MX2015002847A - Derivado del acido hialuronico con aminoacido y grupo esterilo introducido en este. - Google Patents

Derivado del acido hialuronico con aminoacido y grupo esterilo introducido en este.

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Takashi Nakai
Tomoko Yasugi
Yoshihiro Tampo
Kenji Yasugi
Tsuyoshi Shimoboji
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Abstract

La presente invención proporciona un derivado de ácido hialurónico que contiene una unidad de disacárido representada por la fórmula (I) o la fórmula (I) y (II) y un complejo que contiene el derivado del ácido hialurónico y un fármaco.

Description

DERIVADO DEL ÁCIDO HIALURÓNICO CON AMINOÁCIDO Y GRUPO ESTERILO INTRODUCIDO EN ÉSTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los derivados del ácido hialurónico que son modificados con aminoácidos y con grupos esterilo introducidos dentro de éste, complejos de los derivados de ácido hialurónico, fármacos y composiciones farmacéuticas que contienen los derivados de ácido hialurónico y fármacos.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Formulaciones que contienen proteínas y péptidos como ingredientes activos se han desarrollado recientemente como consecuencia del avance de la recombinación genética y teenologías de síntesis química, y cada año aumenta el número de tales formulaciones. Sin embargo, las proteínas y péptidos no son fácilmente absorbidos de forma minuciosa por el tracto gastrointestinal, la membrana mucosa, etc. Además, las proteínas y péptidos son inestables en el cuerpo y tienen una corta vida media en la sangre. Por lo tanto, las preparaciones de proteínas y péptidos necesitan ser administrados por las inyecciones frecuentes, que ponen una carga pesada en los pacientes y personal médico. Hay una demanda de una matriz del sistema de entrega (DDS) de fármacos teniendo una liberación sostenida o función de direccionamiento para encapsular una proteína o un péptido sin perjudicar su actividad farmacológica. Además, en términos de eficiencia de la administración, una matriz es preferida ya que se puede encapsular una máxima cantidad de proteínas y/o péptidos.
Las actividades farmacológicas de las proteínas y péptidos son conocidos por ser en gran parte dependientes de sus conformaciones y deterioradas por la degeneración y agregación debido al contacto con una interfaz de aire o un solvente orgánico o condiciones externas tales como temperatura, presión y pH. Proteína desnaturalizada o agregada es también conocida por aumentar los riesgos, tales como ser antigénicas, cuando se administran en un cuerpo. Para las preparaciones de liberación sostenida que contienen una proteína o un péptido como un ingrediente activo, la estabilidad de la proteína o el péptido debe garantizarse durante todo el período comprendido desde el proceso de formulación, a través de la preparación, el almacenamiento y la liberación del ingrediente activo en el cuerpo después de la administración.
Para fármacos de bajo peso molecular, cuestiones relativas a la estabilidad de los fármacos no son grandes en comparación con los de proteínas y péptidos, pero hay todavía una fuerte necesidad de matrices DDS teniendo una función de aumentar la solubilidad de fármacos poco solubles, o una liberación sostenida o función de direccionamiento.
Además, las matrices para uso farmacéutico tienen que ser no antigénicas, no mutagénicas, no tóxicas y biodegradable por razones de seguridad.
El uso de polisacáridos como matrices para portadores farmacéuticos se ha descrito recientemente. Uno de ellos, el ácido hialurónico (HA) es un biomaterial (polisacárido) que fue aislado del cuerpo vitreo en el ojo de bucy por K. Meyer en 1934 y se ha conocido durante mucho tiempo como un componente principal de la matriz extracelular. HA es un glucosaminoglicano compuesto por unidades de disacárido con ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina conectados por un p(l®3)enlace glicosídico. La estructura de HA no difiere entre las especies en los términos químicos y físicos y los seres humanos también tienen una vía metabólica para HA. Por lo tanto, es uno de los biomateriales más seguros para el uso médico, también en cuanto a la inmunidad y la toxicidad.
Además de sus propiedades como un material seguro, las propiedades del ácido hialurónico como un material bioactivo en la inducción de la adhesión celular, la proliferación y movilidad se han convertido recientemente en un asunto de interés. Además, en términos de producción, la producción en masa de ácido hialurónico de alto peso molecular ha sido posible mediante el uso de microorganismos. Por estas razones, se han realizado con impaciencia estudios DSS sobre el ácido hialurónico. La conjugación de fármacos con el ácido hialurónico se ha descrito para ser utilizado con éxito en el direccionamiento del fármaco al tejido canceroso (PTL 1), el direccionamiento al hígado (PTL 2) y la reducción de anitigenecidad (PTL 3). Los receptores de HA, incluyendo CD44, RHAMM (Receptor de la motilidad hialurónica activada con ácido), LYVE-1 (Receptor-1 HA endotelial de vaso linfa), HARE (receptor del ácido hialurónico por endocitosis), se han descrito para estar presentes en el cuerpo (NPL 7 y NPL 8). En particular, CD44 y RHAMM se sobreexpresa en muchas de las células cancerosas. Por lo tanto, se hicieron intentos para usar HA como una matriz de portador de direccionamiento del cáncer. Ejemplos de tales intentos incluyen conjugado paclitaxel-HA (NPL 9-11 y PTL 12), conjugado camptotecina-HA (PTL 13), conjugado doxorrubicina-HPMA [N-(2-hidroxipropil)metacrilamida]-HA (NPL 12), conjugado ácido butírico-HA (NPL 13), doxorrubicina que contienen nanopartículas de HA-PEG-PLGA (NPL 14), gel HA que contiene ARNsi (NPL 15) y liposoma recubierto con HA que contiene doxorrubicina (NPL 16). Además, NPL 17 describe un derivado HA conjugado con ácido cólico vía un enlazador de etilendiamina introducido por un enlace amida. Estos portadores que contienen HA como una matriz se han descrito por ser eficientemente tomados in vitro por células altamente expresando CD44 (véase, por ejemplo, NPL 9). Sin embargo, HA administrado sistémicamente ín vivo es conocido por ser eliminado rápidamente de la sangre; inmediatamente tomado vía los receptores de HARE presentes en, por ejemplo, células endoteliales sinusoidales en el hígado y metabolizados (NPL 18-20). Este tiempo de retención corto del ácido hialurónico en la sangre es una desventaja contra su uso para la retención prolongada de fármacos o como una matriz DDS para el direccionamiento. Los receptores parecen reconocer seis unidades consecutivas de azúcar en el ácido hialurónico. Se hicieron intentos para alargar el tiempo de retención en la sangre mediante la modificación de carboxi (PTL 4, 5 y 6).
Derivados de ácido hialurónico que tienen un tiempo de retención más grande conferido por un alto grado de modificación del carboxi en el radical de ácido glucurónico en ácido hialurónico se desarrollaron y han demostrado que son útiles (PTL 7). En general, aumentando la proporción de modificación de carboxi en el radical del ácido glucurónico prolonga la retención de los derivados de ácido hialurónico en la sangre. Sin embargo, no muestran una correlación lineal, pero la retención cambia abruptamente en un cierto valor umbral.
Ejemplos de la modificación del carboxi en el ácido hialurónico con aminoácido incluyen modificaciones con un éster etílico de glicina por el uso de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metilmorfolinio (en lo sucesivo como DMT-MM) como un agente de condensación, que puede ser producido por, por ejemplo, la reacción de 2-cloro-4,6-dimetoxi-l,3,5-triazina en presencia de N-metilmorfolina, la relación de la modificación de los cuales se ha reportado por ser hasta el 20% (NPL 1). Ejemplos en donde un compuesto a base de triazina es utilizado como un agente de condensación incluyen el ácido hialurónico modificado con alanina, que se han descrito por tener una mayor resistencia a la degradación oxidativa y potencialmente ser utilizado como un suplemento viscoso (NPL 2). Las modificaciones con otros aminoácidos por métodos similares se han reportado (NPL 3, PTL 9). Los ejemplos incluyen una preparación de películas blocompatibles insolubles en agua, en donde se usan clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (en lo sucesivo, referidos como EDC) como un agente de condensación, el ácido hialurónico se modifica con clorhidrato de éster metílico de leucina, clorhidrato de éster metílico de valina, clorhidrato de éster metílico de isoleucina, clorhidrato de éster metílico de la prolina, clorhidrato de éster metílico de fenilalanina, clorhidrato de éster metílico de arginina, y clorhidrato de éster metílico de histidina y gel se hicieron sin desprotección; sin embargo, la relación de modificación de los cuales se desconoce (PTL 8). Además, PTL 15, que fue publicado después de la fecha de prioridad de la presente solicitud, describe que un derivado de ácido hialurónico obtenido modificando carboxi del ácido hialurónico con cierto aminoácido-carboxílico o una amida del mismo tiene características de biodegradabilidad y retención en la sangre, y que tiene un efecto positivo sobre la liberación del fármaco de endosoma al citoplasma.
Otros ejemplos de los portadores de fármacos derivados de polisacáridos incluyen derivados de pululano modificados con un grupo de colesterilo, que se han descrito para formar finas partículas de tamaño nano en solución acuosa y funcionan como moléculas hospederas que forman complejos con moléculas hidrofóbicas de bajo peso molecular, péptidos y proteínas (NPL 4). El análisis termodinámico de los derivados de pululano después de la absorción de la proteína indicó que la proteína tomada es estabilizada por la unión de hidrógeno con grupos hidroxi de pululano (NPL 5).
Otros ejemplos incluyen carboximetilcelulosa (CMC; PTL 10) y quitosano modificado con el ácido linoleico (NPL 6), que se han descrito para ser utilizados como material para la fabricación de complejos con la proteína. Además, PTL 11 describe una composición que contiene un derivado del ácido hialurónico con un grupo de reticulación y un derivado de polisacárido hidrofílico teniendo un grupo hidrofóbico, en donde se prepara el derivado de ácido hialurónico con un grupo de reticulación por una reacción de reticulación del ácido hialurónico o un derivado del mismo teniendo un grupo capaz de reticularse en presencia del derivado de polisacárido hidrofílico. PTL 14 describe que un derivado de ácido hialurónico en donde un colesterilo es introducido como un grupo hidrofóbico forma partículas finas por asociación y forma complejos con los fármacos en el agua.
Lista de Citas Literatura de Patente PTL 1: Publicación Internacional No. 92/06714 PTL 2: Publicación de la solicitud de patente japonesa no examinada núm. JP 2001- 81103.
PTL 3: Publicación de la solicitud de patente japonesa no examinada núm. JP 2- 273176.
PTL 4: Publicación de la solicitud de patente japonesa no examinada núm. JP 5- 85942.
PTL 5: Publicación Internacional No. 01/05434 PTL 6: Publicación Internacional No. 01/60412 PTL 7: Publicación Internacional No. 2006/028110 PTL 8: Publicación Internacional No. 92/20349 PTL 9: Publicación Internacional No. 2011/148116 PTL 10: Publicación Internacional No. 2002/022154 PTL 11: Publicación Internacional No. 2008/136536 PTL 12: Publicación Internacional No. 2004/035629 PTL 13: Publicación Internacional No. 2009/074678 PTL 14: Publicación Internacional No. 2010/053140 PTL 15: Publicación Internacional No. 2012/118189 Literatura que no es de Patente NPL 1: Biomacromolecules, Vol. 8, p. 2190-2195, 2007 NPL 2: CARBOHYDRATE Polymers, Vol. 86, p. 747-752, 2011 NPL 3: CARBOHYDRATE Polymers, Vol. 87, p. 2211-2216, 2012 NPL 4: Macromolecules, Vol. 26, p. 3062-3068, 1993 NPL 5: Colloids and Surfaces, Vol. 112, p. 91-95, 1996 NPL 6: Carbohydrate Polymers, Vol. 62, p. 293-298, 2005 NPL 7: MOLECULAR PHARMACEUTICS, Vol. 5, p. 474-486, 2008 NPL 8: Journal of Drug Targeting, Vol. 16, p. 91-107, 2008 NPL 9: Bioconjugate Chem., Vol. 10, p. 755-763, 1999 NPL 10: Clinical Cáncer Research, Vol. 14, p. 3598-3606, 2008 NPL 11: Bioconjugate Chem., Vol. 19, p. 1319-1325, 2008 NPL 12: Pharmaceutical Research, Vol. 19, p. 396-402, 2002 NPL 13: Clinical Cáncer Research, Vol. 10, p. 4822-4830, 2004 NPL 14: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, Vol. 3, p. 246-257, NPL 15: Journal of Controlled Release, Vol. 119, p. 245-252, 2007 NPL 16: Neoplasia, Vol. 6, p. 343-353, 2004 NPL 17: Journal of Materials Chemistry, Vol. 19, p. 4102-4107, 2009 NPL 18: Cell and Tissue Research, Vol. 243, p. 505-510, 1985 NPL 19: THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 275, 37733-37741, 2000 NPL 20: The Biochemical Journal, Vol. 200, p. 415-424, 1981 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema teenico La retención de un derivado del ácido hialurónico en la sangre se correlaciona con la proporción de modificación de carboxi en su radical de ácido glucurónico. Pero, se ha encontrado también que cambian abruptamente en un cierto valor umbral. Por lo tanto, la retención de un derivado de ácido hialurónico en la sangre es difícil de mantener en un intervalo deseable simplemente mediante el control de la relación de la modificación de carboxi. En consecuencia, se desea una manera más simple y más confiable para el control de la retención en la sangre. Además, la reducción del reconocimiento del ácido hialurónico por los receptores de ácido hlalurónlco hace al ácido hlalurónlco menos susceptibles al metabolismo en el cuerpo viviente y disminuye su blodegradabilidad, una propiedad intrínseca del ácido hialurónico. Por lo tanto, se desea una matriz con propiedades de retención y biodegradabilidad (seguridad) en la sangre.
Un objeto de la Invención es proporcionar un derivado del ácido hialurónico con propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre. Otro objeto de la invención es proporcionar un complejo del derivado de ácido hialurónico y un fármaco, y una composición farmacéutica que comprende el derivado de ácido hialurónico, en particular, un complejo del derivado de ácido hialurónico y el fármaco.
Solución al problema En el estudio con el objetivo de alcanzar los objetos, los presentes inventores encontraron que un derivado del ácido hialurónico obtenido por la introducción posterior de un grupo esterilo en carboxi en el radical del ácido glucurónico y/o carboxi en la molécula de aminoácido de los intermedios obtenidos por la reacción de carboxi en la molécula de ácido glucurónico de ácido hialurónico o una sal de los mismos con un cierto aminoácido o amida de aminoácido para convertir el carboxi en amida tiene propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre y que un complejo del derivado de ácido hialurónico y un fármaco tiene buenas propiedades como una composición farmacéutica, completando así la presente invención. Por otra parte, en el estudio, los presentes Inventores encontraron que los derivados con ciertas amidas del aminoácido (aquellos en donde Ra descrito más adelante es alquilo de Ci-6 sustituido con arilo o heteroarilo, donde se sustituye el arilo con uno o más hidroxi) tales como tirosinamida y triptofanamida, cuyos derivados se modifican con un grupo esterilo, exhiben mejor dispersión en agua a pesar de la hidrofobicidad del grupo esterilo, en comparación con aquellos sin la introducción del grupo esterilo, completando así la presente invención. Además, los presentes inventores compararon los derivados con fenilalaninamida (aquellos en donde Ra descrito al último es alquilo de C1-6 sustituido con arilo, donde el arilo es no sustituido), cuyos derivados se modificaron además con un grupo esterilo en una proporción de introducción del 6% o menos, con los derivados sin fenilalaninamida, cuyos derivados fueron modificados con un grupo esterilo en una proporción de introducción del 6% o menos, y se encontró que, mientras se dispersaban en agua pura, sólo el primero fue dispersado en solución salina y el último agregado para formar precipitación y que el anterior es una excelente matriz para las inyecciones para la administración subcutánea continua, de tal modo completando la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a los derivados del ácido hialurónico con características de biodegradabilidad y retención en la sangre, a los derivados del ácido hialurónico que exhiben mejor dispersión en agua por la introducción de un grupo esterilo y complejos que contienen estos derivados de ácido hialurónico y un compuesto con una actividad farmacológica. Además, la presente invención se refiere a un método para producir el derivado de ácido hialurónico y a una composición farmacéutica que contiene un fármaco y el derivado de ácido hialurónico y un método para producir la composición.
En un aspecto de la presente invención, se proporcionan los derivados del ácido hialurónico según los siguientes puntos (1) a (10). (1) Un derivado del ácido hialurónico que comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (I): [Fórmula química 1] donde R1, R2, R3, y R4 se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6 , formilo, y alquilcarbonilo de C1-6 ; R5 es un átomo de hidrógeno, formilo, o alquilcarbonilo de C1-6; X1 es hidroxi, alcoxi de Ci-6 , -0 Q+, -NR7R8, o -NR9-Z'-Z2; Q+ representa un contraión; R6, R7, R8, y R9 se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno y alquilo de Ci-6; Ra es un átomo de hidrógeno o alquilo de Ci-6, donde los alquilos se pueden sustituir independientemente por uno o más grupos seleccionados de hidroxi, carboxi, carbamoilo, alquiltio de Ci-6 , arilo, y heteroarilo, donde el arilo se puede sustituir con uno o más grupos hidroxi; Z1 es alquileno de C2-30 o -(q^q^q q^q , donde en el alquileno 1 a 5 grupos se seleccionan independientemente de -O-, -NR9-, y -S-S- se pueden insertar, y m es un número entero seleccionado de 1 a 100; Z2 se selecciona de los grupos representados por las siguientes fórmulas: -NRb-Z3, -NRb-COO-Z3, -NRb-CO-Z3, -NRb-CO-NRc-Z3, -COO-Z3, -CO-NRc-Z3, -O-C0-NRc-Z3, -O-COO-Z3, -S-Z3, -co-za-s-z3, -o-co-zb-s-z3, -NRb-CO-Zb-S-Z3, y -S-S-Z3; Rb y Rc se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de . 20, aminoalquilo de C2-2o, e hidroxialquilo de C2-2o, donde en los radicales alquilo de los 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de -O- y -NRf- se pueden insertar; Rf se selecciona independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci_i2, aminoalquilo de C2-i2, e hidroxialquilo de C2-i2, y en los radicales alquilo de los grupos 1 a 2 grupos seleccionados independientemente de -O- y -NH- se pueden insertar; R9 se selecciona independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de C1-20, aminoalquilo de C2-20, o hidroxialquilo de C2-2o, y en los radicales alquilo de los grupos 1 a 3 seleccionados independientemente de -O- y -NH- se pueden insertar; Z3 es un grupo esterilo; Za es alquileno de C1-5; y Zb es alquileno de C2-8 o alquenileno de C2.8; y en donde si el ácido hialurónico comprende unidades de no repetición representadas por la fórmula (I), donde X1 es -NR^Z^Z2, entonces el derivado de ácido hialurónico además comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (II): [Fórmula química 2] donde Rla, R2a, R3a, y R4a se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6 , formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; R5a es un átomo de hidrógeno, formilo, o alquilcarbonilo de Ci-6; y X2 es -NR^Z^Z2, donde R9, Z1, y Z2 son como se definieron antes. (2) El derivado de ácido hialurónico según el punto anterior (1), además consta de una unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb): [Fórmula química 3] donde Rlb, R2b, R3b, y R4b se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6 , formilo, y alquilcarbonilo de C1-6; R5b se selecciona de un átomo de hidrógeno, formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; y Xb se selecciona de hidroxi y -0 Q+, donde Q+ representa un contraión. (3) El derivado de ácido hialurónico de acuerdo a los puntos anteriores (1) o (2), en donde X1 es -NR^-Z2 en la fórmula (I). (4) El derivado de ácido hialurónico según cualquiera de los anteriores (1) a (3), en donde un porcentaje de la unidad de disacárido representada por la fórmula (I) en unidades de repetición de disacárido existente es del 70 al 100%. (5) El derivado de ácido hialurónico según cualquiera de los anteriores (1) a (4), donde un porcentaje de la unidad de disacárido que comprende el grupo -NR9-ZX-Z2 en unidades de repetición de disacárido existentes es del 3 al 50%. (6) El derivado de ácido hialurónico de acuerdo a los puntos anteriores (1) o (2), que comprenden una unidad de no repetición representada por la fórmula (I), en donde X1 es -NR^Z1- Z2. (7) El derivado del ácido hialurónico de acuerdo con cualquiera de (1), (2) y (6), en donde la suma de los porcentajes de la unidad de repetición representada por (I) y la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en unidades de repetición de disacárido existentes es del 70 al 100%. (8) El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de los anteriores (1) a (7), en donde el derivado de ácido hialurónico es producido mediante el uso de ácido hialurónico exclusivamente que consta de la unidad de disacárido representada por la fórmula (Ilb) según (2) y tiene un peso molecular promedio en peso de 3 kilo Daltons a 1,500 kilo Daltons cuando Rlb, R2b, R3b, y R4b son todos átomos de hidrógeno, R5b es acetilo, y Xb es -0 Na+. (9) El derivado de ácido hialurónico de acuerdo a cualquiera de (1) a (8), en donde Z1 es alquileno de C2-io, Z2 es -NH-COO-Z3, y Z3 es un grupo colesterilo. (10) El derivado de ácido hialurónico según cualquiera de los anteriores (1) a (9), en donde el derivado de ácido hialurónico se obtiene por la reacción de un derivado de ácido hialurónico que comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb) y una unidad de repetición representada por la fórmula (la), [Fórmula química 4] . donde Xa se selecciona de hidroxi, -0 Q+, alcoxi de Ci-6 , y -NR7R8 y R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, y Ra son como se definieron en el anterior (1), con un compuesto representado por la fórmula HNR^Z^Z2, donde R9, Z1, y Z2 son como se definieron en el anterior (1).
