CN117599199A - 用于靶蛋白水解的聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于靶蛋白水解的聚合物及其制备方法和用途。本发明的聚合物结合有靶蛋白配体和E3连接酶配体，该聚合物能够解决现有递送系统在水溶性、药动性质和细胞膜渗透性等方面存在的递送问题。同时，本发明制备的聚合物可以组装形成纳米颗粒，在体内具有天然的靶向性。此外，本发明的聚合物为“多接头”型分子，其结合靶蛋白的侧链配体分子和招募E3连接酶的配体分子数量和比例均可灵活调节，有利于构建组合库进行优化，从而获得最佳蛋白降解效率。

Description

用于靶蛋白水解的聚合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及蛋白质靶向降解技术领域，具体涉及用于靶蛋白水解的聚合物及其制备方法和用途。
背景技术
基于泛素-蛋白酶体系统的靶向蛋白降解嵌合体(PROTAC)是近年来药物研究领域的一个新兴方向，受到广泛关注。细胞内的泛素-蛋白酶体系统是胞内蛋白质降解的主要途径(被授予2004年诺贝尔化学奖)，由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去泛素化酶和蛋白酶体构成，能够对胞内的有害蛋白(“垃圾蛋白”)进行泛素标记，并将该蛋白引导进入蛋白酶体(“垃圾清理系统”)中，降解成肽段或氨基酸。其中，E3泛素连接酶负责对目的蛋白选择性地进行泛素化，进而使其被蛋白酶体识别和降解，是该系统的关键酶。
在此基础上，耶鲁大学的Craig Crews教授开创性地提出靶向蛋白降解嵌合体(简称PROTAC)“双接头”分子设计策略，利用细胞自身的蛋白质降解机制(泛素-蛋白酶体系统)，靶向降解胞内特定蛋白。具体而言，PROTAC为一种“双接头”分子，由一个连接臂和两个配体(一般为小分子)组成，其中，一个配体分子可与靶蛋白相结合；而另一个配体分子可以与E3泛素连接酶相结合。PROTAC进入细胞后，可结合靶蛋白，并招募E3泛素连接酶，对靶蛋白进行泛素化标记，并将其引导进入蛋白酶体系统中进行降解。近年来，PROTAC已经成为一种全新的药物设计策略，已有多个PROTAC分子进入临床研究阶段，进展顺利。正是由于良好的前景，PROTAC被Nature、Science等顶级期刊以专稿形式进行报道，并被称为药物治疗的“下一个重磅疗法”。
PROTAC由于活性超高，在药物设计开发设计方面潜力巨大。PROTAC分子的优势主要表现在：①具有超高活性。PROTAC分子可对靶蛋白进行彻底降解(而非传统的蛋白抑制机理)，且可循环降解多个靶蛋白分子，具有催化活性，因此，理论上只需要极低剂量即可实现极强效果。②PROTAC策略特别适宜于针对具有多种突变体的蛋白进行药物设计。PROTAC分子降解蛋白的过程是一种“Event-driven(事件驱动)”的行为，即只要与靶蛋白结合即能将其有效降解，对PROTAC分子与靶蛋白之间结合力相对要求不高，因此，PROTAC往往对其靶蛋白的多种突变体均有效。③PROTAC策略比传统大规模筛选小分子药物的研发模式更理性，可在现有活性不足的小分子抑制剂或者激动剂的基础上进行设计，改造成蛋白降解剂，发挥相应的生物活性。④PROTAC在细胞内一旦与靶蛋白结合，即可催化降解，起效速度较快，通常在给药后15分钟到1小时即产生蛋白降解效应。
然而，PROTAC由于本身分子结构的原因，仍存在药物递送和筛选优化问题相关问题。这些问题具体体现在：①在细胞转运方面，存在不易入胞的问题。PROTAC分子包含两个配体分子和一个连接臂，相比传统小分子药物往往更难跨膜转运入胞，制约了其药理作用的充分发挥；②在体内转运方面，亦普遍存在给药方面的一些问题。PROTAC分子不符合传统药物化学的成药性规则(即类药性五规则)，溶解度普遍较差，导致体内给药困难、药动性质不佳等问题。③在优化筛选方面，存在结构配比单一，靶蛋白与E3连接酶配体比例受限的问题。单一固定配比只能通过调整linker来进行筛选，手段单一，限制性强，不利于建立组合库进行高通量筛选和优化。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决PROTAC存在的药物递送以及优化筛选相关问题。本发明合成了一种具有能以多价的方式结合并降解靶蛋白的聚合物，其能够以纳米粒的方式递送入胞，解决PROTAC的递送问题，多接头的设计便于高通量筛选和优化。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物结合有靶蛋白配体和E3连接酶配体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物包括含有靶蛋白配体的第一结构单元和含有E3连接酶配体的第二结构单元。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述第一结构单元与所述第二结构单元之间含有1-200个结构单元。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物的第一结构单元和所述第二结构单元各自分别选自2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯单体、小分子化合物、氨基酸、核酸分子、cIAP配体、MDM2配体、Von Hippel-Lindau配体或cereblon配体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述靶蛋白配体为第一结构单元的基团，或通过活性基团连接的配体；和所述E3连接酶配体为第二结构单元的基团，或通过活性基团连接的配体，优选地，所述活性基团包括但不限于氨基、羧基、巯基、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、双键、三键和叠氮中的至少一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述第一结构单元含有的配体包括但不限于7元环、小分子化合物、适配体、蛋白、核酸分子、细胞代谢物、药物、激素、金属离子、糖、肽段、抗体或其片段。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物包括但不限于基于2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯的聚合物、壳聚糖、基于乳酸和/或羟基乙酸的聚合物、基于氨基酸的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物、多肽或其组合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物选自无规共聚物、嵌段聚合物或均聚物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其中，所述聚合物的分子量为2000-20000。在某些实施方案中，分子量是指数均分子量。在某些实施方案中，分子量是指重均分子量。
本发明的第二方面，提供一种用于靶蛋白水解的聚合物的制备方法，其包括：
(1)制备含有靶蛋白配体的第一结构单元；
(2)制备结构构建单元；
(3)使所述第一结构单元、结构构建单元和含活性基团的化合物合成无规共聚物；
(4)使所述无规共聚物连接含有E3连接酶配体的第二结构单元。
本发明的第三方面，提供本发明所述的聚合物在用于降解靶蛋白中的用途。
本发明的第四方面，提供一种用于降解细胞内靶蛋白的方法，其包括使本发明所述的聚合物与细胞接触并进入细胞内的步骤。
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的聚合物和药物学可接受载体。
本发明解决了常规PROTAC在递送方面存在的一些基本问题。本发明的聚合物以递送系统形式给药，有利于解决PROTAC分子在水溶性、药动性质和细胞膜渗透性等方面存在的递送问题。
