JPWO2006028110A1 - 水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法 - Google Patents

水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法 Download PDF

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Abstract

薬物担体として実用的な水溶性ＨＡ修飾物、およびその製造方法を提供する。本発明は、非プロトン性極性溶媒中で、ＢＯＰ系縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合で置換基を下限が５モル％以上導入することにより製造される、実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長された水溶性ヒアルロン酸修飾物、およびその製造方法を提供する。さらに、そのヒアルロン酸修飾物を架橋することにより、従来知られているゲルに比べ、同じ架橋性官能基導入率でも非常に長い薬物徐放が可能となるヒアルロン酸ゲルを提供する。

Description

本発明は、薬物担体として有用な水溶性ヒアルロン酸修飾物、該ヒアルロン酸修飾物の製造方法、該ヒアルロン酸修飾物と薬物とのコンジュゲート、および該ヒアルロン酸修飾物から得られるゲルに関する。
一般に、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマーとのコンジュゲーションが試みられている。特に、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」とも称す）は、その不活性な性質と生体内でのタンパク質による薬物の吸着を防ぐ効果を有することから広く用いられており、ＰＥＧコンジュゲート化タンパク質は医薬品として既に実用化の段階に入っている。しかし、ＰＥＧは生分解性ポリマーではない為、長期投与により体内に蓄積した場合の安全性等の問題は明らかでない。更には、最近、ＰＥＧコンジュゲート化リポソームにおいて投与２回目のクリアランスが異常に早い現象（Ａｃｃｅｒｅｌａｔｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ現象、以下「ＡＢＣ現象」とも称す）が報告されており（非特許文献１および２を参照）、ＰＥＧコンジュゲート化医薬品の安全性、有効性は十分に確立されたとは言い難い。
ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」とも称す）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である。ヒアルロン酸は、その化学的および物理的構造に種差が無く、ヒトにおいてもヒアルロン酸の代謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関しても非常に安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）ということができる。近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面が注目されている。また、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となり、関節疾患治療薬などの医薬として実用化されており、化粧品等の分野においても実用化が進んでいる。さらに、薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献１を参照）、肝臓へのターゲティング（特許文献２を参照）、抗原性の低減（特許文献３を参照）、血中滞留時間の延長（特許文献４、５および６を参照）等が達成できるという報告がなされている。
汎用されているＰＥＧと比べて、薬物のコンジュゲート担体としてヒアルロン酸を用いる際の利点は、生分解性を有する点、巨大サイズ化が可能な点、さらに、１分子中に多くの反応点を持つため、複数の薬物（同一薬物を複数、或いは２種類以上の薬物）を１分子中に担持できるということである。このような利点を有するヒアルロン酸を薬物コンジュゲート担体として用いることは、ターゲティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を持つコンジュゲートを設計開発する手段となる。また、ヒアルロン酸は生分解性である上に、その化学的構造に種差が無いことから、安全性という点においてもＰＥＧよりも優れた担体であるといえる。
しかし、ヒアルロン酸自体の血中滞留時間は短く、静脈内注射（以下、「ｉｖ」とも称す）で半減期が２分間であると報告されている（非特許文献３を参照）。本発明者の検討においても、ただ単にヒアルロン酸を薬物にコンジュゲートしただけでは、薬物の血中滞留時間の大きな延長や、薬効の持続性の向上は確認されなかった。ヒアルロン酸の主代謝部位は肝臓およびリンパ腺であり、その代謝は、主にＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ、ＨＡＲＥ等のヒアルロン酸に特異的に結合する細胞膜局在レセプターを介した細胞内への取り込みとそれに引き続くヒアルロニダーゼによる分解によるものである。これらの分子は共に、ヒアルロン酸の連続した遊離のカルボキシ基（６糖）を主な認識部位にしていることが報告されている（非特許文献４を参照）。
従って、血中滞留時間が短いというヒアルロン酸の問題を克服すべく、ヒアルロン酸に置換基を導入したヒアルロン酸修飾物を薬物担体として利用する試みもある（特許文献４、５および６を参照）。一般に、ヒアルロン酸に置換基を導入すればその血中滞留時間は延長され、その程度は置換基の導入率と相関すると考えられる。ヒアルロン酸の様々な位置に置換基が導入されたヒアルロン酸修飾物が報告されている。その中でも、ヒアルロン酸におけるグルクロン酸部分のカルボキシ基に加水分解されにくいアミド結合を介して置換基を導入することが、得られるヒアルロン酸修飾物とヒアルロン酸レセプターとの結合阻害において効果的であり、当該ヒアルロン酸修飾物は血中滞留時間の面において優れていると考えられる。
一方、ヒアルロン酸をテトラブチルアンモニウム塩にし、ジメチルスルホキシド中で置換基と反応させることによって、ヒアルロン酸のカルボキシ基をアミド化したヒアルロン酸修飾物（特許文献７を参照）も報告されているが、この発明は架橋体調製を目的としたもので、血中滞留性延長を目指したものではない。さらに言えば、この発明においては縮合剤として１，１−カルボニルジイミダゾール（以下、「ＣＤＩ」とも称す）を用いている。我々の検討では、縮合剤としてＣＤＩを用いても血中滞留性が充分に延長された（ヒアルロニダーゼによる分解に対して充分な耐性を持つような）ヒアルロン酸誘導体を得ることはできず、さらに、反応中にヒアルロン酸分子量が大きく低下することが確認されている。
これら以外にも、水と極性有機溶媒の混合溶媒中で、ヒアルロン酸のカルボキシ基に置換基を導入した例も報告されている（特許文献８を参照）。しかしながら、得られたヒアルロン酸修飾物について、血中滞留時間の延長が見られるかどうかにについては一切触れられていない。
このように、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、特に血中滞留時間を実用的なレベルまで延長した水溶性ヒアルロン酸修飾物は知られておらず、その製造方法も知られていなかった。
近年実用化されている薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤薬物は一般に血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっており、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。また、低分子化合物からなる薬物もその血中半減期の短さから持続製剤のニーズは高い。
例えば、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（以下、「ＰＬＧＡ」とも称す）等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、ｐＨの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている（非特許文献５および６を参照）。親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っておらず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放型製剤は現在のところ実現していない。
非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持ち、安全性の面から好ましいと考えられるＨＡを徐放基材に用いた架橋方法、ＨＡゲルからのタンパク質やペプチド薬物の徐放も多数報告されている。ＨＡを化学架橋でゲル化させる方法としては、カルボジイミド法（特許文献９参照）、ジビニルスルホン法（特許文献１０参照）、グリシジルエーテル法（特許文献１１参照）等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、ＨＡとタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、ｉｎ ｓｉｔｕ架橋を行うと、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうしたｉｎ ｓｉｔｕ架橋により、ＨＡゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤についての報告がなされている（例えば、特許文献１２参照）。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でＨＡをｉｎ ｓｉｔｕ架橋すると、回収率の点で問題がある。例えば、ヒドラジド基（以下、「ＨＺ」とも称す）を導入したＨＡ誘導体（以下、「ＨＡ−ＨＺ」とも称す）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルからなる架橋剤で架橋する方法（特許文献１３参照）が報告されているが、生理条件下でのｉｎ ｓｉｔｕ架橋を目的としているため、ｐＨ７.４〜８．５で架橋形成反応を行っているが、本発明者らによる検討では、この方法で得られるＨＡゲルからのタンパク質またはペプチドの回収率は低い。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であり、タンパク質またはペプチドを反応させずにＨＡを化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（特許文献１４参照）、生分解性でないＰＥＧ断片が残存する問題がある。また、こうした問題点を解決する為、タンパク質、ペプチドとの反応性を極力抑えたヒアルロン酸ゲルも報告されているが（特許文献１５参照）、徐放期間は１週間程度に留まっている。
さらに、こうした薬物徐放性物質を注射可能な製剤とするには、これを微粒子化する必要がある。こうした検討にスプレードライヤーは広く使用されており、インシュリン（非特許文献７、非特許文献８参照）、ｒｈ抗ＩｇＥ抗体（非特許文献９参照）を微粒子化した報告、ヒアルロン酸の微粒子中に薬物を封入した報告（特許文献１６、特許文献１７参照）はあるが、共に短時間に皮下で溶解してしまうため薬物徐放期間は非常に短く、徐放目的としての実用性は低い。また、スプレードライ中にキトサンの架橋反応を行い、低分子薬物を封入する報告（非特許文献１０参照）もあるが、放出期間は数分と短く、架橋剤に用いるアルデヒドがアミノ基などの官能基と高い反応性を有するため、タンパク質、ペプチド、その他のアミノ基などの官能基を有する低分子薬物には使用することができない。
このように、水溶性ヒアルロン酸修飾物を基材とした実用的な徐放型製剤は知られておらず、その製造方法も知られていなかった。
国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット 特開２００１−８１１０３号公報 特開平２−２７３１７６号公報 特開平５−８５９４２号公報 国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット 特表２００２−５１９４８１号公報 国際公開ＷＯ９４／１９３７６号パンフレット 国際公開第９４／０２５１７号パンフレット 特開昭６１−１３８６０１号公報 特開平５−１４０２０１号公報 米国特許第５８２７９３７号明細書 国際公開９５／１５１６８号パンフレット 国際公開第００／４４８０８号パンフレット 国際公開第０４／０４６２００号パンフレット 特許第３４４５２８３号公報 国際公開 ＷＯ９６／１８６４７号パンフレット Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．第２５５巻、第１６７−１７４頁、２００３年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．第８８巻、第３５−４２頁、２００３年 Ｊ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．第２４２巻、第２７−３３頁、１９９７年 Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．第２２８巻、第２１６−２２８頁、１９９６年 Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第８８巻、第１６６−１７３頁、１９９９年 Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ 第１５巻、第６９９−７１３頁、１９９８年 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．第２３３巻、第２２７−２３７頁、２００２年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．第９１巻，第３８５−３９４頁，２００３年 Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．第６０巻，第３０１−３０９頁，１９９８年 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．第１８７巻，第５３−６５頁，１９９９年
発明が解決しようとする課題は、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、該ヒアルロン酸修飾物の製造方法、該ヒアルロン酸修飾物と薬物とのコンジュゲート、および該ヒアルロン酸修飾物から得られる、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子化合物、あるいはそれらと高分子のコンジュゲートを封入し、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲルを提供することにある。
ヒアルロン酸修飾物を合成するに際し、一般的にヒアルロン酸修飾物の合成において汎用されている方法に従って、水中での脱水縮合反応によりヒアルロン酸に置換基を導入した場合、ヒアルロン酸のカルボキシ基の修飾率は最大でも約７０モル％程度である上、このヒアルロン酸のカルボキシ基を最大限修飾したヒアルロン酸修飾物であっても実用的な薬物担体としては不充分なものであった。例えば、薬物担体としては大きな分子量を有するヒアルロン酸（分子量５８万ダルトン（Ｄａ））を用い、そのカルボキシ基の７３モル％を修飾したヒアルロン酸修飾物であっても、ラットにおける平均血中滞留時間（ＭＲＴ）は１６時間程度でしかなく、実用的な薬物担体としては不充分であった（本願明細書比較例５−１）。
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、非プロトン性極性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基に置換基をアミド結合で導入することにより得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物が、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長できることを見出し、また、得られたヒアルロン酸修飾物を架橋したヒアルロン酸ゲルが従来知られている方法で架橋したゲルに比べ、同じ架橋性官能基導入率でも非常に長い徐放機能を示すことを見出し、本発明を完成させた。
本発明の１つの側面によれば、非プロトン性極性溶媒中で、式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、それぞれ独立にＣ1-6アルキル基から選択され、またはＲ10およびＲ11、Ｒ12およびＲ13、ならびにＲ14およびＲ15は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になって含窒素ヘテロ環を形成してもよく、環Ｂは置換されていてもよい単環式または縮環式の含窒素ヘテロ環基であり、Ｘ-はアニオンを表す］
で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、５モル％以上の修飾率で置換アミド基に変換する工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。
当該側面の１つの態様において、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基は、少なくとも１以上の官能基を含む。ここで、前記置換基に官能基が複数存在する場合、当該官能基は同一の種類であっても異なる種類であってもよい。また、前記ヒアルロン酸修飾物に含まれる置換アミド基は全てが同一の種類であってもよく、また異なる種類の置換アミド基が前記ヒアルロン酸修飾物に含まれていてもよい。
置換アミド基に含まれる当該官能基は、例えば、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基であってもよく、好ましくは、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、メタクリロイル基およびアクリロイル基である。ここで、当該官能基の種類は、好ましくは１または２種類であり、２種類の場合はその内の１種類が水酸基であるのが好ましい。置換アミド基１個あたりの当該官能基の総数は、例えば１〜１０個、好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜４個である。置換アミド基１個あたりの当該官能基の総数が２個以上の場合、その内の１個の官能基が水酸基以外であり、その余の官能基は、全て水酸基であるか、全ての官能基が水酸基であるのが好ましい。当該置換アミド基の置換基は、例えば、アミノアルキル基（このアミノアルキル基のアルキレン鎖は１個以上、例えば１〜９個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい。以下全ての「アミノアルキル基」について、この記述が付加される。）、アミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は１個以上、例えば１〜９個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい。以下全ての「ヒドロキシアルキル基」について、この記述が付加される。）、ヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシアルキル基、メタクリロイルアミノアルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシアルキル基、アクリロイルアミノアルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基またはアクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基であってもよい。
より具体的には、アミノＣ2-10アルキル基（このアミノＣ2-10アルキル基のアルキレン鎖は１個以上、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい）、アミノ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、アミノ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、ヒドロキシＣ2-10アルキル基（このヒドロキシＣ2-10アルキル基のアルキレン鎖は１個以上、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい）、ヒドロキシ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、メルカプトＣ2-10アルキル基、メルカプト（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、メルカプト（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシＣ2-6アルキル基、メタクリロイルアミノＣ2-6アルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシＣ2-6アルキル基、アクリロイルアミノＣ2-6アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシ（ポリＣ2-10アルキレンオキシ）アルキル基またはアクリロイルオキシ（ポリＣ2-10アルキレンアミノ）アルキル基であってもよい。
ここで、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類は、単一でも複数でもよい。複数の種類とは２〜４種類、好ましくは２または３種類、さらに好ましくは２種類を意味する。カルボキシ基の変換により生じる複数種類の置換アミド基を有する本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法としては、あらかじめアミノ基を有する化合物を複数混合しておき、この混合物とヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基とを縮合させる方法が挙げられる。あるいは、ヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基が全て反応しない程度の量、例えば５〜９５モル％の第１のアミノ基を有する化合物を縮合させ、次いで、残存するカルボキシ基に対し第２のアミノ基を有する化合物を縮合させ、以降必要な回数の同じ操作を繰り返してもよい。カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類が複数である場合は、各々の置換アミド基への変換時の修飾率を合算して、ヒアルロン酸およびその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基の修飾率とする。複数の置換アミド基の組み合わせの具体例としては、置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；メルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基；置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基という組み合わせが挙げられるが、置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基、水酸基で置換されたアミド基とメルカプト基で置換されたアミド基および水酸基で置換されたアミド基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基で置換されたアミド基の組み合わせが好ましく、置換されていてもよいアミノ基で置換されたアミド基と水酸基で置換されたアミド基の組み合わせがさらに好ましい。
より具体的には、以下のｉ）〜ｉｖ）の４つの群について、ｉ）とｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｖ）、ｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｉ）とｉｖ）、ｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）という組み合わせを作成し、それぞれの群から任意の１つの基を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる：
ｉ）アミノアルキル基で置換されたアミド基、アミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基およびアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基；
ｉｉ）ヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基、ヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基およびヒドロキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基；
ｉｉｉ）メルカプトアルキル基で置換されたアミド基、メルカプト（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基およびメルカプト（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基；および
ｉｖ）メタクリロイルオキシアルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルアミノアルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基、アクリロイルオキシアルキル基で置換されたアミド基、アクリロイルアミノアルキル基で置換されたアミド基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基およびアクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基で置換されたアミド基。
中でも、ｉ）とｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）およびｉｉ）とｉｖ）の組み合わせが好ましく、さらに、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基、アミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基およびアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基の組み合わせが好ましく、さらにまた、アミノアルキル基で置換されたアミド基とヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基の組み合わせが特に好ましい。
カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の種類としては、単一であるか２種類であるのが好ましい。
カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基およびその組み合わせとしては、上記ｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）の各群中に記載された置換アミド基単独、並びに、これらと、ヒドロキシアルキル基で置換されたアミド基との組み合わせ、ヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基で置換されたアミド基との組み合わせが好ましい。
ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の例には、式：
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ；
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−ＳＲ7；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−ＳＲ8；
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ16）＝ＣＨ2；
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）q−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ17）＝ＣＨ2；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ18）＝ＣＨ2；または
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ19）＝ＣＨ2
［式中、ｍ、ｌ、ｐ、ｊおよびｑは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、ｎ、ｒ、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１〜２００から選択される整数であり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、Ｒ7は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2）j−ＮＨ2であり、Ｒ8は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｙ3）z−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2であり、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、およびＲ19はそれぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4およびＹ5は、それぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−である］
で表される、化合物が含まれる。
上記式中の−（ＣＨＲ5）m-2−においてｍが４以上の場合のＲ5は水素原子または水酸基からそれぞれ独立に選択されるものであり、−（ＣＨＲ5）m-2−は例えば（ｍ−２）個ある−ＣＨＲ5−が任意の割合および順番で−ＣＨ2−と−ＣＨＯＨ−とが混在している状態を示す。（ｍ−２）個ある−ＣＨＲ5−が任意の割合および順番で−ＣＨ2−と−ＣＨＯＨ−とが混在している状態には、（ｍ−２）個の−ＣＨＲ5−全てが−ＣＨ2−および−ＣＨＯＨ−である場合も含まれる。ｍが２である時は−（ＣＨＲ5）m-2−は単結合を意味する。
