CN110446506B - 纳米脂质体-微泡缀合物及包含其的用于改善或治疗毛发脱落的组合物 - Google Patents

纳米脂质体-微泡缀合物及包含其的用于改善或治疗毛发脱落的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米脂质体‑微泡缀合物，其具有包封在其中的Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物，以及包含所述纳米脂质体‑微泡缀合物的改善或治疗毛发脱落的组合物。目前，用作毛发脱落治疗剂的药物具有严重的副作用的缺点，例如性欲减退和勃起功能障碍，并且当药物治疗停止时，毛发脱落复发。然而，当使用本发明的纳米脂质体‑微泡缀合物时，可以基本上抑制诱导毛发脱落的SRD5A2，并且可以有效地进行雄性毛发脱落的治疗。

Description

纳米脂质体-微泡缀合物及包含其的用于改善或治疗毛发脱 落的组合物
技术领域
本发明涉及纳米脂质体-微泡缀合物，其中CAS9蛋白、抑制SRD5A2 基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中，以及涉及用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物。
更具体地，本发明涉及纳米脂质体-微泡缀合物，其被配置成使得具有包封在其中的Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体与其中具有疏水性气体的微泡化学稳定地缀合，以及涉及用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物。
背景技术
基因编辑技术源自微生物的适应性免疫，其开始集中于免疫系统，其中噬菌体片段通过噬菌体感染被记忆为DNA，然后相应的DNA被Cas9 (CRISPR相关蛋白9：RNA指导的DNA核酸内切酶)切割，Cas9是当继发感染时充当基因剪刀的核酸酶。这已发展成如果特定的碱基序列被指导RNA(guide RNA，gRNA)识别，则允许通过Cas9蛋白切割相应位点的基因校正技术(Ran FA等,2013，Woo JW等,2015)。
该技术作为治疗基因突变诱导的疾病(其被认为是无法治愈的疾病) 的根本病因的方法而受到关注。然而，仍然存在待解决的问题，例如基因编辑系统的有效体内递送和靶基因之外基因的脱靶。特别地，使用最初使用的Cas9质粒的基因编辑系统的安全性需要关于体内递送时的多种免疫应答和抗生素抗性进行验证。最近，用于体外产生由蛋白质和指导RNA 构成的基因剪刀(Cas9)和递送其的系统已被用作另外的替代，但也存在与有效地递送至细胞以及蛋白质和RNA的稳定性相关的问题 (Ramakrishna S等,2014)。
毛发脱落通常是指从头皮脱落浓黑的毛发。毛发脱落的原因是多样的，但遗传学和雄性激素雄激素被认为是重要的因素。其中，雄性雄激素性脱发(占毛发脱落的约60％至70％)以其中睾酮被5-α还原酶(SRD5A) 转化为二氢睾酮(DHT)的方式发展，并且过量产生的二氢睾酮与真皮乳头细胞(DPC)的雄激素受体(AR)结合，从而诱导凋亡，导致由毛发的小型化造成的毛发脱落。由于具有大量表达的5-α还原酶、特别是5-α还原酶2型(SRD5A2)(主要分布在毛囊的外根鞘和真皮乳头中)的男性或具有高活性5-α还原酶2型的人与大多数男性相比具有相当大量的二氢睾酮，因此毛发脱落的可能性提高。因此，雄性雄激素性脱发的主要治疗是降低5-α还原酶2型的量或活性以防止睾酮转化为二氢睾酮。
目前开发用作毛发脱落治疗剂的药物包括保法止(Propecia)、米诺地尔(Minoxidil)和度他雄胺(Dutasteride)。保法止的作用是直接抑制5-α还原酶2型，而度他雄胺的作用是抑制5-α还原酶1型和2型从而阻止睾酮转化为二氢睾酮，由此减少毛发脱落的进展。然而，在服用其的患者中会出现副作用例如性欲减退、勃起功能障碍等，并且当中断药物施用时会重新开始毛发脱落。特别地，USFDA建议不育或低精子数量的男性停止服用所述药物，并且禁止育龄女性服用所述药物，因为这样的药物可能导致胎儿的男性性功能障碍(Myscore V等,2012)。
SRD5A2是与毛发脱落相关的基因之一，并且因此认为降低SRD5A2 基因表达是重要的，因为其与诱导凋亡的二氢睾酮相关。
同时，细胞内药物递送系统中所需的两个重要特性是效率和细胞毒性 (安全性)，并且由胆固醇或脂质构成的纳米脂质体载体技术被广泛使用 (Zuris JA等,2015)。然而，单独的这种纳米脂质体技术不利于将药物递送到存在于充当皮肤屏障的角质层下面的真皮中(Nemes Z等,1999)。
微泡是FDA批准的诊断性超声造影剂，其以填充有疏水性气体的微尺寸泡的形式提供。当微泡暴露于超声时，微泡技术引起空洞形成，从而临时在周围细胞的细胞膜中形成孔，由此可使用声孔效应将纳米脂质体有效地递送到细胞中，通过其，材料通过由此形成的孔穿透细胞，这与其他细胞递送方法不同。
因此，本发明人将微泡技术应用于纳米脂质体以有效地将抑制 SRD5A2基因表达的纳米脂质体递送至真皮层，并且优选地，已经制备了组合物，其中具有包封在其中的Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体与微泡缀合。由此，制备了具有进入真皮中的良好药物递送效率的载体，并用作改善或治疗毛发脱落的组合物，从而最终实现本发明。
[引用列表]
[专利文献]
(专利文献1)韩国专利No.10-1710026(发明名称：Nanoliposome carriercomposition containing hybrid of Cas9 protein and guide RNA，申请人：MoogeneMedi，登记日期：2017年2月20日)
(专利文献2)韩国专利No.10-1683463(发明名称： Microbubble-Liposome-Melanin nanoparticle complex and Contrast agent comprising the same，申请人：Seoul National University Industry-Academic Cooperation Foundation，登记日期：2016年12月1日)
(专利文献3)韩国专利申请公开No.10-2016-0089526(发明名称： Delivery,useand therapeutic applications of the CRISPR-CAS systems and compositions fortargeting disorders and diseases using particle delivery components，申请人：Seoul National University Industry-Academic Cooperation Foundation，公开日期：2016年7月27日)
[非专利文献]
(非专利文献1)Ran RA等,Genome engineering using the CRISPR-Cas9system,Nat.Protoc.,2013,8(11),2281-2308。
(非专利文献2)Woo JW等,DNA-free genome editing in plants withpreassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins,Nat.Biotechnol.,2015, 33(11),1162-1164。
(非专利文献3)Ramakrishna S等,Gene disruption by cell-penetratingpeptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA,Genome Res,2014, 24(6),1020-1027。
(非专利文献4)Myscore V等,Finasteride and sexual side effects, IndianDermatol Online J,2012,3(1),62-65。
(非专利文献5)Zuris JA等,Cationic lipid-mediated delivery of proteinsenables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo,Nat.Biotechnol.,2015,33(1),73-80。
发明内容
技术问题
因此，本发明旨在提供纳米脂质体-微泡缀合物，其中CAS9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中，以及提供用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物。
更具体地，本发明旨在提供纳米脂质体-微泡缀合物，其中具有包封在其中的Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体与其中具有疏水性气体的微泡化学稳定地缀合，以及提供用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物，从而抑制SRD5A2基因表达。