蛋白降解聚合物以递送系统形式给药，有利于解决PROTAC分子在水溶性、药动性质和细胞膜渗透性等方面存在的递送问题。蛋白降解聚合物多为两亲性聚合物(或以第一和第二结构单元作为疏水性部分)，可以制成纳米颗粒(小微粒悬液可供静脉注射)的形式给药，具有体内长循环功能，并具有细胞膜促透性，可有效规避传统PROTAC存在的递送问题。除此之外，蛋白降解聚合物还具有被动靶向性，蛋白降解聚合物纳米载体系统经体内给药后，极易分布至肿瘤、炎症等高代谢的疾病部位，蛋白降解聚合物可以直接靶向靶器官，因此在治疗疾病方面具有独特优势。
本发明的聚合物在分子结构设计和增强蛋白降解效率方面具有明显优势。从分子结构设计的角度，常规PROTAC为“双接头”分子，两个配体分子之间摩尔比通常只能为1：1，难以优化；而本发明的聚合物为“多接头”型分子，其结合靶蛋白的侧链配体分子和招募E3连接酶的配体分子数量和比例均可灵活调节，有利于构建组合库进行优化，获得最佳蛋白降解效率。
附图说明
图1示出了本发明设计的靶向蛋白降解聚合物示意图。
图2示出了RA患者滑膜中STING信号被激活。a.STING(红色)、FAPα(绿色)和DAPI(蓝色)的mIF染色的代表性图像(n＝3)。比例尺：20μm(上)，5μm(下)。STING和FAPα的共免疫染色显示STING在RA的FAPα+FLS中高度表达。b.STING和P-IRF3的mIHC的代表性图像(n＝3)。比例尺：100μm(上)，20μm(下)。c.RA和OA滑膜中FAPα+阳性细胞数(％，n＝3)***P＜0.001。d.RA和OA滑膜STING阳性细胞数(％，n＝3)**P＜0.01。e.STING与FAPα+在RA和OA滑膜中的共定位细胞(％，n＝3)***P＜0.001。组织学评分显示STING(f)和P-IRF3(g)在RA滑膜中高度表达(n＝3)*P<0.05、**P<0.01。h.OA和RA患者原代滑膜成纤维细胞的分离、蛋白质提取和蛋白质印迹检测(n＝3)。i.STING、P-STING、P-TBK1和P-IRF3在RA和OA滑膜中的相对表达水平(n＝3)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01。j.分离来源于正常(Nor)和AIA(模型)大鼠的原代滑膜成纤维细胞，蛋白质提取和蛋白质印迹检测(n＝3)。k.STING、P-STING、P-TBK1和P-IRF3在AIA模型和正常大鼠滑膜中的相对表达水平(n＝3)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3为PolyTACs的合成、表征和初步蛋白质降解。a.PolyTACs聚合物纳米颗粒和PEG-b-P(C7A70-r-E3Ln-AMA4-n)共聚物的化学结构的示意图。在纳米颗粒状态(pH>pHt)下，相关的PolyTACs纳米探针由于荧光猝灭而保持“非活性”状态。在聚合物状态(pH<pHt)下，聚合物离解导致荧光活化为“活性”状态。b.PC7A和PolyTACs 1-3。c.PolyTACs-1/2的TEM图像分别在较高pH 7.8和较低pH 6.3下呈现，比例尺为100nm。d.折线图显示了PolyTACs纳米探针的归一化荧光强度作为pH的函数。相对荧光强度标准化为(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)，其中F是不同pH条件下染料缀合的聚合物溶液的荧光强度，Fmax(Fmin)是最大(最小)荧光强度。e.用PolyTAC-1(9.6μM)和PolyTAC-2(9.6μM)处理的THP1细胞显示出TBK1/IRF3磷酸化作用的减少，随后STING降解，而用PolyTAC-3(9.6μM)处理的THP1没有显示出降解作用。f.用PolyTAC-1(9.6μM)和PolyTAC-2(9.6μM)处理的Jurkat细胞显示出TBK1/IRF3磷酸化作用降低，随后STING降解，而用PolyTAC-3(9.6μM.)处理的Jurkat细胞没有显示出降解作用。g.STING在THP-1细胞中的相对表达水平(n＝3)*与NC(阴性对照)组相比，***P<0.001。h.STING在Jurkat细胞中的相对表达水平(n＝3)*与NC组相比P＜0.05、***P＜0.0001。i.随着PolyTAC-1浓度的增加，在一定浓度范围内(0、2.4μM、4.8μM、7.2μM、9.6μM、12μM、14.4μM)，PolyTAC-1的降解效果随着PolyTAC1浓度的增加而逐渐增强。j.STING在Jurkat细胞中的相对表达水平(n＝3)****P<0.0001。
图4示出了PolyTACs在原发性FLS中降解STING和抑制STING/IRF3途径的有效性。a.在用PolyTAC-1(12μM)处理的AIA大鼠的原代FLS中，从第12小时开始观察PolyTAC-1的降解作用。b.STING在AIA大鼠原发性FLS中的相对表达水平(n＝3)****与0h组相比P＜0.0001。c.用PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)治疗AIA大鼠的原发性FLS显示TBK1/IRF3磷酸化作用减少，随后STING降解。d.STING、P-STING、P-TBK1、P-IRF3在AIA大鼠原发性FLS中的相对表达水平(n＝3)***P＜0.001、***P＜0.0001。e.随着PolyTAC-1浓度的增加，在一定浓度范围内(0、2.4μM、4.8μM、7.2μM、9.6μM、12μM、14.4μM)，PolyTAC-2的降解效果随着浓度的增加而逐渐增强。f.STING、P-STING、P-TBK1、P-IRF3在RA患者原发性FLS中的相对表达水平(n＝3)***P＜0.001、***P＜0.0001。g.RA患者原发性FLS中STING(红色)和P-IRF3(绿色)的细胞内丰度和分布。h.STING和P-IRF3的平均荧光强度(n＝4)，***P<0.0001，**P<0.01，ns(无显著性)与NC组相比。i.接受TNF-α(4ng/ml)治疗的RA患者的原发性FLS显示STING通路的激活更强，进一步治疗PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)显示TBK1/IRF3磷酸化作用降低，随后STING降解**与TNF-α治疗的原发性FLS相比。此外，当用PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)处理TNF-α诱导的细胞24小时时，观察到PolyTAC-1和PolyTAC-2有效降解STING并抑制下游STING/P-IRF3信号通路(j)。
图5示出了对PolyTACs内吞和降解途径的探究。a-b.纳米颗粒的细胞摄取。培养HeLa细胞直到达到80％汇合，随后在不同时间点引入Cy3缀合的纳米颗粒。纳米粒子处理后，更换细胞培养基，并使用Lyso Tracker标记溶酶体。随后，利用共聚焦显微镜观察Cy3标记的纳米颗粒和Lyso-Tracker标记的溶酶体的共定位。HeLa细胞摄取PolyTACs的共聚焦显微镜分析。a.将PolyTACs纳米颗粒与HeLa细胞孵育不同时间。溶酶体由Lyso跟踪器(蓝色)指示。使用ImageJ软件通过Lyso和NP之间的相关性确定PolyTACs的溶酶体定位，比例尺：10μm。b.统计图。c.RA患者原发性FLS中STING(红色)和CRBN(蓝色)的细胞内丰度、分布和共定位。如白色箭头所示，STING和CRBN的共同定位显示为粉红色斑点。比例尺：20μm。d.STING(n＝4)和CRBN(n＝4)。e.接受PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)治疗的RA患者的原发性FLS显示，随着STING的降解，TBK1/IRF3磷酸化作用降低，PS-341(蛋白酶体抑制剂，7.5nmol/l)可以逆转这种作用。f.STING、P-STING、P-TBK1、P-IRF3的相对表达水平(n＝3)****与NC组相比P＜0.0001#与用PolyTAC-1治疗的FLS相比++++P＜0.0001。
