JP2766303B2 - グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法 - Google Patents
グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法Info
- Publication number
- JP2766303B2 JP2766303B2 JP1091798A JP9179889A JP2766303B2 JP 2766303 B2 JP2766303 B2 JP 2766303B2 JP 1091798 A JP1091798 A JP 1091798A JP 9179889 A JP9179889 A JP 9179889A JP 2766303 B2 JP2766303 B2 JP 2766303B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sod
- modified
- added
- glycosaminoglycan
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、修飾酵素及びその製造法に関し、更に詳し
くはグリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシ
ドジスムターゼ及びその製造法に関するものである。
くはグリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシ
ドジスムターゼ及びその製造法に関するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） スーパーオキシドジスムターゼ（以下「SOD」とい
う。）は、ラジカルで反応性に富む活性酵素であるスー
パーオキシドの有害作用から生体を防禦する働きを有す
るといわれている。薬効の面では、抗リウマチ剤、心筋
梗塞又は臓器移植の際の使用、抗血栓剤の使用後に生じ
るラジカルの除去等の種々の炎症への適用が期待されて
いる。
う。）は、ラジカルで反応性に富む活性酵素であるスー
パーオキシドの有害作用から生体を防禦する働きを有す
るといわれている。薬効の面では、抗リウマチ剤、心筋
梗塞又は臓器移植の際の使用、抗血栓剤の使用後に生じ
るラジカルの除去等の種々の炎症への適用が期待されて
いる。
SODの原料としては、ヒト赤血球（J.Biol.Chem.,244,
4565（1969））、ウシ赤血球（J.Biol.Chem.,246,2875
（1975））、ニワトリ肝臓（J.Biol.Chem.,248,3582（1
973））、麦芽（Biochim.Biophys.Acta,317,50（197
3））、エンドウマメ（Biochim.Biophys.Acta,268,305
（1972））、ホウレンソウ（Eur.J.Biochem.,36,257（1
973））、酵母（Biochim.Biophys.Acta,289,276（197
2））、パンカビ（J.Biol.Chem.,247,3410（1972））等
があり、更に遺伝子組換えで大量調製も可能である。
4565（1969））、ウシ赤血球（J.Biol.Chem.,246,2875
（1975））、ニワトリ肝臓（J.Biol.Chem.,248,3582（1
973））、麦芽（Biochim.Biophys.Acta,317,50（197
3））、エンドウマメ（Biochim.Biophys.Acta,268,305
（1972））、ホウレンソウ（Eur.J.Biochem.,36,257（1
973））、酵母（Biochim.Biophys.Acta,289,276（197
2））、パンカビ（J.Biol.Chem.,247,3410（1972））等
があり、更に遺伝子組換えで大量調製も可能である。
しかし、蛋白のもつ宿命である、ヒト由来以外のSOD
の抗原性の問題、ヒト又は哺乳類動物由来のSODでの血
中における安定性及び効果の問題（ヒト由来のものは活
力が小さく、血中での安定性が悪いと報告されてい
る。）が報告されており、実用化には更に一工夫が必要
である。
の抗原性の問題、ヒト又は哺乳類動物由来のSODでの血
中における安定性及び効果の問題（ヒト由来のものは活
力が小さく、血中での安定性が悪いと報告されてい
る。）が報告されており、実用化には更に一工夫が必要
である。
かかる問題点を解消すべくポリアルキレングリコール
でSODを修飾する試みがなされているが（特開昭61−249
388号公報及び特開昭62−115280号公報）、多糖による
修飾ではデキストランによる修飾が報告されているのみ
である（特開昭62−115280号公報）。
でSODを修飾する試みがなされているが（特開昭61−249
388号公報及び特開昭62−115280号公報）、多糖による
修飾ではデキストランによる修飾が報告されているのみ
である（特開昭62−115280号公報）。
しかしながら、デキストランによる修飾では、SODの
抗炎症作用の増強が認められるが、免疫原性を抑制する
効果は認められていない（特開昭62−115280号公報５頁
左下欄参照）。
抗炎症作用の増強が認められるが、免疫原性を抑制する
効果は認められていない（特開昭62−115280号公報５頁
左下欄参照）。
本発明者らは、デキストランによるSODの修飾の欠点
を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、デキストランの代
わりにグリコサミノグリカン（以下「GAG」という。）
を用いることにより抗炎症作用を維持し、かつ、免疫原
性を抑制できることを見出し本発明を完成するに至っ
た。
