CN104603156B - 引入有氨基酸和甾基的透明质酸衍生物 - Google Patents

引入有氨基酸和甾基的透明质酸衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明提供含有式(I)或式(II)表示的二糖单元的透明质酸衍生物、以及由该透明质酸衍生物和药物形成的复合物。

Description

引入有氨基酸和甾基的透明质酸衍生物
技术领域
本发明涉及被氨基酸修饰并引入有甾基的透明质酸衍生物、该透明质酸衍生物和药物的复合物、以及含有该透明质酸衍生物和药物的药物组合物。
背景技术
近年来，由于重组基因技术和化学合成技术的发展，以蛋白质和肽为活性成分的制剂被实用化，其数量逐年持续递增。但是，蛋白质和肽难以通过消化管或粘膜等吸收，另外在体内不稳定，血中半衰期短。因此，蛋白质制剂和肽制剂需要通过频繁注射来给药，给患者和医务人员均带来很大的负担。期望开发出在不损害药理活性的情况下用于将蛋白质或肽胶囊化的具有缓释性或靶向功能的DDS(药物递送系统)基材。另外，从给药效率的观点考虑，期望向基材中尽可能地封装入大量的蛋白质、肽。
已知，蛋白质和肽的药理活性因为它们的高维结构而比较大，由于与有机溶剂或空气界面的接触、压力或温度、pH等外部环境引起的变性和凝集，蛋白质和肽的药理活性会受到损伤。另外，当把变性或凝集的蛋白质给药于体内时，已知会增加抗原性等的风险。对于以蛋白质或肽为活性成分的缓释制剂来说，从制剂化工序起，经过制剂的贮存期间，直至给药后该活性成分在生物体内释放为止，寻求确保蛋白质和肽的稳定性。
对于低分子药物来说，关于药物稳定性的课题与蛋白质·肽相比不那么大，但依然对具有提高难溶性药物的溶解性的功能、或具有缓释性或靶向功能的DDS基材存在很大需求。
另外，从安全性的角度考虑，用于制剂的基材必须兼具非抗原性、 非诱变源性、无毒性、生物降解性。
近年来，报道有使用多糖作为药物载体的基材等。其中，透明质酸(HA)已知是于1934年由K.Meyer从牛眼的玻璃体中分离出的生物材料(多糖)，一直作为细胞外基质的主要成分而熟知。HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过β(1→3)糖苷键连接而成的二糖单元构成的粘多糖的一种。HA在化学和物理结构方面没有种类的差异，人也具有对其的代谢途径，HA是在免疫性和毒性方面最安全的医用生物材料(Biomaterial)之一。
除了上述安全性等特性以外，近年来，透明质酸作为与细胞的粘附、增殖、移动的诱导相关的生理活性物质的方面也备受瞩目。进而从制造的观点考虑，可以由微生物大量生产高分子量的透明质酸，因此关于透明质酸的DDS研究日益盛行。通过将药物与透明质酸形成轭合物，据报道能够实现药物向癌组织的靶向(专利文献1)、向肝脏的靶向(专利文献2)、降低抗原性等(专利文献3)。另外，报道了在生物体内存在CD44、RHAMM(调控透明质酸介导的游走性的受体)、LYVE-1(淋巴管内皮细胞透明质酸受体1)、HARE(胞吞透明质酸受体)等HA受体(非专利文献7和非专利文献8)。特别是CD44和RHAMM在大量的癌细胞中过表达，因此正在尝试使用HA作为癌靶向载体的基材。作为其粒子，可举出紫杉醇-HA轭合物(非专利文献9～11和专利文献12)、喜树碱-HA轭合物(专利文献13)、多柔比星-HPMA[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]-HA轭合物(非专利文献12)、酪酸-HA轭合物(非专利文献13)、多柔比星封入HA-PEG-PLGA纳米粒子(非专利文献14)、siRNA封入HA凝胶(非专利文献15)、多柔比星封入HA被覆脂质体(非专利文献16)等。进而，非专利文献17报道了通过酰胺键引入的经由乙二胺连接基与胆酸轭合的HA衍生物。以这些HA为基材的载体可在体外被有效地吸收到CD44高度表达的细胞中(例如非专利文献9)。但是，在将HA系统给药时，已知HA可被肝脏等的肝窦内皮细胞中存在的HARE受体瞬间吸收而代谢，迅速从血中消失(非专利文献18～20)。这样，在使用透明质酸来延长滞留性或作为靶向用DDS基材时，其在血中滞留时间短成为缺点。认为 透明质酸的连续6个糖单元是受体的识别部位，通过修饰羧基，试图进行血中滞留时间的延长(专利文献4、5和6)。
通过高度修饰透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基，开发出了实现血中滞留性长期化的透明质酸衍生物，公开了其有用性(专利文献7)。一般来说，通过提高葡糖醛酸部分的羧基的修饰率，也可以使透明质酸衍生物的血中滞留性长期化。但是，已知两者并非线性相关，在某一阀值处，滞留性就会发生急剧变化。
作为透明质酸中的羧基被氨基酸修饰的粒子，例如可举出在N-甲基吗啉的存在下，使用通过采用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪而生成的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉(以下也称为DMT-MM)作为缩合剂，通过甘氨酸的乙酯的修饰，但修饰率最大为20％(非专利文献1)。另外，作为使用三嗪系化合物作为缩合剂的例子，报道了引入有丙氨酸的透明质酸对酶解的抗性增强，可期待用作粘性的添加物(非专利文献2)、还报道了通过类似的方法，用其他的氨基酸进行的修饰(非专利文献3，专利文献9)。另外，还存在使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(以下也称为EDC)作为缩合剂，通过用亮氨酸的甲酯盐酸盐、缬氨酸的甲酯盐酸盐、异亮氨酸的甲酯盐酸盐、脯氨酸的甲酯盐酸盐、苯丙氨酸的甲酯盐酸盐、精氨酸的甲酯盐酸盐和组氨酸的甲酯盐酸盐修饰，在不脱保护的情况下凝胶化，制备非水溶性的生物相容性的膜的例子，但不知晓修饰率(专利文献8)。另外，在本申请优先权日以后公开的专利文献15中报道了，通过将透明质酸的羧基用特定的氨基-羧酸或其酰胺修饰而得到的透明质酸衍生物，兼具生物降解性和血中滞留性两者，而且对药物从胞内体向细胞质内的释放有效。
另外，报道了：作为来自多糖的药物载体，引入有胆甾醇基等的普鲁兰多糖衍生物在水溶液中形成纳米尺寸的微粒，具有作为与疏水性低分子、肽、蛋白质等形成复合物的主分子的功能(非专利文献4)。通过对摄取蛋白质后的该普鲁兰多糖衍生物进行热力学评价可知，被摄取的蛋白质由于与普鲁兰多糖的羟基之间形成氢键而稳定化(非专利文献5)。
另外，还报道了羧基甲基纤维素(CMC)(专利文献10)和引入有亚油酸的壳聚糖(非专利文献6)用作与蛋白质的复合物形成材料。进而，专利文献11中，报道了一种包含具有交联基的透明质酸衍生物和具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的组合物，其中，具有交联基的透明质酸衍生物是通过在亲水性多糖类衍生物的存在下，透明质酸或具有可交联基团的其衍生物的交联形成反应而制备的。专利文献14报道了，具有胆甾醇基作为疏水基的基团引入到透明质酸中的透明质酸衍生物通过在水中缔合而形成微粒，从而形成与药物的复合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO92/06714号小册子
专利文献2：特开2001-81103号公报
专利文献3：特开平2-273176号公报
专利文献4：特开平5-85942号公报
专利文献5：国际公开WO01/05434号小册子
专利文献6：国际公开WO01/60412号小册子
专利文献7：国际公开WO2006/028110号小册子
专利文献8：国际公开WO92/20349号小册子
专利文献9：国际公开WO2011/148116号小册子
专利文献10：国际公开第WO2002/022154号
专利文献11：国际公开第WO2008/136536号
专利文献12：国际公开第WO2004/035629号
专利文献13：国际公开第WO2009/074678号
专利文献14：国际公开第2010/053140号
专利文献15：国际公开第2012/118189号
非专利文献
非专利文献1：Biomacromolecules，第8卷，第2190-2195页，2007年
非专利文献2：CARBOHYDRATE Polymers，第86卷，第747-752 页，2011年
非专利文献3：CARBOHYDRATE Polymers，第87卷，第2211-2216页，2012年
非专利文献4：Macromolecules，第26卷，第3062-3068页，1993年
非专利文献5：Colloids and Surfaces，第112卷，第91-95页，1996年
非专利文献6：Carbohydrate Polymers，第62卷，第293-298页，2005年
非专利文献7：MOLECULAR PHARMACEUTICS.，第5卷，第474-486页，2008年
非专利文献8：Journal of Drug Targeting.，第16卷，第91-107页，2008年
非专利文献9：Bioconjugate Chem.，第10卷，第755-763页，1999年
非专利文献10：Clinical Cancer Research.，第14卷，第3598-3606页，2008年
非专利文献11：Bioconjugate Chem.，第19卷，第1319-1325页，2008年
非专利文献12：Pharmaceutical Research.，第19卷，第396-402页，2002年
非专利文献13：Clinical Cancer Research.，第10卷，第4822-4830页，2004年
非专利文献14：Nanomedicine：Nanotechnology，Biology，andMedicine.，第3卷，第246-257页，2007年
非专利文献15：Journal of Controlled Release，第119卷，第245-252页，2007年
非专利文献16：Neoplasia，第6卷，第343-353页，2004年
非专利文献17：Journal of Materials Chemistry.，第19卷， 第4102-4107页，2009年
非专利文献18：Cell and Tissue Research.，第243卷，第505-510页，1985年
非专利文献19：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，第275卷，第37733-37741页，2000年
非专利文献20：The Biochemical Journal，第200卷，第415-424页，1981年
发明内容
发明要解决的课题
透明质酸衍生物的血中滞留性虽然与葡糖醛酸部分的羧基的修饰率相关，但已知在某一阀值处会发生急剧变化，仅通过控制羧基的修饰率，难以将透明质酸衍生物的血中滞留性控制在期望的范围内。因此，期望通过更简便且可靠的方法来控制血中滞留性的方法。另外，当透明质酸受体对透明质酸的识别降低时，可以预见：透明质酸难以接受在生物体内的代谢，作为透明质酸本身所具有的特性的生物降解性下降。因此，要求兼具生物降解性(安全性)和血中滞留性两者的特征的新型基材。
本发明要解决的课题是提供一种兼具生物降解性和血中滞留性两者的特性的透明质酸衍生物。另外，本发明要解决的进一步的课题是提供该透明质酸衍生物和药物的复合物和含有该透明质酸衍生物的药物组合物、尤其是该透明质酸衍生物和药物的复合物。
解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过使透明质酸或其盐的葡糖醛酸部分的羧基与特定的氨基酸或氨基酸酰胺反应转化成酰胺而得到的中间体的、葡糖醛酸部分的羧基和/或氨基酸部分的羧基中进一步引入甾基而得到的透明质酸衍生物兼具生物降解性和血中滞留性两者的特性，并且该透明质酸衍生物和药物的复合物具有作为药物组合物的良好的特性，至此完成了本发明。另外，在深入研究的过程中发现，使用酪氨酰胺、色氨酰胺等某些氨基酸酰胺(后述的Ra为可被 芳基或杂芳基取代的C1-6烷基、且该芳基被1个以上羟基取代的情况)时，与不引入甾基的情况相比，引入甾基的情况，尽管甾基具有疏水性，但在纯水中更好地分散，至此完成了本发明。进而，在使用苯丙氨酰胺(后述的Ra为可被芳基取代的C1-6烷基、且该芳基为未取代的情况)的基础上进一步以6％以下的引入率引入甾基的情况，与不使用苯丙氨酰胺而以6％以下的引入率引入甾基的情况相比，在纯水中，二者的情况均能分散，但在生理盐水中，后者的情况能分散的状况相比，前者的情况产生凝集而形成沉淀，前者的情况例如作为持续性的皮下给药用注射制剂的基材是非常优异的，至此完成了本发明。
即，本发明涉及兼具生物降解性和血中滞留性的透明质酸衍生物、以及通过引入甾基而能够在水中更好地分散的透明质酸衍生物、以及、含有这些透明质酸衍生物和具有药理活性的化合物的复合物。进而，本发明涉及这些透明质酸衍生物的制造方法、以及含有药物和这些透明质酸衍生物的药物组合物及其制造方法。
本发明的一个方面是提供以下的(1)～(10)项的透明质酸衍生物。
(1)透明质酸衍生物，含有式(I)表示的重复单元，
[化1]
[式中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
R5为氢原子、甲酰基、或C1-6烷基羰基；
X1为羟基、C1-6烷氧基、-O-Q+、-NR7R8、或-NR9-Z1-Z2；
Q+表示抗衡阳离子；
R6、R7、R8和R9独立地选自氢原子和C1-6烷基；
Ra为氢原子或C1-6烷基，在此，该烷基可被独立地选自羟基、羧基、 氨基甲酰基、C1-6烷硫基、芳基和杂芳基的1个以上基团取代，在此，该芳基可被1个以上羟基取代；
Z1为C2-30亚烷基、或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，在此，该亚烷基可被独立地选自-O-、-NRg-和-S-S-的1～5个基团插入，m为选自1～100的整数；
Z2选自下式表示的基团：
-NRb-Z3、
-NRb-COO-Z3、
-NRb-CO-Z3、
-NRb-CO-NRc-Z3、
-COO-Z3、
-CO-NRc-Z3、
-O-CO-NRc-Z3、
-O-COO-Z3、
-S-Z3、
-CO-Za-S-Z3、
-O-CO-Zb-S-Z3、
-NRb-CO-Zb-S-Z3、和
-S-S-Z3；
Rb和Rc独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，在此，该基团的烷基部分可被独立地选自-O-和-NRf-的1～3个基团插入；
Rf独立地选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基、和羟基C2-12烷基，该基团的烷基部分可被选自-O-和-NH-的1～2个基团插入；
Rg独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基或羟基C2-20烷基，该基团的烷基部分可被独立地选自-O-和-NH-的1～3个基团插入；
Z3为甾基；
Za为C1-5亚烷基；
Zb为C2-8亚烷基或C2-8亚烯基]，
其中，
当所述透明质酸衍生物不含X1为-NR9-Z1-Z2的式(I)表示的重复单 元时，所述透明质酸衍生物还含有式(II)表示的重复单元，
[化2]
[式中，R1a、R2a、R3a和R4a独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
R5a为氢原子、甲酰基、或C1-6烷基羰基；
X2为-NR9-Z1-Z2，在此，R9、Z1和Z2如上述所定义的]。
(2)上述(1)所述的透明质酸衍生物，还含有式(IIb)表示的重复单元，
[化3]
[式中，R1b、R2b、R3b和R4b独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
R5b为氢原子、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
Xb选自羟基和-O-Q+、在此，Q+表示抗衡阳离子]。
(3)上述(1)或(2)所述的透明质酸衍生物，其中，在式(I)中，X1为-NR9-Z1-Z2。
(4)上述(1)～(3)任一项所述的透明质酸衍生物，其中，所存在的二糖重复单元中的式(I)表示的二糖单元的比例为70～100％。
(5)上述(1)～(4)任一项所述的透明质酸衍生物，其中，存在的二糖重复单元中的含有基团-NR9-Z1-Z2的二糖单元的比例为3～50％。
(6)上述(1)或(2)所述的透明质酸衍生物，其不含X1为-NR9-Z1-Z2 的式(I)表示的重复单元。
(7)上述(1)、(2)和(6)任一项所述的透明质酸衍生物，其中，存在的二糖重复单元中的(I)表示的重复单元的比例和式(II)表示的重复单元的比例之和为70～100％。
(8)上述(1)～(7)任一项所述的透明质酸衍生物，其使用仅由上述(2)中定义的式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸制造，其在R1b、R2b、R3b和R4b全部为氢原子、R5b为乙酰基、且Xb为-O-Na+时的重均分子量为3kDa～1500kDa。
(9)上述(1)～(8)任一项所述的透明质酸衍生物，其中，Z1为C2-10亚烷基，Z2为-NH-COO-Z3，Z3为胆甾醇基。
(10)上述(1)～(9)任一项所述的透明质酸衍生物，其通过将分别含有式(IIb)表示的重复单元和式(Ia)表示的重复单元的透明质酸衍生物
[化4]
[式中，Xa选自羟基、-O-Q+、C1-6烷氧基、和-NR7R8，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、Q+和Ra如上述(1)所定义]
与下式
HNR9-Z1-Z2
[式中，R9、Z1、和Z2如上述(1)所定义]
表示的化合物反应而得到。
本发明的另一个方面是提供以下的(11)和(12)的药物组合物。
(11)药物组合物，含有上述(1)～(10)任一项所述的透明质酸衍生物和药物。
(12)上述(11)所述的药物组合物，其中，药物通过与透明质酸衍生物形成复合物而被负载。
本发明的又一个方面是提供在上述(1)～(10)任一项所述的透明质酸衍生物中负载有药物的透明质酸衍生物-药物复合物。优选提供通过透明质酸衍生物在水中缔合而形成微粒以负载药物的透明质酸衍生物-药物复合物。
本发明的再一个方面是提供含有上述(1)～(10)任一项所述的透明质酸衍生物的生物降解性的药物载体。
本发明的还一个方面是提供药物的给药方法，包括向对象给予治疗有效量的药物和上述(1)～(10)任一项所述的透明质酸衍生物。
予以说明，X1为羟基、-O-Q+、或-NR9-Z1-Z2时，Ra中的芳基(可被1个以上羟基取代)优选为未取代。
发明效果
通过使用本发明的透明质酸衍生物，可以提供在保持它们的生物活性的条件下大量封入药物、特别是低分子化合物或具有药效的蛋白质或肽的缓释制剂。另外，透明质酸衍生物在安全性方面也是优异的，并且在药物的血中滞留性和生物降解性这两方面，作为药物制剂的载体，以及作为持续性的皮下给药用注射制剂的基材，具有特别优异的性质。另外，通过调整本发明的透明质酸衍生物的羧基的修饰程度、即所引入的基团-NR9-Z1-Z2和/或氨基酸(包括氨基酸酰胺)的比例，也可以控制使用该衍生物制造的制剂的药代动力学。
附图说明
[图1-1]是实施例1-1制备的胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯(Chol-C6)的盐酸盐的1H-NMR谱的一例。
[图1-2]是以实施例1-3制备的99kDa的HA-Na为起始原料制备的透明质酸的TBA盐(HA-TBA)的1H-NMR谱(溶剂：D2O)的一例。
[图1-3]是以实施例1-4制备的99kDa的HA-Na为起始原料制备的HA-Ala的1H-NMR谱的一例。
[图1-4]是以实施例1-4制备的99kDa的HA-Na为起始原料制备的HA-Ala-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：7％)。
[图1-5]是以实施例1-5制备的99kDa的HA-Na为起始原料制备的HA-ThrNH2/Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-6]是实施例1-6制备的HA-Ser-OEt的1H-NMR谱的一例。
[图1-7]是实施例1-6制备的HA-Ser的1H-NMR谱的一例。
[图1-8]是实施例1-6制备的HA-Ser-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-9]是实施例1-7制备的HA-Gly-OEt的1H-NMR谱的一例。
[图1-10]是实施例1-7制备的HA-Gly的1H-NMR谱的一例。
[图1-11]是实施例1-7制备的HA-Gly-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-12]是实施例1-8制备的HA-Thr的1H-NMR谱的一例。
[图1-13]是实施例1-8制备的HA-Thr-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-14]是实施例1-9制备的HA-Asn的1H-NMR谱的一例。
[图1-15]是实施例1-9制备的HA-Asn-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：7％)。
[图1-16]是实施例1-10制备的HA-Asp的1H-NMR谱的一例。
[图1-17]是实施例1-10制备的HA-Asp-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-18]是实施例1-11制备的HA-Ile的1H-NMR谱的一例。
[图1-19]是实施例1-11制备的HA-Ile-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-20]是实施例1-12制备的HA-Leu的1H-NMR谱的一例。
[图1-21]是实施例1-12制备的HA-Leu-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-22]是实施例1-13制备的HA-Val的1H-NMR谱的一例。
[图1-23]是实施例1-13制备的HA-Val-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-24]是实施例1-14制备的HA-Phe的1H-NMR谱的一例。
[图1-25]是实施例1-14制备的HA-Phe-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-26]是实施例1-15制备的HA-SerNH2/Chol/FL的1H-NMR谱(溶剂：0.02N DClDMSO-d6/D2O混液)的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-27]是实施例1-15制备的HA-SerNH2/Chol/FL的1H-NMR谱(溶剂：D2O)的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-28]是实施例1-16制备的HA-GlyNH2/Chol/FL的1H-NMR谱(溶剂：0.02N DClDMSO-d6/D2O混液)的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-29]是实施例1-16制备的HA-GlyNH2/Chol/FL的1H-NMR谱(溶剂：D2O)的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-30]是实施例1-17制备的HA-LeuNH2/Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-31]是实施例1-18制备的HA-ValNH2/Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-32]是实施例1-19制备的HA-Ala/Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-33]是实施例1-20制备的HA-Ser-OEt/Chol/FL的1H-NMR谱的一例。
[图1-34]是实施例1-20制备的HA-Ser/Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-35]是比较例1-1制备的HA-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图1-36]是比较例1-2制备的HA-EDOBEA的1H-NMR谱的一例。
[图1-37]是比较例1-2制备的HA-EDOBEA-Ac/FL的1H-NMR谱的一例。
[图1-38]是比较例1-3制备的HA-Tyr的1H-NMR谱的一例。
[图1-39]是比较例1-3制备的HA-Tyr-Chol/FL的1H-NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图2-1-1]是表示99k HA-Ala-Chol-7％/FL(表9：样品2-1)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-2]是表示99k HA-Ala-Chol-24％/FL(表9：样品2-2)和99k HA-Chol-24％/FL(表9：比较品2-2)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-3]是表示99k HA-Ala-Chol-30％/FL(表9：样品2-3)和99k HA-Chol-25％/FL(表9：比较品2-3)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-4]是表示50k HA-Ala-Chol-6％/FL(表9：样品2-4)和50k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-4)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-5]是表示50k HA-Ala-Chol-22％/FL(表9：样品2-5)和50k HA-Chol-20％/FL(表9：比较品2-5)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-6]是表示50k HA-Ala-Chol-26％/FL(表9：样品2-6)和50k HA-Chol-27％/FL(表9：比较品2-6)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-7]是表示10k HA-Ala-Chol-16％/FL(表9：样品2-7)和10k HA-Chol-15％/FL(表9：比较品2-7)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-8]是表示99k HA-ThrNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-8)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-9]是表示99k HA-ThrNH2/Chol-24％/FL(表9：样品2-9)和99k HA-Chol-24％/FL(表9：比较品2-2)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-10]是表示99k HA-ThrNH2/Chol-31％/FL(表9：样品2-10)和99k HA-Chol-25％/FL(表9：比较品2-3)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-11]是表示99k HA-Ser-Chol-6％/FL(表9：样品2-11)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-12]是表示99k HA-Gly-Chol-6％/FL(表9：样品2-12)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-13]是表示99k HA-Thr-Chol-6％/FL(表9：样品2-13)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-14]是表示99k HA-Asn-Chol-7％/FL(表9：样品2-14)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-15]是表示99k HA-Asp-Chol-6％/FL(表9：样品2-15)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-16]是表示99k HA-Ile-Chol-6％/FL(表9：样品2-16)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-17]是表示99k HA-Leu-Chol-6％/FL(表9：样品2-17)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-18]是表示99k HA-Val-Chol-6％/FL(表9：样品2-18)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-19]是表示99k HA-Phe-Chol-6％/FL(表9：样品2-19)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-20]是表示99k HA-ValNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-20)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-21]是表示99k HA-SerNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-21)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实 施例2-2)。