技术方案
本发明涉及纳米脂质体-微泡缀合物，其中Cas9蛋白、抑制SRD5A2 基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中。
抑制SRD5A2基因表达的指导RNA可包含SEQ.ID.NO:1、2、3、4 或5的碱基序列。
纳米脂质体可包含卵磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和金属螯合脂质。
纳米脂质体可与单克隆或多克隆抗体结合，所述单克隆或多克隆抗体能够识别选自以下的在真皮乳头细胞中表达的至少一种蛋白质：内皮联蛋白、CD34、角蛋白18和IL-6(白细胞介素6)。
微泡可包含两性磷脂、阴离子磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和含有二硫基的脂质。
纳米脂质体-微泡缀合物的颗粒尺寸可为800至1500nm。
本发明可提供用于改善或治疗毛发脱落的包含纳米脂质体-微泡缀合物的组合物。
此外，本发明提供了制备能够选择性识别真皮乳头细胞的纳米脂质体 -微泡缀合物的方法。更优选地，通过分别制备纳米脂质体和微泡然后将其混合来制备纳米脂质体-微泡缀合物。
纳米脂质体可如下制备。
优选地，纳米脂质体通过以下制备：
S1)制备Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物，并通过将卵磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和金属螯合脂质在氯仿中混合来制备脂质膜组合物；
S2)向脂质膜组合物添加Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导 RNA和阳离子聚合物的复合物并进行超声；
S3)对经超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声；
S4)对在S3中进行超声的脂质膜组合物进行离心并回收沉淀的纳米脂质体；以及
S5)使用交联剂使抗体与在S4中获得的沉淀的纳米脂质体结合。
而且，微泡可如下制备。
微泡通过以下制备：
A)通过将两性磷脂、胆固醇、阴离子脂质、含有胺基的脂质和含有二硫基的脂质在氯仿中混合来制备脂质膜组合物；
B)将葡萄糖溶液添加至步骤A并进行超声；
C)对在步骤B中进行超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声；以及
D)通过将疏水性气体引入在步骤C中进行超声的脂质膜组合物来制备微泡。
可通过将由此制备的微泡与纳米脂质体混合来形成纳米脂质体-微泡缀合物。
以下，将给出本发明的详细描述。
本发明涉及纳米脂质体-微泡缀合物，其中Cas9蛋白、抑制SRD5A2 基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中。
Cas9蛋白可获自用pET28a/Cas9-Cys质粒(Cas9-Cys插入pET28a(+) 载体中)转化的细胞或菌株。优选地，通过将pET28a/Cas9-Cys质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中并过表达Cas9蛋白来获得Cas9蛋白。
用于本发明的指导RNA选自以下SEQ.ID.NO:1至5的碱基序列，并且包含指导RNA的纳米脂质体载体组合物用于通过抑制SRD5A2基因的表达来改善或治疗毛发脱落。
SEQ.ID.NO:1的指导RNA衍生自以下SEQ.ID.NO:6的人(智人) SRD5A2的DNA序列的一部分，并且靶向以下SEQ.ID.NO:11的SRD5A2 的DNA序列的一部分(SEQ.ID.NO:6和SEQ.ID.NO:11具有彼此互补的碱基序列)，并且如上所述SEQ.ID.NO:2～5也分别对应于SEQ.ID.NO: 7～10和SEQ.ID.NO:12～15。
[表1]
Figure GDA0004044618040000061
在另一方面，本发明提供了用于动物实验的纳米脂质体-微泡缀合物，所述动物实验将代替在研究和开发期间难以临床应用的人，并且用于动物实验的纳米脂质体-微泡缀合物包含选自以下SEQ.ID.NO:16至20的指导RNA。动物优选地包括小鼠(小家鼠(Musmusculus))。各个序列的对应关系以与表1相同的方式在下表2中示出。
[表2]
Figure GDA0004044618040000071
在选自SEQ.ID.NO:1至5或SEQ.ID.NO:16至20的指导RNA序列之后可包含支架序列以与Cas9蛋白形成复合物。此处，支架序列的种类没有特别的限制，并且可使用任何序列，只要其是用于制备指导RNA的典型碱基序列即可。
因此，应用于本发明的纳米脂质体的指导RNA可包含与以下支架序列结合并且因此可用于制备纳米脂质体的指导RNA。
[表3]
Figure GDA0004044618040000081
/>
Figure GDA0004044618040000091
被SEQ.ID.NO:1至5的指导RNA的碱基序列靶向的SEQ.ID.NO: 11至15的DNA序列是存在于SRD5A2(智人染色体17，GenBank No. NC_000002.12)中的碱基序列，并且上述DNA被SEQ.ID.NO:1至5的指导RNA切割。
被SEQ.ID.NO:16至20的指导RNA的碱基序列靶向的SEQ.ID.NO: 26至30的DNA序列是存在于SRD5A2(小家鼠，染色体17，GenBank No. NC_000083.6)中的碱基序列，并且上述DNA被SEQ.ID.NO:16至20 的指导RNA切割。
SEQ.ID.NO:31至40的指导RNA可使用T7 RNA聚合酶通过体外转录来合成。
阳离子聚合物优选地包含选自以下的至少一种：聚-L-赖氨酸、聚酰氨基胺、聚[2-(N,N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯]、壳聚糖、聚-L-鸟氨酸、环糊精、组蛋白、胶原蛋白、葡聚糖和聚乙烯亚胺。最优选地，使用聚乙烯亚胺。
纳米脂质体可包含卵磷脂(α-磷脂酰胆碱)、阳离子磷脂、胆固醇和金属螯合脂质，从而通过卵磷脂、阳离子磷脂、胆固醇和金属螯合脂质形成构成纳米脂质体的膜。
卵磷脂广泛分布在动物/植物中并且具有优异的生物相容性，并且先前已经证实其稳定性，因此卵磷脂可广泛用于食品和药物载体技术。此外，其可用作有助于控制纳米脂质体的尺寸和改变纳米脂质体的形状的材料。
阳离子磷脂可包含选自以下的至少一种：二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3- 磷酸乙醇胺(DPPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。优选地可使用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
金属螯合脂质优选地包含选自以下的至少一种：DOGS-NTA-Ni脂质、 DMPE-DTPA-Gd脂质和DMPE-DTPA-Cu脂质。DOGS-NTA-Ni脂质是具有由以下化学式1表示的化学结构的脂质：
[化学式1]
Figure GDA0004044618040000101
并且被称为1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)。
*1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaceticacid)succinyl](nickel salt)
DMPE-DTPA-Gd脂质是具有由以下化学式2表示的化学结构的脂质：
[化学式2]
Figure GDA0004044618040000102
并且被称为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-二亚乙基三胺五乙酸(钆盐)。
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(gadolinium salt)
DMPE-DTPA-Cu脂质是具有由以下化学式3表示的化学结构的脂质：
[化学式3]
Figure GDA0004044618040000111
并且被称为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-二亚乙基三胺五乙酸(铜盐)。
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(copper salt)