上記式中の−（ＣＨＲ6）p-2−においてｐが４以上の場合のＲ6は水素原子または水酸基からそれぞれ独立に選択されるものであり、−（ＣＨＲ6）p-2−は例えば（ｐ−２）個ある−ＣＨＲ6−が任意の割合および順番で−ＣＨ2−と−ＣＨＯＨ−とが混在している状態を示す。（ｐ−２）個ある−ＣＨＲ6−が任意の割合および順番で−ＣＨ2−と−ＣＨＯＨ−とが混在している状態には、（ｐ−２）個の−ＣＨＲ6−全てが−ＣＨ2−および−ＣＨＯＨ−である場合も含まれる。ｐが２である時は−（ＣＨＲ6）p-2−は単結合を意味する。
Ｒ7およびＲ8の定義に含まれる保護基は、メルカプト基の保護が可能な保護基を意味し、その具体例は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。中でも基中に１級アミノ基を有しない基が好ましく、さらにエチルチオ基およびｔ−ブチルチオ基等のＣ1-6アルキルチオ基、並びに２−ニトロフェニルチオ基、２−カルボキシフェニルチオ基等の置換フェニルチオ基が好ましい。さらにまた、２−ピリジルチオ基等のヘテロアリールチオ基も好ましい。
Ｒ7としては、−Ｓ−（ＣＨ2）j−ＮＨ2および２−ピリジルチオ基が好ましく、Ｒ8としては、−Ｓ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｙ3）z−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2および２−ピリジルチオ基が好ましい。
ここで、反応させる化合物の種類は、単一であっても複数であってもよい。反応させる化合物の種類としては、単一であるか２種類であるのが好ましい。
複数の反応させる化合物の組み合わせの具体例としては、以下のｉ）〜ｉｖ）の４つの群について、ｉ）とｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｖ）、ｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｉ）とｉｖ）、ｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）という組み合わせを作成し、それぞれの群から任意の１つの化合物を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる：
ｉ）Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2、およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2；
ｉｉ）Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ、およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ；
ｉｉｉ）Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−ＳＲ7、およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−ＳＲ8；および
ｉｖ）Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ16）＝ＣＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）q−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ17）＝ＣＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ18）＝ＣＨ2、およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ19）＝ＣＨ2。
中でも、ｉ）とｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）およびｉｉ）とｉｖ）の組み合わせが好ましく、さらに、
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2とＨ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2とＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ；
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2とＨ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ；および
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2とＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ
の組み合わせが好ましく、さらにまた、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2とＨ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨの化合物の組み合わせが特に好ましい。
反応させる化合物およびその組み合わせとしては、上記ｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）の各群中に記載された化合物単独、並びに、これらと、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨとの組み合わせ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨとの組み合わせが好ましい。
本発明の別の側面において、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基から選択され、
Ｒａは、水素原子またはＣ1-6アルキル基であり、
Ｒｂは、水素原子、Ｃ1-6アルキル基または基−ＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2であり、
Ａは、−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ−、−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−Ｏ−、−（ＣＨ2）j−Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−Ｓ−、−（ＣＨ2）l−Ｏ−、−（ＣＨ2）q−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨ−または−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−であり、

ここで、ｍ、ｌ、ｐ、ｊおよびｑは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、ｎ、ｒ、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１〜２００から選択される整数であり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、Ｒ20は、水素原子またはメチル基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4およびＹ5は、それぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−である］
で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むものである、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。
ここで、−Ａ−Ｒｂの種類は、単一でも複数でもよく、−Ａ−Ｒｂの種類としては、単一であるか２種類であるのが好ましい。複数の−Ａ−Ｒｂの組み合わせの具体例としては、以下のｉ）〜ｉｖ）の４つの群について、ｉ）とｉｉ）、ｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）、ｉｉ）とｉｖ）、ｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）、ｉ）とｉｉ）とｉｖ）、ｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）、ｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）；ｉ）とｉｉ）とｉｉｉ）とｉｖ）という組み合わせを作成し、それぞれの群から任意の１つの化合物を選ぶことによって形成される組み合わせが挙げられる：
ｉ）−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2と−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2；
ｉｉ）−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨと−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ；
ｉｉｉ）−（ＣＨ2）j−ＳＨとＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−ＳＨ；および
ｉｖ）−（ＣＨ2）l−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2、−（ＣＨ2）q−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2および−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2。
中でも、ｉ）とｉｉ）、ｉｉ）とｉｉｉ）およびｉｉ）とｉｖ）の組み合わせが好ましく、さらに、−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2と−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ、−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2と−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2と−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨおよび−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2と−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨの組み合わせが好ましく、さらにまた、−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2と−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨの−Ａ−Ｒｂの組み合わせが特に好ましい。
−Ａ−Ｒｂおよびその組み合わせとしては、上記ｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）の各群中に記載された−Ａ−Ｒｂの各具体例単独、並びに、これらと、−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨとの組み合わせ、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨとの組み合わせが好ましい。
当該側面の１つの態様において、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含む水溶性ヒアルロン酸修飾物は、例えば、以下の式（ＩＩＩ）：
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲａは、既に定義されたとおりであり、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基から選択され、
Ｒｃは、水素原子またはＣ1-6アルキル基であり、
Ｇは、−（ＣＨ2）m−または−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）ｎ’−であり、
ｍは２〜１０から選択される整数であり、ｎ’は１〜１０から選択される整数である］
で表される化合物であってもよい。
本発明の一つの態様において、修飾率は、例えば３０モル％以上であり、好ましくは５５モル％以上でありうる。また、別の態様において、当該修飾率は、例えば７０モル％以下であり、好ましくは６０モル％以下、より好ましくは３０％以下でありうる。
前記水溶性ヒアルロン酸修飾物は、例えば薬物担体として使用されてもよい。当該修飾物には、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものも含まれる。当該水溶性ヒアルロン酸修飾物の哺乳動物における平均血中滞留時間は、例えば１７時間以上、好ましくは１８時間以上、さらに好ましくは３０時間以上である。
本発明の別の側面によれば、式（Ｉ）の−Ａ−Ｒｂの末端がＣ1-6アルキル基で置換されていてもよいアミノ基である水溶性ヒアルロン酸修飾物において、当該ヒアルロン酸修飾物のアミノ基をジカルボン酸でアミド化し、置換基の末端にカルボキシ基を導入する工程をさらに含む、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。ここでジカルボン酸は特に限定されないが、例えばシュウ酸、Ｃ1-10アルキレンジカルボン酸またはＣ1-10アルケニレンジカルボン酸などを用いることができ、好ましいジカルボン酸は、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸またはアジピン酸である。当該アミド化は特に限定されないが、例えば前記ヒアルロン酸修飾物のアミノ基とジカルボン酸無水物を反応させることにより行うことができる。
本発明の別の側面によれば、上記の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物が提供される。当該水溶性ヒアルロン酸修飾物は特に限定されないが、ヒアルロン酸をその構成ユニットの２糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和２糖分解物を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率が３０％以下となるものが好ましい。
本発明の別の側面によれば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体が提供される。当該薬物担体は、特に限定はされないが、例えば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体であってもよい。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物と薬物とからなる水溶性ヒアルロン酸修飾物−薬物コンジュゲートが提供される。
さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物を架橋することで得られるヒアルロン酸ゲルが提供される。当該ヒアルロン酸ゲルは、例えば、薬物の封入に使用されうる。ここで、封入できる薬物は、特に限定されないが、例えば、高分子と薬物とのコンジュゲートであってもよい。このヒアルロン酸ゲルを乾燥させることで、封入する薬物の徐放性をさらに高めることもできる。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のヒアルロン酸ゲルを含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む、医療用デバイスが提供される。当該医療用デバイスは、特に限定されないが、例えば上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施したものであってもよい。
さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物からなるヒアルロン酸ゲル微粒子の製造方法であって、
ａ）当該ヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製する工程；
ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法が提供される。ここで、前記工程ｂ）は、特に限定はされないが、例えば前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程であってもよい。
さらに本発明の別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物からヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、
ａ）ヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；
ｂ）得られた乾燥物を凍結する工程；および
ｃ）得られた凍結物を粉砕する工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法が提供される。ここで、ヒアルロン酸ゲルは、本発明のヒアルロン酸修飾物を架橋することにより得られるものである。
また、得られる微粒子の平均粒子径は、特に限定はされないが、例えば０．０１μｍ〜１５０μｍ、好ましくは０．１μｍ〜５０μｍである。ここで、得られる微粒子は、例えば薬物担体、特に薬物徐放担体であってもよい。
当該側面の１つの態様において、上記製造方法の架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されていてもよい。
本発明の別の側面によれば、上記方法で製造されたヒアルロン酸ゲル微粒子、および当該ヒアルロン酸ゲル微粒子を含む医薬組成物が提供される。
本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いることで、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長することが可能である。従って、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を担体に用い、薬物をコンジュゲート化すること、あるいは、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を薬物を含有した微粒子，ゲルなどの少なくとも表面近傍に局在化させることで、従来の技術では達成できなかった、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。
また、本発明のヒアルロン酸修飾物を、架橋し、ゲル化することにより、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、核酸あるいはそれらと高分子のコンジュゲート等の薬物を封入、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲル徐放製剤の提供を可能にする。
本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後のＧＰＣデータの一例である。 比較例の水溶性ヒアルロン酸修飾物およびヒアルロン酸をヒアルロニダーゼ処理した後のＧＰＣデータの一例であり、縦軸方向のスケールは図１と同一である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 ＣＤＩを用いた導入（比較例１−１４）における、反応前後でのＧＰＣデータの一例である。 ＢＯＰの添加量によるジアミン化合物の導入率の制御に関するＮＭＲデータの一例である（実施例２）。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基を変換しカルボキシ基を導入した水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である（実施例３−２）。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のアミノ基を変換しカルボキシ基を導入した水溶性ヒアルロン酸修飾物のヒアルロニダーゼ処理後のＧＰＣデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＧＰＣチャートの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後のＧＰＣデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をヒアルロニダーゼ処理した後のＧＰＣデータの一例である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である 分子量の異なる蛍光標識ＨＡ修飾物ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣおよびＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣの血中濃度推移を示した図である。 本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 分子量２００ｋＤａのＨＡから合成した、アミノ基修飾率の異なる蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を示した図である。 ＨＡ修飾物のアミノ基導入率と平均血中滞留時間（ＭＲＴ）との相関およびアミノ基導入率とヒアルロニダーゼにより分解される２糖の分率との相関を示した図である。 分子量２００ｋＤａ ＨＡから合成した置換アミド基上の置換基が異なる蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を示した図である。 本発明のＡＥＭＡ基導入ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 本発明のＡＰＭＡ基導入ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 本発明のメタクリロイル基導入ヒアルロン酸修飾物のＮＭＲデータの一例である。 ＨＡゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＨＺの放出性を示した図である。 蛍光標識ＨＡ−ＨＺを封入したＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル微粒子の顕微鏡写真の一例である。 蛍光標識ＨＡ−ＡＭを封入したＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル微粒子の顕微鏡写真の一例である。 ＨＡゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＡＭの放出性を示した図である。 ラットにＨＡ−ＦＩＴＣ標識ＦａｂコンジュゲートおよびＦＩＴＣ標識Ｆａｂを単回静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。 ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートをラットに静脈内投与したときの血漿中濃度推移を示した図である。
発明の実施の形態
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明は、非プロトン性極性溶媒中で、特定の縮合剤を用い、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基に置換基をアミド結合で下限が５モル％以上導入する、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法に関する。
溶媒は極性有機溶媒でなければならず、特に非プロトン性極性溶媒が好ましい。非プロトン性極性溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水を溶媒に使用した場合には、何れの縮合剤を用いても実用上十分な血中滞留性を付与するために必要な修飾率が得られず、また、これまでにない長期間の薬物徐放を実現する、より均一的な架橋性官能基の導入ができない。使用可能な非プロトン性極性溶媒は、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」とも称す）、ジメチルアセトアミド（以下、「ＤＭＡｃ」とも称す）、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称す）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（以下、「ＤＭＩ」とも称す）、スルホラン（以下、「ＳＦ」とも称す）、Ｎ−メチルピロリドン（以下、「ＮＭＰ」とも称す）またはそれらの２種以上の混合溶媒等が挙げられる。好ましくは、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンまたはそれらの２種以上の混合溶媒であり、特に好ましくは、ジメチルスルホキシドである。
本発明の製造方法には、式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、環ＢおよびＸ-は、既に定義したとおりである］
で示される縮合剤が用いられる。ここで、環Ｂは、酸性プロトンを有さない含窒素へテロ環基であれば特に限定されず、Ｃ1-6アルキル基またはハロゲン原子などの置換基により置換されていてもよい。環Ｂには、例えばピロリジン−２，５−ジオン−１−イル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、ベンゾトリアゾール−１−イルなどが含まれる。Ｘ-には、例えばフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなどのハロゲン化物イオン、ＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、ＰＦ6 -などが含まれる。
Ｒ10およびＲ11、Ｒ12およびＲ13、ならびにＲ14およびＲ15が、それらが結合する窒素原子と一緒になって形成する含窒素ヘテロ環としては、５〜７員飽和含窒素ヘテロ環などが好ましく、具体的にはピロリジン、ピペリジン、ホモピペリジンなどが含まれる。
好ましくは、当該縮合剤は環Ｂがベンゾトリアゾール−１−イルであるＢＯＰ系縮合剤である。好ましいＢＯＰ系縮合剤としては、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＢＯＰ」とも称す）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（以下、「ＰｙＢＯＰ」とも称す）、およびこれらの混合物が挙げられる。ＢＯＰ系縮合剤は単独でまたは適宜組み合わせて利用することができる。
なお、上記以外の他の縮合剤、例えばＮ，Ｎ'−カルボニルジイミダゾール（以下、「ＣＤＩ」とも称す）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」とも称す）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」とも称す）、ＥＤＣ／３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（以下、「ＨＯＤｈｂｔ」とも称す）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（以下、「ＥＥＤＱ」とも称す）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロリド ｎ−水和物（以下、「ＤＭＴ−ＭＭ」とも称す）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（以下、「ＴＢＴＵ」とも称す）等では、実用上十分な血中滞留性（例えば平均血中滞留時間（以下、「ＭＲＴ」とも称す）で１８時間以上）を有するヒアルロン酸修飾物は得られず、またはヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を付与するために必要な高い導入率が得られない。またさらに、縮合剤としてＣＤＩを用いた場合は、縮合反応中にＨＡ分子量が低下してしまうため実用的ではない。さらにまた、これまでにない長期間の薬物徐放を実現する、より均一的な官能基の導入ができない。
本発明に用いられるヒアルロン酸（ＨＡ）はＨＡ骨格を有していれば特に限定されず、ＨＡの一部を誘導体化したＨＡ誘導体や、酵素、熱分解等で低分子化したＨＡ、ＨＡ及びＨＡ誘導体の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、等）なども含まれる。本発明に用いられるＨＡは、どのようにして得られたＨＡでもよく、動物組織から抽出されたＨＡ、発酵法で得られたＨＡ、化学合成で得られたＨＡなど、その由来は限定されない。また、ＨＡを有機溶媒に可溶化する為に、テトラブチルアンモニウム塩等の疎水性の高い対イオンにイオン交換したものを用いてもよい。
本発明の水溶性ＨＡ修飾物において、置換アミド基に変換されているカルボキシ基の割合は、カルボキシ基修飾率として以下の式：
により算出される。本発明の水溶性ＨＡ修飾物のカルボキシ基修飾率の下限は５％以上であればよいが、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、修飾率の下限は３０モル％以上であることが好ましく、５０モル％以上であることがさらに好ましく、５５モル％以上であることがさらに好ましく、６０モル％以上であることがさらに好ましい。また、修飾率の上限は１００モル％以下であればよい。例えば、タンパク質およびペプチドと結合させてコンジュゲートを形成するために用いられる水溶性ヒアルロン酸修飾物の修飾率の具体例としては、３０〜１００モル％、５０〜１００モル％および６０〜１００モル％が挙げられる。一方、長時間の薬物徐放を実現するためのゲルとなるヒアルロン酸修飾物としての観点では、修飾率の下限は、５％モル以上が好ましく、１０％モル以上がさらに好ましい。また、修飾率の上限は、皮下での分解性を維持するためには、７０％モル以下が好ましく、６０％モル以下がさらに好ましく、中でも４０モル％以下がさらに好ましく、３０モル％以下がさらにまた好ましい。例えば、タンパク質およびペプチドを封入するためのハイドロゲルの基材として用いられる水溶性ヒアルロン酸修飾物の修飾率の範囲の具体例としては、５〜７０モル％、５〜６０モル％、５〜４０％、５〜３０モル％、１０〜７０モル％、１０〜６０モル％、１０〜４０％および１０〜３０モル％が挙げられる。