を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、デキストランの代
わりにグリコサミノグリカン（以下「GAG」という。）
を用いることにより抗炎症作用を維持し、かつ、免疫原
性を抑制できることを見出し本発明を完成するに至っ
た。
［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、SODとGAGとを還元末端酸化法によって結合
させることを特徴とする修飾酸素の製造法、及びそれに
より得られるSODにGAGが結合した修飾酵素に関するもの
である。
させることを特徴とする修飾酸素の製造法、及びそれに
より得られるSODにGAGが結合した修飾酵素に関するもの
である。
本発明に用いるSODとしては、特に制限はないが、特
にヒト又はその他の哺乳類由来のSODが好ましい。
にヒト又はその他の哺乳類由来のSODが好ましい。
また、GAGとしては、例えば、ヒアルロン酸（以下「H
A」という。）、コンドロイチン硫酸（以下「CS」とい
う。）（A,B,C,D,E,F,H）、ヘパリン（以下「Hep」とい
う。）、ヘパラン硫酸（以下「HS」という。）ケラタン
硫酸（以下「KS」という。）、ケラタンポリ硫酸（以下
「KPS」という。）及びこれらの塩、例えばナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
A」という。）、コンドロイチン硫酸（以下「CS」とい
う。）（A,B,C,D,E,F,H）、ヘパリン（以下「Hep」とい
う。）、ヘパラン硫酸（以下「HS」という。）ケラタン
硫酸（以下「KS」という。）、ケラタンポリ硫酸（以下
「KPS」という。）及びこれらの塩、例えばナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
還元末端酸化法では、0.05Mホウ酸緩衝液（pH8.3）に
GAGを溶解し、水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温で
５時間反応させて還元末端還元GAGを得る。これを40mM
イミダゾール塩酸（pH6.5）水溶液に溶解し、５〜７倍
モルの過ヨウ素酸ナトリウムを０℃で加えて反応させ、
還元末端酸化GAGを得る。これにSODを加えて室温で１〜
20時間反応させた後、水素化シアノホウ素ナトリウムを
加えて室温で２〜20時間反応させ、精製して目的物を得
る。
GAGを溶解し、水素化ホウ素ナトリウムを加えて室温で
５時間反応させて還元末端還元GAGを得る。これを40mM
イミダゾール塩酸（pH6.5）水溶液に溶解し、５〜７倍
モルの過ヨウ素酸ナトリウムを０℃で加えて反応させ、
還元末端酸化GAGを得る。これにSODを加えて室温で１〜
20時間反応させた後、水素化シアノホウ素ナトリウムを
加えて室温で２〜20時間反応させ、精製して目的物を得
る。
以上の結合反応によって得られる修飾酵素は、常法に
従って、透析、アルコール沈殿、ゲルろ過、イオン交換
クロマトグラフィー等により精製することができる。
従って、透析、アルコール沈殿、ゲルろ過、イオン交換
クロマトグラフィー等により精製することができる。
本発明の修飾酵素は、抗炎症剤、特に抗リウマチ剤と
して有用である。
して有用である。
本発明の修飾酵素を医薬として適用するに際しては、
有効成分として本発明の修飾酵素又はその無毒性で薬学
的に許容される塩を、固体又は液体の医薬用担体又は希
釈剤、即ち、賦形剤、安定剤等の添加剤とともに含む製
剤とすることが好ましい。特に好ましい塩は、アルカリ
金属塩及びアルカリ土類金属塩のような薬学的に許容さ
れる無毒性の塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩が
挙げられる。これらの塩は水溶性であるため、注射剤と
して用いる場合に最適である。該医薬製剤において、前
記有効成分の担体成分に対する割合は、１〜90重量％の
間で変動させうる。
有効成分として本発明の修飾酵素又はその無毒性で薬学
的に許容される塩を、固体又は液体の医薬用担体又は希
釈剤、即ち、賦形剤、安定剤等の添加剤とともに含む製
剤とすることが好ましい。特に好ましい塩は、アルカリ
金属塩及びアルカリ土類金属塩のような薬学的に許容さ
れる無毒性の塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩が
挙げられる。これらの塩は水溶性であるため、注射剤と
して用いる場合に最適である。該医薬製剤において、前
記有効成分の担体成分に対する割合は、１〜90重量％の
間で変動させうる。
剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒剤、散剤、
錠剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、
又は原末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静
脈内投与、筋肉内投与又は皮下投与してもよい。また、
坐剤、軟骨剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、ロー
ション剤等の剤形にして、外用剤として用いることもで
きる。また、注射用の粉末にして、用時調製して使用し
てもよい。
錠剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、
又は原末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静
脈内投与、筋肉内投与又は皮下投与してもよい。また、
坐剤、軟骨剤、パップ剤、貼付剤、リニメント剤、ロー