图6示出了PolyTAC-1和PolyTAC-2在体内的靶向分布特征和STING的降解改善了RA病理。a.AIA模型大鼠生物分布的代表性IVIS图像。PolyTAC-2在体内表现出靶向聚集，并且从第8小时起在AIA模型大鼠的患肢关节中观察到PolyTAC-1和PolyTAC-2的靶向聚集。Nor、AIA模型、PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)、对照组(12μM)踝关节肿胀(b)、HE(c)和番红-O/固绿染色(d)的代表性图像。e.每5天评估一次关节肿胀厚度(每组n＝6只大鼠)。f.每5天评估一次多关节炎指数(PI)(每组n＝6只大鼠)。HE(g-i)滑膜增生、软骨破坏和骨侵蚀的组织学评分，n＝3#与正常组比较，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001*与AIA模型相比，P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns(无显著性)。j.Nor、AIA模型、PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)、对照组(12μM)踝关节切片STING的代表性IHC染色。k.ELISA法检测血浆中IFNα、IFNβ、TNFα、IL-6和IL-17，发现PolyTAC-1、PolyTAC-2显著抑制STING诱导的AIA模型IFNα，IFNβ，TNFα、IL-6和IL-17的分泌。与AIA模型相比，n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7为PC7A和PolyTAC-1/2/3的合成路线(含有或不含有染料)。a.2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(iii)的合成方法。试剂和条件：(Ⅰ)TEA，DCM，RT，过夜。b.合成PEG-Br(vi)的步骤。试剂和条件：(Ⅱ)TEA，DCM，RT，过夜。c.合成PEG-PC7A-r-AMA(ix)的步骤。试剂和条件：(Ⅲ)CuBr2，TPMA，AIBN，DMF，IPA，70℃，48h.d，PC7A，PolyTACs 1-3和染料偶联的PolyTACs 1-3(xii)的合成方法。试剂和条件：(Ⅳ)TEA，DCM，RT，过夜。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
用于靶蛋白水解的聚合物
本发明的一方面，提供一种用于靶蛋白水解的聚合物，“靶蛋白”可以是本领域技术人员希望在细胞或哺乳动物例如人受试者中选择性降解的任何多肽或蛋白质，本文也可称作“感兴趣的蛋白，POI”。本发明中，靶蛋白的选择性降解将会降低蛋白质水平，从而降低靶蛋白在细胞中的作用，基于对蛋白质水平的控制可以提供对疾病或病症的治疗或改善。靶蛋白包括具有生物学功能或活性，如结构、调节、激素、酶促、遗传、免疫、储存、运输和信号转导功能和活性的任何蛋白质和多肽。
在某些实施方案中，靶蛋白的实例包括但不限于结构蛋白、受体、酶、细胞表面蛋白，与细胞整合功能(包括参与催化活性、表观遗传调控、芳香化酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成)相关的蛋白，具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节活性、信号转导活性、结构分子活性、结合活性、受体活性、细胞活力、膜融合、细胞通讯、生物学过程调节、发育、细胞分化、受刺激反应相关的蛋白质，行为蛋白，细胞粘附蛋白，参与细胞死亡的蛋白，参与运输的蛋白质等。
本发明中，靶蛋白可以包括来自真核生物和原核生物的蛋白质，包括哺乳动物，如人、驯养动物，微生物，病毒，真菌和寄生虫，以及用于药物治疗的众多其他靶点。优选地，靶蛋白包括但不限于STING、ALK、FAK、PRMT5、PLK1等。
本发明中，靶蛋白配体是指与靶蛋白结合的配体或部分。例如，靶蛋白结合配体可以是选择性和/或特异性结合靶蛋白的任何部分。根据本发明的用于靶蛋白水解的聚合物可以包含以足够的结合亲和力结合所述靶蛋白靶的蛋白结合配体，从而使靶蛋白比未被聚合物结合时更容易降解或发生蛋白水解。
本发明中，靶蛋白结合配体可以包含或衍生自任何已知的用作蛋白功能的调节剂、启动子和/或抑制剂的小分子(或其类似物或片段)(例如，已知与靶蛋白结合的任何小分子)。在某些实施方案中，靶蛋白配体包括STING、ALK、FAK、PRMT5或PLK1结合剂(如抗体或其片段)或小分子化合物。在一个优选的实施方案中，靶蛋白配体还可以包括与STING、ALK、FAK、PRMT5或PLK1结合的活性基团。
在一个示例性实施方案中，靶蛋白结合配体可以包括7元环，特别是含杂原子，例如氮原子的7元环。
在一个示例性实施方案中，E3连接酶配体包括Von Hippel-Lindau配体或cereblon配体。
在某些实施方案中，本发明的聚合物包括但不限于PC7A(基于2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯的聚合物)、壳聚糖、基于乳酸和/或羟基乙酸的无规共聚物(例如PLGA)、基于氨基酸的高分子聚合物(例如PLL)、聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物或多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的聚合物为PC7A，其具有下式所示的结构：
在某些实施方案中，本发明的聚合物具有通式PEG-b-P(C7A70-r-E3Ln-AMA4-n)。在优选的实施方案中，其具有以下所示的结构：
本发明中，降解可以通过测量靶蛋白在如本文所述的聚合物存在下的量和/或将其与在不存在聚合物时观察到的靶蛋白量进行比较而确定。例如，可以测定已经用本文所述的聚合物接触和/或处理的细胞中的靶蛋白的量。该量可以与未用聚合物接触和/或处理的细胞中的靶蛋白的量进行比较。如果在用聚合物接触和/或处理的细胞中靶蛋白的量降低，则可以认为该聚合物会增进和/或促进靶蛋白的降解。
本发明中，靶蛋白的量可以使用本领域已知的方法，例如，通过免疫印迹分析测试、Western蛋白质印迹分析和/或ELISA进行测定。
本发明中，水解或降解是指相较于未使用聚合物处理，向细胞施予本发明的聚合物后靶蛋白的量减少至少10％，例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
制备方法
本发明的一个方面，提供了一种用于靶蛋白水解的聚合物的制备方法，其包括(1)制备骨架结构；(2)使所述骨架结构连接含有靶蛋白配体的第一结构单元和含有E3连接酶配体的第二结构单元。在某些实施方案中，所述方案包括(1)制备含有靶蛋白配体的第一结构单元的骨架结构；(2)使所述骨架结构连接含有E3连接酶配体的第二结构单元。在优选的实施方案中，所述方案包括(1)制备含有靶蛋白配体的第一结构单元；(2)制备PEG结构单元；(3)使所述第一结构单元、PEG结构单元和AMA合成无规共聚物PEG-PC7A-r-AMA；(4)使所述无规共聚物连接含有E3连接酶配体的第二结构单元。
本领域技术人员能够理解，根据所连接配体的不同，可以选择合适的活性基团以形成所需的聚合物，活性基团的实例包括但不限于：氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、羰基(＝CO)、磺酸基(-SO3H)，此外，醛基、酮基、酯基、酰卤、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、双键、三键和叠氮等也可以用于连接配体。