DOGS-NTA-Ni脂质的功能是使用在蛋白质纯化过程中使用的 His-Tag(6X组氨酸)和Ni2+亲和力有效地将Cas9蛋白(包含His-Tag) 包封到纳米脂质体中。更具体地，DOGS-NTA-Ni被配置成在18碳原子上形成一个双键，因此能够与卵磷脂形成脂质，并且Ni2+附着于其末端，因此附着于Cas9蛋白的两个(His-Tag)与一个Ni2+彼此连接，由此将Cas9 蛋白更有效地包封到纳米脂质体中。DMPE-DTPA-Gd脂质和 DMPE-DTPA-Cu脂质具有与上述相同的作用，并有效地诱导将包含Cas9 蛋白的复合物包封到纳米脂质体中。
本发明的纳米脂质体可包含与单一种类的指导RNA结合的Cas9蛋白，或与每种指导RNA结合的Cas9蛋白的组合(例如：‘Cas9蛋白-SEQ. ID.NO:1的指导RNA’，‘Cas9蛋白-SEQ.ID.NO:2的指导RNA’等)。
纳米脂质体能够与单克隆或多克隆抗体结合，所述单克隆或多克隆抗体能够识别选自以下的在真皮乳头细胞中表达的蛋白质：内皮联蛋白、 CD34、角蛋白18和IL-6。
可使用本领域中广泛已知的技术容易地产生抗体。多克隆抗体可获自在将选自内皮联蛋白、CD34、角蛋白18和IL-6的抗原蛋白质注射到动物中之后收集的血清。动物可包括任何动物宿主，例如山羊、兔、猪等。单克隆抗体可使用如本发明所属领域中广泛已知的杂交瘤方法(Kohler G. 和Milstein C.)或噬菌体抗体文库方法(Clackson等；Mark等)来制备。杂交瘤方法可使用免疫相关宿主动物(例如小鼠)的细胞和癌症或骨髓瘤细胞系进行。然后，通过本发明所属领域中广泛已知的使用聚乙二醇的方法，将两种细胞融合，然后可通过标准组织培养方法来增殖产生抗体的细胞。然后，通过使用有限稀释技术的亚克隆获得均匀的细胞群，然后可使用标准技术在体外或体内大量培养能够产生对上述抗原蛋白具有特异性的抗体的杂交瘤。
噬菌体抗体文库方法可以以这样的方式进行：其中，获得针对选自内皮联蛋白、CD34、角蛋白18和IL-6的抗原蛋白的抗体基因，并以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面上，从而体外制备抗体文库，然后从文库中分离并且从而产生与上述抗原蛋白结合的单克隆抗体。由此产生的抗体可通过电泳、透析、离子交换色谱法、亲和色谱法等分离。
抗体可包括抗体分子的功能性片段以及具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式。抗体分子的功能性片段是至少具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab)2、Fv等。
在本发明中，抗体可使用选自以下的至少一种交联剂作为接头进行结合：1,4-双-马来酰亚胺基丁烷、1,11-双-马来酰亚胺基四甘醇、1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己酸酯]]及其磺酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯]及其磺酸酯(磺基-SPDP)、间- 马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯及其磺酸酯(磺基-MBS)和琥珀酰亚胺基[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯]及其磺酸酯(磺基 -SMPB)。
接头的功能是使纳米脂质体的阳离子磷脂与抗体彼此连接。
本发明的纳米脂质体可稳定地分散在中性水、细胞培养液、血液等中持续数小时或更久。
本发明的微泡可包含两性磷脂、阴离子磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和含有二硫基的脂质，并且通过将疏水性气体引入包含其混合物的脂质膜组合物来形成构成气泡的膜来制备。
两性磷脂可以选自：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、 1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MPPC)和1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)。优选地使用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。
阴离子磷脂可包含选自以下的至少一种：联十六烷基磷酸酯(DCP)、 1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate， DEPA)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯(DLPA)、1,2-二肉豆蔻酰基 -sn-甘油基-3-磷酸酯(DMPA)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯 (DOPA)。优选地使用联十六烷基磷酸酯(DCP)。
对于阳离子磷脂，可以使用与制备纳米脂质体所用相同的阳离子磷脂，更具体地，阳离子磷脂可包含选自以下的至少一种：二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)、1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基 -3-磷酸乙醇胺(DPPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。优选地使用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
含有二硫基的脂质可通过以下示例：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-2000-N-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，称为 DSPE-PEG-sPDP。
*DSPE-PEG-sPDP：1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N-poly(ethyleneglycol)-2000-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate
DSPE-PEG-sPDP脂质是具有以下化学式4的化学结构的脂质：
[化学式4]
Figure GDA0004044618040000131
对于微泡的制备，两性磷脂与阴离子磷脂与胆固醇与阳离子磷脂与含有二硫基的脂质的混合比可为1～3mM:0.1～0.3mM:0.5～2mM:0.1～0.3 mM:0.1～0.3mM。此处，作为两性磷脂:阴离子磷脂:胆固醇:阳离子磷脂: 含有二硫基的脂质，可使用DPPC:DCP:胆固醇:DPPE:sPDP，并且优选地， DPPC:DCP:胆固醇:DPPE:sPDP以2.0mM:0.18mM:0.9mM:0.17mM:0.17 mM的比混合。
当微泡与纳米脂质体缀合从而形成纳米脂质体-微泡缀合物时，微泡中的DSPE-PEG-sPDP脂质用作交联剂。
微泡可由两性磷脂、阴离子磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和含有二硫基的脂质的混合物的鼓泡产生。微泡的内部可填充选自SF6、CO2、CF4和 C3F8的疏水性气体。疏水性气体优选为SF6。
纳米脂质体的颗粒尺寸可为100至200nm。如果纳米脂质体的尺寸小于10nm，则难以将Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封到纳米脂质体中，并且在体内注射时其稳定性可能降低，这是不期望的。另一方面，如果其尺寸超过200nm，则包含纳米脂质体的组合物在体内注射时稳定性可能降低，这是不期望的。另外，微泡的颗粒尺寸可为800至1500nm。因此，纳米脂质体-微泡缀合物的颗粒尺寸可为约800至1500nm。
本发明可提供用于改善或治疗毛发脱落的包含纳米脂质体-微泡缀合物组合物的组合物。纳米脂质体-微泡缀合物组合物通过SRD5A2基因疗法有效治疗毛发脱落。
在根据本发明制备纳米脂质体-微泡缀合物组合物的方法中，制备纳米脂质体，制备微泡，并将纳米脂质体和微泡混合，从而产生缀合物。
在纳米脂质体的制备中，当在S1中制备复合物时，Cas9蛋白、抑制 SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物可以以1:1～3:30～70的摩尔比混合。此处，如果其混合比在上述范围之外，则难以获得复合物。在 S1中，卵磷脂、金属螯合脂质、胆固醇和阳离子磷脂可以以 2:0.1～5:0.01～0.5:0.01～0.5的摩尔比混合。如果其混合比在上述范围之外，则难以制备构成纳米脂质体的脂质。另外，S3中的冷冻-解冻可重复1至 12次。当脂质膜组合物进行冷冻-解冻的过程以这种方式重复时，可形成具有更均匀尺寸的纳米脂质体分散溶液，并且可以提高纳米脂质体的药物包封效率。如果重复该过程的次数超过12次，则纳米脂质体的包封效率可能降低。因此，上述过程优选地进行12次或更少。在S5中，将纳米脂质体与交联剂混合1至5小时，然后向其添加抗体，并一起混合1至5小时。在S5中，纳米脂质体、交联剂和抗体可以以10～30:1～5:1的重量比结合。