ション剤等の剤形にして、外用剤として用いることもで
きる。また、注射用の粉末にして、用時調製して使用し
てもよい。
経口、経腸、非経口もしくは局所投与に適した医薬用
の有機又は無機の、固体又は液体の担体もしくは希釈剤
を、本発明の修飾酵素を含む医薬製剤を調製するために
用いることができる。水、ゼラチン、乳頭、デンプン、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベン
ジルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール、石
油樹脂、やし油、ラノリン又は医薬に用いられる他のキ
ャリアー（担体）は全て、本発明の修飾酵素の担体とし
て用いることができる。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤
や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なpHを維持するた
めの塩類を補助薬剤として適宜用いることもできる。
の有機又は無機の、固体又は液体の担体もしくは希釈剤
を、本発明の修飾酵素を含む医薬製剤を調製するために
用いることができる。水、ゼラチン、乳頭、デンプン、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベン
ジルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール、石
油樹脂、やし油、ラノリン又は医薬に用いられる他のキ
ャリアー（担体）は全て、本発明の修飾酵素の担体とし
て用いることができる。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤
や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なpHを維持するた
めの塩類を補助薬剤として適宜用いることもできる。
更に、該医薬製剤は、リウマチ等の炎症性の疾患又は
症状の治療において、本発明の修飾酵素とともに適切に
投与することができる他の医薬として有効な成分、例え
ば他の適当な抗炎症剤又は抗炎症酸素剤を含有していて
もよい。
症状の治療において、本発明の修飾酵素とともに適切に
投与することができる他の医薬として有効な成分、例え
ば他の適当な抗炎症剤又は抗炎症酸素剤を含有していて
もよい。
顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤又はカプセル剤の場合に
は、該医薬製剤は本発明の修飾酵素を５〜80重量％含有
しているのが好ましく、液剤の場合には、対応する量
（割合）は、１〜30重量％であるのが好ましい。また、
非経口投与のうち、注射剤の場合は１〜10重量％、坐剤
の場合は１〜50重量％が好ましい。局所投与用である軟
膏剤又は０パップ剤等として用いる場合は、医薬製剤10
0gに対し、本発明の修飾酵素を0.1〜10g含有させること
が好ましい。
は、該医薬製剤は本発明の修飾酵素を５〜80重量％含有
しているのが好ましく、液剤の場合には、対応する量
（割合）は、１〜30重量％であるのが好ましい。また、
非経口投与のうち、注射剤の場合は１〜10重量％、坐剤
の場合は１〜50重量％が好ましい。局所投与用である軟
膏剤又は０パップ剤等として用いる場合は、医薬製剤10
0gに対し、本発明の修飾酵素を0.1〜10g含有させること
が好ましい。
臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し本発明の
修飾酵素として、１日量100〜2000mgを内服するのが好
ましいが、年齢、症状により適宜増減することも可能で
ある。前記１日量の本発明の修飾酵素は、１日に１回、
又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分けて投
与することが好ましい。
修飾酵素として、１日量100〜2000mgを内服するのが好
ましいが、年齢、症状により適宜増減することも可能で
ある。前記１日量の本発明の修飾酵素は、１日に１回、
又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分けて投
与することが好ましい。
また、注射剤として用いる場合には、本発明の修飾酵
素として成人に対し１回量10〜1000mgを投与するのが好
ましく、軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、前
記含有割合のものを適当量患部に塗布することが好まし
い。
素として成人に対し１回量10〜1000mgを投与するのが好
ましく、軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、前
記含有割合のものを適当量患部に塗布することが好まし
い。
（発明の実施例） 以下、実施例、試験例により本発明を更に詳細に説明
するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。
なお、以下の実施例等において、酸素活性及び物性の
測定等は以下の条件で行った。
測定等は以下の条件で行った。
SOD活性の測定： J.M.McCord及びI.Fridvichの方法（J.Biol.Chem.,24
4,6049（1969））に準じて行った。
4,6049（1969））に準じて行った。
電気泳動： アセチルセルロース膜（Separax JOOKOO CO.,LTD.）
を用い、0.1Mピリジン／ギ酸緩衝液（pH3.0）、0.5mA/c
mで30分泳動し、クーマシーブルー、又はアルシアンブ
ルー及びトルイジンブルーで染色した。
