KR101870694B1 - Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 현재 탈모 치료체로 사용되고 있는 약제의 경우 성욕 감퇴나 발기 부전 등과 같은 심각한 부작용이 초래되며, 약물 치료를 중단 할 경우 다시 탈모가 진행되는 단점을 가지고 있다. 그렇지만, 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이용할 경우, 탈모를 유도시키는 SRD5A2를 근본적으로 억제할 수 있으며, 남성형 탈모의 치료를 매우 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 {Nanoliposome-microbubble assemblies encapsulating complex of Cas9 protein, guide RNA for repressing gene expression or SRD5A2 gene and cationic polymer, and composition comprising the same for improving or treating hair loss}
본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로는 본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀에 소수성 기체를 포함하는 마이크로버블이 화학적으로 안정적인 상태로 결합되어 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유한 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
미생물의 적응면역에서 비롯된 유전자 편집 기술은 박테리오 파지의 감염에 의해 박테리오 파지의 단편을 DNA로 기억하고 있다가 2차 감염이 되었을 때 유전자 가위 역할을 하는 누클레아제(nuclease)인 Cas9(CRISPR associated protein 9 : RNA-guided DNA endonuclease enzyme)으로 해당 DNA를 잘라 없애는 면역 시스템에서 시작되었다. 이는 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)가 특정 염기 서열을 인식 하게 되면 Cas9 단백질이 해당 부위를 잘라 고칠 수 있는 유전자 교정 기술로 발전하게 되었다(Ran FA et al., 2013, Woo JW et al., 2015).
이는 불치병으로 분리되었던 유전자 이상으로 유도된 질환에서 질병의 근본원인을 치료할 수 있는 방법으로 각광받고 있다. 하지만 유전자 편집 시스템의 효율적인 체내 전달과 목표 유전자가 아닌 다른 유전자를 자르는 off targeting 등의 해결해야 하는 문제점들을 가지고 있다. 특히 초기 방식인 Cas9 플라스미드를 사용한 유전자 편집 시스템은 체내 전달시의 항생제 저항성, 여러 면역 반응 등의 안전성에 대한 검증이 필요하였다. 최근에는 단백질로 이뤄진 유전자 가위(Cas9)와 가이드 RNA를 실험관내에서 만들어 전달하는 시스템이 그 대안으로 적용되고 있으나 이 또한 세포내 효율적인 전달과 단백질과 RNA의 안정성에 대한 문제가 제기되고 있다(Ramakrishna S et al., 2014).
탈모는 일반적으로 두피의 굵고 검은 머리털이 빠지는 것을 의미한다. 탈모의 원인은 다양하지만 유전적인 원인과 남성 호르몬인 안드로겐(androgen)이 중요한 인자로 생각되고 있다. 그 중에서 60-70% 정도로 큰 비율을 차지하고 있는 남성형 탈모증(androgenic alopecia)은 테스토스테론(testosterone)이 5-알파 환원 효소(5-alpha reductase, SRD5A)에 의해서 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)로 전환되고, 과다하게 생성된 디하이드로테스토스테론이 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC)의 남성호르몬 수용체(androgenic receptor, AR)에 결합하여 세포 사멸(apoptosis)을 유발시켜, 모발의 소형화로 인해 탈모가 진행되는 것이다. 5-알파 환원 효소 중 모낭의 모유두와 외측모근초에 주로 분포하는 제 2형 5-알파 환원 효소(5-alpha reductase type 2, SRD5A2) 자체가 많이 발현되어 있는 남성이나 제 2형 5-알파 환원 효소의 활성도가 높은 사람이 디하이드로테스토스테론의 양이 일반 남성보다 상대적으로 많기 때문에 탈모의 발생 가능성이 커지는 것이다. 따라서, 남성형 탈모증의 치료 핵심은 제 2형 5-알파 환원 효소의 양이나 활성도를 낮춰 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 막는데 있다.
현재 탈모 치료제로 프로페시아(Propecia), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 약물이 개발되어 있다. 프로페시아는 제2형 5-알파 환원 효소를 직접적으로 억제하고, 두타스테리드는 제1형, 제2형 5-알파 환원 효소를 억제하여 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 억제하여 탈모의 진행을 완화시킨다. 하지만, 복용 환자에서 성욕 감퇴, 발기 부전 등과 같은 부작용이 발생하며, 복용 중단 시 탈모가 다시 진행되는 단점을 가진다. 특히, 미국 FDA에서는 불임이나 정자의 수가 적은 남성의 경우 약물 복용을 중단할 것을 권고하고, 가임기 여성의 경우 태아의 남성 성기 형성 장애를 발생시킬 수 있으므로 복용을 금지하고 있다(Myscore V et al., 2012).
SRD5A2 유전자는 탈모와 연관된 유전자 중 하나이며, 특히 세포 사멸을 유도하는 디하이드로테스토스테론과 연관되어 있기 때문에 본 유전자를 개선시키는 것이 중요하게 여겨지고 있다.
한편 세포 내 약물 전달 시스템에서 요구되는 중요 두 가지 성질은 효율성과 세포 독성(안전성)으로서, 콜레스테롤이나 지질 등으로 구성된 나노 리포좀 전달체 기술이 폭넓게 사용되고 있다(Zuris JA et al., 2015). 하지만 이러한 나노 리포좀 기술만으로는 피부 장벽의 역할을 하는 각질층 밑에 존재하는 진피 내로의 약물 전달이 용이하지는 않다(Nemes Z et al., 1999).
마이크로버블은 FDA에 승인된 진단 초음파 조영제로서 소수성 기체로 채워진 마이크로 크기의 기포 형태를 가지고 있다. 초음파에 노출된 마이크로버블은 공동현상(cavitation)이 일어나 주변 세포의 세포막이 일시적으로 기공을 형성하게 되고, 이 기공을 통해 세포 내로 물질이 투과되는 초음파 천공법(sonoporation)으로 나노 리포좀이 세포 내로 전달됨으로써 다른 세포 전달법보다 더 효과적으로 전달할 수 있다.
이에 본 발명자들은 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 나노 리포좀을 진피층까지 효율적으로 전달하기 위해, 상기 나노 리포좀에 이러한 마이크로버블 기술을 적용하였으며, 바람직하게는, Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체를 나노 리포좀에 봉입하고, 이를 마이크로버블과 결합시킨 조성물을 제조하였다. 따라서 이와 같은 기술을 통해 진피 내로 약물 전달 효율이 좋은 전달체를 제조하고, 이를 탈모 개선 또는 치료용 조성물로 이용함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
대한민국 등록특허 제10-1710026호 (발명의 명칭 : Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물, 출원인 : 주식회사 무진메디, 등록일자 : 2017년02월20일) 대한민국 등록특허 제10-1683463호 (발명의 명칭 : 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체 및 이를 포함하는 조영제, 출원인 : 서울대학교산학협력단, 등록일자 : 2016년12월01일) 대한민국 공개특허 제10-2016-0089526호 (발명의 명칭 : 입자 전달 성분을 이용한 표적 장애 및 질병에 대한 ＣＲＩＳＰＲ-ＣＡＳ 시스템 및 조성물의 전달, 이용 및 치료 적용, 출원인 : 서울대학교산학협력단, 공개일자 : 2016년07월27일)
Ran RA et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Nat Protoc, 2013, 8(11), 2281-2308. Woo JW et al., DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol, 2015, 33(11), 1162-1164. Ramakrishna S et al., Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA, Genome Res, 2014, 24(6), 1020-1027. Myscore V et al., Finasteride and sexual side effects, Indian Dermatol Online J, 2012, 3(1), 62-65. Zuris JA et al., Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol, 2015, 33(1), 73-80.
본 발명의 목적은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
보다 구체적으로는 본 발명의 목적은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀에 소수성 기체를 포함하는 마이크로버블이 화학적으로 안정적인 결합되어 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체와 이를 함유하여 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 효능이 있는 탈모 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체에 관한 것이다.
상기 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA는 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 메탈 킬레이팅 지질을 포함할 수 있다.
상기 나노 리포좀에는 모유두 진피 세포에서 발현하는 endoglin, CD34, keratin 18 및 IL-6(interleukin 6)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 단백질을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합될 수 있다.
상기 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 포함할 수 있다.
