003/015259
Authority: WO
Inventors: Tsuyoshi Shimoboji; Keiko Motokawa; Teruo Nakamura
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-28
Publication date: 2004-06-17
Also published as: AU2003284484A1; JPWO2004050712A1

Abstract

　本発明の目的は、タンパク質またはペプチドの生物活性を阻害せずに高封入率で封入でき、完全に生分解性で安全なタンパク質またはペプチドの徐放製剤を提供することである。本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド共存下で、ｐＨ６以下の溶液中で架橋、ハイドロゲル化することを特徴とするヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法に関連する。本発明により、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらの効率な当該ゲル内への封入、および徐放が可能となる。

Description

明細書

薬物徐放担体技術分野

本発明は、タンパク質またはペプチドを徐放するヒアルロン酸ハイド口ゲル薬物徐放担体に関する。背景技術

近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が Ήまれている。

薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤は、製剤調製時、あるいは徐放中のタンパク質またはべプチドの変性、凝集による回収率低下が大きな問題である。ポリ乳酸—ポリグリコール酸共重合体 (PLGA) 等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤も試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、 pHの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が認められる（J. Pha rm. Sc i. 第 88巻、第 166— 173頁、 1999年、および：！. Mi c r oenc ap s u 1 a t i on 第 15巻、第 699 _ 713頁、 1998年）。こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが実用化には至っていない。この原因は、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率、および製剤に用いる基材の安全性の全てを実用化レベルで実現することが困難なためである。安全性の面からは、徐放基材として、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つ素材でなければならない。

ヒアルロン酸 (HA) は、 1934年、 K. Mey e rによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細マトリックスの主成分として古くから知られている。ヒアルロン酸は、 D—グルクロン酸と N—ァセチルダルコサミンとが /3 ( 1→3 ) グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドダリカンの一種である（式（I I ) ) 。

ヒアルロン酸は、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料 (B i om a t e r i a 1 ) である。近年、微生物による高分子量ヒアルロン酸の大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。

ヒアルロン酸を基材に用いた架橋方法、ヒアルロン酸ゲルからのタンパク質やぺプチド薬物の徐放も多数報告されている。ヒアルロン酸を化学架橋でゲル化させる方法としては、カルポジイミド法（国際公開第 9 4 Z 0 2 5 1 7号パンフレット）、ジビニルスルフォン法（特開昭 6 1— 1 3 8 6 0 1号公報）、グリシジルエーテル法（特開平 5— 1 4 0 2 0 1号公報）、等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはべプチドを導入する方法では、ヒアルロン酸とタンパク質またはべプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、 i n s i t u架橋を行うと高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうした i n s i t u架橋により、ヒアルロン酸ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入、徐放させることも報告されている（例えば、米国特許第 5 8 2 7 9 3 7号明細書）が、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でヒアルロン酸を i n s i t u架橋すると、封入したタンパク質またはペプチドの回収率が低い点に問題がある。ヒドラジド基（H Z ) を導入したヒアルロン酸誘導体 (HA-H Z ) を N—ハイドロキシスクシンィミド（NH S) からなる架橋剤で架橋する方法（国際公開 9 5 1 5 1 6 8号パンフレット、および国際公開第 0 0 /4 4 8 0 8号パンフレット）が報告されているが、生理条件下での i n s i t u架橋を目的としているため、 p H 7. 4

—8. 5で架橋反応を行っている。本発明者らによる検討では、この方法で得られるヒアルロン酸誘導体ゲルからの、タンパク質またはペプチドの回収率は低い

。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。

またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。

封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であるが、タンパク質またはペプチドを反応させずにヒアルロン酸を化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。

一方、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール（P E G) を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（国際公開第 0 0 /4 4 8 0 8号パンフレツト）、生分解性でない P E G断片が残存する問題がある。発明の開示

上述したとおり、夕ンパク質またはべプチド存在下でその生物活性を維持したまま i n s i t ιιでヒアルロン酸を効率的に化学架橋する方法、高回収率を得られるヒアルロン酸の架橋方法、およびそのような方法により高封入率で製造され、高回収率を得られる、タンパク質またはペプチド徐放製剤は知られていない。本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸 (HA) にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を、ヒドラジド基と反応する官能基が、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して 4

0モル％以下の架橋剤量を用い、夕ンパク質またはべプチド共存下で、 p H 6.