を用い、0.1Mピリジン／ギ酸緩衝液（pH3.0）、0.5mA/c
mで30分泳動し、クーマシーブルー、又はアルシアンブ
ルー及びトルイジンブルーで染色した。
HPLCによる分子量測定： 東ソ−製カラムG6000PW×２を用い、0.2M食塩水溶液
で溶出し、HAのキャリブレーションカーブからHA−SOD
の分子量を測定した。
で溶出し、HAのキャリブレーションカーブからHA−SOD
の分子量を測定した。
参考例１ HA修飾SODの製造（水溶性カルボジイミド縮
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）500mgを水500mlに溶解
し、0.01N塩酸でpH6.0とした。この水溶液にウシ赤血球
由来のSOD5mgを溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下［WS
C］という。）30mgを加えて４℃で20時間反応させた。
反応液にエタノールを加えて沈殿物を得た。この沈殿物
を水に溶解し、再度エタノールを加えて、沈殿物として
HA修飾SODを得た。
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）500mgを水500mlに溶解
し、0.01N塩酸でpH6.0とした。この水溶液にウシ赤血球
由来のSOD5mgを溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下［WS
C］という。）30mgを加えて４℃で20時間反応させた。
反応液にエタノールを加えて沈殿物を得た。この沈殿物
を水に溶解し、再度エタノールを加えて、沈殿物として
HA修飾SODを得た。
収量:482mg SOD含量:0.92％ HA含量:99.08％ 分子量:118万 電気泳動：第１図参照 SOD活性：未修飾SODの67.2％ ［α］D:−79.0（Ｃ＝1,H2O） 参考例２ HA修飾SODの製造（水溶性カルボジイミド縮
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）200mg、ヒト赤血球由来
のSOD5mg及びWSC19mgを用い、実施例１と同様に処理し
てHA修飾SODを得た。
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）200mg、ヒト赤血球由来
のSOD5mg及びWSC19mgを用い、実施例１と同様に処理し
てHA修飾SODを得た。
収量:198mg SOD含量:2.30％ HA含量:99.70％ 分子量:118万 電気泳動：第１図参照 SOD活性：未修飾SODの44.4％ ［α］D:−78.5（Ｃ＝1,H2O） 参考例３ HA修飾SODの製造（臭化シアン活性化法） 鶏冠由来のHA（分子量15万）400mgを2Mリン酸緩衝液
（pH11.5）に溶解し、臭化シアンのアセトニトリル溶液
（100mg/ml）1mlを加えて４℃で５分間反応させた。直
ちに、アセトニトリル150mlを加えて沈殿物を得、アセ
トニトリルで素早く洗浄した。この沈殿物を0.1M炭酸水
素ナトリウム水溶液に溶解し、１％のイヌ赤血球由来の
SOD水溶液10mlを加えて４℃で20時間反応させた。反応
液にエタノールを加え、得た沈殿物を水に溶解し、エタ
ノールアミン0.1mlを加えて室温で１時間反応させた。
反応液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を充分に
エタノールで洗浄して乾燥させて、HA修飾SODを得た。
（pH11.5）に溶解し、臭化シアンのアセトニトリル溶液
（100mg/ml）1mlを加えて４℃で５分間反応させた。直
ちに、アセトニトリル150mlを加えて沈殿物を得、アセ
トニトリルで素早く洗浄した。この沈殿物を0.1M炭酸水
素ナトリウム水溶液に溶解し、１％のイヌ赤血球由来の
SOD水溶液10mlを加えて４℃で20時間反応させた。反応
液にエタノールを加え、得た沈殿物を水に溶解し、エタ
ノールアミン0.1mlを加えて室温で１時間反応させた。
反応液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を充分に
エタノールで洗浄して乾燥させて、HA修飾SODを得た。
収量:350mg SOD含量:21.2％ HA含量:78.8％ 分子量:17.2万 電気泳動：第１図参照 SOD活性：未修飾SODの82.1％ ［α］D:−68.0（Ｃ＝1,H2O） 実施例４ HA修飾SODの製造（還元末端酸化法） （１）HAの還元末端の還元 鶏冠由来のHA（分子量100万）2000mg（0.00192mmol）
を0.05Mホウ酸緩衝液（pH8.3）200mlに溶解し、水素化
ホウ素ナトリウム1.82mgを加えて室温で５時間反応させ
た。反応液に酢酸を加えてpHを4.5として、エタノール
を加えて沈殿させた。沈殿物を充分にエタノールで洗浄
して乾燥させて、還元末端還元HAを得た。
を0.05Mホウ酸緩衝液（pH8.3）200mlに溶解し、水素化
ホウ素ナトリウム1.82mgを加えて室温で５時間反応させ
た。反応液に酢酸を加えてpHを4.5として、エタノール
を加えて沈殿させた。沈殿物を充分にエタノールで洗浄
して乾燥させて、還元末端還元HAを得た。
収量:1800mg （２）還元末端酸化HA 還元末端還元HA1700mg（0.001635mmol）を40mMイミダ
ゾール塩酸（pH6.5）水溶液250mlに溶解、０℃に冷却し
て過ヨウ素酸ナトリウム1.39956mgを加えて１時間反応
させた。反応液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物
を充分にエタノールで洗浄して、還元末端酸化HAを得
た。
