TR201809421T4 - Çölyak hastaliğinda oral enzi̇m tedavi̇si̇ i̇çi̇n metakri̇li̇k hi̇yalüroni̇k asi̇t türevleri̇ni̇n hi̇drojelleri̇. - Google Patents

Çölyak hastaliğinda oral enzi̇m tedavi̇si̇ i̇çi̇n metakri̇li̇k hi̇yalüroni̇k asi̇t türevleri̇ni̇n hi̇drojelleri̇. Download PDF

Info

Publication number
TR201809421T4
TR201809421T4 TR2018/09421T TR201809421T TR201809421T4 TR 201809421 T4 TR201809421 T4 TR 201809421T4 TR 2018/09421 T TR2018/09421 T TR 2018/09421T TR 201809421 T TR201809421 T TR 201809421T TR 201809421 T4 TR201809421 T4 TR 201809421T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
eda
pep
enzyme
composition according
hyaluronic acid
Prior art date
Application number
TR2018/09421T
Other languages
English (en)
Inventor
Pitarresi Giovanna
Salvatore Palumbo Fabio
Giammona Gaetano
Original Assignee
Nemysis Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nemysis Ltd filed Critical Nemysis Ltd
Publication of TR201809421T4 publication Critical patent/TR201809421T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/28—Treatment by wave energy or particle radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21026—Prolyl oligopeptidase (3.4.21.26), i.e. proline-specific endopeptidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Bu buluş, prolil endopeptidaz (PEP), endoproteaz (EP) ve bunların kombinasyonundan oluşan grupta seçilen en az bir ekzojen enzim ile yüklenen hidrojelleri içeren bir hiyalüronik asit türevleri içeren farmasötik bir bileşim ile ilgilidir; söz konusu bileşim, çölyak hastalığının oral yolla tedavisine yöneliktir. (Şekil 10)

Description

TEKNIK ALAN Bu bulus, prolil endopeptidaz (PEP), endoproteaz (EP) ve bunlarin kombinasyonundan olusan grupta seçilen en az bir ekzojen enzim ile yüklenen hidrojelleri içeren bir hiyalüronik asit türevleri içeren farmasötik bir bilesim ile ilgilidir; söz konusu bilesim, çölyak hastaliginin oral yolla tedavisine yöneliktir.
TEKNIGIN BILINEN DURUMU Çölyak hastaligi, bu karmasik iltihapli hastalikta çevresel faktörler etkili olsa da, genetik olarak duyarli kisilerde glüten tarafindan indüklenen ince bagirsak patolojisidir.
Glüten, insan gastrointestinal sistemi enzimleri için tercih edilmeyen substratlar olan prolin ve glütamin açisindan zengin bir gliadin ve glütenin karisimidir. Sonuç olarak, glüten, 30-40 amino aside kadar metastabil immünojenik peptidlerin üretimi ile insanlarda tamamen bozulmaz. Özellikle, temsili bir glüten proteini olan oi2- gliadin dizisi, büyük peptidlerin olusumu ile midede pepsinler tarafindan ayrilir, ince bagirsagin lümeninde bagirsak firçamsi kenarli membranin pankreatik proteazlari ve peptidazlari ile absorpsiyon için tek aminoasitlere, di- ve tri-peptidlere sindirilir.
Ancak, 33-mer dizisi, epitelyal bariyeri çaprazlamak için sindirimden devam eder, selektif glütamin kalintilarinda transglutaminaz 2 (TG2) tarafindan deamine edilir.
Altta yatan lamina propriyada, deamine 33-mer'den türetilen epitoplar, insan lökosit antijeni (HLA) DQ2 Için yüksek afinite gösterir. Antijen sunan hücrelerin (APC'ler) yüzeyindeki deamine glüten peptidleri-DQ2 kompleksleri, bagirsak mimarisinin tahribatina, besinlerin kötü absorpsiyonuna, diyare ve anemiye neden olan glütene özgü intestinal T hücrelerinden güçlü bir inflamatuar yanit ortaya çikarir.
Tam glütensiz diyet, çogu hastada çölyak hastaliginin belirti ve semptomlarinin çözülmesini saglar ve bu patoloji için bugüne kadar bulunan tek tedavidir. Açiktir ki, insan beslenmesindeki glütenin birçok yerde bulunmasindan dolayi, bu kisitlama zor bir deneyimdir ve siklikla yasam kalitesinin azalmasina neden olur. Ayrica, glütensiz alüminler çok pahalidir, bu nedenle tadlarinin çok iyi olmamasinin yani sira ekonomik nedenler genellikle hastalari caydirmaktadir.
Maalesef, kati bir glüten içermeyen diyete kasten ya da istemeden hastanin uymamasi, artan morbidite ve mortalite ile iliskili olabilen osteoporoz, ikincil bagisiklik hastaliklari, maligniteler gibi komplikasyonlara neden olmaktadir. Bu nedenle, ekzojen prolil endopeptidazlarinin (PEPler) oral uygulanmasi dahil olmak üzere glütensiz diyetin terapötik alternatiflerine büyük ihtiyaç vardir.
Gastrointestinal sistemin insan enzimlerinden farkli olarak, ekzojen PEP'ler, prolin açisindan zengin glüten peptidleri etkili bir sekilde hidrolize edebilir ve sonrasinda inflamatuar yaniti önleyebilir.
Bu amaç dogrultusunda, asidik ortamda veya gastrointestinal proteazlar oldugunda farkli dizilimler ve zincir uzunlugu spesifitesi ve kararliligi ile Flavobacterium meninosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) ve Aspergillus niger den (AN) türetilen PEP gibi çesitli PEP'ler önerilmistir (Bethune MT ve Khosla C. Oral enzyme therapy for celiac sprue. Methods Enzymol. 2012; 502z241-271).
Ancak, bu enzimin oral yoldan uygulanmasi için, hem enzim degismeden üretim prosesine hem de gastro ve/veya intestinal sisteme aktif bir formda ve etkili dozda, tercihen zaman içinde kademeli ve sabit bir sekilde salinmasina izin veren uygun bir formülasyonun seçilmesi gereklidir. bilesimi açiklamaktadir, bu bilesim, sunlari içermektedir: bahsi geçen glütenaz ile kombinasyon halinde etkili dozda bir safra ayirma maddesi; burada adi geçen safra ayirma maddesi, söz konusu glütenazin enterik stabilitesini arttirir; burada adi geçen glütenaz, Flavobacterium meningosepticum prolil endopeptidaz (FM PEP), Sphingomonas kapsül prolil endopeptidaz (SC PEP) Myxococcus xanthus prolil endopeptidaz (MX prolil endopeptidaz) ve arpa EP-BZ endoproteinazdan olusan gruptan seçilir. Bugüne kadar piyasada PEP içeren oral formülasyonlar mevcut degildir, ancak klinik denemelerde PEP SC ve EP-BZ (bir arpa endoproteaz) arasinda ALVOO3 markali kombinasyon gibi sadece birkaç örnek vardir (Tye-Din JA, Anderson RP, Ffrench RA, Brown GJ, Hodsman P, Siegel M, Botwick W, Shreeniwas R. The effects of ALVOO3 pre-digestion of gluten on immune response Ancak, simdiye kadar incelenen oral enzim tedavisinin, yüksek glüten duyarliligi veya refrakter çölyak hastaligi tip 1 olan hastalarda normal günlük glüten aliminin >13 9 kadar olan immünojenik epitoplarini yeterince bozmadigi, bunun yerine birkaç yüz miligramin birkaç gram glütene zararli etkisini ortadan kaldirdigi veya glütensiz diyetin zaman zaman transgresyonunu sagladigi görülmektedir.