本发明的聚合物还可以具有对不同环境的响应性。在一个实施方案中，聚合物为pH敏感型聚合物，其在低pH时为团聚状态，在中性pH时解聚为舒展状态。在另一个实施方案中，聚合物为温度敏感型聚合物。
用于降解细胞内靶蛋白的方法
本发明还公开一种用于降解细胞内靶蛋白的方法，其包括使本发明所述的聚合物与细胞接触并进入细胞内的步骤。根据本发明，当靶蛋白与本文所述的聚合物接触时，例如，当靶蛋白在细胞中与任何一个聚合物接触时，该靶蛋白的降解就可以发生。
在一个实施方案中，本发明的方法为体内方法。在另一个实施方案中，本发明的方法为体外方法。
药物组合物
本发明的一方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的用于靶蛋白水解的聚合物。在该组合物中，可以合适地配制聚合物，而使其能够进入细胞而诱导靶蛋白降解。
本发明中，药物学可接受载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于磷酸盐缓冲溶液和/或盐水。药物学可接受载体可以是水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。除了上述载体成分之外，上述药物组合物可替代地或另外包括合适的一种或多种其他的载体成分，如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。
本发明的药物组合物可以存在于对受试者给药药物化合物的任何典型制剂中，其实例包括但不限于胶囊、颗粒剂、片剂、粉末、锭剂、栓剂、喷雾剂、凝胶、乳膏、软膏、无菌水性制剂、无菌溶液、气溶胶、植入物等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
用途
本发明还提供聚合物在用于降解靶蛋白中的用途。本发明还提供聚合物在用于制备预防、改善和/或治疗有需要的受试者疾病的药物中的用途。所述疾病优选为自身免疫性疾病，其实例包括但不限于系统性红斑狼疮、I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、重症肌无力或多发性肌炎。在优选的实施方案中，所述疾病为GAS-STING免疫通路异常相关的疾病。
本发明使用的术语“受试者”指任何动物(如哺乳动物)，其包括但不限于即将接受特定治疗的人类、非人灵长类动物、啮齿动物以及诸如此类。
本领域技术人员能够理解，本文所述的聚合物还可以与其他药物联合用药以用于预防、治疗和/或改善疾病或病症，其他药物可以是任何有利于疾病，例如对实体瘤或血液疾病有利的治疗剂，对此不特别进行限定。
实施例1
本实施例以类风湿性关节炎作为示例性的自身免疫性疾病对本发明聚合物进行说明。
1.材料和方法
1.1材料
聚乙二醇(PEG)、三(2-吡啶甲基)胺(TPMA)、溴化铜(CuBr2)、2-(1-氮杂苯基)乙醇、甲基丙烯酰氯、偶氮二异丁腈(AIBN)、2-溴异丁溴(BiBB)、2-氨乙基甲基丙烯酸酯(2-aminoethyl methacrylate,AMA)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-((2-(2,6-二氧嘧啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)己酸酯(Thali-NHS)、2,5-二氟代吡咯烷-3-基6-(2S)-2-(3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰胺基)-5-甲基己酰胺基)己酸盐(Besta-NHS)、荧光染料。
1.2方法
1.2.1PC7A和PolyTACs的合成
1.2.1.1 2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯的合成程序(iii)
具体合成路线如图7所示，采用一步取代反应合成了2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯。具体地，将2-(氮杂-1-基)乙烷-1-醇(i，14.32g，100mmol)和三乙胺(TEA，20.24g，200mmol)溶于二氯甲烷(DCM，200ml)中，然后在冰浴下加入甲基丙烯酰氯(ii，12.54g，120mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。通过加水使反应骤冷。反应混合物用H2O(50mL×3)洗涤，用无水Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到浅黄色液体产物iii(19.00g，产率：90％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.14-6.04(m,1H),5.54(t,J＝1.6Hz,1H),4.23(t,J＝6.2Hz,2H),2.83(t,J＝6.2Hz,2H),2.76-2.68(m,4H),1.97-1.88(m,3H),1.71-1.50(m,9H)。
1.2.1.2PEG-Br(vi)的合成程序
PEG-Br是通过一步取代反应合成的。将PEG 5000(iv，8g，1.6mmol)溶于甲苯(100mL)中，然后将混合物在125℃下搅拌2小时。随后，在真空下除去甲苯，并获得用于后续反应的剩余固体。将这些固体和TEA(303.57mg，3.2mmol)溶于DCM(100mL)中，逐滴加入2-溴异丁基溴(v，441.41mg，1.9mmol)，随后将混合物在室温下搅拌过夜。随后，将反应混合物在真空下浓缩，固体用THF再溶解，然后用纯水透析2天，通过冷冻干燥获得白色絮凝固体的最终产物PEG-Br。最终产物的产率为90％(19.00g)。
1.2.1.3PEG-PC7A-r-AMA的合成程序
采用经典的连续活化剂再生-可逆加成-断裂链转移聚合(ICAR-ATRP)引发剂合成了无规共聚物PEG-PC7A-r-AMA。首先，将CuBr2(178.68μg，0.8μmol)和TPMA(232.28μg、0.8μmol)。然后加入异丙醇(IPA，20mL)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，20ml)的混合物以溶解反应物。最后，加入温育的CuBr2和TPMA。将氩气注入系统30分钟以去除氧气后，将混合物在70℃下搅拌48小时。聚合后，用15mL THF稀释反应混合物，并通过Al2O3柱除去铜，然后将残留物在蒸馏水中透析并冻干，以获得黄白色粉末ix。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.04(s,140H),3.65(s,450H),3.39(s,3H),2.73(d,J＝29.7Hz,420H),1.82(m,148H),1.61(s,560H),1.10-0.77(m,210H)。
1.2.1.4PC7A和PolyTAC(xii)的合成程序
通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与氨基酸的反应合成了PC7A和PolyTACs。具体地，将固定当量的2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)己酸盐(x，Thali NHS)或2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-6-((2S)-2-(3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰胺基)-5-甲基己酰胺基)己酸酯(xi，Besta NHS)和1当量的PEG-PC7A-r-AMA(ix)溶于DCM中，并加入2当量的TEA，在室温下搅拌过夜，蒸发DCM以获得PC7A-PolyTAC-3(xii，n＝0、1或3)。