[图2-1-22]是表示99k HA-LeuNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-22)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-23]是表示99k HA-GlyNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-23)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-24]是表示99k HA-Ala/Chol-6％/FL(表9：样品2-24)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-25]是表示99k HA-Ser/Chol-6％/FL(表9：样品2-25)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-1-26]是表示99k HA-Tyr-Chol-6％/FL(表9：比较品2-8)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例2-2)。
[图2-2-1]是99k HA-Ala-Chol-7％/FL(表9：样品2-1)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-2]是99k HA-Ala-Chol-24％/FL(表9：样品2-2)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-3]是99k HA-Ala-Chol-30％/FL(表9：样品2-3)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-4]是50k HA-Ala-Chol-6％/FL(表9：样品2-4)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-5]是50k HA-Ala-Chol-22％/FL(表9：样品2-5)和给药该 样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-6]是50k HA-Ala-Chol-26％/FL(表9：样品2-6)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-7]是10k HA-Ala-Chol-16％/FL(表9：样品2-7)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-8]是99k HA-ThrNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-8)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-9]是99k HA-ThrNH2/Chol-24％/FL(表9：样品2-9)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-10]是99k HA-ThrNH2/Chol-31％/FL(表9：样品2-10)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-11]是99k HA-Ser-Chol-6％/FL(表9：样品2-11)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-12]是99k HA-Gly-Chol-6％/FL(表9：样品2-12)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-13]是99k HA-Thr-Chol-6％/FL(表9：样品2-13)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-14]是99k HA-Asn-Chol-7％/FL(表9：样品2-14)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-15]是99k HA-Asp-Chol-6％/FL(表9：样品2-15)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-16]是99k HA-Ile-Chol-6％/FL(表9：样品2-16)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-17]是99k HA-Leu-Chol-6％/FL(表9：样品2-17)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-18]是99k HA-Val-Chol-6％/FL(表9：样品2-18)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-19]是99k HA-Phe-Chol-6％/FL(表9：样品2-19)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-20]是99k HA-ValNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-20)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-21]是99k HA-SerNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-21)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-22]是99k HA-LeuNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-22)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-23]是99k HA-GlyNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-23)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-24]是99k HA-Ala/Chol-6％/FL(表9：样品2-24)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝 脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-25]是99k HA-Ser/Chol-6％/FL(表9：样品2-25)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-2-26]是99k HA-EDOBEA-Ac/FL(比较例1-2)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，确认给药样品如何代谢(实施例2-3)。
[图2-2-27]是99k HA-Tyr-Chol-6％/FL(表9：比较品2-8)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例2-3)。
[图2-3-1]是给药99k HA-Ala-Chol-7％/FL(表9：样品2-1)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-2]是给药99k HA-Ala-Chol-24％/FL(表9：样品2-2)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-3]是给药99k HA-Ala-Chol-30％/FL(表9：样品2-3)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-4]是给药50k HA-Ala-Chol-6％/FL(表9：样品2-4)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-5]是给药50k HA-Ala-Chol-22％/FL(表9：样品2-5)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-6]是给药50k HA-Ala-Chol-26％/FL(表9：样品2-6)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-7]是给药10k HA-Ala-Chol-16％/FL(表9：样品2-7)的小 鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-8]是给药99k HA-ThrNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-8)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-9]是给药99k HA-ThrNH2/Chol-24％/FL(表9：样品2-9)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-10]是给药99k HA-ThrNH2/Chol-31％/FL(表9：样品2-10)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-11]是给药99k HA-Ser-Chol-6％/FL(表9：样品2-11)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-12]是给药99k HA-Gly-Chol-6％/FL(表9：样品2-12)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-13]是给药99k HA-Thr-Chol-6％/FL(表9：样品2-13)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-14]是给药99k HA-Asn-Chol-7％/FL(表9：样品2-14)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例 2-4)。
[图2-3-15]是给药99k HA-Asp-Chol-6％/FL(表9：样品2-15)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-16]是给药99k HA-Ile-Chol-6％/FL(表9：样品2-16)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-17]是给药99k HA-Leu-Chol-6％/FL(表9：样品2-17)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-18]是给药99k HA-Val-Chol-6％/FL(表9：样品2-18)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-19]是给药99k HA-Phe-Chol-6％/FL(表9：样品2-19)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-20]是给药99k HA-ValNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-20)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-21]是给药99k HA-SerNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-21)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-22]是给药99k HA-LeuNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-22)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-23]是给药99k HA-GlyNH2/Chol-6％/FL(表9：样品2-23)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-24]是给药99k HA-Ala/Chol-6％/FL(表9：样品2-24)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-25]是给药99k HA-Ser/Chol-6％/FL(表9：样品2-25)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-26]是给药99k HA-EDOBEA-Ac/FL(比较例1-2)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图2-3-27]是给药99k HA-Tyr-Chol-6％/FL(表9：比较品2-8)的小鼠尿样品的尺寸排阻色谱法分析结果，左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图(实施例2-4)。
[图3-1]是实施例3-1制备的HA-Gln的NMR谱的一例。
[图3-2]是实施例3-1制备的HA-Gln-Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-3]是实施例3-2制备的HA-Met的NMR谱的一例。
[图3-4]是实施例3-2制备的HA-Met-Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-5]是实施例3-3制备的HA-AlaNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-6]是实施例3-4制备的HA-AsnNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-7]是实施例3-4制备的HA-AsnNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-8]是实施例3-5制备的HA-IleNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-9]是实施例3-6制备的HA-GlnNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-10]是实施例3-7制备的HA-MetNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-11]是比较例3-1制备的HA-Glu的NMR谱的一例。
[图3-12]是比较例3-1制备的HA-Glu-Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图3-13]是比较例3-2制备的HA-Trp的NMR谱的一例。
[图3-14]是比较例3-2制备的HA-Trp-Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图4-1-1]是表示99k HA-Gln-Chol-6％/FL(表15：样品4-1)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-2]是表示99k HA-Met-Chol-6％/FL(表15：样品4-2)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-3]是表示99k HA-AlaNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-3)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-4]是表示99k HA-AsnNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-4)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实 施例4-2)。
[图4-1-5]是表示99k HA-IleNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-5)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-6]是表示99k HA-GlnNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-6)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-7]是表示99k HA-MetNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-7)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-8]是表示99k HA-Glu-Chol-6％/FL(表15：比较品4-1)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-9]是表示99k HA-Trp-Chol-6％/FL(表15：比较品4-2)和99k HA-Chol-6％/FL(表9：比较品2-1)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-1-10]是表示10k HA-Tyr-Chol-7％/FL(表15：比较品4-3)和10k HA-Chol-15％/FL(表9：比较品2-7)的血浆中浓度变化的图(实施例4-2)。
[图4-2-1]是99k HA-Gln-Chol-6％/FL(表15：样品4-1)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-2]是99k HA-Met-Chol-6％/FL(表15：样品4-2)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-3]是99k HA-AlaNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-3)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-4]是99k HA-AsnNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-4)和给 药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-5]是99k HA-IleNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-5)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-6]是99k HA-GlnNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-6)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-7]是99k HA-MetNH2/Chol-6％/FL(表15：样品4-7)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-8]是99k HA-Glu-Chol-6％/FL(表15：比较品4-1)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-9]是99k HA-Trp-Chol-6％/FL(表15：比较品4-2)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图4-2-10]是10k HA-Tyr-Chol-7％/FL(表15：比较品4-3)和给药该样品的小鼠肝脏样品的尺寸排阻色谱法分析结果，表明给药样品在肝脏中的代谢(实施例4-3)。
[图5-1]是实施例5-1制备的HA-TyrNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图5-2]是实施例5-2制备的HA-TrpNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图5-3]是实施例5-3制备的HA-PheNH2/Chol/FL的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图6-1-1]是表示实施例6-1中的作为难溶性药物的紫杉醇向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和紫杉醇的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的 上清液中的紫杉醇浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-1-2]是表示实施例6-1中的作为难溶性药物的紫杉醇向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和紫杉醇的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的紫杉醇浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-1-3]是表示实施例6-1中的作为难溶性药物的紫杉醇向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和紫杉醇的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的紫杉醇浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-1-4]是表示实施例6-1中的作为难溶性药物的紫杉醇向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和紫杉醇的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的紫杉醇浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-2-1]是表示实施例6-2中的作为难溶性药物的环孢菌素向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和环孢菌素的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的环孢菌素浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-2-2]是表示实施例6-2中的作为难溶性药物的环孢菌素向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和环孢菌素的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的环孢菌素浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-2-3]是表示实施例6-2中的作为难溶性药物的环孢菌素向本发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和环孢菌素的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的环孢菌素浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图6-2-4]是表示实施例6-2中的作为难溶性药物的环孢菌素向本 发明透明质酸衍生物中的封入(本发明的透明质酸衍生物和环孢菌素的复合化)的结果的图，纵轴表示通过使本发明透明质酸衍生物共存而提高的上清液中的环孢菌素浓度(溶解度)。纵轴的值越大，显示封入效果越高。
[图7-1]是表示实施例7-1中的紫杉醇从HA-Ala-Chol-41％中的释放结果的图，横轴表示时间(小时)，纵轴表示未释放时向HA-Ala-Chol-41％中封入(与HA-Ala-Chol-41％复合化)的紫杉醇的量。
[图7-2]是表示实施例7-2中的环孢菌素从HA-Ala-Chol-41％中的释放结果的图，横轴表示时间(小时)，纵轴表示未释放时向HA-Ala-Chol-41％中封入(与HA-Ala-Chol-41％复合化)的环孢菌素的量。
[图8-1]是实施例8制备的HA-Ala-C2-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图8-2]是实施例8制备的HA-Ala-C2-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：7％)。
[图8-3]是实施例8制备的HA-Ala-C12-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：7％)。