Son olarak, simdiye kadar önerilen oral tedavinin, her ögünde, diyet glüteninin kasitli olarak ya da kasitsiz olarak yutuldugu PEP'Ierin uygulanmasini gerektirmesi muhtemeldir.
Bu nedenle alanda, önceki bölümdeki dezavantajlari içermeyen, çölyak hastaliginin oral tedavisinde kullanim amaciyla ekzojen PEP'lerin daha iyi salinmasina ihtiyaç duyulmaktadir.
Bu nedenle, günlük tek doza PEP ve/veya EP' uygulanmasini saglamak için gastrointestinal sistemde ve kademeli bir sekilde enzimin aktif formunu ve etkili dozajini salabilen prolil endopeptidaz (PEP) ve endoproteazdan (EP) olusan gruptan seçilen ekzojen enzimin oral yoldan uygulanmasi için yeni formülasyonlar saglama amacini tasimaktadir.
BULUSUN TANIMI Bulus, en az bir ekzojen enzim içeren bir bilesim saglar, söz konusu enzim, prolil endopeptidaz (PEP), endoproteaz (EP) ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan grupta seçilir, bahsi geçen enzim, bir foto çapraz baglanmis metakrilik hiyalüronik asit türevleri (HA-EDA-MA) hidrojeli içine hapsedilir, burada hiyalüronik asit türevleri, karbonik fenilesterler veya haloformik fenilesterler arasindan seçilen bir karbonatlama maddesi ile aktivasyondan sonra en az bir hidroksil grubunun etilendiamin (EDA) ile reaksiyon ve daha sonra metakrilik anhidrit (MA) ile reaksiyon Dalton arasinda moleküler agirliga sahip olan hiyalüronik asit (HA) veya bunun bir tuzunu içerir.
Elde edilen bilesim, jel veya dondurularak kurutulmus toz halinde hazirlanir.
Hidrojel içinde hapsedilen enzim, sasirtici bir sekilde, dondurarak kurutma islemi sirasinda bozunmadan korunmustur, bu sayede, bulusun bilesiminin dondurularak kurutulmus toz formu olarak üretimi ve stabil uzun raf ömrü saglanir. Bulusa göre bir bilesim, ekzojen enzimin, simüle edilmis gastrointestinal sivilari içinde sürekli bir sekilde ve gliadin peptidini detoksifiye etmek için aktif bir formda salinmasina izin verir. Bulusa uygun bir bilesim, bu nedenle, çölyak hastaliginin tedavisinde kullanim için uygundur ve çölyak hastalarinda gliadin peptidini detoksifiye edebilen aktif form halinde, oral uygulama ve enzimlerin (PEP'ler, EP'ler veya bunlarin kombinasyonlari) sürekli salinmasi için, enterik kaplamali ya da kaplamasiz olarak granül, kapsül veya tablet gibi geleneksel oral dozaj formunun hazirlanmasi için kullanilabilir. Bu nedenle, bu bulusun konusu, ayni zamanda, bulusa göre bilesimi ve en az bir baska farmasötik olarak kabul edilebilir maddesini içeren birfarmasötik oral formülasyon olup, bahsi geçen formülasyon çölyak hastaliginin tedavisinde kullanim içindir.
Baslangiç polimerinin, yani hiyalüronik asidin mukoz yapisma özellikleri, gastrointestinal sistemin mukozasina yapismayi ve bunun sonucu olarak gliadin peptidinin detoksifiye edilecegi yerde enzimlerle yüklenen formülasyonun (PEPler, EP'ler veya bunlarin kombinasyonlari) daha uzun bir kalicilik süresine izin verebilir.
Bulusun baska bir amaci, hiyalüronik asit hidroksil gruplarinin. etilendiamin ve ardindan metakrilik anhidrid ile islevsellestirildigi metakrilik hiyalüronik asit türevlerinin hazirlanmasi için bir proses olup, söz konusu proses, tek potlu bir prosestir. Çizimler Sekil 1, HA-EDA-MAtürevinin 1H-NMR spektrumunu göstermektedir.
Sekil 2, HA-EDA-MA solüsyonlarinin foto-isini için kullanilan Pyrex tüp piston sisteminin semasini göstermektedir; (Piston, tüpün duvarlarinda daha kolay isinlanan solüsyonun ince birfilmini olusturur.) Sekil 3, 4 °C'de 5 güne kadar depolandiktan sonra enzim ile islenen substrat solüsyonlarinin (Z-GIy-Pro-pNA) bir ölçüsü olarak eksprese edilen pH 7.2'deki fosfat tampon solüsyonu içindeki PEP FM'nin stabilitesini gösterir.
Sekil 4, farkli zamanlarda 366 nm'de isinlandiktan sonra enzim ile islenen substrat solüsyonlarinin (Z-GIy-Pro-pNA) bir ölçüsü olarak eksprese edilen PEP FM aktivitesini göstermektedir; Sekil 5, hazirlanmalarindan hemen sonra (a) ve 10 gün boyunca 4 °C'de saklandiktan sonra (b) analiz edilen HA-EDA-MA jellerinden salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH 7,2'de O ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi; Sekil 6, hazirlandiktan hemen sonra (a), 10 gün boyunca 4 °C de saklandiktan sonra (b) ve 10 gün boyunca -20 °C'de saklandiktan sonra (c) HA-EDA-MA dondurularak kurutulmus tozlardan salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH 7,2'de 0 ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi; Sekil 7, hazirlandiktan hemen sonra (3), 10 gün boyunca 4 °C de saklandiktan sonra (b) ve 10 gün boyunca -20 °C'de saklandiktan sonra (o) analiz edilen 1,5 w/w trehazol varliginda HA-EDA-MA dondurularak kurutulmus tozlardan salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH 7,2'de 0 ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi; Sekil 8, hazirlandiktan hemen sonra (a), 10 gün boyunca 4 °C de saklandiktan sonra (b) ve 10 gün boyunca -20 °C'de saklandiktan sonra (c) analiz edilen 1,5 w/w trehazol varliginda HA-EDA-MA dondurularak kurutulmus tozlardan salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH 7,2'de 0 ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi; Sekil 9, 4 °C'de 10 gün (a), 1 ay (b) ve 2 ay (0) saklandiktan sonra analiz edilen %3 w/w trehazol varliginda HA-EDA-MA dondurularak kurutulmus tozlardan salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH 7,2'de 0 ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi; Sekil 10. -20°C'de 10 gün (a), 1 ay (b) ve 2 ay (0) saklandiktan sonra analiz edilen salinan PEP FM'yi göstermektedir. Salim çalismalari simüle edilmis intestinal sivilarda, pH ?2'de 0 ile 24 saat arasinda gerçeklestirildi.