ここで、カルボキシ基修飾率は、プロトンＮＭＲで定量することができる。具体的には、プロトンＮＭＲで得られるアミノ化（以下、「ＡＭ化」とも称す）またはメタクリロイル化（以下、「ＭＡ化」とも称す）されたＨＡ誘導体中のアミノ化合物の量と、ＨＡ由来のピークとの比較から求めることができる。例えば、エチレンジアミン（以下、「ＥＤＡ」とも称す）でアミノ基を導入したヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）のプロトンＮＭＲから得られるアミン化合物由来のピーク（２．９〜３．１ｐｐｍ：測定溶媒Ｄ2Ｏ）と、ＨＡ由来のピーク（１．８〜１．９ｐｐｍ：測定溶媒Ｄ2Ｏ）の比、またはアミノエチルメタクリレート（以下、「ＡＥＭＡ」とも称す）でメタクリロイル基を導入したＨＡ−ＡＥＭＡのプロトンＮＭＲから得られるメタクリロイル化合物由来のピーク（５．５〜６．１、１．８ｐｐｍ）と、ＨＡ由来のピーク（１．８〜１．９ｐｐｍ）の比を実測する。
また、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明の水溶性ＨＡ修飾物の分子量も、その体内動態を左右する。本発明の水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間はＨＡの分子量にも依存し、分子量の大きなＨＡ程その血中滞留時間は長い。従って、水溶性ＨＡ修飾物の分子量と水溶性ＨＡ修飾物のカルボキシ基の修飾率を変化させることで、水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間を制御することが可能である。本発明に用いられる原料ＨＡの分子量は特に制限されないが、余りに低分子量では得られた水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間が短くなる。逆に、余りに高分子量になると得られた水溶性ＨＡ修飾物の粘度が非常に高くなり、高濃度での投与が難しくなる。また、本発明の水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間は分子量が一定以上大きくなるとほとんど変化しなくなるので、通常、原料ＨＡの分子量は粘度平均分子量で５０００ダルトン〜１００万ダルトンであることが好ましく、１万ダルトン〜３０万ダルトンであることがより好ましく、８万ダルトン〜３０万ダルトンであることがさらに好ましい。
一方、長時間の薬物徐放を実現するためのゲルの基材としてヒアルロン酸修飾物が使用される場合は、本発明に用いられる原料ＨＡの分子量は特に限定されず、いかなる分子量の原料ＨＡでも使用することが可能であるが、例えば５０００〜３５０万ダルトン、好ましくは１万〜２００万ダルトン、さらに好ましくは２万〜３０万ダルトンのＨＡを使用してもよい。
なお、ＨＡ重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４−０６−１５３３１０−Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。
本発明の製造方法により得られる水溶性ＨＡ修飾物の血中滞留時間は、原料ＨＡの血中滞留時間に比べて延長されているものであることが好ましい。ここで、血中滞留時間は、平均血中滞留時間（例えば、本明細書実施例５−３に記載のＭＲＴとして算出される）、血中半減期（以下、「ｔ１／２」とも称す）、血中クリアランス（以下、「Ｃｌ」とも称す）などの公知の代表的なパラメーターを利用して適宜比較することができる。本発明製造方法により得られる水溶性ＨＡ修飾物のヒトを含む哺乳動物における血中滞留時間は、実用面から平均血中滞留時間（以下、「ＭＲＴ」とも称す）の下限が１８時間以上のものであることが好ましく、３０時間以上のものがより好ましい。上限は、薬物濃度制御の観点から、１ヶ月以下、好ましくは２週間以下である。
また、本発明の別の側面によれば、本発明の製造方法により得られる水溶性ＨＡ修飾物は、原料ＨＡに比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものであることが好ましい。ここで、「ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、原料ＨＡと本発明の水溶性ＨＡ修飾物をそれぞれヒアルロニダーゼにより酵素分解させた際に、原料ＨＡよりも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、一定時間ヒアルロニダーゼ処理した際に、原料ＨＡでは観察される２糖分解ピークが観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する）と判定することができる。なお、ＨＡの分解速度や分解状態はゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）などの常法を用いて観察することができる。
本発明において、グルクロン酸部分のカルボキシ基を変換して導入されるアミド基の置換基としては、当該変換後に得られるＨＡ修飾物が水溶性であれば特に制限されない。本発明のＨＡ修飾物が有する置換基はどのような置換基であってもよいが、得られたＨＡ修飾物の水溶性を保持するために、親水性の置換基または疎水性の低い置換基を導入することが好ましい。
上記のアミド化の際にヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の具体例は、一分子中に１種類かつ１個以上の官能基を持ち、窒素原子上に置換基を有していてもよいアミノ基を有するアミン類である。ここで、窒素原子上の置換基を有していてもよいアミノ基を除いた官能基とは置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、アクリロイル基から選択される。その官能基の種類は好ましくは１つおよび２種類である。官能基が１種類かつ１個場合、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合する化合物は、アルキレンジアミン化合物もしくはアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキルアミン化合物等の２つのアミノ基を有する化合物（以下、「ジアミン化合物」とも称す）；アミノ基と水酸基を有する化合物；アミノ基とメルカプト基を有する化合物；アミノ酸、ペプチド等のアミノ基とカルボキシ基を有する化合物；アミノ基とアルデヒド基を有する化合物、アミノ基とメタクリロイル基を有する化合物；または、アミノ基とアクリロイル基を有する化合物から選択される。上記の化合物はアミノ基に置換基を有していてもよく、当該置換基には例えばＣ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルキルカルボニル基などが含まれる。
なお、これらの化合物においては、化合物中の任意の炭素原子が、例えば１〜９個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい。ただし、同一炭素原子が複数の水酸基で置換されることや、既に酸素原子、窒素原子等のヘテロ原子が結合している炭素原子がさらに水酸基で置換されていることはない。
前述の通り、アミド化の際にヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の種類は単一であっても、複数であってもよい。すなわち、単品であっても混合品であってもよく、単品を段階的に反応させていってもよい。
また、これらの化合物で、ヒアルロン酸のカルボキシ基を変換して生じる置換アミド基の置換基としては、アミノアルキル基（このアミノアルキル基のアルキレン鎖は１個以上、例えば１〜９個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい）、アミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は１個以上、例えば１〜９個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜３個の水酸基で置換されていてもよい）、ヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシアルキル基、メタクリロイルアミノアルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシアルキル基、アクリロイルアミノアルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基またはアクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基等が挙げられる。
特定の実施態様において、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にアミド結合する化合物の具体例は、
式：Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2で表されるジアミン化合物；
式：Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨおよびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨで表されるアミノ基と水酸基を有する化合物；
式：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−ＳＲ7およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−ＳＲ8で表されるアミノ基とメルカプト基を有する化合物；ならびに
式：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ16）＝ＣＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）q−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ17）＝ＣＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ18）＝ＣＨ2およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ19）＝ＣＨ2で表されるアミノ基とメタクリロイル基もしくはアクリロイル基を有する化合物であり、上記式中において、ｍ、ｌ、ｐ、ｊおよびｑは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、ｎ、ｒ、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１〜２００から選択される整数であり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素原子または水酸基であり、かつ、（ｍ−２）個ある−ＣＨＲ5−および（ｐ−２）個ある−ＣＨＲ6−が任意の割合および順番で−ＣＨ2−と−ＣＨＯＨ−とが混在している状態を示しており、Ｒ7は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2）j−ＮＨ2であり、Ｒ8は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｙ3）z−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2であり、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、およびＲ19はそれぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4およびＹ5は、それぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−である］である。
ここで、分子中でＲ5およびＲ6が水酸基であるＣＨＲ5およびＣＨＲ6の個数は、それぞれ０〜８であるが、好ましくは０〜３、さらに好ましくは０および１である。Ｒ5およびＲ6が水酸基であるＣＨＲ5およびＣＨＲ6の個数を調節することで、本発明の水溶性ＨＡ集修飾物の、水に対する溶解度を調節することができる。Ｒ5がすべて水素原子の場合、ｍとしては２〜６が好ましく、その具体例として２および６が挙げられる。Ｒ5の１つが水酸基である場合、ｍの具体例としては３が挙げられる。Ｙ1が酸素原子の場合、ｎの具体例としては２が挙げられる。Ｙ1が−ＮＨ−の場合、ｎの具体例としては１が挙げられる。ｌの具体例としては１が挙げられる。ｐ、ｑの具体例としては３が挙げられる。ｒの具体例としては１および３が挙げられる。
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2の好ましい具体例としては、例えば、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）5−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）7−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）8−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）9−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）10−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2−ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）3−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）3−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）3−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2およびＨ2Ｎ−（ＣＨ2）5−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2が挙げられ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＮＨ2、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2およびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＮＨ2が好ましい。
Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨの好ましい具体例としては、例えば、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）4−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）5−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）6−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）7−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）8−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）9−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）10−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）3−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2−ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）3−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）3−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）3−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−（ＣＨＯＨ）2−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）3−（ＣＨ2）2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＯＨ）2−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）6−ＯＨおよびＨ2Ｎ−（ＣＨ2）5−ＣＨＯＨ−（ＣＨ2）4−ＯＨが挙げられ、Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）3−ＯＨおよびＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−ＯＨが好ましい。
なお、これらの化合物は例えばシグマ−アルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよい。
ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物は、担持される薬物がタンパク質およびペプチドの時、薬物を本発明の水溶性ＨＡ修飾物から得られるゲル中に封入する場合は、アミノ基とメタクリロイル基を有する化合物、アミノ基とアクリロイル基を有する化合物、アミノ基とメルカプト基を有する化合物、アミノ基とメタクリロイル基を有する化合物およびアミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、アミノ基とアクリロイル基を有する化合物およびアミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、並びにアミノ基とメルカプト基を有する化合物およびアミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせが好ましい。また、薬物と本発明の水溶性ＨＡ修飾物とをコンジュゲートにする場合は、ジアミン化合物、アミノ基とメルカプト基を有する化合物、ジアミン化合物およびアミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせ、並びにアミノ基とメルカプト基を有する化合物およびアミノ基と水酸基を有する化合物の組み合わせが好ましい。
アミノ基と水酸基を有する化合物は、反応性官能基である、アミノ基、メルカプト基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基のカルボキシ基への導入率制御に用いることができる。
本発明において「アルキル基」とは、炭素数１以上の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば以下に定義する「Ｃ1-6アルキル基」などである。
本発明において「Ｃ1-6アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ1-4アルキル基」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチルなどが含まれる。
本発明において「Ｃ1-6アルキルカルボニル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を有するアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、ヘキサノイルなどが含まれる。
本発明において「アルキレンオキシ基」とは、炭素数が１以上のアルキレン鎖を含み、炭素原子と酸素原子で連結する２価の基であり、例えば以下に定義する「Ｃ2-10アルキレンオキシ基」などである。
「Ｃ2-10アルキレンオキシ基」とは、炭素数が２〜１０のアルキレン鎖を含む炭素原子と酸素原子で連結する２価の基であり、例えばエチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、ブチレンオキシ基などが含まれる。
本発明において導入される置換基の導入量は、縮合剤のＨＡに対する添加量で調節することができる。
また、本発明の水溶性ＨＡ修飾物の電荷に関して、導入された置換基がカチオン性であった場合、トータルの電荷がプラス側に振れ、血中滞留時間の短縮に繋がるため、本発明の水溶性ＨＡ修飾物を薬物とのコンジュゲートとして血中滞留時間を延長する場合には修飾電荷はノニオン性か、アニオン性であることが好ましい。
本発明の水溶性ＨＡ修飾物の調製方法では、例えば、テトラブチルアンモニウム(ＴＢＡ)塩化したＨＡをＤＭＳＯに溶解し、分子の両末端にアミノ基を１つずつ有するジアミノ系化合物を添加、ＨＡのカルボキシ基にＢＯＰ系縮合剤で縮合させ、アミノ基を導入したＨＡ（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）を合成できる。
また、本発明の水溶性ＨＡ修飾物のうち、カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、置換されていてもよいアミノ基である場合、この置換されていてもよいアミノ基をさらに修飾することで、メルカプト基、アクリロイル基、メタクリル基などの官能基を導入できる。この際、残存したアミノ基は、例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで処理するか、マレイン酸、グルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシ基に戻してトータル電荷をアニオン性にした方が血中滞留時間の延長には好ましい。ここで用いられる縮合剤は、特に限定されず、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、Ｎ，Ｎ'−カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＥＤＣ／３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロリド ｎ−水和物、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレートならびにこれらの混合物などを使用することができる。得られるヒアルロン酸修飾物のトータル電荷の観点からは、アミノ酸またはペプチドなどのアミノ基を、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基と反応させた化合物、あるいはａ）アミノ基；ｂ）メルカプト基、アクリロイル基およびメタクリル基等の官能基から選択される官能基というａ）とｂ）との両方を有するアミン類を、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシ基と反応させた化合物なども好ましい。
また、本発明は、上述した製造方法により得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物自体にも関する。
この水溶性ヒアルロン酸修飾物は、薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、好ましくは、ヒアルロン酸をその構成ユニットの２糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和２糖分解物（例えば、式ＩＶの化合物を含む）：
を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率の上限が３０％以下であるという特徴を有する。このピークエリアの分率の上限は、好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１３％以下である。また、下限は０％以上であればよい。当該測定は、通常の高速液体クロマトグラフィーを用いて当該技術分野において通常用いられる方法により行うことができ、例えばＧＰＣカラム（例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ １０／３０およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（いずれもアマシャムバイオサイエンス株式会社製）など）を使用することができる。また使用する溶離液は特には限定されないが、例えばＰＢＳ(例えば、シグマ−アルドリッチ社製Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ２錠をとり、精製水４００ｍＬに溶解させて得たもの)を使用することができる。
ここで、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率は、以下の式：
で求めることができる。また、ヒアルロニダーゼとしては、例えばヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）等を使用することができる。
薬物とのコンジュゲートとした時に実用的な血中滞留時間を得るためのヒアルロン酸修飾物としての観点では、本発明の水溶性ＨＡ修飾物は、特に限定はされないが、例えば１０ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬの水に対する溶解度を有する。実際に治療を目的として投与される時のＨＡ修飾物の濃度は１０〜５００ｍｇ/ｍＬ程度であるので、本発明の水溶性ＨＡ修飾物の溶解度は、好ましくは室温において生理食塩水に対して１０ｍｇ/ｍＬ以上である。
本発明の水溶性ＨＡ修飾物は、薬物担体として用いることができる。担持される薬物は特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチドおよび核酸等を用いることが可能である。また、薬物を担持させるにおいては、公知の各種の方法を用いることができ、薬物を本発明の水溶性ＨＡ修飾物から得られるゲル中に封入してもよく、薬物と本発明の水溶性ＨＡ修飾物とをコンジュゲートにしてもよい。
本発明の水溶性ＨＡ修飾物と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーの、薬物とのコンジュゲート化で使用されている方法を用いることができる。例えば、水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、薬物のカルボキシ基との脱水縮合反応；薬物のアミノ基と、水溶性ＨＡ修飾物のカルボキシ基との脱水縮合反応；
水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入された薬物との反応；薬物のアミノ基と、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどとして修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物との反応；
水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入された薬物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；薬物のアミノ基と、アルデヒドおよびケトンなどのカルボニル化物として修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；
水溶性ＨＡ修飾物に導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリール化物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入された薬物との反応；薬物に導入したメルカプト基と、マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリール化物、ビニルスルホンおよびメルカプト化物などとして修飾基が導入された水溶性ＨＡ修飾物との反応；
水溶性ＨＡ修飾物に導入したアビジンと、薬物に導入したビオチンとの結合；薬物に導入したアビジンと、水溶性ＨＡ修飾物に導入したビオチンとの結合；
などを利用することができる。水溶性ＨＡ修飾物あるいは薬物へ、これらの修飾基（アビジンおよびビオチン由来の基を含む）を導入するには、これらの修飾基およびカルボキシ基（このカルボキシ基はＮＨＳエステルなどの活性エステルとなっていてもよい）から任意に選ばれる２つ以上、好ましくは２つの基を分子内に有する化合物が用いられ、この化合物においては、これらの基以外の分子内の構造は、コンジュゲートを調製するまでの間に不都合な反応が進行しないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。
具体的には、置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む本発明の水溶性ＨＡ修飾物を合成し、ここで、アミノ基の一部をＮ−スクシンイミジル ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−［２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ］ｐｒｏｐｉｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）と反応させ、メルカプト基を導入したＨＡ（以下、「ＨＡ−ＳＨ」とも称す）を調製する。
この際、余剰のアミノ基は、例えば無水コハク酸等で処理、カルボキシ基に戻してトータル電荷をアニオン性にした方が好ましい。一方で、タンパク質にメルカプト基と特異的に反応する修飾基を導入して、マレイミド、ビニルスルホンなどとする。これをＨＡ−ＳＨと反応させコンジュゲートを調製してもよい。また逆に、例えば、置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む本発明の水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基をマレイミドブチリロキシスルホサクシンイミドと反応させてマレイミド基が導入された水溶性ＨＡ修飾物（以下、「ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ」とも称する）とし、さらに、メルカプト基含有タンパク質またはペプチド等の薬物と反応させコンジュゲートを調製してもよい。あるいは、置換アミド基の置換基が、アミノ基を含む本発明の水溶性ＨＡ修飾物のアミノ基の一部をＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ（同仁化学社、ＰＩＥＲＣＥ（ピアス）社等により販売）等のマレイミド基含有化合物と反応させＨＡ−ＡＭ−ＭＩとし、余剰のＡＭ基は、例えば無水コハク酸等で処理する。一方でタンパク質にシステインを導入するか、またはメルカプト基を有するリンカーを反応させておき、これをＨＡ−ＡＭ−ＭＩと反応させコンジュゲートを調製してもよい。
ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保つためには、薬物と水溶性ＨＡ修飾物主鎖間のスペーサーの長さを調節すること、または部位特異的なコンジュゲートとすることもできる。