在S5中制备的纳米脂质体中，可将巯基引入阳离子磷脂中以实现与微泡的缀合。优选地，添加2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-iminothiolane hydrochloride)。当添加巯基时，仅回收纳米脂质体，然后将其分散在葡萄糖水溶液(特别是浓度为1至20％(w/v)的葡萄糖水溶液)中，并且其因此可用于随后与微泡混合。
对于纳米脂质体与微泡的缀合，可在根据本发明制备微泡期间在步骤 B中使用葡萄糖溶液、甘油和丙二醇的至少一种溶液使微泡稳定，然后可将其与纳米脂质体混合。优选地使用葡萄糖溶液。此处，葡萄糖溶液的浓度可为1至20％(w/v)。如果葡萄糖的浓度超过20％(w/v)，则溶液可能变得黏性使得无法合成微泡。
当根据本发明制备纳米脂质体时，金属螯合脂质带负电荷(-)，使得响应于Cas9蛋白和抑制SRD5A2基因表达的指导RNA的杂交体的负电荷(-) 而难以包封纳米脂质体。因此，为了克服该问题，可通过制备包含具有正电荷(+)的阳离子聚合物的复合物来更有效地包封纳米脂质体。
本发明可提供包含纳米脂质体-微泡缀合物的药物组合物。本发明的药物组合物可根据各典型方法配制成经口剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气溶胶制剂，以及外用制剂、栓剂和无菌可注射溶液。可包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶(
Figure GDA0004044618040000151
)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂通常可使用稀释剂或赋形剂例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等来制备。用于经口施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这样的固体制剂可通过将本发明的组合物与至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。除简单的赋形剂之外，还可使用润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等。经口液体制剂可包括混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂，并且还可不仅包含简单的稀释剂，例如水或液体石蜡，还可包含多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂精酯、甘油明胶等。
当施用时，根据本发明的药物组合物的量可根据待治疗的对象的年龄、性别和体重、治疗的具体疾病或病理学状况、疾病或病理学状况的严重程度、施用途径和处方者的判断而有所不同。基于这些因素的剂量确定对于本领域技术人员来说将是明显的，并且剂量通常为0.01mg/kg/天至约 2000mg/kg/天。优选地，剂量设定为1mg/kg/天至500mg/kg/天。施用可每天一次或每天数次地进行。剂量不以任何方式限制本发明的范围。
根据本发明的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物，例如小鼠、家畜、人等。可考虑所有施用方式，例如通过经口、直肠内、静脉内、肌内、皮下、腹膜内或脑室内注射。
有利效果
本发明涉及纳米脂质体-微泡缀合物，其中CAS9蛋白、抑制SRD5A2 基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中，并涉及用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物。目前，用于治疗毛发脱落的药物引起严重的副作用，例如性欲减退或勃起功能障碍，并且当药物治疗停止时，毛发脱落再次进展。然而，当使用本发明的纳米脂质体-微泡缀合物时，可以从根本上抑制诱导毛发脱落的SRD5A2的表达，并且可以非常有效地进行雄性毛发脱落的治疗。
尽管韩国专利No.10-1710026公开了一种具有包封在其中的靶向糖尿病表达基因的Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体，并且韩国专利No.10-1683463公开了一种微泡-脂质体-黑色素纳米颗粒复合物，但是其中并未公开根据本发明的缀合技术，其中抗体结合的纳米脂质体与微泡缀合以提高向引起毛发脱落的基因或在其中表达基因的真皮乳头细胞的递送效率。
附图说明
图1示意性示出了当将纳米脂质体-微泡缀合物递送至真皮乳头细胞 (DPC)并进行超声时，细胞膜被穿孔并且微泡塌陷，由此纳米脂质体进入细胞的过程；
图2示出了使用通过在实验室中结合制备的体外转录的sgRNA和经纯化的Cas9蛋白的杂交体(Cas9/sgRNA杂交体，Cas9-RNP)确认SRD5A2 基因是否实际上被切割的结果；
图3示出了通过动态光散射(DLS)评价对比例1的纳米脂质体、对比例2的微泡和实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物的尺寸和分散性的结果；
图4示出了通过将RITC引入纳米脂质体并将FITC引入微泡进行的纳米脂质体-微泡缀合物的共聚焦激光扫描显微术图像，以证实实施例2 中纳米脂质体和微泡的缀合；
图5示出了回声反射的的结果，以确认疏水性气体是否保持在对比例 1的纳米脂质体、对比例2的微泡和实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物中；
图6示出了通过将根据本发明的单链指导RNA(sgRNA1至5，依次为SEQ.ID.NO:1至5)引入质粒系统然后在真皮乳头细胞中表达SRD5A2 的mRNA来测量根据本发明的单链指导RNA效率的结果；
图7示出了用纳米脂质体-微泡缀合物处理真皮乳头细胞然后用Cas9 的抗体进行免疫染色之后的共聚焦激光扫描显微术图像，以确认本发明的纳米脂质体-微泡缀合物是否引入到真皮乳头细胞中；
图8A示意性地示出了通过用根据本发明的实施例2的纳米脂质体- 微泡处理真皮乳头细胞，SRD5A2基因中PAM结构之后的一个碱基序列的切割，并且图8B示出了在用实施例2的纳米脂质体-微泡处理细胞然后进行超声之后评价抑制SRD5A2 mRNA表达的效果的结果；
图9示出了用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物处理真皮乳头细胞之后评价SRD5A2蛋白表达程度的结果；
图10示出了当用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物预处理真皮乳头细胞然后用睾酮处理时真皮乳头细胞存活状态的共聚焦激光扫描显微术图像；
图11示出了当用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物预处理真皮乳头细胞然后用睾酮处理时细胞存活和增殖的WST-1测定结果；
图12示出了在用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物预处理之后用睾酮处理真皮乳头细胞时转化为二氢睾酮的程度的western印迹结果；
图13示出了在用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物预处理之后用睾酮处理真皮乳头细胞时测量胱天蛋白酶-3活性以评价凋亡的结果；
图14示出通过将从小鼠真皮组织提取的DNA与Cas9蛋白和单链小鼠指导RNA(sgRNAm1至5：依次为SEQ.ID.NO:36至40)混合，测量Cas9蛋白和指导RNA的杂交体活性的结果；
图15示出了在用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物重复处理诱导毛发脱落的小鼠一次(测试组1)、三次(测试组2)和五次(测试组3)之后是否出现毛发生长效果的图像；以及
图16示出了在用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡处理小鼠之后评价小鼠真皮组织中SRD5A2 mRNA表达程度的结果。
具体实施方式
通过以下实施例将给出对本发明更好的理解。然而，本发明不限于本文中描述的实施例，而是可以具体化为其他形式。此外，阐述实施例是为了向本领域技术人员提供对本发明精神的理解，以使得本文中的教导是彻底和完整的。
<实施例1.指导RNA的制备和Cas9蛋白的纯化>
实施例1-1.靶向SRD5A2基因的指导RNA的制备