BULUSUN DETAYLI AÇIKLANMASI Bulusa göre HA-EDA-MA türevleri, en az bir hidroksil grubu ve hiyalüronik asidin tüm hidroksil gruplari arasinda olusan EDA ve MA'da bir islevsellestirme derecesini göstermektedir.
HA-EDA-MA türevleri, %1 w/v ve %20 w/v arasinda bir konsantrasyonda sulu solüsyonda ve 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda en az bir eksojen enzim, tercihen bir PEP oldugunda, 180-800 nm araliginda bir dalga boyunda foto-isinlama yoluyla foto-çapraz baglanabilirler.
HA-EDA-MA türevleri, %1 w/v ve %20 w/v arasinda bir konsantrasyonda 180-800 nm araliginda bir dalga boyunda foto-isinlama yoluyla foto-çapraz baglanabilirler ve ardindan 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda en az bir eksojen enzim, tercihen bir PEP solüsyonu ile elde edilen temas ile yüklenebilir.
HA-EDA-MA türevleri, sulu ortamda, tercihen, eksojen enzim, tercihen prolil endopeptidazlar (PEP) varliginda bir 366 nm dalga boyunda UV isinlamasi yoluyla foto-çapraz baglanabilir.
Bulusa göre bir bilesimde, enzim bir PEP veya tek bir mikroorganizmadan türetilmis bir EP olabilir veya farkli mikroorganizmalardan türetilen veya biyoteknoloji yöntemi ile üretilen PEP ve / veya EP'Ierin bir kombinasyonu olabilir; teknikte bilinen herhangi bir PEP veya EP ve bunlarin bir kombinasyonu, bulusa göre bir hidrojel içine hapsedilmek için uygundur. notlarda tarif edildigi gibi E. coli'de rekombinant teknik ile de hazirlanabilir. Bulusa göre, tercihen PEP, Flavobacterium meningosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) ya da Aspergillus niger (AN) içeren grupta seçilen bir mikroorganizmadan türetilir. Bulusa göre tercihen EP bir arpa EP'dir, özellikle tercih edilen EP-BZ'dir.
Tercihen, bulusa göre, bahsi geçen enzim, jel formunda hidrojel içinde, 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda tutulur. Enzimlerle yüklü HA- EDA-MA hidrojelleri, jel olarak üretilebilir. Enzimler ile yüklü HA-EDA-MA hidrojelleri, dondurularak kurutulmus toz halinde üretilebilir.
Dondurarak kurutma islemi, hem kreprotektanlar olmadiginda hem de oldugunda, polimer agirligina göre %0,1 ile %10 w/w arasinda bir konsantrasyonda gerçeklestirilebilir; bahsedilen kriyoprotektan tercihen trehalozdur.
Bulusa göre, PEP'ler (özellikle PEP FM) yüklenmis HA-EDA-MA hidrojelleri, farkli zamanlarda (hazirlanmalarindan alti ay öncesine kadar) farkli sicakliklarda (-20 ila 37 °C) depolandiktan sonra simüle edilmis gastrointestinal sivilarinda PEP'lerin salinim deneylerinde test edilmistir. Önceki bir patentte (Giammona, G., Palumbo, F. S., Pitarresi. G., Method to produce hyaluronic acid functionalized derivatives and formation of hydrogels thereof. WO , HA-EDA-MA sentezi rapor edilmistir, ancak MA ile daha fazla reaksiyon içim izolasyon ve saflastirma kullanildiktan sonra HA-EDA türevlerinin ilk üretimini dahil etmistir, bu sayede iki potlu bir sentez rapor edildi.
Tersine, bu bulusta, HA-EDA türevlerinin izolasyonu olmaksizin HA-EDA-MA türevlerinin dogrudan üretilmesine izin veren tek potlu bir sentez istemi belirtilmistir.
Daha sonra, bu bulusun diger bir konusu, metakrilik hiyalüronik asit türevlerinin üretimi için tercihen bir pot olan bir prosedürdür, söz konusu prosedür, asagidaki adimlari içerir: (a) en azindan bir hidroksil HA grubunun aktivasyonunu elde etmek için karbonik fenilesterler veya haloformik fenilesterler arasindan seçilen bir karbonatlama ajani ile polar aprotik bir solvent içinde bir hiyalüronik asit (HA) tuzunun temas ettirilmesi, burada HA, bahsedilen polar aprotik organik solvent içinde çözünebilen bir tuz formundadir; (b) (a) adimindan elde edilen aktive HA tuzunun, nükleofilik ikame ile HA-EDA elde etmek amaciyla etilendiamin (EDA olarak belirtilen NH2-CH2-CH2-NH2) ile temas ettirilmesi; (0) (b) adimindan elde edilen HA-EDA'nin, nükleofilik ikame ile HA-EDA-MA elde etmek üzere metakrilik anhidrid (MA olarak belirtilir) ile temas ettirilmesi; burada tercihen yukaridaki tüm adimlar ayni kap içinde gerçeklestirilir.
Organik solventlerde çözünen hiyalüronik asit tuzu tercihen tetrabutilamonyik tuz (TBA olarak belirtilir) veya setiltrimetilamonyum tuzu (CTA olarak belirtilir) arasindan seçilir.
Islevsellestirme reaksiyonlari için kullanilan polar aprotik organik solvent tercihen dimetilsülfoksit, dimetilformamit, dimetilasetamid ve bunlarin karisimlari arasindan seçilir. (a) adiminda kullanilan karbonatlama maddesi tercihen bis(4-nitr0fenil karbonat) (bir karbonilfenil ester) ve/veya bir kloro nitrofenil karbonat olabilir. (c) adimi tercihen dietilamin, trietilamin, dimetilaminopiridin ve bunlarin karisimlari arasindan seçilen bir katalizör varliginda gerçeklestirilir.
Tüm adimlar tercihen 5 ila 60 °C arasindaki sicakliklarda gerçeklestirilir.
HA'ya bagli EDA ve MA gruplarindaki islevsellestirme derecesi, sadece bir hidroksil grubundan tüm HA hidroksil gruplarina kadar degisebilir ve yukarida tarif edilen proseste kullanilan karbonilasyon maddesi miktarina baglidir (dogru orantili olarak). Tercihen islevsellestirme derecesi, %5 ile 95, daha tercihen %20 ile 80 arasinda degisir.
Bir baska yönüne göre, bu bulus, yukarida tarif edilen islemden elde edilebilen türevleri ile ilgilidir.
