JP2017514836A - セリアック病の経口酵素治療のためのメタクリルヒアルロン酸誘導体のヒドロゲル - Google Patents

Abstract

本発明は、セリアック病の経口処置用のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）およびエンドプロテアーゼ（ＥＰ）からなる群から選択される外来酵素を導入された、官能基化ヒアルロン酸誘導体由来のヒドロゲルを含む組成物に関する。特に、本発明は、ヒアルロン酸のヒドロキシル基に特定の活性基を形成し、その後、挿入した活性基をエチレンジアミンで置換し、最後に、メタクリル酸無水物との反応により、ヒアルロン酸のメタクリル酸誘導体を調製するのに有用なワンポット法に関する。得られたメタクリルヒアルロン酸誘導体は、照射によりプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）およびエンドプロテアーゼ（ＥＰ）からなる群から選択される外来酵素を導入したヒドロゲルの調製に使用される。調製されたヒドロゲルは、人工胃腸液中で活性型としての酵素放出を可能にする能力が証明されている。【選択図】図１０

Description

本発明は、少なくとも１つの外来酵素を導入したヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルを含む医薬組成物であって、前記酵素はプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ：ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、エンドプロテアーゼ（ＥＰ：ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択され；前記組成物はセリアック病の経口処置用である医薬組成物に関する。

セリアック病は、この複雑な炎症性疾患に環境要因が関与している場合でも、やはり遺伝的感受性がある者にグルテンにより引き起こされる小腸病変である。

グルテンは、ヒト胃腸管の酵素にとって好ましい基質でないプロリンおよびグルタミンが多く含まれる、グリアジンとグルテニンとの混合物である。その結果、グルテンは、ヒトにおいて完全には分解されず、最大３０〜４０アミノ酸の準安定な免疫原性ペプチドが産生される。特に、代表的なグルテンタンパク質α２−グリアジンの配列は、胃内のペプシンにより切断されて大きなペプチドを形成し、これが小腸の管腔内で吸収のため膵臓プロテアーゼおよび腸管刷子縁膜のペプチダーゼにより単一アミノ酸、ジ−およびトリ−ペプチドに消化される。しかしながら、３３ｍｅｒ配列は消化を通じて存続して上皮性関門を通過し、選択されたグルタミン残基でトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）により脱アミノ化される。粘膜固有層において、脱アミノ化３３ｍｅｒに由来するエピトープは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）ＤＱ２に対して高親和性を示す。抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）の表面上の脱アミノ化グルテンペプチド−ＤＱ２複合体は、グルテン特異的腸管Ｔ細胞から強力な炎症反応を惹起し、これが腸管構造の破壊、栄養素の吸収障害、下痢および貧血を引き起こす。

完全なグルテンフリー食により大部分の患者のセリアック病の徴候および症状の回復が可能になり、これまでこの病変の唯一の処置である。言うまでなく、グルテンはヒトの食事に広く含まれているため、この制限はつらい経験であり、多くの場合、生活の質の低下を伴う。さらに、グルテンフリーの食物は非常に高価であり、したがって最適とは言えない味に加えて、経済的理由により患者はためらってしまうことが多い。

残念ながら、自発的かどうかに関わらず、厳格なグルテンフリー食に対する患者のコンプライアンスが不良であると、骨粗鬆症、二次性免疫障害、悪性腫瘍等の罹患率および死亡率の上昇に関連し得る合併症が起こる。

したがって、中でも外来プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）の経口投与を含む、グルテンフリー食の代替治療法が強く求められている。

胃腸管のヒト酵素と異なり、外来ＰＥＰは、プロリンリッチなグルテンペプチドを効率的に加水分解し、次いで炎症反応を回避することができる。

この目的で、異なる配列および鎖長特異性、ならびに酸性媒体中または消化管プロテアーゼの存在下での安定性を有するフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＦＭ）、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）（ＭＸ）、スフィンゴモナス・カプスラータ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ）（ＳＣ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＡＮ）に由来するＰＥＰなど様々なＰＥＰが提案されている（非特許文献１）。

しかしながら、これらの酵素の経口投与では、酵素を変化させることのない製造プロセスと、好ましくは時間をかけて徐々に一定に活性型として有効用量で胃および／または腸管においてそれが放出されることとの両方を許容する適切な製剤を選択することが必要である。

これまでＰＥＰを含む経口製剤は市場にない一方、臨床試験においてはＰＥＰ ＳＣとＥＰ−Ｂ２（オオムギエンドプロテアーゼ）との、ＡＬＶ００３というブランドの組み合わせなど、ほんの数例が存在する（非特許文献２）。

しかしながら、現在まで検討された経口酵素治療は、＞１３ｇになる通常の１日のグルテン摂取の免疫原性エピトープを十分に分解できずに、むしろグルテン感受性の高いまたは難治性１型セリアック病の患者において数百ミリグラムから数グラムのグルテンの有害作用を除去できるか、またはグルテンフリー食の時々の不遵守を許容できるかであるようである。

最後に、これまで提案された経口治療はおそらく、食事性グルテンが意図的にまたは意図せずに摂取されるあらゆる食事と共に、ＰＥＰの投与を必要とすると考えられる。

以上のように当該分野では、前の部分の欠点に悩まされない、セリアック病の経口処置に使用される外来ＰＥＰの放出の改善が求められている。

したがって、本発明は、胃腸管において活性型の酵素を有効用量で徐々に放出することができ、ＰＥＰおよび／またはＥＰ投与を１日１回にすることができる、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）およびエンドプロテアーゼ（ＥＰ）からなる群から選択される外来酵素の経口投与用の新規な製剤を提供する目的を有する。

定義および略語
ＥＤＡ：エチレンジアミン
ＥＰ：エンドプロテアーゼ
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＭＡ：メタクリル酸無水物
ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ：少なくとも１つのヒドロキシル基がエチレンジアミン（ＥＤＡ）との反応およびその後のメタクリル酸無水物（ＭＡ）との反応で官能基化されているヒアルロン酸
ＰＥＰ：プロリルエンドペプチダーゼ
ＰＥＰ ＦＭ：フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来するプロリルエンドペプチダーゼ
ＰＥＰ ＭＸ：ミキソコッカス・ザンサスに由来するプロリルエンドペプチダーゼ
ＰＥＰ ＳＣ：スフィンゴモナス・カプスラータに由来するプロリルエンドペプチダーゼ
ＰＥＰ ＡＮ：アスペルギルス・ニガーに由来するプロリルエンドペプチダーゼ

ベチューン（Ｂｅｔｈｕｎｅ）ＭＴおよびコースラ（Ｋｈｏｓｌａ）Ｃ著、「Ｏｒａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．」メソッズ・イン・エンジモノジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、２０１２年、第５０２巻、ｐ．２４１〜２７１ タイ−ディン（Ｔｙｅ−Ｄｉｎ）ＪＡ、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ＲＰ、フレンチ（Ｆｆｒｅｎｃｈ）ＲＡ、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ＧＪ、ホドスマン（Ｈｏｄｓｍａｎ）Ｐ、シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）Ｍ、ボトウィック（Ｂｏｔｗｉｃｋ）Ｗ、シュリーニワズ（Ｓｈｒｅｅｎｉｗａｓ）Ｒ著、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＬＶ００３ ｐｒｅ−ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．」クリニカルイムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１３４巻、ｐ．２８９〜９５

本発明は、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、エンドプロテアーゼ（ＥＰ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、光架橋型メタクリルヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ）ヒドロゲルに包括された、少なくとも１つの外来酵素を含む組成物であって、ヒアルロン酸誘導体は５０，０００〜１，５００，０００ダルトンの分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩を含み、好ましくはワンポット合成を用いることにより少なくとも１つのヒドロキシル基が、炭酸フェニルエステルまたはギ酸フェニルエステルの間で選択される炭酸化剤で活性化後、エチレンジアミン（ＥＤＡ）との反応およびその後のメタクリル酸無水物（ＭＡ）との反応で官能基化されている組成物を提供する。

得られた組成物は、ゲルまたは凍結乾燥粉末として調製される。

ヒドロゲルに包括された酵素は驚くべきことに、凍結乾燥プロセス中の分解から保護され、したがって凍結乾燥された粉末形態としての本発明の組成物の製造、および安定な長期保管期間を可能にした。

本発明による組成物は、グリアジンペプチドを解毒できる活性型としての外来酵素の人工胃腸液における持続的な放出を可能にする。したがって本発明による組成物はセリアック病の処置に使用するのに好適であり、セリアック病患者のグリアジンペプチドを解毒できる活性型としての酵素（ＰＥＰ、ＥＰまたはそれらの組み合わせ）の経口投与および持続放出のため、腸溶コーティングを用いてまたは用いずに顆粒、カプセルまたは錠剤のような従来の経口剤形を調製するのに使用してもよい。したがって本発明の主題はまた、本発明による組成物と、セリアック病の処置に使用される少なくとももう１つの薬学的に許容される成分とを含む経口医薬製剤である。

出発ポリマー、すなわちヒアルロン酸の粘膜付着特性により、胃腸管の粘膜への接着と、その結果として、グリアジンペプチドを解毒しなければならない部位での酵素（ＰＥＰ、ＥＰまたはそれらの組み合わせ）を導入した製剤の耐久時間を長くすることとが可能になり得る。

本発明のさらなる目的は、メタクリルヒアルロン酸誘導体を調製するためのプロセスであって、ヒアルロン酸のヒドロキシル基がエチレンジアミン、次いでメタクリル酸無水物で官能基化され、前記プロセスがワンポットプロセスであるプロセスである。

ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ溶液の光照射に使用されるパイレックス（登録商標）管−ピストン系のスキームを示す。 ４℃で５日まで保存後に酵素で処理した基質溶液（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ）の３８０ｎｍの吸光度（ＡＢＳ：ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）指標で表したリン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの安定性を示す。 ３６６ｎｍで様々な時間照射後に酵素で処理した基質溶液（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ）の３８０ｎｍの吸光度（ＡＢＳ）指標で表したＰＥＰ ＦＭ活性を示す。 その調製直後（ａ）および４℃で１０日間保存後（ｂ）に解析したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルから放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。 その調製直後（ａ）、４℃で１０日間保存後（ｂ）および−２０℃で１０日間保存後（ｃ）に解析したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ凍結乾燥粉末から放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。 その調製直後（ａ）、４℃で１０日間保存後（ｂ）および−２０℃で１０日間保存後（ｃ）に解析した、１．５ｗ／ｗのトレハロースの存在下でのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ凍結乾燥粉末から放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。 その調製直後（ａ）、４℃で１０日間保存後（ｂ）および−２０℃で１０日間保存後（ｃ）に解析した、３％ｗ／ｗのトレハロースの存在下でのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ凍結乾燥粉末から放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。 ４℃で１０日間（ａ）、１ヶ月（ｂ）および２ヶ月（ｃ）保存後に解析した、３％ｗ／ｗのトレハロースの存在下でＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ凍結乾燥粉末から放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。 −２０℃で１０日間（ａ）、１ヶ月（ｂ）および２ヶ月（ｃ）保存後に解析した、３％ｗ／ｗのトレハロースの存在下でのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ凍結乾燥粉末から放出されたＰＥＰ ＦＭを示す。放出試験は、人工腸液、ｐＨ７．２中で０〜２４時間行った。

本発明によるＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体は、ヒアルロン酸の少なくとも１つのヒドロキシル基から全ヒドロキシル基の間でＥＤＡおよびＭＡの官能基度を示す。

ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体は、１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖの濃度の水溶液中、１８０〜８００ｎｍの範囲の波長での光照射によって、１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度の少なくとも１つの外来酵素、好ましくはＰＥＰの存在下で光架橋することができる。

ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体は、１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖの濃度で１８０〜８００ｎｍの範囲の波長での光照射によって光架橋し、次いで得られたヒドロゲルを、１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度の少なくとも１つの外来酵素、好ましくはＰＥＰの溶液と接触させることにより導入することができる。

ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体は、外来酵素、好ましくはプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）の存在下で好ましくは３６６ｎｍ波長のＵＶ照射によって水性媒体中で光架橋することができる。

本発明による組成物において、酵素は、単一の微生物に由来するＰＥＰでもまたはＥＰでもよいし、あるいは酵素は、異なる微生物に由来するＰＥＰおよび／もしくはＥＰの組み合わせであっても、またはバイオテクノロジー法によって製造してもよい。本発明によれば、当該技術分野において公知の任意のＰＥＰまたはＥＰおよびそれらの組み合わせが、ヒドロゲルに包括するのに好適である。

ＰＥＰはまた、ベチューンら著、メソッズ・イン・エンジモノジー、２０１２年、第５０２巻、ｐ．２４１〜２７１およびその中の注記に記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いた組換え技術により調製してもよい。

本発明によれば、好ましくはＰＥＰは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＦＭ）、ミキソコッカス・ザンサス（ＭＸ）、スフィンゴモナス・カプスラータ（ＳＣ）またはアスペルギルス・ニガー（ＡＮ）からなる群から選択される微生物に由来する。

本発明によれば、好ましくはＥＰはオオムギＥＰであり、特に好ましいのはＥＰ−Ｂ２である。

好ましくは、本発明によれば、前記酵素は、１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度でゲル形態のヒドロゲルに包括される。

酵素を導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルは、ゲルとして製造してもよい。

酵素を導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルは、凍結乾燥粉末として製造してもよい。

凍結乾燥は、ポリマーの重量に対して０．１〜１０％ｗ／ｗの濃度の凍結保護物質の非存在下または存在下の両方で行うことができる。前記凍結保護物質は好ましくはトレハロースである。

本発明によるＰＥＰ（特にＰＥＰ ＦＭ）を導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルは、様々な時間（調製から６ヶ月まで）および様々な温度（−２０〜３７℃）でのその保存後に、人工胃腸液中のＰＥＰの放出アッセイで試験されている。

以前の特許（ジャムモーナ（Ｇｉａｍｍｏｎａ），Ｇ．、パランボ（Ｐａｌｕｍｂｏ），Ｆ．Ｓ．、ピタレジ（Ｐｉｔａｒｒｅｓｉ）．Ｇ．、ヒアルロン酸官能基化誘導体を製造するための方法およびそのヒドロゲルの形成（Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）。国際公開第２０１０／０６１００５Ａ１号）では、ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡの合成が報告されているが、ＨＡ−ＥＤＡ誘導体を最初に製造し、それを単離および精製後にＭＡとのさらなる反応に利用することを含み、したがってツーポット合成が報告されている。

これに対して本発明では、ＨＡ−ＥＤＡ誘導体を単離することなくＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の直接製造を可能にするワンポット合成が特許請求されている。

次いで、メタクリルヒアルロン酸誘導体の製造のための、好ましくはワンポットである手順であって、以下の：
（ａ）ＨＡの少なくとも１つのヒドロキシル基の活性化を得るため、極性非プロトン性溶媒中のヒアルロン酸（ＨＡ）塩を、炭酸フェニルエステルまたはギ酸フェニルエステルの間で選択される炭酸化剤と接触させるステップであって、前記ＨＡは、前記極性非プロトン性有機溶媒に可溶な塩の形態であるステップ；
（ｂ）求核置換によってＨＡ−ＥＤＡを得るため、ステップ（ａ）で得られた活性化ＨＡ塩をエチレンジアミン（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、ＥＤＡと表記される）と接触させるステップ；
（ｃ）求核置換によってＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡを得るため、ステップ（ｂ）で得られたＨＡ−ＥＤＡをメタクリル酸無水物（ＭＡと表記される）と接触させるステップ；
を含み、
好ましくは上記のすべてのステップは同じ容器で行われる
手順は、本発明のさらなる主題である。

有機溶媒に可溶なヒアルロン酸塩は、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩（ＴＢＡと表記される）またはセチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡと表記される）との間で選択される。

官能基化反応に利用される極性非プロトン性有機溶媒は、好ましくはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドおよびそれらの混合物の間で選択される。

ステップ（ａ）に利用される炭酸化剤は、好ましくはビス（４−ニトロフェニルカーボネート）（カルボニルフェニルエステル）および／またはクロロニトロフェニルカーボネートであってもよい。

ステップ（ｃ）は、好ましくはジエチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジンおよびそれらの混合物の間で選択される触媒の存在下で行われる。

すべてのステップは、好ましくは５〜６０℃の温度で行われる。

ＨＡに結合したＥＤＡ基およびＭＡ基の官能基度は、ＨＡの１つのみのヒドロキシル基から全ヒドロキシル基にわたってもよく、上述のプロセスに使用される炭酸化（ｃａｒｂｏｎｉｌａｔｉｎｇ）剤の量に（正比例して）依存する。好ましくは官能基度は、５〜９５％、一層好ましくは２０〜８０％にわたる。

さらなる態様によれば、本発明は、上述のようなプロセスから得られる５０，０００〜１，５００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を扱う。

以下に、上述のプロセスに供したときＨＡヒドロキシル基に起こる官能基化（共有結合）の種類の単なる代表例を意図しているＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡの構造式を示す。

以下に報告した構造は、官能基化度の代表例を意図するものではなく、官能基化度はむしろ、上記のように、上記のプロセスに使用した反応性炭酸化（ｃａｒｂｏｎｉｌａｔｉｎｇ）剤の量に正比例する。

具体的には、ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の官能基化の種類は、出発ヒアルロン酸の２つの連続した二糖単位を記載する以下の構造で表すことができ、少なくとも１つのヒドロキシル基が官能基化されている。

さらなる態様によれば、本発明は、光架橋手順を利用して上述の生成物、すなわちＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体から得られる架橋したヒドロゲルであって、水溶液または有機溶液中の前述した官能基化誘導体の濃度が１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖであるヒドロゲルを扱う。好ましくはヒドロゲルは、５分から１０時間の照射時間で、ラジカル光開始剤を用いてまたは用いずに１８０〜８００ｎｍの波長にて照射することにより得られる。

こうしたヒドロゲルは、γ線、マイクロ波照射または他の電離放射線によっても得ることができる。

こうした光架橋は、単官能および多官能両方の、アクリル酸およびメタクリル酸モノマー、ポリエチレングリコールメタクリレートおよびアクリレートのような適切な添加剤の存在下でも、または可塑性、硬度、親水性および親油性の特徴を変化または向上させるのに利用される他の添加剤の存在下でも起こり得る。

さらなる態様によれば、本発明は、光照射により得られ、照射プロセス中および／またはその後１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマーの酵素濃度を有する外来プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）を導入する、ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルの製造を扱う。

特定の態様によれば、本発明は、１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマーの酵素濃度を有する外来プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、好ましくはフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＦＭ）に由来するＰＥＰの存在下、好ましくは３６６ｎｍにて１０分間水性媒体中で光架橋されるＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の製造を扱う。

ＰＥＰを導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルは、ポリマーの重量に対して０．１〜１０％ｗ／ｗの濃度の凍結保護物質の非存在下または存在下でゲルまたは凍結乾燥粉末の両方として製造される。

得られたＰＥＰを導入したヒドロゲルは、その製造直後と、様々な時間（調製から６ヶ月まで）および様々な温度（−２０〜３７℃）でのその保存後との両方の、人工胃腸液中での放出実験に使用した。

実験結果から、以下：
・ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に単独で溶解させたＰＥＰ ＦＭは、低温、たとえば４℃で保存しても経時的にその活性を徐々に失う。
・ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に単独で溶解させたＰＥＰ ＦＭは、凍結保護物質の存在下でも溶液の凍結乾燥後、完全にその活性を失う；
・ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に単独で溶解させ、３６６ｎｍで１０分間光照射したＰＥＰ ＦＭは、光照射の間にその活性を維持するが、溶液の凍結乾燥後、凍結保護物質の存在下でも完全にその活性を失う；
・ ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の存在下でリン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に溶解させ、３６６ｎｍで１０分間光照射したＰＥＰ ＦＭは、凍結保護物質の非存在下および存在下の両方で凍結乾燥後もその活性を維持する；
・ 光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、ゲルとして回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、それらの調製直後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約７０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができる。ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルに残存するＰＥＰ ＦＭの量は、完全にその活性を維持する。
・ 光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、ゲルとして回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、４℃で１０日間保存後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約６０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができ、活性の消失が起きるのはごく一部である（約２０％）。
・ 凍結保護物質の非存在下で光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、凍結乾燥粉末として回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、それらの調製直後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約７０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができる。ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルに残存するＰＥＰ ＦＭの量は、完全にその活性を維持する。
・ 凍結保護物質の非存在下で光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、凍結乾燥粉末として回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、４℃または−２０℃で１０日間保存後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約５０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができ、活性の消失が起きるのはごく一部である（約３０％）。これは、凍結乾燥後にＰＥＰ ＦＭは、単独すなわちＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルの非存在下で完全にその活性を失うため、非常に良好な結果である。
・ ポリマーの重量に対して１．５％ｗ／ｗのトレハロース（凍結保護物質の例として）の存在下で光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、凍結乾燥粉末として回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、それらの調製直後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約６０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができる。ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルに残存するＰＥＰ ＦＭの量は、完全にその活性を維持する。
これらのサンプルは４℃で１０日間保存される場合、人工腸液ｐＨ７．２中で２４時間まで活性型として約５０％のＰＥＰ ＦＭをなお持続的に放出することができ、活性の消失が起きるのはごく一部である（約３０％）。
これらのサンプルは−２０℃で１０日間保存される場合、人工腸液ｐＨ７．２中で２４時間まで活性型として約５０％のＰＥＰ ＦＭをなお持続的に放出することができ、ＰＥＰ ＦＭは完全にその活性を維持する。
・ ポリマーの重量に対して３％ｗ／ｗのトレハロース（凍結保護物質の例として）の存在下で光照射の間にＰＥＰ ＦＭを導入し、凍結乾燥粉末として回収したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡのヒドロゲルは、それらの調製直後に解析した場合、人工腸液ｐＨ７．２中で約５０％の酵素を２４時間まで活性型として持続的に放出することができる。ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルに残存するＰＥＰ ＦＭの量は、完全にその活性を維持する。
これらのサンプルは４℃または−２０℃で１および２ヶ月保存される場合、人工腸液ｐＨ７．２中で２４時間まで活性型として約５０％のＰＥＰ ＦＭをなお持続的に放出することができ、ＰＥＰ ＦＭは完全にその活性を維持することが立証される。

したがって、上記の結果によれば、ＰＥＰ ＦＭおよび適切な濃度の凍結保護剤の存在下でＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルの光照射により調製された本発明による組成物は、酵素活性を凍結乾燥プロセスから完全に保護することができる。

凍結乾燥粉末として回収されたＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルに導入されたＰＥＰ ＦＭは、様々な時間および温度での保存中に完全にその活性を維持し、人工腸液ｐＨ７．２中で２４時間まで活性型としてＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルから放出される。

ＰＥＰ ＦＭの導入に利用したのと同じアプローチに従い、本発明は、ミキソコッカス・ザンサス（ＭＸ）由来のＰＥＰ、スフィンゴモナス・カプスラータ（ＳＣ）由来のＰＥＰまたはアスペルギルス・ニガー（ＡＮ）由来のＰＥＰのようなプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、およびエンドプロテアーゼ（ＥＰ）からなる群から選択される他の外来酵素を導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルを、すべて単独で、またはＰＥＰ ＦＭと組み合わせて、もしくはそれらの間で組み合わせてもしくは他の酵素と組み合わせて利用して扱う。

結論としてＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルは、
− 導入した酵素を凍結乾燥プロセスから保護することができる；
− 導入した酵素を、凍結保護物質の存在下で全体として、凍結乾燥粉末の保存中の変化から保護することができる；
− 人工胃液（酸活性酵素の場合）および人工腸液（すべての酵素の場合）において活性型としての酵素の持続的な放出を可能にすることができる、
− セリアック病患者のグリアジンペプチドを解毒できる活性型としての酵素の経口投与および放出のため、腸溶コーティングを用いてまたは用いずに顆粒、カプセルおよび錠剤のような従来の経口剤形を調製するのに使用することができる。

本発明について以下の例によってさらに説明する。以下の例は、本発明の理解を促進することを意図するものであり、本明細書に説明され特許請求された本発明を特に限定するものと解釈されることを意図するものではない。

実施例１
ワンポット合成によるＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の調製
水酸化テトラブチルアンモニウム溶液を用いてヒアルロン酸溶液の中和により調製したヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ−ＴＢＡ）１ｇを、９０ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた（ヒアルロン酸の重量平均分子量２６０ｋＤａ）。

４−ＮＰＢＣ／ＨＡ−ＴＢＡの繰り返し単位のモル比を０．５と等しくなるように選択した好適な量のビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（４−ＮＰＢＣ）を、１０ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させた。この溶液を４０℃で撹拌下、ＨＡ−ＴＢＡ溶液に一滴ずつ加えた。４時間後、１７５μｌのエチレンジアミン（ＥＤＡ）を一滴ずつ加え、この溶液を４０℃でさらに３時間放置した。

ＨＡ−ＴＢＡ−ＥＤＡのアミノ基のモル数と比較して８倍モル過剰になるよう適切な量（９００μｌ）のメタクリル酸無水物（ＭＡ）を加え、次いで１０５μｌの触媒トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加え、最終溶液を４０℃で２４時間放置した。

反応のワークアップは最初に１０ｍｌのＮａＣｌ飽和溶液を加えることにより達成し、この混合物を室温で撹拌下３０分放置した。次いで、反応液をエタノールに沈殿させ、生成物を、反応中間体およびＮａＣｌを含まない生成物が得られるまでエタノール／再蒸留水（９：１）の溶液で数回洗浄した。得られた固体はＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体と命名した。スキーム１は、ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を調製するのに使用したワンポット手順を示す。

スキーム１．ワンポット手順によりＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を得るため、エチレンジアミン（ＥＤＡ）およびメタクリル酸無水物（ＭＡ）を用いた、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ−ＴＢＡ）の官能基化反応

ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体について^１Ｈ−ＮＭＲによるキャラクタリゼーションを行ったところ（図１を参照）、以下のピークを示した（Ｄ_２Ｏ）：δ １．９（ｓ，−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_３）；δ ２．０（ｓ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_３）；δ ５．５および５．７（ｍ，−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_３）。

官能基度は、メタクリル基のビニルプロトンに帰属するピークδ５．５および５．７の面積を、ＨＡ反復単位のＮ−アセチルグルコサミン部分のメチル基に帰属するδ１．９の面積と比較することにより評価した。ＨＡ−ＥＤＡの反復単位に結合したメタクリル基の官能基度は５０％ｍｏｌ／ｍｏｌになり、ＥＤＡのフリーなアミノ基に帰属するピークは、すなわちδ３．１（ｍ，ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）で存在しておらず、したがってすべてのアミノ基は、メタクリル酸無水物で誘導体化されていた。

実施例２
ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体の光架橋
実施例１に従い得られた３０ｍｇのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を、６％ｗ／ｖに等しい最終濃度を有すべく、５００μｌの０．０５Ｍリン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に室温で溶解させ、真空下で脱気した。次いで、この溶液をパイレックス（登録商標）管に入れ、Ｒａｙｏｎｅｔ ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｏｒ ＵＶを用いて３６６ｎｍの波長で１０分間照射した（図２を参照）。この後、得られたヒドロゲルをゲルとして回収するか、または凍結乾燥して粉末を得た。

実施例３
ＰＥＰ ＦＭ活性の評価
フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＦＭ）に由来するＰＥＰの活性を、当該酵素がその特異的基質、すなわちカルボベンゾキシ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｐ−ｐＮＡ）と反応する比色アッセイにより測定した。

具体的には、４０％ジオキサン中の０．２５ｍｌの２ｍＭ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを、１．０ｍｌの０．１Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２と混合し、この溶液を３０℃で５分間プレインキュベートした。この後、０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．１ｍｌの酵素を加え、３０℃で１０分間インキュベーション後、２．０ｍｌのトリトン−Ｘ１００溶液（１０ｇのトリトン−Ｘ１００／９５ｍｌの１Ｍ 酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．０）の添加により反応を止めた。

得られた生成物の吸光度を３８０ｎｍで測定した。

酵素活性の１単位は、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡから３０℃、ｐＨ７．２で１分につき１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素活性と定義される。

実施例４
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの、時間の関数としての安定性
０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．２Ｕ／ｍｌのＰＥＰ ＦＭのアリコート（１．０ｍｌ）を調製し、その経時的な安定性を評価するため５日間まで４℃で冷蔵庫に保管した。１日後、２日後、３日後、４日後および５日後、酵素の活性を、実施例３で報告したように比色アッセイにより評価した。各実験は３回ずつ行った。結果を図３に示す。

実施例５
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの凍結乾燥およびその活性の評価
トレハロース（７．５μｇ／ｍｌまたは１５μｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下、０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．２Ｕ／ｍｌのＰＥＰ ＦＭ１ｍｌを凍結乾燥した。次いで酵素の活性を実施例３で報告したように比色アッセイにより評価した。各実験は３回ずつ行った。すべての場合において、活性は認められなかった。

実施例６
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの光照射およびその活性の評価
０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．２Ｕ／ｍｌのＰＥＰ ＦＭ１ｍｌを、３６６ｎｍに等しい波長で様々な時間（１〜２０分）光照射した。

各照射時間後、酵素の活性を実施例３で報告したように比色アッセイにより評価した。

非照射酵素溶液の活性アッセイも行い、陽性対照として使用した。各実験は３回ずつ行った。結果を図４に示す。

実施例７
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの光照射後の凍結乾燥およびその活性の評価
０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中の０．２Ｕ／ｍｌのＰＥＰ ＦＭ１ｍｌを、３６６ｎｍに等しい波長で１０分間光照射した。

照射溶液を凍結乾燥させ、酵素の活性を実施例３で報告したように比色アッセイにより評価した。

実験は３回ずつ行い、すべての場合において活性は認められなかった。

実施例８
トレハロースの存在下でのリン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中のＰＥＰ ＦＭの光照射後の凍結乾燥およびその活性の評価
０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．２Ｕ／ｍｌのＰＥＰ ＦＭ２００μｌを、０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の１５μｇ／ｍｌのトレハロース８００μｌと混合した。この溶液を３６６ｎｍに等しい波長で１０分間光照射した。

照射溶液を凍結乾燥させ、酵素の活性を実施例３で報告したように比色アッセイにより評価した。

実験は３回ずつ行い、すべての場合において活性は認められなかった。

実施例９
ＰＥＰ ＦＭを導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルの調製
３０ｍｇのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を、４００μｌの０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２に溶解させた。この溶液を真空下で脱気し、次いで０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．４Ｕ／ｍｇのＰＥＰ ＦＭ１００μｌを加えた。ここにおいて最終ポリマー濃度は、６％ｗ／ｖに等しかった。この溶液を３６６ｎｍに等しい波長で１０分間光照射した。

得られたＰＥＰ ＦＭを導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルをその調製直後または４℃で１０日間保存後に解析した。

各実験は３回ずつ行った。

実施例１０
ＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルの調製
０．４Ｕ／ｍｇのポリマーのＰＥＰ ＦＭを導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルを、実施例９で報告したように調製した。

光照射後、得られたヒドロゲルを凍結乾燥させ、次いでその調製直後または４℃もしくは−２０℃で１０日間保存後に解析した。

各実験は３回ずつ行った。

実施例１１
１．５％ｗ／ｗのトレハロースの存在下でＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルの調製
３０ｍｇのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を、３５０μｌの０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２と、０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の４．５ｍｇ／ｍｌのトレハロース１００μｌとの混合物に溶解させた。この溶液を真空下で脱気し、次いで０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．４Ｕ／ｍｇのＰＥＰ ＦＭ５０μｌを加えた。この溶液を３６６ｎｍに等しい波長で１０分間光照射した。

光照射後、得られたヒドロゲルを凍結乾燥させ、次いでその調製直後または４℃もしくは−２０℃で１０日間保存後に解析した。

各実験は３回ずつ行った。

実施例１２
３％ｗ／ｗのトレハロースの存在下でＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルの調製
３０ｍｇのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を、３５０μｌの０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２と、０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の９ｍｇ／ｍｌのトレハロース１００μｌとの混合物に溶解させた。この溶液を真空下で脱気し、次いで０．０５Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の０．４Ｕ／ｍｇのＰＥＰ ＦＭ５０μｌを加えた。この溶液を３６６ｎｍに等しい波長で１０分間光照射した。

光照射後、得られたヒドロゲルを凍結乾燥させ、次いでその調製直後または４℃もしくは−２０℃で１０日間、１ヶ月もしくは２ヶ月保存後に解析した。

各実験は３回ずつ行った。

実施例１３
人工腸液ｐＨ７．２中の実施例９のサンプルからの放出試験
ＰＥＰ ＦＭを導入したＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルのアリコート（１５ｍｇ）を、１０ｍｌの人工腸液ｐＨ７．２を含むバイアルに２４時間入れた（１００ｒｐｍ、３７℃）。所定の時間間隔で、０．１５ｍｌの放出媒体を採取し、アッセイにより解析して実施例３に記載されているように酵素活性を判定した。等量の新鮮な媒体を加え、シンク条件を、実験を通して維持した。酵素の量は、検量線（ｙ＝１，５８３６×＋０，０５３７、ｒ^２＝０．９９８１）を用いて判定した。

各実験は３回ずつ行った。

２４時間後にＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡゲルに残存する酵素量の判定は、酵素活性判定のためのアッセイを用いて行ったが、この場合基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡをゲルと直接接触させて加えた。

具体的には、放出試験に使用した１５ｍｇのゲルを、０．５ｍｌの人工腸液ｐＨ７．２および４．０ｍｌの０．１Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２と共に加え、次いでこのサンプルを１００ｒｐｍ、３７℃で２４時間インキュベートした。この後、４０％ジオキサン中の１．２５ｍｌの２ｍＭ Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを１．０ｍｌの０．１Ｍ リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２と混合し、得られた溶液を３０℃で５分間プレインキュベートし、次いでこの溶液をゲルに加え、３０℃で１０分間インキュベーション後、２０ｍｌのトリトン−Ｘ１００溶液（１０ｇのトリトン−Ｘ１００／９５ｍｌの１Ｍ 酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．０）の添加により反応を止めた。

得られた生成物の吸光度を３８０ｎｍで測定した。

各実験は３回ずつ行った。放出実験の結果を図５に示す。

実施例１４
人工腸液ｐＨ７．２中の実施例１０のサンプルからの放出試験
凍結保護物質の非存在下でＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルからのＰＥＰ ＦＭ（実施例１０）の放出試験を、実施例１３に記載されているように行った。放出実験の結果を図６に示す。

実施例１５
人工腸液ｐＨ７．２中の実施例１１のサンプルからの放出試験
トレハロース（１．５％ｗ／ｗ）の存在下でＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルからのＰＥＰ ＦＭ（実施例１１）の放出試験を実施例１３に記載されているように行った。放出実験の結果を図７に示す。

実施例１６
リン酸塩緩衝溶液ｐＨ７．２中の実施例１２のサンプルからの放出試験
トレハロース（３％ｗ／ｗ）の存在下でＰＥＰ ＦＭを導入した凍結乾燥粉末としてのＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡヒドロゲルからのＰＥＰ ＦＭ（実施例１２）の放出試験を実施例１３に記載されているように行った。放出実験の結果を図８、９および１０に示す。

Claims (11)

1. プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、エンドプロテアーゼ（ＥＰ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、光架橋型メタクリルヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ）ヒドロゲルに包括された少なくとも１つの外来酵素を含む組成物であって、前記ヒアルロン酸誘導体は５０，０００〜１，５００，０００ダルトンの分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩を含み、少なくとも１つのヒドロキシル基が、炭酸フェニルエステルまたはギ酸フェニルエステルの間で選択される炭酸化剤で活性化後、エチレンジアミン（ＥＤＡ）との反応およびその後のメタクリル酸無水物（ＭＡ）との反応で官能基化されている、組成物。
2. 前記酵素は１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度で前記ヒドロゲルに包括される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物はゲルの形態である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
4. 前記組成物は凍結乾燥粉末の形態である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
5. ポリマーの重量に対して０．１〜１０％ｗ／ｗの濃度で少なくとも１つの凍結保護物質をさらに含み；前記凍結保護物質は好ましくはトレハロースである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記酵素は、ＰＥＰである場合、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＦＭ）、ミキソコッカス・ザンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）（ＭＸ）、スフィンゴモナス・カプスラータ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ）（ＳＣ）もしくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（ＡＮ）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される微生物に由来し、ＥＰである場合、オオムギエンドプロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. セリアック病の処置に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む経口投与用の医薬製剤。
9. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を調製するためのプロセスであって、１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖの濃度の水溶液中にて、１８０〜８００ｎｍの範囲の波長での光照射によってＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を光架橋するステップを含み、
   前記光架橋は、１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度の少なくとも１つの外来酵素の存在下で行われるか；または
   前記光架橋は前記外来酵素の非存在下で行われ、その後前記外来酵素は、得られたヒドロゲルを１ｍＵ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇのポリマー濃度の外来酵素の溶液と接触させることにより導入され；
   前記酵素はプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、エンドプロテアーゼ（ＥＰ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択され；
   前記ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体は５０，０００〜１，５００，０００ダルトンの分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）またはその塩を含み、
   少なくとも１つのヒドロキシル基がエチレンジアミン（ＥＤＡ）との反応およびその後のメタクリル酸無水物（ＭＡ）との反応で官能基化されている、プロセス。
10. 以下のステップ：
    （ａ）ヒアルロン酸（ＨＡ）の少なくとも１つのヒドロキシル基の活性化を得るため、極性非プロトン性溶媒中のＨＡ塩を、炭酸フェニルエステルまたはギ酸フェニルエステルの間で選択される炭酸化剤と接触させるステップであって、前記ＨＡは前記極性非プロトン性有機溶媒に可溶な塩の形態である、ステップ；
    （ｂ）求核置換によってＨＡ−ＥＤＡを得るため、前記ステップ（ａ）で得られた活性化ＨＡ塩をエチレンジアミン（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、ＥＤＡと表記される）と接触させるステップ；
    （ｃ）求核置換によってＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡを得るため、前記ステップ（ｂ）で得られたＨＡ−ＥＤＡをメタクリル酸無水物（ＭＡと表記される）と接触させるステップ、
    によりＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を調製するステップを含む、請求項９に記載のプロセス。
11. 前記ＨＡ−ＥＤＡ−ＭＡ誘導体を調製するステップはすべて続いて同じ容器で行われる、請求項１０に記載のプロセス。