[图8-4]是实施例8制备的HA-Ala-C12-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：7％)。
[图8-5]是实施例8制备的HA-Ala-EO2-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：5％)。
[图8-6]是实施例8制备的HA-Ala-EO2-Chol的NMR谱的一例(胆甾醇基的引入率：6％)。
[图9]是实施例9-2制备的HA-Ala-CA的NMR谱的一例(胆烷醇基的引入率：13％)。
具体实施方式
本发明的透明质酸衍生物是含有1个以上式(I)表示的二糖单元(也指重复单元)的透明质酸衍生物。
本发明的一个方案中，透明质酸衍生物基本上由(a)上述式(I)、 (b)上述式(I)和(II)、(c)上述式(I)和式(IIb)、或(d)上述式(I)和式(II)和式(IIb)的重复单元构成。对于该透明质酸衍生物来说，在该衍生物中含有的由D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺构成的二糖重复单元中的例如80％以上、优选90％以上、更优选95％以上为式(I)、(II)或式(IIb)的重复单元。本发明的一个方案中，透明质酸衍生物仅由(a)上述式(I)、(b)上述式(I)和式(II)、(c)上述式(I)和式(IIb)、或(d)上述式(I)和式(II)和式(IIb)表示的重复单元构成。
特定的二糖单元相对于本发明透明质酸衍生物中存在的二糖重复单元的比例是指，特定的二糖单元相对于一定量的作为以二糖单元为重复单元的多糖类的本发明透明质酸衍生物中含有的全部二糖单元的比例。
在表示本发明透明质酸衍生物中含有的二糖单元的式(I)中，R1、R2、R3和R4优选全部为氢原子。R5优选为氢原子或C1-6烷基羰基，更优选为氢原子或乙酰基，进一步优选为乙酰基。另外，在表示本发明透明质酸衍生物中含有的二糖单元的(II)和(IIb)中，R1a、R2a、R3a和R4a、以及R1b、R2b、R3b和R4b优选全部为氢原子。R5a和R5b优选为氢原子或C1-6烷基羰基，进一步优选为氢原子或乙酰基，进一步优选均为乙酰基。
作为式(I)中的Ra的具体例，可举出氢原子、甲基、羟基甲基、1-羟基乙基、氨基甲酰基甲基、羧基甲基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、异丙基、2-羧基乙基、2-甲硫基乙基、2-氨基甲酰基乙基、苯基甲基、(4-羟基苯基)甲基、和吲哚-3-基甲基等。
在以基团-CHRa-为不对称中心的情况下，也包括它们各自的光学活性体及其混合物，作为H2N-CHRa-COOH(氨基酸)表示时、优选为L型(天然型)。
式(I)中，R6、R7、R8和R9例如独立地为氢原子或甲基，优选全部为氢原子。
作为式(I)中的基团-CHRa-CO-X1的方案，例如可举出基团-CHRa-COOH。作为该基团的具体例，可举出以下基团。
[化5]
在此，“*”表示与-NR6-的键合位置(下同)。
作为基团-CHRa-COOH的优选例，可举出以下基团。
[化6]
作为基团-CHRa-COOH的优选例，可举出以下基团。
[化7]
作为基团-CHRa-COOH的优选例，可举出以下基团。
[化8]
作为基团-CHRa-COOH的优选例，可举出以下基团。
[化9]
作为基团-CHRa-COOH的优选例，可举出以下基团。
[化10]
上述基团-CHRa-COOH的任一个的一部分或全部均可转换为基团-CHRa-CONH-Z1-Z2。基团-Z1-Z2的例子如后所述。
作为式(I)中的基团-CHRa-CO-X1的其他方案，例如可举出基团-CHRa-CONH2。作为该基团的具体例，可举出以下基团。
[化11]
作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化12]
作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化13]
作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化14]
作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化15]
从具有生物降解性和血中滞留性两者特性的观点考虑，上述基团是优选的基团。
从具有生物降解性和血中滞留性两者特性的观点考虑，作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化16]
从具有生物降解性和血中滞留性两者特性的观点考虑，作为基团-CHRa-CONH2的进一步优选的例子，可举出以下基团。
[化17]
从在纯水中的更佳的分散性的观点考虑，作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化18]
上述2种基团即便从作为持续性的皮下给药用注射制剂的基材观点考虑也是优选的例子。
从作为持续性的皮下给药用注射制剂的基材的观点考虑，作为基团-CHRa-CONH2的优选例，可举出以下基团。
[化19]
作为R7，更优选为氢原子和甲基，进一步优选为氢原子。
在式(I)、(II)和(IIb)中定义的羧基也可以形成式-COO-Q+表示的盐。在此，Q+只要是能与羧基在水中成盐的抗衡阳离子，就没有特殊限定，在2价以上的情况下根据价数与多个羧基形成盐。作为抗衡阳离子的例子，可举出锂离子、钠离子、铷离子、铯离子、镁离子、钙离子等金属离子；式：N+RjRkRlRm(式中，Rj、Rk、Rl和Rm独立地选自氢原子和C1-6烷基)表示的铵离子等，优选可举出钠离子、钾离子、四烷基铵离子(例如，四正丁基铵离子等)。Rj、Rk、Rl和Rm优选为选自C1-6烷基的相同基团，更优选为正丁基。
作为式(I)中的基团-CHRa-CO-X1的其他方案，例如可举出基团-CHRa-CONH-Z1-Z2。作为该基团的具体例，可举出以下基团。
[化20]
作为该基团的其他具体例，可举出以下基团。
[化21]
作为基团-CHRa-CONH-Z1-Z2的优选例，可举出以下基团。
[化22]
作为基团-CHRa-CONH-Z1-Z2的优选例，可举出以下基团。
[化23]
作为基团-CHRa-CONH-Z1-Z2的优选例，可举出以下基团。
[化24]
从具有生物降解性和血中滞留性两者特性的观点考虑，作为基团-CHRa-CONH-Z1-Z2的优选例，可举出以下基团。
[化25]
作为基团-Z1-Z2的例子，可举出基团-(C2-10亚烷基)-NH-COO-Z3。另外，也可举出基团-(C2-12亚烷基)-NH-COO-Z3。在此，作为C2-12亚烷基的例，优选可举出-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)8-、-(CH2)10-和-(CH2)12-，更优选可举出-(CH2)2-和-(CH2)6-。进而，作为基团-Z1-Z2的例子，可举出基团-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-Z3。在此，m为优选为1～20，更优选为1～10，进一步优选为1～3。作为优选的m的具体例，可举出2。作为基团-Z1-Z2的例，优选可举出基团-(己烷-1,6-二基)-NH-COO-Z3、基团-(乙烷-1,2-二基)-NH-COO-Z3和基团-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-Z3，更优选可举出基团 -(己烷-1,6-二基)-NH-COO-胆甾醇基、基团-(乙烷-1,2-二基)-NH-COO-胆甾醇基和基团-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-胆烷醇基(Cholanoyl)，进一步优选可举出基团-(己烷-1,6-二基)-NH-COO-胆甾醇基。作为Z1、Z2、基团-Z1-Z2的例子，可分别举出与国际公开第2010/053140号的Y、X1、基团-Y-X1相应的基团。作为基团-CO-NRc-Z3和基团-O-CO-NRc-Z3的例子，可分别举出Rc为氢原子的基团。
在本发明的透明质酸衍生物中，还优选含有式(II)的重复单元的透明质酸衍生物。作为进一步优选的方案中，式(I)的X1与式(II)的X2相同。在本发明的一个方面，提供含有X1为-NR9-Z1-Z2的(I)表示的重复单元、式(II)表示的重复单元和式(IIb)表示的重复单元的透明质酸衍生物。
本说明书中记载的用语“甾基”只要是具有甾体骨架的基团，就没有特殊限制。在此，作为甾体，具体可举出胆固醇、脱氢胆固醇、粪烯醇、粪甾醇、胆甾烷醇、菜油甾烷醇、麦角甾烷醇、豆甾烷醇、粪醇、豆甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、麦角甾醇、西米杜鹃醇、胆汁酸(胆烷酸、石胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、原胆酸、胆酸、去氢胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸)、睾酮、雌二醇、孕酮、皮质醇、可的松、醛固酮、皮质酮、去氧皮质酮等。作为甾基，可举出胆甾醇基(也称“胆甾烯醇基”)、豆甾基、羊毛甾基、麦角甾基、胆烷醇基、胆酰基等，优选可举出胆甾醇基(特别是下式表示的胆甾-5-烯-3β-基)、胆烷醇基(特别是下式表示的5β-胆烷-24-醇基)。
[化26]
在此，“**”表示与相邻基团的键合位置。
本说明书中记载的用语“C1-20烷基”是指碳数1～20的直链、支链的 烷基，例如包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等“C1-4烷基”，进而，包括正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、和2-乙基丁基等。在C1-20烷基中，也包括碳数为1～12的“C1-12烷基”、碳数为1～6的“C1-6烷基”。
本说明书中记载的用语“C1-6烷基”是指碳数1～6的直链、支链的烷基，例如包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等“C1-4烷基”。
本说明书中记载的用语“C1-6烷氧基”是指碳数1～6的直链、支链的烷基氧基，例如包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等“C1-4烷氧基”。
本说明书中记载的用语“C1-6烷基羰基”是指，烷基部分为如上所述的C1-6烷基的烷基羰基，例如包括乙酰基、丙酰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、仲丁基羰基、异丁基羰基、叔丁基羰基等“C1-4烷基羰基”。
本说明书中记载的用语“C1-6烷氧基”是指烷基部分为如上所述的C1-6烷基的烷基氧基，例如包括甲氧基(H3C-O-)、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基等。
本说明书中记载的用语“C1-6烷硫基”是指烷基部分为如上所述的C1-6烷基的烷硫基，例如包括甲硫基(H3C-S-)、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、仲丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基等，优选可举出甲硫基。
本说明书中记载的用语“氨基C2-20烷基”是指具有氨基作为取代基的碳数2～20的直链、支链的烷基，例如氨基可位于烷基末端的碳原子上。在氨基C2-20烷基中，也包括碳数为2～12的“氨基C2-12烷基”。
本说明书中记载的用语“羟基C2-20烷基”是指具有羟基作为取代基的碳数2～20的直链、支链的烷基，例如羟基可位于烷基末端的碳原子上。在羟基C2-20烷基中，也包括碳数为2～12的“羟基C2-12烷基”。
本说明书中记载的用语“C2-30烯基”是指碳数2～30的直链或支链的 2价饱和烃基，例如包括乙烯基、丙烯基等，包括C2-20烯基、C2-8烯基、基团-(CH2)n-(在此，n为2～30、优选为2～20、更优选为2～15)。
本说明书中记载的用语“C1-5烯基”是指碳数1～5的直链或支链的2价饱和烃基，例如包括乙烯(乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基)、丙烯(丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基)、丁烷-1,4-二基、和戊烷-1,5-二基等。
本说明书中记载的用语“C2-10烯基”是指碳数2～10的直链或支链的2价饱和烃基，例如包括乙烯(乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基)、丙烯(丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基)、丁烷-1,4-二基、戊烷-1,5-二基、己烷-1,6-二基、庚烷-1,7-二基、辛烷-1,8-二基等。“C2-10烯基”包括碳数2～8的“C2-8烯基”和碳数2～6的“C2-6烯基”。
本说明书中记载的用语“C2-8烯基”是指碳数2～8的直链或支链的2价饱和烃基，例如包括乙烯(乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基)、丙烯(丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基)、丁烷-1,4-二基、戊烷-1,5-二基、己烷-1,6-二基、庚烷-1,7-二基、辛烷-1,8-二基等。
本说明书中记载的用语“C2-8亚烯基”是指含有碳数2～8的直链或支链的1个以上双键的2价烃基，例如包括-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基和辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。在存在几何异构体的情况下，也包括它们各自的异构体和它们的混合物。
本发明中，“芳基”是指芳族碳环基，例如碳数为6～14的芳族碳环基，作为芳基的例子，可举出苯基、萘基(1-萘基和2-萘基)等。作为可被1个以上羟基取代的芳基的例子，可举出4-羟基苯基。
本发明中，“杂芳基”是指在构成环的原子中含有1或多个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子的芳族环基，可被部分饱和。环可以为单环、或与苯环或单环杂芳环稠合的2环杂芳基。构成环的原子数例如为4～15个，优选为5～14个、更优选为6～10个。作为杂芳基的例子，例如可举出呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、 苯并噻二唑、苯并噻唑基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并二氧杂环戊烯基、吲嗪基、咪唑并吡啶基等，优选可举出吲哚-2-基。
本发明的透明质酸衍生物可用作药物载体，该药物载体具有生物降解性。在此，生物降解性是指，在向大鼠和/或人静脉内给药后的15日为止的期间，肝脏中检出的药物载体发生低分子化。“发生低分子化”是指可通过用尺寸排除柱色谱测量肝脏中存在的药物载体的大小来判定(参照本申请说明书实施例2-3)。此时，如果来自肝脏的药物载体的峰顶与给药前的药物载体的峰顶相比向低分子侧移动(即，柱色谱中的保持时间延长)，则判定为药物载体具有生物降解性。予以说明，生物降解性的药物载体由于经过尿、粪便等途径被排泄到体外，有时可检测出在尿中发生低分子化，但具有疏水基的本发明透明质酸衍生物由于其疏水性容易抑制向尿的排泄，因此，虽然存在繁琐和检出次数受限的问题，但检测出在作为透明质酸的主要代谢器官的肝脏中的低分子化，在直接判定药物载体的生物降解性方面，是更优选的。
本发明的又一个方面，本发明提供本说明书中定义的透明质酸衍生物，其中，具有基团-NR9-Z1-Z2(以下也称为疏水基)的式(I)和/或式(II)的重复单元相对于该衍生物中存在的二糖的重复单元的比例(疏水基的引入率)为3～50％。
在此，疏水基的引入率通过下式计算：
[数1]
在此，在“该衍生物中存在的二糖的重复单元”中包含式(I)和式(II)的重复单元、以及式(IIb)的重复单元。该引入率可通过反应条件，例如试剂的比率来控制，例如可通过NMR测定等来确定。
疏水基的引入率为3～50％，优选为5～40％，更优选为5～35％，进 一步优选为5～25％，更进一步优选为5～20％，再进一步优选为5～10％。
在本发明的一个方案中，如后述的实施例1-4所例示的，透明质酸衍生物的式(I)中的X1为-NR9-Z1-Z2。式(I)的二糖单元相对于本发明透明质酸衍生物中存在的二糖重复单元的比例，从具有生物降解性和血中滞留性两者的特性的观点考虑，例如为70％以上、优选为75％以上、更优选为90％以上。上限为100％以下即可。该比例的范围例如为70～100％、优选为75～100％、更优选为90～100％。予以说明，透明质酸衍生物还可以含有式(I I)表示的重复单元。
在本发明的一个方案中，透明质酸衍生物如后述的实施例1-5所例示的，不含X1为-NR9-Z1-Z2的式(I)表示的重复单元。此时，存在的二糖重复单元中的(I)表示的重复单元的比例和式(I I)表示的重复单元的比例之和为70～100％、优选为80～100％、更优选为90～100％。
在此，存在的二糖重复单元中的式(II)表示的重复单元的比例优选为3～50％、更优选为5～40％、进一步优选为5～35％、更进一步优选为5～25％、又进一步优选为5～20％、再进一步优选为5～10％。另外，存在的二糖重复单元中的(I)表示的重复单元的比例优选为20～97％、更优选为30～95％、进一步优选为35～95％、更进一步优选为45～95％、又进一步优选为50～95％、再进一步优选为60～95％。
存在的二糖重复单元中的式(I I)表示的重复单元的比例为5～10％时，(I)表示的重复单元的比例优选为60～95％、更优选为70～95％、进一步优选为75～95％。
存在的二糖重复单元中的式(I I)表示的重复单元的比例为20～40％、优选为20～35％时，(I)表示的重复单元的比例优选为30～80％、更优选为45～80％、进一步优选为60～80％。
存在的二糖重复单元中的式(II)表示的重复单元的比例为10～20％时，式(I)表示的重复单元的比例优选为50～90％、更优选为60～90％、进一步优选为70～90％。
作为用于制造本发明透明质酸衍生物的原料，可使用透明质酸或其盐。作为透明质酸盐，例如可举出钠盐、钾盐、锂盐等碱金属盐，特别 优选的盐是可频繁用作药品的钠盐。HA或其药学上可接受的盐可通过提取鸡冠或猪皮下等生物来源物质的方法或生物发酵法等各种公知的方法制造，或可购入市售的产品(例如，购自电气化学工业株式会社、株式会社资生堂、生化学工业株式会社、R&D system公司等)来获得。
用作原料的仅由式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸(包括盐)的重均分子量优选为1kDa～2,000kDa，更优选为3kDa～1,500kDa，进一步优选为5kDa～1000kDa。进一步优选为10kDa～500kDa、进一步优选为10kDa～200kDa、进一步优选为45kDa～200kDa、进一步优选为50kDa～99kDa。在减小粒径和粘度、或提高溶解性的情况下，该重均分子量优选为1kDa～100kDa，进一步优选为2kDa～70kDa，进一步优选为3kDa～50kDa，进一步优选为5kDa～30kDa。在增大粘度、或提高皮下或关节腔内的滞留性的情况下，该重均分子量优选为45kDa～2000kDa，进一步优选为50kDa～2000kDa，进一步优选为100kDa～1000kDa，进一步优选为200kDa～1000kDa。从作为持续性的皮下给药用注射制剂的基材的观点考虑，该重均分子量优选为5kDa～200kDa。作为重均分子量的具体例，例如可举出5kDa、10kDa、50kDa、99kDa、230kDa和1058kDa。“kDa”是“千道尔顿”的简称。
予以说明，仅由式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸(包括盐)的重均分子量是指，在保持本发明透明质酸衍生物的主链结构的情况下，以式(IIb)中的R1b、R2b、R3b和R4b全部为氢原子、R5b为乙酰基、且Xb为-O-Na+来换算时的重均分子量。因此，例如，实际应用的原料中的部分或全部的二糖单元中Xb为-O-(四正丁基铵离子)，其重均分子量按上述换算计算为45kDa～200kDa的情况是本发明的优选的1个方案。
予以说明，一般来说，透明质酸(包括盐)难以作为单一品得到，因此其分子量作为数平均分子量或重均分子量来计算。在本发明中，以重均分子量来计算。关于重均分子量的测定方法，例如可采用记载于中浜精一等人著，“本质的高分子科学”(讲谈社发行，ISBN4-06-153310-X)中的光散乱法、渗透压法、粘度法等各种公知的方法，本说明书中所示的粘度平均分子量也可以通过使用乌氏粘度计等的本发明所属技术领域 常用的方法来测定。因此，作为原料使用的透明质酸(包括盐)和本发明透明质酸衍生物的分子量也可以作为重均分子量来计算。在使用市售的标注了分子量的透明质酸(包括盐)时，将所标注的数值作为分子量。
本发明的透明质酸衍生物的分子量没有特殊限定，在期待局部给药时的源自扩散延迟的缓释功能的情况下，优选粘度和分子量高的透明质酸，在最终剂型为溶液制剂时，为了顺利给药，优选粘度和分子量低的透明质酸。
含有式(I)表示的二糖单元的本发明的透明质酸衍生物可以通过将葡糖醛酸部分的羧基转换为酰胺来制造。例如可举出以下方法：将原料透明质酸(包括盐等)、优选仅由式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸离子交换为四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，在在适当的缩合剂的存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与式：HNR6-CHRa-COORz(式中，Rz为用于保护羧基的酯形成基、R6和Ra如本说明书中上述所定义)或式：HNR6-CHRa-CONR7R8(式中，R7和R8如本说明书中上述所定义)表示的化合物反应，在存在保护基的情况下进行脱保护(工序1)。在此，酯形成基没有特殊限定，只要是通常用于保护羧基的基团，就没有特殊限定。作为酯形成基的例子，可举出C1-6烷基、苄基、C1-6烷氧基C1-6烷基、和苄氧基C1-6烷基等。
式(I)中的基团：-NR6-CHRa-COORz和-NR6-CHRa-CONR7R8可以在所存在的多个二糖单元的每一个中相同或不同。例如，可以使用不同种类的式：HNR6-CHRa-COORz和/或HNR6-CHRa-CONR7R8表示的化合物进行上述反应。
可在上述反应中使用的缩合剂没有特殊限定，例如可举出4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉(DMT-MM)、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。
虽然没有特殊限定，但从在水和有机溶剂的混合溶剂中反应高效进行的方面考虑，优选DMT-MM。另外，通过使用DMT-MM作为缩合剂，在多个羟基共存的体系中，在抑制酯键形成的情况下，可以高选择性地在氨基和羧基之间形成酰胺键。通过使用该缩合剂，例如可以防止作为溶剂的醇与透明质酸部分的羧基反应、或防止同时存在于透明质酸部分的羧基和羟基在分子内或分子间键合而形成不期望的交联。
作为用于上述反应的溶剂，例如可举出水、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAc)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、环丁砜(SF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二烷(例如1,4-二烷)、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、己烷、乙醚、乙酸乙酯及其混合溶剂。从起始物质、修饰物和产物的溶解性以及缩合剂的反应性的观点考虑，优选使用DMSO单独或水/DMSO混合溶剂。根据作为修饰物的氨基-羧酸的种类，可将它们以甲醇溶液或二烷溶液的形式用于反应。
作为式：HNR6-CHRa-COORz表示的化合物，例如可举出：丙氨酸酯、丝氨酸酯、甘氨酸酯、苏氨酸酯、天冬酰胺酯、天冬氨酸二酯、缬氨酸酯、亮氨酸酯、异亮氨酸酯、谷氨酸二酯、蛋氨酸酯、谷氨酰胺酯、苯丙氨酸酯、酪氨酸酯、和色氨酸酯等。在此，上述酯例如为C1-6烷基酯、芳基酯、C1-6烷氧基C1-6烷基酯、芳基C1-6烷基酯等，优选为甲酯、乙酯、苄基酯等。
作为式：HNR6-CHRa-CONR7R8表示的化合物，例如可举出丙氨酰胺、丝氨酰胺、甘氨酰胺、苏氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸二酰胺、缬氨酰胺、亮氨酰胺、异亮氨酰胺、谷氨酸二酰胺、蛋氨酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酰胺、酪氨酰胺、和色氨酰胺等。
疏水基可以通过将葡糖醛酸的羧基或式(I)的基团-NR6-CHRa-COOH转换为酰胺来引入(工序2)。例如可举出以下方法：将原料透明质酸或其衍生物离子交换为四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，在适当的缩合剂的存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与式：HNR9-Z1-Z2(式中，R9、Z1、和Z2如本说明书中上述所定义)表示的引入有疏水基的胺反应。
可在上述反应中使用的缩合剂没有特殊限定，例如可举出4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉(DMT-MM)、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。
作为用于疏水基引入反应的溶剂，可举出水、DMSO、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、DMF、THF、二氯甲烷、氯仿、己烷、乙醚、乙酸乙酯及其混合溶剂。
或者，可以将葡糖醛酸的羧基或式(I)的基团-NR6-CHRa-COOH的羧基离子交换为四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，在适当的缩合剂的存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与间隔基部分反应(此时，可根据需要进行保护和脱保护反应)，转换羧基(-COOH)，然后使其与适当的试剂反应。由羧基转换的基团与反应试剂的组合的例子如下所示。
-CONR9-Z1-NRbH+Hal-Z3、
-CONR9-Z1-NRbH+Hal-COOZ3、
-CONR9-Z1-NRbH+HOCO-Z3、
-CONR9-Z1-NRbH+Hal-CO-Z3、
-CONR9-Z1-COOH+HO-Z3、
-CONR9-Z1-OH+Hal-COO-Z3、
-CONR9-Z1-COOH+NRc-Z3、
-CONR9-Z1-OCO-Hal+NRc-Z3、
-CONR9-Z1-OCOOH+HO-Z3、
-CONR9-Z1-OCOOH+Hal-Z3、
-CONR9-Z1-OCO-Hal+HO-Z3、
-CONR9-Z1-SH+Hal-Z3、
-CONR9-Z1-Hal+HS-Z3、
-CONR9-Z1-CO-Ya-Hal+HS-Z3
-CONR9-Z1-CO-Ya-SH+Hal-Z3、
-CONR9-Z1-O-CO-CH＝CH2+HS-Z3、
-CONR9-Z1-NRb-CO-C(CH3)＝CH2+HS-Z3、
-CONR9-Z1-SH+HS-R、