Bundan sonra, HA-EDA-MA'nin yapisal bir formülü sunulmakta olup, bu, yukarida tarif edilen prosese tabi tutuldugunda bir HA hidroksil grubuna uygulanan islevsellestirme türünün (kovalent baglanma) sadece temsili olarak tasarlanmasi amaçlanmaktadir. Asagida bildirilen yapi, yukarida belirtildigi gibi, yukaridaki islemde kullanilan reaktif karbonatlama maddesi miktariyla dogrudan orantili olan islevsellestirme derecesinin temsilcisi olarak amaçlanmamistir. Özellikle, HA-EDA-MA türevlerinin islevsellestirme tipi, en azindan bir hidroksil grubunun Islevsellestirildigi, baslangiç hiyalüronik asidin iki ardisik disakkarit birimini tarif eden asagidaki yapi ile temsil edilebilir. 40”( ?0 H Clxa ii Oh Bir baska yönüne göre, bu bulus, yukarida tarif edilen ürünlerden elde edilen çapraz baglanmis hidrojelleri, yani HA-EDA-MAtürevIerini, birfoto çapraz baglama prosedürünü kullanarak ele alir, burada bahsedilen islevsellestirilmis türevlerin sulu veya organik solüsyon içindeki konsantrasyonu %1 w/v ile %20 w/v arasindadir.
Tercihen, hidrojeller, radikal foto-baslatici ile ya da radikal foto-baslatici olmaksizin, 180 ile 800 nm arasindaki dalga boylari ile isinlanarak, 5 ile 10 saat arasinda radyasyona maruz birakilarak elde edilir.
Bu hidrojeller, ayni zamanda, y-isini, mikrodalga isimasi veya diger iyonlastirici radyasyonlarla da elde edilebilir.
Bu tür çapraz çapraz baglanma, hem mono hem de çok fonksiyonlu akrilik ve metakrilik monomerler, polietilenglikol metakrilatlar ve akrilatlar gibi uygun katki maddelerinin varliginda veya plastikligi, sertligi, hidrofilik ve lipofilik karakteri degistirmek veya gelistirmek için kullanilan diger katki maddelerinin varliginda da meydana gelebilir.
Bir baska yönüne göre, bu bulus, foto-isinlama yoluyla elde edilen HA-EDA-MA hidrojellerinin üretimi ile ilgilidir ve isinlama islemi sirasinda ve/veya sonrasinda 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir enzim konsantrasyonuna sahip eksojen prolil endopeptidazlarla (PEPs) yüklenir. Özel bir yönüne göre, bu bulus, FLO-EDA- MAtürevlerinin, sulu ortamda, tercihen 10 dakika boyunca 366 nm'de, ekzojen prolil endopeptidazlarin (PEPs), tercihen 1 mU/mg ve 100U mg polimer arasinda bir enzim konsantrasyonuna sahip Flavobacterium meningosepticum'dan (FM) elde edilen PEP'in foto-çapraz baglanmasina iliskindir.
PEP'Ierle yüklü HA-EDA-MA hidrojelleri, polimerlerin agirligina göre %0,1 w/v ile olmadiginda jel veya dondurarak kurutulmus tozlar olarak üretilir.
PEP'Ierle yüklenen elde edilen hidrojeller, hem üretimden hemen sonra hem de farkli zamanlarda (preparasyondan alti ay öncesine kadar) ve farkli sicakliklarda (- ila 37 °C arasinda) depolandiktan sonra simüle edilmis gastrointestinal sivilarinda serbest birakma deneyleri için kullanilmistir.
Deney, sunlari göstermelidir: 0 Tek basina fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de çözündürülen PEP FM, 4 °C gibi düsük sicaklikta depolanmis olsa bile zamanla aktivitesini kaybeder.
- Tek basina fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de çözündürülen PEP FM, solüsyonun dondurarak kurutulmasindan sonra, kriyoprotektanlarin varliginda da tamamen aktivitesini kaybeder; - Tek basina fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de çözündürülen ve 10 dakika boyunca 366 nm'de foto-isina maruz birakilan PEP FM, solüsyonun dondurarak kurutulmasindan sonra, kriyoprotektanlarin varliginda da tamamen aktivitesini kaybeder; o HA-EDA-MAtürevinin varliginda pH 7.2 fosfat tampon solüsyonu içinde çözülmüs ve 10 dakika boyunca 366 nm'de foto-isinlanmis PEP FM, hem kriyoprotektanlarin oldugunda hem de olmadiginda dondurarak kurutma isleminden sonra etkinligini - Foto isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve jel halinde geri kazanilan HA- EDA-MA hidrojelleri, hazirlandiktan hemen sonra analiz edilirse, 24 saate kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %70'ini sürekli bir sekilde salabilirler. HA-EDA-MAjelIeri içinde kalan PEP FM miktari, tamamen aktivitesini korur.
- Foto-isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve jel olarak geri kazanilan HA- EDA-MA hidrojelleri, 10 gün boyunca 4 °C'de saklandiktan sonra analiz edilirse, simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %60'i 24 saate kadar aktif formda sürekli bir sekilde salinabilir ve aktivitede sadece kismi kayip meydana gelir (yaklasik %20).
- Kriyoprotektanlar olmadiginda foto isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve dondurularak kurutulmus tozlar halinde geri kazanilan HA-EDA-MA hidrojelleri, hazirlandiktan hemen sonra analiz edilirse, 24 saate kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %70'ini sürekli bir sekilde salabilirler. HA-EDA-MAjelleri içinde kalan PEP FM miktari, tamamen aktivitesini o Kriyoprotektanlar olmadiginda foto-isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve kurutulmus tozlar halinde geri kazanilan HA-EDA-MA hidrojelleri, 10 gün boyunca 4 °C ya da -20 °C'de de saklandiktan sonra analiz edilirse, simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %50'si 24 saate kadar aktif formda sürekli bir sekilde salinabilir ve aktivitede sadece kismi kayip meydana gelir (yaklasik %30). Bu, PEP FM'nin tek basina, yani HA-EDA-MA hidrojeli olmadan, dondurarak kurutma prosesinden sonra tamamen aktivitesini kaybettigi için çok iyi bir sonuçtur.
- Polimer agirligna iliskin %1,5 w/w'de trehaloz oldugunda (kriyoprotektan örnegi olarak) foto isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve dondurularak kurutulmus tozlar halinde geri kazanilan HA-EDA-MA hidrojelleri, hazirlandiktan hemen sonra analiz edilirse, 24 saate kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %60'ini sürekli bir sekilde salabilirler. HA-EDA-MAjelleri içinde kalan PEP FM miktari, tamamen aktivitesini korur.
Bu numuneler 10 gün boyunca 4 °C'de saklanirlarsa, hala aktif bir sekilde 24 saat kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'deki PEP FM'nin yaklasik Bu numuneler 10 gün boyunca -20 °C'de saklanirlarsa, 24 saat kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'deki PEP FM'nin yaklasik %50'sini sürekli olarak salabilir ve PEP FM, tamamen aktivitesini sürdürür. - Polimer agirligina iliskin %3 w/w'de trehaloz oldugunda (kriyoprotektan örnegi olarak) foto isinlama sirasinda PEP FM ile yüklü olan ve dondurularak kurutulmus tozlar halinde geri kazanilan HA-EDA-MA hidrojelleri, hazirlandiktan hemen sonra analiz edilirse, 24 saate kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de enzimin yaklasik %50'sini sürekli bir sekilde salabilirler. HA-EDA-MAjelleri içinde kalan PEP FM miktari, tamamen aktivitesini korur.
