CN117467708A - 一种核酸递送复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米载体技术领域，公开了一种核酸递送复合物及其制备方法与应用。所述核酸递送复合物至少包括以下(a)和(b)：(a)含邻苯二酚结构的多酚与核酸形成的复合物内核；(b)PEG化多酚与金属离子形成的复合物外壳；所述复合物外壳位于所述复合物内核表面。该核酸递交复合物能携带核酸分子高效转染进入细胞，而且能彻底避免核酸分子在溶酶体中的降解并及时有效释放，最终发挥相应功能。将其应用于递送siRNA，可充分保留其活性并实现溶酶体快速逃逸以及胞内释放，实现目的基因的高效沉默并降低细胞毒性，在新型siRNA转染试剂成果转化方面拥有极大潜力。
Description
技术领域
本发明属于纳米载体技术领域，具体涉及一种核酸递送复合物及其制备方法与应用。
背景技术
小干扰RNA(Small interferingRNA；siRNA)是一个长20到25个核苷酸的双链RNA，主要参与RNA干扰现象。siRNA干扰技术作为一种新型的基因沉默技术，具有高效、高特异性、低毒性等优点。其作用原理在于siRNA通过与mRNA编码区的特定序列靶向结合，导致mRNA的降解从而沉默目的基因。这种靶向特异性增加了它作为潜在药物的可能性。但是siRNA存在理化稳定性差及生物利用度低等缺陷，这严重阻碍了siRNA的应用。因此，开发更高效稳定的siRNA递送技术是当下研究的挑战和重点。
目前最常用siRNA递送体系包括正离子聚合物胶束、树状大分子或脂质体等。这些纳米转染体系是通过与细胞膜相互作用，将siRNA递送至细胞内。目前商用转染试剂的主要成分仍为脂质体或阳离子型转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)。但是，这两种成分均存在其分子量相关的毒性风险，易使靶细胞死亡，并且其易与血清中蛋白成分形成蛋白壳，显著影响其转染效果。迄今为止，已上市的基于纳米递送系统的siRNA药物制剂仅有一种(onpattro,2018)，其原理基于低分子量弱酸可电离脂质体促进siRNA的包封及稳定。但是其包封率、稳定性、释放及目的基因沉默效率仍有待提高。
因此，本发明希望提出一种更为安全、有效的核酸递送系统，以克服目前核酸药物递送系统存在的不足。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种核酸递送复合物及其制备方法与应用。该核酸递交复合物能携带核酸分子高效转染进入细胞，而且能彻底避免核酸分子在溶酶体中的降解并及时有效释放，最终发挥相应功能。将其应用于递送siRNA，可充分保留其活性并实现溶酶体快速逃逸以及胞内释放，实现目的基因的高效沉默并降低细胞毒性，在新型siRNA转染试剂成果转化方面拥有极大潜力。
本发明提供了一种核酸递送复合物，至少包括以下(a)和(b)：
(a)含邻苯二酚结构的多酚与核酸形成的复合物内核；
(b)PEG化多酚与金属离子形成的复合物外壳；
所述复合物外壳位于所述复合物内核表面。
在所述核酸递送复合物中，核酸与含邻苯二酚结构的多酚通过分子间氢键结合形成内核，PEG化多酚与金属离子配位螯合形成三维网络外壳。该核酸递送复合物能对核酸进行有效包封保护，改善核酸包封效率、递送效率、稳定性以及生物安全性，其性能要明显由于商用转染试剂。
优选地，所述(a)中含邻苯二酚结构的多酚包括多巴胺、单宁酸、茶多酚中的至少一种。
优选地，所述(a)中核酸为siRNA。
优选地，所述(b)中PEG化多酚的制备方法为：将PEG-NHS与盐酸多巴胺(4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚盐酸盐)进行反应后，再加入碱性物质进行反应，然后加入甘氨酸；再经透析，制得所述PEG化多酚。
优选地，所述(b)中金属离子选自铪离子、铁离子、铜离子、锰离子中的至少一种。
本发明还提供了上述核酸递送复合物的制备方法，包括以下步骤：
将含邻苯二酚结构的多酚与核酸混合进行反应，制得复合物内核；再加入PEG化多酚与金属离子，搅拌进行反应，制得所述核酸递送复合物。
优选地，所述核酸、所述含邻苯二酚结构的多酚和所述PEG化多酚的质量比为13.3：(350-750)：(100-250)。
更优选地，所述核酸、所述含邻苯二酚结构的多酚和所述PEG化多酚的质量比为13.3：(400-700)：(133-233)。
具体地，当核酸为siRNA、含邻苯二酚结构的多酚为单宁酸时，采用以下质量比的组分制得核酸递送复合物，其包封率、粒径和电势如下表所示：
本发明还提供了上述核酸递送复合物在细胞转染中的应用。所述核酸递送复合物能携带核酸分子高效转染进入细胞，具有包封率高、稳定性强、释放及时、安全性较好的优势，在细胞转染中有着广阔的应用前景。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所提出的核酸递送复合物充分发挥多酚分子的非共价氢键与核酸磷酸基团的高亲和力以及天然多酚的酸响应特性，具有转染条件简单、转染效率不受血清影响等多项优势，qRT-PCR和Western Blot实验证明，本发明所提出的核酸递送复合物具有siRNA包封率更高、稳定性更强、生物安全性更高、释放更及时、目的基因沉默效率更卓越的独特优势，明显优于商用转染试剂lipo3000，其在新型siRNA转染试剂成果转化方面拥有极大潜力。
附图说明
图1为实施例1中负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子的理化特性图；其中，A为STHP纳米粒子形貌的TEM图；B为STHP纳米粒子的粒径分布；C为STHP纳米粒子的紫外图谱；D为STHP纳米粒子在水中放置7天的粒径情况变化图；
图2中A、B分别为实施例1中负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子被B16F10细胞摄取8小时的激光共聚焦图像(蓝色信号为细胞核，红色信号为负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子)以及被B16F10细胞摄取后完成溶酶体逃逸的激光共聚焦图像(红色信号为负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子，绿色信号为细胞的溶酶体)。
图3中A、B分别为负载siRNA-PD-L1的STHP纳米粒子沉默B16F10细胞的PD-L1后，各组的PD-L1 mRNA表达水平和蛋白表达水平。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：核酸递送复合物(STHP)的合成
本实施例提供一种核酸递送复合物(STHP纳米粒子)的合成方法，包括以下步骤：
(1)取50μL的单宁酸溶液(15mg/mL)和10μL的siRNA-Cy5溶液(1nmol/10μL)加入到250μL的EP管中，涡旋2分钟，震荡器上以1000rpm反应1小时；
经换算，上述所用siRNA-Cy5的质量为所用13.3μg。siRNA-Cy5的核苷酸序列如下所示：
正义链(5’-3’)：UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO：1)；
反义链(5’-3’)：ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-cy5(SEQ ID NO：2)。
(2)将1g的8-arm-PEG-NHS用8mL无水DMF完全溶解，称取盐酸多巴胺(4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚盐酸盐)400mg并用2mL无水DMF完全溶解。将二者混合在玻璃瓶中，惰性气体保护，磁力搅拌反应30分钟。将250μL的三乙胺加入瓶中，惰性气体保护下搅拌反应。1小时后撤走惰性气体，密封玻璃瓶，磁力搅拌反应过夜。将玻璃瓶中液体转移到离心管中，加入30mL甘氨酸溶液(50mmol/L，pH＝3)混合均匀。将混合溶液用透析袋(14000WM)透析2天，2L水中加入2mL的1mol/L HCl，并在透析时给予惰性气体(N2)保护，透析完成后冻干成PEG化多酚粉末。
取PEG化多酚粉末配置成浓度为15mg/mL的PEG化多酚溶液，将20μL的PEG化多酚溶液加入到步骤(1)结束后的EP管中，混合均匀，并用ddH2O补到100μL。将900μL ddH2O水加入到4mL的玻璃瓶中，将10μL的HfCl4(4mg/mL)加入到玻璃瓶中，磁力搅拌，混合均匀，再将EP管中的液体滴加入到玻璃瓶中，1000rpm磁力搅拌30分钟。最后将玻璃瓶中的液体转移到4mL(10KD)的超滤管中，再加1mL ddH2O，离心超滤(3000rpm，5分钟)，再加4mL ddH2O，再次超滤离心(3000rpm，5分钟)，用移液枪吹打超滤管中的剩余液体，将液体转移到1.5mL的EP管中定容到1000μL，制得核酸递送复合物(STHP纳米粒子)。
实施例2：核酸递送复合物(STHP纳米粒子)的表征
1.将实施例1所制得的STHP纳米粒子用SEM进行表征，结果如图1中A所示：STHP形貌类似为球状而且颗粒粒径较为均一。
2.如图1中B所示，实施例1中STHP纳米粒子的粒径保持在91nm-105nm左右。
3.如图1中C所示为STHP纳米粒子、单宁酸(TA)、PEG-DA(PEG化多酚)的紫外图谱，
4.将实施例1所制备的STHP纳米粒子放在水中(10μL的STHP纳米粒子与990μLddH2O混合)，分别于第1、2、3、4、5、6、7天检测SHTP的粒径大小。如图1中D所示：在置于水中的7天时间内，SHTP纳米粒子的粒径大小较为稳定。
实施例3：细胞摄取STHP纳米粒子
将B16F10细胞种在共聚焦皿中，5×105个/孔，24小时后待细胞贴壁后加入实施例1中SHTP纳米粒子(siRNA-Cy5的工作浓度为50nM)，药物作用8小时。将培养基吸走，用PBS洗三次，这一步是为了洗走游离在培养基中的SHTP。4％多聚甲醛固定15分钟，用DAPI染细胞核10分钟，用PBS洗三次，加入PBS保持湿润，用激光共聚焦显微镜拍照观察(蓝色信号为细胞核，红色信号为负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子)。
如图2中A所示：负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子能够被细胞吞噬，将siRNA-Cy5(即图2中的siRNA-NC Cy5)递送到细胞内(红色信号在细胞内)。
实施例4：溶酶体逃逸
将B16F10细胞种在共聚焦皿中，5×105个/孔，24小时后待细胞贴壁后加入实施例1中的SHTP纳米粒子，分别使药物作用4、8、12小时，将培养基吸走，用PBS洗一遍，用LysoTracker Green DND-26溶酶体绿色荧光探针染色细胞的溶酶体(用无血清DMEM稀释LysoTracker Green DND-26溶酶体绿色荧光探针，使探针工作浓度为75nM，将探针加入到共聚焦皿中，37度培养箱共孵育30分钟)。轻柔用PBS洗三次，加入PBS用激光共聚焦显微镜拍照观察。
如图2中B中所示，红色信号为负载siRNA-Cy5的STHP纳米粒子，绿色信号为细胞的溶酶体。该结果显示STHP纳米粒子可以将siRNA-Cy5递送到细胞内，并最终完成溶酶体逃逸(最后红色信号与绿色信号不重叠，图中没有红绿叠加后的黄色)。
实施例5：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
将实施例1中的siRNA-Cy5替换为siRNA-PD-L1(siRNA-PD-L1序列(si-PD-L1#1、si-PD-L1#2是两条针对PD-L1基因的不同siRNA的序列)订购于艾基公司)订购于艾基公司)，从而得到负载siRNA-PD-L1的STHP纳米粒子，将其作为实验组。此外，采用市场上常见的转染试剂lipo3000(赛默飞)分别对siRNA-PD-L1(si-PD-L1#1、si-PD-L1#2)和没有功能的siRNA(siRNA-NC)进行负载，将其作为对照组。
si-PD-L1#1、si-PD-L1#2的核苷酸序列如下所示：
si-PD-L1#1：
正义链(5’-3’)：GGAGAAAUGUGGCGUUGAAdTdT(SEQ ID NO：3)；
反义链(5’-3’)：UUCAACGCCACAUUUCUCCdTdT(SEQ ID NO：4)。
si-PD-L1#2：
正义链(5’-3’)：GCGUUUACUGCUGCAUAAUdTdT(SEQ ID NO：5)；
反义链(5’-3’)：AUUAUGCAGCAGUAAACGCdTdT(SEQ ID NO：6)。
将B16F10细胞种在6孔板中，每孔1.5×106个，待细胞贴壁后分别采用上述实验组和对照组沉默PD-L1基因。以上各组中siRNA-PD-L1转染工作浓度都为50nmol/L，48小时后吸走培养基，PBS洗三次，RNA提取试剂盒提取RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，进行RT-qPCR检测基因沉默后细胞的PD-L1的表达水平。
测试结果如图3中A所示，相较于对照组，在mRNA水平上负载siRNA-PD-L1的STHP纳米粒子具有明显更好的转染效率。
实施例6：蛋白免疫印迹
将实施例1中的siRNA-Cy5替换为siRNA-PD-L1(siRNA-PD-L1序列(si-PD-L1#1、si-PD-L1#2是两条针对PD-L1基因的不同siRNA的序列)订购于艾基公司)，从而得到负载siRNA-PD-L1的STHP纳米粒子，将其作为实验组。此外，采用市场上常见的转染试剂lipo3000(赛默飞)分别对siRNA-PD-L1(si-PD-L1#1、si-PD-L1#2)和没有功能的siRNA(si-NC)进行负载，将其作为对照组。
将B16F10细胞种在6孔板中，每孔1.5×106个，待细胞贴壁后分别采用上述实验组和对照组沉默PD-L1基因。以上各组中siRNA-PD-L1转染工作浓度都为50nmol/L，72小时后吸走培养基，PBS洗三次，Lysis buffer冰上裂解细胞，将孔板中的细胞刮下来，12000rpm离心15分钟，取上清，然后用BCA kit进行蛋白定量，加入5×loadingbuffer和lysis buffer使得蛋白的含量为1μg/μL，95℃处理10分钟使蛋白变性。然后进行蛋白免疫印迹实验，检测转染后细胞PD-L1的蛋白表达水平。
测试结果如图3中B所示，相较于对照组，在蛋白水平上负载siRNA-PD-L1的STHP纳米粒子具有明显更好的转染效率。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (9)
1.一种核酸递送复合物，其特征在于，所述核酸递送复合物至少包括以下(a)和(b)：
(a)含邻苯二酚结构的多酚与核酸形成的复合物内核；
(b)PEG化多酚与金属离子形成的复合物外壳；
所述复合物外壳位于所述复合物内核表面。
2.根据权利要求1所述的核酸递送复合物，其特征在于，所述(a)中含邻苯二酚结构的多酚包括多巴胺、单宁酸、茶多酚中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的核酸递送复合物，其特征在于，所述(a)中核酸为siRNA。
4.根据权利要求1所述的核酸递送复合物，其特征在于，所述(b)中PEG化多酚的制备方法为：将PEG-NHS与盐酸多巴胺(4-(2-氨基乙基)-1,2-苯二酚盐酸盐)进行反应后，再加入碱性物质进行反应，然后加入甘氨酸；再经透析，制得所述PEG化多酚。
5.根据权利要求1所述的核酸递送复合物，其特征在于，所述(b)中金属离子选自铪离子、铁离子、铜离子、锰离子中的至少一种。
6.权利要求1-5中任一项所述的核酸递送复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含邻苯二酚结构的多酚与核酸混合进行反应，制得复合物内核；再加入PEG化多酚与金属离子，搅拌进行反应，制得所述核酸递送复合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述核酸、所述含邻苯二酚结构的多酚和所述PEG化多酚的质量比为13.3：(350-750)：(100-250)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述核酸、所述含邻苯二酚结构的多酚和所述PEG化多酚的质量比为13.3：(400-700)：(133-233)。
9.权利要求1-5中任一项所述的核酸递送复合物在细胞转染中的应用。
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