KR102130864B1 - 아미노산 및 스테릴기가 도입된 히알루론산 유도체 - Google Patents
아미노산 및 스테릴기가 도입된 히알루론산 유도체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 의해, 식 (I) 또는 식 (I) 및 (II) 로 나타내는 이당 단위를 포함하는, 히알루론산 유도체, 및 당해 히알루론산 유도체와 약물에 의해 형성되는 복합체가 제공된다.
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Description
본 발명은 아미노산에 의해 수식되고, 또한, 스테릴기를 도입한 히알루론산 유도체, 그 히알루론산 유도체와 약물의 복합체, 및 그 히알루론산 유도체 및 약물을 포함하는 의약품 조성물에 관한 것이다.
최근, 재조합 유전자 기술이나 화학 합성 기술의 발전에 의해, 단백질 및 펩티드를 활성 성분으로 하는 제제가 실용화되고 있고, 그 수는 해마다 계속 증가하고 있다. 그러나, 단백질이나 펩티드는 소화관 혹은 점막 등에서는 잘 흡수되지 않고, 또, 체내에서는 불안정하여 혈중 반감기가 짧다. 그 때문에, 단백질 제제 및 펩티드 제제는 주사에 의한 빈회 투여가 필요해져, 환자에게도 의료 관계자에게도 부담이 커지고 있다. 약리 활성을 손상시키는 일 없이 단백질이나 펩티드를 캡슐화하기 위한 서방성 혹은 타겟팅 기능을 갖는 DDS (약물 송달 시스템) 기재가 요망되고 있다. 또, 투여 효율의 관점에서, 기재에 대해 가능한 한 다량의 단백질, 펩티드를 봉입할 수 있는 것이 바람직하다.
단백질이나 펩티드의 약리 활성은 그들의 고차 구조에서 기인되는 바가 크고, 유기 용매나 공기 계면과의 접촉, 압력이나 온도, pH 와 같은 외부 환경에서 기인되는 변성 및 응집에 의해 단백질이나 펩티드의 약리 활성이 손상되는 것이 알려져 있다. 또, 변성이나 응집한 단백질을 체내에 투여함으로써 항원성 등의 리스크가 높아지는 것도 알려져 있다. 단백질 또는 펩티드를 활성 성분으로 하는 서방성 제제에 있어서는, 제제화 공정으로부터, 제제의 저장 기간을 거쳐, 투여 후에 생체 내에서 당해 활성 성분이 방출될 때까지, 단백질이나 펩티드의 안정성을 확보하는 것이 요구된다.
저분자 약물에 있어서는, 약물의 안정성에 관한 과제는 단백질·펩티드와 비교하면 크지는 않지만, 여전히, 난용성 약물의 용해성 향상 기능이나, 서방성 혹은 타겟팅 기능을 갖는 DDS 기재에 대한 요구는 크다.
또, 안전성의 면에서, 제제에 사용하는 기재는 비항원성, 비변이원성, 무독성, 생분해성을 겸비하는 것이 아니면 안된다.
최근, 다당을 약물 담체의 기재로서 사용한다는 보고가 있다. 그 중에서도, 히알루론산 (HA) 은 1934년, K. Meyer 에 의해 소의 눈의 유리체로부터 단리된 생체 재료 (다당) 로, 세포 외 매트릭스의 주성분으로서 예로부터 알려져 있다. HA 는 D-글루크론산과 N-아세틸글루코사민이 β (1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 이당 단위로 이루어지는 글리코사미노글리칸의 일종이다. HA 는 화학적, 물리적 구조에 종차가 없고, 인간도 그 대사계를 갖고 있으며, 면역성 및 독성이라는 면에서도 가장 안전한 의료용 생체 재료 (Biomaterial) 의 하나이다.
상기 서술한 안전성이라는 특성에 더하여, 최근, 세포의 접착, 증식, 이동의 유도에 관한 히알루론산의 생리 활성 물질로서의 측면도 주목받고 있다. 또한 제조의 관점에서도, 미생물에 의한 고분자량의 히알루론산의 대량 생산이 가능해지고 있어, DDS 연구가 활발히 실시되고 있다. 약물을 히알루론산과 컨쥬게이트함으로써, 약물의 암 조직에 대한 타겟팅 (특허문헌 1), 간장에 대한 타겟팅 (특허문헌 2), 항원성의 저감 등 (특허문헌 3) 을 달성할 수 있다는 보고가 이루어져 있다. 또, 생체 내에는 CD44 나 RHAMM (Receptor for Hyaluronic Acid-Mediated Motility), LYVE-1 (Lymphe Vessel Endothelial HA Receptor-1), HARE (Hyaluronic acid Receptor for Endocytosis) 등의 HA 리셉터가 존재하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 7 및 비특허문헌 8). 특히 CD44 나 RHAMM 은 많은 암 세포에 있어서 과잉 발현하고 있고, 그러므로 HA 를 암 타겟팅 캐리어의 기재로서 이용하는 시도가 이루어지고 있다. 그 예로서, 파클리탁셀-HA 컨쥬게이트 (비특허문헌 9 ∼ 11 및 특허문헌 12), 캠토테신-HA 컨쥬게이트 (특허문헌 13), 독소루비신-HPMA[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드]-HA 컨쥬게이트 (비특허문헌 12), 부티르산-HA 컨쥬게이트 (비특허문헌 13), 독소루비신 봉입 HA-PEG-PLGA 나노 파티클 (비특허문헌 14), siRNA 봉입 HA 겔 (비특허문헌 15), 독소루비신 봉입 HA 피복 리포좀 (비특허문헌 16) 등을 들 수 있다. 또한, 비특허문헌 17 에는, 아미드 결합에 의해 도입한 에틸렌디아민 링커를 통해서 콜산을 컨쥬게이트한 HA 유도체에 대해 보고되어 있다. 이들 HA 를 기재로 한 캐리어는 in vitro 에 있어서의 CD44 고발현 세포에 있어서 효율적으로 삽입되는 것이 보고되어 있다 (예를 들어 비특허문헌 9). 그러나, HA 는 전신 투여한 경우, 간장 등의 유동 내피에 존재하는 HARE 리셉터에 의해 순식간에 삽입되어, 대사되는 것이 알려져 있어, 급속히 혈중으로부터 소실된다 (비특허문헌 18 ∼ 20). 이와 같이 히알루론산을 체류성 연장이나 타겟팅용 DDS 기재로서 사용하는 경우, 그 혈중 체류성의 짧음이 결점이 된다. 히알루론산이 연속하는 6 당이 리셉터의 인식 부위라고 생각되고 있으며, 카르복시를 수식함으로써 혈중 체류 시간의 연장 (특허문헌 4, 5 및 6) 을 실시하는 시도가 이루어지고 있다.
히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시를 고도로 수식함으로써, 혈중 체류성의 장기화를 실현시킨 히알루론산 유도체가 개발되어, 그 유용성이 나타나 왔다 (특허문헌 7). 일반적으로 글루크론산 부분의 카르복시의 수식률을 높임으로써 히알루론산 유도체의 혈중 체류성도 장기화된다. 그러나, 양자는 직선적으로 상관되는 것은 아니고, 어느 임계값을 경계로 급격하게 변화하는 것이 밝혀져 있다.
히알루론산 중의 카르복시를 아미노산으로 수식한 사례로는, 예를 들어, N-메틸모르폴린의 존재하, 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진을 사용함으로써 생성되는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨 (이하, DMT-MM 이라고도 칭한다) 을 축합제로서 사용한, 글리신의 에틸에스테르에 의한 수식을 들 수 있는데, 수식률은 최대 20 % 가 되고 있다 (비특허문헌 1). 또, 트리아진계 화합물을 축합제로서 이용한 사례로는 알라닌을 도입한 히알루론산이, 효소 분해에 대한 내성이 증강하여, 점성의 서플리먼트로서의 이용을 기대할 수 있는 것이 보고되어 있고 (비특허문헌 2), 동일한 수법으로, 다른 아미노산에 관해서도, 수식이 보고되어 있다 (비특허문헌 3, 특허문헌 9). 또, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (이하, EDC 라고도 칭한다) 을 축합제로서 사용하여, 류신의 메틸에스테르염산염, 발린의 메틸에스테르염산염, 이소류신의 메틸에스테르염산염, 프롤린의 메틸에스테르염산염, 페닐알라닌의 메틸에스테르염산염, 아르기닌의 메틸에스테르염산염 및 히스티딘의 메틸에스테르염산염에 의해 수식하고, 탈보호하지 않고 겔화시켜, 비수용성의 생체 적합성 필름을 조제한 사례도 있지만, 수식률은 불명확하다 (특허문헌 8). 또한, 본원 우선일 이후에 공개된 특허문헌 15 에는, 히알루론산의 카르복시를, 특정한 아미노-카르복실산 또는 그 아미드로 수식함으로써 얻어진 히알루론산 유도체가 생분해성과 혈중 체류성의 양방에 특성을 갖는 것, 또, 엔도좀으로부터 세포질 내로의 약물의 방출에 유효하다는 것이 보고되어 있다.
그 외, 다당 유래의 약물 담체로서, 콜레스테릴기 등을 도입한 풀루란 유도체가 수용액 중에 있어서 나노 사이즈의 미립자를 형성하고, 소수성 저분자, 펩티드, 단백질 등과 복합화하는 호스트 분자로서 기능하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 4). 단백질 삽입 후의 당해 풀루란 유도체에 대한 열 역학적 평가에 의해, 삽입된 단백질이 풀루란의 하이드록시기와의 수소 결합에 의해 안정화되는 것이 나타나 있다 (비특허문헌 5).
또, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) (특허문헌 10) 및 리놀레산을 도입한 키토산 (비특허문헌 6) 을 단백질과의 복합체 형성의 재료로서 이용하는 보고도 있다. 또한, 특허문헌 11 에는, 가교성기를 갖는 히알루론산 유도체, 및 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체를 포함하는 조성물로서, 가교성기를 갖는 히알루론산 유도체가, 친수성 다당류 유도체의 존재하, 히알루론산 또는 가교 형성이 가능한 기를 갖는 그 유도체의 가교 형성 반응에 의해 조제되는 조성물이 보고되어 있고, 특허문헌 14 에는, 소수성기로서 콜레스테릴기를 갖는 기를 히알루론산에 도입한 히알루론산 유도체가 수중에서 회합에 의해 미립자를 형성하고, 약물과 복합체를 형성하는 것이 보고되어 있다.
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히알루론산 유도체의 혈중 체류성은 글루크론산 부분의 카르복시의 수식률과 상관되어 있기는 하지만, 어느 임계값을 경계로 급격하게 변화하는 것도 밝혀져 있어, 히알루론산 유도체의 혈중 체류성을, 카르복시의 수식률을 제어하는 것에 의해서만 바람직한 범위 내로 컨트롤하는 것은 곤란하다. 따라서, 보다 간편하고 또한 확실한 방법으로 혈중 체류성을 컨트롤하는 방법이 요망되고 있다. 또, 히알루론산의 리셉터에 의한 인식이 저하되면, 생체 내에서의 대사를 받기 어려워져, 히알루론산이 원래 갖는 특징인 생분해성이 저하되는 것도 예상된다. 따라서, 생분해성 (안전성) 및 혈중 체류성의 양방의 특징을 겸비한 신규 기재가 요구되고 있다.
발명이 해결하고자 하는 과제는 생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특징을 겸비한 히알루론산 유도체를 제공하는 것이다. 또 발명이 해결하고자 하는 추가적인 과제는 그 히알루론산 유도체와 약물의 복합체 및 그 히알루론산 유도체를 포함하는 의약품 조성물, 특히, 그 히알루론산 유도체와 약물의 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명자는 이러한 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 진행한 바, 히알루론산 또는 그 염의 글루크론산 부분의 카르복시를, 특정한 아미노산 또는 아미노산아미드와 반응시켜 아미드로 변환함으로써 얻어진 중간체의, 글루크론산 부분의 카르복시 및/또는 아미노산 부분의 카르복시에, 추가로 스테릴기를 도입함으로써 얻어진 히알루론산 유도체가 생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 것, 및 그 히알루론산 유도체와 약물의 복합체가 의약 조성물로서 양호한 특성을 갖는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 또, 예의 연구를 진행시킨 과정에서, 티로신아미드, 트립토판아미드와 같은 일부의 아미노산아미드 (후술하는 Ra 가 아릴 또는 헤테로아릴로 치환되어 있는 C1-6 알킬이고, 그 아릴은 1 이상의 하이드록시로 치환되어 있는 경우) 를 사용하면, 스테릴기를 도입하지 않은 경우에 비해, 스테릴기를 도입한 경우의 쪽이, 스테릴기의 갖는 소수성에도 상관없이, 순수 중에서 보다 분산하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 또한, 페닐알라닌아미드 (후술하는 Ra 가 아릴로 치환되어 있는 C1-6 알킬이고, 그 아릴은 무치환인 경우) 를 사용한 다음에 추가로 6 % 이하의 도입률로 스테릴기를 도입한 경우, 페닐알라닌아미드를 사용하지 않고 6 % 이하의 도입률로 스테릴기를 도입한 경우와 비교하여, 순수 중에서는 어느 경우도 분산하지만, 생리 식염수 중에서는, 후자의 경우에는 분산하는 데에 반해, 전자의 경우에는 응집하여 침전을 형성하여, 전자의 경우가, 예를 들어 지속성의 피하 투여용 주사 제제의 기재로서 매우 우수한 것도 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 생분해성과 혈중 체류성을 겸비하는 히알루론산 유도체, 및, 스테릴기를 도입함으로써 수중에서 보다 분산하는 히알루론산 유도체, 그리고, 이들 히알루론산 유도체 및 약리 활성을 갖는 화합물을 함유하는 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 히알루론산 유도체의 제조 방법, 그리고 약물 및 이들 히알루론산 유도체를 포함하는 의약품 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 이하의 (1) ∼ (10) 의 히알루론산 유도체가 제공된다.
(1) 식 (I)
[화학식 1]
[식 중, R1, R2, R3, 및 R4 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5 는 수소 원자, 포르밀, 또는 C1-6 알킬카르보닐이고;
X1 은 하이드록시, C1-6 알콕시, -O-Q+, -NR7R8, 또는 -NR9-Z1-Z2 이고;
Q+ 는 카운터 카티온을 나타내고;
R6, R7, R8, 및 R9 는, 독립적으로, 수소 원자, 및 C1-6 알킬에서 선택되고;
Ra 는 수소 원자, 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 그 알킬은, 독립적으로, 하이드록시, 카르복시, 카르바모일, C1-6 알킬티오, 아릴, 및 헤테로아릴에서 선택되는 1 이상의 기로 치환되어 있어도 되고, 여기서 그 아릴은 1 이상의 하이드록시로 치환되어 있어도 되고;
Z1 은 C2-30 알킬렌, 또는 -(CH2CH2O)m-CH2CH2- 이고, 여기서 그 알킬렌은, 독립적으로, -O-, -NRg- 및 -S-S- 에서 선택되는 1 ∼ 5 의 기가 삽입되어 있어도 되고, m 은 1 ∼ 100 에서 선택되는 정수이고;
Z2 는 이하의 식:
에 의해 나타내어지는 기에서 선택되고;
Rb 및 Rc 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-20 알킬, 아미노 C2-20 알킬 및 하이드록시 C2-20 알킬에서 선택되고, 여기서 당해 기의 알킬 부분은, 독립적으로, -O- 및 -NRf- 에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Rf 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-12 알킬, 아미노 C2-12 알킬, 및 하이드록시 C2-12 알킬에서 선택되고, 당해 기의 알킬 부분은 -O- 및 -NH- 에서 선택되는 1 ∼ 2 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Rg 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-20 알킬, 아미노 C2-20 알킬 또는 하이드록시 C2-20 알킬에서 선택되고, 당해 기의 알킬 부분은, 독립적으로, -O- 및 -NH- 에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Z3 은 스테릴기이고;
Za 는 C1-5 알킬렌이고;
Zb 는 C2-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이다]
로 나타내는 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체로서, X1 이 -NR9-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위가 포함되지 않는 경우, 또한, 식 (II):
[화학식 2]
[식 중, R1a, R2a, R3a 및 R4a 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5a 는 수소 원자, 포르밀, 또는 C1-6 알킬카르보닐이고;
X2 는 -NR9-Z1-Z2 이고, 여기서, R9, Z1, 및 Z2 는 이미 정의한 바와 같다];
로 나타내는 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체.
(2) 식 (IIb)
[화학식 3]
[식 중, R1b, R2b, R3b, 및 R4b 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5b 는 수소 원자, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
Xb 는 하이드록시, 및 -O-Q+ 에서 선택되고, 여기서 Q+ 는 카운터 카티온을 나타낸다]
로 나타내는 반복 단위를 추가로 포함하는, 상기 (1) 에 기재된 히알루론산 유도체.
(3) 식 (I) 에 있어서 X1 이 -NR9-Z1-Z2 인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 히알루론산 유도체.
(4) 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, 식 (I) 로 나타내는 이당 단위의 비율이 70 ∼ 100 % 인, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
(5) 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, 기 -NR9-Z1-Z2 를 포함하는 이당 단위의 비율이 3 ∼ 50 % 인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
(6) X1 이 -NR9-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위가 포함되지 않는, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 히알루론산 유도체.
(7) 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율 및 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율의 합이 70 ∼ 100 % 인, (1), (2), 및 (6) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
(8) R1b, R2b, R3b, 및 R4b 전부를 수소 원자로 하고, R5b 를 아세틸로 하고, 또한, Xb 를 -O-Na+ 로 했을 경우의 중량 평균 분자량이 3 킬로달톤 ∼ 1500 킬로달톤이 되는, 상기 (2) 에 정의한 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산을 사용하여 제조되는, 상기 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
(9) Z1 이 C2-10 알킬렌이고, Z2 가 -NH-COO-Z3 이고, Z3 이 콜레스테릴기인, (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
(10) 식 (IIb) 로 나타내는 반복 단위 및 식 (Ia)
[화학식 4]
[식 중, Xa 는 하이드록시, -O-Q+, C1-6 알콕시, 및 -NR7R8 에서 선택되고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, 및 Ra 는 상기 (1) 에 정의한 바와 같다]
로 나타내는 반복 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체를 이하의 식
HNR9-Z1-Z2
[식 중, R9, Z1, 및 Z2 는 상기 (1) 에 정의한 바와 같다]
으로 나타내는 화합물과 반응시킴으로써 얻어지는, 상기 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 이하의 (11) 및 (12) 의 의약 조성물이 제공된다.
(11) 상기 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체와 약물을 포함하는 의약 조성물.
(12) 약물이 히알루론산 유도체와 복합체를 형성함으로써 담지되는, 상기 (11) 에 기재된 의약 조성물.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체에 약물이 담지된 히알루론산 유도체-약물 복합체가 제공된다. 바람직하게는 히알루론산 유도체가 수중에서 회합에 의해 미립자를 형성하여 약물을 담지하는 히알루론산 유도체-약물 복합체가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체를 포함하는 생분해성의 약물 담체가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 히알루론산 유도체와 함께 치료 유효량의 약물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 약물의 투여 방법이 제공된다.
또한, X1 이 하이드록시, -O-Q+, 또는 -NR9-Z1-Z2 일 때, Ra 중의 아릴 (1 이상의 하이드록시로 치환되어 있어도 된다) 은 무치환인 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 사용함으로써, 약물, 특히 저분자 화합물이나 약효를 갖는 단백질이나 펩티드를 그 생물 활성을 유지한 채로 다량으로 봉입한 서방성 제제를 제공하는 것이 가능해진다. 또, 히알루론산 유도체는 안전성의 면에 있어서도 우수하고, 약물의 혈중 체류성과 생분해성의 쌍방에 있어서, 의약 제제의 담체로서, 또, 지속성의 피하 투여용 주사 제제의 기재로서 특히 우수한 특성을 갖고 있다. 또, 본 발명의 히알루론산 유도체의 카르복시의 수식의 정도, 즉, 도입하는 기 -NR9-Z1-Z2 및/또는 아미노산 (아미노산아미드를 포함한다) 의 비율을 조절함으로써, 당해 유도체를 이용하여 제조하는 제제의 체내 동태를 제어하는 것도 가능하다.
[도면의 간단한 설명]
도 1-1 은 실시예 1-1 에서 조제한 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트 (Chol-C6) 의 염산염의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-2 는 실시예 1-3 에서 조제한 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 히알루론산의 TBA 염 (HA-TBA) 의 1H-NMR 스펙트럼 (용매:D2O) 의 일례이다.
도 1-3 은 실시예 1-4 에서 조제한 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-Ala 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-4 는 실시예 1-4 에서 조제한 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-Ala-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:7 %) 이다.
도 1-5 는 실시예 1-5 에서 조제한 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-ThrNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-6 은 실시예 1-6 에서 조제한 HA-Ser-OEt 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-7 은 실시예 1-6 에서 조제한 HA-Ser 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-8 은 실시예 1-6 에서 조제한 HA-Ser-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-9 는 실시예 1-7 에서 조제한 HA-Gly-OEt 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-10 은 실시예 1-7 에서 조제한 HA-Gly 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-11 은 실시예 1-7 에서 조제한 HA-Gly-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-12 는 실시예 1-8 에서 조제한 HA-Thr 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-13 은 실시예 1-8 에서 조제한 HA-Thr-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-14 는 실시예 1-9 에서 조제한 HA-Asn 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-15 는 실시예 1-9 에서 조제한 HA-Asn-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:7 %) 이다.
도 1-16 은 실시예 1-10 에서 조제한 HA-Asp 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-17 은 실시예 1-10 에서 조제한 HA-Asp-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-18 은 실시예 1-11 에서 조제한 HA-Ile 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-19 는 실시예 1-11 에서 조제한 HA-Ile-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-20 은 실시예 1-12 에서 조제한 HA-Leu 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-21 은 실시예 1-12 에서 조제한 HA-Leu-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-22 는 실시예 1-13 에서 조제한 HA-Val 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-23 은 실시예 1-13 에서 조제한 HA-Val-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-24 는 실시예 1-14 에서 조제한 HA-Phe 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-25 는 실시예 1-14 에서 조제한 HA-Phe-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-26 은 실시예 1-15 에서 조제한 HA-SerNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼 (용매:0.02 N DCl DMSO-d6/D2O 혼액) 의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-27 은 실시예 1-15 에서 조제한 HA-SerNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼 (용매:D2O) 의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-28 은 실시예 1-16 에서 조제한 HA-GlyNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼 (용매:0.02 N DCl DMSO-d6/D2O 혼액) 의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-29 는 실시예 1-16 에서 조제한 HA-GlyNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼 (용매:D2O) 의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-30 은 실시예 1-17 에서 조제한 HA-LeuNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-31 은 실시예 1-18 에서 조제한 HA-ValNH2/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-32 는 실시예 1-19 에서 조제한 HA-Ala/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-33 은 실시예 1-20 에서 조제한 HA-Ser-OEt/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-34 는 실시예 1-20 에서 조제한 HA-Ser/Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-35 는 비교예 1-1 에서 조제한 HA-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 1-36 은 비교예 1-2 에서 조제한 HA-EDOBEA 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-37 은 비교예 1-2 에서 조제한 HA-EDOBEA-Ac/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-38 은 비교예 1-3 에서 조제한 HA-Tyr 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 1-39 는 비교예 1-3 에서 조제한 HA-Tyr-Chol/FL 의 1H-NMR 스펙트럼의 일례 (콜레스테릴기의 도입률:6 %) 이다.