Bu numuneler 1 ve 2 ay boyunca 4 °C'de ya da -20 °C'de saklanirlarsa, 24 saat kadar aktif formda simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'deki PEP FM'nin yaklasik Bu nedenle, yukaridaki sonuçlara göre, PEP FM ve uygun bir konsantrasyona sahip bir kriyoprotektan oldugunda HA-EDA-MA hidrojellerinin foto-isinlanmasi yoluyla hazirlanan bulusa uygun bilesim, enzim aktivitesini tamamen dondurarak kurutma prosesinden koruyabilmektedir.
Dondurarak kurutulmus tozlar olarak geri kazanilan HA-EDA-MA hidrojellerine yüklenen PEP FM, farkli zamanlarda ve sicaklikta depolanma sirasindaki aktivitesini tamamen korur ve simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de aktif form olarak EDA-MA hidrojellerinden salinir.
PEP FM'yi yüklemek için kullanilan ayni yaklasimi izleyerek, bu bulus, her biri tek basina veya PEP FM ile kombinasyon halinde ya da diger enzimlerle birlikte kullanilan, Myxococcus xanthus'deki (MX) PEP, Sphingomonas capsulata'deki (SC) PEP ya da Aspergillus niger'deki (AN) PEP veya endoproteazdaki (EP) PEP gibi, prolil endopeptidazdan (PEP) olusan grupta seçilen diger eksojen enzimle yüklenmis HA-EDA-MA hidrojelleri ile ilgilidir.
Sonuç olarak HA-EDA-MA hidrojelleri sunlari yapabilir: - yüklü enzimleri, dondurarak kurutma prosesinden korumak; - yüklü enzimleri, dondurularak kurutulmus tozlarin depolanmasi sirasinda, genel olarak kriyoprotektanlar oldugunda, degistirmekten korumak; - enzimlerin simüle edilmis gastik sivisinda (asit-aktif enzimler için) ve simüle edilmis intestinal sivida (tüm enzimler için) aktif formda ve sürekli olarak salinmasini saglamak, - çölyak hastalarinda gliadin peptidin detoksifiye edilebildigi enzimlerin aktif formda oral olarak uygulanmalari ve salinmalari için, enterik kaplamali ya da kaplamasiz olarak granül, kapsül ve tabletler gibi konvansiyonel oral dozaj formu hazirlamak.
Bulus, bulusun anlasilmasina yardimci olmasi amaçlanan ve burada tarif edilen ve talep edilen bulusu spesifik olarak kisitladigi seklinde yorumlanmamasi amaçlanan asagidaki örneklerle daha detayli açiklanacaktir.
DENEYSEL BÖLÜM Tek pot sentez ile HA-EDA-MA türev/nin hazirlanmasi Tetrabütilamonyum hidroksit solüsyonu kullanilarak hiyalüronik asit solüsyonu nötralizasyonu ile hazirlanan 1 g tetrabütilamonyum tiyaleronik asit (HA-TBA), 90 ml susuz dimetilsülfoksit (DMSO) (agirlikça ortalama hiyalüronik asit agirligi içinde çözüldü. 0,5'e esit bir HA-TBA molar orani 4-NPBC/Tekrar Eden Üniteleri elde edecek sekilde seçilen uygun miktarda bis(4-nitrofenil) karbonat (4-NPBC), 10 ml susuz ortamda DMSO içinde çözüldü; bu solüsyon, karistirilarak 40 °C'de HA-TBA solüsyonuna damla damla eklendi. 4 saat sonra damla damla eklendi ve sovlent, 3 saat daha 40 °C'de birakildi.
HA-TBA-EDA üzerindeki amino gruplarinin mollerine kiyasla sekiz kat molar fazlalik elde etmek için uygun bir hacimde (900 ml) metakrilik anhidrit (MA) eklendi, daha sonra ilave edildi ve nihai solüsyon, 40 °C'de 24 saat birakildi.
Reaksiyonun hazirlanmasi, önce 10 ml NaCI doymus bir solüsyon ekleyerek gerçeklestirildi ve karisim, oda sicakliginda 30 dakika karistirildi. Daha sonra, reaksiyon solüsyonu, etanol Içine çökeltildi ve ürün, reaksiyon ara ürünleri içermeyen bir ürün ve NaCI elde edilene kadar birkaç kez bir etanol/bidistil su (9:1) solüsyonu ile yikandi. Elde edilen kati HA-EDA-MA türevi olarak adlandirildi. Sema 1, HA-EDA-MA türevini hazirlamak için kullanilan tek pot prosedürünü göstermektedir.
Sema 1. Tek pot prosedürü ile HA-EDA-MA türevini elde etmek için etilendiamin (EDA) ve metakrilik anhidrit (MA) ile hiyalüronik asit (HA-TBA) tetrabütilamonyum tuzunun islevsellestirilmesi reaksiyonu .5 ve 5.7 (m, -CO-CH=CH-CH3) piklerini gösteren 1H-NMR ile karakterize edilmistir (bkz. Sekil 1).
Islevsellestirme derecesi, metakrilik grubun vinil protonlarina atfedilebilen 6 5.5 ve .7 pik noktalarinin HA tekrarli birimlerinin N-asetilglukosamin kisminin metil grubuna atfedilen alandaki 6 1.9 ile karsilastirilmasiyla degerlendirilmistir.
EDA'nin tekrarlanan ünitelerine baglanan metakrilik gruplarindaki islevsellesme derecesi, %50 mol/mol ile sonuçlanmistir, amino içermeyen EDA gruplarina ait pik yoktur, yani 6 3.1'de (m, CO-NH-CHz-CHz-NHz), böylece tüm amino gruplari metakrilik anhidrid ile türevlendirilmistir.
HA-EDA-MA türevini'n foto çapraz baglanmasi Örnek 1'i izleyerek elde edilen 30 mg HA-EDA-MA türevi, %ö'ya esit bir nihai konsantrasyona sahip olmak için, oda sicakliginda, pH 7.2'deki 500 ul 0,05 M fosfat tampon solüsyonu içinde çözülüp vakum altinda gazi alindi. Daha sonra solüsyon, Pyrex tüpüne yerlestirildi ve 10 dakika boyunca 366 nm dalga boyunda bir Rayonet fotoreaktör UV kullanilarak isinlandi (bakiniz Sekil 2). Bu süreden sonra, elde edilen hidrojel, jel olarak geri kazanildi veya bir toz elde etmek için dondurularak kurutuldu.
PEP FM aktivitesinin degerlendirilmesi Flavobacterium meninosepticum'dan (FM) türetilen PEP aktivitesi, enzimin kendi spesifik substrati yani karbobenzoksi-Gly-Pro-p-nitroanilid (Z-GIy-Prp-pNA) ile reaksiyona girdigi bir kolorimetrik analiz yoluyla ölçüldü. tampon solüsyonu pH 7.2 ile karistirildi ve solüsyon, 5 dakika süreyle 30 °C'de inkübe edildi. Bu süreden sonra, 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2, 0,1 ml enzim eklendi ve 30 dakika boyunca 10 dakika inkübasyondan sonra, reaksiyon 2,0 Elde edilen ürünün absorbansi 380 nm'de ölçüldü.