ゾール塩酸（pH6.5）水溶液250mlに溶解、０℃に冷却し
て過ヨウ素酸ナトリウム1.39956mgを加えて１時間反応
させた。反応液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物
を充分にエタノールで洗浄して、還元末端酸化HAを得
た。
収量:1610mg アルデヒド基：還元末端の70％ （３）HA修飾SOD 還元末端酸化HA100mgを0.05Mリン酸緩衝液（pH8.0）1
0mlに溶解し、ウシ赤血球由来のSOD2.3mgを加えて室温
で20時間反応させた。次いで、水素化シアノホウ素ナト
リウム0.4mgを加えて室温で２時間反応させた。反応液
にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を充分にエタノ
ールで洗浄して乾燥させて、HA修飾SODを得た。
0mlに溶解し、ウシ赤血球由来のSOD2.3mgを加えて室温
で20時間反応させた。次いで、水素化シアノホウ素ナト
リウム0.4mgを加えて室温で２時間反応させた。反応液
にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を充分にエタノ
ールで洗浄して乾燥させて、HA修飾SODを得た。
収量:89.7mg SOD含量:2.0％ HA含量:98.0％ 分子量:100万 電気泳動：第１図参照 SOD活性：未修飾SODの89.8％ ［α］D:−78.0（Ｃ＝1,H2O） 参考例５ CS修飾SODの製造（水溶性カルボジイミド縮
合法） ウシ気管軟骨由来のCS（分子量15000）100mgを水10ml
に溶解し、0.01N塩酸でpH6.0とした。これにウシ赤血球
由来のSODを１、２、５、10、20又は40mg加えた後、WSC
を6mgずつ加えて４℃で20時間反応させた。反応液にエ
タノールを加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度エ
タノールを加えて沈殿させて、それぞれ以下の表１に示
すCS−SOD−１、２、３、４、５又は６を得た。
合法） ウシ気管軟骨由来のCS（分子量15000）100mgを水10ml
に溶解し、0.01N塩酸でpH6.0とした。これにウシ赤血球
由来のSODを１、２、５、10、20又は40mg加えた後、WSC
を6mgずつ加えて４℃で20時間反応させた。反応液にエ
タノールを加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度エ
タノールを加えて沈殿させて、それぞれ以下の表１に示
すCS−SOD−１、２、３、４、５又は６を得た。
実施例６ Hep修飾SODの製造（還元末端酸化法） （１）Hepの還元末端の還元 豚小腸由来のHep（分子量15000）5000mg（0.3335mmo
l）及び水素化ホウ素ナトリウム315.4mg（18.34mmol）
を用い、実施例４（１）と同様に処理して還元末端還元
Hepを得た。
l）及び水素化ホウ素ナトリウム315.4mg（18.34mmol）
を用い、実施例４（１）と同様に処理して還元末端還元
Hepを得た。
収量:4835mg Ｓ含量:12.57％ （２）還元末端酸化Hep 還元末端還元Hep4000mg（0.2667mmol）及び過ヨウ素
酸ナトリウム228mg（1.067mmol）を用い、実施例４
（２）と同様に処理して還元末端酸化Hepを得た。
酸ナトリウム228mg（1.067mmol）を用い、実施例４
（２）と同様に処理して還元末端酸化Hepを得た。
収量:3785mg Ｓ含量:12.66％ アルデヒド基：還元末端の68％ （３）Hep修飾SOD 還元末端酸化Hep100mgを0.05Mリン酸緩衝液（pH8.0）
10mlに溶解し、ウシ赤血球由来のSOD60mgを加えて室温
で20時間反応させた。次いで、水素化シアノホウ素ナト
リウム20mgを加えて室温で２時間反応させた。反応液に
エタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度
エタノールで沈殿させてHep修飾SODを得た。
10mlに溶解し、ウシ赤血球由来のSOD60mgを加えて室温
で20時間反応させた。次いで、水素化シアノホウ素ナト
リウム20mgを加えて室温で２時間反応させた。反応液に
エタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度
エタノールで沈殿させてHep修飾SODを得た。
収量:120mg SOD含量:55％ Hep含量:45％ 分子量:43600 電気泳動：第１図参照 SOD活性：未修飾SODの82.4％ ［α］D:12.0（Ｃ＝1,H2O） 参考例７ HA修飾SODの製造（水溶性カルボジイミド縮
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）を実施例１に準じて大
腸菌由来のSOD（3000U/mg蛋白）に結合させた。
合法） 鶏冠由来のHA（分子量100万）を実施例１に準じて大
腸菌由来のSOD（3000U/mg蛋白）に結合させた。
SOD含量:1.00％ HA含量:99.00％ 分子量:110万 SOD活性：未修飾SODの44.0％ ［α］D:−69.0（Ｃ＝1,H2O） 試験例１ 免疫学的活性の測定 Swiss−Webster系雌性マウス４匹を１群として、腹腔
内に週に１回12週間、0.05Mリン酸緩衝液pH7.0（以下
「PBS」という。）に溶解した大腸菌由来のSOD又は参考
例７で得たHA修飾SOD（以下「HA−SOD−７」という。）
を蛋白として0.1mg分投与した。０、３、６、９、12週
目に眼窩後の血管（retroorbital plexus）から採血し
て−20℃に保存した。それぞれの血清はVollerらの方法