1.2.1.5荧光染料偶联的PolyTACs的合成
染料偶联的PC7A和PolyTAC-1/2/3的合成与通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)与氨基反应合成PC7A和PolyTAC-1/2/3相同。具体地，将纯化的PC7A或PolyTAC-1/2/3和相应的染料(Cy3或NHS或ICG-OSu)溶解在DCM中，加入2当量的TEA，在室温下搅拌过夜，蒸发DCM，并通过使用纯水透析和冷冻干燥获得染料缀合的PC7A-PolyTAC-3。
1.2.2纳米颗粒的制备
所有这些纳米颗粒都是按照典型的程序制备的。简言之，将10mg共聚物溶于1.5mL四氢呋喃(THF)中。在超声处理下将聚合物溶液加入9mL Milli-Q水中，然后使用微超滤系统超滤五次以去除THF。最后，用Milli-Q水将体积固定为1mL，纳米颗粒的浓度为480μM。
1.2.3对照纳米颗粒的合成和制备
对照纳米颗粒的合成和制备方法，除在合成过程中将1.2.1.3中的C7A替换为EPA外，参见1.2.1.3和1.2.2的内容。
1.2.4透射电子显微镜分析
用PBS(pH 7.8或6.3)稀释纳米颗粒，然后将其滴到铜网上并用1％乙酸铀进行负染色。然后使用透射电子显微镜(JEOL1741200EX)对样品进行观察和拍照。
1.2.5颗粒尺寸、放置稳定性和多分散系数
用含有10％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)将纳米颗粒稀释至100μg/mL，然后在4℃和37℃下储存不同时间。最后，采用动态光散射法检测了不同条件下纳米颗粒的粒径和多分散系数的变化。
1.2.6纳米粒子的荧光活化
Lengguang Technology F97Pro获得了纳米颗粒纳米探针在不同pH缓冲溶液中的荧光激活。每个纳米颗粒的初始浓度为1mg/mL，并用不同pH值的PBS稀释至100μg/mL。纳米探针的激发光为780nm，发射光谱为790-900nm。
1.2.7细胞对纳米颗粒的摄取
培养HeLa细胞直到达到80％汇合，随后在不同时间点引入Cy3缀合的纳米颗粒。纳米粒子处理后，更换细胞培养基，并使用Lyso Tracker标记溶酶体。随后，利用共聚焦显微镜观察Cy3标记的纳米颗粒和Lyso-Tracker标记的溶酶体的共定位。
1.2.8人滑膜样品和细胞培养
滑膜标本取自符合2010年ACR诊断标准并接受了全膝关节置换手术的RA患者，以及符合2010ACR/EULAR诊断标准并在北京大学第一医院接受关节置换术的骨关节炎(OA)患者。该研究得到了北京大学第一医院医学伦理委员会的批准。
从RA患者的滑膜组织中分离人原发性FLS，切成小块，并在2mg/mL I型胶原酶(C8140，Solarbio)和0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(T1320，Solarbio)中消化4小时。离心所得细胞悬浮液，并将细胞沉淀重悬于含有10％ FBS(ST30-302P，Pan)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，C11995500BT，Invitrogen)中。孵育24小时后，通过PBS洗涤除去非粘附细胞。从第三代到第七代使用FLS，细胞类型采用本领域已知的方法得到了确认。
1.2.9动物和细胞培养
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重200-250g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本研究经北京大学第一医院动物伦理委员会批准。大鼠在尾部底部注射完全弗氏佐剂(7027，Chondrex)以构建佐剂诱导的关节炎(AIA)模型，而对照大鼠接受盐水注射。测量临床参数，包括关节肿胀厚度、多关节炎指数(PI)和组织学分析。由两名观察者记录每个后关节的关节肿胀厚度和PI，观察者对于治疗组是不知情的，然后对每只动物取平均值。采集关节组织和血液样本进行病理分析、细胞培养和炎性细胞因子分析。原代大鼠FLSs的提取和培养方案参考了先前的出版物，并且在第三代和第七代之间使用了RAFLSs。Jurkat和THP-1细胞购自中国科学院细胞库(中国上海)，并在补充有10％FBS和0.05mMβ-巯基乙醇的RPMI培养基中培养。所有细胞在37℃、5％ CO2中生长。
1.2.10苏木精和伊红(HE)、番红O(SO)/固绿染色
将解剖的组织在4％甲醛中固定48小时，然后在10％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脱钙30天。将标本包埋，切成7μm的石蜡切片，分别用HE和SO染料染色。在显微镜(VS200，Olympus，Japan)下拍摄组织学图像。使用4点量表，分别评估滑膜炎、软骨损伤和骨侵蚀，0表示组织健康完整，3表示严重关节炎。组织学评分由两名不了解分组的独立研究人员进行，然后取平均值进行分析。
12.2.11免疫组织化学(IHC)
石蜡包埋的样品被切成8μm的切片。使用目标回收溶液Tris-EDTA缓冲液和微波炉进行抗原回收10-15分钟。将切片置于3％ H2O2中30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。添加3％ BSA以均匀覆盖组织以阻断非特异性结合30分钟。将组织与抗STING(1:100，PA5-116052，Invitrogen)、P-IRF3(1:100、PA5-36775，Invitroen)的抗体在4℃下孵育过夜，并使用DAB试剂盒(G1212-200T，Servicebio)进行免疫检测。
1.2.12多重免疫组织化学(mIHC)
将4μm石蜡包埋的人滑膜组织切片用一系列分级乙醇溶液进行脱蜡和再水化，然后用柠檬酸盐缓冲液(pH 8.0)提取抗原。用3％过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性15分钟，用10％驴血清阻断非特异性结合位点。然后，将组织切片与抗STING的第一种一抗(1:100，PA5-116052，Invitrogen)在4℃下孵育过夜，然后与二抗在室温下孵育1小时。将载玻片与CY3-TSA溶液(用TBST适当稀释)在黑暗条件下孵育10分钟。通过将载玻片浸入EDTA抗原回收缓冲液(pH 8.0)中并在亚沸腾温度下保持8分钟，静置8分钟，然后再重复亚沸腾温度7分钟，进行微波处理以去除与组织结合的一抗和二抗。对第二个一抗FAPα+(1:100，AP61510，Abcepta)和二抗重复步骤。
1.2.13免疫荧光染色(IF)
共聚焦培养皿中的细胞用PBS洗涤三次，并在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟。固定后，用0.3％Triton X-100(Solarbio，China)在PBS中在室温下透化样品10-15分钟，并用驴血清在室温下封闭1小时。一抗与样品在4℃用PBS洗涤后，将样品与Alexa Fluor 488或594二抗(Abcam，China)进一步孵育。细胞核用DAPI(Beyotime，China)染色5分钟。通过荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS，Germany)观察并捕获图像。
1.2.14蛋白质印迹