(式中，R9、Z1、Rb、Rc和Z3如本说明书中上述所定义，Hal表示选自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子的卤原子)。
作为反应方案，可举出脱卤代氢反应、缩合反应、脱水反应、迈克尔加成等亲核加成反应、氧化二硫化物形成反应等，它们都是众所周知的反应，本领域技术人员可进行适宜选择以发现优选的反应条件。在转化物或反应物具有羧基的情况下，可转化成N-羟基琥珀酰亚胺(以下也称为“NHS”)酯来反应。
另外，可举出以下方法：使葡糖醛酸的羧基或式(I)的基团-NR6-CHRa-COOH的羧基与2-氨乙基-2-吡啶基二硫化物反应，制备引入有具有末端被离去基修饰的巯基的间隔基的透明质酸衍生物，使其与硫代胆固醇发生亲核取代反应，形成二硫键。
进而可举出以下方法：制备在葡糖醛酸的羧基或式(I)的基团-NR6-CHRa-COOH的羧基上引入有一部分间隔基的化合物和在甾基中引入有一部分间隔基的化合物，使它们发生反应。一些具体例如上所述，进而，在Y上插入-S-S-的情况下，可举出以下方法：分别制备在葡糖醛酸的羧基或式(I)的基团-NR6-CHRa-COOH的羧基上引入有末端具有巯基的间隔基的透明质酸衍生物和引入有末端具有巯基的甾基，使它们发生氧化反应以形成二硫键。此时，其中一个巯基与2-巯基吡啶反应形成二硫化物后，可以被另一个巯基取代。
工序1和工序2的先后顺序没有关系。例如可通过如下方法进行：将原料透明质酸(包括盐等)、优选仅由式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸离子交换成四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，在适当的缩合剂的存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与式：HNR9-Z1-Z2(式中，R9、Z1、和Z2如本说明书中上述所定义)表示的引入有疏水基的胺反应， 然后在适当的缩合剂的存在下，在溶剂中使该反应物与式：HNR6-CHRa-COORz(式中，Rz为用于保护羧基的酯形成基，R6和Ra如本说明书中上述所定义)或式：HNR6-CHRa-CONR7R8(式中，R7和R8如本说明书中上述所定义)表示的化合物反应。
在本发明的一个方案中，透明质酸衍生物通过使分别含有式(IIb)表示的重复单元和式(Ia)
[化27]
[式中，Xa选自羟基、-O-Q+、C1-6烷氧基和-NR7R8，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、Q+和Ra如本说明书中上述所定义]
表示的重复单元的透明质酸衍生物与下式
HNR9-Z1-Z2
[式中，R9、Z1、和Z2如本说明书中上述所定义]
表示的化合物反应而得到。
反应通过使羧基(包括盐)与氨基缩合，将羧基转化为酰胺来进行，可采用与工序2同样的方法。
本发明可含有下式(III)表示的重复单元。因此，本发明的一个方案中，提供分别含有(a)式(I)和式(III)、(b)式(I)和式(II)和式(III)、(c)式(I)和式(IIb)和式(III)、或(d)式(I)和式(II)和式(IIb)和式(III)表示的1个以上二糖单元的透明质酸衍生物。
式(III)表示的二糖单元：
[化28]
[式中，R1c、R2c、R3c和R4c各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
R5c为氢原子、甲酰基或C1-6烷基羰基；
Re为氢原子或C1-6烷基；
Rd为氢原子、C1-6烷基、-CO-C(R10)＝CH2、或-CO-G4-Xc；
R10为氢原子或甲基；
G4选自亚苯基、C3-8亚环烷基、或-G5-(C1-10烯基)-G6-，在此，C1-10烯基部分可被插入1～3的亚苯基或C3-8亚环烷基；
G5和G6各自独立地选自直接键、亚苯基、或C3-8亚环烷基；
Xc为巯基、卤原子或下式表示的基团：
[化29]
Yb为-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH-、-CH2-(CHR16)p-2-CH2-O-、-(CH2)j-S-或-(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G-；
l、p、和j为独立地选自2～10的整数、R15和R16各自独立地选自氢原子或羟基；
a为选自2～10的整数；
b为各自独立地选自2～10的整数；
c为选自1～200的整数；
Y1为氧原子或-NRn-；
G为氧原子、硫原子或-NH-；
Rn为氢原子、C1-6烷基、-CO-(CH2)d-Ro、-(CH2)e-Rp或-(CH2)f-(Y2-(CH2)g)h-Rq；
g为各自独立地选自2～10的整数；
d、e、f和h为各自独立地选自2～10的整数；
Ro、Rp和Rq各自独立地为氢原子、羟基、羧基或-NHRr；
Y2为氧原子或-NH-；
Rr为氢原子、甲酰基或C1-6烷基羰基]。
作为制造含有式(III)表示的二糖单元的本发明透明质酸衍生物的方法，例如可举出以下方法：使上述的透明质酸的四丁基铵盐在适当的缩合剂的存在下、在溶剂中与该透明质酸盐和式：HNRe-Yb-Rw(式中，Rw为氢原子、C1-6烷基、-CO-C(R10)＝CH2、-CO-G4-Xc、羟基的保护基、氨基的保护基、或巯基的保护基，Re、Yb、R10、G4、和Xc如本说明书中上述所定义)表示的化合物反应，在存在保护基的情况下进行脱保护的方法。在上述反应中可使用本说明书上述的缩合剂和溶剂。
作为-CO-G4-Xc的具体例，可举出下式表示的基团：
[化30]
可用于上述反应的保护基团的具体例，例如记载于T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Third Edition，John Wiley&Sons，Inc.，NewYork，1999中。
作为羟基的保护基的例子，可举出C1-6烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基氨基羰基、二(C1-6烷基) 氨基羰基、芳基C1-6烷基、杂芳基C1-6烷基、芳基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷基、C1-6烷基二硫醚、((氨基C1-6烷基)羰基氧基)C1-6烷基、不饱和杂环羰基氧基C1-6烷基、芳基二(C1-6烷基)甲硅烷基、三(C1-6烷基)甲硅烷基等。作为优选的羟基的保护基，可举出乙酰基等。
-NH-或氨基的保护基的例子包括C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、C1-6烷氧羰基、C1-6烷基氨基羰基、二(C1-6烷基)氨基羰基、芳基C1-6烷基、杂芳基C1-6烷基、(芳基C1-6烷基)氨基羰基等。作为优选的氨基的保护基，可举出乙酰基、叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基等。另外，通过保护氨基，可形成邻苯二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺、戊二酰亚胺、1-吡咯基等饱和或不饱和的杂环基。
作为巯基的保护基，例如可举出乙硫基和叔丁硫基等C1-6烷硫基、2-硝基苯硫基和2-羧基苯硫基等取代的苯硫基、以及2-吡啶基硫基等杂芳基硫基。优选的例子为2-吡啶基硫基。
作为上述式(III)的-NRe-Yb-Rd表示的基的例子，可举出下式表示的基团：
-NH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH2；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NH2；
-NH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-OH；
-NH-(CH2)j-SH；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-SH；
-NH-(CH2)p-O-CO-C(R10)＝CH2；
-NH-(CH2)l-NHCO-C(R10)＝CH2；
-NH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH-CO-CH2-SH；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NH-CO-(CH2)u-SH；
-NH-(CH2)p-O-CO-CH2-CH2-SH；
-NH-(CH2)l-NHCO-(CH2)u-SH；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-O-CO-CH2-CH2-SH；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NHCO-CH2-CH2-SH；
-NH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH-CO-CH2-Br；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NH-CO-CH2-I；
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NHCO-C(R10)＝CH2；或
-NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-O-CO-C(R10)＝CH2
[式中，R10、R15、R16、Y1、c、j、l和p如本说明书中所定义的，u为1～3的整数]。
在此，透明质酸衍生物的分子中含有的R15和R16为羟基的CHR15和CHR16的个数分别为0～8，优选为0～3、进一步优选为0和1。通过调节R15和R16为羟基的CHR15和CHR16的个数，可以调节本发明透明质酸衍生物在水中的溶解度。当R15全部为氢原子时，l优选为2～6，其具体例可举出2和6。R15之一为羟基时，l的具体例可举出3。Y1为氧原子时，c的具体例可举出2。Y1为-NH-时，c的具体例可举出1～3。l和p的具体例可举出3。
作为-(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G-的具体例，例如可举出-(CH2)2-(O-CH2-CH2)c-O-、-(CH2)2-(O-CH2-CH2)c-NH-、-(CH2)3-(O-CH2-CH2-CH2)c-O-、-(CH2)3-(O-CH2-CH2-CH2)c-NH-、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O-、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-、-(CH2)3-NRn-(CH2)4-O-、-(CH2)3-NRn-(CH2)4-NH-、-(CH2)6-NRn-(CH2)6-O-、-(CH2)6-NRn-(CH2)6-NH-、-(CH2)3-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)3-O-、-(CH2)3-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)3-NH-、-(CH2)3-NRn-(CH2)4-NRn-(CH2)3-O-、-(CH2)3-NRn-(CH2)4-NRn-(CH2)3-NH-(精胺型)、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O-、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O-、-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-。在此，作为Rn，优选全部为氢原子。
作为与这些-(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G-键合的Rd的具体例，例如可举出氢原子、-CO-CH＝CH2、-CO-C(CH3)＝CH2、-CO-CH2-Cl、-CO-CH2-Br、-CO-CH2-I、-CO-CH2-SH、-CO-CH2-CH2-SH等。
另外，作为-NRe-Yb-Rd表示的基团的具体例，可举出 -NH-(CH2)3-N(-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3)-(CH2)2-SH、-NH-(CH2)2-N(-(CH2)3-NH-(CH2)4-NHCOCH3)-(CH2)3-SH和-NH-(CH2)5-N(-(CH2)3-NH-(CH2)2-NHCOCH3)-(CH2)2-SH。
进而，作为-NRe-Yb-Rd表示的基团的具体例，可举出以下基团：
-NH-(CH2)p1-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH；
-NH-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH；
-NH-CH(CO2H)-(CH2)-SH；
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-SH；和
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-CONH-CH(CONH-CH2-CO2H)-CH2-SH
(在此，R17为氢原子或C1-6烷基、p1表示2～10的整数、q表示1～200的整数。)
存在的二糖重复单元中的式(III)表示的重复单元的比例例如为0.1～99.5％，优选为1～30％。
作为制造含有式(III)表示的二糖单元的本发明透明质酸衍生物的方法，可举出以下方法：使透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基(-COOH)与式：H2N-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH2表示的二胺反应，转化为式：-CONH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH2表示的酰胺，再修饰末端的氨基，转换为基团：-CONH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NHRd表示的酰胺(工序3a)。
作为上述二胺的具体例，例如可举出H2N-(CH2)2-NH2、H2N-(CH2)3-NH2、H2N-(CH2)4-NH2、H2N-(CH2)5-NH2、H2N-(CH2)6-NH2、H2N-(CH2)7-NH2、H2N-(CH2)8-NH2、H2N-(CH2)9-NH2、H2N-(CH2)10-NH2、H2N-CH2-CHOH-CH2-NH2、H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-NH2、H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-NH2、H2N-CH2-CHOH-(CH2)3-NH2、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-NH2、H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)2-NH2、H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-NH2、H2N-CH2-(CHOH)3-CH2-NH2、H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-NH2、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-NH2、H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-NH2、H2N-CH2-CHOH-CH2-CHOH-(CH2)2-NH2、H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-CHOH-CH2-NH2、H2N-(CH2)2-(CHOH)2-(CH2)2-NH2、H2N-CH2-(CHOH)3-(CH2)2-NH2、H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-CHOH-CH2-NH2、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)4-NH2、H2N-(CH2)3-CHOH-(CH2)4-NH2、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)6-NH2和H2N-(CH2)5-CHOH-(CH2)4-NH2。
作为制造含有式(III)表示的二糖单元的本发明透明质酸衍生物的方法，可举出以下方法：使透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基(-COOH)与式：H2N-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH表示的羟胺反应，转化为式：-CONH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH表示的酰胺，再修饰末端的羟基，转换为基团：-CONH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-ORd(工序3b)。工序3a和工序3b合起来称为工序3。
作为上述羟胺的具体例，例如可举出H2N-(CH2)2-OH、H2N-(CH2)3-OH、H2N-(CH2)4-OH、H2N-(CH2)5-OH、H2N-(CH2)6-OH、H2N-(CH2)7-OH、H2N-(CH2)8-OH、H2N-(CH2)9-OH、H2N-(CH2)10-OH、H2N-CH2-CHOH-CH2-OH、H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-OH、H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-OH、H2N-CH2-CHOH-(CH2)3-OH、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-OH、H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)2-OH、H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-OH、H2N-CH2-(CHOH)3-CH2-OH、H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-OH、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-OH、H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-OH、H2N-CH2-CHOH-CH2-CHOH-(CH2)2-OH、H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-CHOH-CH2-OH、H2N-(CH2)2-(CHOH)2-(CH2)2-OH、H2N-CH2-(CHOH)3-(CH2)2-OH、H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-CHOH-CH2-OH、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)4-OH、 H2N-(CH2)3-CHOH-(CH2)4-OH、H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)6-OH和H2N-(CH2)5-CHOH-(CH2)4-OH。
予以说明，这些化合物例如由Sigma-Aldrich公司等市售，可适宜购入后使用。另外，也可以根据文献所述的方法，或参考文献所述的方法来合成。
式(III)中的基团：-NRe-Yb-Rd在存在的多个二糖单元的每个中可以相同或不同。例如可使用不同种类的式：HNRe-Yb-Rd表示的化合物进行上述反应。
式(I)中的X1为羟基、-O-Q+或C1-6烷氧基时，基团-NRe-Yb-Rd不仅可存在于式(III)表示的二糖单元中所示的位置，部分或全部该基团可取代式(I)中的X1，X1可以为-NRe-Yb-Rd。
工序1、工序2和工序3的先后顺序没有关系。作为优选的顺序，可举出工序1、工序2、然后工序3的顺序、工序2、工序1、然后工序3的顺序、以及，工序1、工序3、然后工序2的顺序。
在式(III)表示的二糖单元中含有反应性碳-碳双键的透明质酸衍生物可用于与具有2个以上巯基的交联剂(例如，二硫苏糖醇：DTT、丁烷二硫醇、聚乙二醇二硫醇)的交联反应。另外，在式(III)表示的二糖单元中含有巯基的透明质酸衍生物可用于通过与具有2个以上巯基的交联剂(例如，二硫苏糖醇：DTT、丁烷二硫醇、聚乙二醇二硫醇)形成二硫化物而进行的交联反应、或用于使用含有2个以上的反应性碳-碳双键的交联剂(例如二乙烯砜)的交联反应。通过进行交联反应，可使本发明的透明质酸衍生物凝胶化。
作为交联反应的其他例子，可举出通过使氨基修饰的透明质酸衍生物与在C2-20烯基的两端具有琥珀酰亚胺酯或其他酰亚胺酯的交联剂(例如，双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯(BS3)、乙二醇-双[硫代琥珀酰亚胺基]琥珀酸酯(Sulfo-EGS)、二甲基己二酸酯盐酸盐(DMA)等)的缩合反应进行的交联；使氨基修饰的透明质酸衍生物与在C2-20烯基的两端具有甲酰基的交联剂(例如，戊二醛等)的交联；使巯基修饰的透明质酸衍生物在氧化条件下(例如，在四硫酸钠(STT)存在下等)的氧化反 应进行的交联；使巯基修饰的透明质酸衍生物与在C2-20烯基的两端具有马来酰亚胺(MAL)或甲基丙烯酰基等不饱和键合的交联剂(例如，1,4-双马来酰亚胺丁烷(BMB)、二甲基丙烯酸乙烯酯(EDMA)等)的迈克尔加成反应进行的交联；使通过丙烯酰基和甲基丙烯酰基等不饱和键合修饰的透明质酸衍生物与各种聚合引发剂(例如，过氧化二硫酸钾(KPS)/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、Irgacure2959等)的自由基聚合进行的交联；在二胺化合物(例如，EDA、2,2’-(乙二氧基)双(乙二胺)等)共存下用缩合剂(例如，N,N’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉氯化物(DMT-MM)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等)进行的交联。上述交联的形成既可以在透明质酸衍生物的分子内，也可以在多个透明质酸衍生物的分子间。
将本发明的透明质酸衍生物通过化学交联凝胶化的工序可以适宜选择其条件。交联的条件是指交联方法、聚合物浓度、交联剂浓度、溶剂、溶剂pH、盐浓度、温度、时间等。
使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序中，在交联形成的反应条件中，例如通过提高化学交联时的聚合物浓度和可形成交联的基团的引入率，可提高所生成的凝胶的交联密度。
使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序中的交联剂与本发明透明质酸衍生物的比例，在使用两端具有可形成交联的基团的交联剂的情况下，优选以使该基团不会过度不足地迅速参与到交联反应的比例(例如摩尔比)来添加交联剂。例如，使引入有甲基丙烯酰基(MA基)的聚合物与DTT发生迈克尔加成反应而进行交联的情况的摩尔比优选为MA基：SH基＝3：1～1：3，特别优选为2：1～1：2。
使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序中的溶剂优选为能充分溶解 聚合物和交联剂的溶剂，没有特殊限定，优选使用水、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和选自它们的混合溶剂。另外，也可以混合使用易与这些溶剂混和的有机溶剂。没有特殊限定，作为混和的有机溶剂，例如可举出甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈等。
本发明透明质酸衍生物的凝胶所具有的化学交联结构也可以含有在生物体内分解的结构。没有特殊限定，例如作为用于交联反应的基团，可以使用具有酯键和甲基丙烯酰基的基团。另外，作为交联剂，可以使用Sulfo-EGS或EDMA等具有酯键的化合物、或可被生物体内的酶分解的具有肽间隔基的化合物。另外，通过由巯基的氧化形成的二硫键而交联的凝胶通过二硫化物交换反应或还原反应而在生物体内分解。通过具有分解性的化学交联结构，可以控制本发明透明质酸衍生物的凝胶在生物体内的分解速度，由此也可以控制药物的释放速度。
本发明的透明质酸衍生物由于在水溶液中形成纳米微粒，通过在稀薄的条件下交联，可形成纳米尺寸的微粒凝胶，用作血中控释载体、靶向载体。所谓稀薄条件是指10mg/mL以下，优选5mg/mL以下、进一步优选1mg/mL以下。另一方面，通过在高浓度的条件下交联，微粒之间产生交联，可以形成块状的凝胶。将其用作皮下缓释型的载体。高浓度的条件是指5mg/mL以上，优选为20mg/mL以上、进一步优选为40mg/mL。
使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序可以分批进行，也可以在乳液中或喷雾液滴中等不连续相中进行。例如，在W/O乳液中进行的情况下，使溶解了聚合物或交联剂等的水相在与水不能混合的溶剂中乳化，进行凝胶化反应即可。与水不能混合的溶剂没有特殊限定，例如可举出己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、中链脂肪酸甘油三酯(MCT)、液体石蜡、大豆油等。也可以添加用于使乳化稳定的界面活性剂。另外，例如也可以在超临界二氧化碳或PEG等可脱溶剂的溶剂中进行。在此情况下，通过将溶解有聚合物或交联剂等的水相或有机溶剂相在上述溶剂中乳化、分散，可实现伴随脱溶剂(溶剂扩散)的聚合物的浓缩，可得到更高的交联密度的凝胶。
在使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序中及其后，可以进行停止交联反应的操作和去活或洗涤残存的交联性官能团的操作。从安全性的观点、保存稳定性的观点、与封入的药物的副反应等的观点考虑，优选除去与反应无关的交联性官能团、仅与交联剂一端键合的基团、残存的交联剂等。没有特殊限定，例如，在未反应的交联剂残存的情况下，可用过量的水等洗涤除去。另外，例如，在聚合物上取代的甲基丙烯酰基残存的情况下，可以通过添加过量的巯基乙醇等，使甲基丙烯酰基失活后，再用过量的水等洗涤除去剩余的巯基乙醇。进而，例如在巯基残存的情况下，添加过量的3-马来酰亚胺丙酸、碘乙酸等，使巯基失活后，再用过量的水等洗涤除去剩余的3-马来酰亚胺丙酸、碘乙酸。
在使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序的后，可进行粉碎工序。作为粉碎方法，可举出使用乳棒和乳钵的粉碎或研磨机的粉碎，优选使用研磨机的粉碎。作为研磨机粉碎装置，可举出离心式粉碎机(日本精机制作所)和冲击式研磨机(株式会社Dalton)等的旋转圆盘式粉碎装置、喷雾器(东京喷雾器制造株式会社)、样品研磨机(东京喷雾器制造株式会社)、Bantam研磨机(东京喷雾器制造株式会社)和SK研磨机(Tokken公司)等筛磨机的粉碎装置、超微少量实验室气流磨(A-O气流磨，Seishin公司)等气流粉碎装置、以及可在超低温下粉碎的linrex研磨机(液化天然气株式会社)等，优选SK研磨机和linrex研磨机。