（In Manual of Clinical Immunology（N.R.Rose and
H.Friedman.eds.）,pp.506−512,American Society for
Microbiology,Washington,DC（1976））に従い、HPO
（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）ELISAで力価
を測定した。即ち、抗原を炭酸塩緩衝液（0.5M,pH9.5）
で10μg/mlに希釈し、100μｌを用いた。プレート（Nun
c Immuno II microtiter plates）を４℃で一晩インキ
ュベートし、ツイーン（Tween）入り生理食塩水（0.05
％Tween20）で３回洗浄した。試験に用いられる血清を
ツィーン（Tween）入りPBS（0.05％Tween20）で希釈
し、100μｌを加えた。３つのコントロール、即ち、抗
原コントロール、抗血清コントロール、正常マウスコン
トロールが作られたことになる。室温で１時間インキュ
ベートし、各々に100μｌのHOP−結合ヤギ抗マウス免疫
グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）を加えて、室温で１時間3
0分インキュベートした。ｏ−フェニレンジアミン基質1
00μｌを加えて10分間インキュベートし、4N硫酸0.01ml
を加えて反応を中止した。力価は光学密度がコントロー
ルの血清を対照にして0.01となるところの希釈倍率で表
した。
内に週に１回12週間、0.05Mリン酸緩衝液pH7.0（以下
「PBS」という。）に溶解した大腸菌由来のSOD又は参考
例７で得たHA修飾SOD（以下「HA−SOD−７」という。）
を蛋白として0.1mg分投与した。０、３、６、９、12週
目に眼窩後の血管（retroorbital plexus）から採血し
て−20℃に保存した。それぞれの血清はVollerらの方法
（In Manual of Clinical Immunology（N.R.Rose and
H.Friedman.eds.）,pp.506−512,American Society for
Microbiology,Washington,DC（1976））に従い、HPO
（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）ELISAで力価
を測定した。即ち、抗原を炭酸塩緩衝液（0.5M,pH9.5）
で10μg/mlに希釈し、100μｌを用いた。プレート（Nun
c Immuno II microtiter plates）を４℃で一晩インキ
ュベートし、ツイーン（Tween）入り生理食塩水（0.05
％Tween20）で３回洗浄した。試験に用いられる血清を
ツィーン（Tween）入りPBS（0.05％Tween20）で希釈
し、100μｌを加えた。３つのコントロール、即ち、抗
原コントロール、抗血清コントロール、正常マウスコン
トロールが作られたことになる。室温で１時間インキュ
ベートし、各々に100μｌのHOP−結合ヤギ抗マウス免疫
グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）を加えて、室温で１時間3
0分インキュベートした。ｏ−フェニレンジアミン基質1
00μｌを加えて10分間インキュベートし、4N硫酸0.01ml
を加えて反応を中止した。力価は光学密度がコントロー
ルの血清を対照にして0.01となるところの希釈倍率で表
した。
なお、デキストラン（分子量120000）を用いて実施例
と同様に処理して得られる修飾SOD（以下「Dex−SOD」
という。）についても同様の試験を行った。結果を表２
に示す。
と同様に処理して得られる修飾SOD（以下「Dex−SOD」
という。）についても同様の試験を行った。結果を表２
に示す。
表２から、本発明の修飾酵素は、未修飾SOD及びDex−
SODに比し抗原性が顕著に低いことがわかる。
SODに比し抗原性が顕著に低いことがわかる。
試験例２ マウス虚血足浮腫に及ぼす影響 Y.Oyanaguiらの方法（Free Rad.Res.Comms.,４
（６）,385−396）に準じて行った。
（６）,385−396）に準じて行った。
８週令のddy系雄性マウスを保定器にて保定し、縫合
糸（プレイン２号）で右後肢を一周縛り、一方を固定
し、もう一方に500gのオモリを吊して一定時間虚血を行
った。虚血前及び60分後の足蹠厚をノギスで測定した。
その後、足蹠を切断し足蹠重量も測定した。一群５匹を
用い、投与群には、ウシ赤血球由来のSOD又は実施例１
で得たHA−SODを虚血開始前30分又は虚血直前に、SODは
10000単位/kg、HA−SODは500、2000単位/kg投与した。
なお、コントロール群には、生理食塩水を虚血直前に静
注した。結果を表３に示す。
糸（プレイン２号）で右後肢を一周縛り、一方を固定
し、もう一方に500gのオモリを吊して一定時間虚血を行
った。虚血前及び60分後の足蹠厚をノギスで測定した。
その後、足蹠を切断し足蹠重量も測定した。一群５匹を
用い、投与群には、ウシ赤血球由来のSOD又は実施例１
で得たHA−SODを虚血開始前30分又は虚血直前に、SODは
10000単位/kg、HA−SODは500、2000単位/kg投与した。
なお、コントロール群には、生理食塩水を虚血直前に静
注した。結果を表３に示す。
表３から明らかなように、本発明の修飾酵素は、未修
飾SODに比し、活性単位で1/20、蛋白量で1/13.4の量で
虚血直前投与でほぼ同等の効果を示した。虚血30分前投
与では未修飾SODが効果を示さないのに対し、本発明の