用冷PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液(Beyotime，China)在冰上裂解30分钟。将裂解物在4℃下以12000rpm离心15分钟，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，China)收集上清液进行蛋白质定量。蛋白质在8-10％ SDS-PAGE凝胶中进行电泳，并转移到PVDF膜上，然后用QuickBlockTM封闭缓冲液(Beyotime，China)，然后与相应的一抗在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗一起孵育。使用ECL溶液(Beyotime，China)观察蛋白质条带，并使用自动化学发光成像分析系统(Syngene，England)检测。通过使用Image J软件对蛋白质印迹条带进行定量。
1.2.15ELISA
根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒评估大鼠血浆中TNF-α(HS044Ra，China)、IFN-α(HS1023-Ra，China)。在450nm和540nm处读取测定板。所有样本均重复运行。
2.2.16小动物活体成像系统
ICG标记的PolyTAC-2用于IVIS光谱成像。注射前用异氟烷麻醉5分钟。腹膜内注射标记的PolyTAC-2后，通过使用IVIS Lumina Series III(PerkinElmerzei)在780nm波长下对0h、8h、16h、20h和24h的荧光强度进行体内成像测量来测试ICG标记的PolyTAC-2的生物分布。
1.2.17安全评估
健康小鼠(20-30g)腹腔注射单剂量的PolyTAC-1(分别为15mg/kg和75mg/kg)和PolyTAC-2(分别为15min和75mmg/kg)，以研究PolyTACs在体内的安全性。
腹膜内注射后7天，采集大鼠的全血样本，对小鼠进行麻醉，并对包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的器官进行组织学分析。然后将血样在4℃下以3000rpm/分钟离心30分钟，取上清液立即检测。在日立7020自动生化分析仪上测定所获得血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(urea)、尿酸(UA)和总蛋白(TP)。
1.2.18统计分析
定量结果为平均值±标准偏差。学生双侧t检验用于两组比较的统计分析。对于多重比较，采用了双向方差分析(ANOVA)。P值存在显著差异<0.05。
2.结果
2.1RA患者和AIA大鼠滑膜中STING/P-IRF3通路的激活
为了研究STING在RA滑膜中的表达水平和STING/IRF3通路的激活，本发明收集了临床上RA和OA患者的滑膜组织。RA和OA的发病机制和表型有显著差异。与OA衍生的FLS22-24相比，RA FLS保持着单独增加的增殖、迁移和侵袭能力，OA通常被用作“疾病”对照，以揭示RA25的自身免疫特征。IF染色显示STING在RA患者的滑膜中高表达(图2a)。进一步的分析表明，STING和FLSs标记物FAPα+在RA样本中的表达显著高于OA样本(图2c，2d)，STING与FAPα+的共定位在RA样本中达约61％(图2e)，表明与OA组相比，STING在RA中FLSs中的表达更高。IHC显示RA患者STING和P-IRF3的荧光增加(图2b)，这是STING途径下游的标志。进一步的分析表明，RA中STING和P-IRF3的表达显著高于OA样本(图2f，2g)，表明FLSs中STING/P-IRF3通路显著激活。为了进一步验证FLSs中激活的STING/IRF3途径，我们分离了原代人FLSs并进行了蛋白质印迹分析。如图6所示，与OA患者相比，RA患者的STING、P-STING、P-TBK1和P-IRF3显著上调(图2h，2i)。此外，通过蛋白质印迹，在AIA模型的原发性FLS中也发现STING、P-STING、P-TBK1和P-IRF3的上调(图2j，2k)。这些发现表明，在RA滑膜中的FLSs中STING的高表达和STING/P-IRF3通路的激活。
2.2PolyTACs纳米颗粒的设计
为了降解STING蛋白，使用无规共聚物设计开发了PolyTACs聚合物纳米颗粒(PEG-b-P(C7A-r-E3L))。四种类型的纳米材料从先前的数据中筛选出来并用于开发，包括PC7A和PolyTAC-1/2/3(图3b)。PEG表示聚乙二醇，C7A是2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(pH敏感单体)的单体，也是STING蛋白的配体，E3L表示E3泛素连接酶配体(图3a)。通过1HNMR证实了C7A单体和聚合物PC7A的结构正确性。此外，还设计和合成了对照纳米颗粒，其不具有STING结合功能，但具有与PC7A类似的pH转变点(pHt)作为对照。根据先前的数据，具有70个C7A片段的PC7A纳米颗粒显示出最强的STING结合能力。因此，本研究中选择的所有PolyTACs纳米颗粒都含有70个C7A片段。此外，经过初步筛选，只保留了两个E3连接酶配体-沙利度胺和ubenimex，并且E3连接糖配体的数量不到四个。
2.3PolyTACs纳米颗粒的表征
PolyTAC表现出对pH敏感的活化特性，通过滴定确定PolyTAC的pH转变点为7.1。为了响应环境pH的变化，PolyTACs从缔合纳米颗粒(NPs)的状态转变为解离的聚合物(图3a)。当环境pH值高于pHt时，PolyTAC是尺寸约为30nm的球形颗粒，而当环境pH低于pHt时，纳米颗粒离解成聚合物，在透射电子显微镜下无法观察到(图3c)。此外，使用荧光激活分析研究了PolyTACs的pH敏感特性，通过荧光染料偶联，PolyTACs纳米颗粒显示为pH敏感的“活性/非活性”探针，具有高荧光激活率(“活性”和“非活性”状态之间>50倍，图3d)。随后，使用动态光散射方法检测PolyTACs纳米颗粒的长期粒径稳定性、电势和多分散指数(PDI)。结果发现，PolyTAC可以在长程内保持稳定，但PDI随着时间的增加略有增加，显示出更宽的粒度分布。
2.4PolyTACs对STING蛋白的初步降解作用
本发明进行了蛋白质印迹实验来评估PolyTACs在降解STING方面的功效。将THP-1和Jurkat细胞与PC7A(7.2μM)、PolyTAC-1(7.2μM)、PolyTAC-2(7.2μM)和PolyTAC-3(7.2μM)孵育20h。结果表明，PolyTAC-1和PolyTAC-2能够降解STING，而PolyTAC-3则不能(图3e-h)。与PC7A共孵育后，THP-1和Jurkat细胞中STING的降解与先前的报道一致。为了进一步评估浓度和降解效力之间的关系，用浓度为0、2.4、4.8、7.2、9.6、12和14.4μM的PolyTAC-2处理THP-1细胞。结果发现，在2.4μM时观察到降解效果，在一定的浓度范围内，浓度与降解效果呈正相关(图3i，3j)。
2.5PolyTACs降解STING并抑制STING/P-IRF3信号通路
为了进一步评估PolyTACs在动物模型和人类中降解STING的功效，本发明首先检测了其对AIA大鼠原发性FLS STING激活的影响。从AIA模型和正常大鼠中分离出原发性FLS，并进行蛋白质印迹分析。用PolyTAC-1(12μM)处理FLSs 0、1、6、12、18、24小时，发现从12小时开始观察到降解效果，在12-24小时范围内，PolyTAC-1的降解效率随着孵育时间的增加而增加(图4a、4b)。
接下来，本发明研究了PolyTACs在调节STING/P-IRF3通路中的作用。在该部分中，选择STING抑制剂H-151作为阳性药物对照组。H-151是STING的一种强效、选择性和共价拮抗剂，在细胞和体内都具有显著的抑制活性。用PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)处理后，P-STNG、P-TBK1和P-IRF3的水平降低，表明STING/P-IRF3途径被PolyTAC-1、PolyTAC2和H-151抑制(图4c、4d)。