在使本发明透明质酸衍生物凝胶化的工序的后可进行干燥工序。作为干燥方法，例如可举出通风干燥、恒温槽中的干燥、减压干燥、热风循环式干燥等。可在不使本发明的凝胶发生分解和变质的范围内适宜选择风速、干燥小时、温度、压力等。
可以通过向本发明透明质酸衍生物的凝胶中封入药物而制成药物组合物。根据本发明的一个方面，可以将分别含有(a)式(I)和式(III)、(b)式(I)和式(II)和式(III)、(c)式(I)和式(IIb)和式(III)、或(d)式(I)和式(II)和式(IIb)和式(III)表示的1个以上二糖单元的透明质酸衍生物使用交联剂进行交联、凝胶化，用作 用于封入药物(低分子化合物、蛋白质、肽、或核酸)的载体。作为药物封入方法，可举出向预先交联的透明质酸衍生物凝胶中添加药物溶液的方法。在该方法中，首先，通过向溶胀的凝胶内部扩散，药物被吸收，被吸收的药物通过保持在由透明质酸衍生物凝胶的疏水性相互作用而产生的物理交联区域而使得药物被封入。没有特殊限定，可适宜选择溶剂、盐浓度、pH、温度、时间、改性剂的添加等条件以使药物稳定且高收率地封入。例如，由于根据药物封入时的盐浓度和pH，透明质酸衍生物凝胶的溶胀度和密度发生变化，药物的电离状态等也会发生变化，可适宜通过其组合使用适当的条件。通过在低盐浓度下进行药物的封入，利用透明质酸衍生物的羧基之间的静电排斥，减少凝胶密度，可以增加药物封入量，或可封入更高分子量的药物。药物封入后，通过提高盐浓度，使静电排斥减弱，提高凝胶密度，使凝胶网眼的药物尺寸更小，由此强固保持药物，使延迟释放成为可能。此时，盐浓度可以是生理盐浓度。
另外，作为药物封入方法，可举出将本发明的透明质酸衍生物与药物复合化后，通过交联进行凝胶化的方法。没有特殊限定，可适宜选择复合化时的溶剂、盐浓度、pH、温度、时间、改性剂的添加、上述亲水性多糖类衍生物(HP)浓度、药物浓度、HP与药物的比率等条件，以使药物稳定且高收率与纳米凝胶复合化。未复合的游离的药物可通过透析法或尺寸排阻色谱法(SEC)法等分离、除去。交联时，优选使用不使被封入的药物改性的交联条件。
被封入本发明透明质酸衍生物的凝胶中的药物可通过药物在凝胶中的单纯扩散、透明质酸衍生物的凝胶的分解、和与生物体成分的药物替代而释放。在通过药物的扩散释放药物的情况下，可通过凝胶的交联密度、和交联区域的量及其疏水性的强度来控制其速度。凝胶的分解是指例如化学交联区域的分解、透明质酸衍生物的骨架的分解等。通过这样的分解，产生交联密度的下降(溶胀率的增大)。交联密度下降时，由于凝胶中的药物扩散速度提高，促进释放，另外通过切断键，也能促进释放。因此，通过控制化学交联区域的分解性、聚合物骨架的分解性、间隔基的分解性等，可以控制药物的释放速度。
与生物体成分的替代是指例如在将凝胶给药到皮下或血中等生物体内时，存在白蛋白等血浆蛋白质或脂质等，通过将它们与浸润、封入在凝胶中的药物进行替代以使药物释放的情况。本发明透明质酸衍生物的凝胶不仅通过在疏水基之间产生的物理交联，而且通过上述化学交联，可以控制用生物体成分的伴随浸润的药物的替代。生物体成分的浸润可以通过凝胶的交联密度、凝胶中的电荷等来控制其速度。予以说明，在通过上述交联形成凝胶后添加药物溶液而封入药物的情况下，可适宜选择其封入条件，以促进封入时药物容易被凝胶吸收，并抑制生物体成分在生物体内的浸润。没有特殊限定，例如，在封入蛋白质的情况下，通过在其等电点附近进行封入工序，可以抑制透明质酸衍生物和药物之间的静电排斥。另外，通过在透明质酸中含有的来自葡糖醛酸的羧酸的pKa(约4.0)以下进行封入工序，可以减弱凝胶所带的负电荷，由此可在该条件下抑制凝胶与带负电荷的蛋白质之间的静电排斥，提高封入效率。另外，例如在比生物体内低的盐浓度下进行封入工序时，凝胶的溶胀率比在生物体内高，因此容易封入。
进而，本发明的同时引入有疏水基和交联性官能团的透明质酸衍生物的通过化学交联进行的凝胶化可在具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的共存下进行。具体地，通过将引入有疏水基和具有不饱和键的官能团的本发明的透明质酸衍生物与具有疏水基的亲水性多糖类衍生物混合、交联，可以制备物理性封入了具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的透明质酸衍生物凝胶。
具有疏水基的亲水性多糖类衍生物是指在亲水性多糖类及其衍生物中，每1分子多糖1分子可引入至少1分子以上的疏水基的亲水性多糖类。亲水性多糖类没有特殊限定，优选为普鲁兰多糖、支链淀粉、直链淀粉、葡聚糖、甘露糖、果聚糖、菊粉、壳多糖、壳聚糖、透明质酸、糊精，它们是市售的，也可以根据文献所述的方法获得具有各种平均分子量的多糖类。作为亲水性多糖类，特别优选的是普鲁兰多糖、透明质酸、糊精。作为糊精，优选Cluster糊精(注册商标)。Cluster糊精(注册商标)可以购买使用由Ezaki Glico株式会社销售的产品。作为 疏水基，没有特殊限定，优选为C8-50的烃基、甾基、聚乳酸(PLA)基、聚乳酸·二醇酸共聚物(PLGA)基团等基团或含有这些基团的基团，特别优选胆含有甾醇基的基团、C8-30的直链或分岐烷基或含有该基团的基团。疏水基可以隔着间隔基被引入。
在具有疏水基的亲水性多糖类衍生物中，也可以含有本发明的透明质酸衍生物。即，也可以向适当的凝胶中封入包含本发明透明质酸衍生物的微粒。
具有疏水基的亲水性多糖类衍生物可通过各种公知的方法制造。另外，向作为亲水性多糖类的普鲁兰多糖的羟基中引入有作为疏水基的N-[6-(胆甾醇基氧基羰基氨基)己基]氨基甲酰基的水亲水性多糖类衍生物(以下也称为“胆固醇普鲁兰多糖”、“CHP”)可购入市售产品(例如，日本油脂株式会社)来获得。具有疏水基的亲水性多糖类衍生物，通过水溶液中疏水性相互作用，多个分子自发缔合，形成具有纳米尺寸(1～1,000nm)的凝胶结构的微粒(纳米凝胶)等，由此与疏水性药物或具有药效的蛋白质或肽之间生成复合物。
用于本发明的具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的分子量没有特殊限定，优选为1kDa～1,000kDa、更优选为10kDa～300kDa。另外，上述亲水性多糖类衍生物可以是药学上可接受的盐。
进而，例如，本发明的透明质酸衍生物和具有疏水基的亲水性多糖类衍生物中含有的羟基也可以作为可形成交联的基团利用。即，本发明的透明质酸衍生物和具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的羟基可以通过特定的交联剂，例如，二乙烯基砜(DVS)、碳二亚胺、或C2-20烯基的两端具有缩水甘油醚的交联剂等进行交联。
引入到透明质酸的羧基中的取代基的种类有多个时，这些取代基可同时引入，也可以依次引入。
根据本发明的另一方面，提供本说明书中定义的上述透明质酸衍生物，其特征在于，通过在水中缔合形成微粒。没有特殊限定，具有以下这样的特性：通过引入的基团-NR9-Z1-Z2的疏水性相互作用引发水中的自发缔合，形成纳米规格的微粒。为了构筑期望的递药系统，通过本发明 透明质酸衍生物形成的纳米微粒是非常有力的手段之一，可用作在原样保持内部形成的疏水区域中作为活性成分的蛋白质、肽、低分子化合物的情况下将它们递送至靶向部位的胶囊。另外，可以通过将药物制成轭合物来将药物递送至靶向部位。
纳米规格的微粒可以系统给药、特别是可以静脉内给药，可以用作用于将封入(复合化)的药物在血中缓慢释放的血中药物缓释、以及向靶向的脏器和细胞选择性递送药物的靶向用的载体。在用作靶向用的载体的情况下，可以通过加入靶向元件来靶向至各脏器以及细胞。作为靶向元件，例如可举出靶向组织特异性肽、抗体、片段化抗体、适体、针对癌细胞的RGD肽、叶酸、茴香酰胺、转铁蛋白、针对肝脏的半乳糖、维生素E等。为了强固药物在血中的保持，可以将透明质酸衍生物进一步化学交联。
另外，已知，一定大小以下的分子被肾排泄，例如据报道，与透明质酸同样为直链聚合物的聚乙二醇(PEG)的分子量为40kDa以下，其被肾排泄(Europian Journal ofCancer.，第31卷，第766-770页，1995年)。因此，同等程度以下的分子量的透明质酸以及透明质酸衍生物也有可能被肾排泄，而瞬间在血中消失。但是，引入有本发明疏水基的HA衍生物即使在PEG被肾排泄的分子量以下，通过缔合也可以用作用于血中药物缓释和靶向用的载体。
由于透明质酸衍生物的微粒通过在水溶液中自缔合而形成，因此可以通过将固体透明质酸衍生物溶解在水或盐水溶液中而形成。另外，在其他方法中，溶解在其他溶剂(例如DMSO)中后，通过用水或盐水溶液代替溶剂，也可以形成微粒。为了使形成的微粒的尺寸均一化，可进行超声波处理。
随着透明质酸衍生物的疏水基引入率提高，向水中的溶解性减小。因此，为了在水溶液中形成分散性的微粒，优选使用制备成通过共价键引入的疏水基为80％以下、优选60％以下的透明质酸衍生物。
由于透明质酸具有作为解离基的羧基，因此在体系中的离子强度越高，溶解性越低。因此，通过控制引入率，可以制备出在低盐浓度下或 无盐条件下溶解，在生理食盐浓度下凝集·沉淀的透明质酸衍生物，其可用作皮下缓释制剂的基材。另外，引入了在生理盐浓度下也能形成稳定微粒的程度的疏水基的透明质酸衍生物可以用作系统给药型的药物载体。
所形成的微粒的粒径没有特殊限定，为了使微粒在注射给药时不堵塞针眼地通过，粒径优选为200μm以下，更优选为100μm以下。另外，在静脉给药的情况下，为了不堵塞末梢血管，粒径优选为500nm以下，更优选为200nm以下。另外，为了避免吸收到网状内皮系统，提高血中滞留性，优选为100nm以下，进一步优选为50nm以下。
本发明的透明质酸衍生物可用作药物制剂中的药物载体，可提供含有本发明透明质酸衍生物和药物的药物组合物。本发明的透明质酸衍生物可在水溶液中自发地与药物形成复合物，不需要特别的操作，通过在水溶液中混合、孵育该透明质酸衍生物和药物，容易形成载体-药物的复合物，从而可负载药物。复合物形成的驱动力主要为透明质酸衍生物的疏水基与药物的疏水性相互作用，药物为碱性时，有时有助于与透明质酸衍生物的羧酸的静电相互作用。认为在生物体的盐浓度下，静电相互作用碱弱、疏水性相互作用增强，主要通过疏水性相互作用而形成复合物。
在上述式(I)和(II)中，Z1为烯基时，烯基的碳链越长，该基团的疏水性越高，可通过强的疏水性相互作用形成强力的微粒。另外，烯基越长，可使分子间的络合越大，粘度约高。进而，通过改变烯基的长度，还可以控制微粒的尺寸。
疏水基中的连接基(间隔基)部分为酯或碳酸酯时(例如，在X1或X2中包含-COO-Z3或-O-COO-Z3时)，通过生物体内中的酯或碳酸酯分解，透明质酸衍生物的疏水性下降，进一步提高生物降解性，从安全性方面优选。另外，已知在肿瘤组织周边中pH较低，在具有这样的间隔基的情况下，负载目标药物本发明透明质酸衍生物的缔合物再肿瘤周边崩解，可使药物在肿瘤周边释放。
特别是在具有-O-CO-CH2-CH2-S-这样的β硫代羧酸酯结构的连接基时，通过略微降低pH(pH6左右)也可促进分解。因此，pH应答比通常 的酯尖锐。另外，在涉及向细胞内递送药物的情况下，连接基也应答细胞核内体的pH下降，可以仅在摄入到细胞后释放药物。
连接基(间隔基)部分具有二硫键时(例如，在X1或X2中含有-S-S-Z3时)，还原状态下连接基分解，通过降低透明质酸衍生物的疏水性，本发明的透明质酸衍生物的缔合物崩解。由于已知细胞质为还原环境，通过向使用该连接基的透明质酸衍生物中封入药物来给药，药物可不在血中释放，而是仅在细胞质内释放药物。
形成载体-药物复合物时的溶剂、盐浓度、pH、温度、时间、改性剂的添加等的条件可根据所用的药物适宜变更。例如，随着药物封入时的盐浓度和pH的不同，透明质酸衍生物的密度发生变化，药物在其电离状态等下也会发生变化。作为所用的改性剂的例子，可举出尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠等。在添加改性剂的情况下，在形成复合物后，通过用过量的水等洗涤，可以除去剩余的改性剂。
没有特殊限定，例如，在形成本发明的透明质酸衍生物和蛋白质的复合物的情况下，通过在其等电点附近形成复合物，可以抑制透明质酸衍生物和蛋白质的静电排斥，因此可以增加复合物中含有的蛋白质的量。另外，通过在葡糖醛酸部分的羧基的pKa(约4.0)以下的条件下进行复合物形成工序，可以减弱透明质酸衍生物所具有的负电荷，因此当蛋白质在该条件下带负电荷时，可以抑制静电排斥，可以增加复合物中含有的蛋白质的量。进而，例如通过在比生物体内低的盐浓度中形成复合物形成工序，可以使水溶液中形成的透明质酸衍生物的微粒的密度下降，可以增加复合物中含有的蛋白质的量。另外，通过在该状态下提高盐浓度，可以提高微粒的密度，强力地封入蛋白质。
透明质酸衍生物与蛋白质的复合物的形成也受蛋白质的分子量的影响。一般来说，蛋白质的低分子量越低，该蛋白质向透明质酸衍生物的微粒内部的转移速度越高。另外，依赖于疏水基的引入率的微粒的密度也影响与蛋白质的复合物形成的速度、和复合物中含有的蛋白质的量。
从透明质酸衍生物和药物的复合物的生物体内的药物释放通过药物从复合物的扩散以及用生物体成分替换药物来促进。通过增加微粒的密 度，控制该扩散和替换，可以控制药物的缓释。
生物体内存在血浆蛋白质和脂质等生物体成分，将透明质酸衍生物和药物的复合物给药于皮下或血中等生物体内时，有时通过用该生物体成分替换复合物内的药物来释放药物。作为产生该替代的主要的生物体内蛋白质，可料想为白蛋白。通过降低本发明透明质酸衍生物的疏水基的引入率，可以提高葡糖醛酸部分的羧基的负电荷，可以抑制用具有负电荷的白蛋白(pI＝4.6)的替代。
作为使用本发明的透明质酸衍生物作为药物载体的方法，可举出在上述水溶性液体中自发与药物形成复合物的方法，制成药物与本发明的透明质酸衍生物键合的轭合物的方法。即，根据本发明的另一个方面，提供在含有式(I)表示的二糖单元的透明质酸衍生物中键合1个以上的上述药物而成的透明质酸衍生物-药物结合物。在该方面的一个方案中，作为透明质酸衍生物，可使用分别含有(a)式(I)和式(III)、(b)式(I)和式(II)和式(III)、(c)式(I)和式(IIb)和式(III)、或(d)式(I)和式(II)和式(IIb)和式(III)表示的1个以上的二糖单元的透明质酸衍生物。例如，通过使式(III)的基团-NRe-Yb-Rd中含有的羟基、氨基、巯基、卤原子(溴、碘等)或反应性的碳-碳双键(甲基丙烯酰基、丙烯酰基等)与药物键合，可制备上述的透明质酸衍生物-药物结合物。
予以说明，在基团-NRe-Yb-Rd与药物之间可进一步插入式-G1-G2-G3-J-***表示的基团，
(式中，***表示与药物的键合部位，
G1选自直接键、-C(＝O)-、-NRs-和-S-，
G2选自-(CH2)i-和-(CH2)qa-(O-CH2-CH2)k-，
G3选自直接键、-C(＝O)-NRt-(CH2)r-和-NRu-C(＝O)-(CH2)ma-，
J表示下式表示的基，
[化31]
Rs、Rt和Ru独立地选自氢原子和C1-6烷基，i是选自1～10的整数，qa是选自2～10的整数，k是选自1～100的整数，r和ma是独立地选自1～10的整数)。
作为式-G1-G2-G3-J-***的具体例，例如可举出下式：
[化32]
存在于本发明透明质酸衍生物的主链末端的葡糖醛酸的4位和乙酰葡糖胺的1位的羟基可以转换为其他基团，例如可以为C1-6烷氧基、甲酰基氧基和C1-6烷基羰基氧基等。
制备由本发明的透明质酸衍生物和药物形成的轭合物的方法可以使用在已知的聚合物和药物的轭合物的制备中使用的方法，例如可以利用以下的反应。
透明质酸衍生物的葡糖醛酸部分的羧基与药物的氨基、羟基、碘、溴或、药物中引入的氨基、羟基、溴、碘的反应；
透明质酸衍生物的N-乙酰葡糖胺部分的6位的羟基与药物的羧基或药物中引入的羧基的反应；
透明质酸衍生物中引入的氨基与药物的羧基或药物中引入的羧基的反应；
透明质酸衍生物中引入的氨基与通过修饰转换为异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰叠氮、NHS酯和环氧化物等的药物的反应；
药物的氨基或药物中引入的氨基与通过修饰转换为异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰叠氮、羰基、NHS酯和环氧化物的透明质酸衍生物的反应；
透明质酸衍生物的氨基与具有羰基或引入有羰基的药物(醛和酮等)的席夫碱形成以及还原氨基化反应；
药物的氨基或药物中引入的氨基与通过修饰引入有羰基的透明质酸衍生物的席夫碱形成以及还原氨基化反应；
透明质酸衍生物中引入的巯基与具有不饱和键的化合物(马来酰亚胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、烯丙基化物、乙烯砜等)、卤化物(氯乙酸酯、溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酰胺、溴乙酰胺、碘乙酰胺等)或硫醇药物或通过修饰转换为该化合物的药物的反应；和
药物中引入的巯基与通过修饰具有不饱和键的化合物(马来酰亚胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、烯丙基化物、乙烯砜等)、卤化物(氯乙酸酯、溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酰胺、溴乙酰胺、碘乙酰胺等)或转换为硫醇的透明质酸衍生物的反应。
进而，将含有在上述疏水基引入HA衍生物时使用的酯或碳酸酯、β-硫酯、二硫化物、在特定部位切断的肽的连接基(间隔基)用作用于与药物形成轭合物的连接基。这些连接基如上所述，在靶向部位断裂以释放药物。
用于制备轭合物而在透明质酸衍生物或药物的修饰中使用的试剂，只要在轭合物的制备中不发生不良反应，就没有特殊限定。该化合物可作为试剂购入，或参考文献公知的方法来合成。
具体地，可以合成本发明的透明质酸衍生物，再使用DMT-MM等缩合剂与具有氨基的药物或引入有氨基的药物反应，通过酰胺键形成与药物的轭合物。此时，可以将药物与胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐等一起加入，同时引入疏水基。另外，可以在药物的前后加入该化合物。另外，即使在合成·精制本发明的透明质酸衍生物后与药物反应，也可以在合成·精制引入了药物后的透明质酸衍生物后引入疏水基衍生物。
另外，可以合成本发明的透明质酸衍生物，再使用DMT-MM、1,3-二 氯己基碳二亚胺(DCC)等缩合剂与具有羟基的药物或引入了羟基的药物反应，通过酯键形成明质酸衍生物与药物的轭合物。此时，可以将药物与胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐等一起加入，同时引入疏水基。另外，可以在药物的前后加入该化合物。但是，为了避免酯的水解，优选引入疏水基后再将药物制成轭合物。上述方法例如可参考将紫杉醇通过酯引入到HA中的报道(Bioconjugate第19卷、第1319-1325页，2008年)等进行。
另外，可合成本发明的透明质酸衍生物，再与作为溴化物或碘化物的药物或通过修饰转换为溴化物或碘化物的药物反应，通过将葡糖醛酸部分的羧基转换为酯，由此将药物制成轭合物。为了避免酯的水解，优选引入疏水基后再将药物制成轭合物。
可合成本发明的透明质酸衍生物，再与具有羧基的药物或引入有羧基的药物制成NHS酯，与N-乙酰葡糖胺部分的6位的羟基反应，通过酯键将药物制成轭合物。此时，既可以通过胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐等向HA中引入疏水基后加入药物，也可以在引入前加入药物。另外，既可以在合成·精制本发明的透明质酸衍生物后与药物反应，也可以在合成·精制引入了药物的透明质酸衍生物后引入疏水基衍生物。为了避免酯键的水解，期望引入疏水基衍生物后再将药物制成轭合物。上述方法例如可参考将喜树碱通过酯引入到HA中的报道(国际公开第WO2009/074678号)等。
在一个方案中，可以在合成本发明的透明质酸衍生物后，使葡糖醛酸部分的羧基与乙二胺等二胺发生脱水缩合，引入氨基。进而，使N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(PIERCE社)或N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(PIERCE社)与氨基反应，合成引入有碘乙酰基的透明质酸衍生物。可以将具有巯基的药物与该透明质酸衍生物一起形成轭合物。该方法即使是对于蛋白质、肽、核酸等含有大量氨基等反应性基团的高分子药物来说也是特别有效的，因为轭合物是巯基可选择的。此时，药物的引入可发生在向HA中引入疏水基衍生物的前后。
可以合成X1为-NH2-COO-R的本发明的透明质酸衍生物，此时，将葡 糖醛酸部分的羧基的一部分与2-氨基乙基-2-吡啶基二硫盐酸盐反应。可以使该透明质酸衍生物与具有巯基的药物以及引入有巯基的药物进行二硫键交换反应，即可以通过取代反应引入。
在此，为了有效保持该轭合物的生物活性，可以调节药物和透明质酸衍生物之间的连接基的长度。另外，也可以引入在生物体内的特定部位被酶等切断的肽连接基。例如可参考以下报道进行：将甲氨蝶呤经由含肽的连接基引入到HA中的报道(国际公开第WO2005/095464号)、将多柔比星经由含有HPMA(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)和肽的连接基引入到HA中的报道(国际公开第WO2002/090209号)等。
另外，存在大量关于使抗体与低分子化合物轭合而成的ADC(抗体药物轭合物)的报道(国际公开第WO2009/026274号；Expert Opinion.，第15卷、第1087-1103页、2005年；Bioconjugate Chem.，第19卷、第1960-1963页、2008年；Bioconjugate Chem.in press、Bernhard Stump ら、Antibody-Drug Conjugates：Linking Cytotoxic Payloads toMonoclonal Antibodies)，可以参考这些报道来制备透明质酸衍生物和低分子化合物之间的轭合物。
含有本发明的透明质酸衍生物和1个以上药物的药物组合物以及本发明透明质酸衍生物与1个以上药物结合而成的轭合物可以是纳米微粒、微粒、溶液、乳液、混悬液、凝胶、胶束、植入物、粉末或膜的形式。粉末可以将通过冷冻干燥或喷雾干燥而得的固体粉碎来制造，也可以通过干燥沉淀物而得的物质来制造。
本发明的药物组合物和轭合物可以通过经口、非经口、鼻腔内、阴道内、眼内、皮下、静脉内、肌内、皮内、腹腔内、关节腔内、脑内或口腔内的途径来给药。
本发明的药物组合物和轭合物，特别是在以局部缓释为目的情况下，为了不堵塞针孔地通过，优选为200μm以下，更优选为100μm以下。
本发明的药物组合物和轭合物，特别是在以靶向以CD44为代表的透明质酸受体为目的情况下，其尺寸优选为5μm以下。
本发明的药物组合物和轭合物，特别是在以延长血中滞留性、以及 向肿瘤组织或炎症组织的蓄积性为目的情况下，其尺寸优选为500nm以下，进一步优选为200nm以下。另外，为了避免被吸收到网状内皮系统并提高血中滞留性，其尺寸优选为100nm以下。
本发明的药物组合物和轭合物，在以具有粘膜附着性且用于非侵袭给药用途的目的情况下，其尺寸优选为200μm以下。从粘膜附着性的观点考虑，优选所用的透明质酸衍生物的疏水基引入率越低越好。
形成本发明的透明质酸衍生物和复合物的药物制药是可负载的药物，就没有特殊限定。另外，与本发明透明质酸衍生物结合的药物只要是可制备成轭合物，就没有特殊限定。作为该药物的例子，可举出蛋白质和/或肽、多糖类、核酸类、低分子化合物，优选可举出蛋白质和/或肽。
作为低分子化合物的例子，例如可举出制癌剂(例如，烷基化剂、代谢拮抗剂、紫杉醇等生物碱等)、环孢菌素等免疫抑制剂、抗炎药(甾体类、非甾体类抗炎药等)、抗风湿药、抗菌剂(β-内酰胺系抗生素、氨基糖苷系抗生素、大环内酯系抗生素、四环素系抗生素、新喹诺酮系抗生素、磺胺药等)等。
作为蛋白质和肽的例子，例如可举出促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α、β、γ(INF-α、β、γ)、促血小板生成素(TPO)、亲胆碱能神经因子(CNTF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子结合蛋白质(TNFbp)、白介素-10(IL-10)、FMS类似酪氨酸激酶(Flt-3)、生长激素(GH)、胰岛素、胰岛素类似生长因子-1(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源性神经营养因子(BDNF)、角质化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、骨保护素(OPG)、瘦素、甲状旁腺激素(PTH)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、成骨蛋白质(BMP)、心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、抗体、双体、小体、碎片抗体等。
作为核酸类的例子，例如可举出DNA、RNA、反义引物、引诱物、核酶、小分子干扰RNA、RNA适体等。
向本发明透明质酸衍生物的凝胶中封入药物，或将本发明的透明质 酸衍生物-药物结合物制成含有1种或1种以上的药学上可接受的稀释剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、佐剂、防腐剂、缓冲剂、粘合剂、稳定剂等的药物组合物，根据目标的给药途径，能够以适当的任意的形式给药。给药途径可以是非经口途径或经口途径。
根据本发明，能够提供以往的缓释制剂所无法获得的可长期缓释释放蛋白质、肽、核酸、低分子化合物等药物、和/或具有适当的生物降解性的安全性高的缓释制剂和药物组合物。
实施例
以下，将本发明的优选的具体实施方案以实施例进行说明。
另外，以下所述的HA单元是指透明质酸中的N-乙酰葡糖胺-葡糖醛酸的重复单元(1个单元)。在1H-NMR谱的测定中，使用日本电子株式会社制的JNM-ECA500。透析使用再生纤维素制透析膜(以分子量50kDa和99kDa的透明质酸钠盐为起始原料时，Spectra Pore 4：分级分子量12k～14kDa，以分子量10kDa的透明质酸钠盐为起始原料时，Spectra Pore7：分级分子量1kDa或2kDa)。
〔实施例1〕透明质酸衍生物的合成
(实施例1-1)胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的制备
在氩气氛下，向胆甾醇基氯甲酸酯(3.37g、7.5mmol)的无水二氯甲烷(20mL)溶液中加入三乙胺(TEA、1.05mL)进行搅拌。在冰冷却下，滴加6-(叔丁氧羰基)氨基-1-氨基己烷(1.12mL、5mmol)，在原样冰冷却下搅拌30分钟后，升温至室温，将该混合物搅拌过夜。将反应混合物用超纯水和饱和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后在减压下蒸馏除去溶剂。将所得残渣用硅胶柱色谱(洗脱液：乙酸乙酯：正己烷＝1：4)精制，合并目标物的极分，减压蒸馏除去溶剂。将所得残渣溶解在乙酸乙酯(40mL)中，加入4N盐酸/乙酸乙酯溶液(40mL)，在室温下搅拌过夜。将生成的沉淀物通过离心分离回收。将所得固体用乙酸乙酯洗涤4次后，在减压下干燥，得到胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯(Chol-C6)的盐酸盐(1.2g)。产物的1H-NMR谱(EtOH-d6)如图1-1所示。
(实施例1-2)阳离子交换树脂的四丁基铵(TBA)的成盐
将DOWEX(注册商标)50WX-8-400(Sigma-Aldrich公司制)混悬在超纯水中，通过倾析将树脂用超纯水洗涤3次左右。相对于树脂的阳离子交换量加入约1.5摩尔等量的40重量％的四丁基氢氧化铵水溶液(TBA-OH)(Sigma-Aldrich公司制)，搅拌30分钟。通过倾析除去剩余的TBA-OH溶液后，再用过量的超纯水重复洗涤，最后通过使用0.45μm的过滤器过滤，得到阳离子交换树脂的TBA盐。