使用T7 RNA聚合酶(NEB)通过体外转录方法制备靶向KRAS基因的指导RNA。为此，通过PCR方法制备140b.p.DNA模板，其使用如下表4中所示的包含T7启动子序列和SEQ.ID.NO:6： GTGTACTCACTGCTCAATCG、SEQ.ID.NO:7： AGGGGCCGAACGCTTGTAAT、SEQ.ID.NO:8： ACTATATATTGCGCCAGCTC、SEQ.ID.NO:9： CACAGACATACGGTTTAGCT、SEQ.ID.NO:10： TCCATTCAATGATCTCACCG、SEQ.ID.NO:21： ACAGACATGCGGTTTAGCGT、SEQ.ID.NO:22： CGCGCAATAAACCAGGTAAT、SEQ.ID.NO:23： TCCATTCAATAATCTCGCCC、SEQ.ID.NO:24： TCCTGGGCGAGATTATTGAA、SEQ.ID.NO:25： AGCCCGGAGAGGTCATCTAC(对应于SRD5A2基因的20b.p.序列)的‘69-mer正向引物’，包含与指导RNA结合的支架序列的‘20-mer反向引物’和质粒Cas指导载体(plasmid Cas guide vector)(Origene)。对该DNA模板、rNTP混合物、T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂在37℃下进行转录2小时，从而产生指导RNA，然后进行RNA纯化，由此提高RNA 纯度。
*T7启动子序列对应于下表4的加下划线部分。
*表1的粗体序列是识别SRD5A2基因的位点，其中通过识别支架序列的模板(质粒Cas指导载体)来合成指导RNA，并且其碱基序列与最终指导RNA的序列是相同的(其中T替换为U)。
*F引物之后的GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA是支架序列的一部分。
*质粒Cas指导载体包含支架序列的模板。
*该测试中使用的质粒Cas指导载体的结构如图17中所示。来源： http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/Detail.aspx？sku＝GE100001
[表4]
Figure GDA0004044618040000191
Figure GDA0004044618040000201
通过上述实验，制备了具有下表5的碱基序列的指导RNA。
[表5]
Figure GDA0004044618040000202
/>
Figure GDA0004044618040000211
最终指导RNA识别作为靶标的人SRD5A2基因的SEQ.ID.NO:11至 15的碱基序列，并且识别作为靶标的小鼠SRD5A2基因的SEQ.ID.NO:26 至30的碱基序列。
实施例1-2.Cas9蛋白的纯化
将pET28a/Cas9-Cys质粒(Addgene质粒#53261)转化到大肠杆菌 (DH5α)中，并且在28℃下在0.5mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃型半乳糖苷)中过表达Cas9蛋白，并且在裂解缓冲液(20mM pH 8.0的 Tris-Cl、300mM NaCl、20mM咪唑、1×蛋白酶抑制剂混合物、1mg/mL 溶菌酶)中超声过表达Cas9-蛋白的大肠杆菌。将在超声之后获得的裂解物离心以得到包含蛋白质的液体。使用Ni-NTA琼脂糖珠提取方法(洗脱缓冲液：20mM pH 8.0的Tris-Cl、300mM NaCl、300mM咪唑、1×蛋白酶抑制剂混合物)从液体中分离Cas9蛋白。将由此分离的蛋白质在储存缓冲液(50mM pH 8.0的Tris-HCl、200mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5mMPMSF、20％甘油)(截止10K)中透析，从而除去咪唑，然后量化蛋白质浓度(使用BCA方法)。
**pET28a/Cas9-Cys质粒(Addgene质粒#53261)的结构：图18，来源：Addgene(http://www.addgene.org/)
<实施例2.纳米脂质体-微泡缀合物的产生>
实施例2-1.纳米脂质体的产生
通过将在实施例1中制备的Cas9蛋白、指导RNA和聚乙烯亚胺以 1:2:50的摩尔比混合来制备复合物。此处，作为指导RNA，使用包含支架序列的人SEQ.ID.NO:31、32、33、34或35(其中包含SEQ.ID.NO:1、2、3、4或5)和小鼠SEQ.ID.NO:36、37、38、39或40(其中包含SEQ.ID.NO:16、17、18、19或20)。
接下来，将卵磷脂(Sigma Aldrich)、DOGS-NTA-Ni脂质(Avanti polar lipids)、胆固醇(Sigma Aldrich)和DPPE(Sigma Aldrich)以2:1:0.1:0.05 的摩尔比在氯仿中混合，然后使用旋转蒸发器制成脂质膜。
向脂质膜添加Cas9蛋白/指导RNA/聚乙烯亚胺复合物并通过超声混合。重复使用液氮的冷冻-解冻循环五次，然后进行超声(探针模式)，从而制备具有更小尺寸的均匀纳米脂质体组合物。
此后，回收通过离心沉淀的纳米脂质体组合物(脂质的总量：20.43 mg，Cas9和gRNA的总量：0.1mg)并与2.5mg的磺基-SMCC(ProteoChem) (充当用于抗体结合的接头)在室温(即25℃)下在PBS中混合2小时。
接下来，提供经纯化的抗体以与纳米脂质体结合，并且用于与纳米脂质体结合的抗体是能够识别已知在真皮乳头细胞中过表达的内皮联蛋白、 CD34、角蛋白18和IL-6的单克隆或多克隆抗体。特别地，选择内皮联蛋白抗体(抗内皮联蛋白)，与2-巯基乙胺(Thermo)在10mM EDTA中在 37℃下混合2小时，然后用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)进行纯化(内皮联蛋白抗体和2-巯基乙胺以1mg:0.6mg的比混合)。因此，抗体纯化过程通过图19的图描述(向包含相同的两个Y形链的抗体添加2-巯基乙胺以得到半抗体，然后对半抗体进行纯化并与纳米脂质体结合)。图19的来源：Wu S等,Highly sensitive nanomechanicalimmunosensor using half antibody fragments,Anal.Chem.,2014,86(9),4271-4277。
如图19所示，当制备半抗体时，产生了-SH。由于-NH2存在于纳米脂质体的DPPE脂质中，其与磺基-SMCC(接头)反应，并且因此纳米脂质体的磺基-SMCC与半抗体的-SH彼此结合。以这种方式，通过制备半抗体，纳米脂质体识别真皮乳头细胞的能力可以加倍。
将1mg如此纯化的抗体(抗内皮联蛋白)与接头结合的纳米脂质体组合物在4℃下混合12小时，然后回收离心产生的沉淀，从而获得能够选择性识别真皮乳头细胞的抗体结合的纳米脂质体。
为了向纳米脂质体(具有通过接头与其结合的经纯化的抗体)的脂质结构的DPPE(阳离子磷脂)引入巯基以使纳米脂质体与微泡缀合，添加 2-亚氨基硫烷盐酸盐(pH 8.2)(粉末相，以相对于20.53mg/mL纳米脂质体0.5mg的量添加)，在25℃下混合2小时，并进行离心从而回收所得的沉淀物并将其分散在5％(w/v)葡萄糖水溶液中。
实施例2-2.微泡的产生
将15.4mg DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，Sigma Aldrich)、3.48mg胆固醇(Sigma Aldrich)、1mg DCP(联十六烷基磷酸酯，Sigma-Aldrich)、1.2mgDPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，Sigma Aldrich)和5mg DSPE-PEG-sPDP(1,2-二硬脂酰基-sn-磷酸乙醇胺-N-[PDP聚(乙二醇)]，Avanti polar)在1mL氯仿中混合，然后使用旋转蒸发器制成用于微泡合成的脂质膜。
此后，向其添加1mL的5％(w/v)葡萄糖水溶液并通过超声混合。重复使用液氮的冷冻-解冻循环三次，进行超声(探针模式)，然后进行SF6气体填充，从而制备分散相的微泡组合物。
实施例2-3.纳米脂质体-微泡的形成
将1mL在实施例2-1中制备的纳米脂质体(20.53mg/mL)和0.5mL 实施例2-2的微泡(26.08mg/mL)混合(以2:1的体积比)，由此纳米脂质体和微泡分散在葡萄糖水溶液中。
然后，使用机器(Tianjin Iris)施加强烈振动[混合频率：4500tr/mn (cpm：m3/分)]15秒，从而形成纳米脂质体-微泡缀合物，然后将其以分散在5％葡萄糖水溶液中的状态冷藏。
由此获得的纳米脂质体-微泡缀合物称为‘实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物’。
<对比例1.抗体结合的纳米脂质体>
以与实施例2-1中相同的方式制备纳米脂质体(未与微泡缀合)，不同之处在于仅进行至抗体结合的步骤而不进行巯基的引入，并且这样的纳米脂质体用作对比例1的组合物。
<对比例2.微泡>