Enzim aktivitesinin bir birimi, Z-GIy-Pro-pNA'dan, 30 °C'de, pH 7.2'de, dakikada 1 umol p-nitroanilin üreten enzim aktivitesi olarak tanimlanir.
PHEP Fil/l'nin fosfat tampon solsüyonu pH 7.2'de zamanin bir fonksiyonu olarak stabilitesi hazirlandi ve zaman içinde stabilitelerini degerlendirmek için bir buzdolabinda 5 güne kadar 4 °C'de tutuldu. 1, 3, 4 ve 5 gün sonra, enzim aktivitesi Örnek 3'te bildirildigi gibi kolorimetrik deney yoluyla degerlendirildi. Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi. Sonuçlar Sekil 3'te gösterilmistir.
PH 7.2'de fosfat tampon solüsyonu içinde PEP FM'nin dondurarak kurutulmasi ve aktivitesinin degerlendirilmesi Trehaloz oldugunda ya da olmadiginda (7,5 ug/ml veya 15 uglml) 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2 içinde bir ml 0,2 Ulml PEP FM dondurularak kurutuldu.
Daha sonra, enzim aktivitesi Örnek 3'te bildirildigi gibi kolorimetrik deney yoluyla degerlendirildi. Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi. Her durumda, aktivite bulunamadi.
PH 7.2'de fosfat tampon solüsyonu içinde PEP FM'n/n foto isinlanmasi ve aktivitesinin degerlendirilmesi 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de bir ml 0,2 Ulml PEP FM, farkli zamanlarda (1 ila 20 dakika) 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlanmistir.
Her bir isinlama süresinden sonrai enzim aktivitesi Örnek 3'te bildirildigi gibi kolorimetrik deney yoluyla degerlendirildi.
Aktivite tahlili ayrica, bir pozitif kontrol olarak kullanilan isinlanmamis enzim solüsyonlari üzerinde gerçeklestirildi. Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi.
Sonuçlar Sekil 4'te gösterilmistir.
Foto isin/anmasindan sonra PH 7.2'de fosfat tampon solüsyonu içinde PEP Fll/l'nin dondurarak kurutulmasi ve aktivitesinin degerlendirilmesi pH 7.2'de bir ml 0,2 U/ml PEP FM, 10 dakika boyunca 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlanmistir. gibi kolorimetrik deney yoluyla degerlendirildi.
Deney, üç kopya halinde gerçeklestirildi ve her durumda aktivite bulunmadi.
Trehaloz oldugunda foto isinlanmasindan sonra PH 7.2'de fosfat tampon solüsyonu içinde PEP FM'nin dondurarak kurutulmasi ve aktivitesinin degerlendirilmesi fosfat tampon solüsyonu pH 7,2 içinde 800 pl 15 mg/ml trehaloz ile karistirildi. Bu solüsyon, 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlandi. Isinlanan solüsyon, dondurularak kurutuldu ve enzim aktivitesi Örnek 3'te bildirildigi gibi kolorimetrik Deney, üç kopya halinde gerçeklestirildi ve her durumda aktivite bulunmadi.
PEP FM ile yüklü HA-EDA-MA jelin hazirlanmasi Otuz mg HA-EDA-MA türevi, 400 pl 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2 içinde çözüldü. Vakum altinda solüsyonun gazi alindi ve ardindan 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de 100 ml 0,4 U/mg PEP FM eklendi. Bu sayede, nihai polimer konsantrasyonu, %6 wlv'ye esit oldu. Solüsyon, 10 dakika boyunca 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlandi.
PEP FM ile yüklenmis olan elde edilen HA-EDA-MAjeli, hazirlanmasindan hemen sonra ya da 10 gün boyunca 4 °C'de saklandiktan sonra analiz edildi.
Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi.
PEP FM ile yüklü dondurularak kurutulmus toz olarak HA-EDA-MA hidrojel hazirlanmasi PEP FM ile 0,4 U/mg polimerde yüklenmis HA-EDA-MA hidrojel, Örnek 9'da rapor edildigi gibi hazirlandi.
Foto isinlamadan sonra, elde edilen hidrojel dondurularak kurutuldu, daha sonra hazirlanmasindan hemen sonra veya 10 gün boyunca 4 °C veya -20 °C'de saklandiktan sonra analiz edildi.
Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi.
HA-EDA-MA hidrojelinin hazirlanmasi Otuz mg HA-EDA-MA türevi pH 7.2'de 0,05 M fosfat tampon solüsyonu içinde, 350 içinde çözüldü. Vakum altinda solüsyonun gazi alindi ve ardindan 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de 100 ml 0,4 U/mg PEP FM eklendi. Solüsyon, 10 dakika boyunca 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlandi.
Foto isinlamadan sonra, elde edilen hidrojel dondurularak kurutuldu, daha sonra hazirlanmasindan hemen sonra veya 10 gün boyunca 4 °C veya -20 °C'de saklandiktan sonra analiz edildi.
Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi.
HA-EDA-MA hidrojel/nin hazirlanmasi Otuz mg HA-EDA-MA türevi pH 7.2'de 0,05 M fosfat tampon solüsyonu içinde, 350 pl 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2 ve 100 pl 9 mglml trehaloz karisimi içinde çözüldü Vakum altinda solüsyonun gazi alindi ve ardindan 0,05 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de 100 ml 0,4 Ulmg PEP FM eklendi. Solüsyon, 10 dakika boyunca 366 nm'ye esit bir dalga boyunda foto-isinlandi.
Foto isinlamadan sonra, elde edilen hidrojel dondurularak kurutuldu, daha sonra hazirlanmasindan hemen sonra veya 10 gün, 1 ay ya da 2 ay boyunca 4 °C veya - °C'de saklandiktan sonra analiz edildi. Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi.
Simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de Örnek 9'daki örnekten salinim çalismalari PEP FM yüklü HA-EDA-MA jeli alikotlari (15 mg), 24 saat boyunca 100 ml simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2 içeren (100 rpm, 37 °C) siselere yerlestirildi. Önceden belirlenmis zaman araliklarinda, 0,15 ml salim ortami çekildi ve Örnek 3'te tarif edildigi gibi enzim aktivitesinin belirlenmesi için tahlil ile analiz edildi. Esit hacimde taze ortam eklendi ve deney boyunca batma kosullari saglandi. r2 = 0,9981).
Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi. 24 saat sonra HA-EDA-MA jeline kalan enzim miktarinin belirlenmesi, enzim aktivitesinin belirlenmesi için tahlil kullanilarak gerçeklestirildi, ancak bu durumda Z-Gly-Pro-pNA substrati jel ile dogrudan temas halinde yerlestirildi. Özellikle, ayirma çalismalari için kullanilan 15 mg jel, 0,5 ml simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2 ve 4,0 ml 0,1 M fosfat tampon solüsyonu pH 7.2 ile ilave edildi, daha sonra numune 100 rpm'de, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edildi. Bu süreden tampon solüsyonu pH 7.2 ile karistirildi ve elde edilen solüsyon, 5 dakika süreyle °C'de önceden inkübe edildi, ardindan jele ilave edilip 10 dakika boyunca °C'de inkübasyondan sonra, reaksiyon 20 ml Triton-X100 solüsyonu (10 g Triton- X100/95 ml 1M asetat tamponu, pH 4.0) eklenerek durduruldu.