상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 800~1500nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 탈모의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 모유두 진피 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 제조방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 나노 리포좀과 마이크로버블을 각각 제조한 후 이를 혼합하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 제조할 수 있다.
상기 나노 리포좀은 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
바람직하게는, Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체를 제조하고,
레시틴, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 메탈 킬레이팅 지질을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계;
상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전물 상태의 나노 리포좀을 회수하는 제4단계; 및,
상기 제4단계에서 얻은 침전물 상태의 나노 리포좀에 가교제를 통해 항체를 결합하는 제5단계; 를 포함하여 상기 나노 리포좀을 제조할 수 있다.
또한 상기 마이크로버블은 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
양쪽성 인지질, 콜레스테롤, 음이온성 지질, 아민기를 갖는 지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 클로로포름상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제A단계;
상기 제A단계에 글루코오스 용액을 넣어 초음파 처리하는 제B단계;
상기 제B단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제C단계; 및,
상기 제C단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물에 소수성 기체를 주입하여 마이크로 버블을 제조하는 제D단계;
를 포함하여 상기 마이크로버블을 제조할 수 있다.
이렇게 제조된 마이크로버블에 나노 리포좀을 혼합하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 자세하게 설명한다.
본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체에 관한 것이다.
상기 Cas9 단백질은 pET28a/Cas9-Cys 플라스미드(pET28a(+) 벡터에 Cas9-Cys가 삽입된 것)가 형질전환된 세포 또는 균주에서 획득할 수 있다. 바람직하게는 pET28a/Cas9-Cys 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 Cas9 단백질을 과발현하여 얻을 수 있다.
본 발명에서 적용할 수 있는 가이드 RNA는 하기의 서열번호 1 내지 5의 염기서열에서 선택되는 가이드 RNA이며, 이러한 가이드 RNA가 포함된 나노 리포좀 전달체 조성물은 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하여 탈모를 개선 또는 치료할 수 있는 기능을 한다.
상기 서열번호 1의 가이드 RNA는 하기의 서열번호 6의 사람(Homo sapiens) SRD5A2 의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이며, 하기의 서열번호 11의 SRD5A2 의 일부 DNA 염기서열을 타겟으로 하며(서열번호 6과 서열번호 11는 상보적인 염기서열을 가짐), 서열번호 2~5 대비 서열번호 7~10, 서열번호 12~15도 동일하게 대응된다.
가이드 RNA 염기서열 가이드 RNA의 전사(제조)를 위한 DNA 염기서열 가이드 RNA의 타켓 DNA 염기서열
서열번호 1 : GUGUACUCACUGCUCAAUCG 서열번호 6 : GTGTACTCACTGCTCAATCG 서열번호 11 : CGATTGAGCAGTGAGTACAC
서열번호 2 : AGGGGCCGAACGCUUGUAAU 서열번호 7 : AGGGGCCGAACGCTTGTAAT 서열번호 12 : ATTACAAGCGTTCGGCCCCT
서열번호 3 : ACUAUAUAUUGCGCCAGCUC 서열번호 8 : ACTATATATTGCGCCAGCTC 서열번호 13 : GAGCTGGCGCAATATATAGT
서열번호 4 : CACAGACAUACGGUUUAGCU 서열번호 9 : CACAGACATACGGTTTAGCT 서열번호 14 : AGCTAAACCGTATGTCTGTG
서열번호 5 : UCCAUUCAAUGAUCUCACCG 서열번호 10 : TCCATTCAATGATCTCACCG 서열번호 15 : CGGTGAGATCATTGAATGGA
한편, 본 발명에서는 연구개발 중에는 임상적용이 힘든 사람을 대신할 동물실험용 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 제공하며, 이 동물실험용 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 하기의 서열번호 16 내지 20에서 선택되는 가이드 RNA를 포함한다. 상기 동물로는 바람직하게는 마우스(Mus musculus)를 사용한다. 각 서열의 대응관계는 표 1과 동일한 방법으로 표 2에 나타내었다.
가이드 RNA 염기서열 가이드 RNA의 전사(제조)를 위한 DNA 염기서열 가이드 RNA의 타켓 DNA 염기서열
서열번호 16 : ACAGACAUGCGGUUUAGCGU 서열번호 21 : ACAGACATGCGGTTTAGCGT 서열번호 26 : ACGCTAAACCGCATGTCTGT
서열번호 17 : CGCGCAAUAAACCAGGUAAU 서열번호 22 : CGCGCAATAAACCAGGTAAT 서열번호 27 : ATTACCTGGTTTATTGCGCG
서열번호 18 : UCCAUUCAAUAAUCUCGCCC 서열번호 23 : TCCATTCAATAATCTCGCCC 서열번호 28 : GGGCGAGATTATTGAATGGA
서열번호 19 : UCCUGGGCGAGAUUAUUGAA 서열번호 24 : TCCTGGGCGAGATTATTGAA 서열번호 29 : TTCAATAATCTCGCCCAGGA
서열번호 20 : AGCCCGGAGAGGUCAUCUAC 서열번호 25 : AGCCCGGAGAGGTCATCTAC 서열번호 30 : GTAGATGACCTCTCCGGGCT
상기 서열번호 1 내지 5, 또는, 서열번호 16 내지 20에서 선택되는 가이드 RNA 염기서열 이후에는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하기 위해 스캐폴드 염기서열(scaffold sequence)이 포함될 수 있다. 이 때 스캐폴드 염기서열의 종류는 크게 제한되지 않으며, 가이드 RNA의 제조에 이용되는 통상적인 염기서열이라면 어떤 것이든지 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 나노 리포좀에 적용되는 가이드 RNA는 하기의 스캐폴드 염기서열과 결합된 가이드 RNA가 적용되어 나노 리포좀 제조에 이용될 수 있다.
적용대상 가이드 RNA 스캐폴드 염기서열과 결합된 가이드 RNA
서열번호 1 : GUGUACUCACUGCUCAAUCG 서열번호 31 :
GUGUACUCACUGCUCAAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 2 : AGGGGCCGAACGCUUGUAAU 서열번호 32 :
AGGGGCCGAACGCUUGUAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 3 : ACUAUAUAUUGCGCCAGCUC 서열번호 33 :
ACUAUAUAUUGCGCCAGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 4 : CACAGACAUACGGUUUAGCU 서열번호 34 :
CACAGACAUACGGUUUAGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 5 : UCCAUUCAAUGAUCUCACCG 서열번호 35 :
UCCAUUCAAUGAUCUCACCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 16 : ACAGACAUGCGGUUUAGCGU 서열번호 36 :
ACAGACAUGCGGUUUAGCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 17 : CGCGCAAUAAACCAGGUAAU 서열번호 37 :
CGCGCAAUAAACCAGGUAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 18 : UCCAUUCAAUAAUCUCGCCC 서열번호 38 :
UCCAUUCAAUAAUCUCGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 19 : UCCUGGGCGAGAUUAUUGAA 서열번호 39 :
UCCUGGGCGAGAUUAUUGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 20 : AGCCCGGAGAGGUCAUCUAC 서열번호 40 :
AGCCCGGAGAGGUCAUCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
상기 서열번호 1 내지 5의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 서열번호 11 내지 15의 DNA 염기서열은 SRD5A2(Homo sapiens Chromosome 17, Genbank No. NC_000002.12)에 존재하는 염기서열이며, 서열번호 1 내지 5의 가이드 RNA를 통해 상기 DNA가 잘려지게 된다.
상기 서열번호 16 내지 20의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 서열번호 26 내지 30의 DNA 염기서열은 SRD5A2(Mus musculus, Chromosome 17, Genbank No. NC_000083.6)에 존재하는 염기서열이며, 서열번호 16 내지 20의 가이드 RNA를 통해 상기 DNA가 잘려지게 된다.
상기 서열번호 31 내지 40의 가이드 RNA는 T7 RNA 폴리머라아제(T7 polymerase)를 사용한 시험관 내 전사 반응 과정(in vitro transcription)을 통하여 합성할 수 있다.