为了进一步研究PolyTACs对人类原发性FLS中STING的潜在降解，从RA患者中分离出原发性FL，并用浓度为0、2.4、4.8、9.6、12、14.4、19.2和24μM的PolyTAC-1对其进行治疗。如图4e和4f，在2.4μM时观察到降解效果，在0-12μM的一定浓度范围内，浓度与降解效果呈正相关，这与AIA大鼠的结果一致。然而，在该范围之外，没有观察到降解效果随着浓度的增加而增强。IF染色显示，用PolyTAC-1(12μM)和PolyTAC-2(12μM)处理导致原发性RA FLSs中STING的降解，STING和P-IRF3均减少(图4g，4h)。在RA进展的炎症级联反应中，TNF在促进FLSs的激活中发挥关键的促炎细胞因子作用。活化的FLS反过来通过产生趋化因子、炎性细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPS)，促进炎症周期和软骨破坏。为了研究STING信号通路在RA炎症级联反应中的激活，本发明用TNF-α(4ng/ml)刺激RA患者的原发性FLS，并观察到STING及其通路下游分子(包括P-TBK1和P-IRF3)的表达升高。这些发现表明RA的炎症级联反应可以进一步促进STING信号通路的激活。此外，当用PolyTAC-1(12μM)、PolyTAC-2(12μM)和H-151(2μM)处理TNF-α诱导的细胞24小时时，观察到PolyTAC-1和PolyTAC-2有效降解STING并抑制下游STING/P-IRF3信号通路(图4i、4j)。
2.6PolyTACs内吞和降解途径的机制
PolyTACs纳米粒子表现出良好的细胞质效应，可以逃离溶酶体，在细胞质中发挥蛋白质降解作用。如图5a、5b所示，纳米颗粒和溶酶体的共定位在12小时内逐渐增加，表明在此阶段进入细胞的纳米颗粒数量持续增加。12小时后，纳米颗粒与溶酶体的共定位逐渐降低，表明纳米颗粒被释放到细胞质中。PolyTACs与溶酶体共定位的时间分析与PolyTACs开始发挥其蛋白质降解作用的时间一致。
为了进一步研究PolyTACs的降解机制，确定PolyTACs通过细胞内蛋白酶体降解STING的作用，并且PolyTACs对STING的降解是以大的复合物的形式降解STING和CRBN，本发明使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体，然后通过免疫荧光染色和蛋白质印迹观察PolyTACs蛋白质降解能力的变化。本发明用PolyTAC-1、PolyTAC-2、PolyTAC-1和PS-341、PolyTAC-2和PS-341治疗原发性人类FLS。如图5c、5d所示，PolyTAC-1和PolyTAC-2处理显著降低了细胞中STING和CRBN蛋白的水平，进一步验证了PolyTAC-1、PolyTAC-2对STING蛋白的降解作用。此外，CRBN水平的降低也证实了STING蛋白以与CRBN的大的复合物的形式被降解。蛋白酶体抑制剂PS-341可以在很大程度上阻断PolyTAC-1和PolyTAC-2对STING和CRBN蛋白的降解，表明PolyTAC-1或PolyTAC-2确实在通过蛋白酶体降解蛋白质中发挥作用。
在PS-341的参与下，通过蛋白质印迹进一步验证了PolyTAC-1和PolyTAC-2对STING蛋白的降解及其对STING下游信号通路的影响。如图5e、5f所示，PolyTAC-1和PolyTAC-2可以降解STING并抑制STING/IRF3途径，而PS-341可以逆转这些作用，充分证实了蛋白酶体在PolyTAC-1、PolyTAC-2降解蛋白质中的作用。
2.7PolyTAC在AIA模型中抑制STING信号并减轻炎症
为了研究PolyTACs在RA发展和进展中的作用，本发明建立了AIA模型，这是一种典型的类风湿性关节炎建模方法，也是应用最广泛的大鼠RA模型。为了研究PolyTACs在体内的生物分布，构建了ICG标记的PolyTAC-2，并在大鼠模型中进行腹膜内注射(10mg/kg)。使用小动物活体成像系统，通过荧光成像测量施用后0、8、16、20和24小时的关节中ICG标记的PolyTAC-2的荧光强度，早在8小时就观察到关节炎关节中的荧光信号。荧光聚集强度逐渐增加到最大值，然后呈下降趋势。而正常组大鼠关节处的荧光强度始终为零(图6a)。对24小时时关节炎部位的荧光强度进行了比较分析，发现与正常小鼠相比，PolyTACs-2在关节炎模型小鼠的RA部位显示出显著的积聚和激活。
接下来，评估了PolyTAC在AIA模型中的治疗潜力。关节炎诱导21天后，AIA大鼠的脚踝和爪子出现严重肿胀。将PolyTAC-1、PolyTAC-2或对照纳米颗粒(对照)静脉注射到大鼠中(10mg/kg)。如图6b、6e、6f、PolyTAC-1和PolyTAC-2在给药后表现出较强的治疗效果，显著缓解疾病发展，降低关节肿胀严重程度评分和多关节炎指数(PI)。对照组AIA大鼠的关节厚度和PI评分与AIA组几乎没有差异。为了进一步评估关节炎症和软骨破坏程度，在AIA模型大鼠中进行滑膜和软骨组织病理学检查。与模型组相比，对照纳米颗粒在减轻关节炎症和软骨破坏水平方面没有效果，而PolyTAC-1和PolyTAC-2显著减轻了滑膜增生和关节炎症(图6c)，组织学评分降低证明了这一点(图6g-i)。番红-O/固绿染色显示，模型组和对照组的一些踝关节切片中有一部分软骨组织消失(图6d)。相比之下，PolyTAC-1和PolyTAC-2组的关节中可以发现几乎完整和红色染色的软骨，表明PolyTAC-1和PolyTAC-2有效地减少了软骨破坏，这是RA的典型病理表现(图6d)。此外，IHC染色显示PolyTAC-1和PolyTAC-2处理显著降低了STING的表达(图6j)。免疫学上，大鼠血浆中炎性细胞因子的Elisa测定表明，PolyTAC-1和PolyTAC-2有效降低了TNF-α、IFNα、IFN-β、IL-6和IL-17水平的分泌(图6k)。这些细胞因子在调节RA的进展中起着关键作用，IFNα和IFNβ是STING通路的下游细胞因子。这些发现表明，在AIA模型中，PolyTAC-1和PolyTAC-2可以降解STING并抑制STING信号通路并减轻病理。
2.8PolyTAC的系统安全性
为了评估PolyTAC-1和PolyTAC-2的全身毒性，健康小鼠接受不同剂量的PolyTAC-1、PolyTAC-2治疗。将小鼠随机分为正常组、PolyTAC-1低剂量组(15mg/kg)、PolyTAC-1高剂量组(75mg/kg)、PolyTAC-2低剂量组和PolyTAC-2高剂量组。腹膜内注射后第7天，对血液和重要器官进行取样和检查。肝功能指标，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和白蛋白(ALB)；心功能指标，包括肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)；肾功能指标，包括尿素氮(urea)和尿酸(UA)，以及总蛋白(TP)都进行了测量。这些指标在PolyTAC-1和PolyTAC-2治疗后没有显示出显著变化。最后，对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏样品进行切片和HE染色。图像显示PolyTAC-1和PolyTAC-2在这些器官中没有引起形态学变化或炎症。因此，PolyTAC-1和PolyTAC-2表现出高度的生物相容性，并且不会对主要器官造成急性损伤。
3.讨论
STING途径可由多种细胞质dsDNA触发，无论其来源和序列如何，并被认为在自身免疫性疾病中发挥关键作用。在RA患者中，FLS和滑膜中细胞质dsDNA和cGAS的表达增加，其表达与类风湿性滑膜炎的严重程度相关。RA FLS中细胞质dsDNA水平的增加通过cGAS/STING途径促进炎症反应，细胞质dsDNA积累是FLS介导的类风湿性滑膜炎症的重要因素。与OA FLS相比，cGAS在RA-FLS中过表达。此外，TNF-α刺激上调RA FLS31cGAS缺乏症患者的cGAS表达，阻断干扰素反应，减少炎症细胞浸润和关节肿胀。在本发明中，提供了直接证据证明与OA患者相比，在RAFLS中检测到STING的高表达和STING/P-IRF3信号通路的激活。这些发现表明cGAS/STING靶向治疗RA的潜在益处。