4以下の溶液中で架橋、ハイド口ゲル化することで、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらを効率よく封入できることを見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらを i n s i t u架橋し、ハイドロゲル中に封入したタンパク質またはペプチド徐放製剤に関するものであり、本発明の一つの側面によれば、 p H 6. 4以下の溶液中でヒアル口ン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とするヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法が提供される。

ここで、ヒアルロン酸におけるヒドラジド基の導入は、特に限定はされるものではないが、好ましくは、ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、導入される。

ここで、置換ヒドラジド基または置換アミド基の置換基は、ヒドラジド基を有する置換基であれば特に限定されないが、例えば、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝 C 。アルキル基、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝 C ₀ヒドロキシアルキル基、ヒドラジド基を有するポリアルキレンォキサイド基、ヒドラジド基を有するポリペプチド基、およびヒドラジド基を有するポリエステル基等が、挙げられる。

また、エステル基としては、ヒドラジド基を有するエステル基であれば特に限定されないが、例えば、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝。アルキルエステル基、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝ヒドロキシアルキルエステル基、ヒドラジド基を有するポリアルキレンォキサイドエステル基、ヒドラジド基を有するポリべプチドを含むエステル基、およびヒドラジド基を有するポリエステル基等が挙げられる。

さらに、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、特に限定されるものではないが、好ましくは式（I ) ：

(式中、 X。は、一 N (― R 一、または—〇—であり、

は、水素原子、直鎖または分枝 0アルキル基、直鎖または分枝 Ci— o ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

は、一 Y — R₂— Y₂— NHNH₂であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — ₆アルキル基、直鎖または分枝 — ₆アルケニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキニル基、直鎖または分枝アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 Cト₆アルキニルカルポニル基、または一 S〇₂〇Hであり、

は、単結合、 -N (_R₃) CO—、一 N (― R₃) —、 -CO-, または _CH₂CO—であり、

R₂は、単結合、直鎖または分枝 ^。アルキレン基、直鎖または分枝

。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

Y₂は、単結合、 -Ν (― R₄) CO—、 -CO-, または、一 CH₂C〇一であり、

R₃および R₄は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C i 0アルキル基、直鎖または分枝 C —i。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。

さらに、式（I) において、 X。は、好ましくは一 N (— R 一であり、は、好ましくは水素原子であり、 R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、好ましくは水素原子であり、は、好ましくは単結合、または、一 CO—であり、 R₂は、好ましくは直鎖または分枝アルキレン基であり、 Y₂は、好ましくは、単結合、または、一 CO—であり、 R₃は、好ましくは水素原子であり、 R₄は、好ましくは水素原子である。

また式（I) 中、ポリアルキレンオキサイド基とは、 ― (CH (― R) CH₂ 〇） _n-OH (式中、 Rは水素原子、または ₅アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくは nは、 1一 20の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸 1—20個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

本願発明の別の側面によれば、上記の方法により作製された、ヒアルロン酸ゲルが提供される。該ヒアルロン酸ゲルは、特に限定されるものではないが、ハイド口ゲルであることが望ましい。

本願発明のさらに別の側面によれば、タンパク質又はペプチド存在下で、 pH 6. 4以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする薬物徐放担体の製造方法が提供される。該薬物徐放担体の製造方法は、好ましくは上記式 (I) (X₀、 Xい R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6については、上述のとおりである。）で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を、合成する工程、および、該ヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド存在下、 pH6. 4以下でィ匕学架橋する工程、を含むものである。

本願発明のさらに別の側面によれば、上記の方法により作製された薬物徐放担体が提供され、さらに該薬物徐放担体を含む薬剤組成物が提供される。図面の簡単な説明図 1は、 pH4. 8でゲル化した際の、 NHS基の存在比（対 HZ基）による回収 EPOの変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) のチヤ一トである。

図 2は、 NH S基の存在比（対 H Z基）を 10 %としてゲル化した際の、 p H値による回収 EPOの変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) の測定結果である。

図 3は、 NHS基の存在比（対 HZ基）を 10%としてゲル化した際の、 p H値による EPO回収率の変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（HPL C) の測定結果である。

図 4は、 pH4. 8でゲル化した際の、 HZ基の導入率、および NHS基の存在比（対 HZ基）による EPO回収率の変ィ匕を示すグラフである。

図 5は、 HZ基の導入率、および NHS基の存在比（対 HZ基）による EP 〇回収率の変化を示すグラフである。

図 6は、 NHS基の存在比（対 HZ基）が 10モル％の際の、 pH値による EPO回収率の変化を示すプロットである。

図 7は、 pH4. 8、 NHS基の存在比（対 HZ値）を 20%としてゲル化した際の、 150 mM PBS (pH7. 4) での EP 0累積放出率の経時変化を示すグラフである発明を実施するための好ましい形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明の薬物徐放担体の製造法は、夕ンパク質またはべプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋、 Λィドロゲレ化することを特徴とする。