修飾酵素は明らかに効果を示した。このことは、本発明
の修飾酵素が血中で安定であり、持続性を有することを
示すものといえる。
飾SODに比し、活性単位で1/20、蛋白量で1/13.4の量で
虚血直前投与でほぼ同等の効果を示した。虚血30分前投
与では未修飾SODが効果を示さないのに対し、本発明の
修飾酵素は明らかに効果を示した。このことは、本発明
の修飾酵素が血中で安定であり、持続性を有することを
示すものといえる。
試験例３ 急性毒性試験 実施例４及び参考例１〜３で得たHA修飾SODを生理食
塩水に２％溶解し、急性毒性試験を行った。被検動物と
しては４週令のSlc−ddy系雌雄マウスを用い、投与は最
も毒性が発現しやすい腹腔内投与により行った。
塩水に２％溶解し、急性毒性試験を行った。被検動物と
しては４週令のSlc−ddy系雌雄マウスを用い、投与は最
も毒性が発現しやすい腹腔内投与により行った。
何れのHA修飾SODのLD50も2000mg/kg以上であった。
［発明の効果］ 本発明によれば、従来の多糖修飾SODの欠点である抗
原性を低下させたGAG修飾SODを提供することができる。
原性を低下させたGAG修飾SODを提供することができる。
第１図は、電気泳動の結果を示す図である。第１図にお
いて、Ａはクーマシーブルーで、Ｂはアルシアンブルー
及びトルイジンブルーで、それぞれ染色した場合を示
す。 １……ウシ赤血球由来のSOD ２……参考例１で得たHA−SOD ３……ヒト赤血球由来のSOD ４……参考例２で得たHA−SOD ５……イヌ赤血球由来のSOD ６……参考例３で得たHA−SOD ７……実施例４で得たHA−SOD ８……HA＋CS＋Hep ９……参考例５で得たCS−SOD−３ 10……実施例６で得たHep−SOD
いて、Ａはクーマシーブルーで、Ｂはアルシアンブルー
及びトルイジンブルーで、それぞれ染色した場合を示
す。 １……ウシ赤血球由来のSOD ２……参考例１で得たHA−SOD ３……ヒト赤血球由来のSOD ４……参考例２で得たHA−SOD ５……イヌ赤血球由来のSOD ６……参考例３で得たHA−SOD ７……実施例４で得たHA−SOD ８……HA＋CS＋Hep ９……参考例５で得たCS−SOD−３ 10……実施例６で得たHep−SOD
Claims (3)
- 【請求項１】スーパーオキシドジスムターゼにグリコサ
ミノグリカンを還元末端酸化法によって結合させること
を特徴とする修飾酵素の製造法。 - 【請求項２】グリコサミノグリカンの還元末端を還元し
て還元末端還元グリコサミノグリカンを得、その還元末
端の一級水酸基を酸化してアルデヒド基を有する還元末
端酸化グリコサミノグリカンを得、次いでこれにスーパ
ーオキシドジスムターゼを反応させることを特徴とす
る、修飾酵素の製造法。 - 【請求項３】請求項２記載の還元末端酸化法によって製
造される、スーパーオキシドジスムターゼにグリコサミ
ノグリカンが結合した修飾酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1091798A JP2766303B2 (ja) | 1989-04-13 | 1989-04-13 | グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1091798A JP2766303B2 (ja) | 1989-04-13 | 1989-04-13 | グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273176A JPH02273176A (ja) | 1990-11-07 |
| JP2766303B2 true JP2766303B2 (ja) | 1998-06-18 |
Family
ID=14036635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1091798A Expired - Fee Related JP2766303B2 (ja) | 1989-04-13 | 1989-04-13 | グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2766303B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04248984A (ja) * | 1991-02-05 | 1992-09-04 | Kuraray Co Ltd | スーパーオキシドジスムターゼ誘導体およびその製造方法 |
| US20060239987A1 (en) * | 2005-04-22 | 2006-10-26 | Robert Foster | Nutritional composition and methods of making and using same |
| EP1906992A1 (fr) * | 2005-06-28 | 2008-04-09 | Life Science Investments Limited | Utilisation d' un melange de superoxyde dismutase et de catalase pour le traitement des lesions d origine inflammatoire de la peau |
| WO2012118189A1 (ja) | 2011-03-03 | 2012-09-07 | 中外製薬株式会社 | アミノ－カルボン酸により修飾されたヒアルロン酸誘導体 |
| KR102130864B1 (ko) | 2012-09-05 | 2020-07-08 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 아미노산 및 스테릴기가 도입된 히알루론산 유도체 |