また、本発明は、上記の水溶性ヒアルロン酸修飾物を架橋することで得られるヒアルロン酸ゲルにも関する。本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いた薬物徐放ゲルは、例えば、薬物共存下の溶液中でメタクリロイル基またはアクリロイル基を導入したヒアルロン酸誘導体をメルカプト基含有化合物で架橋することにより、薬物を封入できる。ここで架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。
架橋時のｐＨは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに不飽和基とメルカプト基の選択的反応を優先させ、タンパク質またはペプチド含有アミノ基との反応を防ぐｐＨが好ましい。そのようなｐＨは当業者が適宜選択することが可能であるが、例えばｐＨ６．０〜９．５、好ましくはｐＨ７.０〜９．５である。
ＨＡにメタクリロイル基を導入した本発明の水溶性ＨＡ修飾物に用いられる架橋剤としては、不飽和結合と求核付加反応で反応するメルカプト基を２つ以上同一分子に含む化合物が用いられる。例えば、ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」とも称す）、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システインを２つ以上含むペプチド等が挙げられる。
薬物を共存させる溶液における溶媒としては、本発明のＨＡ修飾物および封入する薬物が溶解し、かつ封入する薬物が変性しない溶媒であればよく、例えば、水、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコールおよびアセトニトリルならびにこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくは水とエタノールとの混合溶媒および水等が挙げられる。
メルカプト基の不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基：不飽和結合を有する基＝３：１〜１：３が好ましい。更に好ましくは、２：１〜１：２である。
また、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為にトリエタノールアミン等の塩基性化合物を添加することが好ましい。この際好ましい濃度としては、１０〜２０μＬ／ｍＬである。
さらに、本発明は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるヒアルロン酸ゲル微粒子にも関する。本発明のヒアルロン酸修飾物を用いて、架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法としては、
ａ）本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製する工程；
ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を進行させる工程を含む製造方法が好ましい。当該製造方法の工程ａ）における希薄溶液は、架橋反応に必要な基質および試薬などを含む溶液であるが溶媒により高度に希釈されているために反応が進行しないかまたは進行が極めて遅い溶液であり、その濃度は特に限定はされないが、例えば０．１％〜５％、好ましくは０．２％〜３％である。また本発明に用いる溶媒としては、当該技術分野において通常用いられている溶媒またはそれらの混合物を用いることができ、特に限定はされないが、例えば水、ＤＭＳＯ、エタノール、Ｎ−メチルピロリドン、超臨界炭酸液などである。この製造方法で得られた架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子は、好ましくは、インジェクタブルなものである。
上記製造方法の工程ｂ）の希薄溶液を微粒子状の液滴に分散する方法には、当該技術分野で通常用いられる方法であれば特に限定されないが、当該希薄溶液を噴霧する方法、当該希薄溶液を別の液体と混合することによりエマルジョンを形成する方法などが含まれ、当該希薄溶液を噴霧する方法が好ましい。ここで微粒子状の液滴は、特に限定されないが例えば０．０１μｍ〜１．５ｍｍ、好ましくは０．１μｍ〜５００μｍの平均粒子径を有することができる。
上記製造方法の工程ｃ）における溶液の濃縮の方法は、架橋反応の進行をより早める濃度まで濃縮することができる手段であれば特に限定されない。また当該濃縮には、例えば、当該架橋反応が固相反応として進行するような溶媒が完全に除去された状態も含まれる。
本発明の架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子は、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物を含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋することにより製造することができる。また、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋反応を起こさせ、架橋反応と乾燥を同時に行うことで薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子とすることを特徴とする。
さらに具体的には、本発明の架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子の製造方法としては、微粒子の溶媒留去による乾燥と架橋反応が同時に進行する製造方法であればよい。例えば、液体を噴霧乾燥するスプレードライヤーを用い、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む溶液を噴霧乾燥することで、濃縮乾燥中にヒアルロン酸修飾物を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ればよい。スプレードライを用いる場合は、薬物の変性を防ぐために、乾燥温度は１００℃以下であることが好ましい。
このようにして、架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を基材としたヒアルロン酸ゲル微粒子を得ることができる。
あるいは、架橋反応可能なＨＡ修飾物（テトラブチルアンモニウム塩）と薬物をＤＭＳＯなどの極性有機溶媒に溶かしておき、二酸化炭素等の超臨界液体の添加により極性有機溶媒を抽出しヒアルロン酸修飾物を濃縮することにより、ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を生じさせて微粒子を得ても良い。これらの微粒子化方法を用いる時は、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０等の界面活性剤を添加（１％〜２％程度）することで、生成された微粒子の回収率を上げることができる。当該製造方法においては、濃縮前のヒアルロン酸修飾物の溶液は架橋反応を起こさない程度の濃度である必要があり、具体的にはヒアルロン酸修飾物の濃度は０．１％〜５％が好ましい。
また、別法としては、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸修飾物と薬物とを含む水溶液を脱水性を有する液体（例えば、分子量４００ダルトンのポリエチレングリコール等）の中にエマルジョン化することで、脱水濃縮中にヒアルロン酸を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ることもできる。この方法を用いる時は、封入効率を上げるため、カチオン性かノニオン性の薬物が好ましい。
また、微粒子形成後に熱処理をすることでさらに含水率を低下させ、架橋反応を完全に終了させたほうが好ましい。この場合、架橋密度も上がり、徐放期間の延長も期待できる。
また、
ａ）本発明のヒアルロン酸修飾物を架橋し、ヒアルロン酸ゲルを得る工程；
ｂ）得られたヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；
ｃ）得られた乾燥物を凍結する工程；および
ｄ）得られた凍結物を粉砕する工程を含む製造方法により、架橋ヒアルロン酸ゲル微粒子を製造することができる。
当該製造方法の工程ａ）における架橋時に薬物を封入することにより、薬物担持ゲルを得ることができ、当該ゲルを使用することにより、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持ゲル微粒子を得ることもできる。
当該製造方法の工程ｂ）における乾燥方法としては、例えば通風乾燥、日光照射による乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧下での乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられ、ゲル中に封入する薬物の性質などを考慮して適宜選択される。風速、乾燥時間、温度、圧力は、本発明のヒアルロン酸ゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択されるが、恒温槽中での乾燥の場合、温度は、３０〜６０℃が好ましく、３０〜４５℃がさらに好ましい。工程ｂ）により、工程ａ）で得られたヒアルロン酸ゲルの徐放性をさらに高めることもできる。
当該製造方法の工程ｃ）における凍結方法は、乾燥されたヒアルロン酸ゲルの凍結が達成できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ドライアイス、液体窒素、液体酸素、液体ヘリウムと接触させる方法を挙げることができ、また、これらで冷却された金属と接触させてもよい。接触させる時間は特には限定されないが、３〜３０分間が好ましく、１０〜１５分間がさらに好ましい。
当該製造方法の工程ｄ）における粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）およびインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、およびＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ−Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミルおよびリンレックスミルが好ましい。
さらに、工程ｃ）の凍結と工程ｄ）の粉砕の工程を、２〜１０回、好ましくは３〜５回繰り返してもよい。
これらの方法に従って得られたヒアルロン酸ゲル微粒子の微粒子径は、用途によって最適化すればよいが、インジェクタブルにするために通常、０．０１μｍ〜１５０μｍが好ましい。経皮投与の時は、０．０１μｍ〜１５０μｍが好ましく、経鼻、経肺投与の時は、０．０１μｍ〜５μｍが吸入効率の点で好ましく、静注投与の時には、０．０１μｍ〜０．２μｍ程度が血中動態の点から好ましい。
また、本発明の水溶性ＨＡ修飾物は薬物とのコンジュゲート以外にも、高分子ミセル、リポソーム、ナノ微粒子等の微粒子性薬物キャリアーにおいて、その血中滞留時間の延長を目的として、表面修飾に用いることもできる。ここで表面修飾とは他の合成高分子、天然高分子、脂質、金属、セラミックスあるいはそれらの複合体などからなる物質の表面に、本発明の水溶性ＨＡ修飾物を化学的に結合または物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合または物理的に吸着させた本発明の水溶性ＨＡ修飾物をさらに架橋することで、当該物質の最表面に本発明の水溶性ＨＡ修飾物あるいはその架橋体が存在している状態を指す。例えば、本発明の水溶性ＨＡ修飾物とＰＬＧＡ等の疎水性高分子を結合させた化合物を含む高分子ミセルや、本発明の水溶性ＨＡ修飾物をリン脂質に結合させたリポソーム、あるいは、本発明の水溶性ＨＡ修飾物に疎水性分子を結合させ、疎水性相互作用で疎水性微粒子表面をコートした微粒子、あるいは前記コート後さらに架橋した微粒子薬物担体等が挙げられる。
また、本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子は、本発明のヒアルロン酸修飾物と同様、薬物担体としても用いることができる。ここで、本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子からなる薬物担体とは、疾患の治療または診断のために用いられる微粒子状の薬物担体を意味する。当該担体の粒径は特に限定はされないが、例えば１ｎｍ〜２００μｍである。
本発明のヒアルロン酸ゲル微粒子は、好ましくは、薬物徐放担体である。
担持される薬物の徐放性能は、架橋された本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の架橋密度に大きく依存するため、カルボキシ基修飾率を制御することで、薬物の徐放性能を制御することができる。
また、本発明の水溶性ＨＡ修飾物およびそれを架橋して得られるＨＡゲルを、外科手術後の癒着防止剤などの医療用デバイスの成分とすることもできる。本発明における医療用デバイスとは、疾患の治療または診断、あるいはそれらの補助に用いられるデバイスであれば特に限定されず、例えば人工臓器、インプラント、カテーテル、薬物内包ゲル、薬物内包ペレットなどが含まれる。
上記医療用デバイスの具体例としては、本発明の水溶性ＨＡ修飾物で表面修飾を施した医療用デバイスが挙げられる。
なお、本発明のヒアルロン酸修飾物と結合させる薬物および本発明のヒアルロン酸ゲルに封入する薬物（低分子化合物、タンパク質、ペプチド、および核酸）の例としては、以下のものを挙げることができる。
低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β-ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等）などを挙げることができる。
タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（以下、「ＧＬＰ−１」とも称す）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等を挙げることができる。
核酸の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ等を挙げることができる。
また、本発明のヒアルロン酸ゲルに封入する薬物としては、上述の薬物と高分子とのコンジュゲートが好ましい。この場合に用いられる高分子としては、特に限定されないが、例えば、ＰＥＧ、ＨＡ、ＨＡ修飾物、デキストラン、プルラン、ポリグルタメート、ポリシアル酸等が挙げられる。
本発明の水溶性ＨＡ修飾物、ヒアルロン酸ゲル、およびヒアルロン酸ゲル微粒子は、薬物とのコンジュゲートとして、または薬物を封入して、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明により、従来の方法では得られない、実用的なレベルまで血中滞留時間が延長された水溶性ＨＡ修飾物を製造することが可能となる。さらに本発明により提供される水溶性ＨＡ修飾物を担体に用い、薬物をコンジュゲート化することで、従来の技術では達成できなかった、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。
さらに、本発明の水溶性ＨＡ修飾物を用いることで、従来のＨＡ修飾物では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物、あるいはそれらと高分子とのコンジュゲートを封入し、長期間徐放できる安全性の高いヒアルロン酸ゲル 徐放製剤、医薬組成物を提供することが可能である。
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＮＭＲ測定は、核磁気共鳴装置 ＪＮＭ−ＥＣＡ５００（日本電子株式会社製）を用いて測定した。ＮＭＲの測定条件を以下に示す。
ＮＭＲ測定条件
Ｄａｔａ ｐｏｉｎｔ：１６３８４
Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｗｉｄｔｈ（Ｘ ｓｗｅｅｐ）：１５ｐｐｍ
Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（Ｘ ａｃｑ ｔｉｍｅ）：１．７４９ｓ
Ｐｕｌｓｅ ｄｅｌａｙ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｅｌａｙ）：３０ｓ
Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ（Ｓｃａｎｓ）：６４
温度：室温
測定溶媒：Ｄ2Ｏ
また、以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。
〔実施例１〕非プロトン性極性溶媒中でのヒアルロン酸修飾物の合成（縮合剤、溶媒混合比率、酵素分解性）
非極性溶媒中における様々な合成条件を検討し、各条件で得られたヒアルロン酸修飾物の酵素耐性の評価を行った。
（実施例１−１）
テトラブチルハイドロオキサイド（シグマ−アルドリッチ社製）でテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化したＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８−４００（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて、分子量２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ；電気化学工業株式会社製）をＴＢＡ塩化した。得られたテトラブチルアンモニウム塩化ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ−ＴＢＡ」とも称す）２９．１ｍｇを２．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるようＤＭＳＯ（和光純薬株式会社製）に溶解した。ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社製）／エチレンジアミン（以下、「ＥＤＡ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）＝１／２．５／１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温下で一晩反応させた。その後、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を１０ｍＬ加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（以下、「ＭＷＣＯ」とも称す）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたヒアルロン酸（以下、「ＨＡ−ＡＭ」とも称す）２５．８ｍｇを得た。
（実施例１−２）
エチレンジアミンの代わりに２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（以下、「ＥＤＯＢＥＡ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ３５．１ｍｇを用い、ＨＡユニット／ＢＯＰ／ＥＤＯＢＥＡ＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で反応させたこと以外は実施例１−１と同様の方法で行い、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）２７．２ｍｇを得た。
（実施例１−３）
ＥＤＯＢＥＡの代わりにヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ６２．０ｍｇを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で行い、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４１．１ｍｇを得た。
（実施例１−４）
ＢＯＰの代わりにＰｙＢＯＰ（国産化学株式会社製）を用い、ＨＡ−ＴＢＡ ５１．８ｍｇを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３９．０ｍｇを得た。
（比較例１−１）
ＤＭＳＯの代わりに水を用い、ＢＯＰの代わりにＥＤＣ（シグマ−アルドリッチ社製）を用い、５０．０ｍｇのＨＡ（ナトリウム塩）を１．０ｍｇ／ｍＬ濃度とし、ＨＡユニット／ＥＤＣ／エチレンジアミン・２ＨＣｌ（以下、「ＥＤＡ・２ＨＣｌ」とも称す；和光純薬株式会社製）＝１／４／１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比にした。ｐＨは７．０に調整し一晩反応させた。それ以外は実施例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３６．１ｍｇを得た。
（比較例１−２）
ＤＭＳＯの代わりに水／エタノール（９０／１０）を用いたこと以外は比較例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３６．０ｍｇを得た。
（比較例１−３）
ＤＭＳＯの代わりに水／エタノール（７０／３０）を用いたこと以外は比較例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３８．３ｍｇを得た。
（比較例１−４）
ＥＤＣの代わりにＥＤＣ／ＨＯＤｈｂｔ（渡辺化学工業株式会社製）を用い、ＨＡユニット／ＥＤＣ／ＨＯＤｈｂｔ／ＥＤＡ・２ＨＣｌ＝１／４／４／１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比にしたこと以外は比較例１−３と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４９．３ｍｇを得た。
（比較例１−５）
ＤＭＳＯの代わりに水／ＤＭＳＯ（６０／４０）を用い、ＨＡユニット／ＥＤＣ／ＥＤＡ・２ＨＣｌ＝１／２／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比にしたこと以外は比較例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４４．０ｍｇを得た。
（比較例１−６）
ＥＤＣの代わりにＢＯＰを用いたこと以外は比較例１−５と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４２．１ｍｇを得た。
（比較例１−７）
ＥＤＡ・２ＨＣｌの代わりにヘキサメチレンジアミン・２ＨＣｌ（ＨＭＤＡ・２ＨＣｌ；東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は比較例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３５．２ｍｇを得た。
（比較例１−８）
ＥＤＡ・２ＨＣｌの代わりにＨＭＤＡ・２ＨＣｌを用いたこと以外は比較例１−３と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３３．３ｍｇを得た。
（比較例１−９）
ＥＤＡ・２ＨＣｌの代わりにＨＭＤＡ・２ＨＣｌを用い、水／エタノール（６０／４０）を用いたこと以外は比較例１−３と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３３．６ｍｇを得た。
（比較例１−１０）
ＥＤＡ・２ＨＣｌの代わりにＨＭＤＡ・２ＨＣｌを用い、水／エタノール（６０／４０）を用いたこと以外は比較例１−４と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４８．４ｍｇを得た。
（比較例１−１１）
水／ＤＭＳＯ（６０／４０）の代わりに水／ＤＭＳＯ（５０／５０）を用い、５１．９ｍｇのＨＡを用いたこと以外は比較例１−５と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４７．５ｍｇを得た。
（比較例１−１２）
ＢＯＰの代わりにＤＣＣ（和光純薬株式会社製）を用い、６９．９ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを４．０ｍｇ／ｍＬ濃度とし、ＨＡユニット／ＤＣＣ／ＥＤＯＢＥＡ＝１／４／１００ （ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比にしたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）５４．５ｍｇを得た。
（比較例１−１３）
ＢＯＰの代わりにＤＣＣを用い、５４．１ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）４０．７ｍｇを得た。
（比較例１−１４）
ＢＯＰの代わりにＣＤＩ（シグマ−アルドリッチ社製）を用い、５０．０ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３１．６ｍｇを得た。
（比較例１−１５）
ＢＯＰの代わりにＥＤＣを用い、４６．４ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３０．４ｍｇを得た。
（比較例１−１６）
ＢＯＰの代わりにＥＥＤＱ（和光純薬株式会社製）を用い、５８．４ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３９．５ｍｇを得た。
（比較例１−１７）
ＥＥＤＱの代わりにＤＭＴ−ＭＭ（和光純薬株式会社製）を用い、５３．５ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３３．２ｍｇを得た。
（比較例１−１８）
ＤＭＴ−ＭＭの代わりにＴＢＴＵ（和光純薬株式会社製）を用い、５６．０ｍｇのＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は実施例１−２と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）３０．０ｍｇを得た。
（試験例１）酵素分解性評価
実施例１−１〜１−４および比較例１−１〜１−１８で得られたＨＡ−ＡＭを２ｍｇ/ｍＬ濃度に蒸留水（ミリＱ水）に溶解した。この溶液５５μＬに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３２μＬおよび水７７μＬを加え、ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１Ｕ/ｍＬ溶液(０．０１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）)４４μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。各サンプル１００μＬを分取し、５０ｍＭ酢酸溶液を７２０μＬ加え反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）に供してＨＡ−ＡＭの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（２３２ｎｍの吸収）。ＧＰＣの条件を以下に示す。
ＧＰＣの測定条件
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ １０／３０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（３本連結）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ：５０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２３２ｎｍ）
２糖分解ピーク（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：１３０分）が観察されたものを×、観察されなかったものを○で評価し、表１に示す。また、典型的なＧＰＣデータを図１および図２に示す（実施例１−１〜１−４、比較例１−３、１−５、１−６、１−１４、参考例）。
また、実施例１−１〜１−４のアミノ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：エチレンジアミン部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）。プロトンＮＭＲデータを図３に示す。アミノ基導入率はそれぞれ９７．５、７５．５、８８．３、８４．５％だった。
なお、ＣＤＩを用いた導入（比較例１−１４）における、反応前後でのゲル浸透クロマトグラムを図４に示す。また、以下にＧＰＣ条件を示す。
ＧＰＣの測定条件
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷXL（ＴＯＳＯＨ社製）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ：５０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２１０ｎｍ）
縮合剤としてＣＤＩを用いた場合、明らかな分解が観察され、ＣＤＩを用いる縮合ではＨＡの分子量が極端に低下したことが確認された。さらに、ヒアルロニダーゼによる分解に対する耐性が得られなかったため、ＨＡへのアミノ化合物の導入には不向きであることが明らかとなった。
さらに、本試験例においては、ａ）溶媒としてＤＭＳＯ単独を用いる、ｂ）縮合剤としてＢＯＰまたはＰｙＢＯＰを用いる、という条件の両方を満たさない場合も、ヒアルロニダーゼによる分解に対する耐性が得られなかったため、ＨＡへのアミノ化合物の導入には不向きであることが明らかとなった。
〔実施例２〕ＢＯＰの添加率によるジアミン化合物の導入率制御
ジアミン化合物の導入率の制御を行うために、様々な比率で縮合剤を添加し、酵素耐性評価を行った。
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを２．０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した溶液を３つ用意し、各溶液にＨＡユニット／エチレンジアミン（ＥＤＡ）＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＡを加え、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対しそれぞれ１．０８、１．５または２．０の当量比で加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥を行った。
また、ＨＡ（２３ｋＤａ）−ＴＢＡを２．０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した溶液を３つ用意し、各溶液にＨＡユニット／２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＯＢＥＡを加え、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対しそれぞれ１．０、１．５または２．０の当量比で加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥を行った。