本発明の薬物徐放担体は、以下のような優れた特徴を有している。

1. 生分解性、生体に対する安全性を付与できる。

2. タンパク質の変性を防ぐことができる。

ィ匕学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。本発明の薬物徐放担体は、ヒアルロン酸 (HA) にヒドラジド基を導入したヒアル口ン酸誘導体を夕ンパク質またはべプチド共存下で架橋することを特徴とする。架橋時の pHは、アミノ基に対する HZとの選択的反応性、タンパク質の変性等を考慮し、 pH3. 0〜pH6. 4が好ましい。さらに好ましくは、 pH3. 5〜pH6. 2、特に好ましくは pH4. 0〜6. 0である。

一般的にタンパク質やペプチドのァミノ基の pK a (— NH₃ ⁺ → -NH ₂) は、 9程度であるのに対し、ヒドラジド基（HZ) の場合は、 3程度である。これらの官能基が、スクシンィミジルエステル、アルデヒド基、ビニルスルフォン基等の求核的に反応しうる官能基と反応するには、反応点である窒素原子の不対電子が脱プロトン化されている必要がある。よって、架橋時の pH、および導入されたヒドラジド基に対する架橋剤の量比を調製することで、架橋剤とヒドラジド基およびアミノ基との反応性を制御できると考えられる。

また、いかに架橋剤とヒドラジド基との選択的反応が進行しても、余剰の架橋剤が存在すれば反応性の低いアミノ基とも反応してしまう。そこで、本薬物徐放担体において、ヒドラジド基と反応する架橋剤中の官能基は、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して 40モル％以下であることが好ましく、さらに好ましくは 20モル％以下、特に好ましくは 10モル％以下である。

また、本薬物徐放担体において、その架橋剤中のヒドラジド基と反応する化合物官能基は、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して通常、 0. 1モル％以上であり、好ましくは 1モル％以上であり、特に好ましくは 3モル％以上である。

本発明でいう化学反応性を有するヒドラジド基とは、一般にアミノ基、ヒドラジド基の定量化に用いられるトリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS) 法で定量される HZ基を言う。

架橋剤としては、ヒドラジド基と求核的または求電子的に反応しうる官能基を 2以上有するものであれば特に限定されないが、例えば、スクシンィミジルォキシカルボニル基、イミドエステル基などの反応性の高いエステル基、イソチオシァネ一ト基、イソシァネート基、ァリルハライド基、カルポジイミド基、スルホニルクロライド基、スルフォニルフルオライド基、アルデヒド基、ペン夕フルォ口フエノキシカルポニル基、 p—二トロフエノキシカルポニル基、イミダゾリルカルボ二ル基、ビニルスルホン基、酸無水物、 4一二トロフエニルフオルメート基、エポキシド基、アルキルホスフェート基、力一ポネート基、アクリルアジド基、フヱニルアジド基等の官能基を同一分子内に 2つ以上持つ分子が挙げられる。当該架橋剤の例には、ビス [スルホスクシンィミジル] スべレート、ジスクシンィミジルグルタレート、ジスクシンィミジルタルトレート、エチレングリコールビス [スクシンイミジルスクシネ一卜] などが含まれる。

さらに、架橋剤は水中で用いることができるように、水溶性を付与する置換基、例えば、スルホン酸基、ホスホン酸基などで置換されていてもよい。

ヒアルロン酸へのヒドラジド基の導入は当業者に公知の方法で行うことができ、ヒアルロン酸の力ルポキシル基と 2価のヒドラジド含有化合物（ジヒドラジドィ匕合物）を、縮合剤を用いて縮合させることにより合成することができる。ジヒドラジド化合物としては、コハク酸ジヒドラジド、ダル夕ル酸ジヒドラジド、ァジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジドが挙げられる。また、縮合剤としては、 1， 3—ジシクロへキシルカルポジイミド、 1， 3—ジイソプロピル力ルポジイミド、 1ーェチルー 3 - ( 3一ジメチルァミノプロピル) カルポジイミドなどが挙げられる。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を 1 _工チル— 3— ( 3一ジメチルァミノプロピル) カルポジィミド（E D C) で縮合させ、ヒドラジド基で修飾されたヒアルロン酸 (HA-H Z) を合成することが可能である。

ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基のヒアルロン酸への導入率は特に限定されないが、流動性のないゲルを得るために H Aのダルク口ン酸当たり 3モル％以上、好ましくは 5モル％以上である。

ヒアルロン酸誘導体と薬理作用を持つタンパク質またはべプチドとカゝらなるノ\ イド口ゲルの調製方法としては、例えば、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質またはべプチドを酢酸ノッファーゃリン酸緩衝生理食塩水等に溶解した後、ここに架橋剤を加えて均一分散させ室温等で約 2時間反応させればよい。

本発明に用いられるヒアルロン酸は、どのようにして得られたヒアルロン酸でもよく、動物 «から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、ヒアルロン酸にさらなる処理を行ってもよい。本発明のヒアルロン酸には、様々な方法で修飾された修飾ヒアルロン酸や、ナトリウム、力リウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。ヒアルロン酸はカルポキシル基とハイド口キシル基が修飾されることが多いが、本発明において修飾ヒアルロン酸はどの部分が修飾されていてもよい。修飾ヒアルロン酸は特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化されたヒアルロン酸 (国際公開第 95/25751号パンフレツト）、 N—硫酸化されたヒアルロン酸（国際公開 98Z45335号パンフレツト）、エステル化されたヒアルロン酸（欧州特許出願公開第 0216453、国際公開第 98/08876号パンフレツ卜、欧州特許出願公開第 0341745号明細書）、過沃素酸酸化されたヒアルロン酸、アミド修飾されたヒアルロン酸などを挙げることができる。

本発明に用いられるヒアル口ン酸の分子量は特に限定されず、いかなる分子量のヒアルロン酸でも使用することが可能であるが、通常 5000〜 350万ダルトン、好ましくは 1万〜 200万ダルトンのヒアルロン酸を用いることができる薬効を持つ夕ンパク質またはべプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロポエチン（EPO) 、ダラニュロサイトコロニー刺激因子（G— CSF ) 、インターフェロン一ひ、 β、丁、 (INF— 、 β、 γ) 、トロンポポェチン（TPO) 、シリアリーニューロ卜ロフイクファクタ一（CNTF) 、チュ一マ一ネクローシスファクタ一結合タンパク質（TNFbp) 、インタ一ロイキン -10 (I L— 10) 、 FMS類似チロシンカイネース（F l t— 3) 、成長ホルモン（GH) 、インシュリン、インシュリン類似成長因子一 1 (IGF— 1) 、血小板由来成長因子（PDFG) 、インターロイキン一 1レセプ夕一アン夕ゴ二スト（I L— I r a) 、ブレイン由来ニュ一ロトロフイクファクタ一（BDN F) 、ケラチノサイト成長因子（KGF) 、幹細胞因子（SCF) 、メガカリオサイト成長分化因子（MGDF) 、ォステオプロテゲリン（OPG) 、レフ。チン、副甲状腺ホルモン（PTH) 、塩基性フイブロブラスト成長因子（b— FGF ) 、骨形成タンパク質（BMP) 、グルカゴン様ペプチド— 1 (GLP— 1) 、抗体、ダイアポディー等が挙げられる。

本発明の方法は、 G— CSFのように分子中にメルカプト基が存在するような夕ンパク質でも、タンパク質中のメルカプト基を反応させずにヒアルロン酸を架橋できる点で優れている。

本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、特に限定されないが、例えば、ハイド口ゲルまたはオルガノゲルであってもよく、好ましくはハイドロゲルである。

本発明の徐放担体は、 1種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例

E P〇封入 HAハイドロゲルの調製

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（RP— HPLC) 分析は、 W a t e r s 600 Sコント口一ラ、 717 p 1 u sォ一トサンプラー、 486紫外光吸収測定器 (Wa t e r s社製）を用い、以下の測定条件より行った。カラム： C4(粒子径、サイズ . 6X250mm、 VYDAC製）移動相 A：水 Zァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸 =400 100/1, 移動相 B：水 Zァセトニトリル Zトリフルォロ酢酸 = 100/400/1 流速： lmLZ分

移動相 AZB=65ノ 35〜0ノ100のグラジェント溶出

カラム温度：室温付近

サンプル温度： 4°C

検出波長： UV 28 Onm 解析ソフト： Mi 1 1 en i um32 ve r. 3. 21 トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS) によるァミノ基の定量は、「学会出版センタ一生物化学実験法 12 蛋白質の化学修飾く上 > 初版」 37ベージに記載の方法（TNBS法）に従った。ただし、 TNBS溶液は 0. 5Mに調製し、ヒドラジド基を定量するために 500 nmの吸光度を測定した。