(实施例1-3)HA的TBA盐的制备
分别将分子量10kDa、50kDa和99kDa的透明质酸钠盐(HA-Na、资生堂株式会社制)以15mg/mL的浓度溶解在超纯水中。相对于HA单元(单元分子量401.3)的摩尔数，添加按树脂的离子交换量换算为5摩尔等量的实施例1-2中制备的阳离子交换树脂的TBA盐的混悬液。搅拌15分钟后，使用0.45μm的过滤器进行过滤，冷冻干燥滤液，得到作为白色固体的透明质酸的TBA盐(HA-TBA)。
作为代表例，将以99kDa的HA-Na为起始原料制备的产物的以D2O为溶剂的1H-NMR谱示于图1-2。通过来自HA的葡糖胺的乙酰基的信号(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自TBA的4个乙烯的信号(N(CH2CH2CH2CH3)4，1.4、1.7ppm；16H)的积分值，计算TBA相对于HA单元的量比，由该比计算HA-TBA的单位平均分子量。例如，以99kDa的HA-Na为起始原料制备的HA-TBA的单位平均分子量为752.6。
(实施例1-4)通过L-丙氨酸(Ala)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Ala-Chol/FL)的合成
制备以实施例1-3中合成的HA-Na(10kDa、50kDa、99kDa)为起始原料的HA-TBA的无水DMSO溶液(5mg/mL)。然后，相对于HA单元添加5摩尔等量的L-丙氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich公司制)，接着相对于HA单元添加6摩尔等量的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.3M NaCl水溶液、超纯水透析。向所得透析液中添加2N NaOH，制成pH12.5以上，搅拌1小时，使乙酯水解，进行羧基的脱保护。然后，使用2N HCl进行 中和，再进行透析，然后冷冻干燥，得到作为白色固体的HA-Ala。采用与实施例1-3所述相同的条件测定的HA-Ala的1H-NMR谱的代表例(使用99kDa的HA作为起始原料的产物)如图1-3所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自丙氨酸中的甲基的峰(-CH3、1.4ppm；3H)的积分值，由下述式计算HA单元中的丙氨酸的引入率(Ala引入率)(表1)。
[数2]
相对于HA-Ala水溶液，添加约5摩尔等量的实施例1-2制备的阳离子交换树脂的TBA盐的混悬液，搅拌15分钟后，使用0.45μm的过滤器进行过滤，将滤液冷冻干燥，得到作为白色固体的HA-Ala的TBA盐(HA-Ala-TBA)。由采用与实施例1-3所述相同的条件测定的HA-Ala-TBA的1H-NMR谱，采用与实施例1-3所述相同的方法计算TBA相对于HA单元的量比，通过来自葡糖胺的乙酰基的峰的积分值和用作内标的来自3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠-d4(TSP-d4)的甲基的峰(-Si(CH3)3，0.0ppm；9H)的积分值，定量每重量的HA单元含量。
制备HA-Ala-TBA的无水DMSO溶液(10mg/mL)，然后，相对于HA-Ala-TBA单元，以下表1所示的比率向各溶液中添加实施例1-1制备的Chol-C6盐酸盐。接着，相对于HA-Ala-TBA，以下表1所示的比率加入DMT-MM，再相对于HA-Ala-TBA单元分别以0.04摩尔等量和0.07摩尔等量添加5-氨甲基荧光素(FL)盐酸盐(Invi trogen公司制)和DMT-MM，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.3M乙酸氨/DMSO溶液、0.15MNaCl水溶液、超纯水透析，将所得透析液冷冻干燥，得到作为黄色固体的目标物(HA-Ala-Chol/FL)。
使用0.02N DCl DMSO-d6/D2O混合液(2N DCl D2O：DMSO-d6＝1：99)作为测定溶剂的1H-NMR谱的代表例(使用99kDa的HA作为起始原料，胆甾醇基的引入率为7％的产物)如图1-4所示。通过来自葡糖胺的乙酰 基的峰(COCH3、1.6～2.0ppm；3H)的积分值和来自胆甾醇基中的甲基的峰(CH3、0.7ppm；3H)的积分值，由下述式计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表1)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6～2.0ppm附近的峰与来自胆甾醇基的峰(5H)重叠，因此，计算将1.6～2.0ppm附近的峰的积分值减去来自胆甾醇基的甲基的峰(0.7ppm)的积分值的5/3的值(即，积分值(1.6～2.0ppm)-积分值(0.7ppm)×5/3)，将其作为来自HA的乙酰基的积分值，用于计算引入率。
[数3]
[表1]制备HA-Ala-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
予以说明，在此，作为可与Chol-C6盐酸盐的氨基反应的基图，可举出透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基和Ala的羧基两者。这样，在向2种反应点引入疏水基的情况下，如目标物的简称中“-Chol”所示那样，使用连字符表示。
(实施例1-5)通过L-苏氨酰胺(ThrNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-ThrNH2/Chol/FL)的合成
制备以实施例1-3中制备的HA-Na(99kDa)为起始原料制备的HA-TBA的无水DMSO溶液(10mg/mL)。然后，相对于HA单元以下表2所示比率向各溶液中添加实施例1-1制备的Chol-C6盐酸盐。接着DMT-MM相对于 HA单元添加以下表2所示的比率，再相对于HA单元分别以0.04摩尔等量和0.07摩尔等量添加5-氨甲基荧光素(FL)盐酸盐(Invitrogen公司制)和DMT-MM，在室温下搅拌7小时。然后，相对于HA单元添加3摩尔等量的L-苏氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，接着相对于HA单元添加5摩尔等量的DMT-MM，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.3M乙酸氨/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超纯水透析，将所得透析液冷冻干燥，得到作为黄色固体的目标物(HA-ThrNH2/Chol/FL)。
使用0.02N DCl DMSO-d6/D2O混合液(2N DCl D2O：DMSO-d6＝1：99)作为测定溶剂的1H-NMR谱的代表例(使用99kDa的HA作为起始原料，胆甾醇基的引入率为6％的产物)如图1-5所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(COCH3、1.6～2.0ppm；3H)的积分值和来自胆甾醇基中的甲基的峰(CH3、0.7ppm；3H)的积分值，由下述式计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表2)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6～2.0ppm附近的峰与来自胆甾醇基的峰(5H)重叠，因此，计算将1.6～2.0ppm附近的峰的积分值减去来自胆甾醇基的甲基的峰(0.7ppm)的积分值的5/3而得到的值(即，积分值(1.6～2.0ppm)-积分值(0.7ppm)×5/3)，将其作为来自HA的乙酰基的积分值，用于计算引入率。
[数4]
另外，通过来自葡糖胺的乙酰基的峰的积分值和来自苏氨酰胺的甲基的峰(-CH3、1.2ppm；3H)的积分值，计算HA单元中的苏氨酰胺的引入率(表2)。
[数5]
[表2]制备HA-ThrNH2/Chol/FL时的试剂使用量和引入率
予以说明，在此，Chol-C6盐酸盐的氨基仅与透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基反应，不再向引入的ThrNH2中引入疏水基。这样，在仅向透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基引入疏水基的情况，如目标物的简称中“-Chol”所示那样，使用连字符表示。
(实施例1-6)通过L-丝氨酸(Ser)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Ser-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-丝氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich公司制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Ser。另外，采集脱保护羧基前的透析溶液的一部分进行冷冻干燥，作为引入率计算用样品(HA-Ser-OEt)。采用与实施例1-3所述相同条件测定的引入率计算用样品的1H-NMR谱如图1-6所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.9ppm；3H)的积分值和来自丝氨酸的乙酯中的甲基的峰(-CH3、1.2ppm；3H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的丝氨酸的引入率(表3)。另外，脱保护的样品采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-7所示。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Ser的TBA盐(HA-Ser-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Ser-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-8所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-7)通过L-甘氨酸(Gly)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Gly-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用甘氨酸乙酯盐酸盐(和光纯药株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Gly。另外，采集脱保护羧基前的透析溶液的一部分进行冷冻干燥，作为引入率计算用样品(HA-Gly-OEt)。采用与实施例1-3所述相同条件测定的引入率计算用样品的1H-NMR谱如图1-9所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自甘氨酸的乙酯中的甲基的峰(-CH3、1.3ppm；3H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的甘氨酸的引入率(表3)。另外，脱保护的样品采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-10所示。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Gly的TBA盐(HA-Gly-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Gly-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-11所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-8)通过L-苏氨酸(Thr)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Thr-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-苏氨酸甲酯的盐酸盐(Bachem社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Thr。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-12所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自苏氨酸中的甲基的峰(-CH3、1.2ppm；3H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的苏氨酸的引入率(表3)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Thr的TBA盐(HA-Thr-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Thr-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-13所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-9)通过L-天冬酰胺(Asn)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Asn-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-天冬酰胺甲酯盐酸盐(Bachem社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Asn。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-14所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自天冬酰胺的亚甲基的峰(-CH2CONH2、2.7、2.8ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的天冬酰胺的引入率(表3)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Asn的TBA盐(HA-Asn-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Asn-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-15所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-10)通过L-天冬氨酸(Asp)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Asp-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-天冬氨酸二乙酯盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Asp。采用与实施例1-3所述相同条件测定的 1H-NMR谱如图1-16所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自天冬氨酸中的亚甲基的峰(-CH2COOH、2.7、2.8ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的天冬氨酸的引入率(表3)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Asp的TBA盐(HA-Asp-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Asp-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-17所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-11)通过L-异亮氨酸(Ile)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Ile-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-异亮氨酸甲酯盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得 到作为白色固体的HA-Ile。采用与实施例1-3所述相同条件测定的 1H-NMR谱如图1-18所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自异亮氨酸中的2个甲基的峰(-CH(CH3)CH2CH3、0.9ppm；6H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的异亮氨酸的引入率(表3)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰与异亮氨酸的3位的氢的峰(-CH(CH3)CH2CH3、1.9ppm；1H)重叠，因此，计算将1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去0.9ppm处的峰的积分值的1/6而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Ile的TBA盐(HA-Ile-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Ile-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-19所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-12)通过L-亮氨酸(Leu)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Leu-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-亮氨酸乙酯盐酸盐(东京化成工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Leu。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-20所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自亮氨酸中的2个甲基的峰(-CH(CH3)2、0.9ppm；6H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的亮氨酸的引入率(表3)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Leu的TBA盐(HA-Leu-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Leu-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-21所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-13)通过L-缬氨酸(Val)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Val-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-缬氨酸乙酯盐酸盐(渡边化学工 业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Val。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-22所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自缬氨酸中的2个甲基的峰(-CH(CH3)2、0.9ppm；6H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的缬氨酸的引入率(表3)。予以说明，来自缬氨酸的3位的氢的峰(-CH(CH3)2、2.1ppm；1H)与来自葡糖胺的乙酰基的峰重叠，因此，从1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去0.9ppm处的峰的积分值的1/6而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Val的TBA盐(HA-Val-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Val-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的 1H-NMR谱如图1-23所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
(实施例1-14)通过L-苯丙氨酸(Phe)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Phe-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich公司制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Phe。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-24所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自苯丙氨酸中的苯基的峰(-C6H5、7.2～7.4ppm；5H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的苯丙氨酸的引入率(表3)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Phe的TBA盐(HA-Phe-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Phe-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-25所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表3)。
[表3]制备HA-AA-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(实施例1-15)通过L-丝氨酰胺(SerNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-SerNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-丝氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-SerNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-26所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表4)。另外，采用与实施例1-3所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-27所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自丝氨酰胺的亚甲基的峰(-CH2-、3.9ppm；2H)的积分值，与实施例1-5同样操作，计算HA单元中的丝氨酰胺的引入率(表4)。予以说明，来自丝氨酰胺的亚甲基的峰与葡糖醛酸的2～5位的峰(4H)、葡糖胺的2～6位的峰(6H)重叠，因此，计算将3.2～4.2ppm处的峰的积分值减去2.0ppm处的峰的积分值的10/3而得到的值，将其作为来自丝氨酰胺的亚甲基的峰，用于计算引入率。
(实施例1-16)通过L-甘氨酰胺(GlyNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-GlyNH2/Chol/FL)的合成代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用甘氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色 固体的HA-GlyNH2/Chol/FL。
采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-28所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表4)。另外，采用与实施例1-3所述相同条件测定的产物的 1H-NMR谱如图1-29所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自甘氨酰胺的亚甲基的峰(-CH2-；2H)的积分值，与实施例1-5同样操作，计算HA单元中的甘氨酰胺的引入率(表4)。予以说明，来自甘氨酰胺的亚甲基的峰与葡糖醛酸的2～5位的峰(4H)、葡糖胺的2～6位的峰(6H)重叠，因此，采用与实施例1-15同样的方法，计算来自甘氨酰胺的亚甲基的峰的积分值。
(实施例1-17)通过L-亮氨酰胺(LeuNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-LeuNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-亮氨酰胺盐酸盐(东京化成工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-LeuNH2/Chol/FL。
采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-30所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表4)。另外，通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.9ppm；3H)的积分值和来自亮氨酰胺的2个甲基的峰(-CH(CH3)2、0.9ppm；6H)的积分值，与实施例1-5同样操作，计算HA单元中的亮氨酰胺的引入率(表4)。
(实施例1-18)通过L-缬氨酰胺(ValNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-ValNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-缬氨酰胺盐酸盐(东京化成工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-ValNH2/Chol/FL。
采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-31所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表4)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.9ppm；3H)的积分值和来自缬氨酰胺的2个甲基的峰(-CH(CH3)2、1.0ppm；6H)的 积分值，与实施例1-5同样操作，计算HA单元中的缬氨酰胺的引入率(表4)。