本发明设计了PolyTACs，不仅可以降解THP-1细胞中的STING，而且在人和大鼠的原代滑膜成纤维细胞中也证明了它们可以降解STING并阻断STING-IFN/NF-κb信号通路以抑制炎症反应。这在AIA大鼠模型中也得到了验证。Joschka等人证明TNF诱导线粒体变化并阻断PINK1介导的线粒体自噬诱导。这种TNF依赖性线粒体损伤导致mtDNA泄漏到细胞质裂解物中，随后与cGAS结合并激活cGAS/STING/IFN信号传导和随后的ISG诱导。在本发明中，还证明了在TNF-α诱导的情况下，PolyTACs仍然可以降解STING并阻断STING-IFN/NF-κb信号通路。
本发明的PolyTAC设计与使用聚合物纳米载体递送PROTAC的系统不同，后者负责蛋白水解活性。PolyTAC比传统PROTAC具有几个明显的优势。在候选药物优化的分子设计中，PolyTAC在结构优化方面比PROTAC表现出更大的灵活性，能够结合不同的配体类型和调节配体比率。本发明证明了具有70个C7A重复单元和少于4个THD缀合物的优化PolyTAC。在三元复合物的形成过程中，与二价PROTAC相比，作为多价大分子的PolyTAC与POI和E3连接酶表现出更长的持久性和更强的结合亲和力。在某些情况下，这种聚合物甚至可以诱导多个POI的缩合，从而提高蛋白质降解的效率。
本发明证明了合成的PolyTAC与人类和大鼠STING蛋白的兼容性。这一发现对候选药物从实验室研究到患者护理的临床转化具有重要意义。基于PolyTACs的药物开发策略有助于弥合实验动物模型和人类患者之间的差距，解决种间差异。此外，PolyTAC显示出对感兴趣的靶蛋白(POI)的不同突变体或亚型的潜在适用性。在未来的临床应用中，PolyTAC有望治疗更广泛的患者，无论基因和蛋白质变化如何，简化临床实践中的药物决策过程。
针对STING，现有的激动剂比抑制剂数量更多。在本发明中，通过将STING激动剂(PC7A)与E3连接酶的小分子配体偶联，成功地将其转化为降解剂(PolyTACs)，用于治疗另一种疾病。这种方法可以作为能够与特定蛋白质结合的各种其他分子(聚合物、碳水化合物、肽)的通用策略。目前，广泛的聚合物已被报道为将活性药物分子递送到细胞中的有效载体。在这些研究中，大多数聚合物本身通常不表现出药理活性，可能是因为它们对蛋白质的亲和力较弱。有趣的是，本发明中提出的蛋白质降解策略并不需要严格依赖高亲和力。即使PolyTACs分子与靶蛋白的温和结合也足以诱导降解。因此，PolyTACs战略在显著扩大聚合物在药物领域的潜力方面具有巨大的前景。
除了在降解STING蛋白方面的作用外，PolyTAC还可作为靶向递送至类风湿性关节炎(RA)治疗部位的有效载体。体内成像实验最终证明，与非关节炎模型小鼠相比，PolyTAC在类风湿性关节炎(RA)中表现出优越的位点特异性富集和激活靶向能力。PolyTAC是一种对pH敏感的纳米颗粒，具有独特的特性。首先，作为外源性纳米颗粒，PolyTAC在关节炎部位表现出优先积累，其特征是免疫反应的过度激活和免疫相关细胞的涌入。巨噬细胞尤其具有吞噬和清除外来物质的能力。其次，PolyTAC作为具有独特pH转变点(pHt)的pH敏感纳米颗粒。当周围的pH高于其pHt时，这些纳米颗粒保持完整并处于“非活性”状态。然而，当pH降至pHt以下时，PolyTAC会溶解到聚合物链中，进入“活性”状态。RA部位的炎症反应和高代谢活性创造了一个酸性环境，这有助于PolyTACs的激活。PolyTACs在疾病部位的选择性激活不仅提高了治疗效果，而且最大限度地减少了体内全身毒性。
实施例2
本实施例示出了其它聚合物材料对靶蛋白的降解作用，具体参见下表。
分别以表中所列的聚合物作为骨架，通过骨架上存在的活性基团(氨基、羧基、巯基、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、双键、三键或叠氮等)分别与靶蛋白配体或E3连接酶配体进行偶连，得到相应的聚合物，并利用溶剂挥发法制成纳米粒。分别用纳米粒处理对应的细胞，利用Western Blot法检测不同纳米粒处理后的靶蛋白和内参蛋白的含量，利用ImageJ软件对靶蛋白和内参蛋白的灰度值，利用内参蛋白对靶蛋白进行标准化处理，最终与对照组对比，即可得到蛋白降解效率值。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于靶蛋白水解的聚合物，其特征在于，所述聚合物结合有靶蛋白配体和E3连接酶配体。
2.根据权利要求1所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其特征在于，所述聚合物包括含有靶蛋白配体的第一结构单元和含有E3连接酶配体的第二结构单元。
3.根据权利要求2所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其特征在于，所述第一结构单元与所述第二结构单元之间含有1-200个结构单元；
优选地，所述第一结构单元含有的配体包括7元环、小分子化合物、抗体、适配体、蛋白、核酸分子、细胞代谢物、药物、激素、金属离子、糖、肽段或其片段；
优选地，所述聚合物的第一结构单元和所述第二结构单元各自分别选自2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯单体、小分子化合物、氨基酸、核酸分子、Von Hippel-Lindau配体、cereblon配体、cIAP配体或MDM2配体。
4.根据权利要求3所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其特征在于，所述靶蛋白配体为第一结构单元的基团，或通过活性基团连接的配体；和所述E3连接酶配体为第二结构单元的基团，或通过活性基团连接的配体，优选地，所述活性基团包括氨基、羧基、巯基、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、双键、三键和叠氮中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的用于靶蛋白水解的聚合物，其特征在于，所述聚合物选自无规共聚物、嵌段聚合物或均聚物；
优选地，所述聚合物选自基于2-(氮杂环庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯的聚合物、壳聚糖、基于乳酸和/或羟基乙酸的聚合物、基于氨基酸的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状高分子聚合物、多肽或其组合；
优选地，所述聚合物的分子量为2000-40000。
6.一种用于靶蛋白水解的聚合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备含有靶蛋白配体的第一结构单元；
(2)制备结构构建单元；
(3)使所述第一结构单元、结构构建单元和含活性基团的化合物合成无规共聚物；
(4)使所述无规共聚物连接含有E3连接酶配体的第二结构单元。
7.权利要求1-5任一项所述的聚合物在用于降解靶蛋白中的用途。
8.一种用于降解细胞内靶蛋白的方法，其特征在于，包括使权利要求1-5任一项所述的聚合物与细胞接触并进入细胞内的步骤。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的聚合物和药物学可接受载体。
10.根据权利要求1-5任一项所述的用于靶蛋白水解的聚合物在制备药物中的用途。
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