En otro aspecto de la presente invención, composiciones farmacéuticas según los siguientes (11) y (12) son proporcionadas. (11) Una composición farmacéutica que comprende el derivado del ácido hialurónico según cualquiera de los anteriores (1) a (10) y un fármaco. (12) La composición farmacéutica de acuerdo al anterior (11), en donde el fármaco se lleva formando un complejo con el derivado de ácido hialurónico.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un complejo de derivado de ácido hialurónico-fármaco, en donde el fármaco se lleva en el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (10). Preferiblemente, se proporciona un complejo de derivado de ácido hialurónico-fármaco, en donde el derivado de ácido hialurónico forma partículas finas por asociación en agua y mantiene el fármaco.
Por otra parte, en otro aspecto de la presente invención, un portador de fármacos biodegradable que comprende el derivado de ácido hialurónico según cualquiera de (1) a (10) se proporciona.
Por otra parte, en otro aspecto de la presente invención, un método para administrar un medicamento, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco con el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (10) se proporciona.
El arilo (opcionalmente sustituido con uno o más hldroxi) en Ra preferiblemente es no sustituido si X1 es hldroxi, -0 Q+ o - R^Z^Z2.
Efectos ventajosos de la invención Mediante el uso de un derivado de ácido hialurónico de la presente invención, una preparación de liberación prolongada que contiene una gran cantidad de fármacos, en particular, un compuesto de bajo peso molecular o una proteína o un péptido con una eficacia manteniendo sus bioactividades puede ser proporcionada. Además, los derivados del ácido hialurónico son excelentes en cuanto a la seguridad y tienen especialmente excelentes propiedades como un portador para las preparaciones farmacéuticas y como una matriz para las inyecciones para la administración subcutánea sostenida en términos de la retención del fármaco en la sangre y la biodegradabilidad. Además, la farmacocinétlca de preparaciones producidas con los derivados puede controlarse mediante la regulación del grado de modificación de carboxi, es decir, el porcentaje de la introducción del grupo -NR^Z^Z2 y/o aminoácidos (incluyendo amida del aminoácido), en los derivados de ácido hialurónico de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra un ejemplo de espectros de H-RMN de la sal de clorhidrato de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (Chol-C6) preparado en el ejemplo 1-1.
La figura 2 ilustra un ejemplo de espectros H-RMN (solvente: D20) de sal de TBA del ácido hialurónico (HA-TBA) producida a partir del material de inicio 99 kDa HA-Na preparado en el ejemplo 1-3.
La figura 3 ilustra un ejemplo de espectros JH-RMN de HA-Ala producidos a partir del material de inicio 99 kDa HA-Na preparado en el ejemplo 1-4.
La figura 4 ilustra un ejemplo de espectros ^-RMN de HA-Ala-Chol/FL producidos a partir del material de inicio 99 kDa HA-Na preparado en el ejemplo 1-4 (relación de introducción del grupo colesterilo: 7%).
La figura 5 ilustra un ejemplo de espectros ^-RMN de HA-ThrNH2/Chol/FL producidos a partir del material de inicio 99 kDa FIA-Na preparado en el ejemplo 1-5 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 6 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Ser-OEt preparado en el ejemplo 1-6.
La figura 7 ¡lustra un ejemplo de espectros de ^-R N de HA-Ser preparado en el ejemplo 1-6.
La figura 8 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Ser-Chol/FL producido en el ejemplo 1-6 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 9 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Gly-OEt preparado en el ejemplo 1-7.
La figura 10 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Gly preparado en el ejemplo 1-7.
La figura 11 ¡lustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Gly-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-7 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 12 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Thr preparado en el ejemplo 1-8.
La figura 13 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Thr-Chol/FL producido en el ejemplo 1-8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 14 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Asn preparado en el ejemplo 1-9.
La figura 15 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Asn-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-9 (relación de introducción del grupo colesterilo: 7%).
La figura 16 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Asp preparado en el ejemplo 1-10.
La figura 17 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Asp-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-10 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 18 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Ile preparado en el ejemplo 1-11.
La figura 19 ¡lustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Ile-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-11 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 20 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN de HA-Leu preparado en el ejemplo 1-12.
La figura 21 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN de HA-Leu-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-12 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 22 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Val preparado en el ejemplo 1-13.
La figura 23 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Val-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-13 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 24 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN de HA-Phe preparado en el ejemplo 1-14.
La figura 25 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Phe-Chol/FL preparado en el ejemplo 1-14 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 26 ilustra un ejemplo de espectros XH-RMN (solvente: 0.02 N DCI DMSO-d6/D20 solución mezclada) de HA-SerNH^Chol/FL preparado en el ejemplo 1-15 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 27 ¡lustra un ejemplo de espectros XH-RMN (solvente: D20) de HA-SerNFI^Chol/FL preparado en el ejemplo 1-15 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 28 ilustra un ejemplo de espectros XH-RMN (solvente: 0.02 N DCI DMSO-de/D20 solución mezclada) de HA-GlyNFI^Chol/FL preparado en el ejemplo 1-16 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 29 ilustra un ejemplo de espectros XH-RMN (solvente: D20) de HA-GlyNH^Chol/FL preparado en el ejemplo 1-16 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 30 ilustra un ejemplo de espectros de 1H-RMN preparado en el ejemplo 1-17 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 31 ilustra un ejemplo de espectros de 1H-RMN preparado en el ejemplo 1-18 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 32 ilustra un ejemplo de espectros de XH-R preparado en el ejemplo 1-19 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 33 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN preparado en el ejemplo 1-20.
La figura 34 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN de HA-Ser/Chol/FL preparado en el ejemplo 1-20 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 35 ilustra un ejemplo de espectros de XH-RMN de HA-Chol/FL preparado en el ejemplo comparativo 1-1 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 36 ilustra un ejemplo de espectros de 1H-R N de HA-EDOBEA preparado en el ejemplo comparativo 1-2.
La figura 37 ilustra un ejemplo de espectros de 1H-RMN de HA-EDOBEA-Ac/FL preparado en el ejemplo comparativo 1-2.
La figura 38 ilustra un ejemplo de espectros de xFi-RMN de HA-Tyr preparado en el ejemplo comparativo 1-3.
La figura 39 ilustra un ejemplo de espectros de ^-RMN de HA-Tyr-Chol/FL preparado en el ejemplo comparativo 1-3 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 40 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-1) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 41 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ala-Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-2) y 99k HA-Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-2) (ejemplo 2-2).
La figura 42 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (cuadro 9: muestra 2-3) y 99k HA-Chol-25%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-3) (ejemplo 2-2).
La figura 43 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 50k HA-Ala-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-4) y 50k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-4) (ejemplo 2-2).
La figura 44 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 50k HA-Ala-Chol-22%/FL (cuadro 9: muestra 2-5) y 50k HA-Chol-20%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-5) (ejemplo 2-2).
La figura 45 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 50k HA-Ala-Chol-26%/FL (cuadro 9: muestra 2-6) y 50k HA-Chol-27%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-6) (ejemplo 2-2).
La figura 46 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 50k HA-Ala-Chol-16%/FL (cuadro 9: muestra 2-7) y 50k HA-Chol-15%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-7) (ejemplo 2-2).
La figura 47 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-ThrNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-8) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 48 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-ThrNH2/Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-9) y 99k HA-Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-2) (ejemplo 2-2).
La figura 49 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (cuadro 9: muestra 2-10) y 99k HA-Chol-25%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-3) (ejemplo 2-2).
La figura 50 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-11) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 51 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-12) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 52 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-13) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 53 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-14) y 99k FIA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 54 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k FIA-Asp-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-15) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 55 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ile-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-16) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 56 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-17) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 57 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Val-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-18) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 58 es una gráfica que ¡lustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-19) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 59 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-20) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 60 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-21) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 61 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-LeulMH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-22) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 62 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k FIA-GlyNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-23) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 63 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-24) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 64 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-25) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 65 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k FIA-Tyr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-26) y 99k FIA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 2-2).
La figura 66 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-1) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 67 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k FIA-Ala-Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-2) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 68 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (cuadro 9: muestra 2-3) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 69 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-4) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 70 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k FIA-Ala-Chol-22%/FL (cuadro 9: muestra 2-5) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 71 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala-Chol-26%/FL (cuadro 9: muestra 2-6) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 72 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala-Chol-16%/FL (cuadro 9: muestra 2-7) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 73 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-ThrNFI2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-8) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 74 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k FIA- ThrNH2/Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-9) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 75 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (cuadro 9: muestra 2-10) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 76 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-11) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 77 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-12) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 78 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-13) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 79 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-14) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 80 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Asp-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-15) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 81 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-He-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-16) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 82 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-17) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 83 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Val-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-18) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 84 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-19) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 85 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-20) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 86 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-21) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 87 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-LeuNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-22) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 88 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-GlyNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-23) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 89 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-24) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 90 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-25) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 91 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-EDOBEA-Ac/FL (ejemplo comparativo 1-2) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica que la muestra administrada no es metabolizada (ejemplo 2-3).
La figura 92 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-8) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 2-3).
La figura 93 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ala-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-1), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 94 ¡lustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ala-Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-2), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 95 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ala-Chol-30%/FL (cuadro 9: muestra 2-3), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 96 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 50k HA-Ala-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-4), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 97 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 50k HA-Ala-Chol-22%/FL (cuadro 9: muestra 2-5), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 98 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 50k HA-Ala-Chol-26%/FL (cuadro 9: muestra 2-6), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 99 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 10k HA-Ala-Chol-16%/FL (cuadro 9: muestra 2-7), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 100 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-ThrNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-8), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 101 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-ThrNH2/Chol-24%/FL (cuadro 9: muestra 2-9), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 102 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-ThrNH2/Chol-31%/FL (cuadro 9: muestra 2-10), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 103 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ser-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-11), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 104 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Gly-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-12), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 105 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Thr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-13), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 106 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Asn-Chol-7%/FL (cuadro 9: muestra 2-14), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 107 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Asp-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-15), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 108 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ile-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-16), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 109 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Leu-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-17), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 110 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k FIA-Val-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-18), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 111 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Phe-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-19), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 112 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-ValNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-20), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 113 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-SerNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-21), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 114 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-LeuNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-22), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 115 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-GlyNH2/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-23), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 116 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ala/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-24), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 117 ¡lustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Ser/Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra 2-25), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 118 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-EDOBEA-Ac/FL (ejemplo comparativo 1-2), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 119 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de las muestras de orina de un ratón que recibió 99k HA-Tyr-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra de comparación 2-8), en donde los cromatogramas en puntos del tiempo en una misma escala se muestran a la izquierda y aquellos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha (ejemplo 2-4).
La figura 120 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-GIn en el ejemplo 3-1.
La figura 121 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-GIn-Chol/FL preparado en el ejemplo 3-1 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 122 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de FIA-Met en el ejemplo 3-2.
La figura 123 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Met-Chol/FL preparado en el ejemplo 3-2 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 124 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-3 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 125 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-4 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 126 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-4 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 127 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-5 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 128 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-6 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 129 ilustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 3-7 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6 La figura 130 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Glu preparado en el ejemplo comparativo 3-1.
La figura 131 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Glu-Chol/FL preparado en el ejemplo comparativo 3-1 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 132 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Trp preparado en el ejemplo comparativo 3-2.
La figura 133 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Trp-Chol/FL preparado en el ejemplo comparativo 3-2 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 134 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Gln-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-1) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 135 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Met-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-2) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 136 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-3) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 137 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-AsnNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-4) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 138 es una gráfica que ¡lustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-IleNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-5) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 139 es una gráfica que ¡lustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-GlnNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-6) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 140 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-MetNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-7) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 141 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k HA-Glu-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-1) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 142 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 99k FIA-Trp-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-2) y 99k HA-Chol-6%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-1) (ejemplo 4-2).
La figura 143 es una gráfica que ilustra cambios de las concentraciones de plasma de 10k HA-Tyr-Chol-7%/FL (cuadro 15: muestra 4-3) y 10k HA-Chol-15%/FL (cuadro 9: muestra comparativa 2-7) (ejemplo 4-2).
La figura 144 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Gln-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-1) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 145 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Met-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-2) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 146 ¡lustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-3) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 147 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-AsnNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-4) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 148 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-IleNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-5) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 149 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-GlnNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-6) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 150 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-MetNH2/Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-7) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 151 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Glu-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-1) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 152 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 99k HA-Trp-Chol-6%/FL (cuadro 15: muestra 4-2) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 153 ilustra un análisis de cromatografía de exclusión de tamaño de 10k HA-Tyr-Chol-7%/FL (cuadro 15: muestra 4-3) y una muestra de hígado de un ratón que recibió la muestra, que indica el metabolismo de la muestra administrada en el hígado murina (ejemplo 4-3).
La figura 154 ilustra un ejemplo de espectros de RM preparado en el ejemplo 5-1 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 155 ilustra un ejemplo de espectros de RM preparado en el ejemplo 5-2 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 156 ¡lustra un ejemplo de espectros de RMN preparado en el ejemplo 5-3 (relación de introducción del grupo colesterilo: La figura 157 es una gráfica que ilustra la encapsulaclón de paclitaxel, un fármaco poco soluble, a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-1, en donde la ordenada indica la concentración de paclitaxel (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 158 es una gráfica que ilustra la encapsulación de paclitaxel, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-1, en donde la ordenada indica la concentración de paclitaxel (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 159 es una gráfica que ilustra la encapsulación de paclitaxel, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-1, en donde la ordenada indica la concentración de paclitaxel (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 160 es una gráfica que ilustra la encapsulación de paclitaxel, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-1, en donde la ordenada Indica la concentración de paclitaxel (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 161 es una gráfica que ilustra la encapsulación de ciclosporina, un fármaco poco soluble, a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-2, en donde la ordenada indica la concentración de ciclosporina (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 162 es una gráfica que ilustra la encapsulación de ciclosporina, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-2, en donde la ordenada indica la concentración de ciclosporina (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 163 es una gráfica que ilustra la encapsulación de ciclosporina, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-2, en donde la ordenada indica la concentración de ciclosporina (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 164 es una gráfica que ilustra la encapsulación de ciclosporina, un fármaco poco soluble a un derivado del ácido hialurónico de la presente invención (formación de un complejo del derivado del ácido hialurónico de la presente invención y paclitaxel) en el ejemplo 6-2, en donde la ordenada indica la concentración de ciclosporina (solubilidad) en el sobrenadante que es mejorado por la presencia del derivado del ácido hialurónico de la presente invención. El valor más alto en la ordenada indica la mayor encapsulación.
La figura 165 es un gráfico que ilustra la liberación de paclitaxel de HA-Ala-Chol-41% en ejemplo 7-1, en donde la abscisa y ordenada representan tiempo (hora) y la cantidad de paclitaxel encapsulado en HA-Ala-Chol-41% sin ser liberado (en un complejo con HA-Ala-Chol-41%), respectivamente.
La figura 166 es un gráfico que ilustra la liberación de ciclosporina de HA-Ala-Chol-41% en el ejemplo 7-2, en donde la abscisa y ordenada representan tiempo (hora) y la cantidad de ciclosporina encapsulada en HA-Ala-Chol-41% sin ser liberado (en un complejo con HA-Ala-Chol-41%), respectivamente.
La figura 167 ¡lustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-C2-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 168 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-C2-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 7%).
La figura 169 ¡lustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-Ci2-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 7%).
La figura 170 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-Ci2-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 7%).
La figura 171 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-E02-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 5%).
La figura 172 ilustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-E02-Chol preparado en el ejemplo 8 (relación de introducción del grupo colesterilo: 6%).
La figura 173 ¡lustra un ejemplo de espectros de RMN de HA-Ala-CA preparado en el ejemplo 9-2 (relación de introducción del grupo colesterilo: 13%).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los derivados del ácido hialurónico de la presente invención son derivados del ácido hialurónico que contienen una o más unidades de disacárido (también, las unidades de repetición) representados por la fórmula (I).
En una modalidad de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico es substancialmente compuesto por unidades de repetición representadas por (a) la fórmula anterior (I), (b) las fórmulas anteriores (I) y (II), (c) las fórmulas anteriores (I) y (Ilb), o (d) las fórmulas anteriores (I) y (II) y (Ilb). El derivado de ácido hialurónico contiene disacárido unidades de repetición de disacárido de ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina, de los cuales, por ejemplo, 80% o más, preferiblemente un 90% o más, y más preferentemente 95% o más son unidades de repetición representadas por la fórmula (I), (II), o (Ilb). En una modalidad de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico se compone exclusivamente de unidades representadas representadas por (a) la fórmula anterior (I), (b) las fórmulas anteriores (I) y (II), (c) las fórmulas anteriores (I) y (Ilb), o (d) las fórmulas anteriores (I) y (II) y (Ilb).
El porcentaje de una unidad de disacárido particular para las unidades de repetición de disacárido en un derivado de ácido hialurónico de la presente invención indica el porcentaje de la unidad de disacárido particular para todas las unidades de disacáridos contenidas en una cierta cantidad del derivado del ácido hialurónico de la presente invención, que es un polisacárido con unidades del disacárido como sus unidades de repetición.
En la fórmula (I) que representa unidades de disacárido contenidas en derivados del ácido hialurónico de la presente invención, R1, R2, R3 y R4 son preferiblemente todos los átomos de hidrógeno. R5 es preferentemente un átomo de hidrógeno o alquilcarbonilo de C^, más preferiblemente un átomo de hidrógeno o acetilo e incluso más preferiblemente acetilo. En las fórmulas (II) y (Ilb) que representan unidades de disacárido contenidas en derivados del ácido hialurónico de la presente invención, Rla, R2a, R3a, y R4a y Rlb, R2b, R3b, y R4b son preferentemente todos átomos de hidrógeno. R5a y R5b son preferentemente un átomo de hidrógeno o alquilcarbonilo de Ci-6, más preferiblemente un átomo de hidrógeno o acetilo e incluso más preferiblemente ambos son acetilo.
Ejemplos específicos de Ra en la fórmula (I) incluyen un átomo de hidrógeno, metilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, carbamoilmetilo, carboximetilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, isopropilo, 2-carboxiet¡lo, 2-metiltioetilo, 2-carbamoiletilo, fenilmetilo, (4-h¡droxifen¡l)metil y ¡ndol-3-ilmetilo.
Si el grupo -CHRa- tiene un centro asimétrico, incluye formas activas ópticas respectivas y sus mezclas. Cuando se refirió como H2N-CHRa-COOH (aminoácido), preferiblemente representa la forma L (forma natural).
En la fórmula (I), R6, R7, R8, y R9 son, por ejemplo, independientemente un átomo de hidrógeno o metilo, pero preferiblemente todos los átomos de hidrógeno.
Por ejemplo, el grupo -CHRa-COOH se incluye como una modalidad del grupo -CHRa-CO-X1 en la fórmula (I). Ejemplos concretos de este grupo incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 5] , . , * representa la posición unida a -NR6- (en adelante el mismo).
Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-COOH incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 6] Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-COOH incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 7] Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-COOH incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 8] .
Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-COOH incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 9] Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-COOH incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 10] Cualquiera del grupo -CFIRa-COOH mostrado antes puede ser, todo o en parte, convertido en el grupo -CHRa-CONFI-Z1-Z2. Ejemplos del grupo -Zx-Z2 son como se describe más adelante.
Otras formas del grupo -CHF^-CO-X1 en la fórmula (I) incluye el grupo -CHRa-CONH2 Ejemplos concretos de este grupo incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 11] , .
Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2 incluyen el siguiente grupo.
[Fórmula química 12] .
Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2 incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 13] I Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2 Incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 14] Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2 incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 15] ; También, estos grupos son grupos preferibles que tienen propiedades de biodegradabilidad y la retención en la sangre.
En términos de las propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre, ejemplos preferibles del grupo CHRa-CONH2 Incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 16] En términos de las propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre, ejemplos más preferibles del grupo - CHRa-CONH2 Incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 17] En términos de buena dlspersabllidad en agua pura, ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2 incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 18] Estos dos grupos son ejemplos preferibles también en términos de la matriz para inyecciones para la administración subcutánea sostenida.
En términos de la matriz para las inyecciones para la administración subcutánea sostenida, ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH2incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 19] como R7, un átomo de hidrógeno y metilo son más preferibles, y un átomo de hidrógeno es aún más preferible.