[表4]制备HA-AANH2/Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(实施例1-19)通过L-丙氨酸(Ala)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Ala/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-丙氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich公司制)，在超纯水透析中一次性取出透析液，用2N NaOH进行羧基的脱保护，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-Ala/Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的 1H-NMR谱如图1-32所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表5)。另外，通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.9ppm；3H)的积分值和来自丙氨酸中的甲基的峰(-CH3、1.3ppm；3H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的丙氨酸的引入率(表5)。予以说明，来自丙氨酸的甲基的峰与来自胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯的峰(0.8～1.6ppm、41H)重叠，因此，计算将0.8～1.6ppm处的峰的积分值减去0.7ppm处的峰的积分值的41/3而得到的值，将其作为来自丙氨酸的甲基的峰，用于计算引入率。
(实施例1-20)通过L-丝氨酸(Ser)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Ser/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-丝氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich公司制)，在超纯水透析中一次性取出透析液，用2N NaOH进行羧基的脱保护，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-Ser/Chol/FL。另外，采集脱保护羧基前的透析溶液的一部分进行 冷冻干燥，作为引入率计算用样品(HA-Ser-OEt/Chol/FL)。采用与实施例1-3所述相同条件测定的引入率计算用样品的1H-NMR谱如图1-33所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.3ppm；3H)的积分值和来自丝氨酸的乙酯中的甲基的峰(-CH3、1.6ppm；3H)的积分值，与实施例1-6同样操作，测定HA单元中的丝氨酸的引入率(表5)。另外，脱保护的样品采用与实施例1-5所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-34所示。通过实施例1-5所述的方法，计算胆甾醇基的引入率(表5)
[表5]制备HA-AA/Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(实施例1-21)未作荧光标记的透明质酸衍生物的合成
不添加5-氨甲基荧光素，除此以外，通过实施例1-4(Ala)、实施例1-5(ThrNH2)、实施例1-15(SerNH2)、实施例1-18(ValNH2)所述的方法，得到作为白色固体的HA-Ala-Chol、HA-ThrNH2/Chol、HA-SerNH2/Chol、HA-ValNH2/Chol。通过与对应的实施例所述同样的方法，计算胆甾醇基的引入率以及氨基酸和氨基酸酰胺的引入率(表6)。
[表6-1]制备透明质酸衍生物时的试剂使用量和引入率
[表6-2]制备透明质酸衍生物时的试剂使用量和引入率
(比较例1-1)通过胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Chol/FL)的合成
制备以实施例1-3中制备的HA-Na(10k、50k、99kDa)为起始原料的HA-TBA的无水DMSO溶液(10mg/mL)。然后，相对于HA单元以下表7所示的比率向各溶液中添加实施例1-1制备的Chol-C6盐酸盐。接着相对于HA单元以下表7所示的比率添加DMT-MM，再相对于HA单元分别以0.04摩尔等量和0.07摩尔等量添加5-氨甲基荧光素(FL)盐酸盐(Invitrogen公司制)和DMT-MM，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.3M乙酸氨/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超纯水透析，将所得透析液冷冻干燥，得到作为黄色固体的目标物(HA-Chol/FL)。
使用0.02N DCl DMSO-d6/D2O混合液(2N DCl D2O：DMSO-d6＝1：99)作为测定溶剂的1H-NMR谱的代表例(使用99kDa的HA作为起始原料，胆甾醇基的引入率为6％的产物)如图1-35所示。胆甾醇基相对于HA单元的引入率通过实施例1-4所述的方法计算(表7)。
[表7]制备HA-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(比较例1-2)EDOBEA修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-EDOBEA-Ac/FL)的合成
制备以实施例1-3合成的HA-Na(99kDa)为起始原料制备的HA-TBA的无水DMSO溶液(5mg/mL)。然后，按照HA单元/BOP(和光纯药株株式会社制)/2,2’-(乙二氧基)双(乙胺)(EDOBEA，Sigma-Aldrich公司制)＝1/2.5/50(mol/mol/mol)的等量比依次添加EDOBEA、BOP，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.3M NaCl水溶液、超纯水透析后，冷冻干燥，得到高引入率的HA-EDOBEA。
采用与实施例1-3所述相同条件测定的高引入率的HA-EDOBEA的 1H-NMR谱如图1-36所示。予以说明，测定时，加入NaOD至0.0046，使溶液呈碱性。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自EDOBEA末端的亚甲基的峰(-CH2NH2、2.8ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的EDOBEA的引入率，结果为82％。
接着，将所得高引入率的HA-EDOBEA溶解在超纯水中至10mg/mL，然后用100mM的磷酸缓冲溶液(pH7.4)稀释2倍，制备5mg/mL溶液。向该溶液中以HA单元为0.04摩尔等量加入NHS-荧光素的DMSO溶液，在室温下搅拌1小时，然后相对于HA单元添加40摩尔等量的无水乙酸(和光纯药株式会社制)，再搅拌1小时，由此讲多余的EDOBEA的末端氨基进行乙酰化。将反应溶液依次用0.3M NaCl水溶液、超纯水在遮光 下进行透析后，冷冻干燥，得到作为黄色固体的HA-EDOBEA-Ac/FL。采用与实施例1-3所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图1-37所示。
(比较例1-3)通过L-酪氨酸(Tyr)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Tyr-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-酪氨酸乙酯盐酸盐(和光纯药株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Tyr。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-38所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自酪氨酸中的羟基苯基的峰(-C6H4OH、6.8、7.2ppm；4H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的酪氨酸的引入率(表8)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Tyr的TBA盐(HA-Tyr-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Tyr-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图1-39所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表8)
[表8]制备HA-Tyr-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
〔实施例2〕体内的血中滞留性和生物降解性的确认
(实施例2-1)给药HA衍生物的大鼠的生物样品采样
将实施例1-4～1-20及比较例1-1和1-3所得的化合物以10mg/kg的用量向大鼠静脉内单次给药，给药后5分钟、2、7、24、48、72、168、240和336小时，使用肝素钠处理过的注射器进行颈部静脉采血，通过离心分离得到血浆。比较例的样品中，也存在给药后96小时时采血的样品。该血浆样品至测定时为止冷冻保存在-20℃以下。另外，给药后0～24小时、24～48小时、48～72小时、72～96小时、168～192小时、240～ 264小时、和336～360小时，使用代谢笼采尿，至测定时为止冷冻保存在-20℃以下。进而，在给药后第15天摘取肝脏，至测定时为止冷冻保存在-20℃以下。将比较例1-2得到的化合物以20mg/kg的用量向大鼠静脉内单次给药，进行采尿以及摘取肝脏。
(实施例2-2)给药HA衍生物的大鼠的血浆的分析
将血浆样品解冻后，用HP-β-CD(100mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)溶液稀释2倍，在37℃下孵育1小时，然后用96孔板读数器(ARVO)测定荧光标记的HA衍生物浓度(定量限：0.4μg/mL)。荧光标记的HA衍生物的血浆中浓度变化如图2-1-1～图2-1-26所示。另外，通过WinNonlin Ver.6.1软件(Pharsight社制)分析药物动态参数(血浆中浓度-时间曲线下面积外推值(AUC∞))，其值示于表9。另外，通过下式计算的AUC∞相对于同等程度引入胆固醇的比较品的比率示于表10。
[数6]
[表9]荧光标记的HA衍生物的药物动态参数
样品 荧光标记的HA衍生物 AUC∞(μg·hr/mL)
样品2-1 99k HA-Ala-Chol-7％/FL 2460.8
样品2-2 99k HA-Ala-Chol-24％/FL 775.6
样品2-3 99k HA-Ala-Chol-30％/FL 1557.3
样品2-4 50k HA-Ala-Chol-6％/FL 2226.0
样品2-5 50k HA-Ala-Chol-22％/FL 594.3
样品2-6 50k HA-Ala-Chol-26％/FL 1393.4
样品2-7 10k HA-Ala-Chol-16％/FL 1873.0
样品2-8 99k HA-ThrNH2/Chol-6％/FL 2819.3
样品2-9 99k HA-ThrNH2/Chol-24％/FL 2268.9
样品2-10 99k HA-ThrNH2/Chol-31％/FL 3714.0
样品2-11 99k HA-Ser-Chol-6％/FL 2853.5
样品2-12 99k HA-Gly-Chol-6％/FL 2798.6
样品2-13 99k HA-Thr-Chol-6％/FL 1381.3
样品2-14 99k HA-Asn-Chol-7％/FL 2978.0
样品2-15 99k HA-Asp-Chol-6％/FL 2903.2
样品2-16 99k HA-Ile-Chol-6％/FL 2185.0
样品2-17 99k HA-Leu-Chol-6％/FL 1834.5
样品2-18 99k HA-Val-Chol-6％/FL 1814.7
样品2-19 99k HA-Phe-Chol-6％/FL 2879.6
样品2-20 99k HA-ValNH2/Chol-6％/FL 2935.3
样品2-21 99k HA-SerNH2/Chol-6％/FL 2218.2
样品2-22 99k HA-LeuNH2/Chol-6％/FL 2345.1
样品2-23 99k HA-GlyNH2/Chol-6％/FL 2011.3
样品2-24 99k HA-Ala/Chol-6％/FL 2073.6
样品2-25 99k HA-Ser/Chol-6％/FL 1709.5
比较品2-1 99k HA-Chol-6％/FL 546.9
比较品2-2 99k HA-Chol-24％/FL 161.3
比较品2-3 99k HA-Chol-25％/FL 361.4
比较品2-4 50k HA-Chol-6％/FL 533.1
比较品2-5 50k HA-Chol-20％/FL 199.5
比较品2-6 50k HA-Chol-27％/FL 308.1
比较品2-7 10k HA-Chol-15％/FL 1696.4
比较品2-8 99k HA-Tyr-Chol-6％/FL 403.6
[表10]AUC∞的比率
向羧基中引入氨基酸或氨基酸酰胺，再引入胆甾醇基的HA衍生物(样品2-1～2-25)与在羧基中仅引入胆甾醇基的HA衍生物(比较品2-1～2-7)相比，可见能维持优异的血浆中浓度。
(实施例2-3)给药HA衍生物的大鼠的肝脏的分析
向约1g肝脏样品中加入Tris缓冲液(10mM，pH9.0)，使用珠子匀 浆化。添加4mg/mL链霉蛋白酶溶液，在37℃孵育过夜。离心分离后，用HP-β-CD(100mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)溶液稀释2倍，再在37℃下孵育1小时后，用过滤器过滤，按以下条件进行尺寸排阻色谱法分析。予以说明，对未给药样品的大鼠肝脏也进行同样的处理，与给药前的样品混合，作为标准品同样地进行分析。
尺寸排阻色谱法分析条件
分析柱：TSKgel G5000PWXL(东曹株式会社)
柱温：25℃
流动相：HP-β-CD(10mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)
流速：0.5mL/min
检测：Ex 494nm/Em 515nm
注入量：50μL
结果如图2-2-1～图2-2-27所示。将色谱用各自的最高峰归一化。对于比较例1-2的HA衍生物(HA-EDOBEA-Ac/FL、图2-2-26)，完全未观察到在肝脏中低分子化，与此相比，实施例的HA衍生物均检出为低分子化的给药化合物。这表明本发明的HA衍生物具有生物降解性。另外，认为它们在体内分解后，通过尿或粪排泄到体外。
(实施例2-4)HA衍生物给药大鼠的尿的分析
用0.22μm的过滤器过滤尿样品，用HP-β-CD(100mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)溶液稀释2倍。在37℃下孵育1小时后，用过滤器过滤，按照实施例2-3所述的条件进行尺寸排阻色谱法分析。予以说明，对未给药样品的大鼠的尿样品也进行同样的处理，与给药前的样品混合，作为标准品同样地进行分析。
结果如图2-3-1～图2-3-27所示。左侧图以相同比例尺示出各时间点的色谱，右侧表示将各时间点的色谱用最高峰归一化的图。在给药后0～24小时、24～48小时、48～72小时、72～96小时、168～192小时、240～264小时、和336～360小时，将采集的尿样分别标记为0-1d、1-2d、2-3d、3-4d、7-8d、10-11d、和14-15d示于图中，并且将它们的标准品以STD示于图中。
对于比较例1-2的HA衍生物(HA-EDOBEA-Ac/FL)来说，未在尿中观察到低分子化的给药化合物，与此相比，对于实施例的HA衍生物，均在尿中检出低进分子化的给药化合物。这表明通过检验尿可以简便地评价本发明的HA衍生物的生物降解性。
〔实施例3〕透明质酸衍生物的合成
(实施例3-1)通过L-谷氨酰胺(Gln)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Gln-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-谷氨酰胺甲酯盐酸盐(和光纯药株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Gln。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-1所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自谷氨酰胺的亚甲基的峰(-CH2CH2CONH2、2.3、2.4ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的谷氨酰胺的引入率(表11)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰与谷氨酰胺的其他亚甲基的峰(-CH2CH2CONH2、2.1ppm；2H)重叠，因此，计算将1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去2.3、2.4ppm处的峰的积分值而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算修饰率。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Gln的TBA盐(HA-Gln-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Gln-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-2所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表11)。
(实施例3-2)通过L-蛋氨酸(Met)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Met-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-蛋氨酸乙酯盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Met。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-3所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自蛋氨酸的亚甲基的峰(-CH2SCH3、2.6ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的蛋氨酸的引入率(表11)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰与来自蛋氨酸的其他亚甲基和甲基的峰(-CH2CH2SCH3、2.1ppm；5H)重叠，因此，计算将1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去2.6ppm处的峰的积分值的5/2而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。
再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Met的TBA盐(HA-Met-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Met-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-4所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表11)。
[表11]制备HA-AA-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(实施例3-3)通过L-丙氨酰胺(AlaNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-AlaNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-丙氨酰胺盐酸盐(东京化成工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-AlaNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-5所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表12)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自丙氨酰胺的甲基的峰(-CH3-、1.3ppm；3H)的积分值，与实施例1-5同样操作，计算HA单元中的丙氨酰胺的引入率(表12)。予以说明，来自丙氨酰胺的甲基的峰与来自胆甾醇基的峰(41H)重叠，因此，计算将0.8～1.6ppm处的峰的积分值减去0.7ppm处的峰的积分值的41/3而得到的值，将其作为丙氨酰胺的甲基的峰，用于计算引入率。
(实施例3-4)通过L-天冬酰胺(AsnNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-AsnNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-天冬酰胺盐酸盐(国产化学株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-AsnNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-6所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表12)。另外，采用与实施例1-3所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-7所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自天冬酰胺的亚甲基的峰(-CH2CONH2、2.7、2.8ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的天冬酰胺的引入率(表12)
(实施例3-5)通过L-异亮氨酰胺(IleNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-IleNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-异亮氨酰胺盐酸盐(东京化成工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-IleNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-8所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表12)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自异亮氨酰胺中的亚甲基及2个甲基的峰(-CH(CH3)CH2CH3、0.9ppm；8H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的异亮氨酰胺的引入率(表3)。予以说明，来自异亮氨酰胺的甲基的峰与来自胆甾醇基的峰(41H)重叠，因此，计算将0.8～1.6ppm处的峰的积分值减去0.7ppm处的峰的积分值的41/3而得到的值，将其作为异亮氨酰胺的亚甲基的峰，用于计算引入率。另外，通过来自葡糖胺的乙酰基的峰与异亮氨酸的3位的氢的峰(-CH(CH3)CH2CH3、1.9ppm；1H)重叠，因此，计算将1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去0.8～1.6ppm处的峰的积分值的1/8而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。
(实施例3-6)通过L-谷氨酰胺(GlnNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨 基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-GlnNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-谷氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-GlnNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-9所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表12)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自谷氨酰胺中的亚甲基的峰(-CH 2 CH2CONH2、2.1ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的谷氨酰胺的引入率(表12)。予以说明，来自谷氨酰胺的甲基的峰与来自胆甾醇基的峰(2H)重叠，因此，将减去0.7ppm处的峰的积分值的2/3而得到的值作为来自谷氨酰胺的亚甲基的峰，用于计算引入率。另外，由于来自葡糖胺的乙酰基的峰与谷氨酰胺中的亚甲基的峰(-CH2CH 2 CONH2、1.9ppm；2H)重叠，因此，计算将1.8～2.0ppm处的峰的积分值减去2.1ppm处的峰的积分值的2/2而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。
(实施例3-7)通过L-蛋氨酰胺(MetNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-MetNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-蛋氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色固体的HA-MetNH2-Chol/FL。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图3-10所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表12)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自蛋氨酰胺中的甲基的峰(-SCH3、2.1ppm；3H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的蛋氨酰胺的引入率(表12)。来自葡糖胺的乙酰基的峰与蛋氨酰胺中的亚甲基的峰(-CH2SCH3、1.9ppm；2H)重叠，因此，计算将1.8～2.0ppm处的峰的积分值减去2.1ppm处的峰的积分值的2/3而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算引入率。