상기 양이온성 폴리머로서 바람직하게는 폴리-L-리신, 폴리아미도아민, 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타아크릴레이트], 키토산, 폴리-L-오르니틴, 시클로덱스트린, 히스톤, 콜라겐, 덱스트란 및 폴리에틸렌이민으로 선택되는 것 1종 이상이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리에틸렌이민이 사용될 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴(lecithin, α-phosphatidylcholin), 양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 메탈 킬레이팅 지질을 포함할 수 있으며, 이를 통해, 상기 레시틴, 양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 메탈 킬레이팅 지질이 나노 리포좀을 형성하는 막을 이룰 수 있다.
레시틴은 동/식물계에 널리 분포되어 있어 생체 적합성이 우수하며 그 안정성에 있어서도 이미 검증되어 식품과 제약의 전달체 기술에 널리 활용되고 있다. 또한 나노 리포좀의 크기 조절과 변형을 용이하게 하는 재료로 사용될 수 있다.
상기 양이온성 인지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)을 사용하는 것이 좋다.
메탈 킬레이팅 지질로는 바람직하게는 DOGS-NTA-Ni 지질, DMPE-DTPA-Gd 지질, DMPE-DTPA-Cu 지질로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 DOGS-NTA-Ni 지질은 하기의 화학식 1의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 1]
Figure 112017102492583-pat00001
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)이라 한다.
*1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl](nikel salt)
DMPE-DTPA-Gd 지질은 하기의 화학식 2의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 2]
Figure 112017102492583-pat00002
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(가돌리늄염)이라 한다.
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(gadolinium salt)
DMPE-DTPA-Cu 지질은 하기의 화학식 3의 화학구조를 갖는 지질로서,
[화학식 3]
Figure 112017102492583-pat00003
1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(구리염)이라 한다.
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(copper salt)
상기 DOGS-NTA-Ni 지질은 단백질 정제 방법에서 사용되는 His-Tag(6X histidin)과 Ni2+ 친연성(affinity)을 활용하여 Cas9 단백질(His-Tag 포함된 것)이 효과적으로 나노 리포좀 내부로 봉입(encapsulation)되게 하는 역할을 할 수 있다. 더 자세하게는 상기 DOGS-NTA-Ni은 18개의 탄소에 이중결합이 1개 있는 구조로 레시틴과 함께 지질(lipid)를 형성할 수 있고, 끝에 Ni2+가 결합되어 있어, Cas9 단백질에 붙어있는 His-tag 2개와 Ni2+ 1개가 결합하여 Cas9 단백질이 좀 더 효율적으로 나노 리포좀 안으로 봉입되게 한다. DMPE-DTPA-Gd 지질과 DMPE-DTPA-Cu 지질 또한 이와 동일한 역할을 하며 Cas9 단백질이 포함된 복합체의 나노 리포좀 내 봉입을 효과적으로 유도한다.
본 발명의 나노 리포좀 내에는 단일 종류의 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질이 포함될 수 있으며, 상기 각각의 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질이 혼재되어 존재할 수도 있다(예 : '서열번호 1의 가이드 RNA-Cas9 단백질', '서열번호 2의 가이드 RNA-Cas9 단백질' 등).
상기 나노 리포좀에는 모유두 진피 세포에서 발현하는 endoglin, CD34, keratin 18 및 IL-6 로 이루어진 군 중에서 선택되는 단백질을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합될 수 있다.
상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 다클론성 항체는 endoglin, CD34, keratin 18 및 IL-6 로 이루어진 군 중에서 선택되는 항원 단백질을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단클론성 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler G. and Milstein C.), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson et al.; Marks et al.) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 그리고, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 상기 항원 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다.
상기 파지 항체 라이브러리 방법은, endoglin, CD34, keratin 18 및 IL-6 로 이루어진 군 중에서 선택되는 항원 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 상기 항원 단백질과 결합하는 단클론성 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.
본 발명에서 상기 항체는 1,4-비스-말레이미도부탄, 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜, 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드, 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]] 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트] 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 및, 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트] 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 가교제가 링커로 이용되어 결합될 수 있다.
상기 링커는 나노 리포좀의 양이온성 인지질과 항체를 연결하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 나노 리포좀은 중성의 물, 세포 배양액, 혈액 등에서 수 시간 이상 안정하게 분산될 수 있다.
본 발명의 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 포함할 수 있으며, 이들의 혼합물로 이루어진 지질 필름 조성물에 투입된 소수성 기체를 통해 버블을 형성하는 막을 이룸으로써 마이크로버블이 제조된다.
상기 양쪽성 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1-미리스토일-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, MPPC) 및 1-미리스토일-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, MSPC)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)을 사용하는 것이 좋다.
상기 음이온성 인지질은 디세틸 포스페이트(dicetyl phosphate, DCP), 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate, DEPA), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate, DLPA), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate, DMPA) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, DOPA)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 디세틸 포스페이트(DCP)를 사용하는 것이 좋다.
상기 양이온성 인지질로는 나노 리포좀 제조시 사용하는 것을 동일하게 사용할 수 있으며, 보다 자세하게는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)을 사용하는 것이 좋다.
상기 다이설파이드기를 갖는 지질로는 DSPE-PEG-sPDP이라고도 하는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용하는 것이 좋다.
* DSPE-PEG-sPDP : 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-
N-poly(ethyleneglycol)-2000-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate
DSPE-PEG-sPDP 지질은 하기의 화학식 4의 화학구조를 갖는 지질이다.
[화학식 4]
Figure 112017102492583-pat00004
마이크로버블의 제조를 위한 양쪽성 인지질:음이온성 인지질:콜레스테롤:양이온성 인지질:다이설파이드기를 갖는 지질의 혼합비율은 1~3mM:0.1~0.3mM:0.5~2mM:0.1~0.3mM:0.1~0.3mM일 수 있다. 이 때, 양쪽성 인지질:음이온성 인지질:콜레스테롤:양이온성 인지질:다이설파이드기를 갖는 지질로서, DPPC:DCP:cholesterol:DPPE:sPDP이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DPPC:DCP:cholesterol:DPPE:sPDP이 2.0mM:0.18mM:0.9mM:0.17mM:0.17mM로 혼합될 수 있다.
마이크로버블 내의 상기 DSPE-PEG-sPDP 지질은 나노 리포좀과 결합할 때 가교제가 되어 나노 리포좀-마이크로버블 결합체로 결합될 수 있다.
상기 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질의 혼합물의 버블링으로 유도된 것일 수 있다. 또한 상기 마이크로버블의 내부는 SF6, CO2, CF4 및 C3F8 에서 선택되는 소수성 기체가 내포된 것일 수 있다. 상기 소수성 기체는 바람직하게는 SF6인 것이 더 좋다.
상기 나노 리포좀은 100~200nm의 입자크기를 가질 수 있다. 나노 리포좀의 크기가 10 nm 미만일 경우, Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 상기 나노 리포좀에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 200 nm를 초과할 경우에도 상기 나노 리포좀이 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 상기 마이크로버블은 800~1500nm의 입자크기를 가질 수 있다. 이에 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 대략 800~1500nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물을 함유하는 탈모의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물은 SRD5A2 유전자 치료를 하여 탈모의 치료에 효과적이다.
본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물의 제조방법에 있어서, 나노 리포좀을 제조하고 마이크로버블을 제조하여 이를 혼합함으로써 상기 결합체를 제조할 수 있다.
나노 리포좀 제조에 있어서, 제1단계의 복합체 제조시, Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머는 1:1~3:30~70의 몰 비로 혼합될 수 있다. 이 때의 혼합비를 벗어나게 되면 복합체의 제조가 잘 되지 않을 수 있다. 상기 제1단계의 레시틴, 메탈 킬레이팅 지질, 콜레스테롤 및 양이온성 인지질은 2:0.1~5:0.01~0.5:0.01~0.5 몰 비로 혼합될 수 있다. 마찬가지로 이 때의 혼합비를 벗어나게 되면 나노 리포좀을 구성하는 지질의 제조가 잘 되지 않을 수 있다. 이 때, 상기 제3단계에서 동결하고 융해하는 과정은 1~12회 반복할 수 있다. 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 나노 리포좀 분산액이 형성될 수 있고, 나노 리포좀의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 12회를 초과할 경우에는 나노 리포좀의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다. 상기 제5단계에서 나노 리포좀에 가교제를 1~5시간 동안 혼합한 다음 항체를 첨가하여 1~5시간 동안 혼합하는 것을 특징으로 한다. 상기 제5단계에서 나노 리포좀, 가교제 및 항체는 10~30:1~5:1의 중량비로 결합될 수 있다.