Elde edilen ürünün absorbansi 380 nm'de ölçüldü.
Her deney üç kopya halinde gerçeklestirildi. Salinim deneylerinin sonuçlari, Sekil 'de gösterilmistir.
Simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de Örnek 10'daki örnekten salinim çalismalari Kriyoprotektan (Örnek 10) olmadiginda PEP FM ile yüklü dondurularak kurutulmus toz olarak HA-EDA-MA hidrojelinden gelen PEP FM salim çalismalari örnek 13'te açiklandigi gibi gerçeklestirildi. Salinim deneylerinin sonuçlari, Sekil 6'de gösterilmistir.
Simüle edilmis intestinal sivi pH 7.2'de Örnek 1 1 'daki örnekten salinim çalismalari HA-EDA-MA hidrojelinden gelen PEP FM'nin, trehaloz (%1,5 w/w) oldugunda (Örnek 11) PEP FM ile yüklü dondurularak kurutulmus tozdan ayirma çalismalari Örnek 13'te açiklandigi gibi gerçeklestirildi. Salinim deneylerinin sonuçlari, Sekil 7'de gösterilmistir.
Fosfat tampon solüsyonu pH 7.2'de Örnek 12'daki örnekten salinim çalisma/ari HA-EDA-MA hidrojelinden gelen PEP FM'nin, trehaloz (%3 w/w) oldugunda (Örnek 12) PEP FM ile yüklü dondurularak kurutulmus tozdan ayirma çalismalari Örnek 13'te açiklandigi gibi gerçeklestirildi. Salinim deneylerinin sonuçlari, Sekil 8, 9 ve 'da gösterilmistir.
TANIMLAR VE KISALTMALAR EDA: etilendiamin EP: endoproteaz HA: hiyalüronik asit MA: metakrilik anhidrit HA-EDA-MA: en az bir hidroksil grubunun etilendiamin (EDA) ile ve ardindan metakrilik anhidrit (MA) ile reaksiyona sokuldugu hiyalüronik asit PEP: prolil endopeptidaz PEP FM: Flavobacterium meninosepticum'dan türetilen prolil endopeptidaz PEP MX: Myxococcus xanthus'tan türetilen prolil endopeptidaz PEP SC: Sphingomonas capsulata'dan türetilen prolil endopeptidaz PEP AN: Aspergillus niger'den türetilen prolil endopeptidaz TANIMLAMADA BELIRTILEN REFERANSLAR Basvuran tarafindan belirtilen bu referanslar listesi yalnizca okuyucu için bir kolaylik saglamasi içindir. Avrupa patent dokümaninin bir parçasini teskil etmez.
Referanslarin derlenmesinde büyük bir özen gösterilmis olmakla birlikte hatalar veya eksiklikler olabilir ve EPO bu anlamda hiçbir sorumluluk üstlenmemektedir.
Tarifnamede Atifta Bulunulan Patent Belgeleri Tarifnamede Atifta Bulunulan Patent Disi Dökümanlar BETHUNE MT ; KHOSLA C. Oral enzyme therapy for celiac sprue. Methods TYE-DIN JA ;ANDERSON RP ; FFRENCH RA ; BROWN GJ ; HODSMAN P ; SIEGEL M ; BOTWlCK W ; SHREENIWAS R. The effects of ALV003 pre-digestion of gluten on immune response and symptoms in celiac disease in vivo. Clin 1.5 1.0 0.5 ppm A85(3800m) Süre (gün) 0,25, ` ' 1 J 5 10 12 16 Süre (dakika) kontrol Salman PEP FM %w/w Salman PEP FM %w!w 100an ;.' Süre (saat) Süre (saat) -i- [aj'dan salinan : ijbl'den salinan ' la)'dan salinan ijb)'den salinan lc}'den salinan Saliiiaii PEP FM %wlw 10080 Salman PEP FM %wlw 015 QS Süre (saat) Süre(saat) ija'ji'dan salinan ijbl'den salinan - -- ijcl-'den salinan ija)'dan salinan igDJ'den salinan Saliiiaii PEP FM %wlw Saliiiaii PEP FM %w/w 0.25 0,5 0,15› ijaJ'dan salinan i;b,'i'den salinan lerden salinan 2 b 0 1.3 2 4 ijai'dan salinan ijbji'den salinan -*-- ijc}'den salinan 1 I K› f› 23 .M Süre (saat)

Claims (1)

  1. ISTEMLER En az bir ekzojen enzim içeren bir bilesim olup, söz konusu enzim, prolil endopeptidaz (PEP), endoproteaz (EP) ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan grupta seçilir; söz konusu enzim, bir foto çapraz baglanmis metakrilik hiyal'üronik asit türevleri (HA-EDA-MA) hidrojelinde tutulur; burada hiyalL'ironik asit türevleri, karbonik fenilesterler veya haloformik fenilesterler arasindan seçilen bir karbonatlama maddesi ile aktivasyondan sonra en az bir hidroksil grubunun etilendiamin (EDA) ile reaksiyon ve ardindan metakrilik anhidrit arasinda bulunan moleküler agirliga sahip hiyalüronik asit (HA) veya bunun bir tuzunu içerir. Istem 1'e göre bir bilesim olup, burada söz konusu enzim, 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda hidrojel içinde tutulur. Istemler 1-2'den herhangi birine göre bir bilesim olup, söz konusu bilesim, jel formundadir. Istem 1-2'den herhangi birine göre bir bilesim olup, söz konusu bilesim, dondurularak kurutulmus toz formundadir. istem 4'e göre bir bilesim olup, ayrica polimer agirligina göre %0,1 ile %10 w/w arasinda bir konsantrasyonda en az bir kriyo-koruyucu içerir; soz konusu kriyoprotektan tercihen trehalozdur. Istem 1-5`ten herhangi birine göre bir bilesim olup, burada, söz konusu enzim PEP oldugunda, Flavobacterium meningosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) veya Aspergillus niger (AN) veya bunlarin bir kombinasyonundan olusan grupta seçilen bir mikroorganizmadan türetilir; EP oldugunda ise bir arpa endo-proteazdir. Istemler 1-6'dan herhangi birine göre bir bilesim olup çölyak hastaliginin tedavisinde kullanim içindir. Oral uygulama için bir farmasotik formülasyon olup, söz konusu formülasyon, Istemler 1-8'dan herhangi birine göre bir bilesim içerir. Istemler1-6'dan herhangi birine göre bir bilesimin hazirlanmasi için bir proses olup, söz konusu proses, %1 w/v ile %20 w/v arasindaki bir konsantrasyonda sulu solüsyon içinde 180-800 nm araliginda bir dalga boyunda foto- isinlanmasi yoluyla foto-çapraz baglanma HA-EDA-MA türevlerini içerir. burada adi geçen foto çapraz baglama en az bir eksojen enzim oldugunda 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda gerçeklestirilir burada sözü edilen foto çapraz baglama, ekzojen enzim olmadiginda gerçeklestirilir; bu enzim, sonrasinda elde edilen hidrojellerin, 1 mU/mg ve 100U/mg polimer arasinda bir konsantrasyonda