実施例２のアミノ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ、ＥＤＯＢＥＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）。プロトンＮＭＲデータを図５に示す。また、各ＨＡ修飾物のヒアルロニダーゼ耐性は試験例１と同様の方法で評価した。アミノ基導入率およびヒアルロニダーゼ耐性評価の結果を表２に示す。アミノ基の導入率はＢＯＰの仕込みで制御可能であり、非プロトン極性有機溶媒中でＢＯＰ系試薬を縮合剤として用いることにより、均一的にかつ高導入率までの導入が可能であることが明らかとなった。
ＨＡは水中で分子内水素結合と、分子内および分子外の疎水性相互作用により、２次構造、３次構造を形成していることが知られており（Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ． Ｃｈｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 第１４３巻，第６−１４頁（１９８９年））、均一な化学修飾が難しくなっていると考えられる。このため、水中でＨＡのカルボキシ基の多くを修飾しても、ＨＡレセプターに認識されうる連続した４−６糖の未修飾ドメインが一部残存しており、ここが体内のＨＡレセプターに結合してしまうことで比較的短期間に血中からクリアされてしまうと予想される。
非プロトン性極性溶媒中ではＨＡの水素結合、疎水性相互作用が減弱されることでＨＡの高次構造が壊され、高次構造形成に基づくカルボキシ基周辺環境の不均一性が解消され、より均一的な化学修飾が達成され、酵素耐性が得られるものと考えられる。
〔実施例３〕カルボン酸変換したＨＡ修飾物のヒアルロニダーゼ耐性評価
酵素耐性をより詳細に評価するために、導入した一級アミンをカルボン酸に変換したＨＡ修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の合成を行い、得られたＨＡ修飾物の酵素耐性の評価を行った。
（実施例３−１）ＨＡ−ＡＭの合成
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを４．０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した溶液を６つ用意し、各溶液にＨＡユニット／ＥＤＯＢＥＡ＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）を加え、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し、０．４、０．６、１．０、１．５、１．８５または２．５の当量比で加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行い、ＥＤＯＢＥＡ導入ＨＡ修飾物を得た。
（実施例３−２）一級アミンのカルボン酸への変換
上記（実施例３−１）で得られたサンプルを蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え、１０．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液にＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）に対して２０モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で３０分間撹拌した。その後０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析を行い、次に大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行ない、ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。ＮＭＲスペクトルを図６に示した。アミノ基の隣のメチレンのピーク（２．９〜３．１）が完全に消失し、新たにコハク酸由来のピーク（２．４〜２．６ｐｐｍ）が観察され、アミノ基がカルボン酸へ変換されていることが明らかとなった。
（実施例３−３）酵素分解性評価
実施例３−２で得られたＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを４ｍｇ/ｍＬ濃度で蒸留水（ミリＱ水）に溶解した。この溶液２５μＬに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）２００μＬおよび水２５μＬを加え、ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１Ｕ/ｍＬ溶液(０．２Ｍリン酸緩衝液；ｐＨ６．２)５０μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。各サンプル１００μＬを分取し、５０ｍＭ酢酸溶液を７００μＬ加え反応を停止させた。対照として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）に供してＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した（２３２ｎｍの吸収）。結果を図７および表３に示す。また、ＧＰＣの条件を以下に示す。
ＧＰＣの測定条件
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＰｅｐｔｉｄｅＨＲ １０／３０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）（２本連結）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ Ｒａｔｅ：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ：５０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２３２ｎｍ）
ここで分解産物のうちの２糖分率は溶媒由来のピーク（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ：９０分）を除いた範囲で１００×（２糖のピークエリア)／(全ピークエリア−酵素非添加時全ピークエリア)(％)として算出した。酵素耐性はアミンの導入率、すなわちＨＡのカルボン酸の修飾率に対応して酵素耐性が上がることが明らかとなった。
〔実施例４〕様々な官能基を導入したＨＡ修飾物の合成と二成分の官能基の導入率制御
様々な官能基の導入の検討を行った。また長期間の血中滞留性を維持し、反応性官能基の導入率の制御を行うため二つの化合物の導入を行った。
（実施例４−１）水酸基を導入したＨＡ修飾物（ＨＡ−ＯＨ）の合成
（実施例４−１−１）アミノエタノール（ＡＥｔＯＨ）導入ＨＡ修飾物の合成
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡをＤＭＳＯに溶解して５．０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、そこにＨＡユニット／一級アミン＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でアミノエタノール（以下、「ＡＥｔＯＨ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を添加し、さらにＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比で添加し一晩攪拌した。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液、蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行った。得られたサンプルのＮＭＲチャートを図８に示した。
（実施例４−１−２）２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール（ＡＥＡＥｔＯＨ）を導入したＨＡ修飾物の合成
ＡＥｔＯＨの代わりに２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール（以下、「ＡＥＡＥｔＯＨ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を用いたこと以外は実施例４−１−１と同様の方法で行った。得られたサンプルのＮＭＲチャートを図８に示した。
実施例４−１−１および４−１−２におけるサンプルの1Ｈ−ＮＭＲ測定では、それぞれにおいて新たなピークが観察され目的の変換が達成されたことが確認された。しかし、導入化合物のピークがＨＡ由来のピークと重なるためＡＥｔＯＨおよびＡＥＡＥｔＯＨの導入率の算出はできなかった。
（実施例４−２）二級アミンおよび水酸基を有するアミン化合物の導入
（実施例４−２−１）ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を有するＨＡ修飾物の合成
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡをＤＭＳＯに溶解して５．０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、そこにジエチレントリアミン（以下、「ＤＥＴＡ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）をＨＡユニット／ジエチレントリアミン＝１／１００（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で添加し、さらにＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し１．５の当量比で添加し３時間攪拌した。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させ、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液、蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行った。導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ジエチレントリアミン部分の３つのメチレンプロトン、２．６〜３．１ｐｐｍ）導入率は８９．８％であった。得られたサンプルのＮＭＲチャートを図８に示した。
（実施例４−２−２）１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（ＤＡＨＰ）を有するＨＡ修飾物の合成
ＤＥＴＡの代わりに１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（以下、「ＤＡＨＰ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＤＡＨＰをＨＡユニット／ＤＡＨＰ＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で添加し、さらにＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比で添加し一晩攪拌したこと以外は実施例４−２−１と同様の方法で行った。導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン部分のメチンプロトン、２．６〜２．８ｐｐｍ）導入率は９９．０％であった。得られたサンプルのＮＭＲチャートを図８に示した。
実施例４−２−１および４−２−２における1Ｈ−ＮＭＲ測定によりアルキルに水酸基が付加したジアミン化合物、および二級アミンを有するアミン化合物も導入可能であることが明らかとなった。
（実施例４−３）水酸基およびアミノ基を導入した（ＨＡ−ＡＭ／ＯＨ）の合成
（実施例４−３−１）３−アミノプロパーノールおよび１，３−ジアミノブタンを導入したＨＡ修飾物の合成
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを５．０ｍｇ／ｍＬの濃度にＤＭＳＯに溶解した溶液を５つ用意した。反応試薬は３−アミノプロパノール（以下、「ＡＰｒＯＨ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）、１，３−ジアミノプロパン（以下、「ＤＡＰ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡユニット／反応試薬のアミノ基（ＡＰｒＯＨ＋ＤＡＰ）＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で固定し、ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１００：０、９５：２．５、９０：５、８０：１０、０：１００のモル比となるように各溶液に添加した。その後、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の当量比で各溶液に添加した。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液、蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行った。アミノ基および水酸基の導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図９に示す（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ；ＡＭ：ジアミノプロパン部分のメチレンプロトン、１．７〜１．８、２．９〜３．０ｐｐｍ；ＯＨ：アミノプロパノールのメチレンプロトン、１．５５〜１．６５ｐｐｍ）。
それぞれ導入率は１００：０（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝１００モル％、９５：２．５（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝８８．４：１０．７モル％、９０：５（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝７８．９：１９．２モル％、８０：１０（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝６３．８：３６．０モル％、０：１００（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝９３．２モル％であった（以下、導入率が０：１００（ＡＰｒＯＨ：ＤＡＰ）＝９３．２モル％であるＨＡ修飾物を、「ＨＡ−ＤＡＰ」とも称す）。また、ＧＰＣチャートを図１０に示した（対照：２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ−Ｎａ））。イオン性基でない官能基を導入することにより、ＧＰＣチャート上でピークが低分子側にシフトし見かけ上の分子量が低下する現象が観察され、静電的もしくは水素結合的な分子内の相互作用が変化した可能性が示唆された。また、ＡＭの導入に従いカラムとの相互作用によりピークが低分子量側へシフトすることが観察された。実施例４−３−１により、アミノ基と水酸基とを有する水溶性ＨＡ修飾物の合成が可能であり、その導入率が制御可能であることが明らかとなった。
（実施例４−３−２） （２−アミノエトキシ）エタノール（ＡＥＥｔＯＨ）およびエチレンジアミン（ＥＤＡ）を導入したＨＡ修飾物の合成
反応試薬であるアミノプロパノール（ＡＰｒＯＨ）、ジアミノプロパン（ＤＡＰ）の代わりに（２−アミノエトキシ）エタノール（以下、「ＡＥＥｔＯＨ」とも称す；シグマ−アルドリッチ社製）、エチレンジアミン（ＥＤＡ；シグマ−アルドリッチ社製）を用い、ＨＡユニット／反応試薬のアミノ基（ＡＥＥｔＯＨ＋ＥＤＡ）＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で固定し、ＡＥＥｔＯＨ：ＥＤＡ（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が９５：２．５、９０：５、８０：１０のモル比となるように各溶液に添加し、反応させた以外は実施例４−３−１と同様の方法で行った。アミノ基の導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図１１に示す。（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：エチレンジアミン部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）それぞれＡＭ（ＥＤＡ）の導入率は９５：２．５（ＡＥＥｔＯＨ：ＥＤＡ）＝１３．０モル％、９０：５（ＡＥＥｔＯＨＨ：ＥＤＡ）＝２０モル％、８０：１０（ＡＥＥｔＯＨ：ＥＤＡ）＝３３．０モル％であった。また、ＧＰＣチャートを図１０に示した。実施例４−３−１と同様にイオン性基でない官能基を導入することにより、ＧＰＣチャート上でピークが低分子側にシフトし見かけ上、分子量が低下する減少が観察され、静電的もしくは水素結合的な分子内の相互作用が変化した可能性が示唆された。また、ＡＭの導入に従いカラムとの相互作用によりピークが低分子量側へシフトすることが観察された。
（実施例４−４）酵素分解性評価
実施例４−１および４−３で得られたサンプルを４ｍｇ/ｍＬの濃度で蒸留水（ミリＱ水）に溶解した以外は実施例３−３と同様に行った。また、解析に関してはＡＭ基の影響があるために２糖分率の評価は行わなかった。結果を図１２、１３に示す。
全てのサンプルにおいて、２糖の分解物は観察されず、電荷および反応性官能基の導入率制が可能な酵素耐性を有するＨＡ修飾物が合成可能であることが示唆された。なお、２糖の分解物が観察されなかったということは、ヒアルロニダーゼで分解して得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を測定した場合、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率が３０％以下であったことを意味する。
〔実施例５〕ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の分子量と血中滞留時間との相関（分子量依存性）
ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の血中滞留性を分子量の観点から解析するために、２３ｋ、１００ｋおよび２００ｋＤａのＨＡからＨＡ修飾物を合成し、蛍光色素であるＦＩＴＣを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
（実施例５−１）ＨＡ−ＡＭの合成
ＨＡ（２３ｋＤａ）−ＴＢＡを２ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解し、またＨＡ（１００ｋＤａ）−ＴＢＡおよびＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを４ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した溶液を調製した。ＨＡユニット／ＢＯＰ／２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で各溶液に添加し、室温下で一晩反応させた。その後、反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）を得た。アミノ基導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図１４に示す（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＯＢＥＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）。それぞれ導入率は２３ｋＤａ：８７モル％、１００ｋＤａ：９２．５モル％、２００ｋＤａ：９３．５モル％であった。
（実施例５−２）蛍光標識ＨＡ修飾物の合成
上記（実施例５−１）で得られたＨＡ−ＡＭを蒸留水（ミリＱ水）で溶解し２０．０ｍｇ／ｍＬの溶液とし、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え、濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液にＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）に対して０．０７モル倍のフルオレセインイソチオシアネート（以下、「ＦＩＴＣ」とも称す；ピアス社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間撹拌した。その後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で３０分間撹拌した。ＰＤ−１０カラム（アムシャムバイオサイエンス株式会社製）によるゲル濾過で粗精製した後、大過剰量の０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製した（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）。透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。
ここで得られた各蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ由来のＮ−フルオロセイニルチオカルバモイル基のモル濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ μｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット： ｙ μｍｏｌ／ｍＬ (ＡＭが無水コハク酸処理されたユニット)
と定義し、以下の式より算出した。
なお、式中の残存ＡＭ ｃｏｎｃ．とは未反応のアミノ基を有するユニットのモル濃度を意味し、ＦＩＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＩＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。
得られた結果を表４にまとめた。
（比較例５−１）蛍光標識ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣの合成
５８０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（電気化学工業株式会社製）を０．２５％濃度（ｗ／ｖ）で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（以下、「ＡＤＨ」とも称す）を、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：５：４０のモル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール水溶液、蒸留水（ミリＱ水）に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡのカルボキシ基の７３％であった。
このＨＡ−ＨＺを蒸留水（ミリＱ水）に溶解させた後、等量の１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて終濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。これにＦＩＴＣ／ＨＡのユニット＝３．０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯに溶解させたＦＩＴＣを添加し、室温、遮光下に１時間反応させた。反応溶液２５ｍＬを予め５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１０本）に投入し、未反応のＦＩＴＣを除去した。この租精製した溶液に無水コハク酸／ＨＺ＝２５０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＤＭＳＯに溶解させた無水コハク酸を添加し（３．５ｍＬ）、同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し、凍結乾燥してＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣを得た。
得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ μｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＨＺ−ＳＵＣユニット： ｙ μｍｏｌ／ｍＬ (ＨＺが無水コハク酸処理されたユニット) と定義し、以下の式より算出した。
なお、式中ＦＩＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＩＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。得られた結果を表５にまとめた。
（実施例５−３）血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例５−２および比較例５−１の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内（ｉｖ）および皮下（ｓｃ）に単回投与し、投与前および投与後０．０８３３、０．２５、０．５、１．２、２、４、６、８、１０、１２、２４、４８、７２、９６、１６８時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。（０．２５、１．２、６、１０、１２は比較例５−１のサンプルについてのみ）この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。
測定方法
ＧＰＣにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。以下に条件を示す。
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷXL（ＴＯＳＯＨ社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ：４０μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４９４ｎｍ，ＥＭ：５１８ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＭｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｖｅｒ ３．２１（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。
薬物動態データ
実施例５−２および比較例５−１の蛍光標識ＨＡ修飾物の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点３点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期（ｔ１／２）、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。また、皮下投与後のＢＡ（Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）は皮下投与後の血漿中濃度下面積（ＡＵＣｓｃ）と静脈内投与後の血漿中濃度下面積（ＡＵＣｉｖ）から以下の式に従い算出した。
蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図１５に示し、算出した薬物動態学的パラメーターを表６に示す。
蛍光標識ＨＡ修飾物を用いた薬物動態試験により、非プロトン極性有機溶媒中で合成した本発明のＨＡ修飾物（実施例５−２）はＨＡおよびこれまで報告されたＨＡ誘導体（特許文献４、５および６を参照）と比較して、ラット単回静脈内投与後の血中滞留時間が大幅に改善されることが確認された。また、比較例５−１（分子量５８０ｋＤａのＨＡ修飾物（７３モル％修飾（ＨＺ））のラット単回静脈内投与後の平均血中滞留時間（ＭＲＴ）は１６時間程度であるが、これに対しても本発明のＨＡ修飾物は血中滞留性が５．５倍程度延長されていることが明らかとなった。２３ｋＤａ ＨＡ修飾物に関しては、初期段階で血中濃度が減少する傾向が観察され、一部低分子ＨＡ修飾物が腎排泄されている可能性が示唆された。１００ｋＤａおよび２００ｋＤａのＨＡ修飾物に関しては、血中滞留性に関する特性（ＣＬ、ＭＲＴ，ｔ１／２）はほぼ同様の値となった。しかしながら、分子量依存的に、皮下投与後のＢＡ（Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）は減少し高分子量のＨＡ修飾物ほど血中への移行がされにくい結果となった。
〔実施例６〕ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の修飾率と血中滞留時間との相関
ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の血中滞留性を修飾率の観点から解析するために、２００ｋＤａのＨＡから様々な修飾率のＨＡ修飾物を合成し、蛍光色素であるＦＩＴＣを導入したサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
（実施例６−１）ＨＡ−ＡＭの調製
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを４．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解した溶液を５つ調製し、各溶液にＨＡユニット／ＥＤＯＢＥＡ＝１／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＯＢＥＡを添加し、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し、０．２５、０．５、０．７５、１．０、または１．５の当量比でそれぞれの溶液に加え、一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、限外ろ過後（ＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、凍結乾燥を行った。アミノ基導入率はプロトンＮＭＲ法で定量した。ＮＭＲチャートを図１６に示す。（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＯＢＥＡ部分のメチレンプロトン、２．９〜３．１ｐｐｍ）それぞれ導入率はＢＯＰ試薬比率０．２５：２０．０モル％、０．５：３６．５モル％、０．７５：５４．５モル％、１．０：６９．０モル％、１．５：９０．５モル％であった。
（実施例６−２）蛍光標識ＨＡ修飾物の合成