実施例 1 ：ヒドラジド基（HZ) が導入されたヒアルロン酸 (HA-HZ) の合成

〔実施例 1— 1〕

分子量 2. 5X10⁴ダルトンのヒアルロン酸（HA) (電気化学工業株式会社製） 50011^を1. 0%濃度で蒸留水に溶解し、： »で pHを 4. 7〜4. 8に調製した。 1_ェチル一 3— ( 3 -ジメチルァミノプロピル) カルポジイミド（EDC) とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を、 HA : EDC : ADH= 1 : 0. 3 ： 40モル比になるよう添加し、で pHを 4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。 100 mM塩化ナトリゥム溶液、 25 %ェタノ —ル水溶液、蒸留水で透析（スぺクトラポア 7、分画分子量 (MWCO) ： 12 k— 14kダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体 (HA-HZ) を得た。 TNBS法で定量したところ、 10. 0% であった。

〔実施例 1— 2〕

実施例 1一 1で HA： EDC： ADH=1 ： 0. 3 ： 40モル比の替わりに H A： EDC： ADH=1 ： 1 ： 40モル比になるよう添加したこと以外は実施例 1― 1と同様の方法でヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-HZ) を調製した。 TNBS法で求めた HZ化率は 23. 7%であった。

〔実施例 1— 3〕

実施例 1— 1で HA： EDC： ADH-1 ： 0. 3： 40モル比の替わりに H A： EDC： ADH=1 ： 5 ： 40モル比になるよう添加したこと以外は実施例 1一 1と同様の方法でヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-HZ) を調製した。 TNBS法で求めた HZ化率は 39. 1% (ロット 1) 、 40. 7% (ロット 2) であった。実施例 2： EP〇封入ヒアルロン酸誘導体八ィドロゲル調製

(実施例 2— 1)

実施例 1一 1のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体 (HA-HZ) (MW25KD、 TNBS法で求めた HZ化率は 10. 0%) 111. 0 lmg を 0. 888mLの蒸留水に溶解した。この溶液 0. 640mLに対して、 1M 酢酸水溶液 (pH 4. 8) 0. 080mLを添加、混合し、均一溶液とした。更に 8. 74mg/mLの EPO水溶液を 0. 08 OmLを加えて均一溶液とした。これを 0. 10 OmLずつ取り分け、架橋剤として B S 3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スべレート、 P I ERCE製）をヒドラジド基に対して、 BS 3/HZ=0. 5、 0. 2、 0. 1、 0. 05、および 0、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して B S 3に含まれるスクシンィミジルエステル (N HS) 基が 100、 40、 20、 10、および 0モル％になるように 0. 725、 0. 290、 0. 145、 0. 072、および Omgずつ 10 Omg/mLの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で 2時間反応させて EP 0封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。

(実施例 2 - 2)

実施例 1—2のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-HZ) 、 11 2. O Omgを 0. 896mLの蒸留水に溶解した。この溶液 0. 64 OmLに対して、 1M酢酸水溶液 (pH 4. 8) 0. 08 OmLを添加、混合し、均一溶液とした。更に 8. 74mgZmLの EPO水溶液を 0. 08 OmLを加えて均一溶液とした。これを 0. lmLずつ取り分け、架橋剤として BS 3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スベレー卜、 P I ERCE製）をヒドラジド基に対して BS3/HZ = 0. 5、 0. 2、 0. 1、 0. 05、および 0、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、 BS 3に含まれるスクシンイミジルェステル（NHS) 基が、 100、 40、 20、 10、 0モル％になるように 1. 629、 0. 652、 0. 326、 0. 163、 Omgずつ 10 Omg/mLの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で 2時間反応させて E PO封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。

(実施例 2— 3) 実施例 1— 3で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-H Z) (ロット 1) 、 311. O lmgを 2. 488mLの蒸留水に溶解した。この溶液 0. 640mLに対して、 1M酢酸水溶液（pH 4. 8) 0. 080m Lを添加、混合し、均一溶液とした。更に 8. 74mgZmLの EPO水溶液を 0. 08 OmLを加えて均一溶液とした。これを 0. lmLずつ取り分け、架橋剤として BS 3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スべレ一卜、 P I ERCE 製）を HZに対して BS 3/HZ=0. 5、 0. 2、 0. 1、 0. 05、 0、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、 BS 3に含まれるスクシンィミジルエステル（NHS) 基が、 100、 40、 20、 10、 0モル％になるように 2. 541、 1. 016、 0. 508、 0. 254、 Omgずつ l O Omg ZmLの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で²時間反応させて E P〇封入ヒアルロン酸誘導体ハイド口ゲルを得た。