| US11512147B2 (en) | 2017-11-15 | 2022-11-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Hyaluronic acid derivative modified with polyethylene glycol |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4585754A (en) * | 1984-01-09 | 1986-04-29 | Valcor Scientific, Ltd. | Stabilization of proteins and peptides by chemical binding with chondroitin |
| JPS6467186A (en) * | 1987-09-04 | 1989-03-13 | Kanebo Ltd | Modified superoxide dismutase |
-
1989
- 1989-04-13 JP JP1091798A patent/JP2766303B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02273176A (ja) | 1990-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5310881A (en) | Glycosaminoglycan-modified protein | |
| JP2514950B2 (ja) | 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体 | |
| US4272522A (en) | Method for stimulating phagocytic activity and synergistic compositions therefor | |
| FI57109C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya arginin- och lycinsalter av cefalosporiner vilka salter foerorsakar liten smaerta vid injicering | |
| CS207742B2 (en) | Method of makingthe inclusion complex of the cyclodextrin and acid 1-/p-chlorbenzoyl/-5-methoxy-2-methylind-3-yl-vinegar | |
| JPH0770195A (ja) | 糖修飾インターフェロン | |
| JPH10504347A (ja) | 水溶性ポリエン複合体 | |
| JPS59172425A (ja) | 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤 | |
| JPH03181422A (ja) | 炎症の治療方法及び炎症の治療用合成薬 | |
| JP2766303B2 (ja) | グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法 | |
| US4849563A (en) | Novel 1-alkyl-1-arenesulfonyl-2-alkoxycarbonylsulfenylhydrazines having antineoplastic activity | |
| BG64458B1 (bg) | Използване на цинков хиалуронат срещу пептична язва | |
| FI65990C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara aminosyraderivat | |
| JPH04248984A (ja) | スーパーオキシドジスムターゼ誘導体およびその製造方法 | |
| GB2221907A (en) | Superoxide dismutase composition. | |
| JPH02231078A (ja) | ヒアルロン酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ | |
| JPH04121187A (ja) | ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法 | |
| US5087453A (en) | Method for the treatment of bacterial caused weight loss and/or hypoglycemia | |
| JPH01268645A (ja) | シュワルツマン反応抑制剤 | |
| NL8803092A (nl) | Tromethaminezout van 1-methyl-beta-oxo-alfa-(fenylcarbamoyl)-2-pyrroolpropionitril. | |
| JP3032599B2 (ja) | 長鎖カルボン酸マレイミド | |
| JPH0952843A (ja) | 急性腎不全治療剤 | |
| US4070459A (en) | N-carbamylated orgotein | |
| JP3522798B2 (ja) | 糖修飾蛋白質の製造法 | |
| JPH02209807A (ja) | 抗炎症剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |