CN116763758A

CN116763758A - 一种胞内递送体系及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116763758A
Application number: CN202310702916.0A
Authority: CN
Inventors: 殷黎晨; 杨强; 孙志淞; 刘寻
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2023-06-14
Filing date: 2023-06-14
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明提供了一种胞内递送体系及其制备方法与应用，是一种基于苯硼酸与阳离子聚合物和多酚动态交联的蛋白质胞内递送体系。本发明的递送体系可将不同电荷/分子量的蛋白质、核酸高效递送进入细胞，成功实现内涵体逃逸，并且在溶酶体酸性环境解离，维持蛋白质/核酸活性。该递送体系具有优异的血清稳定性和细胞普适性。这种简单而高效的技术为抗肿瘤蛋白质药物的潜在临床应用提供了新的策略。

Description

一种胞内递送体系及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物递送体系，为一种胞内递送体系及其制备方法与应用，具体为一种蛋白质/核酸胞内递送纳米囊及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质是一类重要的生物材料，其具有良好的生物相容性，多种蛋白质（如酶）还具有特殊的生物功能，因此有望于实现多种应用例如：癌症治疗、免疫治疗及生物成像等。绝大多数生物反应，都在胞内进行，胞内作用的蛋白质制剂具有广阔的应用前景。然而蛋白质分子量较大，不能穿过生物膜屏障，目前的蛋白质制剂多靶向胞外受体或结构域，这很大程度上限制了蛋白质制剂的应用。核酸作为新一代生物技术药物，不但可以从本源上治疗疾病，而且在技术和生产层面均具有显著的平台化特征；然而核酸在体内外稳定性差、递送效率低，极大限制了其成药性。此外，由于核酸的负电荷、高分子质量和亲水性，其透过细胞膜的能力很差。为了解决核酸药物分子本身相关的挑战，最重要的是要开发能够促进核酸吸收到靶细胞的递送载体系统。

目前蛋白质/核酸胞内递送方式多基于阳离子载体协助递送，这种递送方式存在着如下几个问题：1）为了实现较好的递送效果大多使用阳离子载体作为蛋白质载体，阳离子载体在血清中不稳定限制了其在体内的应用。2）阳离子载体合成难度高、成本高，限制其广泛应用。3）阳离子载体表面正电荷密度高，具有较强的细胞毒性。4）阳离子载体与蛋白质的共价相互作用，可能破坏蛋白质的三维结构造成活性的丧失。5）阳离子载体在体内需要长时间降解，存在潜在的安全性问题。

开发高效安全的蛋白质/核酸胞内递送系统，将功能性蛋白质/核酸递送进入功能异常细胞，实现细胞死亡或者功能恢复，同时减少正常细胞的毒副作用具有重要的意义。

发明内容

本发明设计了一种蛋白质/核酸胞内递送纳米囊，能够高效将蛋白质/核酸递送进入胞质，成功实现内涵体逃逸，并在溶酶体酸性环境响应性解离，恢复蛋白质/核酸活性，尤其是，该递送系统在血清条件下可以维持结构稳定。解决了现有技术使用的蛋白质/核酸药物都是通过靶向细胞表面受体或者细胞外特定结构发挥功能的问题以及难以进行系统给药的问题。

本发明采用如下技术方案：

一种胞内递送体系，其制备原料包括多酚单体、阳离子聚合物；所述多酚单体、阳离子聚合物通过小分子连接；所述小分子在细胞内能够与多酚单体分离，优选的，小分子在细胞内能够与多酚单体、阳离子聚合物分离。

本发明中，所述多酚单体可以与蛋白质非共价结合；所述小分子的一端可以与多酚单体反应、另一端可以与阳离子聚合物反应；所述小分子在肿瘤细胞内能够与多酚单体分离，优选的，所述多酚单体与蛋白质非共价结合；所述小分子的一端与多酚单体反应、另一端与阳离子聚合物反应；小分子在肿瘤细胞内能够与多酚单体、阳离子聚合物分离。

一种蛋白质胞内递送纳米囊，包括上述胞内递送体系以及蛋白质，所述蛋白质与多酚单体非共价结合。

上述蛋白质胞内递送纳米囊的制备方法，包括以下步骤，蛋白质与多酚单体反应得到非共价结合的蛋白质-多酚单体；小分子与阳离子聚合物反应得到复合物；再将蛋白质-多酚单体与复合物反应，得到所述蛋白质胞内递送纳米囊。优选的，多酚单体与蛋白质的摩尔比为（5～30）∶1，优选（5～20）∶1；阳离子聚合物与蛋白质的摩尔比为（40～160）∶1，优选（50～100）∶1；小分子与阳离子聚合物的反应基团的摩尔比为1∶（0.8～1.2），优选1∶1。

一种核酸胞内递送纳米囊，包括上述胞内递送体系以及核酸。

上述核酸胞内递送纳米囊的制备方法，包括以下步骤，多酚单体、小分子以及阳离子聚合物反应得到三元聚合物；然后将核酸与三元聚合物孵育，得到所述核酸胞内递送纳米囊。优选的，多酚单体、小分子、阳离子聚合物的摩尔比为1∶（3～5）∶（0.5～1.5），比如1∶4∶1；三元聚合物与核酸的质量比为（1～50）∶1。

本发明公开了胞内递送体系作为药物载体或者在制备药物载体中的应用，尤其是作为蛋白质或者核酸载体，或者制备蛋白质或者核酸载体的应用，得到蛋白质药物或者核酸药物。

本发明公开了上述蛋白质胞内递送纳米囊或者核酸胞内递送纳米囊在制备纳米药物中的应用。优选的，所述纳米药物为抗肿瘤纳米药物或者非抗肿瘤纳米药物，比如抑制人脐静脉内皮细胞迁移的药物、抑制新生血管的生成的药物、减少血管渗漏的药物。

本发明首先由多酚单体与蛋白质在水溶液中发生反应，将多酚单体与蛋白质非共价结合，得到多酚单体-蛋白质；同时小分子与阳离子聚合物在水溶液中发生反应，两者共价结合，得到小分子-阳离子聚合物复合物；然后多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物在水溶液中发生反应，通过多酚单体与小分子共价结合，得到蛋白质纳米囊，具有pH响应性，可在溶酶体酸性条件下解离，恢复原有蛋白质结构与活性。本发明可递送多种电荷/分子量的蛋白质，并实现内涵体逃逸，在溶酶体酸性环境下，去除小分子和阳离子聚合物结构，促使蛋白质活性恢复，发挥生物学功能。此外，本发明的蛋白质胞内递送体系可在血清条件下维持结构稳定，可以进行系统给药。在4T1荷瘤小鼠模型中，使用尾静脉注射方式将毒素蛋白saporin纳米囊（EPP-saporin）注入小鼠体内，成功抑制小鼠肿瘤生长。

本发明由多酚单体、小分子、阳离子聚合物在水溶液中发生反应，得到三元聚合物；然后核酸与三元聚合物在水溶液中混匀孵育，得到三元聚合物-核酸纳米复合物，具有pH响应性可在溶酶体酸性条件下解离，恢复原有核酸结构与活性，可递送多种核酸，并实现内涵体逃逸，在溶酶体酸性环境下，去除小分子和阳离子聚合物，并恢复核酸功能性，发挥生物学功能。此外，本发明的核酸递送体系可在血清条件下维持结构稳定，可以进行系统给药。同时，在B16F10荷瘤小鼠模型中，使用尾静脉注射方式将表达Luc荧光素酶的2-PEI-RT/pLuc纳米复合物注入小鼠体内，成功在小鼠肿瘤处表达Luc荧光素酶。

本发明中，多酚单体为可以与蛋白质进行非共价结合的多酚，比如表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、儿茶素、迷迭香酸、去甲二氢愈创木酸、单宁酸、原花青素、没食子酸、鞣花酸、芦丁或者姜黄素，其一端与蛋白质非共价结合，另一端可以与小分子反应。小分子一端为能够与多酚单体端反应的基团，另一端为能够与阳离子聚合物反应的基团。多酚单体与小分子能够发生反应的一端没有特别限定，只要在水中、室温下能够反应即可。

作为具体的例子，多酚单体的化学结构式为如下结构之一：

小分子的化学结构式为如下结构之一。

阳离子聚合物为聚乙烯亚胺或者聚酰胺-胺，优选的，聚乙烯亚胺的分子量为0.6k～10k，比如为分子量为0.6k、1.8k、10k的聚乙烯亚胺（PEI）；聚酰胺-胺为第0～第5代聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状大分子中的一种或几种。

本发明中，多酚单体与蛋白质的反应在水溶液中、室温下进行，具体的，将多酚单体溶液与蛋白质溶液混合后反应5～60分钟，优选的，反应条件为在室温下反应20～40分钟；反应结束后，得到多酚单体-蛋白质。

本发明中，小分子与阳离子聚合物的反应在水溶液中、室温下进行，具体的，将小分子溶液与阳离子聚合物溶液混合后反应5～60分钟，优选的，反应条件为在室温下反应20～40分钟；反应结束后，得到小分子-阳离子聚合物复合物。

本发明中，多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物的反应在水溶液中、室温下进行，具体的，将多酚单体-蛋白质溶液与小分子-阳离子聚合物复合物溶液混合后反应5～60分钟，优选的，反应条件为在室温下反应20～40分钟；反应结束后，超滤，得到蛋白质胞内递送纳米囊，即EBP-蛋白质（也可称为EPP-蛋白质）。作为一个优点，本发明涉及的反应都在水中进行，无需其他物质参与，保证了蛋白质/核酸纳米囊的纯净。

本发明中，蛋白质为毒性蛋白质、非毒性蛋白质或者酶，核酸为质粒DNA或者mRNA；都是针对疾病，比如肿瘤而言。

本发明的优势在于整个反应都在水溶液中进行，极大的保留了蛋白质/核酸的活性，且反应简单迅速，可进行批量反应，与此同时由于结合到蛋白质/核酸表面单体正负电荷互相屏蔽，其在血清中的稳定性远高于阳离子载体递送方式。另外本发明可以将蛋白质高效递送进入肿瘤细胞中，并且在细胞外，纳米囊（结构E、结构B、结构P）可以将蛋白质/核酸的活性屏蔽，在溶酶体酸性环境下，结构B能够从结构E上掉落，恢复蛋白质/核酸活性，同时结构P从结构B上掉落，降低对细胞毒副作用。

附图说明

图1 为蛋白质胞内递送纳米囊、核酸胞内递送纳米囊的制备示意图；

图2 为多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物反应后溶液中茜素红S的荧光光谱（A）以及组装形成的BSA蛋白质纳米囊透射电镜图（B），标尺为200 nm；

图3 为蛋白质纳米囊胞内递送体系递送不同修饰以及HCl预处理的BSA-FITC在HeLa细胞摄取的平均荧光强度图（A）以及HeLa细胞与BSA或EPP-BSA NCs共孵育24小时后的细胞活力（B）（n= 3）；

图4 为蛋白质纳米囊胞内递送体系递送不同修饰以及HCl预处理的BSA-FITC被HeLa细胞的激光共聚焦图，标尺为50 μm；

图5 为蛋白质纳米囊胞内递送体系经不同内吞抑制剂处理后在HeLa细胞中的摄取水平图（A）以及EPP-BSA NCs在不同浓度血清中孵育后的粒径变化（B））（n= 3）；

图6 为蛋白质纳米囊胞内递送体系在HeLa细胞中不同时间点与溶酶体共定位图；

图7 为蛋白质纳米囊胞内递送体系以及商业化试剂PULSin/蛋白质复合物在不同肿瘤细胞中分布激光共聚焦图（标尺为50 μm）；

图8 为蛋白质纳米囊胞内递送体系以及商业化试剂PULSin/蛋白质复合物在HeLa细胞内递送不同蛋白质的聚光共聚焦图（标尺为50 μm）；

图9 为HeLa细胞与β-gal、PULSIN/β-gal、E-β-gal或EPP-β-gal NCs（4 μg β-gal/mL）共孵育4小时后的X-gal染色图像（标尺为100 μm）以及HeLa细胞与β-gal、PULSIN/β-gal、E-β-gal或EPP-β-gal NCs（4 μg β-gal/mL）共孵育4小时后的β-gal的相对活性（n=3）；

图10 描述蛋白质纳米囊胞内递送体系在HeLa细胞内递送辣根过氧化物酶（HRP）的染色图及定量分析图；

图11 为蛋白质纳米囊胞内递送体系递送核糖核酸酶A纳米囊（EPP-RNase A）或者皂草素蛋白纳米囊（EPP-saporin）在HeLa以及4T1细胞内的毒性测试图；

图12 为蛋白质纳米囊胞内递送体系递送毒性蛋白质皂草素前药（EPP-saporin）在小鼠4T1移植瘤模型的组织分布图；

图13 为蛋白质纳米囊胞内递送体系递送EPP-saporin在小鼠4T1移植瘤模型上抑制肿瘤生长图以及肿瘤切片染色图；

图14为PEI 1.8k/2-APBA的核磁共振氢谱图（D₂O，400 MHz）（A）以及ARS/PEI1.8k/2-APBA混合物的荧光光谱（B）；

图15为各聚合物包载DNA的能力，N表示裸的DNA；

图16为各聚合物包载DNA的能力（n= 3）；

图17为聚合物/DNA质量比为10的TEM图（比例尺= 200 nm）（A）以及含有RT的聚合物/DNA NCs（w/w = 10/1）和PEI 25k/DNA NCs（w/w = 1/1）粒径的变化（B）；

图18为酸处理前后2-PEI-RT、3-PEI-RT和4-PEI-RT的紫外可见光光谱（n= 3）（A）。不同浓度的肝素钠存在下，酸处理前后，2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA NCs的DNA释放量（n= 3）（B）；

图19为使用B16F10细胞在10% FBS的DMEM培养基中不同聚合物/pLuc（1 μg pLuc/mL）质量比下，各聚合物的转染效率。PEI 25k/pLuc NC（w/w = 1/1）作为阳性对照（n = 3）；

图20为在含10% FBS的DMEM培养基中，不同聚合物/pLuc质量比的聚合物/pLucNCs（1 μg pLuc/mL）在HeLa（A），HepG-2（B）和MDA-MB-231（C）细胞中的转染效率（n= 3）。（D）在含有10%、20%或30% FBS的DMEM培养基中，不同聚合物/pLuc质量比下，2-PEI-RT/pLucNCs在B16F10细胞中的转染效率。PEI 25k/pLuc NCs（w/w = 1/1）作为阳性对照（n= 3）；

图21为在4 °C或各类内吞抑制剂存在时，B16F10细胞中2-PEI-RT/YOYO-1-DNANCs（1μg DNA/mL，w/w = 10/1）的相对细胞摄取水平（n= 3）；

图22为2-PEI-RT/YOYO-1-DNA、3-PEI-RT/YOYO-1-DNA和4-PEI-RT/YOYO-1-DNANCs（1 μg DNA/mL, w/w = 10/1）在37 ℃孵卵6小时后B16F10的CLSM图像（比例尺= 20 µm）。细胞核用Hoechst 33342染色和内涵体/溶酶体用Lysotracker Deep Red染色；

图23为MTT法测定不同聚合物/DNA质量比下2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA NCs在B16F10（A）、Hela（B）、MDA-MB-231（C）和HepG-2（D）细胞孵卵24 h后的细胞毒性（1μg DNA/mL，n= 3）；

图24为B16F10荷瘤小鼠模型中，在小鼠肿瘤处表达Luc荧光素酶图；

图25为GFP-HeLa细胞内2-PEI-RT介导Cas9-mRNA/sgRNA基因编辑递送。（A）PBS组、对照组（游离的Cas9-mRNA/sgRNA）、Lipo-Max/Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)NCs和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)NCs处理的HeLa-GFP细胞的CLSM图像（2μg mRNA/mL和1 μg sgRNA/mL，比例尺= 50 µm）。细胞核用Hoechst 33342染色。（B）使用Image J软件从（A）细胞中定量的荧光强度（n= 3）；

图26为PBS、control（free Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)）、Lipo-MAX/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)和2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs处理HeLa细胞后PLK1的相对mRNA水平（2 μgmRNA/mL和1 μg sgRNA/mL，n= 3）；

图27为PBS、control（free Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)）、Lipo-MAX/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)和2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs处理HeLa细胞后PLK1的相对蛋白水平（2 μgmRNA/mL和1 μg sgRNA/mL，n= 3）；

图28为2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs和游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)处理后HeLa细胞的活力（n= 3）；

图29为（A）第7天小鼠眼底代表性的造影结果（FFA）。（B）根据（A）中的FFA结果定量CNV泄漏的平均荧光强度值（n= 10）。（C）荧光素钠渗漏程度的临床分级评价（n= 10）；

图30为玻璃体注射PBS、Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs 7天后的脉络膜铺片的CLSM图像（比例尺= 200 μm）。绿色代表CNV病变部位。细胞核用Hoechst33342染色；

图31为玻璃体内注射PBS、Aflibercept或2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs后，第7天RCS复合体中VEGFA的相对mRNA水平（A）以及玻璃体内注射PBS、Aflibercept或2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs后，第7天RCS复合体中VEGFA分泌含量（B），（n = 6）。

具体实施方式

本发明公开的蛋白质胞内递送纳米囊的结构为D-E-B-P，递送核酸的三元聚合物的结构为E-B-P；其中结构D为蛋白质，结构E为与蛋白质非共价结合的多酚单体，结构P为阳离子聚合物，结构B为连接E和P的结构单体；结构B在细胞溶酶体环境下，能够从结构E与P上掉落。

将多酚单体、小分子、阳离子聚合物一锅法反应，得到E-B-P三元聚合物；再将核酸与E-B-P聚合物在水溶液中混匀孵育，得到三元聚合物-核酸纳米复合物。多酚单体、小分子、阳离子聚合物按摩尔比1∶4∶1反应；多酚单体可以与小分子共价结合形成硼酸酯键；小分子可以与阳离子聚合物共价结合形成亚胺键。

本发明将多酚单体与蛋白质复合，得到多酚单体-蛋白质；同时将小分子与阳离子聚合物发生反应，得到小分子-阳离子聚合物复合物；再将多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物反应，得到蛋白质胞内递送纳米囊。多酚单体与蛋白质的反应在水溶液中、室温下进行，得到多酚单体-蛋白质；小分子与阳离子聚合物的反应在水溶液中、室温下进行，得到小分子-阳离子聚合物复合物；多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物的反应在水溶液中、室温下进行。作为示例，将多酚单体溶液与蛋白质溶液混合后室温反应30分钟，得到多酚单体-蛋白质；同时将小分子溶液与阳离子聚合物溶液混合后室温反应30分钟，得到小分子-阳离子聚合物复合物；再将多酚单体-蛋白质与小分子-阳离子聚合物复合物溶液混合后室温反应30分钟，得到蛋白质胞内递送纳米囊。

优选的，多酚单体为含有一个或多个邻二酚羟基结构的多酚单体；阳离子聚合物为含有伯氨基团阳离子聚合物；小分子一端为可以与多酚单体的邻二酚羟基发生反应形成硼酸酯键的基团，另一端为可以与阳离子聚合物的伯氨基团发生反应形成亚胺的基团，包括醛基、环氧基、硝基、炔基、羧基或者琥珀酰胺基。

优选的，多酚单体与蛋白质的摩尔比为（5～30）∶1；阳离子聚合物与蛋白质的摩尔比为（40～160）∶1；小分子与阳离子聚合物的反应基团（比如伯氨基团）的摩尔比为1∶1。

本发明制备E、B和P修饰的蛋白质制剂（蛋白质胞内递送纳米囊）的方法示意如图1，Protein为蛋白质；制备E、B和P与核酸药物纳米复合物（核酸胞内递送纳米囊）的方法示意如图1，Nuclear acid为核酸。

蛋白质胞内递送纳米囊具体制备方法举例为：

（1）将多酚单体溶于去离子水中，得到多酚单体溶液；将蛋白质溶于去离子水中，得到蛋白质溶液；然后按一定的多酚单体与蛋白质摩尔比混合单体N溶液与蛋白质溶液，室温搅拌30分钟，得到多酚单体-蛋白质；

（2）将小分子溶于去离子水中，得到小分子溶液；将阳离子聚合物溶于去离子水中，得到阳离子聚合物溶液；然后混合小分子溶液与阳离子聚合物溶液，室温搅拌30分钟，得到小分子-阳离子聚合物复合物；

（3）按一定的阳离子聚合物与蛋白质摩尔比混合小分子-阳离子聚合物复合物溶液与多酚单体-蛋白质溶液，室温搅拌30分钟，将反应液转移至超滤管中（MWCO = 3 kDa），超纯水洗涤5次，得到EPP-蛋白质，为蛋白质胞内递送纳米囊。

核酸胞内递送纳米囊具体制备方法举例为：

（1）将多酚单体、小分子、阳离子聚合物分别溶于去离子水中，然后混合，室温搅拌1小时，得到E-B-P聚合物；

（2）按一定的E-B-P聚合物与核酸质量比混合E-B-P聚合物溶液与核酸溶液，室温孵育30分钟，得到E-B-P聚合物-核酸纳米复合物。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明涉及的原料都是常规产品，可市购也可根据现有技术常规制备；涉及的具体操作方法为常规方法，具体测试也为本领域常规方法。C57BL/6J小鼠（6-8周，18-20 g，雌性）购买于常州卡文斯实验动物有限公司（常州，中国），并在无特定病原体（SPF）级别的动物实验室中饲养，每笼6只，可随意饮水，按12:12小时明暗循环（7:00-19:00），饲养温度25 ± 1 ℃。所有动物实验方案均获得苏州大学动物保护和使用委员会的批准。

数据以平均值±标准差（SD）表示。使用Student’s t检验进行统计分析。差异在*p＜0.05时被认为是具有显著性差异，在**p＜0.01和***p＜0.001时被认为是具有非常显著性差异。

小分子、阳离子聚合物（1.8K PEI）分别为下式所示结构，用于以下实施例（特殊说明除外）：

实施例一

多酚单体的化学结构式如下：

将多酚单体溶解于去离子水中，最终浓度为（1 mg/mL），得到多酚单体溶液；将牛血清蛋白质（BSA）溶解于去离子水中（5 mg/mL），得到牛血清蛋白质溶液；然后按照多酚单体与牛血清蛋白质摩尔比为10∶1的比例混合两种溶液，在室温下搅拌30分钟，得到结合多酚的蛋白质单体（E-BSA）溶液。

将小分子溶解于去离子水中，最终浓度为（10 mg/mL），得到小分子溶液；将阳离子聚合物溶解于去离子水中（10 mg/mL），得到阳离子聚合物溶液；然后按照小分子与阳离子聚合物的氨基摩尔比为1∶1的比例混合两种溶液，在室温下搅拌30分钟，得到小分子修饰的阳离子聚合物（B-P）溶液。

将B-P溶液（B最终浓度为1×10^-3mol/L）和茜素红S（ARS，最终浓度为1×10^-4mol/L）溶于缓冲液（pH 8.21, 52.1 wt%的甲醇水溶液，氯化钾，10 mmol/L，磷酸氢二钾，2.7mmol/L，磷酸氢二钠，2.7 mmol/L）中，利用不同浓度E-BSA溶液进行荧光滴定。使用酶标仪在520-660 nm范围记录ARS/EBP-BSA混合物的荧光发射光谱（λex = 495 nm），具体见图2中A。荧光光谱实验结果表明，随着E-BSA浓度增加，ARS/B-P的混合液在590 nm处的荧光强度显著降低，表明E-BSA与B-P成功反应，形成EBP-BSA纳米囊。

按照阳离子聚合物与牛血清蛋白质摩尔比为80∶1的比例混合E-BSA溶液与B-P溶液，在室温下搅拌30分钟，然后将反应液转移至超滤管中（MWCO = 3 kDa），超纯水洗涤5次，得到EBP-蛋白质（EBP-BSA），为蛋白质胞内递送纳米囊。使用透射电镜（TEM）对得到的EBP-BSA样品进行表征，具体见图2中B。TEM实验结果表明，成功形成了120 nm左右的球状纳米囊。

按照阳离子聚合物与牛血清蛋白质摩尔比为40∶1或者120∶1的比例混合E-BSA溶液与B-P溶液，按相同的方法分别形成了240 nm以及210 nm左右的球状纳米囊。

实施例二

使用异硫氰酸荧光素（FITC）对BSA进行标记，在0.1 M NaHCO₃缓冲溶液中按照蛋白质∶FITC = 1:3 (摩尔比)避光条件下，反应过夜，然后使用超纯水透析（MWCO = 3.5kDa）两天，除去未反应的FITC分子，得到标记FITC的蛋白质，然后使用实施例一中方法对蛋白质进行修饰得到E-BSA 、EPP-BSA-FITC。然后将人宫颈癌细胞（HeLa）按照每孔5×10⁴的数量接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。待细胞完全贴壁以后按照4 μg/mL 的浓度将不同修饰以及0.1 M HCl提前处理30分钟的蛋白质样品（pH 6.0）加入到孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育4小时。用PBS清洗三次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，最后通过流式细胞仪分析细胞的摄取情况。具体参见图3A，实验结果表明经EPP修饰的蛋白质，细胞摄取量最高，相比于仅E修饰的蛋白质，其荧光强度增加了68倍，但经HCl处理后，脱去修饰，其失去内化能力，所以荧光强度与未修饰组类似。

比较了EPP-BSA NCs与商业蛋白转染试剂PULSin的胞内递送效率，CLSM和流式结果表明，EPP-BSA NCs胞内递送效率约为PULSin/BSA的4倍（p＜0.001），表明EPP-BSA NCs具有高效的胞内递送效率。

本发明可将蛋白高效递送至肿瘤细胞，并且可维持天然蛋白的生物活性。接下来研究了NCs的生物安全性。首先利用MTT法检测了不同浓度EPP-BSA NCs处理后的HeLa细胞存活率。如图3B所示，即使在较高的BSA浓度（20 μg/mL）下，NCs对HeLa细胞仍未表现出明显的细胞毒性，表明苯硼酸介导的动态交联NCs在实现蛋白质高效胞质递送的同时，也保持了较低的细胞毒性。

进一步使用激光共聚焦实验对于不同修饰以及HCl处理的蛋白质纳米囊的内化进行了研究，首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10%的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将不同修饰以及0.1 MHCl提前处理30分钟的蛋白质样品（pH 6.0）加入到孔中，在37 ℃以及5% CO₂ 的条件下孵育12小时，具体参见图4。共聚焦实验结果与流式细胞术分析结果一致，以上结果共同表明蛋白质胞内递送纳米囊能够高效的将蛋白质递送进入细胞。

EGCG/PEI/PBA与BSA交联形成NCs后，通过荧光发射光谱探究了EPP-BSA-FITC NCs的蛋白质释放情况。以FITC标记的BSA作为模式蛋白，通过检测溶液中BSA-FITC的荧光强度验证了NCs中BSA的释放。EPP-BSA-FITC NCs的相对荧光强度下降至8.3%，表明了BSA-FITC与EGCG/PEI/PBA成功交联，蛋白表面的FITC荧光被屏蔽。用HCl将NCs溶液pH调至6.0后，溶液中荧光强度增加至90.4%，表明酸性条件下后NCs发生解离，BSA-FITC被释放。因此，EPP-BSA-FITC NCs经酸处理后，可有效释放包载的蛋白质。

实施例三

为了进一步探究蛋白质纳米囊的内化机制，使用激光共聚焦方法进行了研究。首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% 的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，PBS洗涤3次，换用新鲜培养基，加入内吞抑制剂：氯丙嗪（CPZ, 10 μg/mL）抑制网格蛋白质介导的内吞作用；染料木黄酮（GNT, 100 μg/mL）抑制小窝蛋白质介导的内吞作用；甲基-β-环糊精（mβCD, 50 μM）减少膜上胆固醇的量抑制脂质筏介导的内吞作用以及渥漫青霉素（WTM, 50 nM）抑制巨胞饮，37 ℃孵育1小时。PBS洗涤3次，更换新鲜培养基，然后加入含有EPP-BSA-FITC的PBS溶液（终浓度为 4 μg/mL）继续孵育4小时，PBS洗涤3次，台盼蓝（0.2 mg/mL, 500 μL）孵育3分钟，PBS洗涤3次，RIPA裂解液（100 μL, 30 min）裂解细胞。通过荧光分光光度计（λ _ex= 488 nm,λ _em= 530 nm）测定细胞摄取水平。将没有抑制剂作用下EPP-BSA-FITC（终浓度为4 μg/mL）处理4小时（37 ℃）HeLa细胞的荧光强度作为100%。具体参见图5中A，使用CPZ进行抑制后，蛋白质纳米囊内化量明显减少，表明蛋白质纳米囊主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。

EPP-BSA NCs能否在体内长时间循环到身体各部位而不与血液中的各类蛋白质或者红细胞等结合，保持自身形态结构和活性的稳定，对于其在生物体内发挥作用至关重要。将制备好的EPP-BSA NCs稀释到不同终浓度血清溶液中，在24小时内观察其粒径变化。如图5中B所示，EPP-BSA NCs的粒径可在24小时内保持稳定，说明其具有良好的稳定性。CLSM图像显示绿色荧光广泛而均匀地分布在细胞质中，流式细胞术结果也表明，在20% FBS条件下，EPP-BSA-FITC NCs大量进入细胞。EPP-BSA NCs的血清抗性内化性能可以为体内全身给药提供可行性。

实施例四

直观显示蛋白质进入细胞后进行溶酶体逃逸，使用激光共聚焦的方法对于蛋白质纳米囊（EPP-BSA-FITC）和溶酶体/内涵体的共定位进行了观察。首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% 的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将蛋白质样品加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下分别孵育0.5、1、2、4小时。用PBS清洗三次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，用Lysotracker deep red （200 nM）标记溶酶体/内含体30分钟，用PBS清洗三次后在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的共定位。具体参见图6。实验结果显示，在孵育0.5和1小时条件下，蛋白质纳米囊（绿色荧光）与溶酶体/内涵体（红色荧光）几乎重合，表明蛋白质纳米囊内吞后被包裹在溶酶体/内涵体中。在孵育2和4小时条件下，绿色荧光均匀分布在整个细胞内。以上实验结果表明，蛋白质纳米囊递送进入细胞后成功实现溶酶体/内涵体逃逸。

实施例五

本发明蛋白质胞内递送纳米囊体系可以用于将蛋白质递送进入不同肿瘤细胞。选取了MDA-MB-231、、U87、B16F10、HepG2、4T1五种肿瘤细胞。首先将不同种类的细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10%的DMEM/1640完全培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的蛋白质样品（EPP-BSA-FITC）加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育4小时。用冷的PBS清洗三次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。按照产品说明书，使用商业化试剂（PULSin）形成PLUSin/蛋白质复合物作对比。具体参见图7。实验结果显示，在五种肿瘤细胞中均观察到了广泛的荧光分布，表明蛋白质胞内递送纳米囊大量内化进入肿瘤细胞中。此外，相比于商业化试剂PULSin，本发明蛋白质纳米囊的内化量明显增加。以上实验结果共同表明，本发明蛋白质纳米囊具有良好的肿瘤细胞普适性，并且其递送能力优于现有的商业化试剂。

实施例六

本发明蛋白质纳米囊递送体系可用于递送不同分子量/电荷的蛋白质。用FITC标记鸡卵白蛋白（OVA-FITC）、细胞色素C（Cyt C-FITC）、核糖核酸酶A（RNase A-FITC）以及免疫球蛋白（IgG-FITC）分别按实施例一中方法制备成EPP修饰的蛋白质纳米囊；按照产品说明书，使用商业化试剂（PULSin）形成PLUSin/蛋白质复合物作对比。

按上述相同方法制备了EPP-OVA-FITC、EPP- Cyt C-FITC、EPP-RNase A-FITC和EPP-IgG-FITC NCs，通过DLS测定了各蛋白复合物的粒径和电位，平均粒径分布在150-200nm之间，电势分布在1-4 mV之间，表明PBA/EGCG/PEI成功与OVA、Cyt C、RNase A和IgG蛋白交联组装。

在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使HeLa细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的终浓度将不同分子量/电荷的蛋白质前药或PLUSin/蛋白质复合物样品加入孔中，在37℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用冷的PBS清洗三次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。具体参见图8。实验结果显示，所有蛋白质纳米囊在细胞内均出现明显且均匀分布，此外，相比于商业化试剂PULSin，本发明蛋白质纳米囊的内化量明显增加。以上实验结果共同表明，本发明蛋白质纳米囊具有良好的普适性，并且其递送能力优于现有的商业化试剂。

实施例七

为了研究E、B、P组装后的生物活性蛋白在细胞内活性恢复情况，制备了E、B、P组装的β-半乳糖苷酶（β-gal）纳米囊。制备方法与实施例一中相同，形成200 nm左右的NCs，并且NCs的表面电势在为正。

将标记FITC荧光的β-gal蛋白作为模型蛋白，探索EPP-β-gal-FITC NCs的递送效率及其在HeLa细胞中的分布情况。经EPP-β-gal-FITC NCs孵育后，细胞内绿色荧光广泛均匀分布，且绿色荧光明显强于同PULSin/β-gal-FITC复合物孵育的细胞。流式分析显示了相同的结果，经EPP-β-gal-FITC NCs孵育后，细胞中平均荧光强度约为PULSin/β-gal-FITC的4倍（p <0.001）。

将HeLa细胞以每孔4×10⁴个接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。为了探究细胞内溶酶体酸性环境对EPP-β-gal活性恢复的作用，0.1 M HCl提前处理30分钟的蛋白质样品（pH 6.0），将不同修饰以及处理的β-gal蛋白质样品按照4 μg/mL的浓度加入孔中在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用PBS洗三次，加入细胞固定液，室温固定10分钟。移除固定液，PBS洗三次，加入含有X-gal（0.1 mg/mL）的底物染色液。将细胞板放置于不含CO₂的37 ℃培养箱中过夜。之后移除染色液，PBS洗三次。用光学显微镜观察细胞的染色。进一步地使用邻硝基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）对酶的活性定量分析。β-gal 胞内递送实验处理后，PBS洗三次，加入200 μL裂解液裂解细胞，取50 μL裂解液加入50μL含有ONPG的酶活检测液，37 ℃放置1 h，之后加入150 μL NaHCO₃（1 M）终止反应，将溶液转移至96孔板中检测420 nm的吸光度。以等浓度未处理的β-gal的酶活作为阳性对照，吸光度定义为100%。具体参见图9。实验结果表明，EPP-β-gal显示出最多的蓝色沉积，表明有大量的β-gal内化，并且执行其生物学功能，HCl提前处理后，蓝色沉积减少，表明酸性环境下纳米囊解离，游离的β-gal蛋白无法进入细胞。定量实验显示了相同的结果，EPP-β-gal在细胞中几乎可以完全恢复活性，证明了E、B、P组装的蛋白质纳米囊可以有效实现蛋白内化，并且在肿瘤细胞中恢复其活性。

实施例八

辣根过氧化物酶（HRP）的胞内递送。制备方法与实施例一中相同，得到E、B、P组装的HRP纳米囊，粒径为188 nm，表面电势为3.17 mV。

利用上述相同的方法研究了EPP-HRP NCs的胞内递送效率及其在细胞中的分布情况。EPP-HRP-FITC NCs可高效进胞，并顺利从溶酶体逃逸，在细胞内均匀分布，CLSM和流式分析均表明EPP-HRP-FITC NCs递送效率明显高于商业试剂PULSin（p <0.001）。

将HeLa细胞以每孔4×10⁴个接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将不同修饰以及处理的HRP蛋白质样品按照4 μg/mL的浓度加入孔中在37℃以及5% CO2的条件下孵育12小时。PBS洗6次，加入四甲基联苯胺（TMB，10 μg/mL）溶液和过氧化氢（3 mM）溶液，室温孵育10分钟，观察各孔的染色情况。具体参见图10。实验结果显示，EPP-HRP中蓝色变化最为明显，未修饰组几乎没有颜色变化，表明EPP-HRP能够有效内化进入细胞，并且执行其生物学功能。

实施例九

毒性蛋白质的胞内递送。选取核糖核酸酶A（RNase A）和皂草素蛋白（saporin）作为模型蛋白质检测胞内的递送效率及生物学功能。制备方法与实施例一中相同，得到EPP-RNase A和EPP-saporin。

将HeLa、4T1细胞以每孔6×10³个接种到96孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。将EPP-RNase A纳米囊按照每孔20 μg/mL，10μg/mL，5 μg/mL，2 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL的蛋白质浓度加入到孔中，继续培养48 h。将EPP-saporin纳米囊按照每孔2 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.2 μg/mL，0.1 μg/mL，0.05 μg/mL的蛋白质浓度加入到孔中，继续培养48 h。用MTT测定法测定细胞的活力，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。具体参见图11。

实验结果显示，EPP-RNase A及EPP-saporin在HeLa和4T1细胞中表现出明显毒性，该结果表明EPP-RNase A及EPP-saporin可以高效递送进入肿瘤细胞，并对肿瘤细胞造成杀伤。

实施例十

saporin-Cy5制备方法与实施例二中类似。在0.1 M NaHCO₃缓冲溶液中，将Cy5-NHS与saporin混合，反应过夜，并使用超纯水透析（MWCO = 3.5 kDa）获得荧光标记的saporin-Cy5。制备方法与实施例一中相同，得到E、B、P组装的EPP-saporin-Cy5纳米囊。

本发明蛋白质纳米囊递送系统在体内的组织分布。将生长良好的乳腺癌细胞（4T1）接种到BALB/c（6-8周）小鼠皮下，建立乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到约200 mm³的时候，Balb/c小鼠尾静脉分别注射saporin-Cy5和EPP-saporin-Cy5（0.5 mg saporin/kg），在4小时的时候，对小鼠进行活体荧光成像。随后将小鼠处死，将其心、肝、脾、肺、肾以及瘤切下，在小动物成像仪下观察蛋白质在各个部位富集情况。具体参见图12。结果表明，EPP-saporin-Cy5能够在肿瘤部位有效富集。

通过Cy5标记saporin蛋白，研究静脉注射后saporin-Cy5和EPP-saporin-Cy5 NCs的药代动力学和生物分布。EPP-saporin-Cy5 NCs在BALB/c小鼠体内的血液循环时间明显长于saporin蛋白，EPP-saporin NCs和saporin蛋白的半衰期（t_1/2）分别为8.7和0.97小时。表明EGCG/PBA/PEI动态交联组装可显著延长蛋白质的血液循环时间。

4T1荷瘤小鼠尾静脉注射saporin-Cy5和EPP-saporin-Cy5 NCs（0.5 mg saporin/kg），给药4小时后，通过小动物成像系统检测其在小鼠体内的组织分布。小鼠体内荧光成像及离体组织荧光成像结果显示，EPP-saporin-Cy5 NCs能够增强在肿瘤部位的富集，EPP-saporin-Cy5的肿瘤累积水平约为6.7% ID/g，表明EPP-saporin-Cy5 NCs可显著延长蛋白复合物的血液循环时间，并且有效靶向肿瘤组织（saporin-Cy5约3.1%，p <0.001）。

本发明蛋白质纳米囊递送体系在体内的抑制肿瘤效果。将生长良好的乳腺癌细胞（4T1）接种到BALB/c（6-8周）小鼠皮下，建立乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到约50 mm³的时候，随机将小鼠分为三组，每组7只，分别为（G1）PBS组，（G2）皂草素（Saporin）组，（G3）EPP-皂草素（EPP-sporin）组。每组小鼠尾静脉给与100 μL的PBS、皂草素或EPP-皂草素，其中皂草素蛋白剂量为0.5 mg/kg。分别在第0，2，4，6天给药。每隔一天测量小鼠肿瘤的体积和体重，肿瘤体积（V）按照下列公式计算：V = 长度 × （宽度）2 × 0.5。第12天处死小鼠，收集其肿瘤以及主要器官，10％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精和曙红（H&E）染色，光学显微镜观察并拍照。其中肿瘤切片另做TUNEL染色。具体参见图13。结果表明，EPP-sporin给药组小鼠肿瘤受到明显抑制，在第12天相较于PBS及saproin给药组小鼠肿瘤抑制率达到80%。并且，肿瘤切片染色结果表明，PBS和saporin处理后的肿瘤组织显示紧密堆积的肿瘤细胞和间质，而EPP-saporin处理后的肿瘤组织则显示明显的细胞坏死及凋亡特征，例如核浓缩、细胞缩小和空泡化。

在12天的观察期内，EPP-saporin NCs给药组小鼠体重与PBS组保持一致，没有明显波动。

EPP-protein NCs在用于体内蛋白递送及相关治疗应用时，需具有良好的生物安全性。通过向血红细胞溶液中加入不同浓度的EPP-saporin NCs，检测其溶血率来评估其对血红细胞的破坏程度。将提取到的小鼠血红细胞稀释10倍，分别与不同浓度的EPP-saporinNCs共孵育。Triton X-100（1 %）处理的血红细胞溶液呈血红色，表明血红细胞膜被完全破坏。而EPP-saporin NCs处理的血红细胞溶液澄清透明，血红细胞沉降在底部，结果与PBS组一致，表明NCs未对细胞膜产生破坏，血红细胞膜仍保持完整。以PBS溶液作为阴性对照，将加入Triton X-100（1%）的溶血率作为100%，计算各组溶血率，在0-100 µg/mL的浓度范围内，EPP-saporin NCs处理的血红细胞的溶血率都低于3%，不产生溶血毒性，具有较好的生物相容性。

健康雌性C57/BL6小鼠在第0、2、4、6天，通过尾静脉分别注射PBS、saporin和EPP-saporin NCs（0.5 mg saporin/kg），在第12天研究其体内生物相容性。提取小鼠血液进行血生化和血常规检测，结果显示，EPP-saporin NCs给药组与PBS对照组的各项血液和生化指标差异不明显，说明EPP-saporin NCs具有良好的生物相容性。此外，小鼠主要器官（心、肝、脾、肺和肾）切片的H&E染色图片中没有显示异常，未检测到坏死、炎症、水肿或其他病理症状。

这些结果表明，EPP-saporin是一种高效的蛋白质药物，EPP-saporin NCs的系统毒性较小，可以用于体内肿瘤治疗。

实施例十一

多酚单体的化学结构式如下：

将多酚单体溶解于去离子水中，最终浓度为（1 mg/mL），得到单体E溶液；将小分子溶解于去离子水中，最终浓度为（1 mg/mL），得到单体B溶液；将PEI溶解于去离子水中，最终浓度为（1 mg/mL），得到P溶液；然后单体E、B、P按1∶4∶1摩尔比的混合，室温搅拌1小时，得到E-B-P聚合物溶液。

PEI与小分子（2-APBA）之间亚胺键的形成，用¹H NMR对PEI 1.8k/2-APBA的化学结构进行了表征，具体见图14中A。在PEI 1.8k/2-APBA（硼酸浓度为1 × 10^-3mol L^-1）和茜素红S（ARS，1 × 10^-4mol L^-1）的混合缓冲液（52.1 wt%甲醇与KCl水溶液，10 mmol L^-1；KH₂PO₄，2.7 mmol L^-1；Na₂HPO₄，2.7 mmol L^-1；pH = 8.21）中，并用不同浓度的EGCG化合物（0、1.25、2.5、5和10 mM）进行荧光滴定。测定ARS/2-APBA-PEI 1.8k/EGCG混合物在535 ~675 nm范围内（λ _ex= 495nm）的荧光发射光谱，具体见图14中B。

五种多酚（RT、NDGA、EA、RA和EGCG）、三种APBA（2-APBA、3-APBA、4-APBA）和PEI1.8k合成了15种三元聚合物，这些聚合物被命名为x-PEI-y，其中与2-APBA、3-APBA和4-APBA相关的x = 2、3和4，与不同天然多酚相关的y = RT、NDGA、EA、RA和EGCG。

实施例十二

将三元聚合物（1 mg mL^-1）和DNA（pLuc，Luc荧光素酶质粒，0.1 mg mL^-1）分别溶于超纯水中，按照不同聚合物/DNA质量比（0.25、0.5、1、2、4、6和8）混匀，在室温条件下孵育30min，形成NCs（聚合物-核酸纳米复合物）溶液。以商业PEI25k装载DNA作为对照。

随后将新制备的不同比例NCs与6 × DNA上样缓冲液混合均匀后，加入1%（w/v）琼脂糖凝胶加样孔中（每孔0.4 μg DNA），电泳（100 V，40 min），通过凝胶成像仪观察含有不同的E-B-P聚合物聚合物对DNA的包载情况。

通过EB排阻实验定量分析含有不同的多酚聚合物材料对DNA的包载能力。将DNA溶液与EB混合（DNA/EB = 10，w/w），室温孵育1 h。再将三元聚合物溶液（0.5 mg mL^-1）加入到DNA/EB混合液中混合均匀，室温孵育30 min，通过多功能酶标仪测定不同三元聚合物的荧光强度（λ _ex= 510 nm，λ _em= 590 nm）。阴性对照和阳性对照分别为纯EB溶液和不含任何三元聚合物的DNA/EB溶液。DNA包载效率（%）公式如下：

其中，F_EB表示纯EB溶液的荧光强度，F₀表示不含有三元聚合物的DNA/EB溶液的荧光强度，F表示加入不同三元聚合物的DNA/EB混合溶液的荧光强度。

参见图15，表明所有E-B-P聚合物质量比≥ 1时，都可以稳定包载DNA，其中含有RT的聚合物在质量比≥0.5时，具有更好包载DNA的效果。EB排阻实验表明，当聚合物/DNA质量比为0.5时，含有RT、RA、NDGA、EA和EGCG的聚合物平均包载DNA效率分别为88.6%、68.5%、60.3%、73.5%和61.2%，参见图16。

使用DLS测定三元聚合物/DNA NCs的粒径和zeta电位，以及通过TEM观察2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA NCs的形态，NCs具有均匀的球形形态，参见图17中A。当含有RT的聚合物/DNA质量比为5～20时，NCs的粒径在103～199 nm之间，其粒径波动范围较小，zeta电位在-1.2～9.5 mV之间，其表面电荷带有微弱正电荷，具有一定抗血清稳定的能力。使用10% FBS的DMEM培养基来测定NCs的血清稳定性，RT多酚聚合物/DNA NCs保持了预期的血清稳定性，孵育12 h后粒径大小略有增加，相比之下，PEI 25k/DNA NCs的大小从平均315 nm急剧增加到924 nm。这些结果表明，含有RT多酚聚合物/DNA NCs可以增强的血清稳定性，参见图17中B。

实施例十三

用HCl室温处理2-PEI-RT、3-PEI-RT和4-PEI-RT（pH = 6.0，1h），然后使用紫外分光光度计分析吸收峰的位移。随后，利用肝素钠置换实验测定用HCl（pH = 6.0，1h）预处理前后NCs的DNA释放情况。HCl（0.1 mM）预处理2-PEI-RT、3-PEI-RT和4-PEI-RT，加入DNA/EB（聚合物/DNA = 1，w/w）溶液孵育30 min，最后加入不同浓度肝素钠溶液，涡旋15 s，室温孵育1 h。将NCs溶液加入到标准96孔黑板中，每孔100 μL，在多功能酶标仪中检测其荧光强度。计算方法与EB排阻的方法相同。参见图18。在酸（pH 6.0，1 h）处理后，聚合物的吸收峰出现了明显的蓝移到350 nm，说明pH诱导的三元聚合物降解。同时，在肝素钠浓度为0.5mg/mL的酸（pH 6.0，1小时）处理后，含RT的多酚聚合物/DNA NCs释放出约78.9%、83.0%和77.6%的DNA，而在相同肝素钠浓度的pH值7.4下，仅释放出约52.7%、47.7%和43.6%的DNA。

实施例十四

将B16F10细胞接种于96孔板（每孔1.5 × 10⁴个细胞），培养24小时。随后，更换为含10% FBS的新鲜DMEM培养基（90 μL），并加入含pLuc的NCs（每孔0.1 µg DNA，10 μL），培养6小时，更换新鲜的DMEM继续培养18小时。然后使用Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶的表达，使用BCA试剂盒检测细胞蛋白浓度水平。最终的转染效率以每毫克蛋白质的相对荧光强度来表示。使用商业化转染试剂PEI 25k（金标准）作为阳性对照。为了考察2-PEI-RT/pLuc、3-PEI-RT/pLuc和4-PEI-RT/pLuc NCs在其它细胞上的转染情况，分别转染HepG-2、MBA-MD-231和HeLa细胞，按上述方法检测NCs的转染效率。为了进一步考察2-PEI-RT/pLuc NCs在不同含量胎牛血清（FBS）的转染情况，分别在10%、20%、30%和50% FBS条件下转染B16F10细胞，按上述方法检测NCs的转染效率。参见图19和图20。结果显示，在HeLa，HepG-2和MDA-MB-231细胞中，含有多酚聚合物/pLuc 纳米复合物的转染效率明显高于PEI25k/pLuc纳米复合物。同时，在含有20%、30%或50% FBS的DMEM培养基中，2-PEI-RT/pLuc 纳米复合物在聚合物/pLuc质量比为10时仍然具有较高的转染效率。

实施例十五

为了进一步探究E-B-P聚合物-核酸纳米复合物的内化机制，使用激光共聚焦方法进行了研究。首先将B16F10细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁PBS洗涤3次，换用新鲜培养基，加入内吞抑制剂：氯丙嗪（CPZ, 10 μg/mL）抑制网格蛋白质介导的内吞作用；染料木黄酮（GNT,100 μg/mL）抑制小窝蛋白质介导的内吞作用；甲基-β-环糊精（mβCD, 50 μM）减少膜上胆固醇的量抑制脂质筏介导的内吞作用以及渥漫青霉素（WTM, 50 nM）抑制巨胞饮，37 ℃孵育1小时。PBS洗涤3次，更换新鲜培养基，然后加入含有E-B-P-pLuc-YOYO-1的溶液（终浓度为 1μg/mL的核酸）继续孵育6小时，含肝素钠的PBS溶液（20 U/mL, 500 μL）洗涤3次，RIPA裂解液（100 μL, 30分钟）裂解细胞。通过荧光分光光度计（λ _ex= 485 nm,λ _em= 530 nm）测定细胞摄取水平。将没有抑制剂作用下E-B-P-pLuc-YOYO-1（终浓度为1 μg/mL的核酸）处理6小时（37 ℃）B16F10细胞的荧光强度作为100%。参见图21，在4 ℃时，E-B-P-pLuc-YOYO-1的细胞摄取水平分别被显著抑制，说明纳米复合物主要通过消耗能量的内吞作用进入细胞。此外，CPZ使E-B-P-pLuc-YOYO-1的摄取水平分别降低，说明纳米复合物主要通过CME进入细胞，而不是通过小窝蛋白和小胞饮介导的内吞作用进入细胞。

实施例十六

使用激光共聚焦的方法对于E-B-P-pLuc-YOYO-1和溶酶体/内涵体的共定位进行了观察。首先将B16F10细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% 的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照1 μg/mL的浓度将核酸样品加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育6小时。用含肝素钠的PBS清洗两次以后，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，用Lysotracker deep red （20 nM）标记溶酶体/内含体30分钟，用PBS清洗三次后在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的共定位。具体参见图22。实验结果显示，在任何时刻，E-B-P-pLuc-YOYO-1（绿色荧光）与溶酶体/内涵体（红色荧光）很少重合，表明E-B-P-pLuc-YOYO-1成功的从溶酶体/内涵体中逃逸。

实施例十七

将B16F10细胞接种到96孔板中（每孔1.5 × 10⁴个细胞），培养24小时后，更换10%FBS的新鲜DMEM培养基，用2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA 纳米复合物（每孔0.1 μg DNA）处理6小时，再在含10% FBS的新鲜DMEM培养基中孵育18小时。加入MTT（5 mgmL^-1，20 μL），37 ℃条件下孵育4小时。小心的移除培养基，加入DMSO（100 μL）溶解甲臜，室温震荡20分钟混合均匀，多功能酶标仪测定570 nm处的吸光度。以PBS处理的细胞存活率作为100%，未接受纳米复合物处理的细胞作为对照。结果以对照细胞活力百分比表示，计算三种纳米复合物处理后的细胞存活率（%）。HeLa、HepG-2和MDA-MB-231细胞进行同样的实验。参见图23，2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA纳米复合物对细胞没有明显的细胞毒性，表明其具有良好的生物安全性。更重要的是，2-PEI-RT/DNA、3-PEI-RT/DNA和4-PEI-RT/DNA NCs在最佳转染浓度（10 μg mL^-1）的溶血率都低于3%，表现出具有良好的生物相容性。

实施例十八

在体内基因转染研究，给B16F10荷瘤C57BL/6小鼠（~100 mm³）静脉注射PBS、jetPEI/pLuc 纳米复合物或2-PEI-RT/pLuc纳米复合物（10 mg 2-PEI-RT/kg，1 mg pLuc/kg）。注射后48小时，小鼠麻醉，腹腔注射D-荧光素钾溶液（100 µL，15 mg/mL）。10分钟后，在体内光学成像系统上进行生物发光成像。参见图24示，在静脉注射2-PEI-RT/pLuc纳米复合物后48小时，肿瘤中观察到显著的生物发光，并且转染效率与商业试剂jetPEI相当。

实施例十九

sgRNA购买自湖南丰晖生物科技有限公司（中国，长沙）。Real time-PCR引物购买自生工生物工程（上海）股份有限公司（中国，上海）。Luc-mRNA和EGFP-mRNA购买自APExBIO（美国，德克萨斯州）。Cas9-mRNA和Cy5-mRNA购买自爱必信生物科技有限公司（中国，上海）

将2-PEI-RT（1 mg mL^-1）和mRNA（1 mg mL^-1）分别配制于超纯水和DEPC水中，按照不同聚合物/mRNA质量比（0.25、0.5、1、2、4、6和8）混匀，在室温条件下孵育30 min，形成NCs。随后将新制备的不同比例NCs与6 × DNA上样缓冲液混合均匀后，加入1%（w/v）琼脂糖凝胶加样孔中（每孔0.4 μg mRNA），电泳（140 V，20 min），通过凝胶成像仪观察2-PEI-RT对mRNA的包载情况。此外，使用DLS测定2-PEI-RT/mRNA NCs的粒径和zeta电位，在2-PEI-RT/mRNA质量比≥0.5时，2-PEI-RT可以稳定包载mRNA，当2-PEI-RT/mRNA的质量比在20-50时，2-PEI-RT/mRNA NCs的粒径可以稳定在301-415 nm之间，且表面电位在0.3-2.3 mV之间，说明其粒径逐渐趋于稳定和表明电荷带有微弱正电。

利用流式细胞术以及CLMS测定2-PEI-RT/Cy5-mRNA NCs在HeLa细胞中的摄取情况，2-PEI-RT/Cy5-mRNA NCs与商业试剂PEI 25k/Cy5-mRNA NCs相比，其细胞摄取能力强于PEI 25k（p＜0.001）。同时，用CLMS观察HeLa细胞摄取和流式细胞仪分析结果相一致。这些结果证明了2-PEI-RT也有高效胞内递送mRNA的能力。

用CLSM观察2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(GFP)NCs在GFP-HeLa细胞中，编辑GFP基因并切除后表达GFP蛋白的情况。将2-PEI-RT、Cas9-mRNA和GFP靶向sgRNA（表1）以45/1/0.5的质量比例混合，在室温下孵卵30 min，形成2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(GFP)NCs。将GFP-HeLa细胞接种于激光共聚焦专用细胞培养皿上（每孔1 × 10⁵个细胞，d = 15 mm），培养24 h。然后用2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(GFP)NCs（每孔1 μg mRNA和0.5 μg sgRNA_(GFP)）在37 ºC含10% FBS的新鲜DMEM孵育24 h。然后，细胞在含10% FBS的新鲜DMEM培养基中孵育48 h。细胞用含肝素钠的PBS（20 U mL^-1）洗涤三次，用Hoechst 33342（5 μg mL^-1）染色20 min，再用PBS洗涤三遍去除多余的染料，CLSM观察并利用 ImageJ 软件对GFP荧光进行荧光定量。以游离的Cas9-mRNA和sgRNA_(GFP)为阴性对照，以商业试剂Lipo-MAX为阳性对照。

以能持续表达绿色荧光蛋白的HeLa细胞（GFP-HeLa）为模型，研究2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA NCs（靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA，sgRNA_(GFP)）进入细胞后敲除GFP基因的能力。CLSM图像显示，游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)处理的HeLa-GFP细胞荧光强度与未处理的细胞相似。相比之下，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)NCs处理显著降低了HeLa-GFP细胞的荧光强度（图25A）。通过荧光定量分析显示，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)NCs处理细胞的平均荧光强度较游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(GFP)处理的GFP-HeLa细胞降低了~69.1%（图25B）。

2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs由Cas9-mRNA和PLK1靶向sgRNA（sgRNA_(PLK1)，表1）按照3.3.4方法制备。HeLa细胞在6孔板上（每孔1 × 10⁶个细胞）孵育24小时。HeLa细胞与2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs（每孔2 μg Cas9-mRNA和1 μg sgRNA_(PLK1)）在37 ºC含10% FBS的新鲜DMEM中孵育24 h。细胞用PBS洗涤三遍去除多余的材料，在含10% FBS的新鲜DMEM培养基中继续孵育48 h。然后使用Trizol试剂从HeLa细胞中提取总RNA。超微量生物检测仪（Nanodrop 2000）测定RNA浓度以及纯度。采用PLK1特异性引物并使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒检测PLK1 mRNA水平（表2）。按反转录试盒说明书操作，以0.5 μg RNA为模板，37 °C条件下反应15 min，85 °C、5 s灭活Evo M-MLV反转录酶，4 °C冷却15 min，将RNA反转录为互补DNA（cDNA）。按SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书操作，以cDNA模板特异性扩增目的基因PLK1和内参基因β-actin。PCR扩增条件为预变性（95 °C，30 s）、PCR 扩增反应（95 °C，5秒，60 °C，30 s，40个循环）。以不与2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs共孵育的HeLa细胞PLK1mRNA表达量为100%，计算与各样品共孵育的HeLa细胞PLK1 mRNA的相对表达量（%）。以游离的Cas9-mRNA和sgRNA_(PLK1)为阴性对照和商业试剂Lipo-MAX为阳性对照。

在蛋白质水平上的基因编辑效率通过Western blot测定，按照上述方法制备2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs，并用其处理HeLa细胞。72 h后加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液提取HeLa细胞中的蛋白质，并用BCA试剂盒检测其蛋白浓度。进行Western blot实验。所用抗体和稀释比例如下，一抗：anti-PLK1兔源单克隆抗体（1:1000），anti-β-actin兔单克隆抗体（1:2000）；二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000）。

在DNA水平上的基因编辑效率通过下一代测序（NGS）方法测定，按照上述方法制备2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs，并用其处理HeLa细胞。72 h后使用细胞/动物组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞的基因组DNA。利用挚科（Tsingke）生物科技有限公司的NGS方法对2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs的基因编辑效率进行评估。

将HeLa细胞接种于96孔板上培养24 h（1.5 × 10⁴个细胞），用含有10% FBS的DMEM培养基（90 μL）替换，每孔加入2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs（每孔Cas9-mRNA终浓度0.2、0.5、0.8、1、2 μg/mL，10 μL）与细胞孵育24 h。细胞用PBS洗涤三遍去除多余的材料，细胞在含10% FBS的新鲜DMEM培养基中孵育48 h，最后使用MTT法测定细胞活力。以游离的Cas9-mRNA和sgRNA_(PLK1)做对照。

在HeLa细胞中，研究2-PEI-RT介导Cas9-mRNA和sgRNA（sgRNA targeting PLK1，sgRNA_(PLK1)）的递送后敲除PLK1基因的能力。首先通过real time-PCR和Western blot检测HeLa细胞内PLK1 mRNA和蛋白的表达水平。如图26所示，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs组与Control组的PLK1 mRNA表达水平对比显著下降了57.3%。Western blot实验进一步证明了，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs组的PLK1蛋白表达水平也显示同样的结果（图27）。随后通过NGS测定，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs处理的HeLa细胞显示了PLK基因的突变率为51.4%。最后，通过MTT法测定了HeLa细胞对2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs产生浓度依赖性毒性，其半致死浓度（IC₅₀）值为1.4 µg Cas9-mRNA/mL（图29）。这些结果共同证明了2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(PLK1)NCs递送至肿瘤细胞内后，具有高效的基因组编辑能力。

实施例二十

参照实施例十九制备2-PEI-RT/RNA NCs，以商业试剂Lipo-2000为对照。利用流式细胞术以及CLMS测定2-PEI-RT/Cy5-mRNA NCs在RPE细胞中的摄取情况，2-PEI-RT/Cy5-mRNA NCs与商业试剂Lipo-2000/Cy5-mRNA NCs相比，其细胞摄取能力强于Lipo-2000（p＜0.01）。

通过常规划痕愈合实验，探究了PBS，游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)，Lipo-2000/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs在HUVEC细胞迁移能力方面的影响，从而证实其体外的抗血管生成能力。在HUVEC细胞形成划痕后的0 h和24 h拍摄了照片。通过显微镜观察前后对比PBS和游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)组伤口愈合率分别为31%和32%。然而，Lipo-2000/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs则显著抑制了HUVEC细胞的迁移，细胞迁移率则分别下降至11%和3.9%。2-PEI-RT/mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs由Cas9-mRNA和VEGFA靶向sgRNA（sgRNA_(VEGFA)，表3）制备。

通过real time-PCR检测RPE细胞内VEGFA mRNA的表达水平，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组与PBS和Free Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)组的VEGFA mRNA表达水平对比显著下降了45.6%；随后使用ELISA试剂盒检测RPE细胞分泌VEGFA蛋白的浓度，结果显示与游离的Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)组对比2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组可以有效的减少细胞上清液中VEGFA蛋白的浓度；最后通过NGS测定，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs处理的RPE细胞显示了VEGFA基因的突变率为31.60%。这些结果共同证明了2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs递送至RPE细胞内后，发挥高效的基因组编辑能力，从而具有抗血管生成方面的潜力，为后续CNV小鼠疾病模型的治疗奠定了基础。

CNV小鼠模型的构建是按照已经报道的激光光凝法，具体实验步骤如下：对C57BL/6小鼠进行全身麻醉，并在小鼠眼球表面滴加托吡卡胺滴眼液进行散瞳。然后使用手持式眼底镜进行激光光凝（激光波长659 nm，功率250 mW），在视神经头周围的3、6、9和12点时钟位置产生4个激光烧伤斑（光斑直径50 μm，持续时间50 ms）。光凝后产生的气泡式烧伤，被视为成功击穿Bruch’s膜，即为有效激光斑。随后，用红霉素眼膏涂抹小鼠眼表，防止发生眼内感染。术后使用电热毯让小鼠恢复体温，待其完全清醒后送回动物房饲养。

激光光凝术后第二天，将小鼠随机分为4组：

Normal组：正常小鼠且未进行玻璃体注射；CNV control组：CNV小鼠玻璃体注射PBS（2 µL）；Aflibercept组：CNV小鼠玻璃体注射Aflibercept（0.1 mg/kg，2 µL）；2-PEI-RT组：CNV小鼠玻璃体注射2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs（9 μg 2-PEI-RT，0.6 μgCas9-mRNA，0.3 μg sgRNA_(VEGFA)，2 μL）。

采取荧光素钠血管造影（FFA）的方式对小鼠眼底情况进行监测，具体实验步骤如下：

（1）1%戊巴比妥钠（100 μL）腹腔注射麻醉小鼠，并向眼内滴加托吡卡胺滴眼液进行散瞳。

（2）每只小鼠腹腔注射2%荧光素钠溶液（200 μL），进行采集眼底血管造影图像（染料注射后5 min）。

（3）使用Image J软件计算每个CNV渗漏的平均信号强度（亮度）。

（4）按照临床分级标准^[19]对CNV病变区域的荧光强度进行评估：无渗漏为0，荧光微弱或呈斑点状；疑似渗漏为1，荧光的尺寸和强度未发现渐进性增加；渗漏为2A，荧光强度增加，但面积大小未变化；病理性显著渗漏为2B，荧光强度和尺寸大小均增加。

给药治疗后第7天，分离出小鼠眼球组织的脉络膜层，制片并对新生血管进行免疫荧光染色，从而能够更直观地测量新生血管的面积大小，具体实验步骤如下：

（1）颈椎脱臼法处死小鼠，立即取出小鼠眼球并放入眼球固定液中室温固定2 h。

（2）在体视显微镜下，用眼科手术专用剪轻轻将眼球周围结缔组织和肌肉去除。然后，剥离角膜和晶状体。最后，从脉络膜上移除视网膜和巩膜并将剩余的眼杯后半部分做四个放射状切口（朝视神经轴方向），剪成花瓣样外观。

（3）将获得的脉络膜用ICC缓冲液（1 × PBS，0.5%牛血清蛋白，0.2%吐温-20，0.1%Triton X-100）洗涤三次并继续在室温封闭1h。随后，加入荧光素标记的Isolectin GS-IB4-AF488（1:1000 稀释）4 ℃冰箱孵育过夜。用ICC缓冲液漂洗3遍后加入Hoechst 33342（5 μg mL^-1）染色细胞核。最后用盖玻片将脉络膜压平到载玻片上。

（4）通过CLSM拍摄图像，使用ImageJ软件定量分析CNV面积。

规划了如下的给药方案：在CNV小鼠模型的建立后，第1天开始介入治疗，（包括PBS、Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs），并在第7天针对CNV面积和血管渗漏情况进行疗效评估。采用了临床上常用的眼底荧光素钠血管造影，来监测和分析CNV区域的情况。

如图29A所示，与注射了PBS的Control组的小鼠眼睛相比，注射了Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组的小鼠眼睛CNV部位的泄漏和损伤面积大大减少。通过相应的荧光素平均强度值的定量分析，Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组与Control组的CNV小鼠眼睛相比有效地减少CNV泄漏（图29B）。以上实验结果证实了2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs具有与临床上使用的Aflibercept相当甚至更优的治疗效果。同时，对各组的荧光素钠渗漏程度进行了临床等级评估。结果显示，在Control组的小鼠眼睛中，2A级（渗漏）和2B级（病理性显著渗漏）所占的比例明显大于0级（无荧光渗漏）和1级（可疑荧光渗漏）所占的比例，而在2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs治疗后的小鼠眼睛中，0级和1级所占的比例明显大于2A级和2B级所占的比例，这表明2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs能够在一定程度上抑制血管渗漏（图29C）。

眼底造影结束后，将小鼠眼球的脉络膜取出，通过免疫荧光染色的方法观察小鼠眼睛CNV区域的大小。如图30所示，Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组的激光斑中的绿色荧光标记区域（CNV区域）的面积与注射PBS的Control组的面积有明显差异，表明Aflibercept和2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs对CNV产生明显的抑制性作用。通过Image J软件计算了荧光区域的面积，Control组、2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组激光斑的CNV面积分别为24.9 ± 16.9、6.4 ± 5.8×10⁴μm²。2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs组的CNV区域荧光面积显著低于Control组，下降程度与Aflibercept组相当。

使用体式显微镜取出小鼠眼球RCS复合体。首先通过real time-PCR检测RCS复合体的VEGFA mRNA的表达水平。如图31中A所示，Control组的CNV小鼠与Normal组的正常小鼠对比，其VEGFA mRNA表达水平显著升高，经过2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs治疗后的CNV小鼠与Control组的CNV小鼠对比VEGFA mRNA表达水平出现显著下降。随后使用ELISA试剂盒检测RCS复合体中VEGFA蛋白的浓度，结果显示与Control组的CNV小鼠对比2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs治疗组可以有效的减少RCS复合体中VEGFA蛋白的浓度（图31中B）。最后通过NGS测定，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs治疗后的CNV小鼠中RPE细胞的VEGFA基因的突变率为23.95%。综上所述，上述实验结果表明了2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)NCs递送至小鼠中的RPE层，发挥良好的基因组编辑能力，从而具有治疗眼部CNV疾病的潜力。

对2-PEI-RT进行生物安全性研究，在玻璃体注射PBS、Aflibercept和2-PEI-RT后第七天，解剖出小鼠的眼球通过H&E染色进行病理学分析。PBS、Aflibercept和2-PEI-RT的小鼠的视网膜各层结构（包括，视网膜色素上皮层（Retinal pigment epithelium，RPE）、外核层（Outer nuclear layer，ONL）、内核细胞层（Inner nuclear cell layer，INL）和视网膜神经节细胞层（Retinal ganglion cell layer，GCL））清晰连续、染色均匀、形状规则及排列整齐致密。同时，与Normal组（未注射）相比，注射PBS、Aflibercept和2-PEI-RT的小鼠眼球均无明显病变产生。

本发明公开了一种三元聚合物递送核酸策略。将单体E、B、P一锅法反应，得到E-B-P聚合物；再将E-B-P聚合物与核酸静电相互作用形成纳米复合物，得到核酸递送载体。

本发明公开了一种蛋白质纳米囊胞内递送策略。蛋白质通过非共价键与多酚单体结合；小分子一端通过形成亚胺键与阳离子聚合物共价结合，同时小分子另一端通过形成硼酸酯键与多酚单体共价结合，成功将蛋白质、多酚单体、小分子、阳离子聚合物组装，形成EPP-蛋白质纳米囊。利用该策略组装的蛋白质纳米囊显示出高效的蛋白质胞内递送效率，且能在溶酶体酸性环境中解离，释放活性蛋白，发挥生物学功能。EPP-蛋白质纳米囊具有优异的血清稳定性，为体内应用奠定基础。该策略实现了不同分子量和等电点蛋白质的胞内递送，包括酶、抗体、毒性蛋白和Cas9蛋白，并且在肿瘤细胞的递送中具有普适性。组装后的EPP-saporin在体内外均具有优异的抗肿瘤效果，在4T1荷瘤小鼠中表现出优异的抗肿瘤功效并具有良好的生物相容性。这是第一例通过同时形成亚胺及硼酸酯键动态交联形成蛋白质纳米囊，它在肿瘤细胞中实现高效的蛋白质胞内递送。

利用该策略组装的E-B-P聚合物-核酸纳米复合物显示出高效的递送效率，且能在溶酶体酸性环境中解离，释放核酸，发挥生物学功能。E-B-P聚合物-核酸纳米复合物具有优异的血清稳定性，为体内应用奠定基础。该策略实现了在不同肿瘤细胞高效递送。组装后的E-B-P聚合物-核酸纳米复合物在体内外均具有优异的基因转染效率，在B16F10荷瘤小鼠中表现出优异的基因转染效率并具有良好的生物相容性。这是第一例通过同时形成亚胺及硼酸酯键动态交联形成E-B-P聚合物-核酸纳米复合物，它在肿瘤细胞中实现高效的核酸递送。进一步使用2-PEI-RT对mRNA进行胞内递送，研究其转染效果，并且分别评估了在持续表达绿色荧光蛋白的HeLa（GFP-Hela）和HeLa两种细胞中2-PEI-RT介导Cas9-mRNA和向导RNA（sgRNA）对GFP和polo样激酶1（PLK1）两种基因进行基因编辑的效率。结果显示，在GFP-HeLa细胞中，使其平均荧光强度显著下降了69.1%。同时，在HeLa细胞中，PLK1 mRNA和蛋白的相对表达水平都显著降低以及PLK基因的突变率为51.4%。使用2-PEI-RT共递送Cas9-mRNA和sgRNA对CNV小鼠模型进行基因编辑治疗。在体外，因为2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)展现出优良基因编辑效率，进而抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移。体内研究结果表明，在玻璃体注射后，相较于Control组，2-PEI-RT/Cas9-mRNA/sgRNA_(VEGFA)组能够显著抑制了新生血管的生成和减少了激光斑处的血管渗漏，同时VEGFA mRNA和蛋白表达水平也发生了显著下降。

这种简单而高效的技术为抗肿瘤蛋白质药物的潜在临床应用提供了新的策略。

Claims

1.一种胞内递送体系，其特征在于，所述胞内递送体系的制备原料包括多酚单体、阳离子聚合物；所述多酚单体、阳离子聚合物通过小分子连接；所述小分子在细胞内能够与多酚单体分离。

2.根据权利要求1所述胞内递送体系，其特征在于，所述多酚单体可以与蛋白质非共价结合；所述小分子的一端可以与多酚单体反应、另一端可以与阳离子聚合物反应；所述小分子在肿瘤细胞内能够与多酚单体分离。

3.一种蛋白质胞内递送纳米囊，其特征在于，包括权利要求1所述胞内递送体系以及蛋白质。

4.根据权利要求3所述蛋白质胞内递送纳米囊，其特征在于，所述蛋白质与多酚单体非共价结合。

5.权利要求3所述蛋白质胞内递送纳米囊的制备方法，其特征在于，蛋白质与多酚单体反应得到非共价结合的蛋白质-多酚单体；小分子与阳离子聚合物反应得到复合物；再将蛋白质-多酚单体与复合物反应，得到所述蛋白质胞内递送纳米囊。

6.一种核酸胞内递送纳米囊，其特征在于，包括权利要求1所述胞内递送体系以及核酸。

7.权利要求6所述核酸胞内递送纳米囊的制备方法，其特征在于，多酚单体、小分子以及阳离子聚合物反应得到三元聚合物；然后将核酸与三元聚合物孵育，得到所述核酸胞内递送纳米囊。

8.权利要求1所述胞内递送体系作为药物载体或者在制备药物载体中的应用。

9.权利要求3所述蛋白质胞内递送纳米囊或者权利要求6所述核酸胞内递送纳米囊在制备纳米药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，所述纳米药物为抗肿瘤纳米药物或非抗肿瘤纳米药物。