以与实施例2-2中相同的方式制备微泡并将其用作对比例2的组合物 (未与纳米脂质体缀合)。
<对比例3.纳米脂质体>
以与实施例2-1中相同的方式制备纳米脂质体，不同之处在于抗体未与其结合，并且这样的纳米脂质体用作对比例3的组合物(未结合抗体的纳米脂质体)。
<对比例4.包含乱序(scramble)指导RNA的抗体结合的纳米脂质体与微泡的缀合物>
使用根据本发明的纳米脂质体制备方法制备包含乱序指导RNA序列 (SEQ.ID.NO:41:GCACUACCAGAGCUAACUCA)作为指导RNA的纳米脂质体。制备乱序指导RNA序列(其是不与DNA的任何位点结合的序列)用作对比例。向包含乱序指导RNA的纳米脂质体引入巯基(实施例2-2)并与微泡缀合(实施例2-3)，从而制备包含乱序指导RNA的结合抗体的纳米脂质体和微泡的缀合物。
同时，认为不具有抗体的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物的靶向效率显著降低，并且因此在本发明中没有作为对比例提供。
<测试例1.在纳米脂质体-微泡缀合物的制备期间指导RNA的活性和功能的评价>
测试例1-1.指导RNA和Cas9蛋白的活性的评价
用于该测试的真皮乳头细胞(DPC)是人毛囊真皮乳头细胞(Human FollicleDermal Papilla Cell，HFDPC)，并且购自Promocell。将这些细胞在通过将Promocell的Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium和Follicle Dermal Papilla CellGrowth Medium SupplementMix产品混合得到的培养基中在5％ CO2培养箱中于37℃下培养24小时或更长时间，然后用于测试。
为了评价指导RNA的制备和Cas9蛋白的纯化，收集真皮乳头细胞 (DPC)，从中提取DNA，并使用正向引物：TTGCCCTCCCCACTTTCTGC 和反向引物：TCCCACCTTCCGGGTATTGC通过PCR方法制备模板片段 (500bp)。然后，向片段引入单独的经纯化的Cas9蛋白或经纯化的Cas9 蛋白和sgRNA3(SEQ.ID.NO:33，图2)的组合。
参考图2，在使用单独的经纯化的Cas9蛋白的测试组中，由于缺乏指导RNA，片段未被Cas9蛋白切割，并且在使用经纯化的Cas9蛋白和 sgRNA3(SEQ.ID.NO:33)的组合的测试组中，片段被Cas9蛋白切割。
测试例1-2.纳米脂质体-微泡缀合物的尺寸的评价
通过动态光散射(DLS)测量在本发明中制备的纳米脂质体、微泡和纳米脂质体-微泡缀合物的尺寸和表面电荷。基于包含SEQ.ID.NO:33的指导RNA的结果在下表6和图3中示出。
[表6]
类别 表面电荷(mV) 平均纳米颗粒尺寸(nm)
实施例2 +2.13 955
对比例1 +1.78 78
对比例2 -0.89 1106
为了将包含指导RNA的纳米脂质体递送到真皮乳头细胞中，必须将负(-)表面电荷值改变为正电荷。参考表6和图3，实施例2的纳米脂质体具有正表面电荷值。此外，与实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物相比，对比例1的纳米脂质体和对比例2的微泡的尺寸和表面电荷没有大的变化。
同时，为了评价实施例2的组合物是否以纳米脂质体-微泡缀合物的形式提供，保持其缀合的状态而不是纳米脂质体和微泡的混合物的状态，使用共聚焦激光扫描显微术进行成像。为此，在制备实施例2-1的纳米脂质体时添加RITC(红色)荧光染料并在合成实施例2-2的微泡时添加FITC (绿色)荧光染料。由此，通过电子显微术和荧光成像分析实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物(最终制备为实施例2-3中的纳米脂质体-微泡缀合物)。结果如图4所示，从其中证实了纳米脂质体有效地与微泡缀合。
测试例1-3.纳米脂质体-微泡缀合物的回声反射的评价
为了评价即使在纳米脂质体与微泡缀合之后微泡中的气体是否仍然保持，使用临床超声波仪(Philips)测量实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物的回声反射。回声反射是超声图像根据超声的传播程度出现白色或黑色的现象。由于纳米脂质体在其中不包含气体，因此在超声时不发生回声反射，但证实了在其中包含气体的微泡的回声反射。该实验基于超声通过微泡中的疏水性气体的传播效率，这是因为超声辐射通过空气传播不良但容易通过液体或固体传播。因此，使探针与测试试样接触，产生超声，并接收反射的超声以确认图像。
用于测量回声反射的临床超声波仪的机械指数(mechanical index， MI)为0.07，并且制备了能够包含纳米脂质体-微泡缀合物的2％琼脂糖凝胶并用5至12MHz矩形超声探针进行测量。
其结果在图5中示出。当对比例2的微泡与实施例2的纳米脂质体- 微泡缀合物进行比较时，回声反射没有变化，因此可以得出结论：实施例 2的纳米脂质体-微泡缀合物被配置成使得纳米脂质体与完整形式的在其中包含有SF6气体的微泡有效地缀合。
<测试例2.SRD5A2表达和活性的测量>
测试例2-1.指导RNA的SRD5A2表达效率的比较
为了在真皮乳头细胞(DPC)中比较sgRNA1、2、3、4和5(SEQ.ID. NO:1、2、3、4和5)的效率，向pCas质粒(实施例1-1的pCas-Guide 质粒)引入SEQ.ID.NO:6、7、8、9和10，并且用其处理真皮乳头细胞。
收集经处理的细胞，使用TRIzol(Invitrogen)从其中提取总RNA，并使用SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)合成cDNA。
使用SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)和AB Step One Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)测量用于测量SRD5A2的mRNA 表达的实时PCR。因此，用于检测的引物的碱基序列如下。
SRD5A2有义：GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2反义：CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH有义：GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH反义：AGGGATCTCGCTCCTGGAA
以上结果在图6中示出。基于DPC中sgRNA效率的比较结果，sgRNA 3(SEQ.ID.NO:3)最有效地降低SRD5A2 mRNA表达，并且因此在所有后续测试中使用包含SEQ.ID.NO:3的指导RNA的那些。
测试例2-2.纳米脂质体-微泡缀合物向真皮乳头细胞中的引入的评价
为了评价实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物是否被引入到真皮乳头细胞中，将DPC用实施例2的浓度为Cas9:gRNA(24.7μg:8.6μg-在全部的培养液中24.7μg Cas9和8.6μggRNA)的纳米脂质体-微泡缀合物处理 2小时，然后用Cas9的抗体进行免疫染色。其共聚焦激光扫描显微术图像图7中在示出。对于免疫染色，将细胞内Cas9蛋白使用Cas9一抗(兔)标记，然后使用二抗CFL-488标记，然后通过共聚焦激光扫描显微术成像。基于包含SEQ.ID.NO:33的指导RNA的结果在图7中示出。
在图7中，DAPI示出了DNA染色的图像，Cas9示出了Cas9蛋白的 CFL-488染色的图像，并且合并示出了其组合的图像。参考图6，可以看到由于用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物进行处理，Cas9蛋白被有效地注射到真皮乳头细胞的细胞核中。
同时，由SEQ.ID.NO:3的指导RNA识别的人基因组DNA的位置在图8A中示出(绿色的加下划线)。参考其，借助于根据本发明的纳米脂质体-微泡缀合物，20个碱基的序列被指导RNA识别，并且PAM(protospacer adjacent motif，前间区序列邻近基序)(AGG序列)位点被Cas9蛋白切割，由此证实了在经切割的DNA的自修复期间一个DNA序列的切割(从用实施例2的纳米脂质体-微泡处理的细胞中直接提取基因组DNA，并且通过Bionia Inc.提供的测序服务鉴定图8A中所示的切割的序列的位置)。
测试例2-3.SRD5A2表达的测定-mRNA表达水平的测量
将真皮乳头细胞用浓度为Cas9:gRNA(24.7μg:8.6μg)的在本发明中制备的纳米脂质体-微泡处理2小时，然后使用TRIzol(Invitrogen)从收集的细胞中提取总RNA，并使用SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio) 合成cDNA。