도 2-1-1 은 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-1) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-2 는 99k HA-Ala-Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-2) 과 99k HA-Chol-24%/FL (표 9:비교 샘플 2-2) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-3 은 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (표 9:샘플 2-3) 과 99k HA-Chol-25%/FL (표 9:비교 샘플 2-3) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-4 는 50k HA-Ala-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-4) 과 50k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-4) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-5 는 50k HA-Ala-Chol-22%/FL (표 9:샘플 2-5) 과 50k HA-Chol-20%/FL (표 9:비교 샘플 2-5) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-6 은 50k HA-Ala-Chol-26%/FL (표 9:샘플 2-6) 과 50k HA-Chol-27%/FL (표 9:비교 샘플 2-6) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-7 은 10k HA-Ala-Chol-16%/FL (표 9:샘플 2-7) 과 10k HA-Chol-15%/FL (표 9:비교 샘플 2-7) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-8 은 99k HA-ThrNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-8) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-9 는 99k HA-ThrNH2/Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-9) 과 99k HA-Chol-24%/FL (표 9:비교 샘플 2-2) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-10 은 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (표 9:샘플 2-10) 과 99k HA-Chol-25%/FL (표 9:비교 샘플 2-3) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-11 은 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-11) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-12 는 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-12) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-13 은 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-13) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-14 는 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-14) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-15 는 99k HA-Asp-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-15) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-16 은 99k HA-Ile-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-16) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-17 은 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-17) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-18 은 99k HA-Val-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-18) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-19 는 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-19) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-20 은 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-20) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-21 은 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-21) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-22 는 99k HA-LeuNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-22) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-23 은 99k HA-GlyNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-23) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-24 는 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-24) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-25 는 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-25) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-1-26 은 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-8) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 2-2).
도 2-2-1 은 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-1) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-2 는 99k HA-Ala-Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-2) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-3 은 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (표 9:샘플 2-3) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-4 는 50k HA-Ala-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-4) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-5 는 50k HA-Ala-Chol-22%/FL (표 9:샘플 2-5) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-6 은 50k HA-Ala-Chol-26%/FL (표 9:샘플 2-6) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-7 은 10k HA-Ala-Chol-16%/FL (표 9:샘플 2-7) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-8 은 99k HA-ThrNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-8) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-9 는 99k HA-ThrNH2/Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-9) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-10 은 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (표 9:샘플 2-10) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-11 은 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-11) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-12 는 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-12) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-13 은 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-13) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-14 는 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-14) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-15 는 99k HA-Asp-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-15) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-16 은 99k HA-Ile-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-16) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-17 은 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-17) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-18 은 99k HA-Val-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-18) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-19 는 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-19) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-20 은 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-20) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-21 은 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-21) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-22 는 99k HA-LeuNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-22) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-23 은 99k HA-GlyNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-23) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-24 는 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-24) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-25 는 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-25) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-26 은 99k HA-EDOBEA-Ac/FL (비교예 1-2) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플이 조금도 대사를 받지 않은 것이 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-2-27 은 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-8) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 2-3).
도 2-3-1 은 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-1) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-2 는 99k HA-Ala-Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-2) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-3 은 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (표 9:샘플 2-3) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-4 는 50k HA-Ala-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-4) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-5 는 50k HA-Ala-Chol-22%/FL (표 9:샘플 2-5) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-6 은 50k HA-Ala-Chol-26%/FL (표 9:샘플 2-6) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-7 은 10k HA-Ala-Chol-16%/FL (표 9:샘플 2-7) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-8 은 99k HA-ThrNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-8) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-9 는 99k HA-ThrNH2/Chol-24%/FL (표 9:샘플 2-9) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-10 은 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (표 9:샘플 2-10) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-11 은 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-11) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-12 는 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-12) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-13 은 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-13) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-14 는 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (표 9:샘플 2-14) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-15 는 99k HA-Asp-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-15) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-16 은 99k HA-Ile-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-16) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-17 은 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-17) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-18 은 99k HA-Val-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-18) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-19 는 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-19) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-20 은 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-20) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-21 은 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-21) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-22 는 99k HA-LeuNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-22) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-23 은 99k HA-GlyNH2/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-23) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-24 는 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-24) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-25 는 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (표 9:샘플 2-25) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-26 은 99k HA-EDOBEA-Ac/FL (비교예 1-2) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 2-3-27 은 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-8) 을 투여한 마우스뇨 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다 (실시예 2-4).
도 3-1 은 실시예 3-1 에서 조제한 HA-Gln 의 NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 3-2 는 실시예 3-1 에서 조제한 HA-Gln-Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-3 은 실시예 3-2 에서 조제한 HA-Met 의 NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 3-4 는 실시예 3-2 에서 조제한 HA-Met-Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-5 는 실시예 3-3 에서 조제한 HA-AlaNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-6 은 실시예 3-4 에서 조제한 HA-AsnNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-7 은 실시예 3-4 에서 조제한 HA-AsnNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-8 은 실시예 3-5 에서 조제한 HA-IleNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-9 는 실시예 3-6 에서 조제한 HA-GlnNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-10 은 실시예 3-7 에서 조제한 HA-MetNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-11 은 비교예 3-1 에서 조제한 HA-Glu 의 NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 3-12 는 비교예 3-1 에서 조제한 HA-Glu-Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 3-13 은 비교예 3-2 에서 조제한 HA-Trp 의 NMR 스펙트럼의 일례이다.
도 3-14 는 비교예 3-2 에서 조제한 HA-Trp-Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 4-1-1 은 99k HA-Gln-Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-1) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-2 는 99k HA-Met-Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-2) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-3 은 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-3) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-4 는 99k HA-AsnNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-4) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-5 는 99k HA-IleNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-5) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-6 은 99k HA-GlnNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-6) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-7 은 99k HA-MetNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-7) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-8 은 99k HA-Glu-Chol-6%/FL (표 15:비교 샘플 4-1) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-9 는 99k HA-Trp-Chol-6%/FL (표 15:비교 샘플 4-2) 과 99k HA-Chol-6%/FL (표 9:비교 샘플 2-1) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-1-10 은 10k HA-Tyr-Chol-7%/FL (표 15:비교 샘플 4-3) 과 10k HA-Chol-15%/FL (표 9:비교 샘플 2-7) 의 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다 (실시예 4-2).
도 4-2-1 은 99k HA-Gln-Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-1) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-2 는 99k HA-Met-Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-2) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-3 은 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-3) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-4 는 99k HA-AsnNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-4) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-5 는 99k HA-IleNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-5) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-6 은 99k HA-GlnNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-6) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-7 은 99k HA-MetNH2/Chol-6%/FL (표 15:샘플 4-7) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-8 은 99k HA-Glu-Chol-6%/FL (표 15:비교 샘플 4-1) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-9 는 99k HA-Trp-Chol-6%/FL (표 15:비교 샘플 4-2) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 4-2-10 은 10k HA-Tyr-Chol-7%/FL (표 15:비교 샘플 4-3) 과 그 샘플을 투여한 마우스 간장 샘플의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과이며, 투여 샘플의 간장에 있어서의 대사가 확인되고 있다 (실시예 4-3).
도 5-1 은 실시예 5-1 에서 조제한 HA-TyrNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 5-2 는 실시예 5-2 에서 조제한 HA-TrpNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 5-3 은 실시예 5-3 에서 조제한 HA-PheNH2/Chol/FL 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 6-1-1 은 실시예 6-1 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 파클리탁셀의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 파클리탁셀의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 파클리탁셀 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-1-2 는 실시예 6-1 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 파클리탁셀의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 파클리탁셀의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 파클리탁셀 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-1-3 은 실시예 6-1 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 파클리탁셀의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 파클리탁셀의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 파클리탁셀 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-1-4 는 실시예 6-1 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 파클리탁셀의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 파클리탁셀의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 파클리탁셀 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-2-1 은 실시예 6-2 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 사이클로스포린의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 사이클로스포린의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 사이클로스포린 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-2-2 는 실시예 6-2 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 사이클로스포린의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 사이클로스포린의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 사이클로스포린 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-2-3 은 실시예 6-2 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 사이클로스포린의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 사이클로스포린의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 사이클로스포린 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 6-2-4 는 실시예 6-2 에 있어서의, 본 발명의 히알루론산 유도체에 대한, 난용성 약물인 사이클로스포린의 봉입 (본 발명의 히알루론산 유도체와 사이클로스포린의 복합화) 의 결과를 나타내는 그래프이며, 세로축은, 본 발명의 히알루론산 유도체를 공존시킴으로써 향상되는, 상청액 중의 사이클로스포린 농도 (용해도) 를 나타낸다. 세로축의 값이 클수록 봉입 효과가 높은 것을 가리킨다.
도 7-1 은 실시예 7-1 에 있어서의, HA-Ala-Chol-41 % 로부터의 파클리탁셀의 방출 결과를 나타내는 그래프이며, 가로축은 시간 (Hour), 세로축은 방출되지 않고 HA-Ala-Chol-41 % 중에 봉입된 상태 (HA-Ala-Chol-41 % 와 복합화한 상태) 의 파클리탁셀의 양을 각각 나타낸다.
도 7-2 는 실시예 7-2 에 있어서의, HA-Ala-Chol-41 % 로부터의 사이클로스포린의 방출 결과를 나타내는 그래프이며, 가로축은 시간 (Hour), 세로축은 방출되지 않고 HA-Ala-Chol-41 % 중에 봉입된 상태 (HA-Ala-Chol-41 % 와 복합화한 상태) 의 사이클로스포린의 양을 각각 나타낸다.
도 8-1 은 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-C2-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 8-2 는 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-C2-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:7 %).
도 8-3 은 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-C12-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:7 %).
도 8-4 는 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-C12-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:7 %).
도 8-5 는 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-EO2-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:5 %).
도 8-6 은 실시예 8 에서 조제한 HA-Ala-EO2-Chol 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜레스테릴기의 도입률:6 %).
도 9 는 실시예 9-2 에서 조제한 HA-Ala-CA 의 NMR 스펙트럼의 일례이다 (콜라노일기의 도입률:13 %).
본 발명의 히알루론산 유도체는 식 (I) 로 나타내는 1 이상의 이당 단위 (반복 단위이기도 하다) 를 포함하는 히알루론산 유도체이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 히알루론산 유도체는 (a) 상기 식 (I), (b) 상기 식 (I) 및 (II), (c) 상기 식 (I) 및 식 (IIb), 또는 (d) 상기 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (IIb) 의 반복 단위로 실질적으로 구성된다. 당해 히알루론산 유도체는, 당해 유도체에 포함되는 D-글루크론산과 N-아세틸글루코사민으로 이루어지는 이당의 반복 단위 중, 예를 들어 80 % 이상이, 바람직하게는 90 % 이상이, 보다 바람직하게는 95 % 이상이 식 (I), (II) 또는 식 (IIb) 의 반복 단위이다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 히알루론산 유도체는 (a) 상기 식 (I), (b) 상기 식 (I) 및 식 (II), (c) 상기 식 (I) 및 식 (IIb), 또는 (d) 상기 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (IIb) 로 나타내는 반복 단위만으로 구성된다.
본 발명의 히알루론산 유도체에 존재하는 이당의 반복 단위에 대한 특정한 이당 단위의 비율은 이당 단위를 반복 단위로 하는 다당류인 본 발명의 히알루론산 유도체의 일정량에 포함되는 모든 이당 단위에 대한 특정한 이당 단위의 비율을 의미한다.
본 발명의 히알루론산 유도체에 포함되는 이당 단위를 나타내는 식 (I) 에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4 는 전부 수소 원자인 것이 바람직하다. R5 는 수소 원자 또는 C1-6 알킬카르보닐인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 아세틸인 것이 더욱 바람직하며, 아세틸인 것이 더욱 바람직하다. 또, 본 발명의 히알루론산 유도체에 포함되는 이당 단위를 나타내는 식 (II) 및 (IIb) 에 있어서, R1a, R2a, R3a 및 R4a, 그리고 R1b, R2b, R3b 및 R4b 는 전부 수소 원자인 것이 바람직하다. R5a 및 R5b 는 수소 원자 또는 C1-6 알킬카르보닐인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 아세틸인 것이 더욱 바람직하며, 모두 아세틸인 것이 더욱 바람직하다.
식 (I) 에 있어서의 Ra 의 구체예로는, 수소 원자, 메틸, 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸, 카르바모일메틸, 카르복시메틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 이소프로필, 2-카르복시에틸, 2-메틸티오에틸, 2-카르바모일에틸, 페닐메틸, (4-하이드록시페닐)메틸, 및 인돌-3-일메틸 등을 들 수 있다.
기 -CHRa- 가 부제 중심이 되는 경우에는, 각각의 광학 활성체 및 그들의 혼합물도 포함되지만, H2N-CHRa-COOH (아미노산) 로서 기재했을 때, L 형 (천연형) 이 되는 것이 바람직하다.
식 (I) 에 있어서, R6, R7, R8, 및 R9 는, 예를 들어, 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸이고, 바람직하게는 전부 수소 원자이다.
식 (I) 에 있어서의 기 -CHRa-CO-X1 의 양태로서, 예를 들어, 기 -CHRa-COOH 를 들 수 있다. 그 기의 구체예로서 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 5]
여기서, 「*」 는 -NR6- 과의 결합 위치를 나타낸다 (이하 동일).
기 -CHRa-COOH 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 6]
기 -CHRa-COOH 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 7]
기 -CHRa-COOH 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 8]
기 -CHRa-COOH 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 9]
기 -CHRa-COOH 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 10]
상기 서술한 기 -CHRa-COOH 는, 모두, 그 일부 또는 전부가 기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 로 변환되어 있어도 된다. 기 -Z1-Z2 의 예는 후술하는 바와 같다.
식 (I) 에 있어서의 기 -CHRa-CO-X1 의 다른 양태로서, 예를 들어, 기 -CHRa-CONH2 를 들 수 있다. 그 기의 구체예로서 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 11]
기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 12]
기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 13]
기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 14]
기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 15]
이들 기는, 생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 관점에서, 바람직한 기이기도 하다.
생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 관점에서는, 기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기도 들 수 있다.
[화학식 16]
생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 관점에서, 기 -CHRa-CONH2 의 더욱 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 17]
순수 중에서의 보다 적합한 분산성의 관점에서, 기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 18]
이들 2 개의 기는 지속성의 피하 투여용 주사 제제의 기재로서의 관점에서도 바람직한 예이다.
지속성의 피하 투여용 주사 제제의 기재로서의 관점에서, 기 -CHRa-CONH2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 19]
R7 로는, 수소 원자 및 메틸이 더욱 바람직하고, 수소 원자가 더욱 바람직하다.
식 (I), (II) 및 (IIb) 에 있어서 정의되는 카르복시는 식 -COO-Q+ 로 나타내는 염을 형성하고 있어도 된다. 여기서, Q+ 는 카르복시와 수중에서 염을 형성하는 카운터 카티온이면 특별히 한정되지 않고, 2 가 이상의 경우에는 가수에 따라 복수의 카르복시와 염을 형성한다. 카운터 카티온의 예로는, 리튬 이온, 나트륨 이온, 루비듐 이온, 세슘 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 등의 금속 이온;식:N+RjRkRlRm (식 중, Rj, Rk, Rl 및 Rm 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 및 C1-6 알킬에서 선택된다) 으로 나타내는 암모늄 이온 등을 들 수 있고, 바람직하게는 나트륨 이온, 칼륨 이온, 테트라알킬암모늄 이온 (예를 들어, 테트라n-부틸암모늄 이온 등) 을 들 수 있다. Rj, Rk, Rl 및 Rm 은 C1-6 알킬에서 선택되는 동일한 기인 것이 바람직하고, n-부틸인 것이 바람직하다.
식 (I) 에 있어서의 기 -CHRa-CO-X1 의 다른 양태로서, 예를 들어, 기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 를 들 수 있다. 그 기의 구체예로서 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 20]
그 기의 다른 구체예로서 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 21]
기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 22]
기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 23]
기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 24]
생분해성과 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 관점에서, 기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 의 바람직한 예로는 이하의 기를 들 수 있다.
[화학식 25]
기 -Z1-Z2 의 예로는, 기 -(C2- 10 알킬렌)-NH-COO-Z3 을 들 수 있다. 또, 기 -(C2- 12 알킬렌)-NH-COO-Z3 도 들 수 있다. 여기서 C2- 12 알킬렌의 예로서, 바람직하게는 -(CH2)2-, -(CH2)6-, -(CH2)8-, -(CH2)10- 및 -(CH2)12- 를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 -(CH2)2- 및 -(CH2)6- 를 들 수 있다. 또한, 기 -Z1-Z2 의 예로는, 기 -(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-Z3 을 들 수 있다. 여기서 m 은 1 ∼ 20 이 바람직하고, 1 ∼ 10 이 더욱 바람직하며, 1 ∼ 3 이 더욱 바람직하다. 바람직한 m 의 구체예로서, 2 를 들 수 있다. 기 -Z1-Z2 의 예로서, 바람직하게는 기 -(헥산-1,6-디일)-NH-COO-Z3, 기 -(에탄-1,2-디일)-NH-COO-Z3 및 기 -(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-Z3 을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 기 -(헥산-1,6-디일)-NH-COO-콜레스테릴, 기 -(에탄-1,2-디일)-NH-COO-콜레스테릴 및 기 -(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-콜라노일을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기 -(헥산-1,6-디일)-NH-COO-콜레스테릴을 들 수 있다. Z1, Z2, 기 -Z1-Z2 의 예로는, 국제 공개 제2010/053140호의, Y, X1, 기 -Y-X1 에 상당하는 것을 각각 들 수도 있다. 기 -CO-NRc-Z3 및 기 -O-CO-NRc-Z3 의 예로는, Rc 가 수소 원자인 기를 각각 들 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체에 있어서, 식 (II) 의 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체도 바람직하다. 더욱 바람직한 양태에 있어서, 식 (I) 의 X1 과 식 (II) 의 X2 는 동일하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, X1 이 -NR9-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위, 식 (II) 로 나타내는 반복 단위 및 식 (IIb) 로 나타내는 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체가 제공된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「스테릴기」 란, 스테로이드 골격을 갖는 기이면 특별히 제한되지 않는다. 여기서 스테로이드로는, 구체적으로는, 콜레스테롤, 데하이드로콜레스테롤, 코프로스테놀, 코프로스테롤, 콜레스타놀, 캄페스타놀, 에르고스타놀, 스티그마스타놀, 코프로스타놀, 스티그마스테롤, 시토스테롤, 라노스테롤, 에르고스테롤, 시미아레놀, 담즙산 (콜라닌산, 리토콜산, 히오데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 데옥시콜산, 아포콜산, 콜산, 데하이드로콜산, 글리코콜산, 타우로콜산), 테스토스테론, 에스트라디올, 프로게스트론, 코르티졸, 코르티존, 알도스테론, 코르티코스테론, 데옥시코르티스테론 등을 들 수 있다. 스테릴기로는, 콜레스테릴기, 스티그마스테릴기, 라노스테릴기, 에르고스테릴기, 콜라노일기, 콜로일기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 콜레스테릴기 (특히, 하기 식으로 나타내는 콜레스타-5-엔-3β-일기), 콜라노일기 (특히, 하기 식으로 나타내는 5β-콜란-24-오일기) 를 들 수 있다.
[화학식 26]
여기서, 「**」 는 이웃 기와의 결합 위치를 나타낸다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-20 알킬」 이란, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형, 분기사슬형의 알킬기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸 등의 「C1-4 알킬」 이 포함되고, 또한, n-펜틸, 3-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, n-헥실, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 3-에틸부틸, 및 2-에틸부틸 등이 포함된다. C1-20 알킬에는, 탄소수가 1 ∼ 12 인 「C1-12 알킬」, 탄소수가 1 ∼ 6 인 「C1-6 알킬」 도 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-6 알킬」 이란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬형, 분기사슬형의 알킬기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸 등의 「C1-4 알킬」 이 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-6 알콕시」 란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬형, 분기사슬형의 알킬옥시기를 의미하며, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, i-부톡시, t-부톡시 등의 「C1-4 알콕시」 가 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-6 알킬카르보닐」 이란, 알킬 부분이 이미 언급한 C1-6 알킬인 알킬카르보닐기를 의미하며, 예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, n-프로필카르보닐, i-프로필카르보닐, n-부틸카르보닐, s-부틸카르보닐, i-부틸카르보닐, t-부틸카르보닐 등의 「C1-4 알킬카르보닐」 이 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-6 알콕시」 란, 알킬 부분이 이미 언급한 C1-6 알킬인 알킬옥시기를 의미하며, 예를 들어, 메톡시 (H3C-O-), 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, i-부톡시, t-부톡시 등이 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1-6 알킬티오」 란, 알킬 부분이 이미 언급한 C1-6 알킬인 알킬티오기를 의미하며, 예를 들어, 메틸티오 (H3C-S-), 에틸티오, n-프로필티오, i-프로필티오, n-부틸티오, s-부틸티오, i-부틸티오, t-부틸티오 등이 포함되며, 바람직하게는 메틸티오를 들 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「아미노 C2-20 알킬」 은 치환기로서 아미노를 갖는 탄소수 2 ∼ 20 의 직사슬형, 분기사슬형의 알킬을 의미하며, 예를 들어, 아미노는 알킬의 말단의 탄소 원자 상에 위치하고 있어도 된다. 아미노 C2-20 알킬에는, 탄소수가 2 ∼ 12 인 「아미노 C2-12 알킬」 도 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「하이드록시 C2-20 알킬」 은 치환기로서 하이드록시를 갖는 탄소수 2 ∼ 20 의 직사슬형, 분기사슬형의 알킬기를 의미하며, 예를 들어, 하이드록시는 알킬의 말단의 탄소 원자 상에 위치하고 있어도 된다. 하이드록시 C2-20 알킬에는, 탄소수가 2 ∼ 12 인 「하이드록시 C2-12 알킬」 도 포함된다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C2- 30 알킬렌」 이란, 탄소수 2 ∼ 30 의 직사슬형 또는 분기사슬형의 2 가의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌 등을 포함하고, C2-20 알킬렌, C2- 8 알킬렌, 기 -(CH2)n- (여기서, n 은 2 ∼ 30, 바람직하게는 2 ∼ 20, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 15) 를 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C1- 5 알킬렌」 이란, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형 또는 분기사슬형의 2 가의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 에틸렌 (에탄-1,2-디일, 에탄-1,1-디일), 프로필렌 (프로판-1,1-디일, 프로판-1,2-디일, 프로판-1,3-디일), 부탄-1,4-디일, 및 펜탄-1,5-디일 등을 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C2- 10 알킬렌」 이란, 탄소수 2 ∼ 10 의 직사슬형 또는 분기사슬형의 2 가의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 에틸렌 (에탄-1,2-디일, 에탄-1,1-디일), 프로필렌 (프로판-1,1-디일, 프로판-1,2-디일, 프로판-1,3-디일), 부탄-1,4-디일, 펜탄-1,5-디일, 헥산-1,6-디일, 헵탄-1,7-디일, 옥탄-1,8-디일 등을 포함한다. 「C2- 10 알킬렌」 은 탄소수 2 ∼ 8 의 「C2- 8 알킬렌」 및 탄소수 2 ∼ 6 의 「C2 -6 알킬렌」 을 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C2- 8 알킬렌」 이란, 탄소수 2 ∼ 8 의 직사슬형 또는 분기사슬형의 2 가의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 에틸렌 (에탄-1,2-디일, 에탄-1,1-디일), 프로필렌 (프로판-1,1-디일, 프로판-1,2-디일, 프로판-1,3-디일), 부탄-1,4-디일, 펜탄-1,5-디일, 헥산-1,6-디일, 헵탄-1,7-디일, 옥탄-1,8-디일 등을 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 용어 「C2- 8 알케닐렌」 이란, 탄소수 2 ∼ 8 의 직사슬형 또는 분기사슬형의, 1 이상의 이중 결합을 포함하는, 2 가의 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, -CH=CH-, -C(CH3)=CH-, 2-부텐-1,4-디일, 헵타-2,4-디엔-1,6-디일 및 옥타-2,4,6-톨루엔-1,8-디일 등을 포함한다. 기하 이성이 존재하는 경우에는, 각각의 이성체 및 그들의 혼합물도 포함된다.