상기 제5단계를 통해 제조된 나노 리포좀에는 마이크로버블과의 결합을 위해 양이온성 인지질에 티올기(thiol group)를 도입할 수 있다. 바람직하게는 2-Iminothiolane hydrochloride를 첨가할 수 있고, 티올기가 도입되면 나노 리포좀만 회수하여 이를 글루코오스 수용액, 특히 1~20%(w/v)의 농도를 갖는 글루코오스 수용액에 분산시켜 이후의 마이크로버블과의 혼합에 이용할 수 있다.
나노 리포좀과 마이크로버블의 결합을 위해, 본 발명에서 마이크로버블의 제조 시 제B단계에서 마이크로버블은 글루코오스 용액, 글리세롤 및 플로필렌 글리콜 중 1종 이상의 용액을 사용하여 안정화 한 후 나노 리포좀과 혼합할 수 있다. 바람직하게는 글루코오스 용액을 사용하는 것이 좋다. 이 때, 글루코오스 용액은 1~20%(w/v)가 될 수 있다. 글루코오스의 농도가 20%(w/v) 초과될 경우에는 점성이 생겨 마이크로버블의 합성이 되지 않을 수 있다.
본 발명의 나노 리포좀 제조시, 메탈 킬레이팅 지질은 음전하(-)를 띄기 때문에, Cas9 단백질과 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA의 혼성체의 음전하(-)에 반응하여 나노 리포좀의 캡슐화가 잘 되지 않을 수 있다. 따라서 이를 극복하기 위하여 양전하(+)를 갖는 양이온성 고분자를 결합시킨 복합체를 제조함으로써 나노 리포좀의 캡슐화를 강화할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 약학 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 현재 탈모 치료체로 사용되고 있는 약제의 경우 성욕 감퇴나 발기 부전 등과 같은 심각한 부작용이 초래되며, 약물 치료를 중단 할 경우 다시 탈모가 진행되는 단점을 가지고 있다. 그렇지만, 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이용할 경우, 탈모를 유도시키는 SRD5A2를 근본적으로 억제할 수 있으며, 남성형 탈모의 치료를 매우 효과적으로 수행할 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-1710026호에 당뇨 발현 유전자를 타겟으로 하는 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1683463호에는 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체가 개시되어 있기는 하지만, 본 발명에서처럼 탈모의 원인이 되는 유전자 또는 이를 발현하는 모유두 진피 세포로의 전달 효율을 높이기 위해 항체 결합 나노 리포좀과 마이크로버블을 결합시킨 결합체 기술은 확인된 바 없다.
도 1은 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC)에 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 전달하여 초음파를 가했을 때, 세포막에 천공이 생기고 마이크로버블이 붕괴되면서 나노 리포좀이 세포 안으로 들어가는 것을 나타내는 모식도이다.
도 2는 in vitro transcriptied sgRNAs와 정제한 Cas9 단백질을 실험실 내에서 결합시켜 혼성체로 제조한 후에(Cas9/sgRNA 혼성체, Cas9-RNP) 이 혼성체를 이용하여 SRD5A2 유전자가 실제 잘리는지 확인한 결과를 나타낸다.
도 3는 비교예 1의 나노 리포좀, 비교예 2의 마이크로버블 및 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 크기 및 분산정도를 dynamic light scattering(DLS)를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 나노 리포좀과 마이크로버블의 결합을 확인하기 위해, 나노 리포좀에는 RITC를, 마이크로버블에는 FITC를 도입하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 제조한 후 이를 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy)으로 찍은 사진을 나타낸다.
도 5는 비교예 1의 나노 리포좀, 비교예 2의 마이크로버블 및 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 내에서 소수성 기체가 유지되는지 확인하기 위해 에코발생도(echogenicity)를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 단일 가닥 상태의 가이드 RNA(sgRNA1~5, 순서대로 서열번호 1~5)의 효율을 plasmid system에 도입한 후 모유두 세포에서의 SRD5A2의 mRNA 발현을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 모유두 진피 세포로 유입되는지 확인하기 위해, 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 처리한 후 Cas9에 대한 항체로 면역염색한 후 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy)으로 찍은 사진을 나타낸다.
도 8A는 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블을 모유두 진피 세포에 처리하여 SRD5A2 유전자에서 PAM 구조 뒤에 1개의 염기서열이 잘려지는 것을 도식화하여 나타낸 것이며, 도 8B는 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블을 세포에 처리하여 초음파를 가한 후, SRD5A2의 mRNA 발현 억제효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 처리하여 SRD5A2 단백질 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 전처리 후 테스토스테론을 처리하였을 때의 모유두 진피 세포의 생존상태를 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy)으로 찍은 사진을 나타낸다.
도 11은 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 전처리 후 테스토스테론을 처리하였을 때 세포 생존과 증식 상태를 WST-1 assay 방법을 통해 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 전처리 후 모유두 진피 세포에 테스토스테론 처리시 나타나는 디하이드로테스토스테론으로 전환정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 전처리 후 테스토스테론 처리로 나타나는 apoptosis를 확인하기 위해 caspase-3 activity를 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 마우스 진피 조직에서 추출한 DNA에 Cas9 단백질과 함께 단일 가닥 상태의 마우스 가이드 RNA(sgRNA m1~5 : 순서대로 서열번호 36~40)을 혼합하여 Cas9 단백질과 가이드 RNA 혼성체의 활성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 마우스에서 탈모를 유도시킨 후, 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블을 마우스에 1회(실험군 1), 3회(실험군 2) 및 5회(실험군 3) 반복 처리 후, 발모 효과가 나타나는 지를 사진으로 확인한 결과이다.
도 16은 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블을 마우스에 처리한 후 마우스 진피 조직에서 나타나는 SRD5A2의 mRNA 발현 정도를 확인한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 가이드 RNA 제조 및 Cas9 단백질 정제>
실시예 1-1. SRD5A2 를 목표유전자로 하는 가이드 RNA 제조
T7 RNA polymerase(NEB)를 활용한 in vitro transcription 방법을 이용하여 KRAS를 목표유전자로 하는 가이드 RNA를 제조하였다. 이를 위해 표 4의 T7 promoter 염기서열과 SRD5A2 유전자의 20 b.p. 염기서열인 서열번호 6 : GTGTACTCACTGCTCAATCG, 서열번호 7 : AGGGGCCGAACGCTTGTAAT, 서열번호 8 : ACTATATATTGCGCCAGCTC, 서열번호 9 : CACAGACATACGGTTTAGCT, 서열번호 10 : TCCATTCAATGATCTCACCG, 서열번호 21 : ACAGACATGCGGTTTAGCGT, 서열번호 22 : CGCGCAATAAACCAGGTAAT, 서열번호 23 : TCCATTCAATAATCTCGCCC, 서열번호 24 : TCCTGGGCGAGATTATTGAA, 서열번호 25 : AGCCCGGAGAGGTCATCTAC 을 포함하는 '69 mer forward primer' , 가이드 RNA에 연결될 스캐폴드 염기서열을 포함하는 '20 mer reverse primer' , plasmid Cas guide vector(origene)를 사용하여 PCR법으로 140 b.p.의 DNA　주형(template)을 제조하였다. 이 DNA 주형, rNTP mixture, T7 RNA polymerase, RNAase inhibitor를 포함하여 37℃에서 2시간 전사 반응을 통하여 가이드 RNA를 제작하였고 RNA 정제 과정을 거쳐 RNA 순도를 높였다.
* T7 promoter 염기서열은 아래 표 4의 밑줄 친 부분에 해당됨.
* 표 1의 굵은 글씨의 염기 서열은 SRD5A2 유전자를 인식하는 부위이며, 스캐폴드 염기서열의 주형(plasmid Cas guide vector)을 인식하여 가이드 RNA 합성이 되며, 최종 제조된 가이드 RNA의 서열과 이 염기서열이 같은(T 대신 U로 치환된) 염기서열 구조를 가짐.
* F 프라이머 뒤의 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA는 스캐폴드 염기 서열 일부분임.
* plasmid Cas guide vector에 스캐폴드 염기서열의 주형이 포함되어 있음.