使用SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)和AB Step One Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)进行用于测量SRD5A2的mRNA 表达的实时PCR。用于检测的引物的碱基序列如下。
SRD5A2有义：GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2反义：CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH有义：GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH反义：AGGGATCTCGCTCCTGGAA
以上结果在图8B中示出，从其中可以证实由于用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物进行处理，在真皮乳头细胞中SRD5A2的mRNA表达显著地降低。
测试例2-4.SRD5A2表达的测定-蛋白质表达水平的测量
在与mRNA表达测试相同的条件下处理实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物，不同之处在于重复用纳米脂质体-微泡缀合物处理的次数在每天1 至5次的范围内变化。收集真皮乳头细胞(DPC)测试组，并用RIPA缓冲液(Sigma)处理这些细胞并从中提取蛋白质，然后使用SRD5A2 ELISA 试剂盒(Antibodies-online)鉴定SRD5A2蛋白的表达。此处，对对比例1至4的组合物进行相同的测试。
结果，如从下表7和图9中明显的，与未用纳米脂质体-微泡缀合物处理的组(对照)不同，随着重复使用根据本发明实施例2的组合物的过程的次数增加，SRD5A2蛋白表达水平降低，并且该降低维持5天或更久。
[表7]
类别 在细胞处理的第5天SRD5A2蛋白表达(倍数)
未处理组 1.00
实施例2处理5次的组 0.43
对比例1处理5次的组 0.75
对比例2处理5次的组 0.99
对比例3处理5次的组 0.85
对比例4处理5次的组 0.98
<测试例3.细胞生存力和增量速率的测量>
测试例3-1.活/死细胞
将真皮乳头细胞用在实施例2中最终获得的浓度为Cas9:gRNA(24.7 μg:8.6μg-在全部的培养液中24.7μg Cas9和8.6μg gRNA)的纳米脂质体- 微泡缀合物重复处理2小时，每天一次，持续共五天(处理标准每天一次，与测试例2-4相同的条件)。此后，为了诱导导致毛发脱落的真皮乳头细胞的凋亡条件，将用于测试的真皮乳头细胞使用新的培养基用2μm钙黄绿素AM(钙黄绿素乙酰氧基甲酯)和4μM EthD-1(乙啶均二聚体-1) 在25℃下处理30分钟。
通过使用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit(Thermo)对细胞进行荧光染色并使用共聚焦激光扫描显微术成像来评价细胞存活和凋亡。通过由钙黄绿素AM识别细胞中酯酶的活性，活细胞显示绿色荧光，并且 EthD-1(乙啶均二聚体-1)穿透死细胞的受损细胞膜从而进入细胞并与核酸结合，从而显示红色荧光。
结果在图10中示出，可以看出细胞生存力随着用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物处理的重复次数而提高。
测试例3-2.细胞生存力的测量
通过WST-1测定(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit)来测量细胞生存力。将DPC以1×104/孔的密度在96孔板中培养24小时，然后用实施例3 和对比例3、4、5和6各自的纳米脂质体-微泡缀合物处理，然后将培养基替换为用包含各个不同浓度(200μM、400μM)睾酮的新培养基，并且在24小时之后，向其添加WST-1试剂。WST-1试剂以培养液的10％的量添加，并在1小时之后，在460nm下测量吸光度，由此将细胞存活和增殖与对照(未处理组)进行比较。在用纳米脂质体处理之后，以24小时的间隔评价细胞存活，持续5天。
此处，图11A示出了用单独纳米脂质体-微泡缀合物处理的细胞测试组的结果，其中细胞生长良好而没有纳米脂质体-微泡缀合物的毒性，并且图11B和11C示出了用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物处理然后用 200至300μM睾酮处理之后的细胞测试组的结果，其中细胞存活和增殖随着重复使用纳米脂质体-微泡缀合物的过程的次数而显著提高，这些结果表明，本发明实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物可以有效地抑制睾酮介导的细胞凋亡。
<测试例4.睾酮转化为二氢睾酮的量的测量>
在用本发明实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物编辑细胞中的SRD5A2 基因之后，评价睾酮是否实际上转化为二氢睾酮(DHT)。以与测试例3-2 中相同的方式用纳米脂质体-微泡缀合物处理细胞，然后使用包含睾酮(0 至400μM)的新培养基处理24小时。
结果在图12中示出，其中在对照(未处理组)中，二氢睾酮的表达水平与睾酮的处理浓度成比例地提高，但是在用实施例2的纳米脂质体- 微泡缀合物处理的组中，即使当睾酮的处理浓度高时，二氢睾酮蛋白的表达没有相对地提高。因此，可以得出结论：本发明的组合物抑制毛发脱落的进展。
<测试例5.胱天蛋白酶-3活性的测量>
使用caspase-3assay kit(Cell Signaling)测量胱天蛋白酶-3活性。如在先前测试中的那样，用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物处理真皮乳头细胞1至5天，然后使用包含睾酮(200μM、400μM)的新培养基进一步处理24小时。此后，从细胞中提取蛋白质，并将提取的蛋白质与200 μL1×测定缓冲液A和底物溶液B混合，并在37℃下反应30分钟。在反应之后，在380nm的激发波长和440nm的发射波长下测量荧光值，从而确定胱天蛋白酶-3活性。
以上结果在图13中示出，从其中可以得出结论：在编辑SRD5A2基因之后用睾酮处理时，随着重复使用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物的过程的次数，胱天蛋白酶-3活性显著降低。
<测试例6.对纳米脂质体-微泡缀合物在小鼠模型中抑制毛发脱落的效果的评价>
测试例6-1.小鼠真皮组织DNA中指导RNA活性的评价
为了在小鼠真皮乳头组织细胞中比较sgRNAm1、m2、m3、m4和 m5(SEQ.ID.NO:16、17、18、19和20)的效率，获得了小鼠真皮组织并从中提取DNA。使用以下引物对提取的DNA进行PCR过程以得到各个模板片段(500bp)：用于sgRNAm1和m2的正向引物：CTCTTTGGACTATTTTGTGGCTT和反向引物： AAGACTGGGAACATTTGGTTTGT，用于sgRNAm3和m4的正向引物： GGCAGGAAGCCCCTCAGGGAGAT和反向引物： AATGTGACCGGCTGCTTCAAGTT，以及用于sgRNA 5的正向引物： AACCCAAAACCAAACACAAAACC和反向引物：GGGTCATAGACATGTGCACCATG。然后，将经纯化的Cas9蛋白单独或与sgRNAm1、m2、m3、m4和m5(SEQ.ID.NO:36、37、38、39和40) 组合向其添加。
参考图14，在使用单独的经纯化的Cas9蛋白的测试组中，由于缺乏指导RNA，片段未被Cas9蛋白切割，并且在使用经纯化的Cas9蛋白和 sgRNA m1、m2、m3、m4和m5(SEQ.ID.NO:36、37、38、39和40) 的组合的测试组中，片段被Cas9蛋白切割。具体地，sgRNAm1(SEQ.ID. NO:36)的效率被评价为最高，并且因此在所有后续小鼠测试中使用包含SEQ.ID.NO:36的指导RNA的那些。
测试例6-2.作为用于在小鼠中改善和治疗毛发脱落的治疗剂的效率的评价
使用动物脱毛器(Philips)和除毛膏(Veet)脱去每只6周龄小鼠 (C57BL/6J)背部的毛发，并且在对照2和测试组1、2和3中，每天在其上施用溶解在丙二醇和乙醇的混合溶液(3:7(v:v))中的睾酮(30 μg/mL)，从而制造类似于人毛发脱落的环境。在对照1中，在脱毛之后未进行处理。在测试组1、2和3中，在每只小鼠的整个脱毛背上使用塑料刮铲以每次200μL的量施用本发明实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物 (200μL，纳米脂质体-微泡以2:1的比缀合并且分散)，并且在3分钟之后，使用医用超声波仪进行超声。使用实施例2的缀合物的处理在测试组 1中进行一次，在测试组2中进行3次，并且在测试组3中进行5次。