Carboxi definido en la fórmula (I), (II), y (Ilb) puede estar en forma de sal representada en la fórmula -COO-Q+. En la fórmula, Q+ no es particularmente limitado mientras sea un contracatión formando una sal con carboxi en agua. Cuando es divalente o más, Q+ forma la sal con una pluralidad de carboxi dependiendo de la valencia. Ejemplo del contracatión incluyen iones metálicos tales como ion de litio ion sodio, ion rubidio, ion de cesio, ion de magnesio y el ion de calcio; e iones de amonio representados por la fórmula N+RjRkR'Rm, en donde Rj, Rk, R1, y Rm son cada uno independientemente seleccionados de un átomo de hidrógeno y alquilo de Ci-6. Preferiblemente los ejemplos incluyen el ion de sodio, ion de potasio y el ion de tetraalquilamonio (por ejemplo, ion de tetra-n-butilamonio). Preferiblemente, RRj, Rk, R1, y Rm son todos el mismo grupo seleccionado de alquilo de Ci-6 y preferiblemente n-butilo.
Otras formas del grupo -CHR^CO-X1 en la fórmula (I) incluyen el grupo -CHRa-CONH-Z1-!2. Ejemplos concretos de este grupo incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 20] - - - - Otros ejemplos específicos del grupo incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 21] Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH-Z -Z incluyen los siguientes grupos [Fórmula química 22] .
Ejemplos preferibles del grupo -CHRa-CONH-Z -Z incluyen los siguientes grupos [Fórmula química 23] Ejemplos preferibles del grupo -CHRMONH-Z^Z2 incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 24] .
En términos de las propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre, ejemplos preferibles del grupo -CHFACONHY-Z2 incluyen los siguientes grupos.
[Fórmula química 25] - Ejemplos del grupo -Z3-Z2 incluyen el grupo -(alquileno de C2-10 )-NH-COO-Z3, así como el grupo -(alquileno de C2-i2 )-NH-COO-Z3. Ejemplos de alquileno de C2-i2 preferiblemente incluyen -(CH2)2-, -(CH2)6-, -(CH2)8-, -(CH2)I0- y -(CH2)I2-, y más preferiblemente, -(CH2)2- y -(CH2)6-. Ejemplos del grupo -Z1-!2 incluyen el grupo -(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-Z3. En la fórmula, m es preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10 y más preferentemente de 1 a 3.
Ejemplos concretos de m preferiblemente incluyen 2. Ejemplos del grupo -Z^Z2 preferiblemente incluyen el grupo -(hexano-l,6-diil)-NH-COO-Z3, el grupo -(etano-1,2-diil)-NH-COO-Z3 y el grupo -(CH2CH20)2-CH2CH2-NH-Z3; más preferiblemente, el grupo -(hexano-l,6-diil)-NH-COO-colesterilo, el grupo -(etano-l,2-diil)-NH-COO-colesterilo, y el grupo -(CH2CH20)2-CH2CH2-NH-colanoilo; y más preferiblemente, el grupo -(hexano-l,6-diil)-NH-COO-colesterilo. Ejemplos de Z1, Z2, y el grupo -Z1-Z2 incluyen aquellos correspondientes a Y, X1, y el grupo -Y-X1 descrito en la Publicación Internacional No. 2010/053140. Ejemplos del grupo -CO-NRc-Z3 y el grupo -O-CO-NRc-Z3 Incluyen los grupos respectivos donde Rc es un átomo de hidrógeno.
Derivados del ácido hialurónico preferibles de la presente invención son los derivados del ácido hialurónico que contienen unidades de repetición representados por la fórmula (II). En una modalidad preferible, X2 en la fórmula (II) y X1 en la fórmula (I) son los mismos. En un aspecto de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico que contiene una unidad de repetición representada por la fórmula (I) donde X1 is -NR^-Z2, se proporciona una unidad de repetición representada por la fórmula (II) y una unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb).
El término "grupo esterilo" utilizado en este documento se refiere a un grupo que tiene un marco de esteroides, particularmente sin limitación. Ejemplos concretos de esteroides incluyen el colesterol, dehidrocolesterol, coprostenol, coprosterol, colestanol, campestanol, ergostanol, stigmastanol, coprostanol, estigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simiarenol, ácidos biliares (ácido colánico, ácido litocólico, ácido hiodeoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido apocólico, ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico), testosterona, estradiol, progesterona, cortisol, cortisona, aldosterona, corticosterona y deoxicorticosterona. Ejemplos del grupo esterilo incluyen colesterilo, stigmasterilo, lanosterilo, ergosterilo, colanoilo y grupos coloilo. Ejemplos preferidos incluyen grupos colesterilo (en particular, el grupo colest-5-en-3p-ilo representado por la siguiente fórmula) y grupos colanoilo (en particular, el grupo 5p-colan-24-oilo representado por la siguiente fórmula).
[Fórmula química 26] donde ** representa la posición anida al grupo vecino.
El término "alquilo de Ci-2o" como se usa aquí se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 20 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye "alquilo de C1-4 " tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, i-butilo, t-butilo, así como, n-pentilo, 3-metilbutilo, 2-metilbutilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 4-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-metilpentilo, 1-metilpentilo, 3-etil butilo y 2-etilbutilo. Alquilo de Ci-2o incluye "alquilo de C1-12 " con 1 a 12 átomos de carbono y "alquilo de Ci-6 " con 1 a 6 átomos de carbono.
El término "alquilo de Ci-6" como se usa aquí se refiere a un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye "alquilo de C1-4 " tal como metilo, etilo, n-prop¡lo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, i-butilo, y t-butilo.
El término "alcoxi de C1-6" usado aquí se refiere a alquilo lineal o ramificado con 1 a 6 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye "alcoxi de Ci-4 " tal como metoxi, etoxi, n-propoxl, i-propoxi, n-butoxi, s-butox¡, i-butoxi, y t-butoxi.
El término "alquilcarbonilo de Ci-6" usado aquí se refiere a un grupo alquilcarbonilo en donde la parte alquilo es alquilo de C1-6 descrito antes. Por ejemplo, el término incluye "alquilcarbonilo de Ci-4 " tal como acetilo, propionilo, n-propilcarbonilo, i-propilcarbonilo, n-butilcarbonilo, s-butilcarbonilo, i-butilcarbonilo, y t-butilcarbonilo.
El término "alcoxi de C1-6" usado aquí se refiere al grupo alquiloxi, en donde la parte alquilo es alquilo de Ci-6 descrito anteriormente. Por ejemplo, el término incluye metoxi (H3C-O-), etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, s-butoxi, i-butoxi, y t-butoxi .
El término "alquiltio de Ci-6" usado aquí se refiere a un grupo alquiltio en donde la parte alquilo es alquilo de Ci-6 descrito anteriormente. Por ejemplo, el término incluye metiltio (H3C-S-), etiltio, n-propiltio, i-propiltio, n-butiltio, s-butiltio, i-butiltio, y t-butiltio, pero es preferiblemente metiltio.
El término "aminoalquilo de C2-2o" usado aquí se refiere al alquilo lineal o ramificado con 2 a 20 átomos de carbono, que tiene amino como un sustituyente. Por ejemplo, amino se puede localizar en un átomo de carbono en un extremo del alquilo. Aminoalquilo de C2-20 incluye "aminoalquilo de C2-i2 " con 2 a 12 átomos de carbono.
El término "hidroxialquilo de C2-20" usado aquí se refiere al grupo alquilo lineal o ramificado con 2 a 20 átomos de carbono, que tiene hidroxi como un sustituyente. Por ejemplo, hidroxi se puede localizar en un átomo de carbono en un extremo del alquilo. Hidroxialquilo de C2-20 incluye "hidroxialquilo de C2-i2 " con 2 a 12 átomos de carbono.
El término "alquileno de C2.30" usado aquí se refiere al grupo hidrocarburo divalente, saturado, lineal o ramificado con 2 a 30 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye etileno y propileno, así como alquileno de C2.20 , alquileno de C2-8 , el grupo -(CH2)n-, donde n es 2 a 30, preferiblemente 2 a 20, y más preferiblemente 2 a 15.
El término "alquileno de Ci-5" usado aquí se refiere al grupo hidrocarburo divalente, saturado, lineal o ramificado con 1 a 5 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye etileno (etano-1,2-diilo, ethano-1, 1-diil), propileno (propano-l,l-diilo, propano-l,2-diilo, propano-1,3-diil), butano-1,4-diilo y penetano-1,5-diilo.
El término "alquileno de C2-io" usado aquí se refiere al grupo hidrocarburo divalente, saturado, lineal o ramificado con 2 a 10 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye etileno (etano-l,2-diilo, etano-1, 1-diil), propileno (propano-l,l-diilo, propano-l,2-diilo, propano-l,3-diil), butano-l,4-diilo, penetano-l,5-diilo, hexano-l,6-diilo, heptano-l,7-diilo, y octano-l,8-diilo. "alquileno de C2-io " incluye "alquileno de C2-6 " con 2 a 6 átomos de carbono y "alquileno de C2-8 " con 2 a 8 átomos de carbono.
El término "alquileno de C2-8" usado aquí se refiere al grupo hidrocarburo divalente, saturado, lineal o ramificado con 2 a 8 átomos de carbono. Por ejemplo, el término incluye etileno (etano-1, 2-diilo, etano-1, 1-diil), propileno (propano-l,l-diilo, propano-l,2-diilo, propano-l,3-diil), butano-l,4-diilo, penetano-l,5-diilo, hexano-l,6-diilo, heptano-l,7-diilo, y octano-l,8-diilo.
El término "alquenileno de C2-8" usado aquí se refiere a un grupo de hidrocarburo divalente, lineal o ramificado con 2 a 8 átomos de carbono, que contiene uno o más dobles enlaces. Por ejemplo, el término incluye -CH=CH-, -C(CH3)=CH-, 2-buteno-l,4-diilo, hepta-2,4-dieno-l,6-diilo y octa-2,4,6-trieno-l,8-diilo. En el caso de isomerismo geométrico, el término incluye los isómeros y sus mezclas.
"Arilo" utilizado en este documento se refiere a un grupo carbocíclico aromático, por ejemplo, un grupo carbocíclico aromático de 6 a 14 átomos de carbono. Ejemplos de arilo incluyen fenilo y naftilo (1-naftilo y 2-naftilo). Ejemplos de arilo sustituido con uno o más hidroxi incluyen 4-hidroxifenilo.
"Heteroarilo" utilizado en este documento se refiere a un grupo de anillo aromático que contiene uno o varios heteroátomos seleccionados de un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre entre los átomos que constituyen el anillo, que pueden ser parcialmente saturados. El anillo puede ser un anillo monocíclico o heteroarilo bicíclico condensado con un anillo de benceno o un anillo monocíclico heteroarilo. El anillo puede estar constituido de, por ejemplo, 4 a 15, preferiblemente 5 a 14, más preferiblemente de 6 a 10 átomos. Ejemplos de heteroarilo incluyen, por ejemplo, furilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, piridilo, pirimidilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzotiadiazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzoxadiazolilo, benzimidazolilo, indolilo, isoindolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, cinnolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, benzodioxolilo, indolizinilo, y imidazopiridilo; e indol-2-ilo se prefiere.
Los derivados del ácido hialurónico de la presente invención pueden ser utilizados como un portador farmacológico, y el portador farmacológico es biodegradable. "Biodegradable" significa que el portador farmacológico detectado en el hígado se convierte en moléculas de peso molecular inferior dentro de 15 días después de la administración intravenosa a la rata y/o humano. Habiendo convertido "en moléculas de peso molecular inferior" puede determinarse midiendo el tamaño del portador farmacológico en el hígado por cromatografía de columna de exclusión de tamaño (véase el ejemplo 2-3 en esta especificación). Un portador farmacológico se determina que es biodegradable si el pico máximo del portador farmacológico recuperado del hígado se desplaza al lado del peso molecular más bajo (es decir, tiempo de retención en el cromatograma de columna se hace más largo) comparado con el pico máximo del portador farmacológico antes de la administración. Los portadores farmacológicos biodegradables se excretan del cuerpo en la orina, las heces o similares. Por lo tanto, el cambio del portador farmacológico en las moléculas de peso molecular inferior puede detectarse en la orina. Sin embargo, la excreción urinaria de los derivados de ácido hialurónico de la presente invención con un grupo hidrofóbico puede ser suprimida debido a su hidrofobicidad. La detección del cambio en las moléculas de peso molecular inferior en el hígado, que es el principal órgano metabólico del ácido hialurónico, por lo tanto es más preferible para la determinación directa de la biodegradabilidad de los portadores farmacológicos a pesar de los problemas y la limitación del número de detección.
Según otro aspecto de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico definido en el presente en donde un porcentaje de la unidad de disacárido que tiene el grupo -NR9-Z1-!2 (en lo sucesivo el grupo hidrofóbico) representado por la fórmula (I) y/o (II) para las unidades de repetición de disacárido presentes en el derivado (cociente de la Introducción del grupo hidrofóbico) es del 3 al 50% se proporciona.
Esta relación de introducción del grupo hidrofóbico se calcula por las siguientes fórmulas: [Fórmula 1] (Número de unidades de repetición del disacárido (Relación de introducción del en donde se introduce el grupo hidrofóbico) grupo hidrofóbico) (Número de unidades de repetición del disacárido existentes) Las "unidades de repetición del disacárido presentes en el derivado" incluyen las unidades de repetición representadas por las fórmulas (I) y (II) y la unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb). La proporción de introducción puede ser controlada por condiciones de reacción, por ejemplo, la proporción de reactivos y puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis de RMN.
La relación de introducción del grupo hidrofóbico es de 3 a 50%, preferiblemente 5 a 40%, más preferiblemente 5 a 35%, más preferiblemente 5 a 25%, más preferiblemente 5 a 20% y más preferentemente 5 a 10%.
En una modalidad de la presente invención, el derivado del ácido hialurónico en donde X1 es -NR^-Z2 en la fórmula (I), como se ilustra en el ejemplo 1-4 descrito abajo, se proporciona. El porcentaje de la unidad de disacárido de fórmula (I) para las unidades de repetición de disacárido presentes en el derivado de ácido hialurónico de la presente invención es, por ejemplo, el 70% o más, preferiblemente un 75% o más, más preferentemente 90% o más. El límite superior puede ser de 100% o menos, con el fin de tener propiedades de biodegradabilidad y retención en la sangre. El intervalo del porcentaje es, por ejemplo, 70 a 100% preferentemente 75 a 100%, más preferiblemente 90 a 100%. El derivado del ácido hialurónico además puede contener una unidad de repetición representada por la fórmula (II).
En una modalidad de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico que no contiene la unidad de repetición representada por la fórmula (I) donde X1 es -NR^Z^Z2, como se ilustra en el ejemplo 1-5 descrito abajo, se proporciona. En este caso, la suma de los porcentajes de la unidad de repetición representada por (I) y la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en las unidades de repetición de disacárido existentes es del 70 a 100%, preferiblemente del 80 a 100% y más preferentemente del 90 al 100%.
El porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en las unidades de repetición de disacárido existentes es preferiblemente del 3 al 50%, más preferiblemente 5 a 40%, más preferiblemente 5 a 35%, más preferiblemente 5 a 25%, más preferiblemente 5 a 20% y más preferentemente del 5 a 10%. El porcentaje de la unidad de repetición representada por (I) en la unidad de repetición de disacárido existente es preferiblemente 20 a 97%, más preferentemente 30 a 95%, más preferentemente 35 a 95%, más preferiblemente 45 a 95%, más preferiblemente 50 a 95% y más preferentemente 60 a 95%.
Si el porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (II) es de 5 a 10%, en las unidades de repetición de disacárido existente, el porcentaje de la unidad de repetición representada por (I) es preferentemente 60 a 95%, más preferiblemente 70 a 95% y más preferentemente 75 a 95%.
Si el porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en las unidades de repetición de disacárido existentes es del 20 al 40% y preferiblemente de 20 a 35%, el porcentaje de la unidad de repetición representada por (I) es preferentemente del 30 al 80%, más preferiblemente del 45 al 80% y más preferentemente del 60 al 80%.
Si el porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en las unidades de repetición de disacárido existentes es del 10 al 20%, el porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (I) es preferentemente 50 al 90%, más preferentemente 60 al 90% y más preferentemente 70 al 90%.
El ácido hlalurónlco o una sal del mismo puede utilizarse como un material de Inicio para la producción de derivados del ácido hialurónico según la presente Invención. Ejemplos de la sal del ácido hialurónico incluyen sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, sales de potasio y sales de litio, y particularmente preferible sales son sales de sodio utilizadas frecuentemente como productos farmacéuticos. HA o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden producirse por métodos conocidos, tales como por métodos incluyendo la extracción de aquellos derivados de organismos vivos como de tejido subcutáneo de crestas y porcino o por la fermentación. También están comercialmente disponibles (por ejemplo, de DENKI KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA, Shiseido Co., Ltd., SEIKAGAKU CORPORATION, R&D Systems, Inc., etc.).
El peso molecular promedio en peso de ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo) compuesto exclusivamente por la unidad de disacárido representada por la fórmula (Ilb) utilizada como material de inicio es preferentemente 1 kDa a 2000 kDa, kDa, más preferiblemente 3 kDa a 1500 kDa y más preferentemente 5 kDa a 1000 kDa; más preferiblemente 10 kDa a 500 kDa, más preferiblemente 10 kDa a 200 kDa, más preferiblemente 45 kDa a 200 kDa y más preferentemente 50 kDa a 99 kDa. Para tener un menor tamaño de partícula, una viscosidad más baja, o mayor solubilidad, el peso molecular promedio en peso es preferentemente 1 kDa a 100 kDa, más preferiblemente 2 kDa a 70 kDa, más preferiblemente 3 kDa a 50 kDa y más preferentemente 5 kDa a 30 kDa. Para tener una viscosidad más alta o una mayor retención bajo la piel o en la cavidad articular, el peso molecular promedio en peso es preferentemente de 45 kDa a 2000 kDa, más preferiblemente 50 kDa a 2000 kDa, más preferiblemente 100 kDa a 1000 kDa y más preferentemente 200 kDa a 1000 kDa. En cuanto a la matriz para las inyecciones para la administración subcutánea sostenida, el peso molecular promedio en peso es preferentemente de 5 kDa a 200 kDa. Ejemplos concretos del peso molecular promedio en peso incluyen, por ejemplo, 5 k Da, 10 kDa, 50 kDa, 99 kDa, 230 kDa y 1058 kDa. "kDa" es una abreviatura para "kilodalton".
El peso molecular promedio en peso del ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo) compuesto exclusivamente por la unidad de disacárido representada por la fórmula (Ilb) se refiere al peso molecular promedio en peso del ácido hialurónico, donde Rlb, R2b, R3b, y R4b son todos átomos de hidrógeno, R5b es acetilo, y Xb es -0 Na+ en la fórmula (Ilb), mientras que la estructura de la cadena principal del derivado del ácido hialurónico según la presente invención. En consecuencia, una modalidad en donde, por ejemplo, todo o una parte de unidades de disacárido en el ácido hialurónico utilizado realmente como un material de inicio es una unidad de disacárido, donde Xb es -0(ion de tetra-n-butil amonio), y el peso molecular promedio en peso calculado como se describió anteriormente es de 45 kDa a 200 kDa, es una modalidad preferible de la presente invención.
El peso molecular del ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo) se calcula como un peso molecular promedio en número o peso molecular promedio en peso, puesto que es difícil obtener ácido hialurónico como una sola especie molecular. En la presente invención, el peso molecular se calcula como un peso molecular promedio en peso. El peso molecular promedio en peso puede medirse mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos como aquellos que miden dispersión de la luz, la presión osmótica o viscosidad, como se describe en, por ejemplo, Seiichi Nakahama et al. "Essential Polymer Science" (KODANSHA LTD., ISBN4-06-153310-X). El peso molecular promedio de viscosidad en este documento se puede medir por un método generalmente utilizado en la téenica a la que pertenece la presente invención, por ejemplo, utilizando el viscosímetro Ubbelohde. En consecuencia, el peso molecular del ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo) utilizado como una materia prima y los derivados del ácido hialurónico según la presente invención se calculan como un peso molecular promedio en peso. Cuando se utiliza un ácido hialurónico comercial mente disponible (incluyendo una sal del mismo) cuyo peso molecular es específicamente indicado, puede utilizarse el valor indicado específicamente como el peso molecular del ácido hialurónico.
El derivado del ácido hialurónico según la presente invención no está particularmente limitado en términos de peso molecular, pero el ácido hialurónico que tiene una alta viscosidad y un peso molecular alto es preferible si una función de proporcionar liberación controlada basada en la difusión retardada sobre la administración local se espera y el ácido hialurónico con una viscosidad baja y un bajo peso molecular es preferible para una administración uniforme si la forma de dosis final es una solución.
El derivado de ácido hialurónico de la presente invención que contiene una unidad de disacárido representada por la fórmula (I) puede ser producido por convertir el carboxi en la molécula de ácido glucurónico en la amida, por ejemplo, mediante la conversión del material de inicio el ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo o similares), preferentemente el ácido hialurónico compuesto exclusivamente por la unidad de disacárido representada por la fórmula (Ilb) en una sal de tetraalquilamonio (por ejemplo, una sal tetrabutilamonio (TBA)) por el intercambio iónico; la reacción de la sal del ácido hialurónico con un compuesto representado por la fórmula HNR6-CHRa-COOR2, donde Rz es un grupo formador de éster para el carboxi de protección y R6 y el Ra son como se definieron antes en este documento, o la fórmula HNR6-CHRa-CONR7R8, donde R7 y R8 son según lo definido en el presente documento anteriormente, en presencia de un agente de condensación adecuado en un solvente; y la eliminación de un grupo de protección (desprotección), si están presentes (paso 1). El grupo de formación de éster no es particularmente limitado mientras sea un grupo generalmente utilizado para la protección de carboxi. Ejemplos del grupo formador de éster incluyen alquilo de Ci.6, bencilo, alcoxi de Ci-6 alquilo de Ci-6 y benciloxi alquilo de C1-6.
Los grupos -NR6-CHRa-COORz y -NR6-CHRa-CONR7R8 en la fórmula (I) pueden ser los mismos o diferentes en cada uno de una pluralidad de unidades de disacáridos presentes. Por ejemplo, los compuestos representados por diferentes fórmulas HNR6-CHRa-COORz y/o HNR6-CHRa-CONR7R8 se pueden usar para realizar la reacción anterior.
Agentes de condensación que se pueden utilizar en la reacción descrita anteriormente incluyen, pero no se limitan particularmente, por ejemplo, 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metilmorfolinio (DMT-MM), N,N'-Carbonildiimidazol (CDI), N,N'-Diciclohexilcarbodiimida (DCC), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihldroquinolina (EEDQ), 2-benzotriazol-l,l,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (HODhbt), benzotriazol-1-oxi-trispirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), benzotriazol-1-il-oxi-tris (dimetilamino)fosfonio hexafluorofosfato (BOP), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodilmida (EDC), o puede utilizarse N-hidroxisuccinimida (NHS).
Sin limitación particular, DMT-MM es preferible que la reacción sea altamente eficiente en un solvente mezclado del agua y un solvente orgánico. Además, el uso de DMT-MM como un agente de condensación permite la formación altamente selectiva de enlace amida entre amino y carboxi mientras se suprime la formación del enlace de éster en el sistema con un gran número de hidroxi. El uso del agente de condensación evita, por ejemplo, la reacción entre el solvente alcohol y carboxi en la molécula de ácido hialurónico y el enlace intramolecular o intermolecular entre hidroxi y carboxi colocado en la molécula de ácido hialurónico para formar reticulación deseada.
Ejemplos del solvente usado en la reacción descrita anteriormente incluyen agua, dimetil sulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAc), l,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), sulfolano (SF), N-metilpirrolidona (NMP), dioxano (por ejemplo, 1,4-dioxano), metanol, etanol, propanol, butanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano, diclorometano, cloroformo, hexano, éter dietílico, acetato de etilo y solventes mixtos de los mismos. En cuanto a la solubilidad de los materiales de inicio, productos modificados y productos y reactividad de agentes de condensación, DMSO solo o agua/solvente mezclado con DMSO se utiliza preferiblemente. Según un tipo de ácido amino-carboxílico, que es el producto modificado, puede utilizarse para una reacción como una solución de metanol o dioxano.
Ejemplos del compuesto representado por la fórmula HNR6-CHRa-COORz incluyen, por ejemplo, éster de alanina, éster de serina, éster de glicina, éster de treonina, éster de asparragina, diéster del ácido aspártico, éster de valina, éster de leucina, éster de isoleucina, diéster del ácido glutámico, éster de metionina, éster de glutamina, éster de fenilalanina, éster de tirosina y éster de triptófano. Los ésteres anteriores son, por ejemplo, ésteres de alquilo de , ésteres de arilo, ásteres de alcoxi de Ci-6 alquilo Ci_6 , ásteres de alquiladlo de Ci-6 , y preferiblemente ásteres de metilo, ásteres de etilo, ásteres de bencilo, etc.
Ejemplos de compuestos representados por la fórmula HNR6-CHRa-CONR7R8 incluyen alaninamida, serinamida, glicinamida, treoninamlda, asparaginamida, ácido aspartico diamida, valinamida, leucinamida, isoleucinamida, ácido glutaminico diamida, metioninamida, glutaminamida, fenilalaninamida, tirosinamida y triptofanamida.
El grupo hidrofóbico puede introducirse mediante la conversión del carboxi en ácido glucurónico o el grupo -NR6-CHRa-COOH en la fórmula (I) en amida (paso 2). Métodos ejemplares incluyen un método incluyendo convertir un material de inicio ácido hialurónico o su derivado en una sal de amonio de tetraalquilo (por ejemplo, sal de tetrabutilamonio (TBA)) y la reacción de la sal de ácido hialurónico con una amina modificada con un grupo hidrofóbico representado por la fórmula HNR^-Z2, donde R9, Z1, y Z2 son como se definió anteriormente, en presencia de un agente de condensación adecuado en un solvente.
Agentes de condensación que se pueden utilizar en la reacción descrita anteriormente incluyen, pero no se limitan particularmente, 4-(4,6-d¡metoxi-1,3,5-tr¡az¡na)-4-metilmorfolinio (DMT-MM), N,IM'-Carbonildiimidazol (CDI), N,N'-Didclohexilcarbodiimida (DCC), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), 2-benzotriazol-l,l,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (HODhbt), benzotriazol-1-oxi-trispirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), benzotrlazol-1-il-oxi-tris (dimetllamino)fosfonlo hexafluorofosfato (BOP) o l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), o N-hidroxisuccinimida (NHS).
Ejemplos del solvente usado en la reacción de introducción del grupo hidrofóbico incluyen agua, DMSO, metanol, etanol, propanol, butanol, acetonitrllo, DMF, THF, diclorometano, cloroformo, hexano, éter dietílico, acetato de etilo y solventes mixtos de los mismos.
Alternativamente, el grupo hidrofóbico puede ser introducido mediante la conversión de carboxi en ácido glucurónico o el carboxi en el grupo -NR6-CHRa-COOH en la fórmula (I) en sal de tetraalqull amonio (por ejemplo, sal de tetrabutilamonio (TBA)), reaccionando la sal de ácido hialurónico con un radical espaciador en presencia de un agente de condensación adecuado en un solvente (en este paso, la protección y desprotección pueden realizarse, si es necesario), convirtiendo el carboxi (-COOH) y luego la reacción con un reactivo adecuado. Abajo se muestran combinaciones ejemplares de un grupo convertido de carboxi y un reactivo de reacción. donde R9, Z1, Rb, Rc, y Z3 es como se define arriba y Hal representa un átomo de halógeno seleccionado de un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo y un átomo de yodo.
Ejemplos del modo de reacción incluyen reacciones de dehidrohalogenación, reacciones de condensación, reacciones de deshidratación, reacciones de adición nucleófila tal como la adición de Michael, reacción de formación oxidativa de disulfuro, que son reacciones bien conocidas y se pueden seleccionar apropiadamente y llevarse a cabo en condiciones de reacción preferibles por una persona experta en la téenica. Si un producto convertido o producto de reacción tiene carboxi, puede ser convertido en éster de imida del ácido N-hidroxi succínico (en adelante también denominado como "NHS") para reaccionar.
Métodos ejemplares también incluyen un método que incluye la reacción de 2-aminoetil-2-piridildisulfuro con el carboxi en el ácido glucurónico o el carboxi en el grupo -NR6-CHRa-COOH en la fórmula (I) para preparar un derivado del ácido hialurónico modificado con un espaciador teniendo un mercapto modificado con un grupo saliente en la terminal y la reacción de éste con tiocolesterol por una reacción de sustitución nucleofílica para formar un enlace disulfuro.
Métodos ejemplares también incluyen un método incluyendo la preparación de un compuesto modificado con una parte de un espaciador en el carboxi en ácido glucurónico o el carboxi en el grupo -NR6-CHRa-COOH en la fórmula (I) y un compuesto modificado con una parte del espaciador en un grupo esterilo y la reacción de estos compuestos, Mientras que algunos de los ejemplos específicos se enumeran arriba, métodos ejemplares además incluyen, si Y contiene -S-S-, un método que incluye la preparación de un derivado de ácido hialurónico modificado con un espaciador teniendo mercapto en la terminal en el carboxi en ácido glucurónico o ei carboxi en el grupo -NR6-CHRa-COOH en la fórmula (I) y un grupo esterilo modificado con un espaciador teniendo mercapto en el terminal y su reacción de froma oxidativa para formar un enlace disulfuro. En este método, un mercapto puede reaccionar con 2-mercaptopiridina para formar disulfuro, y entonces pueden ser sustituido con los otros mercapto.
No es relevante el orden del paso 1 y paso 2. Por ejemplo, un material de inicio ácido hialurónico (incluyendo una sal del mismo), preferentemente ácido hialurónico compuesto exclusivamente por la unidad de disacárldo representada por la fórmula (Ilb), puede convertirse en una sal de tetraalquil amonio de (por ejemplo, sal de tetrabutil amonio (TBA)), la sal del ácido hialurónico puede reaccionar con una amina modificada con un grupo hidrofóbico representado por HNR^Z^Z2, donde R9, Z1, y Z2 son como se definen antes en el presente, en presencia de un agente de condensación adecuado en solvente y luego el producto de reacción puede reaccionar con un compuesto representado por la fórmula HNR6-CHRa-COORz, donde R2 es un grupo formador de éster para proteger carboxi y R6 y Ra son como se definen aquí antes, o la formula HNR6-CFIRa-CONR7R8, donde R7 y R8 son como se definen aquí antes, en presencia de un agente de condensación adecuado en un solvente .
En una modalidad de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico se obtiene por medio de la reacción de un derivado de ácido hialurónico que contiene una unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb) y una unidad de repetición representada por la fórmula (la): [Fórmula química 27] donde Xa se selecciona hidroxi, -0 Q+, Ci-6 alcoxi y -NR7R8, y Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, y Ra son como se definen en el presente documento anterior] con un compuesto representado por la siguiente fórmula HNR^Z^Z2 [donde R9, Z1, y Z2 son como se definen antes en este documento].
La reacción se lleva a cabo por condensación de carboxi (incluyendo una sal del mismo) y amino para convertir carboxi en amida y un método similar al paso 2 se puede usar.
La presente invención puede contener una unidad de repetición representada por la siguiente fórmula (III). Por consiguiente en una modalidad de la presente invención, presentado es un derivado de ácido hialurónico que contiene una o más unidades de disacárido representadas por (a) fórmula (I) y fórmula (III), (b) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (III), (c) fórmula (I) y fórmula (Ilb) y fórmula (III), o (d) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (Ilb) y fórmula (III).
La unidad de disacárido representada por la fórmula (III): [Fórmula química 28] donde Rlc, R2c, R3c, y R4c se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de C^, formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; R5C es un átomo de hidrógeno, o alquilcarbonilo de C^; Re es un átomo de hidrógeno o alquilo de Ci-6; Rd es un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6, -CO-C(R10)=CH2 o -CO-G4-Xc; R10 es un átomo de hidrógeno o metilo; G4 se selecciona de fenileno, cicloalquileno de C3.8, o -G5-(alquileno de Ci-i0)-G6-, donde en el radical alquileno de Cuo 1-3 fenileno o cicloalquileno de C3.8 se puede insertar; G5 y G6 se seleccionan cada uno independientemente de la unión directa, fenileno o cicloalquileno de C3.8; es mercapto, un átomo de halógeno o un grupo representado por la fórmula: [Fórmula química 29] - - - (CH2)b)c-G-; I, p, y j son números enteros seleccionados independientemente de 2 a 10, R15 y R16 cada uno es un átomo de hidrógeno o hidroxi; a es un número entero seleccionado de 2 o 10; b es un entero seleccionado cada uno independientemente de 2 a 10; c es un entero seleccionado de 1 a 200; Y1 es un átomo de oxígeno o -NRn-; G es un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o -NH-; Rn es un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6 , -CO-(CH2)d-R°, -(CH2)e-Rp o -(CH2)r (Y2-(CH2)g)h-Rq; g es un entero cada uno seleccionado Independientemente de 2 a 10; d, e, f y h son enteros cada uno seleccionado independientemente de 2 a 10; R°, Rp, y Rq cada uno es independientemente un átomo de hidrógeno, hidroxi, carboxi, o -NHRr; Y2 es un átomo de oxígeno o -NH-; Rr es un átomo de hidrógeno, formilo, o alquilcarbonilo de Ci-6.] Métodos ejemplares para producir un derivado del ácido hialurónico según la presente invención que contiene una unidad de disacárido representada por la fórmula (III) incluyen, por ejemplo, un método incluyendo la reacción de la sal de tetrabutil amonio del ácido hialurónico descrito anteriormente con la sal del ácido hialurónico y un compuesto representado por la fórmula HNRe-Yb-Rw, donde Rw es un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6 , -CO-C(R10)=CH2, -CO-G4-Xc, un grupo de protección para hidroxi, un grupo de protección para amino o un grupo de protección para mercapto, y Re, Yb, R10, G4, y Xc son tal como se definen en el presente documento antes, en presencia de un agente de condensación adecuado en solvente, y, si un grupo de protección está presente, se remueve el grupo de protección (desprotección). En la reacción anterior, pueden utilizarse un agente de condensación y un solvente definido aquí anteriormente.
Ejemplos específicos de -CO-G4-Xc incluyen los grupos representados por las siguientes fórmulas: [Fórmula química 30] Ejemplos específicos de un grupo de protección utilizado en la reacción descrita anteriormente se describen en, por ejemplo, T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organlc Synthesis, Tercera Edición, John Wllcy & Sons, Inc., New York, 1999.
Ejemplos del grupo de protección para hidroxl Incluyen alquilcarbonllo de Ci-6 , arllcarbonllo, heteroarllcarbonilo, alcoxicarbonllo de Ci-6 , alcoxl de Ci_6 alquilo de Ci_6 , alquilamlnocarbonilo de Ci-6 , dl(alquilo de Ci-6 )amlnocarbonilo, alquilarilo de Ci_6 , alquilheteroarilo de Ci-6 , alqullaminocarbonll arllo de , alquilo de -6 , alquilsulfonilo de Ci-6 , ((aminoalquilo de Ci-6 )carbonilox¡) alquilo de Ci-6 , heterociclo ¡nsaturado carbonlloxl alquilo de Ci-6 , arlldl(alqu¡lo de Ci-6 jsililo, y trl(alquilo de Ci-6 jsllilo. Ejemplos preferibles del grupo protector para hidroxi incluyen acetilo.
Ejemplos del grupo protector para -NH- o amino incluyen alquilcarbonilo de -6 , arilalquilcarbonilo de Ci-6 , arilcarbonilo, heteroarllcarbonilo, alcoxicarbonllo de Ci-6 , alquilaminocarbonilo de Ci-6 , di(alquilo de Ci-6 jaminocarbonilo, arilalquilo de C1-6 , alquilheteroarilo de Ci-s , y (arilalquilo de Ci-6 )aminocarbonilo. Ejemplos preferibles del grupo de protección para amino incluyen acetilo, t-butoxicarbonilo y 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Por protección, el amino pueden formar un grupo heterocíclico saturado o insaturado como una imida del ácido ftálico, una imida del ácido succínico, i ida del ácido glutárico y 1-pirrolilo.
Ejemplos del grupo protector para mercapto incluyen, por ejemplo, alquiltio de Ci_6 tal como etiltio y t-butiltio, feniltio sustituido tal como 2-nitrofeniltio y 2-carboxi feniltio, y heteroariltio tal como 2-piridiltio. Un ejemplo preferido es 2-piridiltio.
Ejemplos del grupo representado por -NRe-Yb-Rd en la fórmula (III) anterior incluyen los grupos representados por las fórmulas: -NH-CF^- CHR^ji^-G NF^; -NH-CH2-CH2-(Yl-CH2-CH2)e-NH2; -NH-CH2-(CHR16)p-2-CH2-OH; -NH-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)C-OH ; -NH-(CH2)j-SH; |. | - - - - - - . [donde R10, R15, R16, Y1, c, j, I, y p son como se definen aquí, y u es un número entero de 1 a 3.] Los números de CHR15 y CHR16, donde R15 y R16 son hidroxi, contenido en la molécula del derivado del ácido hialurónico cada uno es de 0 a 8, preferiblemente 0 a 3, más preferiblemente de 0 a 1. Al controlar los números de CHR15 y CHR16, donde R15 y R16 son hidroxi, la solubilidad en agua del derivado del ácido hialurónico según la presente invención puede ser controlada. Si todos los R15s son átomos de hidrógeno, preferiblemente I es 2 a 6, y ejemplos específicos incluyen 2 y 6. Si uno del R15s es hidroxi, ejemplos específicos de I incluyen 3. Si Y1 es un átomo de oxígeno, ejemplos específicos de c incluyen 2. Si Y1 es -NH-, ejemplos específicos de c incluyen 1 a 3. Ejemplos concretos de 1 y p incluyen 3.
) (CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-. Preferiblemente Rns son todos átomos de hidrógeno.
Ejemplos específicos de Rd que se unen a estos -(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G- incluyen, por ejemplo, un átomo de hidrógeno, -CO-CH=CH2, -CO-C(CH3)=CH2, -CO-CH2-CI, -CO-CH2-Br, -CO-CH2-I, -CO-CH2-SH, y -CO-CH2-CH2-SH.
Ejemplos específicos del grupo representado por -NRe-Yb-Rd incluyen -NH-(CH2)3-N(- (CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3)-(CH2)2-SH, -NH-(CH2)2-N(-(CH2)3-NH-(CH2)4-NHCOCH3HCH2)3-SH, y -NH-(CH2)S-N(-(CH2)3-NH-(CH2)2-NHCOCH3)-(CH2)2-SH.
Además, ejemplos específicos del grupo representado por -NRe-Yb-Rd incluyen los siguientes grupos: -NH-(CH2)pl-O-C0-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(0H)-CH(0H)-CH2-SH; -NH-(CH2)prNH-C(=NH)-(CH2)3-SH; -NH-(CH2)pi-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH; -NH-(CH2)pl-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH; -NH-(CH2)pl-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH; -NH-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-NH-C(=NH)-(CH2)3-SH; -NH-(CH2-CH2-0)q-CH2-CH2-0-C0-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(0H)-CH(0H)-CH2-SH; -NH-(CH2-CH2-0)q-CH2-CH2-NH-C(=NH)-(CH2)3-SH; -NH-(CH2-CH2-0)q-CH2-CH2-NH-C0-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(0H)-CH(0H)-CH2-SH; -NH-(CH2-CH2-0)q-CH2-CH2-NH-C0-CH(NH2)-CH2-SH; -NH-(CH2-CH2-0)q-CH2-CH2-NH-C0-CH(NH2)-(CH2)2-SH; -NH-CH(CO2H)-(CH2)-SH; -NH-CH(C02H)-(CH2)2-SH; y -NH-CH(C02H)-(CH2)2-C0NH-CH(C0NH-CH2-C02H)-CH2-SH [donde R17 es un átomo de hidrógeno o alquilo de C1-6 , ml representa un entero de 2 a 10, y q representa un entero de 1 a 200.] El porcentaje de la unidad de repetición representada por la fórmula (III) en las unidades de repetición de disacárido existentes es, por ejemplo, 0.1 a 99.5% y preferentemente 1 a 30%.
Métodos ejemplares para producir el derivado del ácido hialurónico según la presente invención que contiene la unidad de disacárido representada por la fórmula (III) incluyen un método (paso 3a) incluyendo la reacción del carboxl (-COOH) del radical del ácido glucurónlco del ácido hialurónico con una diamlna representada por la fórmula H2N-CH2-(CHR15)|.2-CH2-NH2 para convertirlo en una amida representada por la fórmula -CONH-CH2-(CHR15)I-2-CH2-NH2, y además la modificación del amino terminal para convertirlo en una amida representada por el grupo -CONH-CH2-(CHR15)|.2-CH2-NHRd.
Ejemplos específicos de la diamina descritos anteriormente incluyen, por ejemplo, H2N-(CH2)2-NH2, H2N-(CH2)3-NH2, H2N-(CH2)4-NH2, H2N-(CH2)S-NH2, H2N-(CH2)6-NH2, H2N-(CH2)7-NH2, H2N-(CH2)8-NH2, H2N-(CH2)9-NH2, H2N-(CH2)10-NH2, H2N-CH2-CHOH-CH2-NH2, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-NH2, H2N-CH2-CHOH-(CH2)3-NH2Í H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)2-NH2, H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)3-CH2-NH2, H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-NH2, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-NH2, H2N-CH2-CHOH-CH2- Métodos ejemplares para producir el derivado del ácido hialurónico según la presente invención que contiene la unidad de disacárido representada por la fórmula (III) incluyen un método (paso 3b) incluyendo la reacción de carboxi (-COOH) en el radical del ácido glucurónico del ácido hialurónico con una hidroxiamina representada por la fórmula H2N-CH2-(CHR16)p.2-CH2-OH para convertirla en una amida representada por la fórmula -CONH-CH2-(CHR16)p.2-CH2-OH, y además la modificación de la terminal hidroxi para convertirla en el grupo -CONH-CH2-(CHR16)p.2-CH2-ORd. Los pasos combinados 3a y 3b se designan como el paso 3.
Ejemplos específicos de la hidroxiamina descritos anteriormente incluyen, por ejemplo, H2N-(CH2)2-OH, H2N-(CH2)3-OH, H2N-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)5-OH, H2N-(CH2)6-OH, H2IM-(CH2)7-OH, H2N-(CH2)8-OH, H2N-(CH2)9-OH, H2N-(CH2)10-OH, H2N-CH2-CHOH-CH2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)3-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)2-OH, H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-OH, H2N-CH2-(CHOH)3-CH2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-OH, H2N-CH2-CHOH-CH2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-CHOH-CH2-OH, H2N-(CH2)2-(CHOH)2-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)3-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-CHÓH-CH2-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)3-CHOH-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)6-OH, y H2N-(CH2)5-CHOH-(CH2)4-OH.
Estos compuestos están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Sigma-Aldrich Co. LLC. Se pueden sintetizar de acuerdo, o en referencia a un método que se describe en referencia.
Los grupos -NRe-Yb-Rd en la fórmula (III) presente en una pluralidad de unidades de disacárido pueden ser los mismos o diferentes. Por ejemplo, un compuesto representado por una fórmula diferente HNRe-Yb-Rd se puede usar para realizar la anterior reacción.
Si X1 en la fórmula (I) es hidroxi, -0 Q+ o alcoxi de Ci-6 , el grupo -NRe-Yb-Rd puede estar no sólo presente en la posición indicada en una unidad de disacárido representada por la fórmula (III), una parte o todo el grupo puede sustituir X1 en la fórmula (I) con X1 siendo -NRe-Yb-Rd.
El orden del paso 1, paso 2 y el paso 3 no es relevante. Los órdenes preferibles incluyen el orden del paso 1, paso 2, y él paso 3, el orden del paso 2, paso 1 y paso 3 y el orden del paso 1, paso 3 y paso 2.
Los derivados del ácido hialurónico que contienen un enlace doble carbono-carbono reactivo en la unidad de disacárido representada por la fórmula (III) pueden ser sometidos a una reacción de reticulación con un reticulador (por ejemplo, ditiotreitol: DTT, butanoditiol, polietilenglicolditiol) que tiene 2 o más grupos mercapto. El derivado de ácido hialurónico que contiene mercapto en la unidad de disacárido representado por la fórmula (III) puede ser sometido a una reacción de reticulación por la formación de disulfuro con un reticulador (por ejemplo, ditiotreitol: DTT, butanoditiol, polietilenglicolditiol) que tiene 2 o más grupos mercapto o una reacción de reticulación que usa un reticulador (por ejemplo, divinilsulfona) que contiene 2 o más enlaces dobles carbono-carbono reactivo. El derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede transformarse en gel por reticulación.
Otros ejemplos de la reacción de reticulación incluyen reticulado por una reacción de condensación de un derivado de ácido hialurónico modificado por amino con un reticulador (por ejemplo, bis[sulfosuccinimidil]suberato (BS3), etilenglicol-bis[sulfosuccinimidil]succinato (Sulfo-EGS), clorhidrato de dimetiladipimidato (DMA) o lo similar) que tienen ásteres de succinimidilo u otros ásteres imida en los dos extremos de alquileno de C2-2o reticulado de un derivado de ácido hialurónico modificado por amino con un reticulador (por ejemplo, glutaraldehído) que tiene formilo en ambos extremos de alquileno de C2-20 ; reticulado por la reacción oxidativa bajo condiciones oxidativas (por ejemplo, en la presencia de tetrationato de sodio (STT)) para los derivados de ácido hialurónico modificados con mercapto; reticulado por la reacción de adición de Michael de un derivado de ácido hialurónico modificado con mercapto y un reticulador (por ejemplo, 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), dimetacrilato de etileno (EDMA)) que tiene enlaces insaturados, de, por ejemplo, maleimida (MAL) o metacriloilo en ambos extremos de alquileno de C2-20 ; reticulado por la polimerización radical de un derivado del ácido hialurónico modificado con un enlace insaturado de tal como alcloilo y el metacriloilo y varios iniciadores de polimerización (por ejemplo, peroxodisulfato de potasio (KPS)/N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), Irgacure 2959); y reticulado con un agente de condensación (por ejemplo, N,N'-carbonildiimidazol (CDI), N,N'-didclohexilcarbodiimida (DCC), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metilmorfolinio (DMT-MM), 2-benzotriazol-l,l,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (HODhbt), benzotriazol-1-oxi-tri(pirrolidino)fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), benzotriazol-l-il-oxi-tri(dimetilamino)fosfonio hexafluorofosfato (BOP), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimlda (EDC), o N-hidroxisuccInimida (NHS)) en la presencia de un compuesto diamina (por ejemplo, EDA, 2,2'-(etilenodioxi)bis(etilendiamina)). El reticulado descrito anteriormente puede ser reticulado intramolecular en un derivado de ácido hialurónico o reticulado intermolecular entre derivados del ácido hialurónico plural Las condiciones para el paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención por reticulado químico pueden seleccionarse apropiadamente. Las condiciones para la reticulación incluyen un método de reticulación, la concentración de polímero, la concentración del reticulador, solvente, pH de solvente, concentración de sal, temperatura y tiempo.
En el paso de gelificación del derivado de ácido hlalurónico de acuerdo con la presente Invención, la densidad de la reticulación del gel producido puede incrementarse, por ejemplo, al incrementar la concentración de polímero en la reticulación química y relación de introducción de grupos reticulables entre las condiciones de reacción de la reticulado.
Cuando un reticulador que tiene grupos reticulables en ambas terminales se agregan al derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención en el paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico, el reticulador preferiblemente se agrega al derivado de ácido hialurónico en una relación del reticulador al derivado de ácido hialurónico, donde la relación (por ejemplo, la relación molar) es tal que los grupos pueden participar rápidamente en la reacción de reticulación sin exceso o deficiencia. Por ejemplo, preferiblemente la relación molar del grupo SH:grupo MA = 3:1 a 1:3, y particularmente preferiblemente 2:1 a 1:2, cuando el polímero que contiene metacriloilo (grupo MA) es reticulado por la reacción de adición de Michael con DTT.
El solvente en el paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención es preferiblemente un solvente que puede disolver suficientemente polímeros y reticuladores, y sin limitación particular, agua, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMAc), dimetilformamlda (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) y solventes mezclados de aquellos seleccionados del mismo son preferiblemente usados. Además, un solvente orgánico que es miscible con estos solventes puede mezclarse y usarse. El solvente orgánico que es miscible no es particularmente limitado, pero sus ejemplos incluyen, por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, acetona y acetonitrilo.
La estructura de reticulado químico que el gel del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención tiene puede contener una estructura para desintegrarse en el cuerpo. Por ejemplo, sin limitación particular, los grupos que tienen un enlace éster y metacriloilo pueden utilizarse como un grupo para ser sometidos a una reacción de reticulación. Además, un compuesto que tiene un enlace éster tal como Sulfo-EGS o EDMA, o un compuesto que tiene un espaciador de péptido digestible con una enzima en el cuerpo viviente puede utilizarse como un reticulador. Además, un gel reticulado por enlaces disulfuro formados por la oxidación de mercapto se desintegra en el cuerpo viviente por una reacción de intercambio de disulfuro y una reacción de reducción. Debido a que el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención tiene una estructura de reticulación química degradable, la tasa de degradación del gel del derivado de ácido hialurónico puede ser controlada en el cuerpo viviente y por lo tanto la tasa de liberación del fármaco se puede controlar.
El derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención forma nano-partículas en una solución acuosa, y por lo tanto puede ser formado en partículas de gel finas de tamaño nano por reticulación bajo una condición diluida, y dichas partículas de gel pueden utilizarse como un portador de liberación controlada en la sangre o un portador de objetivo. La condición diluida se refiere a 10 mg/ml o menos, preferiblemente 5 mg/ml o menos, y más preferentemente 1 mg/ml o menos. Alternativamente, por reticulación bajo una condición de alta densidad, el derivado de ácido hialurónico puede formarse en gel a granel en el cual las partículas finas son reticuladas. Esto es útil como un portador para liberación controlada subcutánea. Una condición de alta densidad se refiere a 5 mg/ml o más, preferiblemente 20 mg/ml o más, y más preferentemente 40 mg/ml.
El paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede ser realizado a granel, o en fase discontinua tal como en emulsión o en gotitas dispersas. Por ejemplo, para llevar a cabo el paso en una emulsión W/O, una fase de agua en la cual un polímero o reticulador se disuelve puede ser emulsionado en un solvente inmiscible en agua y una reacción de gelificación puede llevarse a cabo. Los ejemplos del solvente inmiscible en agua incluyen, sin limitación particular, hexano, cloroformo, diclorometano, acetato de etilo, triglicérido de cadena media (MCT), parafina líquida y aceite de haba. Un agente tensoactivo para estabilizar la emulsificación se puede añadir. Además, el paso puede ser realizado en un solvente que puede ser desplazado (desolvación), por ejemplo, en dióxido de carbono supercrítico o en PEG. En este caso, un gel con una mayor densidad de reticulación puede obtenerse por emulsificación y/o dispersión de un agua o fase solvente orgánico en el cual un polímero, un reticulador, o lo similar se disuelve en un solvente mencionado anteriormente ya que el polímero se concentra en asociación con la desolvación (difusión solvente).
En el paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y después de eso, la operación de detener la reticulación y la operación de desactivación o lavado de un grupo funcional de reticulación restante puede llevarse a cabo. Los grupos funcionales de reticulación que no han participado en la reacción, los grupos que están limitados a solamente un extremo de un reticulador, reticuladores restantes, y lo similar son preferiblemente eliminados en términos de seguridad, estabilidad durante la preservación, y la eliminación de reacciones secundarias con un fármaco encapsulado. Por ejemplo, sin limitación particular, si reticuladores sin reaccionar se mantienen, se pueden eliminar al lavar con agua excesiva. Además, sí el metacriloilo sustituido en un polímero permanece, por ejemplo, mercaptoetanol excesivo puede agregarse para desactivar el metacriloilo, y luego el mercaptoetanol excedente puede ser removido por lavado con el agua en exceso. Adicionalmente, si permanece mercapto, por ejemplo, ácido 3-maleimidopropiónico excedente y/o ácido yodoacético se añade a mercapto desactivado, y luego el ácido 3-maleimldopropiónico excedente y/o ácido yodoacético puede eliminarse mediante el lavado con el agua en exceso.
Un paso de trituración puede llevarse a cabo después del paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. Un método para trituración incluye trituración con el pistilo y mortero y trituración con un molino, pero la trituración con un molino es preferible. Los ejemplos de equipo de trituración por molido incluyen equipo de trituración de disco rotatorio tal como una trituradora de tipo centrífuga (NISSEI Corporation) y un molino de impacto (Dalton Co., Ltd.), equipo de trituración de molido con tamiz tal como un atomizador (Tokyo Atomizer M.F.G. Co., Ltd.), un molino de muestra (Tokyo Atomizer M.F.G. Co., Ltd.), un molino de bantam (Tokyo Atomizer M.F.G. Co., Ltd.) y un molino de SK (Tokken Inc.), equipos de trituración de chorro tal como un molino de chorro super micro de laboratorio (A-0 mil jet, Seishin Enterprise Co., Ltd.), y un molino de linrex (Liquid Gas Co., Ltd.) que puede triturar a temperatura muy baja, pero un molino de SK y un molino de linrex son preferibles.
Un paso de secado puede llevarse a cabo después del paso de gelificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. Los métodos ejemplares para el secado incluyen, por ejemplo, secado por ventilación, secado en un termostato, secado al vacío y secado por circulación de aire caliente. La velocidad de soplado, tiempo de secado, temperatura y presión son seleccionados como sea apropiado como el gel de la presente invención no se descompone o desnaturaliza.
Una composición farmacéutica puede ser preparada por encapsular un fármaco en gel del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. En un aspecto de la presente invención, un derivado de ácido hialurónico que contiene una o más unidades de disacárido representadas por (a) fórmula (I) y fórmula (III), (b) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (III), (c) fórmula (I) y fórmula (Ilb) y fórmula (III), o (d) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (Ilb) y fórmula (III) se pueden reticular utilizando un reticulador, se convierte en gel, y se utiliza como un portador para encapsular un fármaco (un compuesto de bajo peso molecular, una proteína, un péptido o un ácido nucleico). Los métodos ejemplares para encapsular un fármaco incluyen un método de adición de una solución de fármaco para el reticulado de gel de derivado de ácido hialurónico de anticipación. En el método, el fármaco primero es absorbido por la difusión en gel hinchado, y el fármaco absorbido es encapsulado al ser mantenido en los dominios de reticulado físico por la interacción hidrofóbica del gel de derivado de ácido hialurónico. Las condiciones que incluyen, pero no son particularmente limitadas a, solvente, concentración de sal, pH, temperatura, tiempo y adición de desnaturalizante pueden seleccionarse como sea apropiado tal que el fármaco está encapsulado establemente en un alto rendimiento. Por ejemplo, un grado de hinchazón y densidad del cambio de gel derivado de ácido hialurónico y el estado de ionización del fármaco y lo similar también cambia dependiendo de la concentración de sal y pH en el momento de la encapsulamiento de fármaco, por lo tanto las condiciones adecuadas deben ser elegidas en su combinación como sea apropiado. Debido a la repulsión electrostática entre los grupos carboxi del derivado de ácido hialurónico, que lleva a cabo la encapsulamiento del fármaco en una baja concentración de sal resulta en una densidad de gel disminuida, que permite la encapsulamiento de una cantidad incrementada o un peso molecular más alto del fármaco. Después del encapsulamiento de fármacos, aumentar la concentración de sal debilita la repulsión electrostática, aumenta la densidad de gel, y se reduce el tamaño de la malla del gel a menos que el tamaño del fármaco, que hace posible mantener el fármaco firmemente y retrasar la liberación. En el momento, la concentración de sal puede ser una concentración salina fisiológica.
Los métodos ejemplares para encapsular un fármaco también incluyen un método que incluye formar un complejo del fármaco y el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y reticulación para convertir el derivado de ácido hialurónico en gel. Las condiciones que incluyen, pero no son particularmente limitadas a, relación de solventes para la formación de complejo, concentración de sal, pH, temperatura, tiempo, adición de desnaturalizante, concentración del derivado de polisacárido hidrófilo anterior (HP), concentración de fármaco, relación de HP y el fármaco, pueden seleccionarse como sea apropiado tal que el fármaco forma complejo con el nanogel establemente en un alto rendimiento. Los fármacos libres que no forman complejo pueden separarse y eliminarse por diálisis, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) o lo similar. Para la reticulación, es preferible utilizar condiciones de reticulación en que el fármaco encapsulado no es desnaturalizado.
El fármaco encapsulado en gel del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención es liberado por simple difusión del fármaco en el gel, degradación del gel del derivado de ácido hialurónico, y reemplazo del fármaco con un componente biogénico. Si el fármaco es liberado por la difusión del fármaco, la tasa de liberación puede controlarse por la densidad de reticulación del gel y la cantidad e hidrofobicidad del dominio de reticulación. Los ejemplos de la degradación del gel incluyen la degradación del dominio de reticulación química y la degradación de la cadena principal del derivado de ácido hialurónico. Esta degradación causa disminución de la densidad de reticulación (incremento en la relación de hinchazón). La disminución de la densidad de reticulación incrementa la tasa de difusión del fármaco en el gel, y la escisión de enlace también promueve la liberación. La tasa de liberación del fármaco puede controlarse por lo tanto al controlar la degradabilidad del dominio de reticulación química, la degradabilidad de la cadena principal del polímero, y la degradabilidad del espaciador.
El reemplazo con un componente biogénico se refiere a la liberación del fármaco, por ejemplo, por la administración de un gel a un cuerpo viviente, subcutáneamente o en sangre, impregnación de una sustancia tal como una proteína de plasma tal como albúmina o un lípido presente en el cuerpo viviente en el gel, y el reemplazo de una fármaco encapsulado con la sustancia. El gel del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede suprimir el reemplazo del fármaco con un componente biogénico asociado con impregnación del componente no sólo por reticulación física entre grupos hidrofóbicos, sino también por la reticulación química descrita anteriormente. Las tasas de impregnación de componentes biogénicos pueden controlarse por la densidad de reticulación del gel y cargas eléctricas en el gel. Cuando un fármaco es encapsulado por la adición de una solución de fármacos después de la formación de gel por reticulación descrita anteriormente, las condiciones de encapsulamiento pueden seleccionarse como sea apropiado para facilitar la absorción de fármaco en gel durante la encapsulamiento, y suprimir la impregnación de componentes biogénicos en el cuerpo viviente. Por ejemplo, sin limitación, si una proteína es encapsulada, la repulsión electrostática entre el derivado de ácido hialurónico y el fármaco puede suprimirse por llevar a cabo el paso de encapsulamiento en las inmediaciones de su punto isoeléctrico. También, al llevar a cabo el paso de encapsulamiento en un pH igual o inferior a pKa (aproximadamente 4.0) de ácido carboxílico derivado del ácido glucurónico en el ácido hialurónico, la carga negativa que tiene el gel puede ser debilitada. Esto suprime la repulsión electrostática entre el gel y las proteínas cargadas con una carga negativa sobre la condición, y hace posible mejorar la eficiencia de encapsulamiento. Además, llevar a cabo el paso de encapsulamiento, por ejemplo, en la concentración de sal más baja que aquella en el cuerpo viviente hace que el gel se hinche a una tasa de hinchazón más alta que en el cuerpo viviente y facilita el encapsulamiento.
Además, un derivado de ácido hialurónico modificado con un grupo hidrofóbico y un grupo funcional de reticulación de la presente invención puede transformarse en gel por reticulación química en la coexistencia de un derivado del polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico. Específicamente, al mezclar y reticular un derivado de ácido hialurónico modificado con un grupo hidrófobo y un grupo funcional que tiene un enlace insaturado de acuerdo con la presente invención y un derivado del polisacárido hidrófilo y un grupo hidrofóbico, un gel derivado de ácido hialurónico en el que el derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico es físicamente encapsulado puede ser preparado.
El derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico es un polisacárido hidrófilo que puede obtenerse mediante la introducción de un grupo hidrofóbico en un polisacárido hidrófilo o su derivado por lo menos uno o más por una molécula de polisacárido. El polisacárido hidrófilo no es particularmente limitado, pero es preferible pululano, amilopectina, amilosa, dextrano, manano, levan, inulina, quitina, quitosan, ácido hialurónico, o dextrina. Estos polisacáridos que tienen varios pesos moleculares promedio pueden obtenerse comercia Imente o de acuerdo con un método descrito en la literatura. Los polisacáridos hidrófilos particularmente preferidos son pululano, ácido hialurónico y dextrina. Preferiblemente, la dextrina es dextrina Cluster (marca registrada). La dextrina Cluster (marca registrada) puede ser obtenida comercialmente de Ezaki Glico Co., Ltd. y utilizada. El grupo hidrofóbico no es particularmente limitado, pero es preferiblemente un grupo tal como un grupo hidrocarburo de C8-5o, un grupo de estenio, un grupo de ácido poliláctico (PLA), un grupo de copolímero de ácido poliláctico-ácido glicólico (PLGA), o un grupo que contiene dicho grupo. Un grupo particularmente preferible es un grupo que contiene un grupo colesterilo, un alquilo de C8-3o lineal o ramificado o un grupo que contiene dicho grupo. El grupo hidrofóbico puede introducirse mediante un espaciador.
Los ejemplos del derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico incluyen el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. En consecuencia, las partículas finas compuestas por el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención pueden ser encapsuladas en un gel adecuado.
El derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico puede ser preparado por métodos conocidos. Un derivado de polisacárido hidrófilo (en lo sucesivo también denominado "pululano de colesterol" y "CHP") en el que N-[6-(colesteriloxicarbonilamino)hexil]carbamoilo como un grupo hidrofóbico es introducido en hidroxi en pululano como polisacárido hidrófilo es comercialmente disponible (por ejemplo, de NOF Corporation). El derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico forma partículas finas (nanogel) que tienen estructura de gel de nanotamaño (1 a 1000 nm) por asociación espontánea de varias moléculas por interacción hidrofóbica en una solución acuosa, y por lo tanto es capaz de formar un complejo con un fármaco hidrofóbico, o una proteína o un péptido que tiene una eficacia.
El peso molecular del derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico utilizado en la presente invención no está particularmente limitado, pero es preferiblemente 1 kDa a 1000 kDa, y más preferiblemente 10 kDa a 300 kDa. El derivado de polisacárido hidrófilo anterior puede ser también una sal farmacéuticamente aceptable.
Además, por ejemplo, hidroxi contenido en el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y el derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico también está disponible como un grupo reticulable. En consecuencia, hidroxi en el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y el derivado de polisacárido hidrófilo que tiene un grupo hidrofóbico puede ser reticulado por un reticulador particular, por ejemplo, divinilsulfona (DVS), carbodiimida, o un reticulador que tiene glicidil éter en ambos extremos de alquileno de C2-2o· Cuando los grupos carboxi de un ácido hialurónico son sustituidos con clases plurales de sustituyentes, estos sustituyentes pueden introducirse concomita ntemente o consecutivamente.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, un derivado del ácido hialurónico definido aquí caracterizado en que el derivado de ácido hialurónico forma partículas finas por la asociación de agua se proporciona. El derivado de ácido hialurónico tiene una propiedad de formar partículas finas de nanoescala por la asociación espontánea en agua debido a, sin limitación, interacción hidrofóbica del grupo introducido -NR9-!1-!2. Para construir un sistema de suministro de fármaco deseado, las nanopartículas formadas por el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención son uno de los medios muy potentes, y pueden ser utilizados como una cápsula para el suministro de una proteína, un péptido, o un compuesto de bajo peso molecular que es un ingrediente activo en el sitio objetivo mientras que se mantienen en un dominio hidrofóbico formado dentro. Un fármaco puede ser suministrado también al sitio objetivo por la conjugación del fármaco.
Las partículas finas de nanoescala pueden ser administradas sistémicamente, y particularmente intravenosamente, y pueden ser utilizadas como portadores para liberación de fármaco controlada en la sangre, por el cual los fármacos encapsulados (que forman complejo) son liberados en la sangre de manera controlada, o para dirigir, por el cual los fármacos son suministrados selectivamente a las células y los órganos objetivo. Cuando se utilizan como portadores para dirigir, los elementos dirigidos pueden agregarse por dirección a cada uno de los órganos y células. Los ejemplos del elemento dirigido incluyen péptidos específicos de tejido objetivo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, péptidos RGD para las células cancerosas, ácido fólico, anisamida, transferrina, galactosa para el hígado, y tocoferol. Para mejorar la retención del fármaco en la sangre, derivados del ácido hialurónico pueden ser químicamente reticulados adicionalmente.
Las moléculas más pequeñas que un cierto tamaño son conocidas por excretarse por el riñón. Por ejemplo, polietilenglicol (PEG), que es un polímero lineal como el ácido hialurónico, está teniendo un peso molecular de 40 kDa o menos se reporta por ser excretado por el riñón (Europian Journal of Cáncer. Vol.31, p. 766-770, 1995). Por lo tanto, los ácidos hialurónicos y derivados de ácido hialurónico que tienen un peso molecular en el mismo orden pueden ser eliminados inmediatamente de la sangre. Sin embargo, derivados HA modificados con un grupo hidrofóbico de la presente invención pueden formar complejos por asociación y pueden por tanto usarse como portadores para liberación controlada de fármaco en la sangre y para dirigir incluso si los derivados HA tienen pesos moleculares menores que aquellos de PEG que se excretan por el riñón.
Las partículas finas de un derivado de ácido hialurónico están formadas por la auto-asociación en una solución acuosa, y pueden ser por lo tanto formadas al disolver el derivado de ácido hialurónico sólido en el agua o una solución salina acuosa. Alternativamente, se pueden formar partículas finas al disolver un derivado de ácido hialurónico en otro solvente (por ejemplo, DMSO), y luego reemplazar el solvente con agua o una solución salina acuosa. La sonicación puede realizarse para formar tamaños similares de partículas finas.
Al incrementar la relación de introducción del grupo hidrofóbico en el derivado de ácido hialurónico reduce la solubilidad en el agua. Para formar las partículas finas que pueden ser dispersadas en una solución acuosa, el derivado de ácido hialurónico que ha sido preparado para que el grupo hidrofóbico introducido por enlace covalente es 80% o menor, y preferiblemente 60% o menos se utiliza preferiblemente.
Puesto que el ácido hialurónico tiene carboxi, el cual es un grupo de disociación, al incrementar la fuerza iónica en el sistema se reduce su solubilidad. En consecuencia, al controlar la relación de introducción, un derivado de ácido hialurónico que se disuelve en bajas concentraciones de sal o en condiciones libres de sal y agregado o precipitado en concentraciones fisiológicas de sal puede ser preparado. Esto puede utilizarse como una matriz para una formulación de liberación controlada subcutánea. Los derivados del ácido hialurónico modificados con un grupo hidrofóbico en tal grado que se forman las partículas finas estables a concentraciones fisiológicas de sal pueden utilizarse como portadores del fármaco para las administraciones sistémicas.
Los tamaños de partícula de partículas finas que se forman no son particularmente limitados, sino preferiblemente 200 mhh o menos, y más preferiblemente 100 mlti o menos para permitir el paso a través de agujas sin obstrucción cuando se administra por inyección. Para la administración intravenosa, los tamaños de partícula son preferiblemente 500 nm o menos, y más preferiblemente 200 nm o menos para evitar la obstrucción de los vasos sanguíneos periféricos. Además, para evitar la absorción por el sistema reticuloendotelial y mejorar la retención en la sangre, los tamaños de partícula son preferiblemente 100 nm o menos, y más preferiblemente 50 nm o menos.
El derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado como un portador del fármaco en una formulación farmacéutica, y una composición farmacéutica que contiene el derivado de ácido hialurónico de la presente invención y puede proporcionar un fármaco. Puesto que el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención espontáneamente puede formar un complejo con el fármaco en una solución acuosa sin operaciones especiales, es posible fácilmente formar un complejo portador-fármaco y mantener un fármaco al mezclar el derivado de ácido hialurónico y el fármaco en una solución acuosa, y la incubación de la solución. La fuerza impulsora de la formación de complejo es principalmente la interacción hidrofóbica del grupo hidrofóbico del derivado de ácido hialurónico y el fármaco, pero si el fármaco es básico, la interacción electrostática con ácido carboxílico en el derivado de ácido hialurónico puede contribuir. En concentraciones de sal en un cuerpo viviente, la interacción electrostática es más débil, y la interacción hidrofóbica es más fuerte, por lo tanto, los complejos son considerados para ser formados principalmente por interacción hidrofóbica.
Si Z1 es alquileno en las fórmulas (I) y (II) anteriores, conforme más larga es la cadena de carbono del alquileno, mayor es la hidrofobicidad del grupo, y las partículas finas más firmes pueden ser formadas por la mayor interacción hidrofóbica. Además, el alquileno más largo produce el enredo intermolecular más grande y la viscosidad más alta. Los tamaños de las partículas finas pueden controlarse también cambiando la longitud de alquileno.
Si el radical enlazador (espaciador) en un grupo hidrofóbico es éster o carbonato (por ejemplo, X1 o X2 contiene -COO-Z3 o - O-COO-Z3), éster o carbonato se degrada en el cuerpo viviente y la hidrofobicidad del derivado de ácido hialurónico se disminuye. Esto aumenta la biodegradabilidad y es preferible en materia de seguridad. Además, el tejido tumoral es conocido por haber disminuido el pH alrededor del tejido. Al tener dicho espaciador, el montaje del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención que mantiene un fármaco de interés puede desintegrarse alrededor del tumor para liberar el fármaco alrededor del tumor.
Particularmente, si el enlazador es un enlazador que tiene la estructura de éster tiocarboxilato b tal como -OCO-CH2-CH2-S-, la degradación es promovida por una leve disminución en el pH (a pH 6 o lo similar). Por lo tanto, responde al cambio de pH más agudo que el éster habitual. Si se pretende suministrar un fármaco en las células, dicho enlazador responde a la disminución del pH en endosomas, y es capaz de liberar el fármaco solamente después de la absorción celular del fármaco.
Si un radical enlazador (espaciador) tiene un enlace disulfuro (por ejemplo, X1 o X2 contiene -S-S-Z3), el enlazador se descompone bajo condiciones de reducción y el montaje del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención se desintegra debido a la disminución de la hidrofobicidad de los derivados de ácido hialurónico. Ya que el citoplasma es conocido por ser un ambiente de reducción, al encapsular un fármaco en un derivado de ácido hialurónico que contiene este enlazador y administrarlo, es posible liberar el fármaco sólo en el citoplasma pero no en la sangre.
Las condiciones durante la formación de complejo de portador-fármaco, tal como solvente, concentración de sal, pH, temperatura, tiempo y adición de desnaturalizante, pueden ser cambiadas como sea apropiado depende del fármaco a ser utilizado. Por ejemplo, dependiendo de la concentración de sal y pH durante la encapsulamiento del fármaco, el derivado de ácido hialurónico cambia en la densidad y el fármaco es también variado en el estado de ionización. Los ejemplos de los desnaturalizantes que se utilizarán incluyen urea, clorhidrato de guanidina y dodecilsulfato de sodio. Si se agrega un desnaturalizante, el desnaturalizante excedente puede eliminarse al lavar con agua excesiva después de la formación de complejo.
Por ejemplo, sin limitación, si un complejo del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y una proteína se forma, la cantidad de la proteína contenida en el complejo puede aumentarse mediante la realización de la formación de complejo en las proximidades del punto isoeléctrico, ya que esto puede suprimir la repulsión electrostática del derivado de ácido hialurónlco y la proteína. Además, al llevar a cabo el paso de la formación de complejo en las condiciones de pH Igual o inferior a pKa (aproximadamente 4.0) de carboxi en el radical de ácido glucurónico, la cantidad de la proteína contenida en el complejo puede ser aumentada puesto que la carga negativa que el derivado de ácido hialurónico tiene puede ser debilitada y la repulsión electrostática puede ser suprimida, si la proteína está cargada eléctricamente con una carga negativa en las condiciones. Además, al llevar a cabo el paso de formación de complejo, por ejemplo, en una concentración de sal más baja que aquella en el cuerpo viviente, la cantidad de la proteína contenida en el complejo puede ser aumentada puesto que la densidad de las partículas finas del derivado de ácido hialurónico formada en la solución acuosa disminuye. Además, al aumentar la concentración de sal en dicho estado, la densidad de las partículas finas se puede incrementar y la proteína puede ser encapsulada firmemente.
La formación de complejo del derivado de ácido hialurónico y la proteína puede estar influida por el peso molecular de la proteína. Generalmente, conforme menor el peso molecular de la proteína tiene, mayor es la velocidad de transferencia de la proteína en las partículas finas del derivado de ácido hialurónico. Además, la densidad de las partículas finas dependiendo de la relación de Introducción del grupo hidrofóbico puede afectar la velocidad de la formación de complejo con la proteína y la cantidad de la proteína contenida en el complejo.
La liberación del fármaco desde el complejo del derivado de ácido hialurónico y el fármaco en el cuerpo viviente es promovida por el reemplazo del fármaco con los componentes en el cuerpo viviente, además de la difusión del fármaco desde el complejo. La liberación controlada del fármaco puede controlarse aumentando o disminuyendo la densidad de las partículas finas para controlar esta difusión y reemplazo.
El cuerpo viviente contiene componentes biogénicos tal como proteínas de plasma y lípidos. Cuando un complejo de un derivado de ácido hialurónico y un fármaco administrado al cuerpo viviente tal como subcutáneamente o en la sangre, el fármaco puede ser liberado al reemplazar el fármaco en el complejo con estos componentes en el cuerpo viviente. La albúmina se espera que sea una proteína biogénica principal que causa dicho reemplazo. Al disminuir la relación de introducción del· grupo hidrofóbico en el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención, las cargas negativas de carboxi en el radical de ácido glucurónico pueden aumentarse, y reemplazarse con albúmina (pl = 4.6), que tienen una carga negativa, puede ser suprimidas.
Los métodos ejemplares para usar el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención como un portador de fármaco incluyen un método de permitir que el derivado forme espontáneamente un complejo con un fármaco en una solución acuosa descrita anteriormente, así como un método para hacer un conjugado en el cual el fármaco se acopla con el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, en otro aspecto de la presente invención, un conjugado de derivado de ácido hialurónico-fármaco en el cual uno o más de los fármacos descritos anteriormente están acoplados a un derivado de ácido hialurónico que contiene una unidad de disacárido representada por la fórmula (I) se proporciona. En una modalidad de este aspecto, como el derivado de ácido hialurónico, un derivado de ácido hialurónico que contiene una o más unidades de disacárido representadas por (a) fórmula (I) y fórmula (III), (b) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (III), (c) fórmula (I) y fórmula (Ilb) y fórmula (III), o (d) fórmula (I) y fórmula (II) y fórmula (Ilb) y fórmula (III) pueden utilizarse. Por ejemplo, por acoplamiento de hidroxi, amino, mercapto, un átomo de halógeno (tal como bromo y yodo) o enlace doble carbono-carbono reactivo (tal como metacriloilo y acriloilo) contenido en el grupo -NRe-Yb-Rd en la fórmula (III) y el fármaco, el conjugado de derivado de ácido hialurónico-fármaco descrito anteriormente se puede preparar.
Además, entre el grupo -NRe-Yb-Rd y el fármaco, un espaciador representado por la fórmula -G^-G^J-*** donde *** representa el sitio de unión con el fármaco, G1 se selecciona de un enlace directo, -C(=0), - NRS- y -S-, G2 es seleccionado de -(CH2)¡- y -(CH2)qa-(0-CH2-CH2)k-, G3 se selecciona un enlace directo, -C(=0)-NRl-(CH2)r-, y -NRU-C(= 0)-(CH2)ma-, J representa un grupo representado por la siguiente fórmula, [Fórmula química 31] Rs, R£, y Ru se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno y alquilo de Ci-6, i es un entero seleccionado de 1 a 10, qa es un número entero seleccionado de 2 a 10, k es un número entero seleccionado de 1 a 100, r y ma son números enteros independientemente seleccionados de 1 al 10] puede introducirse además.
Los ejemplos específicos de fórmula incluyen, por ejemplo, las siguientes fórmulas: [Fórmula química 32] , Los grupos hidroxi en la posición 4 del ácido glucurónico y la posición 1 de la acetilglucosamina presenta los extremos de la cadena principal del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención pueden ser convertidos en otro grupo, y ejemplos de dicho grupo incluyen alcoxi de Ci.6, formiloxi, y alquilcarboniloxi de Ci.6.
Para preparar un conjugado del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y un fármaco, un método utilizado en la preparación de un conjugado de un polímero conocido y un fármaco puede usarse y, por ejemplo, las siguientes reacciones pueden utilizarse: una reacción de carboxi del radical de ácido glucurónico del derivado de ácido hialurónico con amino, hidroxi, yodo o bromo en una fármaco o amino, hidroxi, bromo o yodo introducido en un fármaco; una reacción de hidroxi en la posición 6 del radical de N-acetilglucosamina del derivado de ácido hialurónico con carboxi en un fármaco o carboxi introducido un fármaco; una reacción de amino introducido en el derivado de ácido hialurónico con carboxi en un fármaco o carboxi introducido un fármaco; una reacción de amino introducido en el derivado de ácido hialurónico con un fármaco convertido en un grupo tal como isotiocianato, isocianato, acilazida, éster de NHS, y epóxido por modificación; una reacción de amino en un fármaco o amino introducido en un fármaco con el derivado de ácido hialurónico convertido en un grupo tal como isotiocianato, isocianato, acilazida, carbonilo, éster de NHS y epóxido por modificación; formación de base de Schiff y aminación reductiva de amino en el derivado de ácido hialurónico y un fármaco (tal como aldehido y cetona) que tiene carbonilo o un fármaco en el cual carbonilo se introduce; formación de base de Schiff y aminación reductiva de amino en un fármaco o amino introducido en un fármaco y el derivado de ácido hialurónico en el cual el carbonilo se introduce por la modificación; una reacción de mercapto introducido en el derivado de ácido hialurónico con un fármaco que es un compuesto que tiene un enlace insaturado (tal como maleimida, éster de acrilato, acrilamida, éster de metacrilato, metacrilamida, un compuesto de alilo y vinilsulfona), un haluro (tal como cloroacetatester, éster de bromoacetato, éster de yodoacetato, cloroacetamida, bromoacetamida y yodoacetamida), o tiol o un fármaco convertido en dicho compuesto por modificación; y una reacción de mercapto introducido en un fármaco con el derivado de ácido hialurónico convertido en un compuesto que tiene un enlace insaturado (maleimida, éster de acrilato, acrilamida, éster de metacrilato, metacrilamida, un compuesto de alilo, vinilsulfona), un haluro (éster de cloroacetato, éster de bromoacetato, éster de yodoacetato, cloroacetamida, bromoacetamida, yodoacetamida) o tiol por modificación.
Además, un enlazador (espaciador) que contiene el éster o carbonato utilizado para introducir un grupo hidrofóbico en un derivado de HA y descrito anteriormente, b tioéster, disulfuro o un péptido que es dividido en un sitio específico puede utilizarse como un enlazador para la conjugación con un fármaco. Estos enlazadores están divididos en un sitio objetivo para liberar el fármaco, como se describió anteriormente.
Los reactivos utilizados para la modificación del derivado de ácido hialurónico o el fármaco para la preparación del conjugado no son particularmente limitados, mientras que no cause ninguna reacción indeseable en la preparación del conjugado. Los compuestos son aquellos que están disponibles como un reactivo o que pueden ser sintetizados en referencia a un método conocido para el público a través de la publicación.
Específicamente, al sintetizar el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y hacer reaccionar el derivado con una fármaco que tiene amino o una fármaco en el cual amino se introduce usando a un agente de condensación tal como DMT-MM, un conjugado puede ser preparado por enlace amida. En esta reacción, el fármaco puede añadirse con, por ejemplo, clorhidrato de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo para introducir un grupo hidrofóbico al mismo tiempo. Además, dicho compuesto puede añadirse después o antes del fármaco. Además, el fármaco puede hacerse reaccionar después de la síntesis y la purificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención o un derivado del grupo hidrofóbico puede introducirse después de la síntesis y la purificación del derivado de ácido hialurónico en el cual se introduce el fármaco.
Además, un fármaco puede ser conjugado con un derivado de ácido hialurónico mediante un enlace de éster al sintetizar el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención, y hacer reaccionar un fármaco que tiene hidroxi o un fármaco en la cual hidroxi se introduce usando a un agente de condensación tal como DMT-MM, 1,3-diclorohexil carbodiimida (DCC). En esta reacción, el fármaco puede añadirse con, por ejemplo, clorhidrato de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo para introducir un grupo hidrofóbico al mismo tiempo. Además, dicho compuesto puede añadirse después o antes del fármaco. Sin embargo, es deseable conjugar el fármaco después de la introducción del grupo hidrofóbico para evitar la hidrólisis del éster. El método anterior puede llevarse a cabo en referencia a un reporte (Bioconjugate Vol. 19, 1319-1325, 2008) que paditaxel se introduce en HA por éster.
Además, un fármaco puede ser conjugado al sintetizar el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención, hacer reaccionar un fármaco que es un bromuro o un yoduro o un fármaco convertido en un bromuro o un yoduro por la modificación, y convertir el carboxi en el radical de ácido glucurónico en éster. Es deseable conjugar el fármaco después de la introducción de un grupo hidrofóbico para evitar la hidrólisis del éster.
Un fármaco puede ser conjugado a un derivado del ácido hialurónico mediante un enlace de éster al sintetizar el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención, convertir un fármaco que tiene carboxi o un fármaco en el cual carboxi es introducido en éster de NHS, y hacer reaccionar el carboxi con hidroxi en la posición 6 del radical de N-acetilglucosamina. En esta reacción, el fármaco puede añadirse después de introducir un grupo hidrofóbico en HA por, por ejemplo, clorhidrato de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo, o el fármaco puede añadirse antes de la introducción. Además, el fármaco puede hacerse reaccionar después de síntesis y purificación del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención o un derivado de grupo hidrofóbico puede introducirse después de la síntesis y purificación del derivado de ácido hialurónico en el cual un fármaco se introduce. Para evitar la hidrólisis del enlace de éster, es deseable conjugar el fármaco después de la introducción de un derivado del grupo hidrofóbico. El método anterior puede llevarse a cabo en referencia a un reporte (Publicación Internacional No. 2009/074678) esta camptotecina se introduce en HA por enlace de éster.
En una modalidad, amino puede ser introducido por la reacción de deshidratación del carboxi del radical de ácido glucurónico y diamina tal como etilendiamina después de la síntesis del derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención. Además, un derivado de ácido hialurónico en el cual yodoacetilo se introduce puede ser sintetizado por hacer reaccionar yodoacetato de N-succinimidilo (PIERCE) o N-succinimidilo [4-yodoacetilo] aminobenzoato (PIERCE) con amino. Un fármaco que tiene mercapto puede ser conjugado con este derivado de ácido hialurónico. Este método es particularmente efectivo para los fármacos de alto peso molecular, tal como proteínas, péptldos y ácido nucleico, que tienen muchos grupos reactivos, tal como aminoácidos, puesto que la conjugación puede ser mercapto selectivamente. En esta reacción, la introducción del fármaco puede ser antes o después de la introducción de un derivado del grupo hidrofóbico en HA.
El derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención en que X1 es -NH2-COO-R es sintetizado y una parte de los grupos carboxi en el radical de ácido glucurónico se hace reaccionar con clorhidrato de 2-aminoetil 2-piridil disulfuro. A este derivado de ácido hialurónico, un fármaco que tiene mercapto y un fármaco en el cual mercapto se introduce puede introducirse por la reacción de intercambio de enlace disulfuro, es decir, una reacción de sustitución.
En esta reacción, la longitud de un enlazador entre el fármaco y el derivado de ácido hialurónico puede ajustarse para mantener la bioactividad del conjugado efectivo. Además, un enlazador de péptido cortado con una enzima en un sitio específico en el cuerpo viviente se puede introducir. Por ejemplo, esto puede hacerse en referencia a un reporte (Publicación International No. 2005/095464) que el metotrexato se introduce en HA vía un enlazador que contiene un péptido y un reporte (Publicación Internacional No. 2002/090209) donde la doxorrubicina se introduce mediante un enlazador que contiene HPMA (N-(2-hidroxipropil)metacrilamida) y un péptido o lo similar.
Además, hay muchos reportes en ADC (Conjugado de fármaco de anticuerpo) en el que un compuesto de bajo peso molecular es conjugado a un anticuerpo (Publicación Internacional No. 2009/026274; Expert Opinión. Vol. 15, p.1087-1103, 2005; Bioconjugate Chem. Vol. 19, p. 1960-1963, 2008; Bioconjugate Chem. in press, Bernhard Stump et al., Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies) y un conjugado de un derivado de ácido hialurónico y un compuesto de peso molecular bajo puede ser preparado en referencia a éstos.
Una composición farmacéutica que contiene uno o más fármacos y el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención y un conjugado en el cual uno o más fármacos se acoplan con el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede ser en forma de nanopartículas, micropartículas, solución, emulsión, suspensión, gel, micela, implante, polvo o película. El polvo puede producirse por trituración de un sólido obtenido por liofilización o secado por aspersión o producido a partir de un material obtenido por secado de precipitado.
Las composiciones farmacéuticas y conjugados de la presente invención pueden ser administrados vía rutas oral, parenteral, intranasal, intravaginal, intraocular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, Intraperitoneal, intraarticular, intracerebral o intraoral.
Las composiciones farmacéuticas y los conjugados de la presente invención particularmente para liberación controlada en local es preferentemente 200 mlti o menos, y más preferentemente 100 m?h o menos, para pasar a través de las agujas sin obstrucción.
Las composiciones farmacéuticas y los conjugados de la presente invención particularmente para dirigir a un receptor de ácido hialurónico que incluye CD44 son preferiblemente 5 mlh o menos en tamaño.
Las composiciones farmacéuticas y los conjugados de la presente invención particularmente para la retención extendida en la sangre y acumulación de tejido del tumor o tejido inflamatorio son preferiblemente 500 nm o menos, y más preferiblemente, 200 nm o menos en tamaño. Además, es preferible 100 nm o menos para evitar la absorción en el sistema reticuloendotelial y mejorar la retención en la sangre.
Las composiciones farmacéuticas y los conjugados de la presente invención para una administración de no agresión de aquellos que tienen una propiedad de adhesión a la membrana mucosa es preferiblemente 200 m?ti o menos en tamaño. En términos de la adhesión a la membrana mucosa, la relación de introducción de un grupo hidrofóbico en el derivado de ácido hialurónico para utilizarse es preferiblemente baja.
Los fármacos que forman un complejo con el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención no son particularmente limitados mientras pueden ser mantenidos. Además, los fármacos que se acoplan con el derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención no son particularmente limitados, mientras un conjugado puede ser preparado. Los ejemplos de los fármacos incluyen proteína y/o péptido, pollsacárido, ácido nuclear, compuestos de bajo peso molecular, y ejemplos preferibles incluyen proteína y/o péptido.
Los ejemplos de los compuestos de bajo peso molecular incluyen, por ejemplo, agentes anticancerígenos (tal como, por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides tal como paclitaxel), fármacos ¡nmunosupresores tal como ciclosporina, agentes antiinflamatorios (tal como, agentes antiinflamatorios no esteroides y esteroides), agentes antirreumáticos, y antibióticos (tal como antibióticos beta-lactama, antibióticos derivados de aminoglucósidos, antibióticos derivados de macrólidos, antibióticos de tetraciclina, antibióticos de quinolona novedosos y fármacos sulfa).
Los ejemplos de las proteínas y los péptidos incluyen, por ejemplo, eritropoyetina (EPO), factor de estimulación de colonia de granulocitos (G-CSF), ¡nterferón-a, b, g, (INF-a, b, g), trombopoyetina (TRO), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión del factor de necrosis tumoral (TNFbp), interleucina-10 (IL-10), tirosina quinasa tipo FMS (Flt-3), hormona del crecimiento (GH), insulina, factor de crecimiento 1 tipo insulina (IGF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), antagonista del receptor de interleucina IL-1 (IL-lra), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de célula madre (SCF), factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF), osteoprotegerina (OPG), leptina, parathormona (PTH), factor de crecimiento de fibroblasto básico (b-FGF), proteínas morfogenéticas óseas (BMP), péptido natriurético atrial (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), péptido natriurético tipo C (CNP), péptido 1 tipo glucagón (GLP-1), anticuerpo, cuerpo de diagrama, mini-cuerpo y fragmentos de anticuerpos.
Los ejemplos de los ácidos nucleares incluyen, por ejemplo, ADN, ARN, antisentido, señuelo, ribozima, ARN de interferencia pequeña y aptámero de ARN.
El derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención en el cual un fármaco se encapsula o el conjugado de fármaco derivado de ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención puede ser administrado en una composición farmacéutica que contiene uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes, adyuvantes, conservantes, reguladores de pH, aglutinantes, y/o estabilizadores en cualquier forma adecuada dependiendo de la ruta destinada de la administración. La ruta de administración puede ser una ruta parenteral o una ruta oral.
De acuerdo con la presente invención, una liberación controlada prolongada de fármacos tal como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y compuestos de bajo peso molecular, que no era posible con una preparación de liberación controlada convencional, y/o formulaciones de liberación controlada segura y composiciones farmacéuticas que tienen una biodegradabilidad apropiada se pueden proporcionar.
EJEMPLOS Las modalidades preferidas específicas de la presente invención se describirán como ejemplos posteriormente.
La unidad HA descrita posteriormente se refiere a una unidad de repetición de N-acetilglucosamina-ácido glucurónico (1 unidad) en ácido hialurónico. La medición de espectros RMN se realiza mediante el uso de JNM-ECA500 (JEOL Ltd.). La diálisis se realiza utilizando una membrana de diálisis hecha de celulosa regenerada (Poro de espectros 4: corte de peso molecular: 12 k ~ 14 kDa, cuando se utiliza la sal de sodio de ácido hialurónico que tienen pesos moleculares de 50 kDa y 99 kDa como material de inicio; poro de espectros 7: corte de peso molecular: 1 kDa o 2 kDa, cuando se utiliza la sal de sodio de ácido hialurónico con un peso molecular de 10 kDa como material de inicio).
EJEMPLO 1 Síntesis de derivado de ácido hialurónico EJEMPLO 1-1 Preparación de clorhidrato de carbamato colesterilo 6-amíno hexilo Trietilamina (TEA, 1.05 mi) se añadió a una solución de cloroformiato de colesterilo (3.37 g, 7.5 mmol) en diclorometano anhidro (20 mi) bajo atmósfera de argón y la mezcla se agitó. 6-(t-Butoxicarbonil)amino-1-aminohexano (1.12 mi, 5 mmol) se agregó gota a gota en hielo, la mezcla se agitó en hielo durante 30 minutos, y luego se calentó a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con agua ultrapura y salmuera saturada y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Luego se destiló el solvente bajo presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía de columna en gel de sílice (eluyente: acetato de etilo: n-hexano = 1:4). Las fracciones que contienen el objetivo se combinaron y el solvente se destiló bajo presión reducida. El residuo resultante se disolvió en acetato de etilo (40 mi), y una solución de ácido clorhídrico 4N/acetato de etilo (40 mi) se añadió. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y el precipitado resultante se recogió por centrifugación. El sólido obtenido se lavó con acetato de etilo 4 veces, y luego se secó bajo presión reducida para obtener clorhidrato de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (Chol-C6) (1.2 g). El espectro de RMN (EtOH-d6) del producto se mostró en la figura 1.
EJEMPLO 1-2 Formación de sal de tetrabutil amonio (TBA) de resina de intercambio catiónico DOWEX (marca registrada) 50WX-8-400 (Sigma-Aldrich) se suspendió en agua ultrapura y la resina se lavó 3 veces O LO SIMILAR con agua ultrapura por decantación. Un 40% en peso de solución acuosa de hidróxido de tetrabutil amonio (TBA-OH; Sigma-Aldrich) se añadió a la resina en aproximadamente 1.5 equivalentes mol por capacidad de intercambio catiónico y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La solución excedente de TBA-OH se removió por decantación, luego el lavado se repitió con el agua ultrapura excesiva, y finalmente la filtración de la solución con un filtro de 0.45 mhti para obtener sal TBA de la resina de intercambio catiónico.
EJEMPLO 1-3 Preparación de sales TBA de HA Las sales de sodio de ácido hialurónico (HA-Na, Shiseido Co., Ltd.) que tienen pesos moleculares de 10 kDa, 50 kDa, y 99 kDa cada una se disuelve en agua ultrapura en una concentración de 15 mg/ml. Las suspensiones de la sal de TBA de resina de intercambio catiónico preparada en el ejemplo 1-2 se añadió en 5 equivalentes mol por mol de unidad HA (peso molecular unitario 401.3) en términos de capacidad de intercambio iónico de la resina. Después de agitar por 15 minutos, las suspensiones se filtraron con un filtro de 0.45 0.45 mlh. El filtrado se secó por congelación para obtener sales TBA de ácido hialurónico (HA-TBA) como sólido blanco.
Como un ejemplo representativo, el espectro ^-RMN del producto producido a partir del material de inicio 99 kDa HA-Na en D20 como un solvente se muestra en la figura 2. Basándose en el valor integrado de señales (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) derivado de acetilo en glucosamina en HA y el valor integrado de señales (N(CH2CH2CH2CH3)4, 1.4, 1.7 ppm; 16H) derivado de cuatro grupos de etileno en TBA, las relaciones de cantidad de unidades de TBA a HA se calcularon. Los pesos moleculares promedio unitarios de HA-TBA se calcularon de estas relaciones. Por ejemplo, el peso molecular promedio unitario de HA-TBA producido a partir del material de inicio 99 kDa HA-Na es 752.6.
EJEMPLO 1-4 Síntesis de un derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-alanina (Ala) v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Ala-Chol/FL) Las soluciones (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizadas a partir de los materiales de inicio HA-Na (10 kDa, 50 kDa, 99 kDa) en el ejemplo 1-3 de DMSO anhidro se preparan. Posteriormente, clorhidrato de éster L-alanina etilo (Aldrich) se añadió en 5 equivalentes mol por unidad de HA. Cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMT-MM) entonces se agregó en 6 equivalentes mol por unidad de HA. Las mezclas se agitaron a temperatura ambiente durante la noche. Las soluciones de reacción se dializaron contra una solución acuosa de NaCI 0.3M y con agua ultrapura en este orden. A los dializados resultantes se añadió NaOH 2N a pH 12.5 o más y las mezclas se agitaron durante 1 hora para hidrolizar el éster etílico para desproteger el carboxi. Las mezclas posteriormente se neutralizaron con HCI 2N, se dializaron adicionalmente, y luego se secaron por congelación para obtener HA-Ala como sólido blanco. Un ejemplo representativo del espectro de ^-RMN de HA-Ala (el producto producido a partir del material de inicio 99 kDa HA) medido en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 3.
Basándose en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.4 ppm; 3H) en alanina, relación de introducción de alanina (relación de introducción de Ala) en unidades de HA se calculó de acuerdo con la expresión que se muestra a continuación (cuadro 1).
[Fórmula 2] Valor integrado derivado de metilo en Relación de introducción de Ala (%) = _ alanina _ xlOO Valor integrado de acetilo derivado de HA Una suspensión de la sal TBA de la resina de intercambio catiónico preparada en ejemplo 1-2 se añadió a las soluciones acuosas de HA-Ala en aproximadamente 5 equivalentes de mol. Después de agitar por 15 minutos, las suspensiones se filtraron con un filtro de 0.45 0.45 miti. Los filtrados se secaron por congelación para obtener sales de TBA de HA-Ala (HA-Ala-TBA) como sólido blanco. Basado en los espectros de :H-RMN de HA-Ala-TBA, medidos en las mismas condiciones que aquellas descritas en el ejemplo 1-3, las relaciones de cantidad de unidad TBA a HA se calcularon por el mismo método como la descripción del ejemplo 1-3 y basadas en el valor integrado del pico derivado de acetilo en glucosamina y el valor integrado de pico derivado de metilo (-S¡(CH3)3, 0.0 ppm; 9H) en 3-(trimetils¡lil)propionato-d4 (TSP-d4) utilizado como un estándar interno, los contenidos de unidad de HA por peso se cuantificaron.
Las soluciones (10 mg/ml) de HA-Ala-TBA en DMSO anhidro se preparan. Posteriormente, clorhidrato de Chol-C6 preparado en el ejemplo 1-1 se añadió soluciones respectivas en las relaciones a la unidad HA-Ala-TBA que se muestra en el cuadro 1 posterior. DMT-MM entonces se agregó a HA-Ala-TBA en la ración que se muestra en el cuadro 1 siguiente. Clorhidrato de 5-aminometilfluoresceina (FL) (Invitrogen) y DMT-MM se agregó en 0.04 equivalentes en mol y 0.07 equivalentes en mol por unidad de HA-Ala-TBA, respectivamente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se dializó contra una solución de acetato de amonio 0.3 M/DMSO, una solución acuosa de NaCI 0.15 M, y agua ultrapura en este orden. Los dializados resultantes se secaron por congelación para obtener los productos objetivo (HA-Ala-Chol/FL) como un sólido amarillo.
Un ejemplo representativo del espectro de H-RMN (el producto que se produce desde el material de inicio 99 kDa HA-Na y tiene una relación de introducción de un grupo de colesterilo de 7%) en una solución mezclada de DCI DMS0-d6/D20 (2 N DCI D20:DMS0-d6 = 1:99) como un solvente medido se muestra en la figura 4. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (COCH3, 1.6 a 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (CH3, 0.7 ppm; 3H) en el grupo de colesterilo, la relación de introducción del grupo colesterilo en unidades HA se calcula de acuerdo con la expresión posterior (cuadro 1). Puesto los picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm que incluyen picos derivados de acetilo en glucosamina se superponen con picos (5H) derivados del grupo colesterilo, los valores obtenidos al sustraer 5/3 del valor integrado del pico (0.7 ppm) derivado de metilo en el grupo de colesterilo del valor integrado de picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm (es decir, valor integrado (1.6 a 2.0 ppm) - valor integrado (0.7 ppm) x 5/3) se utilizan como valores integrados de acetilo derivado de HA para calcular la relación de introducción.
[Fórmula 3] Valor Integrado de metilo derivados de Relación de _ colesterilo grupo (0.7 ppm) _ introducción del Valor integrado de acetilo derivado de HA xl00 grupo (1.6 a 2.0 ppm, valor después de la colesterilo % corrección) CUADRO 1 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-Ala-Chol/FL v relación de introducción En este ejemplo, los ejemplos del grupo con el cual amino en clorhidrato de Chol-puede reaccionar incluyen el carboxi en el radical de ácido glucurónico de ácido hialurónico y carboxi en Ala. Si un grupo hidrofóbico puede introducirse como a dos grupos reactivos como éste, una abreviatura con un guión tal como "-Chol" se utiliza para designar el objetivo.
EJEMPLO 1-5 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-treoninamida (ThrNH^ v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-ThrNHU/Chol/FL) Las soluciones (10 mg/ml) de HA-TBA sintetizado a partir del material de inicio HA-Na (99 kDa) en el ejemplo 1-3 en DMSO anhidro se prepararon. Posteriormente, clorhidrato de Chol-C6 preparado en el ejemplo 1-1 se añadió a soluciones respectivas en las relaciones a la unidad HA que se muestra en el cuadro 2 posterior. DMT-MM entonces se agregó en las relaciones a unidades HA mostradas en el cuadro 2 posterior, clorhidrato de 5-aminometilfluoresceina (FL) (Invitrogen) y DMT-MM se agregaron a 0.04 equivalentes mol y 0.07 equivalentes mol en por unidad HA, respectivamente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 7 horas. Posteriormente, clorhidrato de L-treoninamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se agregó en 3 equivalentes mol por unidad de HA. DMT-MM entonces se añadió en 5 equivalentes mol por unidad de HA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se dializó contra una solución de acetato de amonio 0.3 M/DMSO, una solución acuosa de NaCI 0.15 M, y agua ultrapura en este orden. Los dializados resultantes se secaron por congelación para obtener los productos objetivo (HA-ThrNH2/Chol/FL) como un sólido amarillo.
Un ejemplo representativo del espectro de ^-RMN (el producto que se produce desde el material de inicio 99 kDa HA-Na y tiene una relación de introducción de un grupo de colesterilo de 6%) en una solución mezclada de DCI DMS0-d6/D20 (2 N DCI D20:DMS0-d6 = 1:99) como un solvente medido se muestra en la figura 5. Basado en el valor integrado de los picos derivado de acetilo (COCH3, 1.6 a 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (CH3, 0.7 ppm; 3H) en el grupo de colesterilo, la relación de introducción del grupo colesterilo en unidades HA se calcula de acuerdo con la expresión posterior (cuadro 2). Puesto los picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm que incluyen picos derivados de acetilo en glucosamina se superponen con picos (5H) derivados del grupo colesterilo, los valores obtenidos al sustraer 5/3 del valor integrado del pico (0.7 ppm) derivado de metilo en el grupo de colesterilo del valor integrado de picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm (es decir, valor integrado (1.6 a 2.0 ppm) - valor integrado (0.7 ppm) c 5/3) se utilizan como valores integrados de acetilo derivado de HA para calcular la relación de introducción.
[Fórmula 4] Valor integrado de metilo derivados de colesterilo grupo Relación de introducción _ (0.7 ppm) _ del grupo colesterilo % ~ Valor integrado de acetilo derivado de HA (1.6 a 2.0 ppm, valor después de la corrección) Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo en glucosamina y el valor integrado de pico derivado de metilo (-(%, 1.2 ppm; 3H) en treoninamida, la relación de introducción de treoninamida en unidades de HA se calculó (cuadro 2).
[Fórmula 5] Valor integrado de metilo derivado de Relación de introducción treoninamida = _ xlOO de treoninamida (%) Valor integrado de acetilo derivado de HA CUADRO 2 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-ThrNH2/Chol/FL v relación de introducción En este ejemplo, amino en clorhidrato de Chol-C6 reacciona solamente con carboxi en el radical de ácido glucurónico del ácido hialurónico y ningún grupo hidrofóbico se introduce adicionalmente en el introducido ThrNH2. Si un grupo hidrofóbico puede introducirse a solo el carboxi en el radical de ácido glucurónico como este, una abreviatura con una barra tal como "/Chol" se utiliza para designar el objetivo.
EJEMPLO 1-6 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-serina (Ser! v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Ser-Chol/FLj HA-Ser se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-serinato de etil (Aldrich) se utilizó en lugar de clorhidrato de etil L-alaninato. Además, una parte del dializado (HA-Ser-OEt) antes de la desprotección de carboxi se colectó y secó con congelación como una muestra para el cálculo de la relación de Introducción. El espectro de^-RMN de la muestra para el cálculo de la relación de introducción como es medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 6. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.9 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.2 ppm; 3H) en éster etílico de serina, la relación de introducción de serina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (Cuadro 3). Además, el espectro ^-RMN de la muestra desprotegida como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 7. Una sal de TBA de HA-Ser (HA-Ser-TBA) se obtiene como sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-Ce y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Ser-Chol/FL) como amarillo sólido. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 8. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-7 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-al¡c¡na (Glv> v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-GIv-Chol/FLJ HA-Gly se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de etil glicinato (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de etil L-alaninato. Además, una parte del dializado (HA-Gly-OEt) antes de la desprotección el carboxi se colectó y se secó por congelación como una muestra para el cálculo de la relación de introducción. El espectro deJH-RMN de la muestra para el cálculo de la relación de introducción como es medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 9. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.3 ppm, 3H) en éster etílico de glicina, la relación de introducción de glicina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Además, el espectro ^-RMN de la muestra desprotegida como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 10. Una sal de TBA de HA-Gly (HA-Gly-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Gly-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 11. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-8 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-treonina v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Thr-Chol/FD HA-Thr se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de metil L-treoninato (Bachem) se utilizó en lugar de clorhidrato de etil L-alaninato. El espectro^-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 12. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.2 ppm, 3H) en treonina, la relación de introducción de glicina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Una sal TBA de HA-Thr (HA-Thr-TBA) se obtiene como sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Thr-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 13. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-9 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-asparaaina fAsrO v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo ÍHA-Asn-Chol/FL) HA-Asn se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-asparaginato de metilo (Bachem) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectro^-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 14. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de metileno (- CH2CONH2, 2.7, 2.8 ppm; 2H) en asparagina, la relación de introducción de asparagina en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Una sal TBA de HA-Asn (HA-Asn-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Asn-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectro^-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 15. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-10 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con ácido L-aspártico (ASDI v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Asp-Chol/FÜ HA-Asp se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de dietil L-aspartato (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 16. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de metileno (-CH2COOH2, 2.7, 2.8 ppm; 2H) en ácido aspártico, la relación de introducción de ácido aspártico en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Una sal TBA de HA-Asp (HA-Asp-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Asp-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 17. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-11 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-isoleucina file) y 6- aminohexilcarbamato de colesterilo ( HA-Ile- HA-Ile se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-isoleucinato de metilo (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 18. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3/ 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de dos metilos (-CH(CH3)CH2CH3, 0.9 ppm; 6H) en isoleucina, la relación de introducción de isoleucina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Ya que el pico de hidrógeno en la posición 3 de isoleucina (-CH(CH3)CH2CH3 1.9 ppm; 1H) se traslapa con picos derivados de acetilo en glucosamina, el valor obtenido al sustraer 1/6 del valor integrado del pico en 0.9 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como picos derivados de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción. Una sal TBA de HA-Ile (HA-Ile-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Ile-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 19. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-12 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-leucina fLeul v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Leu- HA-Leu se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-leucinato de etilo (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 20. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3í 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de dos metilos (-CH(CH3)2, 0.9 ppm; 6H) en leucina, la relación de introducción de leucina en unidades HA se calcula de manera similar ai ejemplo 1-4 (cuadro 3). Una sal TBA de HA-Leu (HA-Leu-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Leu-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 21. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-13 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-valina (Val! v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo fHA-Val-Chol/FLl HA-val se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de dletll L-valinato (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espec H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 22. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo ((-CH(CH3)2, 0.9 ppm; 6H) en valina, la relación de introducción de valina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Ya que el pico de hidrógeno en la posición 3 de valina (-CH(CH3)2, 2.1 ppm; 1H) se traslapa con picos derivados de acetilo en glucosamina, el valor obtenido al sustraer 1/6 del valor integrado del pico en 0.9 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como picos derivados de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción. Una sal TBA de HA-Val (HA-val-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Val-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 23. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
EJEMPLO 1-14 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-fenilalanina ( PheJ v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Phe-Chol/FLJ HA-Phe se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-fenilalaninato de etilo (Aldrich) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 24. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de fenilo (-C6H5, 7.2 a 7.4 ppm; 5H) en fenilalanina, la relación de introducción de fenilalanina en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Una sal TBA de HA-Phe (HA-Phe-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Phe-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 25. La relación de introducción del grupo coiesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 3).