본 발명에 있어서 「아릴」 이란, 방향족 탄소 고리기, 예를 들어 탄소수가 6 ∼ 14 인 방향족 탄소 고리기를 의미하고, 아릴의 예로는 페닐, 나프틸 (1-나프틸 및 2-나프틸) 등을 들 수 있다. 1 이상의 하이드록시로 치환된 아릴의 예로는, 4-하이드록시페닐을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「헤테로아릴」 이란, 고리를 구성하는 원자 중에, 1 또는 복수 개의, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자에서 선택되는 헤테로 원자를 함유하는 방향족성의 고리의 기를 의미하고, 부분적으로 포화되어 있어도 된다. 고리는 단고리, 또는 벤젠 고리 또는 단고리 헤테로아릴 고리와 축합한 2 고리형 헤테로아릴이어도 된다. 고리를 구성하는 원자의 수는 예를 들어 4 ∼ 15 이며, 바람직하게는 5 ∼ 14, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 10 이다. 헤테로아릴의 예로는, 예를 들어, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피리다지닐, 피라지닐, 트리아지닐, 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤조티아디아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조옥사디아졸릴, 벤조이미다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 벤조디옥솔릴, 인돌리디닐, 이미다조피리딜 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 인돌-2-일을 들 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체는 약물 담체로서 사용할 수 있고, 당해 약물 담체는 생분해성이다. 여기서 생분해성이라는 것은, 래트 및/또는 인간에게 정맥내 투여 후, 15 일 후까지의 사이에, 간장 중에 있어서 검출되는 약물 담체가 저분자화를 일으키고 있는 것을 의미한다. 「저분자화를 일으키고 있는 것」 은, 간장 중에 존재하는 약물 담체의 크기를, 사이즈 배제 칼럼 크로마토그래피에 맡겨 측정함으로써 판정할 수 있다 (본원 명세서 실시예 2-3 을 참조). 이 때, 간장 유래의 약물 담체의 피크 탑이, 투여 전의 약물 담체의 피크 탑과 비교하여 저분자측으로 이행하고 있는 (즉, 칼럼 크로마토그램에 있어서의 유지 시간이 길어진다) 것이라면, 약물 담체가 생분해성이라고 판정된다. 또한, 생분해성의 약물 담체는, 소변, 대변 등의 경로로 체외로 배설되기 때문에, 소변 중에 있어서 저분자화를 일으키고 있는 것을 검출할 수 있는 케이스도 있지만, 소수성기를 갖는 본 발명의 히알루론산 유도체는 그 소수성에 의해 소변으로의 배설이 억제되기 쉽기 때문에, 번잡함이나 검출 횟수의 제한의 문제는 있기는 하지만, 히알루론산의 주된 대사 장기인 간장에 있어서의 저분자화를 검출하는 것이, 약물 담체의 생분해성을 직접적으로 판정하는 데에 있어서, 보다 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 명세서에 정의한 히알루론산 유도체로서, 당해 유도체에 존재하는 이당의 반복 단위에 대한 기 -NR9-Z1-Z2 (이하, 소수성기라고도 칭한다) 를 갖는 식 (I) 및/또는 식 (II) 의 반복 단위의 비율 (소수성기의 도입률) 이 3 ∼ 50 % 인, 상기 히알루론산 유도체가 제공된다.
여기서, 소수성기의 도입률은 이하의 식:
[수학식 1]
에 의해 산출된다. 여기서, 「당해 유도체에 존재하는 이당의 반복 단위」 에는, 식 (I) 및 식 (II) 의 반복 단위, 그리고 식 (IIb) 의 반복 단위가 포함된다. 당해 도입률은 반응 조건, 예를 들어 시약의 비율에 의해 제어할 수 있으며, 예를 들어, NMR 측정 등에 의해 결정할 수 있다.
소수성기의 도입률은 3 ∼ 50 % 이고, 바람직하게는 5 ∼ 40 % 이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 35 % 이고, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 25 % 이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 20 % 이며, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 10 % 이다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 후술하는 실시예 1-4 에 예시되는 바와 같이, 히알루론산 유도체는 식 (I) 에 있어서 X1 이 -NR9-Z1-Z2 이다. 본 발명의 히알루론산 유도체 중에 존재하는 이당의 반복 단위에 대한 식 (I) 의 이당 단위의 비율은, 생분해성 및 혈중 체류성의 양방의 특성을 갖는 관점에서, 예를 들어 70 % 이상, 바람직하게는 75 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상이다. 상한은 100 % 이하이면 된다. 당해 비율의 범위는, 예를 들어, 70 ∼ 100 %, 바람직하게는 75 ∼ 100 %, 더욱 바람직하게는 90 ∼ 100 % 이다. 또한, 히알루론산 유도체는 식 (II) 로 나타내는 반복 단위를 추가로 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 히알루론산 유도체는, 후술하는 실시예 1-5 에 예시되는 바와 같이, X1 이 -NR9-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위를 포함하지 않는다. 이 경우, 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율 및 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율의 합은 70 ∼ 100 %, 바람직하게는 80 ∼ 100 %, 보다 바람직하게는 90 ∼ 100 % 이다.
여기서, 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율은 바람직하게는 3 ∼ 50 %, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 40 %, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 35 %, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 25 %, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 20 %, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 10 % 이다. 또, 존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의 (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율은 바람직하게는 20 ∼ 97 %, 더욱 바람직하게는 30 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 35 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 45 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 60 ∼ 95 % 이다.
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율이 5 ∼ 10 % 일 때, (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율은 바람직하게는 60 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 70 ∼ 95 %, 더욱 바람직하게는 75 ∼ 95 % 이다.
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율이 20 ∼ 40 %, 바람직하게는 20 ∼ 35 % 일 때, (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율은 바람직하게는 30 ∼ 80 %, 더욱 바람직하게는 45 ∼ 80 %, 더욱 바람직하게는 60 ∼ 80 % 이다.
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율이 10 ∼ 20 % 일 때, 식 (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율은 바람직하게는 50 ∼ 90 %, 더욱 바람직하게는 60 ∼ 90 %, 더욱 바람직하게는 70 ∼ 90 % 이다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하기 위한 원료로는, 히알루론산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 히알루론산염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염을 들 수 있으며, 특히 바람직한 염은 의약품으로서 번용되고 있는 나트륨염이다. HA 또는 그 약학적으로 허용되는 염은 계관이나 돼지 피하 등의 생물 유래의 것을 추출하는 방법이나 생물 발효법 등의 각종 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있고, 혹은 시판되는 것을 구입하여 (예를 들어, 덴키 화학 공업 주식회사, 주식회사 시세이도, 생화학 공업 주식회사, R & D system 사 등으로부터) 입수하는 것도 가능하다.
원료로서 사용되는, 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산 (염을 포함한다) 의 중량 평균 분자량은 1 kDa ∼ 2,000 kDa 이 바람직하고, 3 kDa ∼ 1,500 kDa 이 더욱 바람직하며, 5 kDa ∼ 1000 kDa 이 더욱 바람직하다. 더욱 바람직하게는 10 kDa ∼ 500 kDa, 더욱 바람직하게는 10 kDa ∼ 200 kDa, 더욱 바람직하게는 45 kDa ∼ 200 kDa, 더욱 바람직하게는 50 kDa ∼ 99 kDa 이다. 입자직경이나 점도를 작게 하거나, 또는 용해성을 높이는 경우에는, 그 중량 평균 분자량은 1 kDa ∼ 100 kDa 이 바람직하고, 2 kDa ∼ 70 kDa 이 더욱 바람직하고, 3 kDa ∼ 50 kDa 이 더욱 바람직하며, 5 kDa ∼ 30 kDa 이 더욱 바람직하다. 점도를 크게 하거나, 또는 피하나 관절강 내에서의 체류성을 높이는 경우에는, 그 중량 평균 분자량은 45 kDa ∼ 2000 kDa 이 바람직하고, 50 kDa ∼ 2000 kDa 이 더욱 바람직하고, 100 kDa ∼ 1000 kDa 이 더욱 바람직하며, 200 kDa ∼ 1000 kDa 이 더욱 바람직하다. 지속성의 피하 투여용 주사 제제의 기재로서의 관점에서는, 그 중량 평균 분자량은 5 kDa ∼ 200 kDa 이 바람직하다. 중량 평균 분자량의 구체예로는, 예를 들어, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa, 99 kDa, 230 kDa 및 1058 kDa 을 들 수 있다. 「kDa」 는 「 킬로달톤」 의 약호이다.
또한, 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산 (염을 포함한다) 의 중량 평균 분자량이란, 본 발명의 히알루론산 유도체의 주사슬 구조를 유지한 채로, 식 (IIb) 에 있어서의, R1b, R2b, R3b, 및 R4b 전부를 수소 원자로 하고, R5b 를 아세틸로 하고, 또한, Xb 를 -O-Na+ 로서 환산했을 경우의 중량 평균 분자량을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 실제로 사용하는 원료에 있어서의 일부 또는 모든 이당 단위에 있어서 Xb 가 -O-(테트라n-부틸암모늄 이온) 이고, 그 중량 평균 분자량을 상기에 따라 환산하여 45 kDa ∼ 200 kDa 으로 산출되는 경우에는, 본 발명의 바람직한 일 양태에 포함되게 된다.
또한, 일반적으로, 히알루론산 (염을 포함한다) 은 단일품으로서 잘 얻어지지 않기 때문에, 그 분자량은 수평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로서 산출한다. 본 발명에 있어서는, 중량 평균 분자량으로서 산출하고 있다. 중량 평균 분자량의 측정 방법에 대해서는, 예를 들어, 나카하마 세이이치 외 저 「에센셜 고분자 과학」 (코단샤 발행, ISBN4-06-153310-X) 에 기재된, 광 산란법, 삼투압법, 점도법 등, 각종 공지된 방법을 이용할 수 있고, 본 명세서에 있어서 나타내는 점도 평균 분자량도 우베로데 점도계를 사용하는 등, 본 발명이 속하는 기술 분야에 있어서 통상적으로 이용되는 방법에 의해 측정할 수 있다. 따라서, 원료로서 사용되는 히알루론산 (염을 포함한다) 이나 본 발명의 히알루론산 유도체의 분자량도, 중량 평균 분자량으로서 산출되게 된다. 분자량을 명시하여 시판되고 있는 히알루론산 (염을 포함한다) 을 사용하는 경우에는, 그 명시된 수치를 분자량으로 할 수도 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체의 분자량은 특별히 한정은 되지 않지만, 국소 투여에 있어서의 확산 지연 유래의 서방 기능을 기대하는 경우에는 점도 및 분자량이 높은 히알루론산이 바람직하고, 최종 제형이 용액 제제인 경우, 스무스한 투여를 위해 점도 및 분자량이 낮은 히알루론산이 바람직하다.
식 (I) 로 나타내는 이당 단위를 포함하는 본 발명의 히알루론산 유도체는 글루크론산 부분의 카르복시를 아미드로 변환함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 원료 히알루론산 (염 등을 포함한다), 바람직하게는 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산을, 테트라알킬암모늄염 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염) 으로 이온 교환하고, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서 당해 히알루론산염과 식:HNR6-CHRa-COORz (식 중, Rz 는 카르복시를 보호하기 위한 에스테르 형성기이며, R6 및 Ra 는 본 명세서에 이미 정의된 바와 같다) 또는 식:HNR6-CHRa-CONR7R8 (식 중, R7 및 R8 은 본 명세서에 이미 정의된 바와 같다) 로 나타내는 화합물을 반응시키고, 보호기가 존재하는 경우에는 탈보호를 실시하는 방법을 들 수 있다 (공정 1). 여기서 에스테르 형성기는 특별히 한정되지 않고, 카르복시의 보호에 통상적으로 사용되는 기이면 특별히 한정되지 않는다. 에스테르 형성기의 예로는, C1-6 알킬, 벤질, C1-6 알콕시 C1-6 알킬, 및 벤질옥시 C1-6 알킬 등을 들 수 있다.
식 (I) 에 있어서의 기:-NR6-CHRa-COORz 및 -NR6-CHRa-CONR7R8 은 복수 존재하는 이당 단위의 각각에 있어서 동일해도 되고 상이해도 된다. 예를 들어, 상이한 종류의 식:HNR6-CHRa-COORz 및/또는 HNR6-CHRa-CONR7R8 로 나타내는 화합물을 사용하여 상기 반응을 실시해도 된다.
상기 반응에 있어서 사용할 수 있는 축합제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨 (DMT-MM), N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄4불화붕산염 (TBTU), 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄6불화인산염 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등을 들 수 있다.
특히, 한정은 되지 않지만, DMT-MM 은 물 및 유기 용매의 혼합 용매 중에서도 반응이 고효율로 진행되는 점에 있어서 바람직하다. 또, DMT-MM 을 축합제로서 사용함으로써, 다수의 하이드록시가 공존하는 계에 있어서, 에스테르 결합 형성을 억제하면서, 고선택적으로 아미노와 카르복시에 의한 아미드 결합 형성을 실시할 수 있다. 이 축합제의 사용에 의해, 예를 들어, 용매인 알코올이 히알루론산 부분의 카르복시와 반응하는 것이나, 히알루론산 부분에 동시에 존재하는 카르복시와 하이드록시가, 분자 내 혹은 분자간에 결합하여, 원하지 않는 가교를 형성해 버리는 것을 방지할 수 있다.
상기 반응에 있어서 사용하는 용매로는, 물, 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMAc), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (DMI), 술포란 (SF), N-메틸피롤리돈 (NMP), 디옥산 (예를 들어 1,4-디옥산), 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 디에틸에테르, 아세트산에틸, 및 이들의 혼합 용매를 들 수 있다. 출발 물질, 수식물 및 생성물의 용해성과, 축합제의 반응성의 관점에서는, DMSO 단독 혹은 물/DMSO 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 수식물인 아미노-카르복실산의 종류에 따라서는, 그것을 메탄올 용액이나 디옥산 용액으로서 반응에 사용해도 된다.
식:HNR6-CHRa-COORz 로 나타내는 화합물로서, 예를 들어, 알라닌에스테르, 세린에스테르, 글리신에스테르, 트레오닌에스테르, 아스파라긴에스테르, 아스파르트산디에스테르, 발린에스테르, 류신에스테르, 이소류신에스테르, 글루탐산디에스테르, 메티오닌에스테르, 글루타민에스테르, 페닐알라닌에스테르, 티로신에스테르, 및 트립토판에스테르 등을 들 수 있다. 여기서, 상기 에스테르는, 예를 들어, C1-6 알킬에스테르, 아릴에스테르, C1-6 알콕시 C1-6 알킬에스테르, 아릴 C1-6 알킬에스테르 등이고, 바람직하게는 메틸에스테르, 에틸에스테르, 벤질에스테르 등이다.
식:HNR6-CHRa-CONR7R8 로 나타내는 화합물로서, 예를 들어, 알라닌아미드, 세린아미드, 글리신아미드, 트레오닌아미드, 아스파라긴아미드, 아스파르트산디아미드, 발린아미드, 류신아미드, 이소류신아미드, 글루탐산디아미드, 메티오닌아미드, 글루타민아미드, 페닐알라닌아미드, 티로신아미드, 및 트립토판아미드 등을 들 수 있다.
소수성기는 글루크론산의 카르복시 또는 식 (I) 의 기 -NR6-CHRa-COOH 를 아미드로 변환하여 도입할 수 있다 (공정 2). 예를 들어, 원료 히알루론산 또는 그 유도체를 테트라알킬암모늄염 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염) 으로 이온 교환하고, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서 당해 히알루론산염과 식:HNR9-Z1-Z2 (식 중, R9, Z1, 및 Z2 는 본 명세서에서 이미 정의한 바와 같다) 로 나타내는 소수성기를 도입한 아민을 반응시키는 방법을 들 수 있다.
상기 반응에 있어서 사용할 수 있는 축합제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨 (DMT-MM), N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄4불화붕산염 (TBTU), 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄6불화인산염 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등을 들 수 있다.
소수성기 도입 반응에 있어서 사용하는 용매로는, 물, DMSO, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴, DMF, THF, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 디에틸에테르, 아세트산에틸, 및 이들의 혼합 용매를 들 수 있다.
혹은, 글루크론산의 카르복시 또는 식 (I) 의 기 -NR6-CHRa-COOH 의 카르복시를, 테트라알킬암모늄염 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염) 으로 이온 교환하고, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서 당해 히알루론산염과 스페이서 부분을 반응시키고 (이 때, 필요에 따라 보호 및 탈보호 반응을 실시해도 된다), 카르복시 (-COOH) 를 변환하고, 그 후에 적당한 시약과 반응시켜도 된다. 카르복시로부터 변환되는 기와, 반응 시약의 조합의 예를 이하에 나타낸다.
(식 중, R9, Z1, Rb, Rc 및 Z3 은 본 명세서에서 이미 정의한 바와 같고, Hal 은 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드에서 선택되는 할로겐 원자를 나타낸다).
반응 양식으로는, 탈할로겐화 수소 반응, 축합 반응, 탈수 반응, 마이클 부가 등의 구핵 부가 반응, 산화적인 디술파이드 형성 반응 등을 들 수 있고, 이들은 주지인 반응이며, 당업자가 적절히 선택하여, 바람직한 반응 조건을 알아내어 실시할 수 있다. 변환체 또는 반응물이 카르복시를 갖는 경우에는, N-하이드록시숙신산이미드 (이하, 「NHS」 라고도 칭한다) 에스테르로 하고, 반응시켜도 된다.
또, 글루크론산의 카르복시 또는 식 (I) 의 기 -NR6-CHRa-COOH 의 카르복시에, 2-아미노에틸2-피리딜디술파이드를 반응시켜, 말단에 탈리기로 수식된 메르캅토를 갖는 스페이서가 도입된 히알루론산 유도체를 조제하고, 이것에 티오콜레스테롤을 구핵 치환 반응시켜 디술파이드 결합을 형성하는 방법을 들 수도 있다.
또한, 글루크론산의 카르복시 또는 식 (I) 의 기 -NR6-CHRa-COOH 의 카르복시에 스페이서의 일부를 도입한 것과, 스테릴기에 스페이서의 일부를 도입한 것을 조제하고, 이들을 반응시키는 방법을 들 수도 있다. 구체예의 일부는 상기 서술하였지만, 추가로 Y 에 -S-S- 가 삽입되어 있는 경우에는, 글루크론산의 카르복시 또는 식 (I) 의 기 -NR6-CHRa-COOH 의 카르복시에, 말단에 메르캅토를 갖는 스페이서가 도입된 히알루론산 유도체와, 말단에 메르캅토를 갖는 스페이서가 도입된 스테릴기를 각각 조제하고, 이들을 산화적으로 반응시켜 디술파이드 결합을 형성시키는 방법을 들 수도 있다. 이 때, 일방의 메르캅토를 2-메르캅토피리딘과 반응시켜 디술파이드로 한 후에, 타방의 메르캅토와 치환시킬 수도 있다.
공정 1 과 공정 2 의 순번은 상관없다. 예를 들어, 원료 히알루론산 (염 등을 포함한다), 바람직하게는 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산을, 테트라알킬암모늄염 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염) 으로 이온 교환하고, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서 당해 히알루론산염과 식:HNR9-Z1-Z2 (식 중, R9, Z1, 및 Z2 는 본 명세서에서 이미 정의한 바와 같다) 로 나타내는 소수성기를 도입한 아민을 반응시키고, 이어서, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서, 당해 반응물과 식:HNR6-CHRa-COORz (식 중, Rz 는, 카르복시를 보호하기 위한 에스테르 형성기이며, R6 및 Ra 는 본 명세서에 이미 정의된 바와 같다) 또는 식:HNR6-CHRa-CONR7R8 (식 중, R7 및 R8 은 본 명세서에 이미 정의된 바와 같다) 로 나타내는 화합물을 반응시켜도 된다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 히알루론산 유도체는 식 (IIb) 로 나타내는 반복 단위 및 식 (Ia)
[화학식 27]
[식 중, Xa 는 하이드록시, -O-Q+, C1-6 알콕시 및 -NR7R8 에서 선택되고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, 및 Ra 는 본 명세서에서 이미 정의된 바와 같다]
로 나타내는 반복 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체를 이하의 식
HNR9-Z1-Z2
[식 중, R9, Z1, 및 Z2 는 본 명세서에서 이미 정의된 바와 같다]
으로 나타내는 화합물과 반응시킴으로써 얻어진다.
반응은 카르복시 (염을 포함한다) 와 아미노를 축합시켜, 카르복시를 아미드로 변환함으로써 실시되고, 공정 2 와 동일한 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 이하의 식 (III) 으로 나타내는 반복 단위를 포함하고 있어도 된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에 있어서, (a) 식 (I) 및 식 (III), (b) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (III), (c) 식 (I) 및 식 (IIb) 및 식 (III), 또는 (d) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (IIb) 및 식 (III) 으로 나타내는 1 이상의 이당 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체가 제공된다.
식 (III):
[화학식 28]
[식 중, R1c, R2c, R3c, 및 R4c 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5c 는 수소 원자, 포르밀 또는 C1-6 알킬카르보닐이고;
Re 는 수소 원자 또는 C1-6 알킬이고;
Rd 는 수소 원자, C1-6 알킬, -CO-C(R10)=CH2, 또는 -CO-G4-Xc 이고;
R10 은 수소 원자 또는 메틸이고;
G4 는 페닐렌, C3-8 시클로알킬렌, 또는 -G5-(C1- 10 알킬렌)-G6- 에서 선택되고, 여기서 C1- 10 알킬렌 부분은 1 ∼ 3 의 페닐렌 또는 C3-8 시클로알킬렌이 삽입되어 있어도 되고;
G5 및 G6 은, 각각 독립적으로, 직접 결합, 페닐렌, 또는 C3-8 시클로알킬렌에서 선택되고;
Xc 는 메르캅토, 할로겐 원자 또는 식:
[화학식 29]
으로 나타내는 기이고;
Yb 는 -CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH-, -CH2-(CHR16)p-2-CH2-O-, -(CH2)j-S- 또는 -(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G- 이고;
l, p, 및 j 는, 각각 독립적으로, 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고, R15 및 R16 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 하이드록시이고;
a 는 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고;
b 는, 각각 독립적으로, 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고;
c 는 1 ∼ 200 에서 선택되는 정수이고;
Y1 은 산소 원자 또는 -NRn- 이고;
G 는 산소 원자, 황 원자 또는 -NH- 이고;
Rn 은 수소 원자, C1-6 알킬, -CO-(CH2)d-Ro, -(CH2)e-Rp 또는 -(CH2)f-(Y2-(CH2)g)h-Rq 이고;
g 는, 각각 독립적으로, 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고;
d, e, f 및 h 는, 각각 독립적으로, 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고;
Ro, Rp 및 Rq 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 하이드록시, 카르복시 또는 -NHRr 이고;
Y2 는 산소 원자 또는 -NH- 이고;
Rr 은 수소 원자, 포르밀 또는 C1-6 알킬카르보닐이다]
으로 나타내는 이당 단위.
식 (III) 으로 나타내는 이당 단위를 포함하는 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하는 방법으로는, 예를 들어, 상기 히알루론산의 테트라부틸암모늄염과, 적당한 축합제 존재하, 용매 중에서 당해 히알루론산염과 식:HNRe-Yb-Rw (식 중, Rw 는 수소 원자, C1-6 알킬, -CO-C(R10)=CH2, -CO-G4-Xc, 하이드록시의 보호기, 아미노의 보호기, 또는 메르캅토의 보호기이며, Re, Yb, R10, G4, 및 Xc 는 본 명세서에 이미 정의된 바와 같다) 로 나타내는 화합물을 반응시키고, 보호기가 존재하는 경우에는 탈보호를 실시하는 방법을 들 수 있다. 상기 반응에서는 본 명세서에 이미 기재한 축합제 및 용매를 사용할 수 있다.
-CO-G4-Xc 의 구체예로는, 이하의 식으로 나타내는 기를 들 수 있다:
[화학식 30]
상기 반응에 있어서 사용되는 보호기의 구체예는, 예를 들어, T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999 에 기재되어 있다.
하이드록시의 보호기의 예로는, C1-6 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, C1-6 알콕시카르보닐, C1-6 알콕시 C1-6 알킬, C1-6 알킬아미노카르보닐, 디(C1-6 알킬)아미노카르보닐, 아릴 C1-6 알킬, 헤테로아릴 C1-6 알킬, 아릴 C1-6 알킬아미노카르보닐, C1-6 알킬, C1-6 알킬술포닐, ((아미노 C1-6 알킬)카르보닐옥시) C1-6 알킬, 불포화 헤테로 고리 카르보닐옥시 C1-6 알킬, 아릴디(C1-6 알킬)실릴, 트리(C1-6 알킬)실릴 등을 들 수 있다. 바람직한 하이드록시의 보호기로는, 아세틸 등을 들 수 있다.
-NH- 또는 아미노의 보호기의 예에는, C1-6 알킬카르보닐, 아릴 C1-6 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, C1-6 알콕시카르보닐, C1-6 알킬아미노카르보닐, 디(C1-6 알킬)아미노카르보닐, 아릴 C1-6 알킬, 헤테로아릴 C1-6 알킬, (아릴 C1-6 알킬)아미노카르보닐 등이 포함된다. 바람직한 아미노의 보호기로는, 아세틸, t-부톡시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 등을 들 수 있다. 또, 아미노는 보호됨으로써, 프탈산이미드, 숙신산이미드, 글루탈산이미드, 1-피롤릴 등의 포화 또는 불포화 헤테로 고리기를 형성하고 있어도 된다.
메르캅토의 보호기로는, 예를 들어, 에틸티오 및 t-부틸티오 등의 C1-6 알킬티오, 2-니트로페닐티오 및 2-카르복시페닐티오 등의 치환 페닐티오, 그리고 2-피리딜티오 등의 헤테로아릴티오를 들 수 있다. 바람직한 예는 2-피리딜티오이다.
상기 식 (III) 의 -NRe-Yb-Rd 로 나타내는 기의 예로는, 식:
[식 중, R10, R15, R16, Y1, c, j, l, 및 p 는 본 명세서에서 정의되는 바와 같고, u 는 1 ∼ 3 의 정수이다]
으로 나타내는 기를 들 수 있다.
여기서, 히알루론산 유도체의 분자 중에 포함되는, R15 및 R16 이 하이드록시인 CHR15 및 CHR16 의 개수는 각각 0 ∼ 8 이지만, 바람직하게는 0 ∼ 3, 더욱 바람직하게는 0 및 1 이다. R15 및 R16 이 하이드록시인 CHR15 및 CHR16 의 개수를 조절함으로써, 본 발명의 히알루론산 유도체의, 물에 대한 용해도를 조절할 수 있다. R15 가 전부 수소 원자인 경우, l 로는 2 ∼ 6 이 바람직하고, 그 구체예로서 2 및 6 을 들 수 있다. R15 중 하나가 하이드록시인 경우, l 의 구체예로는 3 을 들 수 있다. Y1 이 산소 원자인 경우, c 의 구체예로는 2 를 들 수 있다. Y1 이 -NH- 인 경우, c 의 구체예로는 1 ∼ 3 을 들 수 있다. l 및 p 의 구체예로는 3 을 들 수 있다.
이들 -(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G- 에 결합하는 Rd 의 구체예로는, 예를 들어, 수소 원자, -CO-CH=CH2, -CO-C(CH3)=CH2, -CO-CH2-Cl, -CO-CH2-Br, -CO-CH2-I, -CO-CH2-SH, -CO-CH2-CH2-SH 등을 들 수 있다.
또, -NRe-Yb-Rd 로 나타내는 기의 구체예로서, -NH-(CH2)3-N(-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3)-(CH2)2-SH, -NH-(CH2)2-N(-(CH2)3-NH-(CH2)4-NHCOCH3)-(CH2)3-SH 및 -NH-(CH2)5-N(-(CH2)3-NH-(CH2)2-NHCOCH3)-(CH2)2-SH 를 들 수 있다.
나아가 또, -NRe-Yb-Rd 로 나타내는 기의 구체예로서, 이하의 기도 들 수 있다:
(여기서, R17 은 수소 원자 또는 C1-6 알킬이고, p1 은 2 ∼ 10 의 정수, q 는 1 ∼ 200 의 정수를 각각 나타낸다.)
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, 식 (III) 으로 나타내는 반복 단위의 비율은, 예를 들어, 0.1 ∼ 99.5 % 이며, 바람직하게는 1 ∼ 30 % 이다.
식 (III) 으로 나타내는 이당 단위를 포함하는 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하는 방법으로서, 히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시 (-COOH) 를, 식:H2N-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH2 로 나타내는 디아민과 반응시켜 식:-CONH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NH2 로 나타내는 아미드로 변환하고, 또한, 말단의 아미노를 수식하여 기:-CONH-CH2-(CHR15)l-2-CH2-NHRd 로 나타내는 아미드로 변환하는 방법 (공정 3a) 을 들 수 있다.
식 (III) 으로 나타내는 이당 단위를 포함하는 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하는 방법으로서, 히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시 (-COOH) 를, 식:H2N-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH 로 나타내는 하이드록시아민과 반응시켜 식:-CONH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH 로 나타내는 아미드로 변환하고, 또한, 말단의 히드록시를 수식하여 기:-CONH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-ORd 로 나타내는 아미드로 변환하는 방법 (공정 3b) 을 들 수 있다. 공정 3a 와 공정 3b 를 아울러 공정 3 이라고 칭한다.
또한, 이들 화합물은 예를 들어 시그마-알드리치사 등에서 시판되고 있으며, 적절히 구입하여 이용할 수 있다. 또, 문헌 기재의 방법에 따라, 혹은 문헌 기재의 방법을 참고로 하여 합성해도 된다.
식 (III) 에 있어서의 기:-NRe-Yb-Rd 는 복수 존재하는 이당 단위의 각각에 있어서 동일해도 되고 상이해도 된다. 예를 들어, 상이한 양태의 식:HNRe-Yb-Rd 로 나타내는 화합물을 사용하여 상기 반응을 실시해도 된다.
식 (I) 에 있어서의 X1 이 하이드록시, -O-Q+ 또는 C1-6 알콕시인 경우, 기 -NRe-Yb-Rd 는 식 (III) 으로 나타내는 이당 단위 중에 나타낸 위치에 존재할 뿐만 아니라, 그 일부 또는 전부가 식 (I) 에 있어서의 X1 과 치환하여, X1 이 -NRe-Yb-Rd 가 되어도 된다.
공정 1, 공정 2 및 공정 3 의 순번은 상관없다. 바람직한 순번으로는, 공정 1, 공정 2, 그리고 공정 3 의 순번, 공정 2, 공정 1, 그리고 공정 3 의 순번, 및, 공정 1, 공정 3, 그리고 공정 2 의 순번을 들 수 있다.
식 (III) 으로 나타내는 이당 단위에 있어서 반응성의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 히알루론산 유도체는 2 이상의 메르캅토를 갖는 가교제 (예를 들어, 디티오트레이톨:DTT, 부탄디티올, 폴리에틸렌글리콜디티올) 와의 가교 반응에 제공할 수 있다. 또, 식 (III) 으로 나타내는 이당 단위에 있어서 메르캅토를 포함하는 히알루론산 유도체는 2 이상의 메르캅토를 갖는 가교제 (예를 들어, 디티오트레이톨:DTT, 부탄디티올, 폴리에틸렌글리콜디티올) 와의 디술파이드 형성에 의한 가교 반응, 또는 반응성의 탄소-탄소 이중 결합을 2 이상 포함하는 가교제 (예를 들어 디비닐술폰) 를 사용하는 가교 반응에 제공할 수 있다. 가교 반응을 실시함으로써, 본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화할 수 있다.
가교 반응의 다른 사례로는, 아미노에 의해 수식한 히알루론산 유도체와, C2-20 알킬렌의 양단에 숙신이미딜에스테르나 그 밖의 이미드에스테르를 갖는 가교제 (예를 들어, 비스[술포숙신이미딜]수베레이트 (BS3), 에틸렌글리콜-비스[술포숙신이미딜]숙시네이트 (Sulfo-EGS), 디메틸아디피미데이트염산염 (DMA) 등) 과의 축합 반응에 의한 가교;아미노에 의해 수식한 히알루론산 유도체와, C2-20 알킬렌의 양단에 포르밀을 갖는 가교제 (예를 들어, 글루타르알데히드 등) 와의 가교;메르캅토에 의해 수식한 히알루론산 유도체의 산화 조건하 (예를 들어, 테트라티오네이트나트륨 (STT) 존재하 등) 에서의 산화 반응에 의한 가교;메르캅토에 의해 수식한 히알루론산 유도체와, C2-20 알킬렌의 양단에 말레이미드 (MAL) 나 메타크릴로일 등의 불포화 결합을 갖는 가교제 (예를 들어, 1,4-비스-말레이미드부탄 (BMB), 디메타크릴산에틸렌 (EDMA) 등) 와의 마이클 부가 반응에 의한 가교;아크로일 및 메타크릴로일 등의 불포화 결합에 의해 수식한 히알루론산 유도체와 각종 중합 개시제 (예를 들어, 퍼옥소2황산칼륨 (KPS)/N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED), Irgacure2959 등) 와의 라디칼 중합에 의한 가교;디아민 화합물 (예를 들어, EDA, 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸렌디아민) 등) 공존하, 축합제 (예를 들어, N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨클로라이드 (DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄4불화붕산염 (TBTU), 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄6불화인산염 (PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 등) 에 의한 가교를 들 수 있다. 상기 가교 형성은 히알루론산 유도체의 분자 내여도 되고, 복수의 히알루론산 유도체의 분자간이어도 된다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화시키는 공정은 적절히 그 조건을 선택해도 된다. 가교 조건이란, 가교 방법, 폴리머 농도, 가교제농도, 용매, 용매 pH, 염 농도, 온도, 시간 등이 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정에 있어서, 가교 형성의 반응 조건 중에서, 예를 들어 화학 가교시의 폴리머 농도 및 가교 형성이 가능한 기의 도입률을 높게 함으로써, 생성하는 겔의 가교 밀도를 높게 하는 것이 가능하다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정에 있어서의, 히알루론산 유도체에 대한 가교제의 비는, 양단에 가교 형성이 가능한 기를 갖는 것을 사용하는 경우, 당해 기가 과부족없이 신속하게 가교 반응에 관여할 수 있는 비 (예를 들어 몰비) 로 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 메타크릴로일 (MA 기) 을 도입한 폴리머를 DTT 를 사용하여 마이클 부가 반응에 의해 가교하는 경우의 몰비는 MA 기:SH 기 = 3:1 ∼ 1:3 이 바람직하고, 2:1 ∼ 1:2 가 특히 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정에 있어서의 용매는 폴리머 및 가교제를 충분히 용해할 수 있는 것이 바람직하고, 특별히 한정되지 않지만, 물, 디메틸술폭시드 (DMSO), 디메틸아세트아미드 (DMAc), 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸피롤리돈 (NMP) 및 이들에서 선택되는 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 또, 이들 용매에 혼화하는 유기 용매를 혼합하여 사용하는 것도 가능하다. 특별히 한정되지 않지만, 혼화하는 유기 용매로는 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 등을 들 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체의 겔이 갖는 화학 가교 구조는 생체 내에서 분해하는 구조를 포함하고 있어도 된다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 가교 반응에 제공하는 기로서, 에스테르 결합 및 메타크릴로일을 갖는 기를 사용해도 된다. 또, 가교제로서, Sulfo-EGS 나 EDMA 등, 에스테르 결합을 갖는 화합물, 또는 생체 내의 효소에 의해 분해되는 펩티드 스페이서를 갖는 화합물을 사용해도 된다. 또, 메르캅토의 산화에 의해 형성하는 디술파이드 결합에 의해 가교한 겔은, 디술파이드 교환 반응이나 환원 반응에 의해, 생체에서 분해된다. 분해성의 화학 가교 구조를 가짐으로써, 본 발명의 히알루론산 유도체의 겔의 생체 내에서의 분해 속도를 제어할 수 있고, 이에 따라 약물의 방출 속도도 제어하는 것이 가능하다.
본 발명의 히알루론산 유도체는, 수용액 중에 있어서 나노 미립자를 형성하기 때문에, 희박한 조건하에 있어서 가교함으로써, 나노 사이즈의 미립자 겔을 형성할 수 있고, 혈중 서방 캐리어, 타겟팅 캐리어로서 사용할 수 있다. 희박한 조건이란, 10 ㎎/㎖ 이하이며, 바람직하게는 5 ㎎/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 이하이다. 한편, 고농도인 조건하에 있어서 가교함으로써, 미립자끼리가 가교한, 벌크상의 겔을 형성할 수 있다. 이것은 피하 서방형 캐리어로서 유용하다. 고농도인 조건이란, 5 ㎎/㎖ 이상이며, 바람직하게는 20 ㎎/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 40 ㎎/㎖ 이다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정은 벌크로 실시해도 되고, 에멀션 중이나 분무 액적 중 등의 불연속상 중에서 실시해도 된다. 예를 들어, W/O 에멀션 중에서 실시하는 경우에는, 폴리머나 가교제 등을 용해시킨 수상을, 물에 혼화하지 않는 용매 중에 유화하고, 겔화 반응을 실시하면 된다. 물에 혼화하지 않는 용매란, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 아세트산에틸, 중사슬 지방산 트리글리세리드 (MCT), 유동 파라핀, 대두유 등을 들 수 있다. 유화를 안정화하기 위한 계면 활성제를 첨가해도 된다. 또, 예를 들어, 초임계 이산화탄소 중이나 PEG 중 등 탈용매가 가능한 용매 중에서 실시해도 된다. 이 경우에는, 폴리머나 가교제 등을 용해시킨 수상이나 유기 용매상을, 전례의 용매 중에 유화, 분산함으로써, 탈용매 (용매 확산) 에 수반하는 폴리머의 농축이 이루어지기 때문에, 보다 높은 가교 밀도의 겔을 얻는 것이 가능해진다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정, 및 그 후에, 가교 반응을 정지하는 조작 및 잔존한 가교성 관능기를 실활 혹은 세정하는 조작을 실시해도 된다. 반응에 관여하지 않았던 가교성 관능기, 가교제의 편단만이 결합한 기, 잔존한 가교제 등은 안전성의 관점, 보존 중 안정성의 관점, 봉입되는 약물과의 부반응 등의 관점에서 제거한 쪽이 바람직하다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 미반응의 가교제가 잔존하고 있는 경우에는, 과잉 물 등으로 세정함으로써 제거해도 된다. 또, 예를 들어 폴리머로 치환한 메타크릴로일이 잔존하는 경우에는, 과잉 메르캅토에탄올 등을 첨가하여, 메타크릴로일을 실활시킨 후, 과잉 물 등으로 잉여 메르캅토에탄올을 세정함으로써 제거해도 된다. 나아가서는, 예를 들어 메르캅토가 잔존하는 경우에는, 과잉 3-말레이미드프로피온산, 요오도아세트산 등을 첨가하여, 메르캅토를 실활시킨 후, 과잉 물 등으로 잉여 3-말레이미드프로피온산, 요오도아세트산을 세정함으로써 제거해도 된다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정 후에, 분쇄 공정을 실시해도 된다. 분쇄 방법으로는, 유봉과 유발을 사용하는 분쇄나 밀을 사용하는 분쇄를 들 수 있지만, 밀을 사용하는 분쇄가 바람직하다. 밀 분쇄 장치로는, 원심식 분쇄기 (닛폰 정기 제작소) 및 임팩트 밀 (주식회사 달톤) 등의 회전 원판형의 분쇄 장치, 아토마이저 (토쿄 아토마이저 제조 주식회사), 샘플 밀 (토쿄 아토마이저 제조 주식회사), 밴텀 밀 (토쿄 아토마이저 제조 주식회사), 및 SK 밀 (톡켄) 등의 스크린 밀의 분쇄 장치, 초미소량 라보 제트 밀 (A-O 제트 밀, 세이신 기업) 등의 제트 분쇄 장치, 그리고, 초저온에서의 분쇄가 가능한 린렉스 밀 (리퀴드 가스 주식회사) 등을 들 수 있지만, SK 밀 및 린렉스 밀이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 겔화시키는 공정 후에, 건조 공정을 실시해도 된다. 건조 방법으로는, 예를 들어 통풍 건조, 항온조 중에서의 건조, 감압 건조, 열풍 순환식 건조 등을 들 수 있다. 풍속, 건조 시간, 온도, 압력 등은 본 발명의 겔이 분해나 변질을 발생시키지 않는 범위에서 적절히 선택된다.
본 발명의 히알루론산 유도체의 겔에 약물을 봉입함으로써 의약 조성물로 할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, (a) 식 (I) 및 식 (III), (b) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (III), (c) 식 (I) 및 식 (IIb) 및 식 (III), 또는 (d) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (IIb) 및 식 (III) 으로 나타내는 1 이상의 이당 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체를, 가교제를 사용하여 가교하고, 겔화하여, 약물 (저분자 화합물, 단백질, 펩티드, 또는 핵산) 을 봉입하기 위한 담체로서 사용할 수 있다. 약물 봉입 방법으로서, 미리 가교된 히알루론산 유도체 겔에 약물 용액을 첨가하는 방법을 들 수 있다. 당해 방법에서는, 먼저, 팽윤한 겔 내부로 확산에 의해 약물이 흡수되고, 흡수된 약물은 히알루론산 유도체 겔의 소수성 상호 작용에 의한 물리 가교 도메인에 유지됨으로써 약물이 봉입된다. 특별히 한정되지 않지만, 용매, 염 농도, pH, 온도, 시간, 변성제의 첨가 등의 조건은 약물이 안정적으로 또한 고수율로 봉입되도록 적절히 선택해도 된다. 예를 들어, 약물 봉입시의 염 농도나 pH 에 의해, 히알루론산 유도체 겔의 팽윤도나 밀도가 변화하고, 약물의 전리 상태 등도 바뀌기 때문에, 그 조합에 따라 적절히, 적합한 조건을 사용하면 된다. 약물의 봉입을 저염 농도하에서 실시함으로써, 히알루론산 유도체의 카르복시끼리의 정전 반발을 이용하여, 겔 밀도를 감소시키고, 약물 봉입량을 증가시키는 것이나, 보다 고분자량의 약물을 봉입할 수 있다. 약물 봉입 후, 염 농도를 상승시킴으로써 정전 반발을 약하게 하고, 겔 밀도를 상승시켜, 겔 망목을 약물 사이즈보다 작게 함으로써, 강고하게 약물을 유지하고, 방출을 늦추는 것이 가능해진다. 이 때, 염 농도를 생리 염 농도로 할 수도 있다.
또, 약물 봉입 방법으로서, 본 발명의 히알루론산 유도체에 약물을 복합화시킨 후, 가교함으로써 겔화시키는 방법을 들 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 복합화시의 용매, 염 농도, pH, 온도, 시간, 변성제의 첨가, 상기 친수성 다당류 유도체 농도 (HP), 약물 농도, HP 와 약물의 비율 등의 조건은 약물이 안정적으로 또한 고수율로 나노 겔과 복합화되도록 적절히 선택해도 된다. 복합화되지 않았던 프리 약물은 투석법이나 사이즈 배제 크로마토그래프 (SEC) 법 등으로 분리, 제거하면 된다. 가교시에는, 봉입된 약물이 변성하지 않는 가교 조건을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체의 겔에 봉입된 약물은 약물의 겔 중에 있어서의 단순 확산, 히알루론산 유도체의 겔의 분해, 및 생체 성분과 약물의 치환에 의해 방출된다. 약물의 확산에 의해 약물 방출이 이루어지는 경우에는, 겔의 가교 밀도, 및 가교 도메인의 양이나 그 소수성의 강도에 의해 그 속도를 제어하는 것이 가능하다. 겔의 분해란, 예를 들어, 화학 가교 도메인의 분해, 히알루론산 유도체의 골격의 분해 등이 있다. 이들 분해에 의해, 가교 밀도의 저하 (팽윤율의 증대) 가 발생한다. 가교 밀도가 저하되면, 겔 중의 약물의 확산 속도가 가속되기 때문에 방출이 촉진되고, 또 결합이 끊어지는 것에 의해서도 방출이 촉진된다. 이 때문에, 화학 가교 도메인의 분해성, 폴리머 골격의 분해성, 스페이서의 분해성 등을 제어함으로써, 약물 방출 속도를 제어하는 것이 가능하다.
생체 성분과의 치환이란, 예를 들어, 겔을 피하나 혈중 등의 생체 내에 투여한 경우, 알부민 등의 혈장 단백질이나 지질 등이 존재하고, 이들이 겔 중에 침윤, 봉입되어 있는 약물과 치환됨으로써 약물이 방출되는 경우를 의미한다. 본 발명의 히알루론산 유도체의 겔은, 소수성기끼리에 의한 물리적인 가교뿐만 아니라, 상기 화학 가교에 의해, 생체 성분의 침윤에 수반하는 약물과의 치환을 억제하는 것이 가능하다. 생체 성분의 침윤은 겔의 가교 밀도, 겔 중의 전하 등에 의해 그 속도를 제어하는 것이 가능하다. 또한, 상기 가교에 의한 겔의 형성 후에 약물 용액을 첨가하여 약물 봉입을 하는 경우에는, 봉입시에 약물은 겔 중에 흡수되기 쉬워, 생체 내에서는 생체 성분의 침윤이 억제되도록 그 봉입 조건을 적절히 선택할 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 단백질을 봉입하는 경우, 그 등전점 부근에서 봉입 공정 실시함으로써, 히알루론산 유도체와 약물의 정전 반발을 억제할 수 있다. 또, 히알루론산에 포함되는 글루크론산 유래의 카르복실산의 pKa (대략 4.0) 이하에서 봉입 공정을 실시함으로써, 겔이 갖는 부전하를 약하게 할 수 있으므로, 그 조건으로 부전하로 대전되어 있는 단백질과의 정전 반발이 억제되고, 봉입 효율의 향상이 가능해진다. 또, 예를 들어 생체 내보다 낮은 염 농도에 있어서 봉입 공정을 실시함으로써, 생체 내보다 겔의 팽윤율이 높아지기 때문에, 봉입이 용이해진다.
또한, 본 발명의 소수성기와 가교성 관능기를 동시에 도입한 히알루론산 유도체의 화학 가교에 의한 겔화를, 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체의 공존하에서, 실시할 수 있다. 구체적으로는, 소수성기 및 불포화 결합을 갖는 관능기를 도입한 본 발명의 히알루론산 유도체와, 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체를 혼합하고, 가교함으로써, 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체를 물리적으로 봉입한, 히알루론산 유도체 겔을 조제할 수 있다.
소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체란, 친수성 다당류 및 그 유도체에, 다당 1 분자당 적어도 1 분자 이상의 소수성기를 도입하여 얻을 수 있는 친수성 다당류이다. 친수성 다당류로는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 풀루란, 아밀로펙틴, 아밀로오스, 덱스트란, 만난, 레반, 이눌린, 키틴, 키토산, 히알루론산, 덱스트린이며, 이들은 시판되고 있거나, 문헌 기재의 방법에 따라, 여러 가지 평균 분자량을 갖는 것을 입수할 수도 있다. 친수성 다당류로서 특히 바람직한 것은 풀루란, 히알루론산, 덱스트린이다. 덱스트린으로는 클러스터 덱스트린 (등록상표) 이 바람직하다. 클러스터 덱스트린 (등록상표) 은 에자키 글리코 주식회사로부터 판매되고 있는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 소수성기로는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 C8- 50 의 탄화수소기, 스테릴기, 폴리락트산 (PLA) 기, 폴리락트산·글리콜산 공중합체 (PLGA) 기 등의 기 또는 이들 기를 포함하는 기이며, 특히 바람직하게는 콜레스테릴기를 포함하는 기, C8- 30 의 직사슬 또는 분기 알킬 또는 당해 기를 포함하는 기이다. 소수성기는 스페이서를 개재하여 도입되어 있어도 된다.
소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체에는, 본 발명의 히알루론산 유도체도 포함된다. 즉, 본 발명의 히알루론산 유도체로 이루어지는 미립자를 적당한 겔에 봉입해도 된다.
소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체는 각종 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 또, 친수성 다당류로서 풀루란의 하이드록시에, 소수성기로서 N-[6-(콜레스테릴옥시카르보닐아미노)헥실]카르바모일을 도입한 친수성 다당류 유도체 (이하, 「콜레스테롤 풀루란」, 「CHP」 라고도 칭한다) 는 시판되는 것을 구입하여 (예를 들어, 니혼 유지 주식회사) 입수하는 것도 가능하다. 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체는, 수용액 중에 있어서 소수성 상호 작용에 의해 수 분자가 자발적으로 회합함으로써 나노 사이즈 (1 ∼ 1,000 ㎚) 의 겔 구조를 갖는 미립자 (나노 겔) 를 형성하는 것 등에 의해, 소수성 약물이나 약효를 갖는 단백질이나 펩티드와 복합화할 수 있는 것이다.
본 발명에 사용되는 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1 kDa ∼ 1,000 kDa, 더욱 바람직하게는 10 kDa ∼ 300 kDa 이다. 또 상기 친수성 다당류 유도체는 약학적으로 허용되는 염이어도 된다.
또한, 예를 들어, 본 발명의 히알루론산 유도체 및 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체에 포함되는 하이드록시도 또한 가교 형성이 가능한 기로서 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 히알루론산 유도체 및 소수성기를 갖는 친수성 다당류 유도체의 하이드록시를, 특정한 가교제, 예를 들어, 디비닐술폰 (DVS), 카르보디이미드, 또는 C2-20 알킬렌의 양단에 글리시딜에테르를 갖는 가교제 등에 의해 가교할 수 있다.
히알루론산의 카르복시에 도입되는 치환기의 종류가 복수일 때에는, 그들 치환기는 동시 도입해도 되고, 순차로 도입해도 된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 명세서에 정의한 히알루론산 유도체로서, 수중에서 회합에 의해 미립자를 형성하는 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 유도체가 제공된다. 특별히 한정되지는 않지만, 도입된 기 -NR9-Z1-Z2 의 소수성 상호 작용에 의해 수중에 있어서 자발적 회합이 일어나, 나노 스케일의 미립자를 형성한다는 특성을 갖는다. 요망되는 드러그 딜리버리 시스템 구축을 위해서, 본 발명의 히알루론산 유도체에 의해 형성되는 나노 미립자는 매우 유력한 수단 중 하나이며, 내부에 형성되는 소수 도메인에 활성 성분인 단백질, 펩티드, 저분자 화합물을 유지한 채로 목적으로 하는 부위에 송달하는 캡슐로서 사용할 수 있다. 또, 약물을 컨쥬게이트함으로써 목적으로 하는 부위에 약물을 송달할 수 있다.
나노 스케일의 미립자는 전신 투여, 특히 정맥내 투여가 가능하고, 봉입 (복합화) 한 약물을 혈중에서 서방하는 혈중 약물 서방, 또, 표적 장기 및 세포로 약물을 선택적으로 딜리버리시키는, 타겟팅용의 담체로서 사용할 수 있다. 타겟팅용 담체로서 사용하는 경우, 타겟 소자를 더함으로써 각 장기 그리고 세포로 타겟팅할 수도 있다. 타겟 소자로는, 예를 들어, 표적 조직 특이적인 펩티드, 항체, 단편화 항체, 앱타머, 암 세포에 대한 RGD 펩티드, 엽산, 아니사미드, 트랜스페린, 간장에 대한 갈락토오스, 토코페롤 등이 있다. 혈중에서의 약물의 유지를 강고하게 하기 위해서, 추가로 히알루론산 유도체를 화학 가교시킬 수도 있다.
또, 히알루론산과 동일한 직사슬형의 폴리머인 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이 분자량 40 kDa 이하에서 신장 배설을 받는 것이 보고되어 있는 (Europian Journal of Cancer. 제 31 권, 제 766-770 페이지, 1995년) 등, 어느 일정한 크기 이하의 분자는 신장 배설을 받는 것이 알려져 있다. 따라서, 동일한 정도 이하의 분자량의 히알루론산 그리고 히알루론산 유도체도 신장 배설되어, 순식간에 혈중으로부터 소실될 염려가 있다. 그러나, 본 발명의 소수성기를 도입한 HA 유도체는, PEG 가 신장 배설을 받는 분자량 이하이더라도, 회합화함으로써 혈중 약물 서방 및 타겟팅용의 담체로서 사용할 수 있다.
히알루론산 유도체에 의한 미립자는 수용액 중에서 자기 회합에 의해 형성되므로, 고체의 히알루론산 유도체를 물 또는 염 수용액에 용해함으로써 형성할 수 있다. 또, 다른 방법에서는, 다른 용매 (예를 들어 DMSO) 에 용해시킨 뒤, 물, 또는 염 수용액으로 치환함으로써도 미립자를 형성할 수 있다. 형성한 미립자의 사이즈를 균일화하기 위해서 초음파 처리를 실시해도 된다.
히알루론산 유도체의 소수성기 도입률이 높아짐에 따라, 물에 대한 용해성이 감소한다. 그 때문에 수용액 중에서 분산성의 미립자를 형성시키기 위해서는, 공유 결합에 의해 도입하는 소수성기는 80 % 이하, 바람직하게는 60 % 이하가 되도록 조제된 히알루론산 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
히알루론산은 해리기인 카르복시를 갖기 때문에, 계 중의 이온 강도가 높을수록 용해성이 낮아진다. 따라서, 도입률을 컨트롤함으로써, 저염 농도하 혹은 무염 조건하에서는 용해하고, 생리 식염 농도로 응집·침전하는 히알루론산 유도체의 조제가 가능하며, 이것은 피하에서의 서방 제제의 기재가 될 수 있다. 또, 생리 염 농도하에 있어서도 안정된 미립자를 형성할 정도의 소수성기를 도입한 히알루론산 유도체는 전신 투여형의 약물 담체가 될 수 있다.
형성되는 미립자의 입자직경은 특별히 한정되지 않지만, 주사에 의한 투여시에 니들을 막히게 하지 않고 통과할 수 있도록 하기 위해서 200 ㎛ 이하인 것이 바람직하고, 100 ㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 또, 정맥 투여의 경우에는, 말초 혈관을 폐색시키지 않기 위해서 입자직경 500 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 200 ㎚ 이하인 것이 더욱 바람직하다. 또, 세망내피계로의 삽입을 회피하고, 혈중 체류성을 향상시키기 위해서 100 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 보다 더 바람직하게는 50 ㎚ 이하이다.
본 발명의 히알루론산 유도체는 의약 제제에 있어서의 약물 담체로서 사용할 수 있으며, 본 발명 히알루론산 유도체와 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 히알루론산 유도체는, 수용액 중에서 자발적으로 약물과 복합체를 형성할 수 있기 때문에, 특별한 조작을 필요로 하지 않고, 당해 히알루론산 유도체와 약물을 수용액 중에서 혼합하고, 인큐베이트함으로써, 담체-약물의 복합체를 용이하게 형성시켜, 약물을 담지할 수 있다. 복합체 형성의 구동력은 주로 히알루론산 유도체의 소수성기와 약물의 소수성 상호 작용이지만, 약물이 염기성인 경우, 히알루론산 유도체의 카르복실산과의 정전적 상호 작용이 기여하는 경우가 있다. 생체 염 농도에서는, 정전적 상호 작용은 약하고, 소수성 상호 작용은 강해지기 때문에, 주로 소수성 상호 작용에 의해 복합체가 형성되는 것으로 생각된다.
상기 식 (I) 및 (II) 에 있어서, Z1 이 알킬렌인 경우, 알킬렌의 탄소 사슬이 길수록 당해 기의 소수성이 높아져, 강한 소수성 상호 작용에 의해 강고한 미립자를 형성할 수 있다. 또, 알킬렌이 길수록 분자간에서의 얽힘이 커져, 점도를 상승시킬 수 있다. 또한, 알킬렌의 길이를 변경함으로서, 미립자의 사이즈를 제어할 수도 있다.
소수성기 중의 링커 (스페이서) 부분이 에스테르 또는 카보네이트인 경우 (예를 들어, X1 또는 X2 에, -COO-Z3 또는 -O-COO-Z3 이 포함되는 경우), 생체 내에 있어서 에스테르 또는 카보네이트가 분해되고, 히알루론산 유도체의 소수성이 저하됨으로써 더욱 생분해성이 높아져, 안전성의 면에서 바람직하다. 또, 종양 조직 주변에서는 pH 가 저하되어 있는 것이 알려져 있고, 이와 같은 스페이서를 갖고 있는 경우, 목적 약물을 담지한 본 발명의 히알루론산 유도체의 회합체는 종양 주변에서 붕괴하여, 약물을 종양 주변에서 방출할 수 있다.
특히, -O-CO-CH2-CH2-S- 와 같은 β티오카르복실산에스테르 구조를 갖는 링커의 경우, 약간의 pH 의 저하 (pH 6 정도) 에 있어서도 분해가 촉진된다. 이 때문에, 통상적인 에스테르보다 pH 응답이 샤프하다. 또, 세포 내로의 약물의 송달을 목표로 하는 경우, 엔도좀에 있어서의 pH 저하에도 응답하여, 세포에 삽입된 후에만 약물을 방출시킬 수 있다.
링커 (스페이서) 부분이 디술파이드 결합을 갖는 경우 (예를 들어, X1 또는 X2 에 -S-S-Z3 이 포함되는 경우), 환원 상황하에 있어서 링커가 분해되고, 히알루론산 유도체의 소수성이 저하됨으로써 본 발명의 히알루론산 유도체의 회합체가 붕괴한다. 세포질은 환원 환경인 것이 알려져 있기 때문에, 이 링커를 사용한 히알루론산 유도체에 약물을 봉입하여 투여함으로써, 혈중에서는 약물을 방출하지 않고, 세포질 내에서만 약물을 방출시킬 수 있다.
담체-약물 복합체를 형성할 때의, 용매, 염 농도, pH, 온도, 시간, 변성제의 첨가 등의 조건은 사용하는 약물에 따라 적절히 변경할 수 있다. 예를 들어, 약물 봉입시의 염 농도나 pH 에 의해, 히알루론산 유도체는 밀도가 바뀜과 함께, 약물도 그 전리 상태 등이 변동한다. 사용하는 변성제의 예로는, 우레아, 염산구아니딘, 도데실황산나트륨 등을 들 수 있다. 변성제를 첨가한 경우에는, 복합체 형성 후에, 과잉 물 등으로 세정함으로써 잉여 변성제를 제거할 수 있다.
특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 본 발명의 히알루론산 유도체와 단백질의 복합체를 형성하는 경우, 그 등전점 부근에서 복합체 형성을 실시함으로써, 히알루론산 유도체와 단백질의 정전 반발을 억제하는 것이 가능하기 때문에, 복합체에 포함되는 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 또, 글루크론산 부분의 카르복시의 pKa (대략 4.0) 이하의 조건으로 복합체 형성 공정을 실시함으로써, 히알루론산 유도체가 갖는 부전하를 약하게 할 수 있으므로, 단백질이 당해 조건하에서 부전하로 대전되어 있는 경우에는 정전 반발을 억제하는 것이 가능하고, 복합체에 포함되는 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 생체 내보다 낮은 염 농도에 있어서 복합체 형성 공정을 실시함으로써, 수용액 중에서 형성되는 히알루론산 유도체의 미립자의 밀도가 저하되기 때문에, 복합체에 포함되는 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 또, 그 상태로 염 농도를 올림으로써 미립자의 밀도를 향상시키고, 강고하게 단백질을 봉입할 수 있다.
히알루론산 유도체와 단백질의 복합체 형성은 단백질의 분자량에도 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 단백질이 저분자량일수록 당해 단백질의 히알루론산 유도체의 미립자 내부로 이행 속도는 높다. 또, 소수성기의 도입률에 의존하는 미립자의 밀도도 단백질과의 복합체 형성의 속도, 및 복합체에 포함되는 단백질의 양에 영향을 줄 수 있다.
히알루론산 유도체와 약물의 복합체로부터의 생체 내에 있어서의 약물 방출은, 복합체로부터의 약물의 확산에 더하여, 생체 성분이 약물과 치환함으로써 촉진된다. 미립자의 밀도를 증감시켜, 이 확산이나 치환을 제어함으로써, 약물의 서방성을 제어하는 것이 가능해진다.
생체 내에는 혈장 단백질이나 지방질 등의 생체 성분이 존재하여, 히알루론산 유도체와 약물의 복합체를 피하나 혈중 등의 생체 내에 투여한 경우, 이 생체 성분이 복합체 내의 약물과 치환함으로써 약물이 방출되는 경우가 있다. 당해 치환을 발생시키는 주된 생체 내 단백질로서 알부민이 상정된다. 본 발명의 히알루론산 유도체의 소수성기의 도입률을 낮게 함으로써, 글루크론산 부분의 카르복시의 부전하를 높게 할 수 있고, 부전하를 갖는 알부민 (pI = 4.6) 과의 치환을 억제할 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 약물 담체로서 사용하는 방법으로는, 전술한 수용성액 중에서 자발적으로 약물과 복합체를 형성시키는 방법 외에, 약물과 본 발명의 히알루론산 유도체를 결합시킨 컨쥬게이트로 하는 방법을 들 수도 있다. 즉, 본 발명의 다른 측면에 있어서, 식 (I) 로 나타내는 이당 단위를 포함하는 히알루론산 유도체에, 상기 약물의 1 이상이 결합한, 히알루론산 유도체-약물 결합체가 제공된다. 이 측면의 하나의 양태에 있어서, 히알루론산 유도체로서, (a) 식 (I) 및 식 (III), (b) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (III), (c) 식 (I) 및 식 (IIb) 및 식 (III), 또는 (d) 식 (I) 및 식 (II) 및 식 (IIb) 및 식 (III) 으로 나타내는 1 이상의 이당 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 식 (III) 의 기 -NRe-Yb-Rd 에 포함되는 하이드록시, 아미노, 메르캅토, 할로겐 원자 (브로모, 요오도 등) 또는 반응성의 탄소-탄소 이중 결합 (메타크릴로일, 아크릴로일 등) 과 약물을 결합시킴으로써, 상기 히알루론산 유도체-약물 결합체를 조제할 수 있다.
또한, 기 -NRe-Yb-Rd 와 약물 사이에, 추가로, 식 -G1-G2-G3-J-***
(식 중, *** 는 약물과의 결합 부위를 나타내고,
G1 은 직접 결합, -C(=O)-, -NRs- 및 -S- 에서 선택되고,
G2 는 -(CH2)i- 및 -(CH2)qa-(O-CH2-CH2)k- 에서 선택되고,
G3 은 직접 결합, -C(=O)-NRt-(CH2)r- 및 -NRu-C(=O)-(CH2)ma- 에서 선택되고,
J 는 이하의 식으로 나타내는 기를 나타내고,
[화학식 31]
Rs, Rt 및 Ru 는, 독립적으로, 수소 원자 및 C1-6 알킬에서 선택되고, i 는 1 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고, qa 는 2 ∼ 10 에서 선택되는 정수이고, k 는 1 ∼ 100 에서 선택되는 정수이며, r 및 ma 는, 독립적으로, 1 ∼ 10 에서 선택되는 정수이다)
로 나타내는 스페이서가 삽입되어 있어도 된다.
식 -G1-G2-G3-J-*** 의 구체예로는, 예를 들어, 이하의 식을 들 수 있다:
[화학식 32]
본 발명의 히알루론산 유도체의 주사슬의 말단에 존재하는 글루크론산 4 위치 및 아세틸글루코사민 1 위치의 하이드록시는 다른 기로 변환되어 있어도 되며, 예를 들어, C1-6 알콕시, 포르밀옥시 및 C1-6 알킬카르보닐옥시 등이어도 된다.
본 발명의 히알루론산 유도체와 약물로 이루어지는 컨쥬게이트의 조제 방법은 이미 알려진 폴리머와 약물의 컨쥬게이트의 조제에서 사용되고 있는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 이하의 반응을 이용할 수 있다.
히알루론산 유도체의 글루크론산 부분의 카르복시와, 약물의 아미노, 하이드록시, 요오도, 브로모 또는, 약물에 도입한 아미노, 하이드록시, 브로모, 요오도의 반응;
히알루론산 유도체의 N-아세틸글루코사민 부분의 6 위치의 하이드록시와, 약물의 카르복시 또는 약물에 도입한 카르복시의 반응;
히알루론산 유도체에 도입한 아미노와, 약물의 카르복시 또는 약물에 도입한 카르복시의 반응;
히알루론산 유도체에 도입한 아미노와, 수식에 의해 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실아지드, NHS 에스테르 및 에폭시드 등으로 변환된 약물의 반응;
약물의 아미노 또는 약물에 도입한 아미노와, 수식에 의해 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실아지드, 카르보닐, NHS 에스테르 및 에폭시드로 변환된 히알루론산 유도체의 반응;
히알루론산 유도체의 아미노와, 카르보닐을 갖는 또는 도입된 약물 (알데히드 및 케톤 등) 의 시프 염기 형성 그리고 환원적 아미노화 반응;
약물의 아미노 또는 약물에 도입한 아미노와, 수식에 의해 카르보닐이 도입된 히알루론산 유도체의 시프 염기 형성 그리고 환원 아미노화 반응;
히알루론산 유도체에 도입한 메르캅토와, 불포화 결합을 갖는 화합물 (말레이미드, 아크릴에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴에스테르, 메타크릴아미드, 알릴화물, 비닐술폰 등), 할로겐화물 (클로로아세트산에스테르, 브로모아세트산에스테르, 요오도아세트산에스테르, 클로로아세트산아미드, 브로모아세트산아미드, 요오도아세트산아미드 등) 또는 티올인 약물 또는 수식에 의해 당해 화합물로 변환된 약물의 반응;및
약물에 도입한 메르캅토와, 수식에 의해, 불포화 결합을 갖는 화합물 (말레이미드, 아크릴에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴에스테르, 메타크릴아미드, 알릴화물, 비닐술폰 등), 할로겐화물 (클로로아세트산에스테르, 브로모아세트산에스테르, 요오도아세트산에스테르, 클로로아세트산아미드, 브로모아세트산아미드, 요오도아세트산아미드 등) 또는 티올로 변환된 히알루론산 유도체의 반응.
또한, 전술한 소수성기를 HA 유도체에 도입할 때에 사용한 에스테르 또는 카보네이트, β티오에스테르, 디술파이드, 특정한 부위에서 절단하는 펩티드를 포함하는 링커 (스페이서) 를, 약물과의 컨쥬게이트용 링커로서 사용할 수도 있다. 이들 링커는 전술한 바와 같이, 표적 부위에 있어서 절단되고, 약물이 방출된다.
컨쥬게이트의 조제를 위해서 히알루론산 유도체 또는 약물의 수식에 사용하는 시약은, 컨쥬게이트의 조제에 있어서 문제있는 반응을 발생시키지 않는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 그 화합물은 시약으로서 입수 가능하거나, 또는 문헌 공지의 방법을 참고로 하여 합성해도 된다.
구체적으로는, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성하고, 또한, 아미노를 갖는 약물 또는 아미노를 도입한 약물을 DMT-MM 등의 축합제를 사용하여 반응시키고, 아미드 결합에 의해 약물을 컨쥬게이트할 수 있다. 이 때, 약물을 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트염산염 등과 함께 첨가하여, 소수성기를 동시에 도입해도 된다. 또, 약물의 후 혹은 전에 당해 화합물을 첨가해도 된다. 또, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성·정제 후에 약물을 반응시켜도 되고, 약물을 도입한 히알루론산 유도체를 합성·정제 후에 소수성기 유도체를 도입해도 된다.
또, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성하고, 또한 하이드록시를 갖는 약물 또는 하이드록시를 도입한 약물을 DMT-MM, 1,3-디클로로헥실카르보디이미드 (DCC) 등의 축합제를 사용하여 반응시키고, 에스테르 결합에 의해 히알루론산 유도체에 약물을 컨쥬게이트할 수 있다. 이 때, 약물을 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트염산염 등과 함께 첨가하여, 소수성기를 동시에 도입해도 된다. 또, 약물의 후 혹은 전에 당해 화합물을 첨가해도 된다. 그러나, 에스테르의 가수 분해를 회피하기 위해서는, 소수성기를 도입 후, 약물을 컨쥬게이트하는 것이 바람직하다. 상기 방법은, 예를 들어, 파클리탁셀이 HA 에 에스테르로 도입된 보고 (Bioconjugate 제 19 권, 제 1319-1325 항, 2008년) 등을 참고로 하여 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성하고, 또한 브롬화물 혹은 요오드화물인 약물 또는, 수식에 의해 브롬화물 혹은 요오드화물로 변환된 약물을 반응시키고, 글루크론산 부분의 카르복시를 에스테르로 변환함으로써 약물을 컨쥬게이트할 수 있다. 에스테르의 가수 분해를 회피하기 위해서는, 소수성기를 도입 후, 약물을 컨쥬게이트하는 것이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체를 합성하고, 또한, 카르복시를 갖는 약물 또는 카르복시를 도입한 약물을 NHS 에스테르로 하고, N-아세틸글루코사민 부분의 6 위치의 하이드록시와 반응시키고, 에스테르 결합에 의해 약물을 컨쥬게이트할 수 있다. 이 때, 콜레스테릴6-아미노헥실카바메이트염산염 등에 의해 소수성기를 HA 에 도입한 후에 약물을 첨가해도 되고, 도입 전에 첨가해도 된다. 또, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성·정제 후에 약물을 반응시켜도 되고, 약물을 도입한 히알루론산 유도체를 합성·정제 후에 소수성기 유도체를 도입해도 된다. 에스테르 결합의 가수 분해를 회피하기 위해서는, 소수성기 유도체를 도입 후, 약물을 컨쥬게이트하는 것이 바람직하다. 상기 방법은, 예를 들어, 캠토테신이 HA 에 에스테르로 도입된 보고 (국제 공개 제WO2009/074678호) 등을 참고로 하여 실시할 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성 후, 글루크론산 부분의 카르복시를 에틸렌디아민 등의 디아민과 탈수 축합시켜, 아미노를 도입할 수 있다. 또한, N-숙신이미딜요오도아세테이트 (PIERCE 사) 나 N-숙신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트 (PIERCE 사) 를 아미노에 반응시켜, 요오도아세틸이 도입된 히알루론산 유도체를 합성할 수 있다. 이 히알루론산 유도체에 대해, 메르캅토를 갖는 약물을 컨쥬게이트할 수 있다. 이 방법은 단백질, 펩티드, 핵산 등의 아미노 등의 반응성기를 많이 포함하는 고분자 약물에 있어서도 메르캅토 선택적으로 컨쥬게이트할 수 있기 때문에 특히 유효하다. 이 때, 약물의 도입은 소수기 유도체를 HA 에 도입하기 전이어도 되고 후여도 된다.
X1 이 -NH2-COO-R 인, 본 발명의 히알루론산 유도체를 합성하고, 여기서, 글루크론산 부분의 카르복시의 일부를 2-아미노에틸2-피리딜디술파이드염산염과 반응시킨다. 이 히알루론산 유도체에 대해 메르캅토를 갖는 약물 그리고 메르캅토를 도입한 약물을 디술파이드 결합 교환 반응, 즉 치환 반응에 의해 도입하는 것이 가능하다.
여기서, 당해 컨쥬게이트의 생물 활성을 유효하게 유지하기 위해서, 약물과 히알루론산 유도체 사이의 링커의 길이를 조절할 수도 있다. 또, 생체 내의 특정 부위에서 효소 등으로 절단되는 펩티드 링커를 도입할 수도 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트가 HA 에 펩티드를 포함하는 링커를 통해서 도입된 보고 (국제 공개 제WO2005/095464호), 독소루비신이 HPMA (N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide) 및 펩티드를 포함하는 링커를 통해서 도입된 보고 (국제 공개 제WO2002/090209호) 등을 참고로 하여 실시할 수 있다.
또, 항체에 저분자 화합물을 컨쥬게이트시킨 ADC (Antibody Drug Conjugate) 에 관한 보고 (국제 공개 제WO2009/026274호;Expert Opinion. 제 15 권, 제 1087-1103 페이지, 2005년;Bioconjugate Chem. 제 19 권, 제 1960-1963 페이지, 2008년;Bioconjugate Chem. in press, Bernhard Stump 등, Antibody-Drug Conjugates : Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies) 가 다수 있으며, 이들을 참고로 하여, 히알루론산 유도체와 저분자 화합물의 컨쥬게이트를 조제할 수도 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체와 1 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물 및 본 발명의 히알루론산 유도체와 1 이상의 약물이 결합한 컨쥬게이트는 나노 미립자, 마이크로 미립자, 용액, 에멀션, 현탁액, 겔, 미셀, 임플란트, 분말, 또는 필름의 형태로 있어도 된다. 분말은 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 얻은 고체를 분쇄하여 제조해도 되고, 침전물을 건조시킨 것으로 제조해도 된다.
본 발명의 의약 조성물 및 컨쥬게이트는 경구, 장관외, 비강내, 질내, 안내, 피하, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 관절강내, 뇌내 또는 구강내의 경로를 거쳐 투여되어도 된다.
본 발명의 의약 조성물 및 컨쥬게이트는, 특히 국소에 있어서의 서방을 목적으로 한 경우, 니들을 막히지 않게 하고 통과할 수 있도록 하기 위해서 200 ㎛ 이하인 것이 바람직하고, 100 ㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물 및 컨쥬게이트는, 특히 CD44 를 비롯한 히알루론산 리셉터로의 타겟팅을 목적으로 한 경우, 그 사이즈는 5 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물 및 컨쥬게이트는, 특히 혈중 체류성 연장, 그리고 종양 조직 또는 염증 조직으로의 집적성을 목적으로 하는 경우, 그 사이즈는 500 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 200 ㎚ 이하이다. 또, 세망 내피계로의 삽입을 회피하고, 혈중 체류성을 향상시키기 위해서는 100 ㎚ 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물 및 컨쥬게이트는, 점막 부착성을 갖고 비침습 투여 용도를 목적으로 한 경우, 그 사이즈는 200 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 점막 부착성의 관점에서는, 사용하는 히알루론산 유도체의 소수성기 도입률은 낮은 쪽이 바람직하다.
본 발명의 히알루론산 유도체와 복합체를 형성하는 약물은 담지 가능한 약물이면 특별히 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 히알루론산 유도체와 결합시키는 약물은 컨쥬게이트가 조제 가능하면 특별히 한정되지 않는다. 당해 약물의 예로는, 단백질 및/또는 펩티드, 다당류, 핵산류, 저분자 화합물을 들 수 있고, 바람직하게는 단백질 및/또는 펩티드를 들 수 있다.
저분자 화합물의 예로는, 예를 들어, 제암제 (예를 들어, 알킬화제, 대사 길항제, 파클리탁셀 등의 알카로이드 등), 사이클로스포린 등의 면역 억제제, 항염증제 (스테로이드제, 비스테로이드제계 항염증제 등), 항류머티즘제, 항균제 (β-락탐계 항생 물질, 아미노글리코시드계 항생 물질, 매크로라이드계 항생 물질, 테트라사이클린계 항생 물질, 신퀴놀론계 항생 물질, 술파제 등) 등을 들 수 있다.
단백질 및 펩티드의 예로는, 예를 들어, 에리트로포에틴 (EPO), 그라눌로사이트 콜로니 자극 입자 (G-CSF), 인터페론-α,β,γ, (INF-α,β,γ), 트론보포에틴 (TPO), 실리아리 뉴로트로픽 팩터 (CNTF), 튜머 네크로시스 팩터 (TNF), 튜머 네크로시스 팩터 결합 단백질 (TNFbp), 인터류킨-10 (IL-10), FMS 유사 티로신 카이네이스 (Flt-3), 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인터류킨-1리셉터안타고니스트 (IL-1ra), 브레인 유래 뉴로트로픽 팩터 (BDNF), 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 간 세포 인자 (SCF), 메가카리오사이트 성장 분화 인자 (MGDF), 오스테오프로테게린 (OPG), 렙틴, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 피브로브라스트 성장 인자 (b-FGF), 골 형성 단백질 (BMP), 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP), 글루카곤형 펩티드-1 (GLP-1), 항체, 다이아바디, 미니바디, 단편화 항체 등을 들 수 있다.
핵산류의 예로는, 예를 들어, DNA, RNA, 안티센스, 데코이, 리보자임, 저분자 간섭 RNA, RNA 앱타머 등을 들 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체의 겔 중에, 약물을 봉입하여, 혹은, 본 발명의 히알루론산 유도체-약물 결합체는 1 종 혹은 그 이상의 약학적으로 허용할 수 있는 희석제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보조제, 방부제, 완충제, 결합제, 안정제 등을 포함하는 의약 조성물로서, 목적으로 하는 투여 경로에 따라, 적당한 임의의 형태로 하여 투여할 수 있다. 투여 경로는 비경구적 경로여도 되고 경구적 경로여도 된다.
본 발명에 의해, 종래의 서방성 제제에서는 얻어지지 않는, 단백질, 펩티드, 핵산, 저분자 화합물과 같은 약물을 장기간 서방할 수 있으며, 및/또는, 적절한 생분해성을 갖는 안전성이 높은 서방성 제제 및 의약 조성물을 제공하는 것이 가능하다.
실시예
이하, 본 발명의 바람직한 구체적 양태를 실시예로서 설명한다.
또, 이하의 기재 중의 HA 유닛이란, 히알루론산 중의 N-아세틸글루코사민-글루크론산의 반복 단위 (1 유닛) 를 의미한다. 1H-NMR 스펙트럼 측정에는, 니혼 전자 주식회사 제조 JNM-ECA500 을 사용하였다. 투석에는 재생 셀룰로오스제 투석막 (분자량 50 kDa 및 99 kDa 의 히알루론산나트륨염을 출발 원료로 할 때에는 스펙트라 포어 4:분획 분자량 12 k ∼ 14 kDa, 분자량 10 kDa 의 히알루론산나트륨염을 출발 원료로 할 때에는 스펙트라 포어 7:분획 분자량 1 kDa 혹은 2 kDa) 을 사용하였다.
[실시예 1] 히알루론산 유도체의 합성
(실시예 1-1) 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트염산염의 조제
콜레스테릴 클로로포르메이트 (3.37 g, 7.5 m㏖) 의 무수 디클로로메탄 (20 ㎖) 의 용액에, 아르곤 분위기하, 트리에틸아민 (TEA, 1.05 ㎖) 을 첨가하여 교반하였다. 빙랭하에서, 6-(t-부톡시카르보닐)아미노-1-아미노헥산 (1.12 ㎖, 5 m㏖) 을 적하하여 첨가하고, 그대로 빙랭하에서 30 분간 교반 후, 실온까지 승온하고, 당해 혼합물을 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을, 초순수 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하에서 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액:아세트산에틸:n-헥산 = 1:4) 로 정제하고, 목적물의 프랙션을 합쳐 용매를 감압하 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 아세트산에틸 (40 ㎖) 에 용해하고, 4 N 염산/아세트산에틸 용액 (40 ㎖) 을 첨가하여 실온에서 하룻밤 교반하였다. 생긴 침전물을 원심 분리에 의해 회수하였다. 얻어진 고체를 아세트산에틸로 4 회 세정 후, 감압하에서 건조시켜, 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트 (Chol-C6) 의 염산염 (1.2 g) 을 얻었다. 생성물의 1H-NMR 스펙트럼 (EtOH-d6) 을 도 1-1 에 나타낸다.
(실시예 1-2) 카티온 교환 수지의 테트라부틸암모늄 (TBA) 염화
DOWEX (등록상표) 50WX-8-400 (시그마-알드리치사 제조) 을 초순수에 현탁시키고, 데칸테이션에 의해 수지를 초순수로 3 회 정도 세정하였다. 40 중량 % 테트라부틸암모늄하이드록시드 수용액 (TBA-OH) (시그마-알드리치사 제조) 을 수지의 카티온 교환능에 대해 약 1.5 몰 등량을 첨가하고, 30 분간 교반하였다. 잉여 TBA-OH 용액을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 또한, 과잉 초순수로 세정을 반복하고, 마지막에 0.45 ㎛ 의 필터를 사용하여 여과함으로써 TBA 염화한 카티온 교환 수지를 얻었다.
(실시예 1-3) HA 의 TBA 염의 조제
분자량 10 kDa, 50 kDa 및 99 kDa 의 히알루론산나트륨염 (HA-Na, 시세이도 주식회사 제조) 을 각각 15 ㎎/㎖ 의 농도로 초순수에 용해시켰다. 실시예 1-2 에서 TBA 염화한 카티온 교환 수지의 현탁액을 HA 유닛 (유닛 분자량 401.3) 의 몰수에 대해 수지의 이온 교환능 환산으로 5 몰 등량 첨가하였다. 15 분간 교반한 후, 0.45 ㎛ 의 필터를 사용하여 여과를 실시하고, 여과액을 동결 건조시켜, 히알루론산의 TBA 염 (HA-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다.
대표예로서 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 생성물의 D2O 를 용매로 한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-2 에 나타낸다. HA 의 글루코사민의 아세틸 유래의 시그널 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, TBA 의 4 개의 에틸렌 유래의 시그널 (N(CH2CH2CH2CH3)4, 1.4, 1.7 ppm;16H) 의 적분값으로부터, HA 유닛에 대한 TBA 의 양비를 산출하고, 이 비로부터 HA-TBA 의 유닛 평균 분자량을 산출하였다. 예를 들어, 99 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 의 유닛 평균 분자량은 752.6 이었다.
(실시예 1-4) L-알라닌 (Ala) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Ala-Chol/FL) 의 합성
실시예 1-3 에서 합성한, HA-Na (10 kDa, 50 kDa, 99 kDa) 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 의 무수 DMSO 용액 (5 ㎎/㎖) 을 조제하였다. 그 후, L-알라닌에틸에스테르염산염 (알드리치사 제조) 을 HA 유닛에 대해 5 몰 등량 첨가하고, 다음으로 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (DMT-MM) 를 HA 유닛에 대해 6 몰 등량 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은 0.3 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하였다. 얻어진 투석액에 2 N NaOH 를 첨가하고 pH 12.5 이상으로 하여, 1 시간 교반하여 에틸에스테르를 가수 분해하고, 카르복시의 탈보호를 실시하였다. 그 후, 2 N HCl 을 사용하여 중화를 실시하고, 또한 투석을 실시한 후, 동결 건조시켜 HA-Ala 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 에 기재와 동일한 조건으로 측정한 HA-Ala 의 1H-NMR 스펙트럼의 대표예 (99 kDa 의 HA 를 출발 원료로서 사용한 생성물) 를 도 1-3 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 알라닌 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.4 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 아래에 나타내는 식으로부터 HA 유닛에 있어서의 알라닌의 도입률 (Ala 도입률) 을 산출하였다 (표 1).
[수학식 2]
HA-Ala 수용액에 대해, 실시예 1-2 에서 TBA 염화한 카티온 교환 수지의 현탁액을 약 5 몰 등량 첨가하고, 15 분간 교반한 후, 0.45 ㎛ 의 필터를 사용하여 여과를 실시하고, 여과액을 동결 건조시켜, HA-Ala 의 TBA 염 (HA-Ala-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 에 기재와 동일한 조건으로 측정한 HA-Ala-TBA 의 1H-NMR 스펙트럼으로부터, 실시예 1-3 에 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 TBA 의 양비를 산출하고, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크의 적분값과, 내부 표준으로서 사용한 3-(트리메틸실릴)프로피온산나트륨-d4 (TSP-d4) 의 메틸 유래의 피크 (-Si(CH3)3, 0.0 ppm;9H) 의 적분값으로부터 중량당 HA 유닛 함량을 정량하였다.
HA-Ala-TBA 의 무수 DMSO 용액 (10 ㎎/㎖) 을 조제하고, 그 후, 실시예 1-1 에서 조제한 Chol-C6 염산염을 HA-Ala-TBA 유닛에 대해 이하의 표 1 에 나타내는 비율로 각 용액에 첨가하였다. 다음으로, DMT-MM 을 HA-Ala-TBA 에 대해 이하의 표 1 에 나타내는 비율로 첨가하고, 추가로 5-아미노메틸플루오레세인 (FL) 염산염 (인비트로젠사 제조), DMT-MM 을 HA-Ala-TBA 유닛에 대해 각각 0.04 몰 등량, 0.07 몰 등량 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은 0.3 M 아세트산암모니아/DMSO 용액, 0.15 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하고, 얻어진 투석액을 동결 건조시켜 목적물 (HA-Ala-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다.
측정 용매로서 0.02 N DCl DMSO-d6/D2O 혼액 (2N DCl D2O:DMSO-d6 = 1:99) 을 사용한 1H-NMR 스펙트럼의 대표예 (99 kDa 의 HA 를 출발 원료로서 사용하고, 콜레스테릴기의 도입률이 7 % 인 생성물) 를 도 1-4 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (COCH3, 1.6 ∼ 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 콜레스테릴기 중의 메틸 유래의 피크 (CH3, 0.7 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 아래에 나타내는 식으로부터 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 1). 또한 글루코사민의 아세틸 유래의 피크가 포함되는 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크에는 콜레스테릴기 유래의 피크 (5H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크의 적분값으로부터 콜레스테릴기 메틸 유래의 피크 (0.7 ppm) 의 적분값을 5/3 한 것을 빼어 산출한 값 (즉, 적분값 (1.6 ∼ 2.0 ppm) - 적분값 (0.7 ppm) × 5/3) 을 HA 유래의 아세틸의 적분값으로 하여, 도입률의 계산에 사용하였다.
[수학식 3]
[표 1]
또한, 여기서는, Chol-C6 염산염의 아미노가 반응 가능한 기로는, 히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시와 Ala 의 카르복시의 양방을 들 수 있다. 이와 같이 2 종류의 반응점에 소수성기가 도입 가능한 경우에는, 목적물의 약칭에 있어서 「-Chol」 과 같이, 하이픈을 사용하여 나타낸다.
(실시예 1-5) L-트레오닌아미드 (ThrNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-ThrNH2/Chol/FL) 의 합성
실시예 1-3 에서 조제한, HA-Na (99 kDa) 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 의 무수 DMSO 용액 (10 ㎎/㎖) 을 조제하였다. 그 후, 실시예 1-1 에서 조제한 Chol-C6 염산염을 HA 유닛에 대해 이하의 표 2 에 나타내는 비율로 각 용액에 첨가하였다. 다음으로 DMT-MM 을 HA 유닛에 대해 이하의 표 2 에 나타내는 비율로 첨가하고, 추가로 5-아미노메틸플루오레세인 (FL) 염산염 (인비트로젠사 제조), DMT-MM 을 HA 유닛에 대해 각각 0.04 몰 등량, 0.07 몰 등량 첨가하고, 실온에서 7 시간 교반하였다. 그 후, L-트레오닌아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 HA 유닛에 대해 3 몰 등량 첨가하고, 다음으로 DMT-MM 을 HA 유닛에 대해 5 몰 등량을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은 0.3 M 아세트산암모니아/DMSO 용액, 0.15 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하고, 얻어진 투석액을 동결 건조시켜 목적물 (HA-ThrNH2/Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다.
측정 용매로서 0.02 N DCl DMSO-d6/D2O 혼액 (2N DCl D2O:DMSO-d6 = 1:99) 을 사용한 1H-NMR 스펙트럼의 대표예 (99 kDa 의 HA 를 출발 원료로서 사용하고, 콜레스테릴기의 도입률이 6 % 인 생성물) 를 도 1-5 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (COCH3, 1.6 ∼ 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 콜레스테릴기 중의 메틸 유래의 피크 (CH3, 0.7 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 아래에 나타내는 식으로부터 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 2). 또한 글루코사민의 아세틸 유래의 피크가 포함되는 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크에는 콜레스테릴기 유래의 피크 (5H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크의 적분값으로부터 콜레스테릴기 메틸 유래의 피크 (0.7 ppm) 의 적분값을 5/3 한 것을 빼어 산출한 값 (즉, 적분값 (1.6 ∼ 2.0 ppm) - 적분값 (0.7 ppm) × 5/3) 을 HA 유래의 아세틸의 적분값으로 하여, 도입률의 계산에 사용하였다.
[수학식 4]
또, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크의 적분값과, 트레오닌아미드의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.2 ppm;3H) 의 적분값으로부터, HA 유닛에 있어서의 트레오닌아미드의 도입률을 산출하였다 (표 2).
[수학식 5]
[표 2]
또한, 여기서는, Chol-C6 염산염의 아미노는 히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시하고만 반응하고, 도입된 ThrNH2 에 추가로 소수성기가 도입되는 경우는 없다. 이와 같이, 히알루론산의 글루크론산 부분의 카르복시에만 소수성기를 도입할 수 있는 경우를, 목적물의 약칭에 있어서 「/Chol」 과 같이, 슬래시를 사용하여 나타낸다.
(실시예 1-6) L-세린 (Ser) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Ser-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-세린에틸에스테르염산염 (알드리치사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Ser 을 백색 고체로서 얻었다. 또, 카르복시를 탈보호하기 전의 투석 용액의 일부를 채취하여 동결 건조시켜 도입률 산출용 샘플로 하였다 (HA-Ser-OEt). 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 도입률 산출용 샘플의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-6 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.9 ppm;3H) 의 적분값과, 세린의 에틸에스테르 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.2 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 세린의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또, 탈보호한 샘플을 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-7 에 나타낸다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Ser 의 TBA 염 (HA-Ser-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Ser-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-8 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-7) L-글리신 (Gly) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Gly-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 글리신에틸에스테르염산염 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Gly 를 백색 고체로서 얻었다. 또, 카르복시를 탈보호하기 전의 투석 용액의 일부를 채취하여 동결 건조시켜 도입률 산출용 샘플로 하였다 (HA-Gly-OEt). 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 도입률 산출용 샘플의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-9 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 글리신의 에틸에스테르 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.3 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 글리신의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또, 탈보호한 샘플을 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-10 에 나타낸다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Gly 의 TBA 염 (HA-Gly-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Gly-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-11 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-8) L-트레오닌 (Thr) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Thr-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-트레오닌메틸에스테르의 염산염 (Bachem 사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Thr 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-12 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 트레오닌 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.2 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 트레오닌의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Thr 의 TBA 염 (HA-Thr-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Thr-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-13 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-9) L-아스파라긴 (Asn) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Asn-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-아스파라긴메틸에스테르염산염 (Bachem 사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Asn 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-14 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 아스파라긴의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CONH2, 2.7, 2.8 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 아스파라긴의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Asn 의 TBA 염 (HA-Asn-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Asn-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-15 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-10) L-아스파르트산 (Asp) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Asp-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-아스파르트산디에틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Asp 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-16 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 아스파르트산 중의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2COOH, 2.7, 2.8 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 아스파르트산의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Asp 의 TBA 염 (HA-Asp-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Asp-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-17 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-11) L-이소류신 (Ile) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Ile-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-이소류신메틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Ile 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-18 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 이소류신 중의 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)CH2CH3, 0.9 ppm;6H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 이소류신의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 이소류신의 3 위치의 수소의 피크 (-CH(CH3)CH2CH3, 1.9 ppm;1H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 0.9 ppm 의 피크의 적분값에 1/6 을 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Ile 의 TBA 염 (HA-Ile-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Ile-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-19 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-12) L-류신 (Leu) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Leu-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-류신에틸에스테르염산염 (토쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Leu 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-20 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 류신 중의 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)2, 0.9 ppm;6H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 류신의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Leu 의 TBA 염 (HA-Leu-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Leu-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-21 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-13) L-발린 (Val) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Val-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-발린에틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Val 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-22 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 발린 중의 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)2, 0.9 ppm;6H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 발린의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 발린의 3 위치의 수소의 피크 (-CH(CH3)2, 2.1 ppm;1H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 0.9 ppm 의 피크의 적분값에 1/6 을 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Val 의 TBA 염 (HA-Val-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Val-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-23 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
(실시예 1-14) L-페닐알라닌 (Phe) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Phe-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-페닐알라닌에틸에스테르염산염 (알드리치사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Phe 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-24 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 페닐알라닌 중의 페닐 유래의 피크 (-C6H5, 7.2 ∼ 7.4 ppm;5H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 페닐알라닌의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Phe 의 TBA 염 (HA-Phe-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Phe-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-25 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 3).
[표 3]
(실시예 1-15) L-세린아미드 (SerNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-SerNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-세린아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-SerNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-26 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 4). 또, 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-27 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 세린아미드의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2-, 3.9 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-5 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 세린아미드의 도입률을 산출하였다 (표 4). 또한, 세린아미드의 메틸렌 유래의 피크에는, 글루크론산의 2 ∼ 5 위치의 피크 (4H), 글루코사민의 2 ∼ 6 위치의 피크 (6H) 가 겹쳐 있기 때문에, 3.2 ∼ 4.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터, 2.0 ppm 의 피크의 적분값에 10/3 을 곱한 값을 뺀 값을 세린아미드의 메틸렌 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
(실시예 1-16) L-글리신아미드 (GlyNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-GlyNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 글리신아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-GlyNH2/Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다.
실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-28 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 4). 또, 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-29 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 글리신아미드의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2-;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-5 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 글리신아미드의 도입률을 산출하였다 (표 4). 또한, 글리신아미드의 메틸렌 유래의 피크에는, 글루크론산의 2 ∼ 5 위치의 피크 (4H), 글루코사민의 2 ∼ 6 위치의 피크 (6H) 가 겹쳐 있기 때문에, 실시예 1-15 와 동일한 방법으로 글리신아미드의 메틸렌 유래의 피크의 적분값을 산출하였다.
(실시예 1-17) L-류신아미드 (LeuNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-LeuNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-류신아미드염산염 (토쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-LeuNH2/Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다.
실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-30 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 4). 또, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.9 ppm;3H) 의 적분값과, 류신아미드의 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)2, 0.9 ppm;6H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-5 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 류신아미드의 도입률을 산출하였다 (표 4).
(실시예 1-18) L-발린아미드 (ValNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-ValNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-발린아미드염산염 (토쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-ValNH2/Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다.
실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-31 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 4). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.9 ppm;3H) 의 적분값과, 발린아미드의 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)2, 1.0 ppm;6H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-5 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 발린아미드의 도입률을 산출하였다 (표 4).
[표 4]
(실시예 1-19) L-알라닌 (Ala) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Ala/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-알라닌에틸에스테르염산염 (알드리치사 제조) 을 사용하고, 초순수 투석 중에 투석액을 한 번 취출하여 2 N NaOH 로 카르복시의 탈보호를 실시한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Ala/Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-32 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 5). 또, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.9 ppm;3H) 의 적분값과, 알라닌 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.3 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 알라닌의 도입률을 산출하였다 (표 5). 또한, 알라닌의 메틸 유래의 피크에는 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트 유래의 피크 (0.8 ∼ 1.6 ppm, 41H) 가 겹쳐 있기 때문에, 0.8 ∼ 1.6 ppm 의 피크의 적분값으로부터 0.7 ppm 의 피크의 적분값에 41/3 을 곱한 값을 뺀 값을 알라닌의 메틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
(실시예 1-20) L-세린 (Ser) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Ser/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-세린에틸에스테르염산염 (알드리치사 제조) 을 사용하고, 초순수 투석 중에 투석액을 한 번 취출하여 2 N NaOH 로 카르복시의 탈보호를 실시한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Ser/Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 또, 카르복시를 탈보호하기 전의 투석 용액의 일부를 채취하여 동결 건조시켜 도입률 산출용 샘플로 하였다 (HA-Ser-OEt/Chol/FL). 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 도입률 산출용 샘플의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-33 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.3 ppm;3H) 의 적분값과, 세린의 에틸에스테르 중의 메틸 유래의 피크 (-CH3, 1.6 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-6 과 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 세린의 도입률을 산출하였다 (표 5). 또, 탈보호한 샘플을 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-34 에 나타낸다. 실시예 1-5 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 5).
[표 5]
(실시예 1-21) 형광 표지되어 있지 않은 히알루론산 유도체의 합성
5-아미노메틸플루오레세인을 첨가하지 않은 것 이외는 실시예 1-4 (Ala), 실시예 1-5 (ThrNH2), 실시예 1-15 (SerNH2), 실시예 1-18 (ValNH2) 에 기재된 방법에 의해 HA-Ala-Chol, HA-ThrNH2/Chol, HA-SerNH2/Chol, HA-ValNH2/Chol 을 백색 고체로서 얻었다. 대응하는 실시예의 기재와 동일한 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률 그리고 아미노산 및 아미노산아미드의 도입률을 산출하였다 (표 6).
[표 6-1]
[표 6-2]
(비교예 1-1) 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Chol/FL) 의 합성
실시예 1-3 에서 조제한, HA-Na (10k, 50k, 99 kDa) 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 의, 무수 DMSO 용액 (10 ㎎/㎖) 을 조제하였다. 그 후, 실시예 1-1 에서 조제한 Chol-C6 염산염을 HA 유닛에 대해 이하의 표 7 에 나타내는 비율로 각 용액에 첨가하였다. 다음으로 DMT-MM 을 HA 유닛에 대해 이하의 표 7 에 나타내는 비율로 첨가하고, 추가로 5-아미노메틸플루오레세인 (FL) 염산염 (인비트로젠사 제조), DMT-MM 을 HA 유닛에 대해 각각 0.04 몰 등량, 0.07 몰 등량 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은 0.3 M 아세트산암모니아/DMSO 용액, 0.15 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하고, 얻어진 투석액을 동결 건조시켜 목적물 (HA-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다.
측정 용매로서 0.02 N DCl DMSO-d6/D2O 혼액 (2N DCl D2O:DMSO-d6 = 1:99) 을 사용한 1H-NMR 스펙트럼의 대표예 (99 kDa 의 HA 를 출발 원료로서 사용하고, 콜레스테릴기의 도입률이 6 % 인 생성물) 를 도 1-35 에 나타낸다. HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률은 실시예 1-4 에 기재된 방법으로 산출하였다 (표 7).
[표 7]
(비교예 1-2) EDOBEA 에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-EDOBEA-Ac/FL) 의 합성
실시예 1-3 에서 합성한, HA-Na (99 kDa) 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 의 무수 DMSO 용액 (5 ㎎/㎖) 을 조제하였다. 그 후, HA 유닛/BOP (와코 쥰야쿠 주식회사 제조)/2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (EDOBEA, 시그마-알드리치사 제조) = 1/2.5/50 (㏖/㏖/㏖) 의 등량비로 EDOBEA, BOP 의 순서로 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은, 0.3 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석한 후, 동결 건조시켜 고 도입률의 HA-EDOBEA 를 얻었다.
실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 고도입률의 HA-EDOBEA 의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-36 에 나타낸다. 또한 측정시에, NaOD 를 0.0046 N 이 되도록 첨가하고, 용액이 알칼리성이 되도록 하였다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, EDOBEA 말단의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2NH2, 2.8 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 EDOBEA 의 도입률을 산출한 결과, 82 % 였다.
다음으로, 얻어진 고도입률의 HA-EDOBEA 를 초순수로 10 ㎎/㎖ 가 되도록 용해시킨 후, 100 mM 의 인산 완충 용액 (pH 7.4) 으로 2 배 희석하여 5 ㎎/㎖ 용액을 조제하였다. 이 용액에 HA 유닛에 대해 0.04 몰 등량의 NHS-플루오레세인을 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 1 시간 교반한 후, HA 유닛에 대해 40 몰 등량의 무수 아세트산 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 첨가하여 추가로 1 시간 교반함으로써, 여분 EDOBEA 의 말단 아미노를 아세틸화하였다. 반응 용액은, 0.3 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 차광하에서 투석을 실시한 후, 동결 건조시켜 HA-EDOBEA-Ac/Fl 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-37 에 나타낸다.
(비교예 1-3) L-티로신 (Tyr) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Tyr-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-티로신에틸에스테르염산염 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Tyr 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-38 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 티로신 중의 하이드록시페닐 유래의 피크 (-C6H4OH, 6.8, 7.2 ppm;4H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 티로신의 도입률을 산출하였다 (표 8). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Tyr 의 TBA 염 (HA-Tyr-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 을 반응시키고, 목적물 (HA-Tyr-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 1-39 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 8)
[표 8]
[실시예 2] in vivo 에서의 혈중 체류성 및 생분해성의 확인
(실시예 2-1) HA 유도체를 투여한 래트로부터의 생체 샘플 채취
실시예 1-4 ∼ 1-20 및 비교예 1-1 및 1-3 에서 얻어진 화합물을 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 투여 후 5 분, 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 및 336 시간에서 헤파린 나트륨 처리한 시린지를 사용하여 경정맥 채혈하고, 원심 분리에 의해 혈장을 얻었다. 비교예의 샘플 중에는 투여 후 96 시간에 있어서도 채혈한 것도 있다. 이 혈장 샘플은 측정까지 -20 ℃ 이하에서 동결 보존하였다. 또, 투여 후 0 ∼ 24 시간, 24 ∼ 48 시간, 48 ∼ 72 시간, 72 ∼ 96 시간, 168 ∼ 192 시간, 240 ∼ 264 시간, 및 336 ∼ 360 시간에서 대사 케이지를 사용하여 채뇨하고, 측정까지 -20 ℃ 이하에서 동결 보존하였다. 또한, 투여 15 일 후에 간장을 적출하고, 측정까지 -20 ℃ 이하에서 동결 보존하였다. 비교예 1-2 에서 얻어진 화합물은 20 ㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 채뇨 그리고 간장 적출을 실시하였다.
(실시예 2-2) HA 유도체를 투여한 래트의 혈장 분석
혈장 샘플을 융해 후, HP-β-CD (100 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0) 용액으로 2 배 희석하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 후, 96 구멍 플레이트 리더 (ARVO) 로 형광 표지 HA 유도체 농도를 측정하였다 (정량 한계:0.4 ㎍/㎖). 형광 표지 HA 유도체의 혈장 중 농도 추이를 도 2-1-1 ∼ 도 2-1-26 에 나타내었다. 또, 약물 동태 파라미터 (혈장 중 농도-시간 곡선 아래 면적 외삽값 (AUC∞)) 을 WinNonlin Ver. 6.1 (Pharsight 사 제조) 에 의해 해석하고, 그 값을 표 9 에 나타내었다. 또, 이하의 식에 의해 산출되는, 동일한 정도로 콜레스테롤이 도입된 비교 샘플에 대한 AUC∞ 의 비율을 표 10 에 나타내었다.
[수학식 6]
[표 9]
[표 10]
카르복시에 아미노산 또는 아미노산아미드를 도입하고, 추가로 콜레스테릴기를 도입한 HA 유도체 (샘플 2-1 ∼ 2-25) 는, 카르복시에 콜레스테릴기만을 도입한 HA 유도체 (비교 샘플 2-1 ∼ 2-7) 와 비교하여, 우위에 혈장 중 농도를 유지하는 것이 분명해졌다.
(실시예 2-3) HA 유도체를 투여한 래트의 간장 분석
약 1 g 의 간장 샘플에 트리스 버퍼 (10 mM, pH 9.0) 를 첨가하고, 비드를 사용하여 호모지네이트하였다. 4 ㎎/㎖ 프로나제 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 원심 분리 후, HP-β-CD (100 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0) 용액으로 2 배 희석하고, 추가로 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 후, 필터 여과하고, 이하의 조건으로 사이즈 배제 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 또한, 샘플 비투여 래트의 간장도 동일한 처리를 실시하고, 투여 전 샘플과 혼합한 것을, 스탠더드로 하여 동일하게 분석을 실시하였다.
사이즈 배제 크로마토그래피 분석 조건
분석 칼럼:TSKgel G5000PWXL (토소 주식회사)
칼럼 온도:25 ℃
이동상:HP-β-CD (10 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0)
유속:0.5 ㎖/min
검출:Ex 494 ㎚/Em 515 ㎚
주입량:50 ㎕
결과를 도 2-2-1 ∼ 도 2-2-27 에 나타낸다. 크로마토그램은 각각의 최강 피크에서 노멀라이즈되어 있다. 비교예 1-2 의 HA 유도체 (HA-EDOBEA-Ac/FL, 도 2-2-26) 에서는, 간장 중에 있어서 전혀 저분자화가 관찰되지 않았던 것에 반해, 실시예의 HA 유도체는 모두 저분자화한 투여 화합물이 검출되었다. 이것은 본 발명의 HA 유도체가 생분해성을 갖는 것을 나타내고 있다. 또, 체내에서 분해 후, 소변 또는 대변으로 체외로 배설되는 것으로 생각된다.
(실시예 2-4) HA 유도체 투여 래트뇨의 분석
소변 샘플을 0.22 ㎛ 의 필터로 여과하고, HP-β-CD (100 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0) 용액으로 2 배 희석하였다. 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 후, 필터 여과하고, 실시예 2-3 에 기재된 조건으로 사이즈 배제 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 또한, 샘플 비투여 래트의 소변 샘플도 동일한 처리를 실시하고, 투여 전 샘플과 혼합한 것을, 스탠더드로 하여 동일하게 분석을 실시하였다.
결과를 도 2-3-1 ∼ 도 2-3-27 에 나타낸다. 왼쪽에 각 시점의 크로마토그램을 동일한 레인지로 나타내고, 오른쪽에 각 시점의 크로마토그램을 최강 피크에서 노멀라이즈한 도면을 나타낸다. 투여 후 0 ∼ 24 시간, 24 ∼ 48 시간, 48 ∼ 72 시간, 72 ∼ 96 시간, 168 ∼ 192 시간, 240 ∼ 264 시간, 및 336 ∼ 360 시간에서 채뇨한 샘플을 각각 0-1d, 1-2d, 2-3d, 3-4d, 7-8d, 10-11d, 및 14-15d 로 하여, 또 각각의 스탠더드를 STD 로 하여 도 중에 나타낸다.
비교예 1-2 의 HA 유도체 (HA-EDOBEA-Ac/FL) 에서는, 저분자화한 투여 화합물이 소변 중에 관찰되지 않았던 것에 반해, 실시예의 HA 유도체에는, 저분자화한 투여 화합물이 소변 중에 검출된 것도 있었다. 이것은, 본 발명의 HA 유도체의 생분해성을, 소변을 조사함으로써 간편하게 평가할 수 있는 경우가 있는 것을 나타내고 있다.
[실시예 3] 히알루론산 유도체의 합성
(실시예 3-1) L-글루타민 (Gln) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Gln-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-글루타민메틸에스테르염산염 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Gln 을 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-1 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 글루타민의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CH2CONH2, 2.3, 2.4 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 글루타민의 도입률을 산출하였다 (표 11). 또한, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 글루타민의 다른 메틸렌의 피크 (-CH2CH2CONH2, 2.1 ppm;2H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 2.3, 2.4 ppm 의 피크의 적분값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 수식률의 산출에 사용하였다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Gln 의 TBA 염 (HA-Gln-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Gln-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-2 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 11).
(실시예 3-2) L-메티오닌 (Met) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Met-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-메티오닌에틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Met 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-3 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 메티오닌의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2SCH3, 2.6 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 메티오닌의 도입률을 산출하였다 (표 11). 또한, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 메티오닌의 다른 메틸렌과 메틸 유래의 피크 (-CH2CH2SCH3, 2.1 ppm;5H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 2.6 ppm 의 피크의 적분값에 5/2 를 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Met 의 TBA 염 (HA-Met-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Met-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-4 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 11).
[표 11]
(실시예 3-3) L-알라닌아미드 (AlaNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-AlaNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-알라닌아미드염산염 (토쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-AlaNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-5 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 12). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 알라닌아미드의 메틸 유래의 피크 (-CH3-, 1.3 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-5 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 알라닌아미드의 도입률을 산출하였다 (표 12). 또한, 알라닌아미드의 메틸 유래의 피크에는, 콜레스테릴 유래의 피크 (41H) 가 겹쳐 있기 때문에, 0.8 ∼ 1.6 ppm 의 피크의 적분값으로부터, 0.7 ppm 의 피크의 적분값에 41/3 을 곱한 값을 뺀 값을 알라닌아미드의 메틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
(실시예 3-4) L-아스파라긴아미드 (AsnNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-AsnNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-아스파라긴아미드염산염 (코쿠산 화학 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-AsnNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-6 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 12). 또, 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-7 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 아스파라긴아미드의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CONH2, 2.7, 2.8 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 아스파라긴아미드의 도입률을 산출하였다 (표 12).
(실시예 3-5) L-이소류신아미드 (IleNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-IleNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-이소류신아미드염산염 (토쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-IleNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-8 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 12). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 이소류신아미드 중의 메틸렌 그리고 2 개의 메틸 유래의 피크 (-CH(CH3)CH2CH3, 0.9 ppm;8H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 이소류신아미드의 도입률을 산출하였다 (표 3). 또한, 이소류신아미드의 메틸 유래의 피크에는, 콜레스테릴 유래의 피크 (41H) 가 겹쳐 있기 때문에, 0.8 ∼ 1.6 ppm 의 피크의 적분값으로부터, 0.7 ppm 의 피크의 적분값에 41/3 을 곱한 값을 뺀 값을 이소류신아미드의 메틸렌 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다. 또, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 이소류신의 3 위치의 수소의 피크 (-CH(CH3)CH2CH3, 1.9 ppm;1H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 0.8 ∼ 1.6 ppm 의 피크의 적분값에 1/8 을 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
(실시예 3-6) L-글루타민아미드 (GlnNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-GlnNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-글루타민아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-GlnNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-9 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 12). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 글루타민아미드 중의 메틸렌 유래의 피크 (-CH 2 CH2CONH2, 2.1 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 글루타민아미드의 도입률을 산출하였다 (표 12). 또한, 글루타민아미드의 메틸 유래의 피크에는, 콜레스테릴 유래의 피크 (2H) 가 겹쳐 있기 때문에, 0.7 ppm 의 피크의 적분값에 2/3 을 곱한 값을 뺀 값을 글루타민아미드의 메틸렌 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다. 또, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 글루타민아미드 중의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CH 2 CONH2, 1.9 ppm;2H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.0 ppm 의 피크의 적분값으로부터 2.1 ppm 의 피크의 적분값에 2/2 를 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
(실시예 3-7) L-메티오닌아미드 (MetNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-MetNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-메티오닌아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-MetNH2-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-10 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 12). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 메티오닌아미드 중의 메틸 유래의 피크 (-SCH3, 2.1 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 메티오닌아미드의 도입률을 산출하였다 (표 12). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 메티오닌아미드 중의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2SCH3, 1.9 ppm;2H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.0 ppm 의 피크의 적분값으로부터 2.1 ppm 의 피크의 적분값에 2/3 을 곱한 값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 도입률의 산출에 사용하였다.
[표 12]
(비교예 3-1) L-글루탐산 (Glu) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Glu-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-글루탐산디에틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Glu 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-11 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 글루탐산의 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CH2COOH, 2.4 ppm;2H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 글루탐산의 도입률을 산출하였다 (표 13). 또한, 글루코사민의 아세틸 유래의 피크에는, 글루탐산의 다른 메틸렌 유래의 피크 (-CH2CH2COOH, 2.1 ppm;2H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.8 ∼ 2.2 ppm 의 피크의 적분값으로부터 2.4 ppm 의 피크의 적분값을 뺀 값을 글루코사민의 아세틸 유래의 피크로 하여, 수식률의 산출에 사용하였다. 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Glu 의 TBA 염 (HA-Glu-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Glu-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-12 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 13).
(비교예 3-2) L-트립토판 (Trp) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Trp-Chol/FL) 의 합성
L-알라닌에틸에스테르염산염 대신에 L-트립토판에틸에스테르염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-Trp 를 백색 고체로서 얻었다. 실시예 1-3 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-13 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 트립토판의 인돌 고리 유래의 피크 (-C8H6N, 7.8 ppm;1H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 트립토판의 도입률을 산출하였다 (표 13). 또한, 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 HA-Trp 의 TBA 염 (HA-Trp-TBA) 을 백색 고체로서 얻었다. 다음으로, 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 Chol-C6 염산염, FL 과 반응시키고, 목적물 (HA-Trp-Chol/FL) 을 황색 고체로서 얻었다. 실시예 1-4 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 1H-NMR 스펙트럼을 도 3-14 에 나타낸다. 실시예 1-4 에 기재된 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 13).
(비교예 3-3) L-티로신 (Tyr) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-Tyr-Chol/FL) 의 합성
10 kDa 의 HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-TBA 를 사용한 것 이외에는, 비교예 1-3 과 동일한 방법으로 실시하고, 10k 의 HA-Tyr-Chol/FL 을 황색 고체로서 얻었다. 티로신 그리고 콜레스테릴기의 도입률도 비교예 1-3 과 동일한 방법으로 산출하였다 (표 13).
[표 13]
(실시예 3-8) 형광 표지되어 있지 않은 히알루론산 유도체의 합성
5-아미노메틸플루오레세인을 첨가하지 않은 것, 그리고 출발 원료로서 사용한 HA-Na 의 분자량이 상이한 것 이외에는 실시예 1-4 ∼ 실시예 1-18 그리고 실시예 3-1 ∼ 실시예 3-7 그리고 비교예 3-1 ∼ 비교예 3-3 에 기재된 방법에 의해 각종 히알루론산 유도체를 백색 고체로서 얻었다. 대응하는 실시예의 기재와 동일한 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률 그리고 아미노산 및 아미노산아미드의 도입률을 산출하였다 (표 14-1, 표 14-2). 원료 히알루론산은, 5 kDa 만 R & D 시스템사 제조를 사용하고, 그 이외는 시세이도사 제조의 것을 사용하였다.
[표 14-1]
[표 14-2]
[실시예 4] in vivo 에서의 혈중 체류성 및 생분해성의 확인
(실시예 4-1) HA 유도체를 투여한 래트로부터의 생체 샘플 채취
실시예 3-1 ∼ 3-7 및 비교예 3-1 ∼ 3-3 에서 얻어진 화합물을 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 투여 후 5 분, 2, 7, 24, 48, 72 및 168 시간에서 헤파린 나트륨 처리한 시린지를 사용하여 경정맥 채혈하고, 원심 분리에 의해 혈장을 얻었다. 비교예의 샘플 중에는 투여 후 96 시간에 있어서도 채혈한 것도 있다. 이 혈장 샘플은 측정까지 -20 ℃ 이하에서 동결 보존하였다. 또, 투여 7 일 후에 간장을 적출하고, 측정까지 -20 ℃ 이하에서 동결 보존하였다.
(실시예 4-2) HA 유도체를 투여한 래트의 혈장 분석
혈장 샘플을 융해 후, HP-β-CD (100 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0) 용액으로 2 배 희석하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 후, 96 구멍 플레이트 리더 (ARVO) 로 형광 표지 HA 유도체 농도를 측정하였다 (정량 한계:0.4 ㎍/㎖). 형광 표지 HA 유도체의 혈장 중 농도 추이를 도 4-1-1 ∼ 도 4-1-10 에 나타내었다. 또, 약물 동태 파라미터 (혈장 중 농도-시간 곡선 아래 면적 외삽값 (AUC∞)) 를 WinNonlin Ver. 6.1 (Pharsight 사 제조) 에 의해 해석하고, 그 값을 표 15 에 나타내었다. 또, 이하의 식에 의해 산출되는, 동일한 정도로 콜레스테롤이 도입된 비교 샘플에 대한 AUC∞ 의 비율을 표 16 에 나타내었다.
[수학식 7]
[표 15]
[표 16]
카르복시에 아미노산 또는 아미노산아미드를 도입하고, 또한, 콜레스테릴기를 도입한 HA 유도체 (샘플 4-1 ∼ 4-7) 는, 카르복시에 콜레스테릴기만을 도입한 HA 유도체 (비교 샘플 2-1) 와 비교하여, 우위에 혈장 중 농도를 유지하는 것이 분명해졌다. 또한, 10k HA-Tyr-Chol-7%/FL (비교 샘플 4-3) 은 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (비교 샘플 2-8) 과 동일하게 카르복시에 콜레스테릴기만을 도입한 HA 유도체와 비교하여 혈중 체류성이 저하되었다. 한편, 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (샘플 2-1), 10k HA-Ala-Chol-16%/FL (샘플 2-7) 은 모두 카르복시에 콜레스테릴기만을 도입한 HA 유도체와 비교하여 우위에 또는 동등하게 혈장 중 농도를 유지하였다. 이로부터, 카르복시에 도입하는 아미노산의 차이에 의한 HA 유도체의 혈중 체류성의 우열은 원료 히알루론산의 분자량에는 영향받지 않는 (의존하지 않는다) 것이 시사된다.
(실시예 4-3) HA 유도체를 투여한 래트의 간장 분석
약 1 g 의 간장 샘플에 트리스 버퍼 (10 mM, pH 9.0) 를 첨가하고, 비드를 사용하여 호모지네이트 하였다. 4 ㎎/㎖ 프로나제 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 원심 분리 후, HP-β-CD (100 mM)/트리스 완충액 (500 mM, pH 9.0) 용액으로 2 배 희석하고, 또한 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 후, 필터 여과하고, 이하의 조건으로 사이즈 배제 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 또한, 샘플 비투여 래트의 간장도 동일한 처리를 실시하고, 투여 전 샘플과 혼합한 것을 스탠더드로 하여 동일하게 분석을 실시하였다.
사이즈 배제 크로마토그래피 분석 조건
분석 칼럼:TSKgel G5000PWXL (토소 주식회사)
칼럼 온도:25 ℃
이동상:HP-β-CD (10 mM)/트리스 완충액 (50 mM, pH 9.0)
유속:0.5 ㎖/min
검출:Ex 494 ㎚/Em 515 ㎚
주입량:50 ㎕
결과를 도 4-2-1 ∼ 도 4-2-10 에 나타낸다. 크로마토그램은 각각의 최강 피크에서 노멀라이즈되어 있다. 비교예 1-2 의 HA 유도체 (HA-EDOBEA-Ac/FL, 도 2-2-26) 에서는, 간장 중에 있어서 전혀 저분자화가 관찰되지 않았던 것에 반해, 실시예의 HA 유도체는 모두 저분자화한 투여 화합물이 검출되었다. 이들로부터, 본 발명의 HA 유도체는 생분해성을 갖고 있어, 체내에서 분해 후, 소변 또는 대변으로 체외로 배설되는 것으로 생각된다.
[실시예 5] 염 농도 응답형 침전 서방 제제
(실시예 5-1) L-티로신아미드 (TyrNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-TyrNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-티로신아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-TyrNH2-Chol/FL 을 황색 수용액으로서 얻었다. 동결 건조품을 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 5-1 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 17). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 티로신 중의 하이드록시페닐 유래의 피크 (-C6H4OH, 6.8, 7.2 ppm;4H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 티로신아미드의 도입률을 산출하였다 (표 17).
(실시예 5-2) L-트립토판아미드 (TrpNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-TrpNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-트립토판아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-TrpNH2-Chol/FL 을 황색 수용액으로서 얻었다. 동결 건조품을 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 5-2 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 17). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 트립토판아미드 중의 인돌 고리 유래의 피크 (-C8H6N, 7.6 ppm;1H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 트립토판아미드의 도입률을 산출하였다 (표 17).
(실시예 5-3) L-페닐알라닌아미드 (PheNH2) 그리고 콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트에 의해 수식한 형광 표지 HA 유도체 (HA-PheNH2/Chol/FL) 의 합성
L-트레오닌아미드염산염 대신에 L-페닐알라닌아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-5 와 동일한 방법으로 실시하고, HA-PheNH2-Chol/FL 을 황색 수용액으로서 얻었다. 동결 건조품을 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 5-3 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 17). 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (-COCH3, 1.8 ppm;3H) 의 적분값과, 페닐알라닌 중의 페닐 유래의 피크 (-C6H5, 7.2 ∼ 7.4 ppm;5H) 의 적분값으로부터, 실시예 1-4 와 동일하게 하여 HA 유닛에 있어서의 페닐알라닌아미드의 도입률을 산출하였다 (표 17)
[표 17]
(비교예 5-1) L-티로신아미드 (TyrNH2) 에 의해 수식한 HA 유도체 (HA-TyrNH2) 의 합성
실시예 1-3 에서 합성한, HA-Na 를 출발 원료로 하는 HA-TBA (99 kDa) 의 무수 DMSO 용액을 조제하였다. 그 후, L-티로신아미드염산염 (와타나베 화학 주식회사 제조) 을 HA 유닛에 대해 5 몰 등량 첨가하고, 다음으로 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (DMT-MM) 를 HA 유닛에 대해 3 몰 등량 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액은 0.15 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하였다. 투석 중에 침전이 생겨, 목적물을 수용액으로서 회수할 수 없었다.
(비교예 5-2) L-트립토판아미드 (TrpNH2) 에 의해 수식한 HA 유도체 (HA-TrpNH2) 의 합성
L-티로신아미드염산염 대신에 L-트립토판아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 비교예 5-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 투석 중에 침전이 생겨, 목적물을 수용액으로서 회수할 수 없었다.
(비교예 5-3) L-페닐알라닌아미드 (PheNH2) 에 의해 수식한 HA 유도체 (HA-PheNH2) 의 합성
L-티로신아미드염산염 대신에 L-페닐알라닌아미드염산염 (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 이외에는, 비교예 5-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. HA-PheNH2 를 백색 고체로서 얻었다.
(실시예 5-4)
실시예 5-1, 실시예 5-2, 비교예 5-1, 비교예 5-2 에서 합성한 HA 유도체의 물로의 투석 후의 용해 성상을 표 18 에 나타낸다.
[표 18]
샘플 5-1 그리고 샘플 5-2 는 스테릴기를 도입하지 않은 비교 샘플 5-1 그리고 비교 샘플 5-2 에 비해, 스테릴기를 도입한 경우의 쪽이, 스테릴기가 갖는 소수성에도 상관없이, 수중에서 보다 분산하는 것이 분명해졌다.
(실시예 5-5) 염 농도 의존적 침전 성능 평가
실시예 5-1, 실시예 5-2, 실시예 5-3, 실시예 3-3 에서 얻어진 HA 유도체 (99k HA-TyrNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-PheNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL) 의 수용액 (초순수) 에 대해, 최종 완충액 조성이 10 mM PB, 150 mM NaCl 이 되도록 농축 완충액을 첨가하고, HA 유도체 농도를 4.5 ㎎/㎖ 로 하였다. 37 ℃ 에서 20 분간 인큐베이트 후, 2000G 로 1 분간 원심하고, 상청액을 96 구멍 플레이트 리더 (ARVO) 로 형광 강도를 측정하였다. 스탠더드를 이용하여 형광 표지 HA 유도체 농도를 산출하고, 당초 사용량에 대한 잔존율을 산출하였다 (표 19). 동일한 조작을 비교예 1-1 에서 얻어진 99k HA-Chol-6%/FL (비교 샘플 5-3) 에 대해서도 실시하였다. 비교 샘플 5-1, 5-2 의 결과는 WO2010/053140 에 기재된 결과이다.
[표 19]
50k HA-Chol-6%/FL (비교 샘플 5-1) 은 염의 농도가 낮은 조건 (초순수) 에서도 생리 염 농도 (150 mM NaCl) 중 어느 것에 있어서도 용액 상태인 것이 WO2010/053140 에 나타나 있다. 또, 99k HA-Chol-6%/FL (비교 샘플 5-3) 도 동일한 거동을 나타내는 것이 본 실험에 의해 나타났다. 한편, 99k HA-PheNH2/Chol-6%/FL (샘플 5-3) 은 염의 농도가 낮은 조건 (초순수) 에서는 용해하고, 생리 염 농도 (150 mM NaCl) 에서는 석출한다는 염 농도 의존적인 거동을 나타내는 것이 확인되었다. 이 결과는 당 등에 의해 등장화한 저염 농도 용액을 조제함으로써 투여 후 피하에서 침전하는 제제에 있어서 본 발명의 HA 유도체가 담체로서 사용될 수 있는 가능성을 시사한다. 또, 그 침전 성능 (잔존량:1 % 이하) 은 지금까지 HA 유도체에서 보고되고 있는 값 (비교 샘플 5-2:50k HA-Chol-7%/FL:22.6 %) 과 비교하여 우위에 높은 것이었다.
99k HA-TyrNH2/Chol-6%/FL (샘플 5-1), 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL (샘플 5-2) 도 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL (샘플 5-3) 과 동일하게 염 농도 의존적인 침전 거동을 나타내고, 염 농도 의존적 침전 제제로서 유용한 것이 나타났다.
(실시예 5-6) 래트 피하에 있어서의 침전성 평가
실시예 5-1, 실시예 5-2, 실시예 5-3 에서 얻어진 형광 표지 HA 유도체 (99k HA-TyrNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-PheNH2/Chol-6%/FL) 에서 얻어진 화합물을 10 ㎎/㎏ 의 용량 (수크로오스 용액) 으로 래트 피하에 단회 투여하였다. 투여 7 일 후, 투여 부위를 확인한 결과, 확실히 형광 표지 HA 유도체가 침전하고, 존재하고 있는 것이 확인되었다.
(실시예 5-7) 형광 표지되어 있지 않은 히알루론산 유도체의 합성
5-아미노메틸플루오레세인을 첨가하지 않은 것, 그리고 출발 원료로서 사용한 HA-Na 의 분자량이 상이한 것 이외에는 실시예 5-1 ∼ 실시예 5-3 에 기재된 방법에 의해 각종 히알루론산 유도체를 백색 고체로서 얻었다. 대응하는 실시예의 기재와 동일한 방법에 의해 콜레스테릴기의 도입률 그리고 아미노산 및 아미노산아미드의 도입률을 산출하였다 (표 20).
[표 20]
[실시예 6] 약물 봉입능 평가
(실시예 6-1) 파클리탁셀 (PTX) 의 봉입
실시예 1-4 그리고 실시예 1-21 그리고 실시예 3-8 그리고 실시예 5-7 에서 얻어진 HA 유도체의 수용액 (초순수) 에 대해, 파클리탁셀 (10 ㎎/㎖, 메탄올 용액) 을 첨가하고, 최종 파클리탁셀 농도를 100 ㎍/㎖, HA 유도체 농도를 1.0 ㎎/㎖ 로 하였다. 4 ℃ 에서 하룻밤 정치 후, 4700G 로 10 분간 원심하고, 상청액 100 ㎕ 에 대해, 50 % 아세토니트릴 100 ㎕, 100 mM HP-β-CD50 ㎕ 를 첨가하고, 이하의 조건으로 역상 크로마토그래피 분석을 실시하였다.
역상
크로마토그래피 분석 조건
분석 칼럼:PLRP-S 1000 Å (Agilent 사) 칼럼 온도:40 ℃
이동상 A:0.1 % TFA 수용액, 이동상 B:0.1 % TFA 아세토니트릴 용액
그라디언트:B5 % → B95 % (3.4 분)
유속:2 ㎖/min
검출:UV 254 ㎚
주입량:30 ㎕
스탠더드를 이용하여 산출한 상청액 중 파클리탁셀 농도를 도 6-1-1 ∼ 도 6-1-4 에 나타낸다. HA 유도체가 존재하지 않는 경우의 파클리탁셀의 용해도는 0.6 ㎍/㎖ 인데 반해, HA 유도체의 존재하에 있어서 우위에 파클리탁셀의 용해도의 향상이 확인되었다. 이것은, 파클리탁셀 등의 난용성 저분자 화합물이 HA 유도체에 봉입되는 것을 시사하고 있다.
(실시예 6-2) 사이클로스포린 (사이클로스포린 A:CyA) 의 봉입
실시예 1-4 그리고 실시예 1-21 그리고 실시예 3-8 그리고 실시예 5-7 에서 얻어진 HA 유도체의 수용액 (초순수) 에 대해, 사이클로스포린 (10 ㎎/㎖, 메탄올 용액) 을 첨가하고, 최종 사이클로스포린 농도를 300 ㎍/㎖, HA 유도체 농도를 1.0 ㎎/㎖ 로 하였다. 4 ℃ 에서 하룻밤 정치 후, 4700G 로 30 분간 원심하고, 상청액 100 ㎕ 에 대해, 50 % 아세토니트릴 100 ㎕, 100 mM HP-β-CD 50 ㎕ 를 첨가하고, 실시예 6-1 에 기재된 조건으로 역상 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 검출은 UV 210 ㎚ 를 사용하였다. 스탠더드를 이용하여 산출한 상청액 중 사이클로스포린 농도를 도 6-2-1 ∼ 도 6-2-4 에 나타낸다. HA 유도체가 존재하지 않는 경우의 사이클로스포린의 용해도는 28 ㎍/㎖ 인데 반해, HA 유도체의 존재하에 있어서 우위에 사이클로스포린의 용해도의 향상이 확인되었다. 이것은 사이클로스포린 등의 난용성 펩티드가 HA 유도체에 봉입되는 것을 시사하고 있다.
[실시예 7] in vitro 릴리스 시험
(실시예 7-1) 파클리탁셀 릴리스 시험
실시예 1-21 에서 얻어진 10k HA-Ala-Chol-41 % 의 수용액 (초순수) 에 대해, 파클리탁셀 (10 ㎎/㎖, 메탄올 용액) 을 첨가하고, 최종 파클리탁셀 농도를 100 ㎍/㎖, HA 유도체 농도를 1.0 ㎎/㎖ 로 하였다. 4 ℃ 에서 하룻밤 정치 후, 프리의 파클리탁셀을 투석막 (3,000 MWCO) 으로 4 ℃ 에서 정제하였다. 얻어진 HA 유도체/파클리탁셀 복합체를 투석막 (3,000 MWCO) 에 넣고, PBS 에 대해, 37 ℃ 에서 인큐베이트하였다. 시간 경과적으로 투석막 내의 파클리탁셀 농도를 역상 크로마토그래피 분석으로 정량하고, 릴리스를 확인하였다. 투석막 내의 파클리탁셀의 잔존량을 도 7-1 에 나타낸다. 이 결과는 HA 유도체를 서방 담체로서 사용할 수 있는 것을 나타내고 있다.
(실시예 7-2) 사이클로스포린 릴리스 시험
파클리탁셀 대신에 사이클로스포린 A 를 사용한 것 이외에는 실시예 7-1 에 기재된 방법으로 실시하고, 사이클로스포린의 릴리스를 확인하였다. 투석막 내의 사이클로스포린의 잔존량을 도 7-2 에 나타낸다. 이 결과는 HA 유도체를 서방 담체로서 사용할 수 있는 것을 나타내고 있다.
[실시예 8] 링커가 상이한 HA-AA-Chol 의 합성
콜레스테릴 6-아미노헥실카바메이트 (Chol-C6) 대신에 콜레스테릴 2-아미노에틸카바메이트 (Chol-C2), 콜레스테릴 12-도데실아미노헥실카바메이트 (Chol-C12), 콜레스테릴 8-아미노-3,6-디옥사옥틸카바메이트 (Chol-EO2) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1-4 와 동일한 방법으로 실시하고, 링커가 상이한 HA-AA-Chol 을 고체로서 얻었다 (표 21). 콜레스테릴 2-아미노에틸카바메이트, 콜레스테릴 12-도데실아미노헥실카바메이트, 콜레스테릴 8-아미노-3,6-디옥사옥틸카바메이트는 WO2010/053140 에 기재된 방법으로 합성하였다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 조건으로 측정한 생성물의 1H-NMR 스펙트럼을 도 8-1 ∼ 도 8-6 에 나타낸다. 실시예 1-5 의 기재와 동일한 방법으로 HA 유닛에 대한 콜레스테릴기의 도입률을 산출하였다 (표 21).
[표 21]
[실시예 9] HA-Ala-콜란산의 합성
(실시예 9-1) N-(2-아미노에틸)5β콜란산아미드 (N-(2-aminoethyl)5β-cholanoamide) 의 합성
5β콜란산메틸에스테르 (steraloids 사, 100 ㎍) 를 에틸렌디아민 (6 ㎖) 에 용해하고, 130 ℃, 4 시간, 환류하였다. 감압 증류 제거 후, 디클로로메탄에 용해하고, 초순수로 세정하였다. 감압하에서 용매를 증류 제거하고, 아미노에틸5β콜란산아미드를 얻었다.
(실시예 9-2) HA-Ala-콜란산의 합성
실시예 1-4 와 동일한 방법으로 합성된 HA-Ala-TBA 의 무수 DMSO 용액 (10 ㎎/㎖) 을 조제하고, 그 후, 실시예 9-1 에서 조제한 아미노에틸5β콜란산아미드를 HA-Ala-TBA 유닛에 대해 이하의 표 22 에 나타내는 비율로 각 용액에 첨가하였다. 다음으로, DMT-MM 을 HA-Ala-TBA 에 대해 이하의 표 22 에 나타내는 비율로 첨가하였다. 반응 용액은 메탄올/물 1/1 혼액, 0.15 M NaCl 수용액, 초순수의 순서로 투석하고, 얻어진 투석액을 동결 건조시켜 목적물 (HA-Ala-CA) 을 백색 고체로서 얻었다.
측정 용매로서 DMSO-d6 을 사용한 1H-NMR 스펙트럼의 대표예 (99 kDa 의 HA 를 출발 원료로서 사용하고, 콜란산의 도입률이 13 % 인 생성물) 를 도 9 에 나타낸다. 글루코사민의 아세틸 유래의 피크 (COCH3, 1.6 ∼ 2.0 ppm;3H) 의 적분값과, 콜라노일기 중의 메틸 유래의 피크 (CH3, 0.6 ppm;3H) 의 적분값으로부터, 아래에 나타내는 식으로부터 HA 유닛에 대한 콜란산의 도입률을 산출하였다 (표 22). 또한 글루코사민의 아세틸 유래의 피크가 포함되는 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크에는 콜란산기 유래의 피크 (7H) 가 겹쳐 있기 때문에, 1.6 ∼ 2.0 ppm 부근의 피크의 적분값으로부터 콜란산기 메틸 유래의 피크 (0.6 ppm) 의 적분값을 7/3 한 것을 빼어 산출한 값 (즉, 적분값 (1.6 ∼ 2.0 ppm) - 적분값 (0.6 ppm) × 7/3) 을 HA 유래의 아세틸의 적분값으로 하여, 도입률의 계산에 사용하였다.
[수학식 8]
[표 22]
Claims (12)
- 식 (I)
[식 중, R1, R2, R3, 및 R4 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5 는 수소 원자, 포르밀, 또는 C1-6 알킬카르보닐이고;
X1 은 하이드록시, -O-Q+, C1-6 알콕시, -NR7R8, 또는 -NH-Z1-Z2 이고;
Q+ 는 카운터 카티온을 나타내고;
R6, R7 및 R8 은, 독립적으로, 수소 원자, 및 C1-6 알킬에서 선택되고;
Ra 는 수소 원자, 또는 C1-6 알킬이고, 여기서 그 알킬은, 독립적으로, 하이드록시, 카르복시, 카르바모일, C1-6 알킬티오, 아릴, 및 헤테로아릴에서 선택되는 1 이상의 기로 치환되어 있어도 되고, 여기서 그 아릴은 1 이상의 하이드록시로 치환되어 있어도 되고;
단, X1 이 -NH-Z1-Z2 인 경우, 기 -CHRa-CONH-Z1-Z2 는,
에서 선택되고;
Z1 은 C2-30 알킬렌, 또는 -(CH2CH2O)m-CH2CH2- 이고, 여기서, 그 알킬렌은, 독립적으로, -O-, -NRg- 및 -S-S- 에서 선택되는 1 ∼ 5 의 기가 삽입되어 있어도 되고, m 은 1 ∼ 100 에서 선택되는 정수이고;
Z2 는 이하의 식:
에 의해 나타내어지는 기에서 선택되고;
Rb 및 Rc 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-20 알킬, 아미노 C2-20 알킬 및 하이드록시 C2-20 알킬에서 선택되고, 여기서 당해 기의 알킬 부분은, 독립적으로, -O- 및 -NRf- 에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Rf 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-12 알킬, 아미노 C2-12 알킬 및 하이드록시 C2-12 알킬에서 선택되고, 당해 기의 알킬 부분은, 독립적으로, -O- 및 -NH- 에서 선택되는 1 ∼ 2 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Rg 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-20 알킬, 아미노 C2-20 알킬 또는 하이드록시 C2-20 알킬에서 선택되고, 당해 기의 알킬 부분은, 독립적으로, -O- 및 -NH- 에서 선택되는 1 ∼ 3 개의 기가 삽입되어 있어도 되고;
Z3 은 콜레스테릴기, 스티그마스테릴기, 라노스테릴기, 에르고스테릴기, 콜라노일기, 또는 콜로일기이고;
Za 는 C1-5 알킬렌이고;
Zb 는 C2-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이다]
로 나타내는 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체로서, X1 이 -NH-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위가 포함되지 않는 경우, 또한 식 (II):
[식 중, R1a, R2a, R3a 및 R4a 는, 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀, 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5a 는 수소 원자, 포르밀, 또는 C1-6 알킬카르보닐이고;
X2 는 -NH-Z1-Z2 이고, 여기서, Z1, 및 Z2 는 이미 정의한 바와 같다]
로 나타내는 반복 단위를 포함하는 히알루론산 유도체. - 제 1 항에 있어서,
식 (I) 에 있어서 X1 이 -NH-Z1-Z2 인 히알루론산 유도체. - 제 1 항에 있어서,
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, 식 (I) 로 나타내는 이당 단위의 비율이 70 ∼ 100 % 인 히알루론산 유도체. - 제 1 항에 있어서,
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, 기 -NH-Z1-Z2 를 포함하는 이당 단위의 비율이 3 ∼ 50 % 인 히알루론산 유도체. - 제 1 항에 있어서,
X1 이 -NH-Z1-Z2 인 식 (I) 로 나타내는 반복 단위가 포함되지 않는 히알루론산 유도체. - 제 6 항에 있어서,
존재하는 이당의 반복 단위에 있어서의, (I) 로 나타내는 반복 단위의 비율 및 식 (II) 로 나타내는 반복 단위의 비율의 합이 70 ∼ 100 % 인 히알루론산 유도체. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
R1b, R2b, R3b, 및 R4b 전부를 수소 원자로 하고, R5b 를 아세틸로 하고, 또한, Xb 를 -O-Na+ 로 했을 경우의 중량 평균 분자량이 3 킬로달톤 ∼ 1500 킬로달톤이 되는, 제 2 항에 정의한 식 (IIb) 로 나타내는 이당 단위만으로 구성되는 히알루론산을 사용하여 제조되는 히알루론산 유도체. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
Z1 이 C2-10 알킬렌이고, Z2 가 -NH-COO-Z3 이고, Z3 이 콜레스테릴기인 히알루론산 유도체. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
식 (IIb)
[식 중, R1b, R2b, R3b 및 R4b 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알킬, 포르밀 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
R5b 는 수소 원자, 포르밀 및 C1-6 알킬카르보닐에서 선택되고;
Xb 는 하이드록시 및 -O-Q+ 에서 선택되고, 여기서 Q+ 는 카운터 카티온을 나타낸다]
로 나타내는 반복 단위 및 식 (Ia)
[식 중, Xa 는 하이드록시, -O-Q+, C1-6 알콕시 및 -NR7R8 에서 선택되고, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, 및 Ra 는 제 1 항에 정의한 바와 같다]
로 나타내는 반복 단위를 각각 포함하는 히알루론산 유도체를 이하의 식
H2N-Z1-Z2
[식 중, Z1, 및 Z2 는 제 1 항에 정의한 바와 같다]
으로 나타내는 화합물과 반응시킴으로써 얻어지는 히알루론산 유도체. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 유도체와 약물을 포함하는 의약 조성물.
- 제 11 항에 있어서,
약물이 히알루론산 유도체와 복합체를 형성함으로써 담지되는 의약 조성물.
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