bir eksojen enzim solüsyonu ile temas ettirilmesiyle yüklenir; burada adi geçen enzim, prolil endopeptidaz (PEP), endoproteaz (EP) ve bunlarin kombinasyonundan olusan grupta seçilir; burada HA-EDA-MA türevleri, en az bir hidroksil grubunun etilendiamin (EDA) ile reaksiyona sokularak ve ardindan metakrilik anhidrit (MA) ile reaksiyona sahip olan hiyalüronik asit (HA) veya bunun bir tuzunu içerir. istem 9'a göre proses olup, HA-EDA-MA türevlerinin asagidaki adimlara göre hazirlanmasini içermektedir. (a) en azindan bir hidroksil HA grubunun aktivasyonunu elde etmek için karbonik fenilesterler veya haloformik fenilesterler arasindan seçilen bir karbonatlama maddesi ile polar aprotik bir solvent içinde bir hiyalüronik asit (HA) tuzunun temas ettirilmesi, burada adi geçen HA adi geçen polar aprotik organik solventte çözünebilen bir tuz formundadir. (b) (a) adimindan elde edilen aktive HA tuzunun, nükleofilik ikame yoluyla HA-EDA elde etmek için etilendiamin (EDA olarak belirtilen NH2-CH2- CH2-NH2) ile temas ettirilmesi; (0) (b) adimindan elde edilen HA-EDA'nin, nükleofilik ikame yoluyla, HA- EDA-MA elde etmek için metakrilik anhidrit (MA olarak belirtilir) ile temas ettirilmesi. istem 10'a göre proses olup, burada HA-EDA-MA türevlerinin hazirlanmasina yönelik asamalar daha sonra ayni kapta gerçeklestirilir.
TR2018/09421T 2014-05-07 2015-05-06 Çölyak hastaliğinda oral enzi̇m tedavi̇si̇ i̇çi̇n metakri̇li̇k hi̇yalüroni̇k asi̇t türevleri̇ni̇n hi̇drojelleri̇. TR201809421T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITFI20140106 2014-05-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201809421T4 true TR201809421T4 (tr) 2018-07-23

Family

ID=51220659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/09421T TR201809421T4 (tr) 2014-05-07 2015-05-06 Çölyak hastaliğinda oral enzi̇m tedavi̇si̇ i̇çi̇n metakri̇li̇k hi̇yalüroni̇k asi̇t türevleri̇ni̇n hi̇drojelleri̇.

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10709787B2 (tr)
EP (1) EP3139961B1 (tr)
JP (1) JP6532483B2 (tr)
CN (1) CN106488772B (tr)
CA (1) CA2946811C (tr)
DK (1) DK3139961T3 (tr)
ES (1) ES2675574T3 (tr)
PT (1) PT3139961T (tr)
RU (1) RU2679638C2 (tr)
TR (1) TR201809421T4 (tr)
WO (1) WO2015169849A1 (tr)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7320788B2 (en) * 2002-02-14 2008-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue
EP1790665B1 (en) * 2004-09-07 2014-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing water-soluble modified hyaluronic acid
WO2007044906A2 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Alvine Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced gastrointestinal stability of oligopeptides and polypeptides
ITRM20080636A1 (it) * 2008-11-28 2010-05-29 Univ Palermo Procedimento per la produzione di derivati funzionalizzati dell acido ialuronico e relativi idrogeli.

Also Published As

Publication number Publication date
EP3139961A1 (en) 2017-03-15
JP2017514836A (ja) 2017-06-08
PT3139961T (pt) 2018-07-13
CA2946811A1 (en) 2015-11-12
ES2675574T3 (es) 2018-07-11
DK3139961T3 (en) 2018-07-16
CA2946811C (en) 2022-05-03
RU2016147586A (ru) 2018-06-08
JP6532483B2 (ja) 2019-06-19
RU2679638C2 (ru) 2019-02-12
US10709787B2 (en) 2020-07-14
WO2015169849A1 (en) 2015-11-12
RU2016147586A3 (tr) 2018-10-05
EP3139961B1 (en) 2018-04-04
US20170049896A1 (en) 2017-02-23
CN106488772A (zh) 2017-03-08
CN106488772B (zh) 2020-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Köllner et al. Mucus permeating thiomer nanoparticles
CN109564213A (zh) 检测伤口微生物感染
US20200277449A1 (en) Injectable hybrid alginate hydrogels and uses thereof
Fabia et al. Effects of Phosphatidylcholine and Phosphatidylinositol on Acetic-Acid-lnduced Colitis in the Rat
Ibrahim et al. Design and characterization of chitosan/citrate films as carrier for oral macromolecule delivery
CN111065421B (zh) 含有交联明胶衍生物粒子的伤口敷料
Leichner et al. Intestinal enzyme delivery: Chitosan/tripolyphosphate nanoparticles providing a targeted release behind the mucus gel barrier
Laffleur et al. Evaluation of functional characteristics of preactivated thiolated chitosan as potential therapeutic agent for dry mouth syndrome
RU2381238C2 (ru) Способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей
Berezin et al. Chitosan-isoniazid conjugates: Synthesis, evaluation of tuberculostatic activity, biodegradability and toxicity
WO2018134268A1 (en) Injectable hydrogels and uses thereof
CN115066231A (zh) 合成组织屏障及其用途
Zhao et al. A KPV-binding double-network hydrogel restores gut mucosal barrier in an inflamed colon
CN101056657A (zh) 抗病毒化合物
WO2021168996A1 (en) Catalase nanocapsules and methods for use
Laffleur et al. In vitro and ex vivo evaluation of biomaterials' distinctive properties as a result of thiolation
KR20210131375A (ko) 소화관 점막 보호 겔
TR201809421T4 (tr) Çölyak hastaliğinda oral enzi̇m tedavi̇si̇ i̇çi̇n metakri̇li̇k hi̇yalüroni̇k asi̇t türevleri̇ni̇n hi̇drojelleri̇.
Müller et al. Immobilization of 2-mercaptoethylamine on oxidized chitosan: a substantially mucoadhesive and permeation enhancing polymer
US20200138711A1 (en) Injectable hydrogels and uses thereof
MD et al. Thiolated polymers: stability of thiol moieties under different storage conditions
CN102573921A (zh) 低聚物-拟钙剂结合物及相关化合物
Ke et al. Development of resveratrol with thiolated alginate as a supplement to prevent nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)
Kali et al. Thiolated Cellulose: A Dual-Acting Mucoadhesive and Permeation-Enhancing Polymer
JP2521229B2 (ja) 大腸崩壊性組成物及びその製造法