[表12]制备HA-AANH2/Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(比较例3-1)通过L-谷氨酸(Glu)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Glu-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-谷氨酸二乙酯盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Glu。采用与实施例1-3所述相同条件测定的 1H-NMR谱如图3-11所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自谷氨酸的亚甲基的峰(-CH2CH2COOH、2.4ppm；2H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的谷氨酸的引入率(表13)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰与来自谷氨酸的其他亚甲基的峰(-CH2CH2COOH、2.1ppm；2H)重叠，因此，计算将1.8～2.2ppm处的峰的积分值减去2.4ppm处的峰的积分值而得到的值，将其作为来自葡糖胺的乙酰基的峰，用于计算修饰率。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Glu的TBA盐(HA-Glu-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Glu-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-12所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表13)。
(比较例3-2)通过L-色氨酸(Trp)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Trp-Chol/FL)的合成
代替L-丙氨酸乙酯盐酸盐，使用L-色氨酸乙酯盐酸盐(渡边化学工 业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-4同样的方法进行，得到作为白色固体的HA-Trp。采用与实施例1-3所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-13所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、2.0ppm；3H)的积分值和来自色氨酸的吲哚环的峰(-C8H6N、7.8ppm；1H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的色氨酸的引入率(表13)。再在与实施例1-4所述相同的条件下，得到作为白色固体的HA-Trp的TBA盐(HA-Trp-TBA)。接着，采用与实施例1-4同样的方法，与Chol-C6盐酸盐、FL反应，得到作为黄色固体的目标物(HA-Trp-Chol/FL)。采用与实施例1-4所述相同条件测定的1H-NMR谱如图3-14所示。通过实施例1-4所述的方法计算胆甾醇基的引入率(表13)。
(比较例3-3)通过L-酪氨酸(Tyr)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-Tyr-Chol/FL)的合成
使用以10kDa的HA-Na为起始原料制备的HA-TBA，除此以外，采用与比较例1-3同样的方法进行，得到作为黄色固体的10k的HA-Tyr-Chol/FL。酪氨酸和胆甾醇基的引入率也通过与比较例1-3同样的方法计算(表13)。
[表13]制备HA-AA-Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(实施例3-8)未荧光标记的透明质酸衍生物的合成
不加入5-氨甲基荧光素，并且用作起始原料的HA-Na的分子量不同，除此以外，通过实施例1-4～实施例1-18以及实施例3-1～实施例3-7以及比较例3-1～比较例3-3所述的方法，得到作为白色固体的各种透明质酸衍生物。通过与对应的实施例所述同样的方法，计算胆甾醇基的引入率以及氨基酸和氨基酸酰胺的引入率(表14-1、表14-2)。原料透明质酸使用仅5kDa的R&D系统社制的产品，其余的原料透明质酸使用资生堂社制的产品。
[表14-1]制备透明质酸衍生物时的试剂使用量和引入率
[表14-2]制备透明质酸衍生物时的试剂使用量和引入率
〔实施例4〕体内的血中滞留性和生物降解性的确认
(实施例4-1)给药HA衍生物的大鼠的生物样品取样
将实施例3-1～3-7和比较例3-1～3-3得到的化合物以10mg/kg的用量向大鼠静脉内单次给药，给药后5分钟、2、7、24、48、72和168小时，使用肝素钠处理过的注射器进行颈部静脉采血，通过离心分离得到血浆。比较例的样品中，也存在给药后96小时时采血的样品。该血浆样品至测定时为止冷冻保存在-20℃以下。另外，给药后第7天摘取出肝脏，至测定时为止冷冻保存在-20℃以下。
(实施例4-2)给药HA衍生物的大鼠的血浆的分析
将血浆样品解冻后，用HP-β-CD(100mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)溶液稀释2倍，在37℃下孵育1小时后，用96孔板读数器(ARVO)测定荧光标记的HA衍生物浓度(定量限：0.4μg/mL)。荧光标记的HA衍生物的血浆中浓度变化如图4-1-1～图4-1-10中所示。另外，通过WinNonlin Ver.6.1(Pharsight社制)软件分析药物动态参数(血浆中浓度-时间曲线下面积外推值(AUC∞))，其值示于表15。另外，将通过下式计算的AUC∞相对于同等程度引入胆固醇的比较品的比率示于表16。
[数7]
[表15]荧光标记的HA衍生物的药物动态参数
[表16]AUC∞的比率
向羧基中引入氨基酸或氨基酸酰胺、再引入胆甾醇基的HA衍生物(样品4-1～4-7)与向羧基中仅引入胆甾醇基的HA衍生物(比较品2-1)相比，可知能够维持优异的血浆中浓度。予以说明，10k HA-Tyr-Chol-7％/FL(比较品4-3)与99k HA-Tyr-Chol-6％/FL(比较品2-8)同样地，与羧基中仅引入胆甾醇基的HA衍生物相比，血中滞留性降低。另一方面，99kHA-Ala-Chol-7％/FL(样品2-1)、10k HA-Ala-Chol-16％/FL(样品2-7)与羧基中仅引入胆甾醇基的HA衍生物相比，能维持更加优异或同等的血浆中浓度。由此启示，由引入到羧基中的氨基酸的差异带来的HA衍生物的血中滞留性的优劣不受原料透明质酸的分子量的影响(不依赖于原料透明质酸的分子量)。
(实施例4-3)给药HA衍生物的大鼠肝脏的分析
向约1g的肝脏样品中添加Tris缓冲液(10mM，pH9.0)，使用珠子进行匀浆化。添加4mg/mL链霉蛋白酶溶液，在37℃孵育过夜。离心分离后，用HP-β-CD(100mM)/Tris缓冲液(500mM，pH9.0)溶液稀释2倍，再在37℃下孵育1小时后，用过滤器过滤，按以下的条件进行尺寸排阻色谱法分析。予以说明，对未给药样品的大鼠肝脏也进行同样的处理，与给药前的样品混合，作为标准品同样地进行分析。
尺寸排阻色谱法分析条件
分析柱：TSKgel G5000PWXL(东曹株式会社)
柱温：25℃
流动相：HP-β-CD(10mM)/Tris缓冲液(50mM，pH9.0)
流速：0.5mL/min
检出：Ex 494nm/Em 515nm
注入量：50μL
结果如图4-2-1～图4-2-10所示。色谱用各自的最高峰归一化。对于比较例1-2的HA衍生物(HA-EDOBEA-Ac/FL、图2-2-26)来说，完全未观察到其在肝脏中低分子化，与此相比，实施例的HA衍生物均被检出为低进分子化的给药化合物。由此认为，本发明的HA衍生物具有生物降解性，在体内分解后，通过尿或粪被排泄到体外。
〔实施例5〕盐浓度应答型沉淀缓释制剂
(实施例5-1)通过L-酪氨酰胺(TyrNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-TyrNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-酪氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色水溶液的HA-TyrNH2-Chol/FL。通过在与实施例1-5所述相同条件下测定冻干品所得的产物的1H-NMR谱如图5-1所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表17)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自酪氨酸中的羟基苯基的峰(-C6H4OH、6.8、7.2ppm；4H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的酪氨酰胺的引入率(表17)
(实施例5-2)通过L-色氨酰胺(TrpNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-TrpNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-色氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色水溶液的HA-TrpNH2-Chol/FL。通过在与实施例1-5所述相同条件下测定冻干品所得的产物的1H-NMR谱如图5-2所示。采用与实施例1-5所 述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表17)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自色氨酰胺中的吲哚环的峰(-C8H6N、7.6ppm；1H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的色氨酰胺的引入率(表17)。
(实施例5-3)通过L-苯丙氨酰胺(PheNH2)和胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯修饰的荧光标记的HA衍生物(HA-PheNH2/Chol/FL)的合成
代替L-苏氨酰胺盐酸盐，使用L-苯丙氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与实施例1-5同样的方法进行，得到作为黄色水溶液的HA-PheNH2-Chol/FL。通过在与实施例1-5所述相同条件下测定冻干品所得的产物的1H-NMR谱如图5-3所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表17)。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(-COCH3、1.8ppm；3H)的积分值和来自苯丙氨酸中的苯基的峰(-C6H5、7.2～7.4ppm；5H)的积分值，与实施例1-4同样操作，计算HA单元中的苯丙氨酰胺的引入率(表17)
[表17]制备HA-AANH2/Chol/FL时的试剂使用量和引入率
(比较例5-1)通过L-酪氨酰胺(TyrNH2)修饰的HA衍生物(HA-TyrNH2)的合成
制备以实施例1-3合成的HA-Na为起始原料制备的HA-TBA(99kDa)的无水DMSO溶液。然后，相对于HA单元添加5摩尔等量的L-酪氨酰胺 盐酸盐(渡边化学株式会社制)，接着相对于HA单元添加3摩尔等量的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)，在室温下搅拌过夜。将反应溶液依次用0.15M NaCl水溶液、超纯水透析。透析中产生沉淀，无法将目标物作为水溶液回收。
(比较例5-2)通过L-色氨酰胺(TrpNH2)修饰的HA衍生物(HA-TrpNH2)的合成
代替L-酪氨酰胺盐酸盐，使用L-色氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与比较例5-1同样的方法进行。透析中产生沉淀，无法将目标物作为水溶液回收。
(比较例5-3)通过L-苯丙氨酰胺(PheNH2)修饰的HA衍生物(HA-PheNH2)的合成
代替L-酪氨酰胺盐酸盐，使用L-苯丙氨酰胺盐酸盐(渡边化学工业株式会社制)，除此以外，采用与比较例5-1同样的方法进行。得到作为白色固体的HA-PheNH2。
(实施例5-4)
实施例5-1、实施例5-2、比较例5-1、比较例5-2合成的HA衍生物向水中透析后的溶解性示于表18。
[表18]HA衍生物在水中的溶解性
样品 HA衍生物 溶解性
样品5-1 99k HA-TyrNH2/Chol-6％/FL 溶解
样品5-2 99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL 溶解
比较品5-1 99k HA-TyrNH2 不溶
比较品5-2 99k HA-TrpNH2 不溶
样品5-1以及样品5-2与未引入甾基的比较品5-1和比较品5-2相比，可知，尽管甾基具有疏水性，引入甾基的样品在水中更加分散。
(实施例5-5)依赖盐浓度的沉淀性评价
向实施例5-1、实施例5-2、实施例5-3、实施例3-3中得到的HA衍生物(99k HA-TyrNH2/Chol-6％/FL、99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL、99k HA-PheNH2/Chol-6％/FL、99k HA-AlaNH2/Chol-6％/FL)的水溶液(超纯水) 中添加浓缩缓冲液至最终缓冲液组成为10mMPB、150mM NaCl，使HA衍生物浓度为4.5mg/mL。在37℃下孵育20分钟后，以2000G离心1分钟，用96孔板读数器(ARVO)测定上清液的荧光强度。使用标准(品)计算荧光标记的HA衍生物浓度，计算相对于最初使用量的残存率(表19)。对比较例1-1所得的99k HA-Chol-6％/FL(比较品5-3)进行同样的操作。比较品5-1、5-2的结果为WO2010/053140所述的结果。
[表19]150mM NaCl条件下的HA衍生物的残存量
样品 荧光标记的HA衍生物 150mM NaCl时的残存量(％)
样品5-1 99k HA-TyrNH2/Chol-6％/FL 1.4％
样品5-2 99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL 3.9％
样品5-3 99k HA-PheNH2/Chol-6％/FL 1％以下
样品5-4 99k HA-AlaNH2/Chol-6％/FL 98.9％
比较品5-1 50k HA-Chol-6％/FL 99.6％
比较品5-2 50k HA-Chol-7％/FL 22.6％
比较品5-3 99k HA-Chol-6％/FL 98.4％
WO2010/053140公开了50k HA-Chol-6％/FL(比较品5-1)即使在盐浓度低的条件(超纯水)下和生理盐浓度(150mM NaCl)下，均能呈溶液状态。另外，本实验显示，99k HA-Chol-6％/FL(比较品5-3)也显示出同样的性状。另一方面确认，99k HA-PheNH2/Chol-6％/FL(样品5-3)显示出在盐浓度低的条件(超纯水)下溶解、在生理盐浓度(150mM NaCl)下析出这样的盐浓度依赖特性。结果启示，通过制备用糖等进行了等渗化的低盐浓度溶液，本发明的HA衍生物可以在给药后皮下沉淀的制剂中用作载体。另外，其沉淀性能(残存量：1％以下)与迄今为止已报道的关于HA衍生物的值(比较品5-2：50k HA-Chol-7％/FL：22.6％)相比，优异得多。
99k HA-TyrNH2/Chol-6％/FL(样品5-1)、99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL(样品5-2)也与99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL(样品5-3)同样地显示出盐浓度依赖性沉淀性能，表明可用作盐浓度依赖的沉淀制剂。
(实施例5-6)大鼠皮下的沉淀性评价
将由实施例5-1、实施例5-2、实施例5-3中得到的荧光标记的HA 衍生物(99k HA-TyrNH2/Chol-6％/FL、99k HA-TrpNH2/Chol-6％/FL、99k HA-PheNH2/Chol-6％/FL)得到的化合物以10mg/kg的用量(蔗糖溶液)向大鼠皮下单次给药。给药后第7天，确认给药部位，结果确认，荧光标记的HA衍生物沉淀、残留。
(实施例5-7)未荧光标记的透明质酸衍生物的合成
不添加5-氨甲基荧光素，并且用作起始原料的HA-Na的分子量不同，除此以外，通过实施例5-1～实施例5-3所述的方法，得到作为白色固体的各种透明质酸衍生物。通过与对应的实施例所述同样的方法，计算胆甾醇基的引入率以及氨基酸和氨基酸酰胺的引入率(表20)。
[表20]制备透明质酸衍生物的实际使用量和引入率
〔实施例6〕药物封入能力评价
(实施例6-1)紫杉醇(PTX)的封入
向实施例1-4以及实施例1-21以及实施例3-8以及实施例5-7得到的HA衍生物的水溶液(超纯水)中加入紫杉醇(10mg/ml，甲醇溶液)，使最终紫杉醇浓度为100μg/mL，HA衍生物浓度为1.0mg/mL。在4℃下静置过夜后，以4700G离心10分钟，向上清液100μL中加入50％乙腈100μL、100mM HP-β-CD 50μL，按照以下条件进行反相色谱分析。
反相色谱分析条件
分析柱：PLRP-S(Agilent公司)
柱温：40℃
流动相A：0.1％TFA水溶液，流动相B：0.1％TFA乙腈溶液
梯度：B5％→B95％(3.4分)
流速：2mL/min
检出：UV254nm
注入量：30μL
使用标准(品)计算的上清液中的紫杉醇浓度如图6-1-1～图6-1-4所示。在HA衍生物不存在的情况下的紫杉醇的溶解度为0.6μg/mL，与此相比确认，在HA衍生物的存在下紫杉醇的溶解度优异地提高。这启示，紫杉醇等难溶性低分子化合物被封入到HA衍生物中。
(实施例6-2)环孢菌素(环孢菌素A：CyA)的封入
向实施例1-4以及实施例1-21以及实施例3-8以及实施例5-7得到的HA衍生物的水溶液(超纯水)中加入环孢菌素(10mg/ml，甲醇溶液)，最终环孢菌素浓度为300μg/mL，HA衍生物浓度为1.0mg/mL。在4℃下静置过夜后，以4700G离心30分钟，向上清液100μL中加入50％乙腈100μL、100mM HP-β-CD 50μL，按照实施例6-1所述的条件进行反相色谱分析。检测使用UV210nm。使用标准(品)计算的上清液中的环孢菌素浓度如图6-2-1～图6-2-4所示。在HA衍生物不存在的情况下的环孢菌素的溶解度为28μg/mL，与此相比确认，在HA衍生物的存在下环孢菌素的溶解度优异地提高。这启示环孢菌素等难溶性肽被封入到HA衍生物中。
〔实施例7〕体外释放试验
(实施例7-1)紫杉醇释放试验
向实施例1-21得到的10k HA-Ala-Chol-41％的水溶液(超纯水)中加入紫杉醇(10mg/ml、甲醇溶液)，使最终紫杉醇浓度为100μg/mL，HA衍生物浓度为1.0mg/mL。在4℃下静置过夜后，将游离的紫杉醇用透析膜(3000MWCO)在4℃下精制。将所得HA衍生物/紫杉醇复合物放入透析膜(3000MWCO)中，用PBS在37℃下孵育。经时用反相色谱分析法定量透析膜内的紫杉醇浓度以确认释放。透析膜内的紫杉醇的残存量如图7-1所示。结果显示，HA衍生物可用作缓释载体。
(实施例7-2)环孢菌素释放试验
代替紫杉醇，使用环孢菌素A，除此以外，采用实施例7-1所述的方法实施，确认环孢菌素的释放。透析膜内的环孢菌素的残存量如图7-2所示。结果显示，HA衍生物可用作缓释载体。
〔实施例8〕具有不同连接基的HA-AA-Chol的合成
代替胆甾醇6-氨基己基氨基甲酸酯(Chol-C6)，使用胆甾醇基2-氨基乙基氨基甲酸酯(Chol-C2)、胆甾醇基12-十二烷基氨基己基氨基甲酸酯(Chol-C12)、胆甾醇基8-氨基-3,6-二氧杂辛基氨基甲酸酯(Chol-EO2)，除此以外，进行与实施例1-4同样的方法，得到作为固体的连接基不同的HA-AA-Chol(表21)。胆甾醇基2-氨基乙基氨基甲酸酯、胆甾醇基12-十二烷基氨基己基氨基甲酸酯、胆甾醇基8-氨基-3,6-二氧杂辛基氨基甲酸酯按照WO2010/053140所述的方法合成。采用与实施例1-5所述相同条件测定的产物的1H-NMR谱如图8-1～图8-6所示。采用与实施例1-5所述同样的方法，计算胆甾醇基相对于HA单元的引入率(表21)。
[表21]制备透明质酸衍生物时的连接基和引入率
〔实施例9〕HA-Ala-胆酸的合成
(实施例9-1)N-(2-氨基乙基)5β-胆烷酰胺(Cholanoamide)的合成
将5β胆酸甲酯(s teraloids公司,100μg)溶解在乙二胺(6mL)中，在130℃回流4小时。减压蒸馏除去溶剂后，将残留物溶解在二氯甲烷中，用超纯水洗涤。减压蒸馏除去溶剂，得到氨乙基5β-胆烷酰胺。
1H-NMR(CDCl3)：δ＝0.64(3H，s，CH3)，0.91(3H，s，CH3)，0.92(3H，d，CH3)2.0-2.3(2H，m，COCH2)，2.8(2H，m，CH 2 CH2NHCO)，3.3(2H，m，CH2CH 2 NHCO)，5.9(1H，br，NHCO)。
(实施例9-2)HA-Ala-胆酸的合成
制备用与实施例1-4同样的方法合成的HA-Ala-TBA的无水DMSO溶 液(10mg/mL)，然后，向各溶液中相对于HA-Ala-TBA单元按下表22所示的比率添加实施例9-1制备的氨基乙基5β-胆烷酰胺。接着，相对于HA-Ala-TBA按下表22所示的比率添加DMT-MM。反应溶液依次用甲醇/水1/1混合液、0.15M NaCl水溶液、超纯水透析，将所得透析液冷冻干燥，得到作为白色固体的目标物(HA-Ala-CA)。
使用DMSO-d6作为测定溶剂的1H-NMR谱的代表例(使用99kDa的HA作为起始原料，胆酸的引入率为13％的产物)如图9所示。通过来自葡糖胺的乙酰基的峰(COCH3、1.6～2.0ppm；3H)的积分值和来自胆烷醇基中的甲基的峰(CH3、0.6ppm；3H)的积分值，由下述式计算胆酸相对于HA单元的引入率(表22)。予以说明，来自葡糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6～2.0ppm附近的峰与来自胆酸基的峰(7H)重叠，因此，计算将1.6～2.0ppm附近的峰的积分值减去来自胆酸基的甲基的峰(0.6ppm)的积分值的7/3而得到的值(即，积分值(1.6～2.0ppm)-积分值(0.6ppm)×7/3)，将其作为来自HA的乙酰基的积分值，用于计算引入率。
[数8]
[表22]制备HA-Ala-CA时的试剂使用量和引入率

Claims (12)

1.透明质酸衍生物，含有式(I)表示的重复单元，
式中，R1、R2、R3和R4独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
R5为氢原子、甲酰基、或C1-6烷基羰基；
X1为羟基、-O-Q+、C1-6烷氧基、-NR7R8、或-NR9-Z1-Z2；
Q+表示抗衡阳离子；
R6、R7、R8和R9独立地选自氢原子和C1-6烷基；
Ra为氢原子或C1-6烷基，所述烷基可独立地被选自羟基、羧基、氨基甲酰基、C1-6烷硫基、芳基和杂芳基的1个以上基团取代，所述芳基可被1个以上羟基取代；
Z1为C2-30亚烷基、或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，所述亚烷基可独立地被选自-O-、-NRg-和-S-S-的1～5个基团插入，m为选自1～100的整数；
Z2选自下式表示的基团：
-NRb-Z3、
-NRb-COO-Z3、
-NRb-CO-Z3、
-NRb-CO-NRc-Z3、
-COO-Z3、
-CO-NRc-Z3、
-O-CO-NRc-Z3、
-O-COO-Z3、
-S-Z3、
-CO-Za-S-Z3、
-O-CO-Zb-S-Z3、
-NRb-CO-Zb-S-Z3、和
-S-S-Z3；
Rb和Rc独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，其中所述基团的烷基部分可独立地被选自-O-和-NRf-的1～3个基团插入；
Rf独立地选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基、和羟基C2-12烷基，所述基团的烷基部分可独立地被选自-O-和-NH-的1～2个基团插入；
Rg独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基或羟基C2-20烷基，所述基团的烷基部分可独立地被选自-O-和-NH-的1～3个基团插入；
Z3为甾基；
Za为C1-5亚烷基；
Zb为C2-8亚烷基或C2-8亚烯基，
其中，
当所述透明质酸衍生物不含X1为-NR9-Z1-Z2的式(I)表示的重复单元时，所述透明质酸衍生物还含有式(II)表示的重复单元，
式中，R1a、R2a、R3a和R4a独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基、和C1-6烷基羰基；
R5a为氢原子、甲酰基、或C1-6烷基羰基；
X2为-NR9-Z1-Z2,其中R9、Z1和Z2如上述所定义的。
2.权利要求1所述的透明质酸衍生物，还含有式(IIb)表示的重复单元，
式中，R1b、R2b、R3b和R4b各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
R5b选自氢原子、甲酰基和C1-6烷基羰基；
Xb选自羟基和-O-Q+，其中Q+表示抗衡阳离子。
3.权利要求1或2所述的透明质酸衍生物，其中，式(I)中X1为-NR9-Z1-Z2。
4.权利要求3所述的透明质酸衍生物，其中，存在的二糖重复单元中的式(I)表示的二糖单元的比例为70～100％。
5.权利要求3所述的透明质酸衍生物，其中，存在的二糖重复单元中的含有基团-NR9-Z1-Z2的二糖单元的比例为3～50％。
6.权利要求1或2所述的透明质酸衍生物，其不含X1为-NR9-Z1-Z2的式(I)表示的重复单元。
7.权利要求6所述的透明质酸衍生物，其中，存在的二糖重复单元中的(I)表示的重复单元的比例和式(II)表示的重复单元的比例之和为70～100％。
8.权利要求1或2所述的透明质酸衍生物，其使用仅由权利要求2中定义的式(IIb)表示的二糖单元构成的透明质酸制造，其在R1b、R2b、R3b和R4b全部为氢原子、R5b为乙酰基、且Xb为-O-Na+时的重均分子量为3kDa～1500kDa。
9.权利要求1或2所述的透明质酸衍生物，其中，Z1为C2-10亚烷基，Z2为-NH-COO-Z3，Z3为胆甾醇基。
10.权利要求1或2所述的透明质酸衍生物，其通过将分别含有式(IIb)表示的重复单元和式(Ia)表示的重复单元的透明质酸衍生物
式中，Xa选自羟基、-O-Q+、C1-6烷氧基和-NR7R8，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、Q+和Ra如权利要求1所定义，
与下式表示的化合物反应而得到，
HNR9-Z1-Z2
式中，R9、Z1、和Z2如权利要求1所定义。
11.药物组合物，含有权利要求1～10任一项所述的透明质酸衍生物和药物。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中，药物通过与透明质酸衍生物形成复合物来负载。
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