上記（実施例６−１）で得られたＨＡ−ＡＭのそれぞれを、蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬとした。これらの溶液にＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）に対して０．０７モル倍（６９％および９０．５％アミン修飾ＨＡの溶液）、０．１７５モル倍（５４．５％アミン修飾ＨＡの溶液）、０．２８モル倍（３６．５％アミン修飾ＨＡの溶液）および０．６３モル倍（２０．０％アミン修飾ＨＡの溶液）のフルオレセインイソチオシアネートをＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加え、室温で１時間撹拌した。その後、ＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）に対して４０モル倍の無水コハク酸をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加え、室温でさらに３０分間撹拌した。２０％アミン修飾物は大過剰量ＤＭＳＯへ透析を行った後、またその他のサンプルは直接、大過剰量の２５％ＥｔＯＨ水溶液に対して透析し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、その後、０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製した。透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを得た。
ここで得られた各蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ μｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット： ｙ μｍｏｌ／ｍＬ (ＡＭが無水コハク酸処理されたユニット)
と定義し、以下の式より算出した。
なお、式中ＦＩＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＩＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。得られた結果を表７にまとめた。
（実施例６−３）血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例６−２の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後０．５、２、４、８、２４、４８、７２、９６、および１６８時間で採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。
測定方法
９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｓａｍｐｌｅ ｖｏｌｕｍｅ：１００μＬ／ｗｅｌｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４８５ｎｍ，ＥＭ：５３８ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。
薬物動態データ
実施例６−２の蛍光標識ＨＡ修飾物の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図１７に示し、ＡＭ導入率とＭＲＴの関係を図１８に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表８に示す。
図１８に示されるＡＭの修飾率とＭＲＴとの関係から、修飾率が５０％の後半から急激にＭＲＴの増加すなわち血中滞留性の延長が起こることが示唆された。すなわち修飾率が５５モル％以上、好ましくは６５モル％以上、さらに好ましくは６９モル％以上の場合、１８時間以上のＭＲＴを有する血中滞留時間の面において好ましいＨＡ修飾物が得られる可能性が高い結果となった。
酵素耐性を獲得したＨＡ修飾物は、ＣＤ４４への認識も大きく低下しているため長期間の血中滞留性が得られるものと考えられる。
〔実施例７〕様々な化合物で修飾したヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間
ヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）の血中滞留性における修飾の影響を解析するために、２００ｋＤａのＨＡを様々なジアミン化合物で修飾し、さらに蛍光色素であるＦＩＴＣを導入したＨＡ修飾物のサンプルを調製し、それぞれの血中滞留性を観察した。
（実施例７−１）蛍光標識ＨＡ修飾物の合成
実施例４−２および４−３−１で得られたＨＡ−ＤＥＴＡ、ＨＡ−ＤＡＨＰ、ＨＡ−ＤＡＰを蒸留水（ミリＱ水）に溶解して２０．０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、これに０．２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０)を加え、濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液にＨＡのユニットに対して０．０７モル倍のフルオレセインイソチオシアネートをＨＡ修飾物溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間撹拌した。その後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸をＨＡ−ＡＭ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えて室温で３０分間撹拌した。各サンプルは大過剰量の０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製した後、透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製を行った。（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ修飾物を得た。
ここで得られた各蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣの濃度０．２５ｍｇ／ｍＬでの４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾 ＨＡユニット： ｘ μｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット： ｙ μｍｏｌ／ｍＬ (ＡＭが無水コハク酸処理されたユニット)
ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣユニット分子量：Ｍ1 ｇ／ｍｏｌ
ＨＡ−ＡＭ−ＦＩＴＣユニット分子量：Ｍ2 ｇ／ｍｏｌ
と定義し以下の式より算出を行った。
なお、式中ＦＩＴＣ ｃｏｎｃ．とはＦＩＴＣ基を有するユニットのモル濃度を意味する。また、ＤＥＴＡ： Ｍ1＝５８６．５、 Ｍ2＝８５３．９、 ＤＡＨＰ： Ｍ1＝５７３．５、 Ｍ2＝８４０．８、 ＤＡＰ： Ｍ1＝５５７．５、 Ｍ2＝８２４．８で算出を行った。
得られた結果を表９にまとめた。
（実施例７−２）血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例７−１の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後０．５、２、４、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間で採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。
測定方法
９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注しマイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｓａｍｐｌｅ ｖｏｌｕｍｅ：１００μＬ／ｗｅｌｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４８５ｎｍ，ＥＭ：５３８ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。
薬物動態データ
実施例７−１の蛍光標識ＨＡ修飾物の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図１９に示した。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表１０に示す。
実施例５に示されるヒアルロン酸誘導体の修飾と同様にＭＲＴの増加すなわち血中滞留性の延長が起こることが示唆された。様々なアミノ基含有化合物での修飾に関しても同様に１８時間以上のＭＲＴを有しており、用途により導入するアミノ基含有化合物を変化させることが可能であることが明らかとなった。〔実施例８〕メタクリロイル基を導入したＨＡ修飾物の合成
ゲル調製用の基材としてメタクリロイル基を有するＨＡ修飾物の合成を行った。
（実施例８−１）ＨＡ−ＡＥＭＡの合成
分子量２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ；電気化学工業株式会社製）をテトラブチルハイドロオキサイド（シグマ−アルドリッチ社製）でテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化したＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８−４００（シグマ−アルドリッチ社製）を用いてＴＢＡ塩化し、得られたテトラブチルアンモニウム塩化ヒアルロン酸（ＨＡ−ＴＢＡ）を２．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるようＤＭＳＯ（和光純薬株式会社製）に溶解した溶液を２つ調製した。ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社製）／アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ；シグマ−アルドリッチ社製）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比および１／０．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＡＥＭＡ、ＢＯＰの順でそれぞれの溶液に添加し、室温下で一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液、続いて蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥して標題のメタクリロイル基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＥＭＡ）を得た。
得られたＨＡ−ＡＥＭＡ中のＡＥＭＡ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、それぞれ、５６．５％（ＢＯＰ：２．５倍当量）、３８．０％（ＢＯＰ：０．５倍当量）がＡＥＭＡ化されていた（ＨＡおよびＨＡ−ＡＥＭＡのＮ−アセチル基、（１．９〜２．１ｐｐｍ）（３Ｈ）、ＨＡ−ＡＥＭＡのメタクリロイル基由来部分、５．５〜６．１ｐｐｍ（各２Ｈ）を比較、図２０を参照）。
（実施例８−２）ＨＡ−ＡＰＭＡの合成
ＡＥＭＡの代わりにアミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ；ポリサイエンス社製）を用い、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社製）／ＡＰＭＡ＝１／２．０／５（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比で反応させた。それ以外は実施例８−１と同様の方法でＨＡ−ＡＰＭＡを得た。
得られたＨＡ−ＡＰＭＡ中のＡＰＭＡ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、４７．５％がＡＰＭＡ化されていた（ＨＡおよびＨＡ−ＡＰＭＡのＮ−アセチル基、（１．９〜２．１ｐｐｍ）（３Ｈ）、ＨＡ−ＡＰＭＡのメタクリロイル基由来部分、５．２〜５．８ｐｐｍ（各２Ｈ）を比較、図２１を参照）。
〔実施例９〕ＢＯＰ添加量によるメタクリロイル基導入制御
メタクリロイル基の導入率の制御を行うために、様々な比率で縮合剤を添加し合成を行い、導入率の解析を行った。
ＨＡ（２００ｋＤａ）−ＴＢＡを５．０ｍｇ／ｍＬ（ＡＥＭＡ用）もしくは４．０ｍｇ／ｍＬ（ＡＰＭＡ用）でＤＭＳＯに溶解した溶液を調製し、ＨＡユニット／ＡＥＭＡ（ポリサイエンス社製）もしくはＡＰＭＡ（ポリサイエンス社製）＝１／５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＡＥＭＡもしくはＡＰＭＡを添加し、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し、０．２、０．２５、０．４、または１．０の当量比で添加し一晩反応させた。その後反応混合物の容量の半分量の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を加え、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨを３まで低下させた後、２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。その後、大過剰の０．３Ｍ ＮａＣｌ水溶液、続いて蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥を行った。
メタクリロイル基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８〜１．９ｐｐｍ、ＭＡ：メタクリロイル基由来、５．５〜６．１ｐｐｍ（ＡＥＭＡ）、５．２〜５．８ｐｐｍ（ＡＰＭＡ））。プロトンＮＭＲデータを図２２に示す。メタクリロイル基導入率を表１１に示す。メタクリロイル基の導入率はＢＯＰの仕込みで制御可能であることが分かった。
〔実施例１０〕蛍光標識ＨＡ−ＨＺ合成
ゲル内封サンプルとして使用するために、蛍光標識化したＨＡ−ＨＺの合成を行った。
（実施例１０−１） ＨＡ−ＨＺの合成
分子量２００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ；電気化学工業株式会社製）を０．５％濃度で蒸留水（ミリＱ水）に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡユニット／ＥＤＣ／ＡＤＨ＝１／０．０５／４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で攪拌下２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール水溶液、続いて蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、凍結乾燥してヒドラジドが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、それぞれ、ＨＡのカルボン酸の３．７５％がＨＺ化されていた（ＨＡおよびＨＡ−ＨＺのＮ−アセチル基、２．１ｐｐｍ（３Ｈ）、ＨＡ−ＨＺのアジピン酸由来部分のメチレン基、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ（各２Ｈ）を比較）。
（実施例１０−２）ＨＡ−ＨＺの蛍光標識化
上記（実施例１０−１）で得られたＨＡ−ＨＺを蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９．０、４．８４ｍＬ）および１０１．３ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（２．４２ｍＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに振とうした。その後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水（ミリＱ水）に置換してさらに透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（２２７．６３ｍｇ）を得た。
〔実施例１１〕蛍光標識ＨＡ−ＨＺ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル調製
メタクリロイル基を導入したＨＡ修飾物を用い、メタクリロイル基とメルカプト基とのマイケル付加反応を利用し、蛍光標識したＨＡ−ＨＺを内封したバルク状のゲルを作成し、その徐放性の評価を行った。
実施例８−１で得られたＡＥＭＡの導入率が５６．５％であるＨＡ−ＡＥＭＡ ３．９７ｍｇと、実施例１０−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（１０７μｇ）を蒸留水（ミリＱ水、６０μＬ）に溶かした。これにトリエタノールアミン（ＴＥＡ、１．３μＬ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液（９．２５ｍｇ／ｍＬ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）、４０μＬ）を加えた。遮光下、３７℃で１時間反応させるとゲルになった。
また、ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し０．４の当量比で添加し一晩反応させた以外は実施例９と同様に合成した導入率１８．８％のＨＡ−ＡＥＭＡ（３．９２ｍｇ）と、実施例５−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ（４１０μｇ）を蒸留水（ミリＱ水、６０μＬ）に溶かした。これにジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液（９．２５ｍｇ／ｍＬ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）、４０μＬ）を加えた。遮光下、３７℃で１時間反応させるとゲルになった（ＨＡ−ＡＥＭＡ４％ｇｅｌ）。ここで、ＨＡ−ＡＥＭＡ４％ｇｅｌとは、水分量１００μＬにつき４ｍｇのＨＡ-ＡＥＭＡが含まれているゲルであることを意味する。
（比較例１１−１）比較対照用のゲル基材合成（ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ）およびゲル調製
実施例１０−１と同様の方法でＨＡユニット／ＥＤＣ／ＡＤＨ＝１／０．２／４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモル比合成したＨＺの導入率が２６．０％のＨＡ−ＨＺ（３６９．８１ｍｇ）を蒸留水（ミリＱ水）で２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、２−イミノチオラン塩酸塩（ＩＴＬ；ピアス社製）をＨＺ／ＩＴＬ＝１／２モル比になるよう２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解、添加し、室温で攪拌下２時間反応させた。エタノールで沈殿、３回洗浄し、乾燥させメルカプト基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ、３２１．６８ｍｇ)を得た。得られたＨＡ−ＨＺ−ＳＨ中のＳＨ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した結果、ＨＡのカルボン酸の２２．０％がＳＨ化されていた。（ＨＡおよびＨＡ−ＨＺ−ＳＨのＮ−アセチル基（１．９ｐｐｍ、３Ｈ）、ＨＡ−ＨＺ−ＳＨのＩＴＬ由来部分のメチレン基（２．１ｐｐｍと２．７ｐｐｍ、各２Ｈ）を比較）。次に、ここで合成したＨＡ−ＨＺ−ＳＨを１．９９ｍｇ(ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ２％ｇｅｌ)および４．０８ｍｇ(ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ４％ｇｅｌ)と実施例１０−２の蛍光標識ＨＡ−ＨＺを９８μｇおよび１０５μｇとを蒸留水（ミリＱ水、６０μＬ）に溶かした。これに四チオン酸ナトリウム二水和物（以下、「ＳＴＴ」とも称す）／ＳＨ＝０．１／１モル比になるようにＳＴＴ溶液（２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）、４０μＬ）を添加し、遮光下、３７℃で１時間反応させるとゲルになった。ここで、ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ２％ｇｅｌとは、水分量１００μＬにつき２ｍｇのＨＡ−ＨＺ−ＳＨが含まれているゲルであることを意味する。ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ４％ｇｅｌとは、ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ２％ｇｅｌにおけるＨＡ−ＨＺ−ＳＨが４ｍｇであることを意味する。
（比較例１１−２）比較対照用のゲル基材合成（ＨＡ−ＨＺ−ＭＡ）とゲル調製
ＨＡ／ＥＤＣ／ＡＤＨ＝１／５／４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモル比にした以外は実施例１０−１と同様に合成し、ＨＡのカルボン酸が６３％ＨＺ化したＨＡ−ＨＺを得た。次に得られたＨＡ−ＨＺ（２０７．４６ｍｇ）を蒸留水（ミリＱ水、９ｍＬ）に溶解した後に、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、ＨＡ濃度２０ｍｇ／ｍＬに調整した。メタクリル酸無水物をＨＺの２０倍当量を滴下して添加し、室温で４時間反応させた。テトラヒドロフランで沈殿後、回収し乾燥させた。沈殿物を蒸留水（ミリＱ水）に溶解し、再びテトラヒドロフランで沈殿、乾燥させた後、乾燥物を蒸留水（ミリＱ水）に溶解し、凍結乾燥してＨＡ−ＨＺ−ＭＡを得た。得られたＨＡ−ＨＺ−ＭＡ中のＭＡ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した結果、ＨＡのカルボン酸の１７．０％がＭＡ化されていた（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン（１．８〜１．９ｐｐｍ）、ＭＡ：メタクリロイル基のＣＨ2＝（５．５〜６．１ｐｐｍ）を比較）。次に、ここで合成したＨＡ−ＨＺ−ＭＡを４．０７ｍｇ(ＨＡ−ＨＺ−ＭＡ４％ｇｅｌ)と実施例１０−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺを９９μｇとを蒸留水（ミリＱ水、６０μＬ）に溶かした。これにトリエタノールアミン（ＴＥＡ、１．３μＬ）とＤＴＴ溶液（２．７１ｍｇ／ｍｌ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）、４０μＬ）を加えた。遮光下、３７℃で一晩反応させるとゲルになった。
（試験例２）ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＨＺ徐放性能評価
実施例１１、比較例１１−１および比較例１１−２で得られたゲルを１ｍＬのＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、経時的に全量サンプリングした。ＧＰＣでバッファー中に放出された蛍光標識ＨＡ−ＨＺを定量した。ＧＰＣの測定条件は下記に示す。ゲル中に封入した蛍光標識ＨＡ−ＨＺを１００％とした時のゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＨＺ放出性を図２３に示す。なお、比較例１１−１および比較例１１−２で得られたゲルは５週間後までサンプリングし、実施例１１で得られたＨＡ−ＡＥＭＡゲルについてはおよそ１０週間後にヒアルロニダーゼを０．２５Ｕを添加し分解さ全ての内封物を放出させた。
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷXL（ＴＯＳＯＨ社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ：２５μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（４９４ｎｍ）
図２３よりＨＡ−ＡＥＭＡから作成したゲルはＡＥＭＡの導入率に関わらず、放出挙動は大きく変化せず、反応する官能基は１８．８％程度でも同様の放出プロファイルを取り、十分長期の徐放が可能であることが示唆された。また、本発明のＨＡ−ＡＥＭＡから作製したゲルはジスルフィド形成によるゲル（比較例１１−１）に比べて非常に長期間の徐放が可能であることが明らかとなった。また、メタクリル酸を直接アミド結合で導入したＨＡ−ＨＺ−ＭＡ（比較例１１−２）と比較しても同様に長期間の徐放が可能となった。メタクリロイル基の結合様式に起因する反応性の違いや修飾官能基の均一性等による結果と考えられ、エステルによるメタクリル酸の結合様式を有するＡＥＭＡのＨＡ修飾物を用いることにより、より長期の徐放が可能なゲルの調製が可能になった。
〔実施例１２〕スプレードライヤーによる蛍光標識ＨＡ−ＨＺ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル微粒子調製
ＨＡ−ＡＥＭＡを用い、スプレードライヤーを用いて注射可能なマイクロゲルの調製を調製を行った。
実施例９および実施例８−１で得られたＡＥＭＡ基の導入率が１１モル％、１９モル％、３８モル％であるＨＡ−ＡＥＭＡのそれぞれ５０ｍｇと、実施例１０−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺ５ｍｇを蒸留水（ミリＱ水、５ｍＬ）に溶かした（一晩）。これにＤＴＴをＡＥＭＡ／ＳＨ＝１／１モル比になるようにＤＴＴ溶液（２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）２５０μＬ）を添加し、以下の条件でスプレードライし、微粒子を得た。得られた微粒子の粒子径は１〜３μｍであった。各試料の粒子をプレパラート上に置き、乾燥状態およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して膨潤させた状態を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真を図２４に示す。ＰＢＳを添加した際にＡＥＭＡ基の導入率が１１モル％、１９モル％の微粒子は溶解した。これらの微粒子は、５０℃恒温槽（ヤマト科学社製 ＤＮ−４２）でキュアリングし、７２時間後にサンプリングした。これらの微粒子をプレパラート上に置き、これにｐＨ７．４のＰＢＳを添加してその粒子状態を顕微鏡で観察したところ、微粒子はＰＢＳに溶解しなかった。以上の操作によりＡＥＭＡ基の導入率が１１モル％、１９モル％、３８モル％の蛍光標識ＨＡ−ＨＺ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル微粒子が得られた（図２４を参照）。
スプレードライ条件
スプレードライヤー：ビュッヒ社製、ミニスプレードライヤー Ｂ−１９１
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｅｅｄ ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（Ｔｙｇｏｎ ｔｕｂｅ，Ｐｕｍｐ ｓｐｅｅｄ＝１５％）
Ｆｅｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｃ．：１０ｍｇ／ｍＬ
Ａｔｏｍｉｚｉｎｇ ａｉｒ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：６５０Ｌ／ｈｒ
Ｄｒｙｉｎｇ ａｉｒ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：４０ｋＬ／ｈｒ（Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ＝１００％）
Ｉｎｌｅｔ ｔｅｍｐ．：９０℃
Ｏｕｔｌｅｔ ｔｅｍｐ．：５５〜６５℃
〔実施例１３〕凍結粉砕による蛍光標識ＨＡ−ＡＭ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲル微粒子調製
ＨＡ−ＡＥＭＡを用い、凍結粉砕法により注射可能なマイクロゲルの調製を行った。
実施例９で得られたＡＥＭＡ基の導入率が１９モル％であるＨＡ−ＡＥＭＡ ４ｍｇと、実施例５−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ ０．４ｍｇを蒸留水（ミリＱ水、５０μＬ）に溶かした（一晩）。これにＡＥＭＡ／ＳＨ＝１／１モル比になるようにＤＴＴ溶液（２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０μＬ）を添加し、遮光下、３７℃で1時間反応させるとゲルになった。このゲルを３７℃恒温槽（ヤマト科学社製 Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＩＳ４２）で乾燥させ、蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋乾燥ゲル（以下、「乾燥ゲル」とも称す）が得られた。更にここで得られた乾燥ゲルを液体窒素で凍結、ＳＫミル（トッケン製 ＳＫ−１００）で粉砕を繰り返した。以上の操作により蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ封入ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋凍結粉砕ゲル微粒子（以下、「凍結粉砕ゲル」とも称す）が得られた。各試料の粒子をプレパラート上に置き、乾燥状態を顕微鏡で観察した。顕微鏡写真を図２５に示す。得られた凍結粉砕ゲルの粒子径は２〜６μｍであった。
（試験例３）ＨＡ−ＡＥＭＡ架橋ゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＡＭ徐放性能評価
実施例１３で得られた乾燥ゲルおよび凍結粉砕ゲルを１ｍＬのＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、経時的に２００μＬサンプリングを行った。ＧＰＣでバッファー中に放出された蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを定量した。ＧＰＣの測定条件は試験例２と同様である。ゲル中に封入した蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣを１００％とした時のゲルからの蛍光標識ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ放出性を図２６に示す。
図２６より本発明の乾燥ゲルは、長期間の徐放が可能であることが明らかとなった。また、凍結粉砕ゲルは、乾燥ゲルに比べ、微粒子化による表面積の増大により初期バーストが大きくなる傾向が見られるものの、充分に長期間の徐放が可能であることが明らかとなり、注射可能な微粒子で長期の徐放が可能なマイクロゲルの調製が可能であることが明らかとなった。
〔実施例１４〕 水溶性ＨＡ修飾物−ＦａｂコンジュゲートおよびＦａｂの調製
（実施例１４−１） ＩｇＧ Ｆａｂの調製
リン酸緩衝液に溶解されたＩｇＧ溶液（５４．０ｍｇ／ｍＬ、０．８５ｍＬ）にＰＢＳ（１．４４５ｍＬ）を加えて希釈した。この液の０．５ｍＬについて、ＩｇＧ Ｆａｂ調製キット（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ、消化酵素としてＰａｐａｉｎを含む、ＰＩＥＲＣＥ（ピアス）社製）に供し、添付文書記載の通り操作して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（調製キットに含有）による非吸着画分を得た。なお、Ｐａｐａｉｎによる消化は３７℃で１５時間行った。得られた溶液を遠心式限外ろ過器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４、アミコン製）を用いて濃縮後、ＰＢＳで再希釈し、最終的に約１．５ｍＬとした。また、ＩｇＧ Ｆａｂ調製キットによる操作から濃縮までの操作は同一条件で計４回行った。４回の調製で得られた液を混合して、約１１．８ｍｇのＩｇＧ Ｆａｂ（以下、「Ｆａｂ」とも称す）（１．９６ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍＬ）を得た。なお、Ｆａｂの濃度定量は紫外可視吸光度測定法により決定した。
（実施例１４−２） ＦａｂのＦＩＴＣ標識
実施例１４−１で得られたＦａｂ ＰＢＳ溶液（１．９６ｍｇ／ｍＬ、６．０ｍＬ）のうちの５ｍＬを脱塩カラム（ＰＤ−１０、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）で１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．５、以下「ＦＩＴＣバッファー」とも称す）（７ｍＬ）に溶媒置換した。遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０、アミコン製）で約５ｍＬに濃縮し、このうちの４．７８ｍＬに、ＦＩＴＣ濃度が２ｍｇ／ｍＬである１％ＤＭＳＯ含有ＦＩＴＣバッファー溶液（３４２μＬ）を加えて室温、遮光下に２時間反応させた。反応溶液を４℃、遮光下に１ＬのＰＢＳに対して透析精製（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ＭＷＣＯ：１００００、ピアス社製）した。透析外液は２、４、６、１５時間後に全量交換し、更に室温、遮光下に２時間透析した後にＦＩＴＣ標識Ｆａｂ溶液を回収した。脱塩カラムでＦＩＴＣバッファーに溶媒置換し、遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）で約４．５ｍＬに濃縮して、ＦＩＴＣ標識ＦａｂのＦＩＴＣバッファー溶液とした。
（実施例１４−３） ファーマコカイネティクス（ＰＫ）試験用ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ溶液の調製
実施例１４−２で得られたＦＩＴＣ標識ＦａｂのＦＩＴＣバッファー溶液約４．５ｍＬのうちの約１．７５ｍＬを脱塩カラム（ＰＤ−１０）でＰＢＳ（３．５ｍＬ）に溶媒置換した。遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）で約０．５ｍＬまで濃縮して、ＰＫ試験用ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ溶液を得た。得られた溶液から２．５μＬ取りＰＢＳで４０倍希釈して２８０および４９５ｎｍの吸光度を測定した。以下の２つの式でＦａｂ濃度およびＦＩＴＣ／Ｆａｂ比を算出したところ、Ｆａｂ：５．９７ｍｇ／ｍＬ、ＦＩＴＣ／Ｆａｂ：３．２４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
（実施例１４−４） メルカプト基を導入したＦＩＴＣ標識Ｆａｂ（ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ−ＳＨ）の調製
実施例１４―２で得られたＦＩＴＣ標識Ｆａｂ溶液約４．５ｍＬのうちの２．７５ｍＬに２−イミノチオラン塩酸塩（２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ・ＨＣｌ；ＩＴＬ；ピアス社製）ＦＩＴＣバッファー溶液（２ｍｇ／ｍＬ、２８３μＬ）を加え、室温、遮光下に３０分間反応させた。脱塩カラム（ＰＤ−１０）で未反応低分子量成分を除去するとともに１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳに溶媒置換した。得られた溶液を遠心式限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）で約１．２ｍＬに濃縮して、ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ−ＳＨ溶液とした。得られたＦＩＴＣ標識Ｆａｂ−ＳＨ溶液から２．５μＬ取り、ＰＢＳで４０倍希釈して２８０および４９５ｎｍの吸光度を測定した。実施例１４−３と同様にＦａｂ−ＳＨ濃度およびＦＩＴＣ／Ｆａｂ−ＳＨ比を算出したところ、Ｆａｂ−ＳＨ：１．０５ｍｇ／ｍＬ、ＦＩＴＣ／Ｆａｂ−ＳＨ：３．２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。また、得られた液から１５μＬ取り、Ｅｌｌｍａｎ試薬でメルカプト基を定量した。メルカプト基およびＦａｂ−ＳＨ濃度からメルカプト基導入率を算出したところ、メルカプト基／Ｆａｂ−ＳＨ：１．９７（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。以下にＥｌｌｍａｎ試薬によるメルカプト基の定量法を示す。
エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬を用いたメルカプト基の定量方法
［試薬］
反応溶媒：１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
エルマン試薬溶液：エルマン試薬 ４０ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ溶液を反応溶媒で１０倍希釈
［標準物質］
システイン塩酸塩一水和物（以下、「Ｃｙｓ」とも称す）を反応溶媒に溶かして１０．５４ｍｇ／ｍＬ（６０ｍＭ）に調製した。
この液１００μＬを反応溶媒で１０倍希釈し、さらに希釈された液２００μＬを反応溶媒で５倍希釈した（終濃度Ｃｙｓ １．２ｍＭ）。
Ｃｙｓ １．２ｍＭ溶液から２倍希釈列を調製した（濃度８点：０．００９４〜１．２ｍＭ）。
［定量］
反応溶媒 １５０μＬにエルマン試薬溶液３μＬを加えた。エルマン試薬を含む反応溶媒に標準物質あるいは試料溶液１５μＬを加えて撹拌混和した。室温で１５分間静置した後に４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。標準物質の測定値から検量線を作成し、試料溶液中のメルカプト基を定量した。
（実施例１４−５） ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＡＭ（ＥＤＯＢＥＡ導入率：９５．５％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０．６２５ｍＬ）を加えた。Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミド エステル（Ｎ−［κ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌｏｘｙ］−ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ；Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ；ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液（１．０７４ｍｇ／ｍＬ、２．１２５ｍＬ）を加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８３．９５ｍｇ／ｍＬ、２．１２５ｍＬ）を加えて更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥してＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣ（９８．１５ｍｇ）を得た。
（実施例１４−６） ＰＫ試験用ＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲート溶液の調製
実施例１４−５で得られたＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、２．２ｍＬ）に実施例１４−４で得られたＦＩＴＣ標識Ｆａｂ−ＳＨ溶液約１．２ｍＬのうちの１．１ｍＬおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（１．１ｍＬ）を加えて３７℃で２時間インキュベートした。ヨード酢酸 の１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ溶液（５５．８μｇ／ｍＬ、１．１ｍＬ）を加えて、更に１時間インキュベートした。反応混合液を下記の条件でＧＰＣに供してコンジュゲート画分を分取した。ＧＰＣ条件を下記に示す。分取した溶液に１／１０容量の１０ｍＭグリシン含有ＰＢＳを加え、遠心式限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：５００００、フナコシ株式会社製）で約３．０ｍＬまで濃縮して、ＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲート溶液とした。得られたＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲート溶液から１０μＬを取り、ＰＢＳで１０倍希釈して２８０および４９５ｎｍにおける吸光度を測定した。実施例１４−４で測定したＦＩＴＣ標識Ｆａｂ−ＳＨの（４９５ｎｍにおける吸光度）／（２８０ｎｍにおける吸光度）比を用いてＦａｂ濃度を算出したところ、Ｆａｂ：１．０５ｍｇ／ｍＬであった。
ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣあるいはＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ともに、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｒｅｐ ｇｒｅｄｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）
〔試験例４〕 ラットにＨＡ−ＦＩＴＣ標識ＦａｂコンジュゲートおよびＦＩＴＣ標識Ｆａｂを単回静脈内投与したときの血漿中濃度推移
雄性ラット（ｓｌｃ：ＳＤ、日本エスエルシー（株））に、実施例１４−６で得られたＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲート溶液および実施例１４−３で得られたＰＫ試験用ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ溶液（いずれも、１０ｍＭグリシン含有ＰＢＳで希釈して、Ｆａｂ濃度１ｍｇ／ｍＬとした）を３ｍｇ／ｋｇで単回尾静脈内投与した（ｎ＝３）。投与１５、３０分、１、２、４、６、８、２４時間後に頚静脈よりヘパリン処理した２５Ｇ注射針付テルモシリンジを用いて採血した。また、ＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲート投与群に関しては、投与４８、７２、９６および１６８時間後にも採血した。採取した血液は直ちに４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、血漿を分離した。
血漿試料５０μＬにＴｗｅｅｎ ２０ ０．０５％含有ＰＢＳ５０μＬを添加後、溶液の蛍光強度を蛍光検出器にて測定した。また、投与液を用いて標準曲線を作成し、それを基に総蛍光強度に基づく血漿中濃度を算出した。蛍光強度測定後、血漿試料を下記の条件でＧＰＣに供し、総蛍光強度に対するＨＡ−ＦＩＴＣ標識ＦａｂコンジュゲートおよびＦＩＴＣ標識Ｆａｂの蛍光強度の割合を測定した。総蛍光強度に基づく血漿中濃度に上記割合を乗じて血漿中ＨＡ−ＦＩＴＣ標識ＦａｂコンジュゲートおよびＦＩＴＣ標識Ｆａｂ濃度を算出した。
ＨＡ−ＦＩＴＣ標識ＦａｂコンジュゲートおよびＦＩＴＣ標識Ｆａｂ投与群ともに血漿中濃度は二相性で減少した（図２７）。ＦＩＴＣ標識Ｆａｂの消失相の半減期は１．５０時間であり、ＦＩＴＣ標識Ｆａｂは素早く循環血より消失したのに対し、ＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲートの半減期は３８．８９時間であり、ＨＡ−ＦＩＴＣ標識Ｆａｂコンジュゲートの血中滞留性の大幅な延長が確認された。
ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＬＣ−１０Ａ（島津製作所）あるいはＷａｔｅｒｓ ６００Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ）
蛍光検出器：Ｌ−７４８０(日立製作所)あるいはＷａｔｅｒｓ ４７４（Ｗａｔｅｒｓ）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷXL（ＴＯＳＯＨ社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０５％含有ＰＢＳ
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：４９０ｎｍ励起による５１８ｎｍの蛍光強度
〔実施例１５〕水溶性ＨＡ修飾物−ＧＬＰ−１コンジュゲートの調製
（実施例１５−１） ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣの調製
ＢＯＰ試薬をＨＡユニットに対し２．５の等量比とした以外は実施例３−１と同様にして得たＨＡ−ＡＭ（ＥＤＯＢＥＡ導入率：９５．５％）水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１７．６６ｍＬ）に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２２．０７５ｍＬ）を加えた。Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミド エステル（Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ；ピアス社製）のＤＭＳＯ溶液（０．５７３ｍｇ／ｍＬ、４．４１５ｍＬ）を加え、室温で３０分間振とうした。無水コハク酸ＤＭＳＯ溶液（２８３．９５ｍｇ／ｍＬ、４．４１５ｍＬ）を加えて、更に室温で１．５時間振とうした。４℃で大過剰量の蒸留水（ミリＱ水）に対して透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ−１４ｋＤａ）、得られた溶液を凍結乾燥して、マレイミド基およびコハク酸が導入されたヒアルロン酸修飾物（以下、「ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣ」とも称す、１７７．８０ｍｇ）を得た。
（実施例１５−２） ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液の調製
天然型のＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；特表平７−５０４６７９号公報記載）の２番目（８位）のアラニンをグリシンに、３１番目（３７位）のグリシンをシステインに変更した変異体（以下、「ＧＬＰ−１変異体」とも称す）を固相法ペプチド合成法で得た（ペプチド研究所社(株)製）。ＧＬＰ−１変異体の０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）にトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩（以下、「ＴＣＥＰ」とも称す）水溶液（２０ｍＭ）を１／２０容量加えた。このＴＣＥＰを含むＧＬＰ−１変異体溶液（１．３２６３ｍＬ）を実施例１５−１で得たＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣ水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍＬ）に加え、３７℃で２時間インキュベートした。同じＴＣＥＰを含むＧＬＰ−１変異体溶液（１．３２６３ｍＬ）を再度添加し、同様にインキュベートした。システイン塩酸塩一水和物の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液（３．６ｍｇ／ｍＬ、０．３８５３ｍＬ）を加え、更に３７℃で１時間インキュベートした。反応混合液を３回に分けて下記の条件でＧＰＣに供してコンジュゲート画分を分取した。分取した画分を遠心式限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：５００００、フナコシ株式会社製）で約４．８５ｍＬまで濃縮して、標題のＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液を得た。ＧＬＰ−１変異体を使用せずに本実施例と同様の操作を行なって得られた試料を対照として補正に用い、得られたＨＡ−ＧＬＰ−１変異体溶液の２８０ｎｍにおける吸光度とカルバゾール−硫酸法で、ＧＬＰ−１変異体濃度、ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣ濃度およびＧＬＰ−１変異体導入率を算出した。ＧＬＰ−１変異体が４２．６ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＨＡ−ＡＭ−ＭＩ／ＳＵＣが３．５４ｍｇ／ｍＬ、ＧＬＰ−１変異体が３．７／ＨＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。
ＧＰＣ条件
Ｓｙｓｔｅｍ：ＦＰＬＣ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
ＧＰＣ Ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｒｅｐ ｇｒｅｄｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）
Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カルバゾール−硫酸法によるＨＡ修飾物定量方法
［試薬］
硫酸溶液：Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏの硫酸溶液（２５ｍＭ）
カルバゾール溶液：カルバゾールのエタノール溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬ：０．１２５％）
［標準物質］
Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミド エステルのＤＭＳＯ溶液を加えないこと以外は実施例１５−１と同様にして、ＨＡ−ＡＭに無水コハク酸のみが導入されたヒアルロン酸修飾物（ＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ）を調製し、ＰＢＳに溶解して０．５ｍｇ／ｍＬとした。この０．５ｍｇ／ｍＬのＨＡ−ＡＭ−ＳＵＣ溶液から２倍希釈列を調製した（濃度５点：０．０３１２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ）。
［定量］
氷冷した硫酸溶液（１ｍＬ）に、ＰＢＳ（対照）および標準物質（各０．２ｍＬ）、ならびに実施例１５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液をＰＢＳで１９．８倍希釈して得た溶液（０．２ｍＬ）を加え、混合した。熱水浴中で２５分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。それぞれにカルバゾール溶液（４０μＬ）を加えて混合した。再度熱水浴中で約３０分間加熱した後、流水で室温まで冷却した。５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、対照および標準物質の吸光度から検量線を作成し，試料溶液に含まれるＨＡ修飾物の濃度を定量した。
〔試験例５〕ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートの血中滞留時間評価
ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート投与ラット血漿サンプル
実施例１５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液をＴｗｅｅｎ ８０を０．０５％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４；以下、「溶媒Ｚ」とも称す）で希釈し、５０μｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後１、４、８、２４、４８、７２、９６、および１６８時間で採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。
測定方法
ＧＬＰ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ａｍｅｒｉｃａ；以下、「キットＷ」とも称す）の９６穴プレートに検量線用標準試料および測定用試料を分注し、マイクロプレートリーダーを用いて分析を行った。以下に条件を示す。
マイクロプレートリーダー：ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：３５５ｎｍ，ＥＭ：４６０ｎｍ）
測定試料の調製
・検量線用試料；
実施例１５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液を溶媒ＺおよびキットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈し、１２．８、６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬの標準液を調製した。この標準液に５μＬの正常ラット血漿を添加し、検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート投与ラット血漿サンプルに、キットＷに同封されたＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート濃度を算出した。
薬物動態データ
投与したＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートの血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ４．０．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の血漿中濃度推移についてモデル非依存的解析を行い、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。半減期（ｔ１／２）は各個体の測定可能な最終３点のデータを用いて算出した。ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートの血中濃度推移を図２８に示す。また、算出した薬物動態学的パラメーターを表１２に示す。
天然型のＧＬＰ−１および天然型のＧＬＰ−１の２番目のアラニンをグリシンに変更した変異体を、ヒトおよびブタに静脈内投与したときの半減期が１〜５分であることが報告されている（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１０巻、第２４７１−２４８３頁、２００３年およびＤｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第４１巻、第２７１−２７８頁、１９９８年）。図２８および表１２から、ＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートをラットに静脈内投与したときの半減期は、２３．６時間、ＭＲＴは３０．２時間となり、天然型のＧＬＰ−１などと比較して大幅に血中滞留性の延長が起きたことが示唆された。
〔試験例５〕経口糖負荷試験
８週齢の雄性ＢＫＳ．Ｃｇ−＋ Ｌｅｐｒdb／＋ Ｌｅｐｒdb／Ｊｃｌマウス（日本クレア株式会社製）を一晩絶食した後、実施例１５−２で得られたＨＡ−ＧＬＰ−１変異体コンジュゲート溶液を溶媒Ｚで希釈したもの（ペプチド量として、１．５μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇまたは１５０μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを静脈内投与し、静脈内投与１分後に５０％グルコース溶液（（株）大塚製薬工場）を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。同様にＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７；株式会社ペプチド研究所製）を溶媒Ｚで希釈したもの（１５０μｇ／ｋｇまたは１５００μｇ／ｋｇ）または溶媒Ｚを静脈内投与し、静脈内投与１分後に５０％グルコース溶液を３ｇ／ｋｇになるように経口投与した。
グルコース投与前（０時間の値とする）、グルコース投与０．５、１、２、および４時間後に尾部より血液を採取し、血糖値を酵素法（ヘキソキナーゼ法、オートセラＳ ＧＬＵ（第一化学薬品（株）；機器名：ＢｉｏＭａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ−ＢＭ１２５０（日本電子（株））にて測定した。
以下の式より血糖降下率を算出した。
ここで、血糖上昇値のＡＵＣとは、横軸にグルコース投与後の時間、縦軸に各個体の血糖値をプロットし、各点を直線で結んで得られるグラフの曲線下面積から、各個体のグルコース投与前の血糖値がグルコース投与４時間後まで変化無く一定であったとした場合のグラフの曲線下面積を減算したものである。具体的には、Ａ1＝グルコース投与前の血糖値、Ｂ1＝グルコース投与３０分後の血糖値、Ｃ1＝グルコース投与１時間後の血糖値、Ｄ1＝グルコース投与２時間後の血糖値、Ｅ1＝グルコース投与４時間後の血糖値としたとき、血糖上昇値のＡＵＣは、以下の式：
から求めることができる。
算出された血糖降下率から、各群ごとに平均値及び標準偏差を算出し、表１３および表１４に示した。ＨＡ-ＧＬＰ−１変異体コンジュゲートでは、ＧＬＰ−１（Ｈｕｍａｎ、７−３７）と比較して、血糖降下作用が大幅に増大し、糖尿病治療剤としての有用性が示唆された。

Claims (40)

  1. 非プロトン性極性溶媒中で、式（ＩＩ）：
    ［式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、それぞれ独立にＣ1-6アルキル基から選択され、またはＲ10およびＲ11、Ｒ12およびＲ13、ならびにＲ14およびＲ15は、それぞれ独立にそれらが結合する窒素原子と一緒になって含窒素ヘテロ環を形成してもよく、環Ｂは置換されていてもよい単環式または縮環式の含窒素ヘテロ環基であり、Ｘ-はアニオンを表す］
    で表される縮合剤を使用して、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、５モル％以上の修飾率で置換アミド基に変換する工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  2. カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、少なくとも１以上の官能基を含み、当該官能基が、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基から選択される、請求項１に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  3. カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基から選択される１つの官能基を含む、請求項１に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  4. カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、メルカプト基、メタクリロイル基またはアクリロイル基から選択される１または２種類の官能基を各置換基中に１〜９個含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  5. 各置換アミド基中の官能基数が１〜４個である、請求項４に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  6. カルボキシ基の変換により生じる置換アミド基の置換基が、アミノアルキル基（このアミノアルキル基のアルキレン鎖は１以上の水酸基で置換されていてもよい）、アミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、ヒドロキシアルキル基（このヒドロキシアルキル基のアルキレン鎖は１以上の水酸基で置換されていてもよい）、ヒドロキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、ヒドロキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メルカプトアルキル基、メルカプト（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メルカプト（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシアルキル基、メタクリロイルアミノアルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、メタクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシアルキル基、アクリロイルアミノアルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基、アクリロイルアミノ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基、アクリロイルオキシ（ポリアルキレンオキシ）アルキル基またはアクリロイルオキシ（ポリアルキレンアミノ）アルキル基である、請求項４に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  7. ヒアルロン酸またはその誘導体と、以下の式：
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ2；
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ1−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＮＨ2；
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−ＯＨ；
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ2−ＣＨ2−ＣＨ2）r−ＯＨ；
    Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）j−ＳＲ7；
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−ＳＲ8；
    Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ16）＝ＣＨ2；
    Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）q−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ17）＝ＣＨ2；
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ18）＝ＣＨ2；または
    Ｈ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ19）＝ＣＨ2
    ［式中、ｍ、ｌ、ｐ、ｊおよびｑは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、ｎ、ｒ、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１〜２００から選択される整数であり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、Ｒ7は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2）j−ＮＨ2であり、Ｒ8は、水素原子、保護基または−Ｓ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｙ3）z−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2であり、Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18、およびＲ19はそれぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4およびＹ5は、それぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−である］
    から選択される１以上の化合物と反応させることにより置換アミド基を形成する、請求項１〜４および６のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  8. 水溶性ヒアルロン酸修飾物が２以上の種類の置換アミド基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  9. 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が式（Ｉ）：
    ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-6アルキルカルボニル基から選択され、
    Ｒａは、水素原子またはＣ1-6アルキル基であり、
    Ｒｂは、水素原子、Ｃ1-6アルキル基または基−ＣＯ−Ｃ（Ｒ20）＝ＣＨ2であり、
    Ａは、−ＣＨ2−（ＣＨＲ5）m-2−ＣＨ2−ＮＨ−、−ＣＨ2−（ＣＨＲ6）p-2−ＣＨ2−Ｏ−、−（ＣＨ2）j−Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ3−ＣＨ2−ＣＨ2）z−Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ4−ＣＨ2−ＣＨ2）t−ＮＨ−または−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｙ5−ＣＨ2−ＣＨ2）y−Ｏ−であり、
    ここで、ｍ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、ｚ、ｔおよびｙは、それぞれ独立に１〜２００から選択される整数であり、Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立に水素原子または水酸基であり、Ｒ20は、水素原子またはメチル基であり、Ｙ3、Ｙ4およびＹ5は、それぞれ独立して、酸素原子または−ＮＨ−である］
    で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  10. 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が薬物担体として使用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  11. 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  12. 前記水溶性ヒアルロン酸修飾物の哺乳動物における平均血中滞留時間が１８時間以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  13. 非プロトン性極性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、スルホラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはこれらの２種以上の混合溶媒から選択される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  14. 非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項１３に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  15. 式（ＩＩ）において、環Ｂがベンゾトリアゾール−１−イルである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  16. 前記縮合剤が、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、およびこれらの混合物から選択されるＢＯＰ系縮合剤である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  17. 修飾率が３０モル％以上である、請求項１〜１６に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  18. 修飾率が７０モル％以下である、請求項１〜１７に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造方法により得ることができる水溶性ヒアルロン酸修飾物。
  20. 請求項１９に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物であって、ヒアルロン酸をその構成ユニットの２糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和２糖分解物を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を測定した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対する２糖に由来するピークエリアの分率が３０％以下である、水溶性ヒアルロン酸修飾物。
  21. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体。
  22. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体。
  23. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物。
  24. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物および薬物を含んでなる水溶性ヒアルロン酸修飾物−薬物コンジュゲート。
  25. 請求項１９または２０に記載のヒアルロン酸修飾物を架橋することで得ることができるヒアルロン酸ゲル。
  26. 請求項２５に記載のヒアルロン酸ゲルを乾燥させることで得ることができるヒアルロン酸ゲル。
  27. 薬物の封入に使用される、請求項２５または２６に記載のヒアルロン酸ゲル。
  28. 封入できる薬物が、高分子と薬物とのコンジュゲートである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲル。
  29. 請求項２７または２８に記載のヒアルロン酸ゲルを含む医薬組成物。
  30. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む、医療用デバイス。
  31. 請求項１９または２０に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施した、請求項３０に記載の医療用デバイス。
  32. 請求項１９または２０に記載のヒアルロン酸修飾物からヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、
    ａ）請求項１９または２０に記載のヒアルロン酸修飾物を含む希薄溶液を調製する工程；
    ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
    ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸修飾物の架橋反応を進行させる工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法。
  33. 前記工程ｂ）が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項３２に記載の製造方法。
  34. 請求項１９または２０に記載のヒアルロン酸修飾物からヒアルロン酸ゲル微粒子を製造する方法であって、
    ａ）請求項２５に記載のヒアルロン酸ゲルを乾燥する工程；
    ｂ）得られた乾燥物を凍結する工程；および
    ｃ）得られた凍結物を粉砕する工程を含むヒアルロン酸ゲル微粒子製造方法。
  35. 得られる微粒子の平均粒子径が０．０１μｍ〜１５０μｍである、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の製造方法。
  36. 得られる微粒子が薬物担体である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の製造方法。
  37. 得られる微粒子が薬物徐放担体である、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の製造方法。
  38. 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、請求項３２、３３、および３５〜３７のいずれか１項に記載の製造方法。
  39. 請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の方法で得ることができるヒアルロン酸ゲル微粒子。
  40. 請求項３９に記載のヒアルロン酸ゲル微粒子を含む医薬組成物。


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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017514836A (ja) * 2014-05-07 2017-06-08 ネミシス リミテッド セリアック病の経口酵素治療のためのメタクリルヒアルロン酸誘導体のヒドロゲル

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5443976B2 (ja) * 2007-05-01 2014-03-19 国立大学法人 東京医科歯科大学 化学架橋ヒアルロン酸誘導体を含むハイブリッドゲルおよびそれを用いた医薬組成物
CN101998868B (zh) * 2008-05-01 2014-06-04 泰尔茂株式会社 视认性医用处置材料
FR2931360B1 (fr) * 2008-05-20 2012-05-18 Centre Nat Rech Scient Nanoparticules contenant un peptide, vecteurs les contenant et utilisations pharmaceutiques desdits nanoparticules et vecteurs
US8759322B2 (en) * 2008-11-05 2014-06-24 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Hyaluronic acid derivative and pharmaceutical composition thereof
ITRM20080636A1 (it) * 2008-11-28 2010-05-29 Univ Palermo Procedimento per la produzione di derivati funzionalizzati dell acido ialuronico e relativi idrogeli.
JP5775004B2 (ja) * 2009-03-03 2015-09-09 アクセス メディカル システムズ，リミティド 高感度蛍光分析のための検出システム及び方法
EP2459239A1 (en) 2009-07-30 2012-06-06 Carbylan Biosurgery, Inc. Modified hyaluronic acid polymer compositions and related methods
KR20130031296A (ko) 2010-05-21 2013-03-28 케밀리아 에이비 신규한 피리미딘 유도체
JP2013533362A (ja) * 2010-07-29 2013-08-22 ユニバーシティ オブ ジュネーブ ヒアルロン酸の疎水性有機化合物とのエステル化用のプロセス
CZ305040B6 (cs) * 2010-09-14 2015-04-08 Contipro Biotech S.R.O. Způsob přípravy vysoce substituovaných amidů kyseliny hyaluronové
FR2967678A1 (fr) * 2010-11-18 2012-05-25 Centre Nat Rech Scient Derives de polysaccharides comprenant un motif maleimide et reaction de couplage par chimie thio-clic
PL2682409T3 (pl) 2011-03-03 2017-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pochodna kwasu hialuronowego zmodyfikowana kwasem aminokarboksylowym
DK2688883T3 (en) 2011-03-24 2016-09-05 Noviga Res Ab pyrimidine
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
TWI424007B (zh) 2011-12-22 2014-01-21 Ind Tech Res Inst 使膠體交聯的方法與藉由此方法形成之經交聯的膠體
CN104603156B (zh) 2012-09-05 2016-10-26 中外制药株式会社 引入有氨基酸和甾基的透明质酸衍生物
KR101445265B1 (ko) * 2012-09-18 2014-09-30 포항공과대학교 산학협력단 히알루론산-핵산 접합체 및 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물
HUE035803T2 (en) 2012-12-21 2018-05-28 Sanofi Sa Dual GLP1 / GIP or trigonal GLP1 / GIP / glucagon agonists
US9572832B2 (en) * 2013-08-29 2017-02-21 Holy Stone Healthcare Co., Ltd. Compound of glycosaminoglycan and its fabrication method as well as application
CZ2014451A3 (cs) 2014-06-30 2016-01-13 Contipro Pharma A.S. Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití
CZ309295B6 (cs) 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CZ306479B6 (cs) 2015-06-15 2017-02-08 Contipro A.S. Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin
CZ306662B6 (cs) 2015-06-26 2017-04-26 Contipro A.S. Deriváty sulfatovaných polysacharidů, způsob jejich přípravy, způsob jejich modifikace a použití
EP3108874A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 TRB Chemedica AG Ophthalmologic pharmaceutical composition
CN109475573A (zh) * 2016-06-13 2019-03-15 珀杜研究基金会 响应性弹性聚合物及其制备和使用方法
CZ308106B6 (cs) 2016-06-27 2020-01-08 Contipro A.S. Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
AR110299A1 (es) * 2016-12-02 2019-03-13 Sanofi Sa Conjugados que comprenden un agonista dual de glp-1 / glucagón, un conector y ácido hialurónico
EP3695288B1 (en) * 2017-10-09 2023-07-19 Total Solar International Decoupled modeling methods and systems
JP7221211B2 (ja) 2017-11-15 2023-02-13 中外製薬株式会社 ポリエチレングリコールにより修飾されたヒアルロン酸誘導体
UY38249A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Sanofi Sa Productos conjugados que comprenden un agonista del receptor triple de glp-1/glucagón/gip, un conector y ácido hialurónico
MA52880A (fr) 2018-06-15 2021-09-22 Croma Pharma Ges M B H Composition d'hydrogel comprenant un polymère réticulé
EP3806917A1 (en) 2018-06-15 2021-04-21 Croma-Pharma GmbH Hydrogel composition comprising a crosslinked polymer
EP4077402B1 (en) 2019-12-19 2024-05-01 Croma-Pharma GmbH Thiol-modified hyaluronan and hydrogel comprising the crosslinked hyaluronan
CN112472705B (zh) * 2020-12-11 2022-11-11 武汉理工大学 一种双药联合智能抗菌水凝胶的制备方法及其应用
JP2021072906A (ja) * 2021-01-18 2021-05-13 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 皮膚充填剤用途のためのコアセルベートヒアルロナンヒドロゲル
WO2024016079A1 (en) * 2022-07-19 2024-01-25 University Of Ottawa Methods for transforming polysaccharides to cross-linkable polysaccharides and products thereof
CN115389681B (zh) * 2022-11-01 2023-01-20 常州百瑞吉生物医药有限公司 一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法
CN115944545B (zh) * 2023-03-10 2023-05-26 广州贝塔健康生物科技有限公司 一种三螺旋胶原蛋白真皮水凝胶及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001524156A (ja) * 1997-05-06 2001-11-27 キトジェニックス インコーポレイテッド 共有結合ｎ，ｏ−カルボキシメチルキトサン及びその使用方法
JP2002529550A (ja) * 1998-11-11 2002-09-10 アクイジティオ ソチエタ ペル アツィオニ 架橋ヒアルロン酸及びその医療上の使用
JP2002256075A (ja) * 2001-02-28 2002-09-11 Sentomedo:Kk 温度応答性材料およびそれを含む組成物
WO2003087019A1 (fr) * 2002-04-18 2003-10-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisya Produit de modification d'acide hyaluronique
WO2004046200A1 (ja) * 2002-11-21 2004-06-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 薬物徐放担体

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5140201A (ja) 1974-10-01 1976-04-03 Dainippon Ink & Chemicals Heihaninsatsubanyokankoseisoseibutsu
US4582865A (en) 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US4605691A (en) 1984-12-06 1986-08-12 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US6174999B1 (en) * 1987-09-18 2001-01-16 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of polyanionic polysaccharides
US5356883A (en) 1989-08-01 1994-10-18 Research Foundation Of State University Of N.Y. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use
JPH0585942A (ja) 1991-02-26 1993-04-06 Denki Kagaku Kogyo Kk インターフエロン−ヒアルロン酸及び／又はその塩の結合体
JPH05140201A (ja) 1991-11-25 1993-06-08 Shiseido Co Ltd 架橋ヒアルロン酸ゲル及びその製造方法
ES2149867T3 (es) 1993-02-26 2000-11-16 Drug Delivery System Inst Ltd Derivados de polisacaridos y soportes para farmacos.
US5616568A (en) 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
US6025444A (en) 1994-11-17 2000-02-15 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Cinnamic acid derivative
JP3308742B2 (ja) 1994-11-17 2002-07-29 生化学工業株式会社 光架橋性ヒアルロン酸誘導体とその架橋体およびそれらの製造方法
US5827937A (en) 1995-07-17 1998-10-27 Q Med Ab Polysaccharide gel composition
JP4018181B2 (ja) * 1995-11-07 2007-12-05 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン誘導体およびその製造法
KR100236771B1 (ko) 1997-04-01 2000-02-01 성재갑 히아루론산을 이용한 약물의 서방성 미세입자 제형
ITPD980169A1 (it) 1998-07-06 2000-01-06 Fidia Advanced Biopolymers Srl Ammidi dell'acido ialuronico e dei suoi derivati e processo per la loro preparazione.
AU6357900A (en) 1999-07-20 2001-02-05 Amgen, Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates, pharmaceutical compositions and related methods
WO2001060412A2 (en) 2000-02-15 2001-08-23 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
GB0129489D0 (en) * 2001-12-10 2002-01-30 Quadrant Healthcare Uk Ltd Sustained-release compositions
WO2003094842A2 (en) * 2002-05-07 2003-11-20 A & D Bioscience, Inc. Conjugates comprising central nervous system active drug
JP2004018750A (ja) * 2002-06-18 2004-01-22 Seikagaku Kogyo Co Ltd 親水性を向上したヒアルロン酸誘導体の製造方法
JPWO2004050712A1 (ja) * 2002-11-29 2006-03-30 中外製薬株式会社 薬物徐放担体
WO2004060404A1 (ja) * 2002-12-27 2004-07-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 薬物担体
US7767806B2 (en) * 2003-09-08 2010-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hyaluronic acid modification products and drug carriers using them
TW200526253A (en) * 2003-11-14 2005-08-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Cross-linked polysaccharide microparticles and process for producing the same
WO2005054302A1 (ja) * 2003-12-05 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 薬物担体及びその製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001524156A (ja) * 1997-05-06 2001-11-27 キトジェニックス インコーポレイテッド 共有結合ｎ，ｏ−カルボキシメチルキトサン及びその使用方法
JP2002529550A (ja) * 1998-11-11 2002-09-10 アクイジティオ ソチエタ ペル アツィオニ 架橋ヒアルロン酸及びその医療上の使用
JP2002256075A (ja) * 2001-02-28 2002-09-11 Sentomedo:Kk 温度応答性材料およびそれを含む組成物
WO2003087019A1 (fr) * 2002-04-18 2003-10-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisya Produit de modification d'acide hyaluronique
WO2004046200A1 (ja) * 2002-11-21 2004-06-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 薬物徐放担体

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017514836A (ja) * 2014-05-07 2017-06-08 ネミシス リミテッド セリアック病の経口酵素治療のためのメタクリルヒアルロン酸誘導体のヒドロゲル

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