(実施例 2— 4)

実施例 2— 3の 1M酢酸水溶液（pH 4. 8) 0. 080mLの替わりに 1 Mのリン酸緩衝液（pH 6. 0) 0. 08 OmLを添加する他は、前述の実施例 2— 3と同様の方法で E P O封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。

(実施例 2 - 5)

実施例 2— 3の 1M酢酸水溶液（pH 4. 8) 0. 080mLの替わりに 1 Mのリン酸緩衝液（pH 7. 4) 0. 08 OmLを添加する他は、前述の実施例 2— 3と同様の方法で EPO封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。

(実施例 2 - 6)

実施例 1— 3で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-H Z) (ロット 2) 、 84. 30mgを 0. 6744mLの蒸留水に溶解した。これを 0. 04 OmLずつ 4つに取り分け、それぞれに対して、 1Mリン酸緩衝液 (pH 6. 2、 6. 4、 6. 6および 6. 8) を 0. 005mL、及び 8. 5

の£?〇水溶液を0. 005mLを添加、混合し、均一溶液とした。これらに、架橋剤として BS 3 (ビス [スルホスクシンィミジル] スべレート、 P I ERCE製）をヒドラジド基に対して BS 3/HZ = 0. 05、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、 BS 3に含まれるスクシンィミジルェステル（NHS) 基が、 10モル％になるように 0. 132mgT 100mg /mLの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で 2時間反応させて E P O封入ヒアリレロン酸誘導体ハイド口ゲルを得た。

実施例 3 ： EPO封入ヒアルロン酸誘導体ハイド口ゲルの EPO回収率測定 (実施例 3— 1)

実施例 2-1-5で調製した E P O封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルに対して、 1Mリン酸緩衝液（pH 6. 5) 0. 020mL、ならびにヒアルロニダーゼ（Hya l u r on i da s e SD、生化学工業製）溶液 ( 1ュニット /mL、 l O OmMリン酸緩衝液、 pH 6. 0、 0. 01%BSAを含む） 0. 10 OmLを添加して、 37°Cで 2日間、酵素処理を行った。一部のゲルに対しては、更にヒアルロニダーゼ（Hy a l u r on i da s e SD) 溶液を追加して、ゲルを完全に分解させた。酵素処理後の溶液 0. 03 OmLを、 100m Mリン酸緩衝液 (pH7. 4) 0. 12 OmLと混合し、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速液体クロマトグラフィ一（RP— HPLC) 測定を行い、 0. lmgZmLの EP〇水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークェリア比から試料溶液中 EPO濃度を算出した。添加した EPO量（0. 0874 mg/ゲル 1個）に対して R P—HP L Cより求めた E P O量を回収率として算出した。

実施例 2-3で調製した 5つのサンプルについての R P—HP L Cの測定結果を図 1に示す。標準溶液の測定より E P Oの保持時間は 19. 789分および 2 1. 484分であり、各サンプルにおいて EPOのピークが観測された。また、実施例 2— 1〜 3についての測定結果を表 1および図 4に示す。この結果は、ヒアルロン酸に導入されたヒドラジド (HZ) 基に対して、スクシンィミジルエステル（NHS) 基が 10〜20%程度となるような条件での架橋反応は、 EPO に大きな影響を与えないことを示している。

実施例 2— 3〜 5の各々で 5つずつ調製した計 15個のサンプルのうち、ヒドラジド（HZ) 基に対するスクシンイミド（NHS) 基の存在比が 10モル％となる条件のものについての RP— HP LCの測定結果を図 2 (クロマトグラム）、表 2 (数値）、および図 5 (グラフ）に示す。この結果は、 pH7. 4の場合に対して ρΗ6· 0および ρΗ4. 8の場合は、 ΕΡ〇の回収率が有意に向上していることを示している。

(実施例 3— 2)