* 이 실험에 사용된 plasmid Cas guide vector의 구조는 도 17과 같음. 출처 : http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/Detail.aspx?sku=GE100001



Human SRD5A2
forward primer		 sgRNA 1 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG GTGTACTCACTGCTCAATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA 2 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG AGGGGCCGAACGCTTGTAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA 3 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG ACTATATATTGCGCCAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA 4 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG CACAGACATACGGTTTAGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA 5 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG TCCATTCAATGATCTCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA



Mouse SRD5A2
forward primer		 sgRNA m1 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG ACAGACATGCGGTTTAGCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA m2 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG CGCGCAATAAACCAGGTAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA m3 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG CGCGCAATAAACCAGGTAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA m4 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG TCCTGGGCGAGATTATTGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
sgRNA m5 GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG AGCCCGGAGAGGTCATCTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
reverse primer AAAAGCACCGACTCGGTGCCA
상기 실험을 통해 하기 표 5의 염기서열을 갖는 가이드 RNA를 제조하였다.
서열번호 31
(SRD5A2 타겟) 		GUGUACUCACUGCUCAAUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 32
(SRD5A2 타겟)		 AGGGGCCGAACGCUUGUAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 33
(SRD5A2 타겟)		 ACUAUAUAUUGCGCCAGCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 34
(SRD5A2 타겟)		 CACAGACAUACGGUUUAGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 35
(SRD5A2 타겟)		 UCCAUUCAAUGAUCUCACCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 36
(SRD5A2 타겟)		 ACAGACAUGCGGUUUAGCGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 37
(SRD5A2 타겟)		 CGCGCAAUAAACCAGGUAAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 38
(SRD5A2 타겟)		 UCCAUUCAAUAAUCUCGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 39
(SRD5A2 타겟)		 UCCUGGGCGAGAUUAUUGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 40
(SRD5A2 타겟)		 AGCCCGGAGAGGUCAUCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
최종 제조된 상기 가이드 RNA는 사람 SRD5A2 유전자의 서열번호 11 내지 15 의 염기서열을 타겟으로 인식하고, 마우스 SRD5A2 유전자의 서열번호 26 내지 30의 염기서열을 타겟으로 인식한다.
실시예 1-2. Cas9 단백질 정제
pET28a/Cas9-Cys plasmid(Addgene plasmid # 53261)를 대장균(BL21)에 형질전환하여 0.5 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)와 28℃ 조건에서 Cas9 단백질을 과발현하였고, Cas9 단백질이 과발현된 대장균을 lysis buffer(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail, 1 mg/mL lysozyme)와 함께 초음파 처리하였다. 초음파 처리하여 얻은 분쇄물을 원심분리하여 단백질이 포함된 액상을 얻었다. Ni-NTA agarose bead 추출법(elution buffer : 20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail)으로 상기 액상에 포함된 Cas9 단백질을 분리하였다. 이후 분리물을 storage buffer(50 mM Tris-HCl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 20% glycerol)에 혼합한 상태로 투석하여(cut off 10K) 이미다졸을 제거한 후 단백질 농도를 정량하였다(BCA법 이용).
** pET28a/Cas9-Cys plasmid(Addgene plasmid # 53261)의 구조 : 도 18 참조, 출처 : Addgene (http://www.addgene.org/)
<실시예 2. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 제작>
실시예 2-1. 나노 리포좀 제작
실시예 1에서 제조한 Cas9 단백질, 가이드 RNA 및 폴리에틸렌이민을 1:2:50의 몰 비(mole ratio)로 혼합하여 복합체를 제조하였다. 이 때 가이드 RNA로는 스캐폴드 염기서열이 포함된 사람 서열번호 31, 32, 33, 34 또는 35(서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5 내포) 및 마우스 서열번호 36, 37, 38, 39 또는 40(서열번호 16, 17, 18, 19 또는 20 내포)을 사용하였다.
다음으로 레시틴(Lecithin, Sigma Aldrich), DOGS-NTA-Ni 지질(Avanti polar lipids), 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma Aldrich) 및 DPPE(Sigma Aldrich)를 2:1:0.1:0.05 몰 비로 클로로포름(chloroform) 상에서 섞은 후 회전 농축기를 활용하여 지질필름(lipid film)화 하였다.
여기에 Cas9 단백질/가이드 RNA/폴리에틸렌이민의 복합체를 넣어 초음파를 가하며 혼합하였다. 액체질소를 활용하여 동결하고 융해하는 과정(freeze thaw cycle)을 5차례 반복하고 이후 초음파(probe 방식) 처리하여 좀 더 작은 사이즈이면서도 균일한 상태의 나노 리포좀 조성물을 제작하였다.
이후 원심분리 방법으로 침전된 나노 리포좀 조성물(lipid의 총량 20.43mg, Cas9과 gRNA의 총량 0.1mg)을 회수하여 항체 결합을 위한 링커로 사용될 Sulfo-SMCC(ProteoChem) 2.5mg을 PBS 상에서 2시간 동안 25℃ 상온에서 혼합하였다.
다음으로는 나노 리포좀에 결합하기 위한 정제 항체를 준비하였는데, 상기 나노 리포좀에 결합할 항체는 모유두 진피 세포에서 과발현하는 것으로 알려진 endoglin, CD34, keratin 18 및 IL-6 등을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체를 선택하였다. 특히 이 중에서도 endoglin 항체(Anti-endoglin)를 선택하여 2-Mercaptoethylamine(Thermo)과 10mM EDTA 상에서 2시간 동안 37℃에서 혼합한 뒤, PD-10 desalting column(GE Healthcare)으로 정제하였다(endoglin 항체와 2-Mercaptoethylamine은 1mg:0.6mg으로 혼합). 이 때, 항체의 정제과정은 도 19의 그림으로 설명할 수 있다(Y 모양을 가지는 동일한 2개의 사슬로 이루어져 있는 항체에 2-Mercaptoethylamine을 첨가하여 half-antibody를 만들어 다시 정제한 뒤 이를 나노 리포좀에 결합시킴). *도 19 출처 : Wu S et al., Highly sensitive nanomechanical immunosensor using half antibody fragments, Anal Chem, 2014, 86(9), 4271-4277.
도 19와 같이 half anti-body를 만들어주면 -SH가 생성된다. 나노 리포좀을 구성하는 DPPE 지질에 -NH2가 존재하기 때문에 여기에 sulfo-SMCC(linker)가 반응하게 되고, 이렇게 만들어진 나노 리포좀의 sulfo-SMCC와 half-antibody의 -SH 부분이 결합하게 된다. 이렇게 half-antibody의 제조를 통해 나노리포좀의 모유두 진피 세포에 대한 인식능력을 배로 증가시킬 수 있다.
이렇게 정제된 항체(anti-endoglin) 1mg을 링커가 결합되어 있는 나노 리포좀 조성물과 4℃에서 12시간 동안 혼합하고, 이후 원심분리 방법으로 침전된 것만을 회수하여 모유두 진피 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 항체가 결합된 나노 리포좀을 얻었다.
정제된 항체를 링커가 결합되어 있는 나노 리포좀의 지질 구조체 중 DPPE(양이온성 인지질)에 티올기를 도입하여 마이크로 버블과 결합시키기 위해 2-Iminothiolane hydrochloride(pH 8.2) (분말 상태, 나노 리포좀 20.53mg/mL 당 0.5mg 첨가)를 첨가하여 25℃에서 2시간 동안 혼합하고, 이후 원심분리 방법으로 침전된 것만을 회수하여 5%(w/v) 글루코오스 수용액에 분산시켰다.
실시예 2-2. 마이크로버블 제작
DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glyerto-3-phosphocholine, Sigma Aldrich) 15.4mg, 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma Aldrich) 3.48mg, DCP(dicetyl phosphate, Sigma-Aldrich) 1mg, DPPE(1,2-dipalmitorysn-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, Sigma Aldrich) 1.2mg 및 DSPE-PEG-sPDP(1,2-distearoly-sn-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)], Avanti polar) 5mg를 클로로포름(chloroform) 1mL 상에서 혼합한 후 회전 농축기를 활용하여 마이크로버블 합성을 위한 지질 필름(lipid film)화 하였다.
그 다음 5%(w/v) 글루코오스 수용액 1㎖을 넣어 초음파를 가하여 혼합하였다. 액체질소를 활용하여 동결하고 융해하는 과정(freeze thaw cycle)을 3차례 반복하고 이후 초음파(probe 방식) 처리한 후, SF6 기체를 충진하여 분산 상태의 마이크로버블 조성물을 제조하였다.
실시예 2-3. 나노 리포좀-마이크로버블 제작
실시예 2-1에서 제조된 나노 리포좀(20.53mg/mL) 1mL과 실시예 2-2의 마이크로버블(26.08mg/mL) 0.5mL을 혼합(2:1 부피비)하여 나노 리포좀과 마이크로버블이 글루코오스 수용액에 분산된 상태가 되게하였다.
이 후 장비(Tianjin Iris)를 사용하여 15초 동안 강한 진동 효과[Mixing frequency : 4500 tr/mn (cpm ; 분 당 m3 이송량 단위)]를 주어 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성시켰고, 이후 5% 글루코오스 수용액에 분산된 상태로 냉장보관하였다.
이렇게 최종 제조된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이하 '실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체'라 한다.
<비교예 1. 항체 결합 나노 리포좀>
실시예 2-1에 기재된 방법으로 나노 리포좀을 제조하되 항체 결합까지만 하고 티올기 도입은 하지 않은 나노 리포좀(마이크로버블 미결합)을 비교예 1의 조성물로 사용하였다.
<비교예 2. 마이크로버블>
실시예 2-2의 방법으로 제조한 마이크로버블을 그대로 비교예 2의 조성물(나노 리포좀 미결합)로 사용하였다.
<비교예 3. 나노 리포좀>
실시예 2-1에 기재된 방법으로 나노 리포좀을 제조하되 항체 결합 전의 나노 리포좀을 비교예 3의 조성물로 사용하였다(항체 미결합 나노 리포좀).
<비교예 4. scramble 가이드 RNA 가 들어있는 항체 결합 나노 리포좀과 마이크로버블의 결합체>
본 발명의 나노 리포좀 제조방법을 이용하되 가이드 RNA로서 scramble 가이드 RNA 서열(서열번호 41 : GCACUACCAGAGCUAACUCA)이 포함된 나노 리포좀을 제조하였다. scramble 가이드 RNA 서열은 DNA 어느 부위와도 결합 하지 않는 서열로서 비교예로서 사용되기 위해 제조된 것이다. 이러한 scramble 가이드 RNA 가 포함된 나노 리포좀에 티올기를 도입(실시예 2-2 참조)하고 마이크로버블과 결합(실시예 2-3 참조)시켜 scramble 가이드 RNA가 들어있는 항체 결합 나노 리포좀과 마이크로버블의 결합체를 제조하였다.
한편, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체에서 항체가 없는 것은 타겟팅이 현저하게 떨어질 것이기에 본원발명에서 굳이 비교예로서 제조하지 않았다.
<실험예 1. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 제조과정에서의 가이드 RNA의 활성 및 기능 확인>
실험예 1-1. 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 활성 확인
이 실험에 사용한 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC)는 Human Follicle Dermal Papilla Cells (HFDPC)로서, Promocell에서 구입하였다. 이 세포를 Promocell의 Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium 과 Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium SupplementMix 제품을 섞어 제조한 배양 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 hr 이상 배양한 것을 실험에 사용하였다.
가이드 RNA 제조와 Cas9 단백질 정제가 잘 되었는지 확인하기 위해, 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC) 세포를 수집하여 DNA를 추출하고 Foward primer : TTGCCCTCCCCACTTTCTGC, Reverse primer : TCCCACCTTCCGGGTATTGC 를 이용하여 PCR법을 통해 template fragment(500bp)를 만들었다. 다음으로 fragment에 정제된 Cas9 단백질만, 정제된 Cas9 단백질과 sgRNA 3(서열번호 33, 도 2)을 혼합하여 넣어주었다.
도 2를 참고하면, 정제된 Cas9 단백질만 넣어준 실험군에서는 가이드 RNA가 존재하지 않기 때문에 Cas9 단백질이 fragment를 자르지 못하였고, 정제된 Cas9 단백질과 sgRNA 3(서열번호 33)을 혼합한 실험군에서는 Cas9 단백질이 fragment를 잘라주었음을 보여주는 결과가 확인된다.
실험예 1-2. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 크기 확인
본 발명에서 제조한 나노 리포좀, 마이크로버블 및 나노 리포좀-마이크로버블 결합체들의 크기와 표면전하를 Dynamic Light Scattering(DLS)로 측정하였다. 서열번호 33의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 그 결과를 표 6 및 도 3에 나타내었다.
조건 표면전하(mV) 나노 입자 평균 크기 (nm)
실시예 2 +2.13 955
비교예 1 +1.78 78
비교예 2 -0.89 1106
모유두 진피 세포 내로 가이드 RNA가 포함된 나노 리포좀을 전달하기 위해서는 (-) 전하를 띄는 표면전하값이 양전하인 것이 좋은데, 표 6 및 도 3을 참고하면 실시예 2의 나노 리포좀은 표면전하값이 양전하에 속한다. 또한, 비교예 1의 나노 리포좀과 비교예 2의 마이크로버블이 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체와 비교하여 크기와 표면전하가 크게 변하지 않은 것을 알 수가 있다.
한편, 실시예 2의 조성물이 나노 리포좀과 마이크로버블의 혼합상태가 아닌 온전한 결합상태를 유지하는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체임을 확인하기 위해 를 공초점 형광 현미경으로 이미지화하였다. 이를 위해 실시예 2-1의 단계에서 의 나노 리포좀 제조 시 RITC(red) 형광 dye를 도입하였고, 실시예 2-2의 마이크로버블 합성 시 FITC(green) 형광 dye를 도입하였다. 이렇게 하여 실시예 2-3에서 나노 리포좀-마이크로버블 결합체로 최종 제조된 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체에 대한 전자현미경 및 형광사진 결과를 도 4에 나타냈으며, 나노 리포좀이 마이크로버블에 잘 결합된 상태임을 확인할 수 있다.
실험예 1-3. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 에코발생도 확인
다음으로는 나노 리포좀과 마이크로버블을 결합한 후에도 마이크로버블 안의 기체가 유지됨을 확인하기 위해, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 에코발생도(Echogenicity)를 임상 초음파 장비(Philips)를 사용하여 확인하였다. 에코발생도란 초음파의 투과되는 정도에 따라 초음파검사의 이미지가 희거나 검게 보이는 현상을 말한다. 나노 리포좀 안에는 기체가 없는 상태이기 때문에 초음파를 가했을 경우 에코발생도가 나타나지 않지만, 마이크로버블은 안에 기체가 있기 때문에 에코발생도가 확인된다. 초음파는 공기 중에서는 거의 전달이 되지 않고 액체나 고체 등에서는 전달이 잘 되기에, 마이크로버블 안의 소수성 기체로 인해 초음파의 전파가 잘 되는 현상을 이용하는 실험이다. 이를 위해 대상물에 프로브를 대고 초음파를 발생시키면서 반사된 초음파를 수신하여 영상을 확인하였다.
에코발생도 측정을 위한 임상 초음파 장비의 mechanical index(MI)는 0.07이고, 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 담을 수 있는 2% 아가로즈 젤을 만들어 5~12 MHz 사각형 초음파 프로브로 측정하였다.
이에 대한 결과는 도 5에 나타내었는데, 비교예 2의 마이크로버블과 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체와 비교하였을 때, 에코발생도가 변함이 없다는 것을 확인할 수 있어 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 '나노 리포좀이 온전한 형태의 SF6 기체가 내포된 마이크로버블과 잘 결합된 상태'임을 알 수 있다.
<실험예 2. SRD5A2 발현 및 활성 측정>
실험예 2-1. 가이드 RNA 의 SRD5A2 발현 효율 비교
모유두 진피 세포 DPC에서의 sgRNA 1, 2, 3, 4 및 5(서열번호 1,2,3,4 및 5)의 효율 비교를 위해 pCas plasmid(실시예 1-1에 있는 pCas-Guide plasmid에 서열번호 6, 7, 8, 9 및 10)을 넣어주어 모유두 진피 세포에 처리해 주었다.
처리한 세포를 수집하여 Trizol(invitrogen)을 이용하여 총RNA를 추출하였고, SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
SRD5A2의 mRNA 발현 확인을 위한 Real-time PCR은 SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)와 AB step one plus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 활용하여 측정하였다. 이 때 검출에 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.
SRD5A2 sense : GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2 antisense : CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH sense : GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH antisense : AGGGATCTCGCTCCTGGAA
상기 결과는 도 6에 나타냈으며 DPC 세포에서 sgRNA 의 효율 비교를 한 결과 sgRNA 3(서열번호 3)이 가장 효율적으로 SRD5A2의 mRNA 발현이 줄었으므로, 이후의 실험은 모두 서열번호 3의 가이드 RNA가 포함된 것을 사용하였다.
실험예 2-2. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 모유두 진피 세포로의 유입 확인
실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 모유두 진피 세포로의 유입을 확인하기 위해, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 DPC 세포에 2시간 동안 Cas9:gRNA(24.7㎍:8.6㎍ - 총 배양액 내에 Cas9 24.7㎍ 및 gRNA 8.6㎍)의 농도로 처리 후 Cas9 에 대한 항체로 면역염색하여 도 7에 공초점 형광 현미경 사진을 나타내었다. 면역염색을 위해 Cas9 의 1차 항체(Rabbit)를 사용 후, 2차 항체 CFL-488 을 사용하여 세포 내 Cas9 단백질을 표지하고, 공초점 형광 현미경으로 이미지화하였다. 상기 결과는 서열번호 33의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 7에 나타내었다.
도 7에서 DAPI는 DNA 염색 사진, Cas9은 Cas9 단백질의 CFL-488 염색 사진, Merge는 이들을 모두 결합시킨 이미지 사진을 나타낸다. 도 6을 참고하면, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리로 인해 모유두 진피 세포의 핵 내로 Cas9 단백질이 잘 주입되어 있음을 알 수 있다.
한편, 서열번호 3 가이드 RNA가 인식하는 인간 게놈 DNA의 위치를 도 8A에 나타내었는데(초록색 밑줄), 이를 참고하면, 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 통해, 가이드 RNA가 염기서열 20개를 인식하게 되고, Cas9 단백질이 PAM(protospacer adjacent motif)(AGG 서열) 부위를 자르게 됨으로써, 잘려진 DNA가 스스로 회복(repair)되는 과정 중에 1개의 DNA 염기서열이 잘려나간 것이 확인되었다(실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블이 처리된 세포로부터 게놈 DNA를 직접 추출하고, 이를 (주)바이오니아에 Sequencing service를 요청하여 도 8A에서 제시된 잘려진 서열의 위치를 확인하였음).
실험예 2-3. SRD5A2 발현 측정 - mRNA 발현량 확인
모유두 진피 세포에 본 발명에서 제조한 각 나노 리포좀-마이크로버블을 2시간 동안 Cas9:gRNA(24.7㎍:8.6㎍)의 농도로 처리 후 수집된 세포에 Trizol(invitrogen)을 이용하여 총RNA를 추출하였고, SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
SRD5A2의 mRNA 발현 확인을 위한 Real-time PCR은 SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)와 AB step one plus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 활용하여 측정하였다. 이 때 검출에 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.
SRD5A2 sense : GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2 antisense : CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH sense : GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH antisense : AGGGATCTCGCTCCTGGAA
상기 결과는 도 8B에 나타냈으며 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리로 인해 모유두 진피 세포에서 SRD5A2 mRNA 발현이 현저하게 감소되는 결과를 확인할 수 있다.
실험예 2-4. SRD5A2 발현 측정 - 단백질 발현양 확인
mRNA 발현 확인 실험과 동일한 조건으로 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 처리하되, 매일 1회씩 1~5회 처리로 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 처리 횟수를 달리 하였다. 모유두 진피 세포(DPC) 처리군을 각각 수집하고, 상기 세포에 RIPA Buffer(Sigma)를 처리하여 단백질을 추출한 후, SRD5A2 ELISA kit(antibodie-online)로 SRD5A2 단백질의 발현을 확인하였다. 이 때 비교예 1~4의 조성물에 대해서도 같은 실험을 수행하였다.
그 결과 본 발명의 실시예 2의 조성물만이 처리 횟수가 증가할수록 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 무처리군(control)과 대비하여 SRD5A2 단백질 발현양이 감소하여 5일 이상 유지됨을 표 7 및 도 9를 통해 확인할 수가 있다.
조건 세포 처리 5일째 SRD5A2 단백질 발현 (fold)
무처리군 1.00
실시예 2의 5회 처리군 0.43
비교예 1의 5회 처리군 0.75
비교예 2의 5회 처리군 0.99
비교예 3의 5회 처리군 0.85
비교예 4의 5회 처리군 0.98
<실험예 3. 세포 생존율 및 증가율 확인>
실험예 3-1. Live/Dead 세포 확인
실시예 2에서 최종적으로 얻은 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 모유두 진피 세포에 2시간 동안 Cas9:gRNA(24.7㎍:8.6㎍ - 총 배양액 내에 Cas9 24.7㎍ 및 gRNA 8.6㎍)의 농도로 매일 1회씩 총 5일까지 반복 처리하였다(처리 기준 1일 1회씩, 실험예 2-4와 동일 조건). 이 후 탈모의 원인이 되는 모유두 진피 세포의 사멸 조건을 유도하기 위해 실험에 사용된 모유두 진피 세포에 배지를 바꾸어 Calcein AM(Calcein acetoxymethyl ester) 2 μM, EthD-1(Ethidium homodimer-1) 4 μM을 25℃에서 30분 동안 처리하였다.
세포 생존 및 사멸은 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit(Thermo)로 세포를 형광 염색하여 공초점 형광 현미경으로 이미지화하였다. 이는 살아있는 세포는 Calcein AM 이 세포 내의 에스터라아제(esterase)의 활성을 인지하여 녹색 형광을 띄며, EthD-1(Ethidium homodimer-1)은 사멸하는 세포의 손상된 세포막으로 침투하여 세포 내부로 들어가 핵산에 결합하여 적색 형광을 띄게 된다.
상기 결과는 도 10에 나타냈으며, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 처리 횟수에 의존적으로 살아있는 세포의 비율이 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예 3-2. 세포 생존율 확인
세포 생존율의 확인은 WST-1 어세이(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit)를 통해 진행하였다. 모듀우 진피 세포(DPC)를 96well plate에 1x104/well의 밀도로 24시간 배양하였다. 이 후 실시예 3, 비교예 3, 4, 5 및 6의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리 후, 테스토스테론이 농도별(200μM, 400μM)로 처리된 배지로 교체하고 다시 24시간 후 그대로 WST-1 시약을 첨가하였다. WST-1 시약을 배양액의 10% 넣고, 1시간 후에 460 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존 및 증식을 대조군(비처리군)과 비교하였다. 세포 생존 평가는 나노 리포좀 처리 후 5일 동안 24시간을 주기로 측정하였다.
이 때, 도 11A는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체만 처리한 세포 실험군에 대한 결과로 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 독성없이 세포가 잘 자람을 보여주며, 도 11B 및 11C는 본 발명 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 처리한 후, 테스토스테론을 200~300μM 처리한 세포 실험군에 대한 결과로서, 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리횟수 의존적으로 세포의 생존 및 증식이 현저하게 증가하는 것이 확인된다. 이러한 결과는 본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 세포에서 테스토스테론에 의한 세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 뜻한다.
<실험예 4. 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로 전환된 양 측정>
본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 세포에서 SRD5A2 유전자를 편집 후, 실제 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론(DHT)로 전환되는지를 확인하였다. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 세포 처리 조건은 실험예 3-2와 동일하게 하였고, 이 후 테스토스테론(0~400 μM)이 포함된 배지로 교체하고 24시간 동안 처리하였다.
상기 결과는 도 12에 나타냈으며, 대조군(비처리군)에서는 테스토스테론 처리 농도와 비례하게 디하이드로테스토스테론의 발현양이 증가하지만, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리군에서는 테스토스테론 처리 농도가 높더라도 디하이드로테스토스테론 단백질 발현이 상대적으로 증가하지 않아, 본 발명의 조성물이 탈모 진행을 억제하는 조성물임을 확인할 수 있다.
<실험예 5. Caspase-3 활성 측정>
Caspase-3 활성을 Caspase-3 assay kit(Cell Signaling)를 사용하여 확인하였다. 이전의 실험에서처럼 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 1~5일 동안 모유두 진피 세포에 처리 후, 테스토스테론(200μM, 400μM)이 포함된 배지로 교체하고 24시간 동안 처리하였다. 이 후, 각 세포로부터 단백질을 추출하고, 추출한 단백질에 1x assay buffer A와 substrate solution B를 200㎕ 넣어 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 excitation 380nm와 emission 440nm 에서 형광 값을 측정하여 Caspase-3 활성을 측정하였다.
상기 결과는 도 13에 나타냈으며, SRD5A2 유전자 편집 후, 테스토스테론이 처리시 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 처리 횟수 의존적으로 Caspase-3 활성이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있다.
<실험예 6. 마우스 모델에서의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 탈모 억제 효과 확인>
실험예 6-1. 마우스 진피 조직 DNA에서의 가이드 RNA의 활성 확인
마우스에서 모유두 진피 조직 내 세포에서의 sgRNA m1, m2, m3, m4 및 m5(서열번호 16, 17, 18, 19 및 20)의 효율 비교를 위해 마우스 진피 조직을 얻어 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 sgRNA m1 및 m2는 Foward primer : CTCTTTGGACTATTTTGTGGCTT, Reverse primer : AAGACTGGGAACATTTGGTTTGT, sgRNA m3 및 m4 는 Foward primer : GGCAGGAAGCCCCTCAGGGAGAT, Reverse primer : AATGTGACCGGCTGCTTCAAGTT, sgRNA 5는 Foward primer : AACCCAAAACCAAACACAAAACC, Reverse primer : GGGTCATAGACATGTGCACCATG를 이용하여 PCR 법을 통해 각각 template fragment(500bp)를 만들었다. 다음으로 정제된 Cas9 단백질, 또는, 정제된 Cas9 단백질과 sgRNA m1, m2, m3, m4 및 m5(서열번호 36, 37, 38, 39 및 40)을 혼합하여 넣어주었다.
도 14를 참고하면, 정제된 Cas9 단백질만 넣어준 실험군에서는 가이드 RNA가 존재하지 않기 때문에 Cas9 단백질이 fragment를 자르지 못하였고, 정제된 Cas9 단백질과 sgRNA m1, m2, m3, m4 및 m5(서열번호 36, 37, 38, 39 및 40)를 혼합한 실험군에서는 Cas9 단백질이 fragment를 잘라주었음을 보여주는 결과가 확인된다. 그 중에서도 sgRNA m1(서열번호 36)의 효율이 가장 좋은 것으로 확인되어, 이후의 마우스 실험은 모두 서열번호 36의 가이드 RNA가 포함된 것을 사용하였다.
실험예 6-2. 마우스에서 탈모 개선 및 치료제로서의 효율 확인
6주령 마우스(C57BL/6J)를 동물용 제모기(philips)와 제모크림(Veet)를 이용하여 마우스 등의 털을 제모한 후, 대조군 2, 실험군 1, 2 및 3에는 프로필렌글리콜과 에탄올의 혼합용액(3:7(v:v))에 녹인 테스토스테론(30㎍/㎖)을 매일 도포하여 사람의 탈모와 유사한 환경으로 만들어주었다. 대조군 1은 제모 후, 아무런 처리를 하지 않았다. 실험군 1, 2 및 3은 본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(200㎕, 나노 리포좀-마이크로버블 2:1 비율로 결합되어 분산된 것)를 마우스의 제모된 등 전체에 플라스틱 스패츌러로 200㎕씩 도포하고 3분 후, 의료용 초음파 기기를 이용하여 초음파에 노출시켰다. 실험군 1은 실시예 2를 1회 처리, 실험군 2는 3회 처리, 실험군 3은 5회 처리한 것을 나타낸다.
상기 결과는 도 15에 나타냈으며, 대조군 2에서는 테스토스테론의 영향으로 21일 이후에 털이 거의 자라지 않았으나, 실시예 2를 3회 및 5회 처리한(실험군 2 및 3) 실험군에서 대조군 2에 비하여 상대적으로 털이 자라나는 것을 확인할 수가 있었다.
실험예 6-3. 마우스에서의 SRD5A2 발현 특징 - mRNA 발현양 확인
마우스에 본 발명에서 제조한 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(Cas9:gRNA(74㎍:26㎍))를 처리 후, 24시간 후에 마우스의 피부를 얻어 Trizol(invitrogen)을 이용하여 총RNA를 추출하였고, SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
SRD5A2의 mRNA 발현 확인을 위한 Real-time PCR은 SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)와 AB step one plus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 활용하여 측정하였다. 이 때 검출에 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.
SRD5A2 sense : GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2 antisense : CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH sense : GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH antisense : AGGGATCTCGCTCCTGGAA
상기 결과는 도 16에 나타냈으며 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리로 인해 모유두 진피 세포에서 SRD5A2 mRNA 발현이 현저하게 감소되는 결과를 확인할 수 있다.
이상과 같은 결과를 통해 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 탈모를 유도시키는 SRD5A2를 근본적으로 억제할 수 있음이 확인되며, 이는 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 남성형 탈모의 치료에 매우 효과적임을 제시한다.
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cacagacata cggtttagct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tccattcaat gatctcaccg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgattgagca gtgagtacac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 attacaagcg ttcggcccct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gagctggcgc aatatatagt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agctaaaccg tatgtctgtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cggtgagatc attgaatgga 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 16 acagacaugc gguuuagcgu 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 17 cgcgcaauaa accagguaau 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 18 uccauucaau aaucucgccc 20 <210> 19 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 19 uccugggcga gauuauugaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 20 agcccggaga ggucaucuac 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 acagacatgc ggtttagcgt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 cgcgcaataa accaggtaat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 tccattcaat aatctcgccc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 tcctgggcga gattattgaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 25 agcccggaga ggtcatctac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 acgctaaacc gcatgtctgt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 attacctggt ttattgcgcg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 gggcgagatt attgaatgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 ttcaataatc tcgcccagga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 guguacucac ugcucaaucg 20 <210> 31 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens <400> 31 guguacucac ugcucaaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 32 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens <400> 32 aggggccgaa cgcuuguaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 33 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens <400> 33 acuauauauu gcgccagcuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 34 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens <400> 34 cacagacaua cgguuuagcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 35 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens <400> 35 uccauucaau gaucucaccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 36 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus <400> 36 acagacaugc gguuuagcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 37 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus <400> 37 cgcgcaauaa accagguaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 38 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus <400> 38 uccauucaau aaucucgccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 39 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus <400> 39 uccugggcga gauuauugaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 40 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus <400> 40 agcccggaga ggucaucuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 41 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scramble gRNA <400> 41 gcacuaccag agcuaacuca 20

Claims (7)

  1. Cas9 단백질, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 염기서열을 포함하는 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 폴리에틸렌이민의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체로서,
    상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)을 포함하면서, 엔도글린(endoglin)을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체가 결합된 것이 특징이고,
    상기 마이크로버블은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 디세틸 포스페이트, 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모의 개선 또는 치료용 조성물.
  7. Cas9 단백질, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 염기서열을 포함하는 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 폴리에틸렌이민의 복합체를 제조하고,
    레시틴, 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
    상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질, 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 염기서열을 포함하는 SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 폴리에틸렌이민의 복합체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
    상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계;
    상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전물 상태의 나노 리포좀을 회수하는 제4단계; 및,
    상기 제4단계에서 얻은 침전물 상태의 나노 리포좀에 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]]의 설폰화염을 통해 엔도글린(endoglin)을 인식할 수 있는 단클론성 또는 다클론성 항체를 결합하는 제5단계;를 포함하여 제조된 나노 리포좀과,
    1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 콜레스테롤, 디세틸 포스페이트, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 클로로포름상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제A단계;
    상기 제A단계에 글루코오스 용액을 넣어 초음파 처리하는 제B단계;
    상기 제B단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제C단계; 및,
    상기 제C단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물에 소수성 기체를 주입하여 마이크로 버블을 제조하는 제D단계;
    를 포함하여 제조된 마이크로버블을 혼합하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 제1항의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 제조 방법.
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