以上结果在图15中示出。在对照2中，由于睾酮的作用，21天之后头发少量生长，而在用实施例2的缀合物处理三次和五次的测试组(测试组2和3)中，与对照2相比相对大量的头发生长。
测试例6-3.小鼠中的SRD5A2表达-mRNA表达水平的测量
用根据本发明的实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物(Cas9:gRNA(74 μg:26μg))处理小鼠，并在24小时后，获得小鼠皮肤，并且使用TRIzol (Invitrogen)从其中提取总RNA，并使用SuprimeScript RT premix 2x (GeNetBio)合成cDNA。
使用SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)和AB Step One Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)测量用于测量SRD5A2的mRNA 表达的实时PCR。因此，用于检测的引物的碱基序列如下。
SRD5A2有义：GGCCTCTTCTGCGTAGATTA
SRD5A2反义：CACCCAAGCTAAACCGTATG
GAPDH有义：GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH反义：AGGGATCTCGCTCCTGGAA
以上结果在图16中示出，从其中可以得出结论：由于用实施例2的纳米脂质体-微泡缀合物进行处理，在真皮乳头细胞中SRD5A2的mRNA 表达显著降低。
总之，本发明的纳米脂质体-微泡缀合物能够从根本上抑制诱导毛发脱落的SRD5A2的表达，由此纳米脂质体-微泡缀合物对治疗雄性毛发脱落非常有效。
<110> Moogene Medi Co., Ltd.
<120> 包封CAS9蛋白、抑制SRD5A2基因之基因表达的指导RNA和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体-微泡缀合物，以及用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物
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<400> 31
guguacucac ugcucaaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 32
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 32
aggggccgaa cgcuuguaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 33
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 33
acuauauauu gcgccagcuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 34
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 34
cacagacaua cgguuuagcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 35
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 35
uccauucaau gaucucaccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 36
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠的gRNA
<400> 36
acagacaugc gguuuagcgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 37
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠的gRNA
<400> 37
cgcgcaauaa accagguaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 38
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠的gRNA
<400> 38
uccauucaau aaucucgccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 39
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠的gRNA
<400> 39
uccugggcga gauuauugaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 40
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠的gRNA
<400> 40
agcccggaga ggucaucuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
<210> 41
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 乱序gRNA
<400> 41
gcacuaccag agcuaacuca 20

Claims (3)

1.纳米脂质体-微泡缀合物，其中Cas9蛋白、抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和聚乙烯亚胺的复合物包封在纳米脂质体中，
其中所述抑制SRD5A2基因表达的指导RNA包含SEQ.ID.NO:1、2、3、4或5的碱基序列，
所述纳米脂质体的特征在于，包含卵磷脂、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)，并且结合够识别内皮联蛋白(endoglin)的单克隆或多克隆抗体，
所述微泡包含1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、联十六烷基磷酸酯、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-2000-N-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
2.用于改善或治疗毛发脱落的组合物，其包含权利要求1所述的纳米脂质体-微泡缀合物。
3.制备权利要求1所述的纳米脂质体-微泡缀合物的方法，所述方法包括：
通过将纳米脂质体与微泡混合来形成纳米脂质体-微泡缀合物，
所述纳米脂质体通过以下制备：
S1)制备Cas9蛋白、包含SEQ.ID.NO:1、2、3、4或5的碱基序列的抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和聚乙烯亚胺的复合物，并通过将卵磷脂、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)在氯仿中混合来制备脂质膜组合物；
S2)向所述脂质膜组合物添加所述Cas9蛋白、包含SEQ.ID.NO:1、2、3、4或5的碱基序列的抑制SRD5A2基因表达的指导RNA和聚乙烯亚胺的复合物并进行超声；
S3)对经超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声；
S4)对在S3中进行超声的脂质膜组合物进行离心并回收沉淀的纳米脂质体；以及
S5)使用琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己酸酯]]及其磺酸酯使能够识别内皮联蛋白(endoglin)的单克隆或多克隆抗体与在S4中获得的所述沉淀的纳米脂质体结合，并且
所述微泡通过以下制备：
A)通过将1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、联十六烷基磷酸酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-2000-N-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯在氯仿中混合来制备脂质膜组合物；
B)将葡萄糖溶液添加至步骤A并进行超声；
C)对在步骤B中进行超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声；以及
D)通过将疏水性气体引入到在步骤C中进行超声的脂质膜组合物中来制备微泡。
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