実施例 2— 6で調製した ΕΡΟ封入ヒアルロン酸ハイドロゲルに対して、 1M リン酸緩衝液（ρΗ 6. 5) 0. 01 OmL、ならびにヒアルロニダ一ゼ（Η ya l u r on i da s e SD、生化学工業製）溶液 (1ュニット ZmL、 1 O OmMリン酸緩衝液、 ρΗ 6. 0、 0. 01%BSAを含む） 0. 050m Lを添加して、 37 °Cで 1日間、酵素処理を行った。酵素処理後の溶液 0. 03 OmLを、 10 OmMリン酸緩衝液（pH7. 4) 0. 12 OmLと混合し、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速、液体クロマトグラフィー（RP—HPL C) 測定を行い、 0. lmgZmLの EPO水溶液を標輕液として、標準溶液と試料溶液のピークエリァ比から試料溶液中 E P O濃度を算出した。添加した E PO量（0. 0428mgZゲル 1個）に対して R P— HP L Cより求めた E P 0量を回収率として算出した。

実施例 2— 6で調製した 4つのサンプルについての RP— HP LCの測定結果を図 3 (クロマトグラム）、表 3 (数値）、および図 6 (グラフ）に示す。この結果は、 E P Oの回収率は架橋反応条件における p Hの変化によつて有意に変化すること、該回収率は pH 6. 0〜6. 8付近で大きく変化すること、さらに約 PH6. 4以下の pH値が架橋反応の条件として好ましいことを示している。

実施例 4： E P0封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルの i n v i t r o 薬物放出実験

(実施例 4一 1)

実施例 1― 3で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸 (HA-H Z) (ロット 2) 、 117. 44mgを 0. 9395mLの蒸留水に溶解した。この溶液に対して、 1M酢酸水溶液（pH 4. 8) 0. 1174mLを添加、混合し、均一溶液とした。更に 8. 57mgZmLの EPOzf溶液を 0. 117 4 mLを加えて均一溶液とした。これを 0. lmLずつ取り分け、架橋剤として BS 3 (P I ERCE製）をヒドラジド基に対して B S 3/HZ = 0. 1、すなわちィヒ学反応性を有するヒドラジド基に対してスクシンィミジルエステル（NH S) 基が 20モル％になるように 0. 526mgずつ 10 OmgZmLの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で 2時間反応させて EPO封入 HAハイド口ゲルを得た（n = 4) 。

4つのうち、 1つのゲルは、実施例 3—1と同様の処理を行い、封入された E PO量を求めた。 3つのゲルは、各々 150mM PBS (pH7. 4) lmL を添加して密封し、 37 の恒温相中で穏やかに振とうすることで、 i n V i t _r o薬物放出実験を行った。 37°Cでの振とう開始後、 1、 3、 6、 20、 4 4、 116、 164、 212、 290、 357時間に溶出液を 0. 2mL採取した。採取後、新たに 150mM PBS (pH7. 4) 0. 2mLを加えて、放出実験を,修镜した。採取した溶出液を試料溶液として、逆相高速液体クロマトグラフィ一（RP— HPLC) 測定を行い、 0. 111187111 の£?0水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピ一クェリァ比から試料溶液中 E P O濃度を算出した。放出された EPO量を算出し、累積放出量を EPO封入量に対する累積放出率として算出した。

EPOの累積放出率（％、平均値土標準偏差、 n=3) を表 4 (数値）および図 7 (グラフ）に示す。この結果は、 EPO封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルからの EPOの徐放期間は約 12日間であり、封入量の 85%が放出されたことを示している。表 1. PH4, 8で NHS基の存在比（対 HZ値）を 0〜： 100%としてゲル化した際の、 1^導入率にょる£?0回収率の変化

NHS基の導入率（％対 HZ基）

HZ基導入率 0 10 20 40 100 実施例 2—1 10.0% 99 102 88 71 28 実施例 2— 2 23.7% 103 100 90 74 13 実施例 2— 3 39.1% 103 100 95 56 8 表 2. HZ導入率 39. 1%の HA— HZを、 NHS基の存在比（対 HZ値) を 0〜100%としてゲル化した際の、 pH値による EPO回収率の変化

表 3. HZ導入率 40. 7%の1^八—《[2を、 NHS基の存在比（対 HZ値) を 10%としてゲル化した際の、 1^値にょる£?〇回収率の変ィ匕

表 4. PH4. 8、 NHS基の存在比（対 HZ値）を 20%としてゲル化した際の、 150mM PBS (pH7. 4) での EPO累積放出率の経時変化放出時間（時間）累積放出率（0/0)

1 0

3 1

6 3

20 15

44 38

116 64

164 74

212 82

290 85

357 85 産業上の利用の可能性

本発明の薬物徐放担体は、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらを i n s i t 11化学架橋、ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク質、ぺプチドの徐放を可能にする。

Claims

請求の範囲

1. pH6. 4以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアル口ン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。

2. 以下の工程を含む、ヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法：

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、ヒドラジド基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体を pH6. 4以下の溶液中で架橋する工程。

3. 以下の工程を含む、ヒアルロン酸ゲルの製造方法：

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上のカルボキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、式（I) ：

(式中、 X。は、一 N (― R 一、または一〇一であり、

は、水素原子、直鎖または分枝 ^。アルキル基、

ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 — ₆アルケニル基、直鎖または分枝 Ci— ₆アルキニル基、直鎖または分枝 (：ト₆アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 C — 6アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C ₆アルキニルカルポニル基、または一 SO ₂OHであり、

は、一 — R₂— Y₂— NHNH₂であり、

は、単結合、 -N (-R₃) CO—、 -N (一 R₃) —、 -CO-, または一 CH₂C〇一であり、

R₂は、単結合、直鎖または分枝じト ₁₀アルキレン基、直鎖または分枝 ( 卜ェ。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

Y₂は、単結合、 — Ν (― R₄) C〇_、 —CO—、または、 — CH₂CO—であり、

R₃および R₄は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 C — ₁₀アルキル基、直鎖または分枝 ^— ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）

で示される繰り返し構造を、少なくとも 1以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、

(b) 上記ヒアルロン酸誘導体を pH 6. 4以下で化学架橋する工程。

4. ヒドラジド基の、ヒアルロン酸誘導体中のダルク口ン酸当たりの導入率が 3モル％以上であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法。

5. 架橋剤中に含まれる、ヒドラジド基と反応する化合物官能基が、導入されたヒドラジド基に対して 40モル％以下であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の製造方法。

6. 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法により作製された、ヒアルロン酸ゲル。

7. 上記ヒアルロン酸ゲルが八イド口ゲルである、請求項 6に記載のヒアルロン酸誘導体ゲル。

8. タンパク質又はペプチド存在下で、 pH6. 4以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアル口ン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする薬物徐放担体の製造方法。

9. 以下の工程を含む、薬物徐放担体の製造方法：

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上の力ルポキシル基を、ヒドラジド基に変換することにより、ヒドラジド基を導入する工程、

(b) 上記ヒドラジド基導入されたヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはべプチド存在下、 PH6. 4以下の溶液中で架橋する工程。

10. 以下の工程を含む、薬物徐放担体の製造方法：

(a) ヒアルロン酸の少なくとも 1以上のカルボキシル基を、ヒドラジド基に変換することにより、式（I) ：

(式中、 X。は、 — N (-R_x) 一、または—〇一であり、

は、水素原子、直鎖または分枝 C;^。アルキル基、直鎖または分枝 Ci— ₁₀ ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

R_a2、 R_a3、 R_a4、 R_a5および R_a6は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝アルキル基、直鎖または分枝 (： ₆アルケニル基、直鎖または分枝 — ₆アルキニル基、直鎖または分枝アルキルカルポニル基、直鎖または分枝 C アルケニルカルポニル基、直鎖または分枝 C アルキニルカルポニル基、または一 S0₂OHであり、

は、一 — R₂— Y₂— NHNH₂であり、

は、単結合、 -N (― R₃) CO—、 — N (― R₃) —、 —CO—、または一 CH₂C〇一であり、

R₂は、単結合、直鎖または分枝 — 。アルキレン基、直鎖または分枝。ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、

Y₂は、単結合、 —Ν (― R₄) CO—、 —CO—、または、 — CH₂C〇—であり、

R₃および R₄は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝 — ₁₀アルキル基、直鎖または分枝 ^。ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンォキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。 )

(b) 上記ヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド存在下、 H6. 4以下で化学架橋する工程。

11. ヒアルロン酸中のダルクロン酸当たりのヒドラジド基の導入率が 3モル %以上であることを特徴とする、 ^求項 8〜10のいずれか 1項に記載の製造方法。

12. 架橋剤中に含まれる、ヒドラジド基と反応する化合物官能基が、導入されたヒドラジド基に対して 40%モル以下であることを特徴とする請求項 8〜1 1のいずれか 1項に記載の製造方法。

13. 請求項 8〜 12のいずれか 1項に記載の方法により作製された、薬物徐放担体。

14. 請求項 13に記載の薬物徐放担体を含む、薬剤組成物。