CUADRO 3 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AA/Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 1-15 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-serinamida (SerNHV) v 6-aminohexilcarbamato de coiesterilo ÍHA-SerNH2/Chol/FL) HA-SerNH2-Chol/FL se obtuvo como sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-serinamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectroxH-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 26. La relación de introducción del grupo coiesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 4). Además, el espectro XH-RMN del producto como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 27. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3/ 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metileno (-CH2-, 3.9 ppm; 2H) en serinamida, la relación de introducción de serinamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-5 (cuadro 4). Ya que el pico derivado de metileno en serinamida se traslapa con picos (4H) de las posiciones 2 a 5 de glucuronato y picos (6H) de posiciones 2 a 6 de la glucosamina, el valor obtenido al sustraer 10/3 del valor integrado del pico en 2.0 ppm del valor integrado de picos en 3.2 a 4.2 ppm se utilizó como picos derivados de metileno en serinamida para calcular la relación de introducción.
EJEMPLO 1-16 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-qlicinamida (GlvNHl· ) v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-GIvNHi/Chol/FLj HA-GlyNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de glicinamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida.
El espectro de ^-R N medido en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 28. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 4). Además, el espectro ^-RMN del producto como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 29. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metileno (-CH2-; 2H) en glicinamida, la relación de introducción de glicinamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-5 (cuadro 4). Ya que el pico derivado de metileno en glicinamida se traslapa con picos (4H) de las posiciones 2 a 5 de glucuronato y picos (6H) de las posiciones 2-6 de glucosamina, el valor integrado del pico derivado de metileno en glicinamida se calculó en un método similar al del ejemplo 1-15.
EJEMPLO 1-17 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-leucinamida 6-aminohexilcarbamato de colesteriio ÍHA-LeuNH^/Chol/FD HA-LeuNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-leucinamida (To yo Chemical Industry Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida.
El espectro de ^-RMN medido en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 30. La relación de introducción del grupo colesteriio en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 4). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.9 ppm; 3H) en glucosamina y el valor Integrado del pico derivado de dos metilos (-CH(CH3)2, 0.9 ppm; 6H) en leucinamida, la relación de introducción de leucinamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-5 (cuadro 4).
EJEMPLO 1-18 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-Valinamida fValNH·») v 6-aminohexilcarbamato de colesteriio (HA-ValNI Chol/FL) HA-ValNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-valinamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida.
El espectro de ^-RMN medido en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 31. La relación de introducción del grupo colesteriio en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 4). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.9 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de dos metilos (-CH(CH3)2, 1.0 ppm; 6H) en valinamida, la relación de introducción de valinamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-5 (cuadro 4).
CUADRO 4 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AANH^/Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 1-19 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-alanina (Ala) v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo fHA-Ala/Chol/FD HA-Ala-Chol/FL se obtuvo como sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-alanina de etilo (Aldrich) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida y el dializado se eliminó una vez durante la diálisis contra agua ultrapura para desproteger el carboxilo con NaOH 2N. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 32. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 5). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.9 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3/ 1,3 ppm; 3H) en alanina, la relación de introducción de alanina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 5). Ya que el pico derivado de metilo en alanina se traslapa con picos (0.8 a 1.6 ppm, 41H) derivados del 6-aminohexilcarbamato de colesterilo, se utilizó el valor obtenido al sustraer 41/3 del valor integrado del pico en 0.7 ppm del valor integrado de picos a 0.8 a 1.6 ppm como picos derivados de metilo en alanina para calcular la relación de Introducción.
EJEMPLO 1-20 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-serina (Ser) y 6- aminohexilcarbamato de colesterilo fHA-Ser/Choi/FD HA-Ser/Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-serinato de etilo (Aldrich) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida y el dializado se eliminó una vez durante la diálisis contra agua ultrapura para desproteger el carboxi con NaOH 2N. Además, una parte del dializado (HA-Ser-OEt/Chol/FL) antes de la desprotección de carboxi se colectó y secó con congelación como una muestra para el cálculo de la relación de introducción. El espectro de^-RMN de la muestra para el cálculo de la relación de introducción como es medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 33. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.3 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.6 ppm, 3H) en éster etílico de serina, la relación de introducción de serina en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-6 (cuadro 5). Además, el espectro ^-RMN de la muestra desprotegida como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 34. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-5 (cuadro 5).
CUADRO 5 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AA/Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 1-21 Síntesis de derivados de ácido hialurónico con ninguna etiqueta fluorescente HA-Ala-Chol, HA-ThrNHj/Chol, HA-SerNH^Chol, y HA-VaINHj/Chol se obtuvieron como sólido blanco respectivamente en los métodos descritos en el ejemplo 1-4 (Ala), ejemplo 1-5 (ThrNH2), ejemplo 1-15 (SerNH2), y ejemplo 1-18 (ValNH2) excepto que no se agregó 5-aminométilfluoresceina. La relación de introducción del grupo colesterilo y la relación de introducción del aminoácido y amida del ácido amino se calcularon en los mismos métodos como los descritos en los ejemplos correspondientes (cuadro 6).
CUADRO 6-1 Cantidad de reactivo usado en la preparación de derivados de ácido hialurónico v relación de introducción CUADRO 6-2 Cantidad de reactivo usado en la preparación de derivados de ácido hialurónico v relación de introducción EJEMPLO COMPARATIVO 1-1 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Chol/FD Las soluciones (10 mg/ml) de HA-TBA sintetizadas a partir del material de inicio HA-Na (10 k, 50 k, 99 k) y preparadas en el ejemplo 1-3 en DMSO anhidro se prepararon. Posteriormente, clorhidrato de Chol-C6 preparado en el ejemplo 1-1 se añadió a soluciones respectivas en las relaciones a la unidad HA que se muestra en el cuadro 7 posterior. DMT-MM entonces se agregó en las relaciones a unidades HA mostradas en el cuadro 7 posterior, y clorhidrato de 5-aminometilfluoresceina (FL) (Invitrogen) y DMT-MM se agregaron a 0.04 mol equivalentes y 0.07 mol equivalentes por unidad HA, respectivamente. La solución de reacción se dializó contra una solución de acetato de amonio 0.3 M/DMSO, una solución acuosa de NaCI 0.15 M, y agua ultrapura en este orden. Los dializados resultantes se secaron por congelación para obtener los productos objetivo (HA-Chol/FL) como un sólido amarillo.
Un ejemplo representativo del espectro de XH-RMN (el producto que se produce desde el material de inicio 99 kDa HA-Na y tiene una relación de introducción de un grupo colesterilo de 6%) en una solución mezclada de 0.02 N DCI DMS0-d6/D20 (2 N DCI D20:DMS0-d6 = 1:99) como un solvente de medición se muestra en la figura 35. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el método que se describe en el ejemplo 1-4 (cuadro 7).
CUADRO 7 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO COMPARATIVO 1-2 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con EDOBEA (HA- Las soluciones (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizado a partir del material de inicio HA-Na (99 kDa) en el ejemplo 1-3 en DMSO anhidro se prepararon. Posteriormente, se agregó EDOBEA y BOP en este orden en una relación equivalente de unidad HA/BOP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)/2,2'-(etilenodioxi)bis(etilamina) (EDOBEA, Sigma-Aldrich) = 1/2.5/50 (mol/mol/mol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se dializó contra una solución acuosa de NaCI 0.3M y con agua ultrapura en este orden y luego se secó por congelación para obtener HA-EDOBEA que tiene una relación de introducción alta.
El espectro de ^-RMN de HA-EDOBEA que tiene una relación de introducción alta medida en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 36. En esta medida, NaOD se añadió a 0.0046 N para hacer la solución alcalina. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (~COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de metileno (-CH2NH2, 2.8 ppm; 2H) en EDOBEA terminal, la relación de introducción de EDOBEA en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 y fue del 82%.
El HA-EDOBEA obtenido que tiene una relación de introducción alta se disolvió en agua ultrapura en 10 mg/ml, y luego se diluyó 2 veces con 100 mM de regulador de pH de fosfato (pH 7.4) para preparar una solución de 5 mg/ml. Una solución de NHS-fluoresceina en DMSO se añadió a esta solución en 0.04 equivalentes de mol por unidad de HA y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La terminal amino del EDOBEA en exceso se acetilo mediante la adición de anhídrido acético (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) en 40 equivalentes de mol por unidad de HA y se agita adicionalmente durante 1 hora. La solución de reacción se dializó en oscuridad con una solución acuosa de NaCI 0.3M y agua ultrapura en este orden, y luego se seca por congelación para obtener HA-EDOBEA-Ac/FL como sólido amarillo. El espectro de^-RMN del producto según lo medido en las mismas condiciones que las descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 37.
EJEMPLO COMPARATIVO 1-3 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-tirosina (Tvrl v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Tyr-Chol/FL HA-Tyr se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-tirosinato de etilo (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RNIN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 38. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de hidroxifenilo (-C6H4OH, 6.8, 7.2 ppm; 4H) en tirosina, la relación de introducción de tirosina en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 8). Una sal TBA de HA-Tyr (HA-Tyr-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Tyr-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectroxH-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 39. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 8).
CUADRO 8 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-Tyr-Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 2 Confirmación de retención en la sanare v biodeqradabilidad ¡n vivo EJEMPLO 2-1 Recolección de muestra biológica de rata que recibió derivado de HA Las dosis únicas de 10 mg/kg de compuesto obtenido en los ejemplos 1-4 a 1-20 y ejemplos comparativos 1-1 y 1-3 se administraron intravenosamente a las ratas. La sangre de la vena yugular se colectó en 5 minutos, 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 y 336 horas después de la administración utilizando jeringas tratadas con heparina sódica y el plasma se obtuvo mediante centrifugación. Algunas muestras de sangre en ejemplos comparativos se colectaron también en 96 horas después de la administración. Estas muestras de plasma son criopreservadas a -20°C o menos hasta la medición. Además, la orina se colectó utilizando jaulas metabólicas de 0 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 168 a 192 horas, 240 a 264 horas, y 336 a 360 horas después de la administración y crioconservadas a -20°C o menos hasta la medición. Además, el hígado se extrajo 15 días después de la administración y se crioconservada a -20°C o menos hasta la medición. Las dosis únicas de 20 mg/kg del compuesto obtenido en ejemplo comparativo 1-2 se administró intravenosamente a ratas seguidas de recolección de orina y la extracción del hígado.
EJEMPLO 2-2 Análisis de plasma de rata que recibió derivados de HA Las muestras de plasma se descongelaron y se diluyeron 2 veces con HR-b-CD (100 m )/regulador de pH tris (500 mM, pH 9.0), se incubaron a 37°C durante 1 hora, y luego se midieron para las concentraciones de derivados de HA etiquetados fluorescentes con un lector de placas de 96 pozos (ARVO; límite de cuantificación: 0.4 mg/ml). Los cambios en las concentraciones de plasma de los derivados de HA etiquetados fluorescente se muestran en la figura 40 a la figura 65. Además, un parámetro farmacocinético (extrapolación del área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo (AUC¥)) se analizó por WinNonlin Ver.6.1 (Pharsight). Los valores se muestran en el cuadro 9. Además, las relaciones de AUCoo a las muestras comparativas en que colesterol se introdujo en el mismo nivel, calculado por la siguiente expresión se muestran en el cuadro 10.
[Fórmula 6] AUC¥ de la muestra Relación de AUC¥ AUC¥ de la muestra comparativa correspondiente CUADRO 9 Parámetro farmacocinético de derivados de HA etiquetados fluorescente CUADRO 10 Relación de AUC¥ Los derivados de HA (muestras 2-1 a 2-25) en que un aminoácido o amida de aminoácido y un grupo colesterilo se introducen en carboxi se revelaron para mantener las mejores concentraciones de plasma que derivados de HA (muestras comparativas 2-1 a 2-7) en el que sólo un grupo colesterilo es introducido en carboxi.
EJEMPLO 2-3 Análisis de hígado de rata que ha recibido derivado de HA A aproximadamente 1 g de muestra de hígado se agregó regulador de pH tris (10 mM, pH 9.0) y la muestra se homogenelzó usando perlas. Se agregó una solución de pronasa 4 mg/ml y la mezcla se incubó a 37°C durante la noche. Después de la centrifugación, la muestra es 2 veces diluida con HR-b-CD (100 mM)/regulador de pH tris (500 mM, pH 9.0), además se incubó a 37°C durante 1 hora, y luego se filtró. La muestra se analizó mediante cromatografía de exclusión de tamaño en las siguientes condiciones. Además, el hígado de una rata sin ninguna administración de muestra se trató de manera similar y las mezclas de este y las muestras antes de la administración se analizaron similarmente como un estándar.
Condiciones de análisis por cromatografía de exclusión de tamaño Análisis de columna: TSKgel G5000 PWXL (Tosoh Corporation) Temperatura de columna: 25°C Fase móvil: HR-b-CD (10 mM)/tris regulador de pH (500 mM, pH 9.0) Velocidad de flujo: 0.5 ml/min Detección: Ex 494 nm/Em 515 nm Volumen de inyección: 50 mL Los resultados se muestran en la figura 66 a la figura 92. Los cromatogramas se normalizaron con los respectivos picos más altos. Mientras el derivado de HA del ejemplo comparativo 1-2 (HA-EDOBEA-Ac/FL, figura 91) no se encontró que se convierte en moléculas de peso molecular más bajo en el hígado, todos los compuestos administrados de los derivados de HA de los ejemplos se detectaron para convertirse en moléculas de peso molecular más bajo. Esto indica que los derivados de HA de la presente invención tienen una biodegradabilidad. Después de la degradación, se considera que es excretado en la orina o heces fuera del cuerpo.
EJEMPLO 2-4 Análisis de la orina de rata que ha recibido derivado de HA Las muestras de orina se filtraron a través de un filtro de 0.22 mm y se diluyeron 2 veces con HR-b-CD (100 mM)/tris regulador de pH (500 mM, pH 9.0). Después de incubar a 37°C durante 1 hora, filtrar y analizar por cromatografía de exclusión de tamaño en las condiciones descritas en el ejemplo 2-3. Además, una muestra de orina de una rata sin ninguna administración de muestra se trató de manera similar y las mezclas de estas y las muestras antes de la administración se analizaron similarmente como un estándar.
Los resultados se muestran en la figura 93 a la figura 119. En las figuras, los cromatogramas en los puntos de tiempo en la misma escala se muestran a la izquierda y ésos normalizados con los picos más altos se muestran a la derecha. Las muestras de orina recolectadas en 0 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 168 a 192 horas, 240 a 264 horas, y 336 a 360 horas después de la administración son designados respectivamente como 0-ld, l-2d, 2-3-4d, 3-4d, 7-8d, 10-lld y 14-15d, y estándares respectivos como STD en las figuras.
Mientras que el compuesto administrado de derivado HA del ejemplo comparativo 1-2 (HA-EDOBEA-Ac/FL) no se encontró que se convierta en moléculas de peso molecular más bajo en la orina, algunos de los compuestos administrados de los derivados de HA de los ejemplos se detectaron que se conviertan en moléculas de peso molecular más bajo en la orina. Esto indica que la biodegradabilidad de los derivados de HA de la presente invención puede evaluarse fácilmente mediante el examen de orina.
EJEMPLO 3 Síntesis de derivado de ácido hialurónico EJEMPLO 3-1 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-qlutamina fGInl v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Gln-Chol/FLJ HA-GIn se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de etil glicinato (Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 120. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivados de metileno (-CH2CH2CONH2, 2.3, 2.4 ppm; 2H) en glutamina, la relación de introducción de glutamina en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 11). Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico del otro metileno (-CH2CH2CONH2, 2.1 ppm; 2H) en glutamina, el valor obtenido al sustraer el valor integrado de picos en 2.3 ppm y 2.4 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como picos derivados de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción. Una sal TBA de HA-GIn (HA-GIn-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-GIn-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 121. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 11).
EJEMPLO 3-2 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-metionina (Metí v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Met-Chol/FLl HA-Met se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-metioninato de etilo (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectro1H-RMN como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 122. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (- COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivados de metileno (CH2SCH3, 2.6 ppm; 2H) en metionina, la relación de introducción de metionina en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 11). Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico derivado del otro metileno y metilo ( -CH2CH2SCH3, 2.1 ppm; 5H) en metionina, el valor obtenido al sustraer 5/2 del valor integrado del pico en 2.6 ppm del valor integrado del pico en 2.6 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como picos derivados de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción.
Una sal TBA de HA-Met (HA-Met-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Met-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrolH-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 123. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 11).
CUADRO 11 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AA-Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 3-3 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-alaninamida 6-aminohexilcarbamato de colesterMo (HA-AlaNH^/Chol/FLl HA-AlaNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-alan¡nam¡da (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro dexH-RMN del producto según lo medido en las mismas condiciones a las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 124. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 12). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 1.3 ppm; 3H) en alaninamida, la relación de introducción de alaninamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-5 (cuadro 12). Ya que el pico derivado de metilo en alaninamida se traslapa con los picos (41H) derivados de colesterilo, el valor obtenido al sustraer 41/3 del valor Integrado del pico a 0.7 ppm del valor Integrado de picos a 0.8 a 1.6 ppm se utilizó como pico derivado de metilo en alaninamida para calcular la relación de introducción.
EJEMPLO 3-4 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-asparaairtam¡da fAsnNHHJ v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo fHA-AsnNH-»/Chol/FLJ HA-AsnNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-asparaginamida (KOKUSAN CHEMICAL Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro de^-RMN del producto según lo medido en las mismas condiciones a las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 125. La relación de Introducción del grupo coiesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 12). Además, el espectro ^-RMN del producto como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 126. Basado en el valor Integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor Integrado de picos derivados de metileno (CH2CONH2, 2.7, 2.8 ppm; 2H) en asparaginamida, la relación de introducción de serinamida en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 12).
EJEMPLO 3-5 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-isoleucina (IleNHl·?) v 6-aminohexilcarbamato de coiesterilo (HA-IleNH- /Chol/FU HA-IleNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-isoleucina (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro de H-RMN del producto según lo medido en las mismas condiciones a las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 127. La relación de introducción del grupo coiesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 12). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metileno y dos metilos (-CH(CH3)CH2CH3, 0.9 ppm; 8H) en isoleuclna, la relación de introducción de isoleucinamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 3). Ya que el pico derivado de metilo de isoleucinamida se traslapa con los picos (41H) derivados de coiesterilo, el valor obtenido al sustraer 41/3 del valor integrado del pico en 0.7 ppm del valor integrado de picos en 0.8 a 1.6 ppm se utilizó como pico derivado de metileno en isoleucinamida para calcular la relación de introducción. Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico de hidrógeno en la posición 3 de isoleucina (~CH3CH2CH3, 1.9 ppm; 1H), el valor obtenido al sustraer 1/8 del valor integrado de los picos en 0.8 a 1.6 ppm del valor integrado de los picos en 0.8 a 2.6 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como picos derivados de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción.
EJEMPLO 3-6 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-qlutanamida v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-GlnNH /Chol/FLl HA-GlnNH2-Chol/FL se obtuvo como un sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que clorhidrato de L-glutanamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 128. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 12). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (~COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivados de metileno (-CH2CH2CONH2, 2.1 ppm; 2H) en glutaminamida, la relación de introducción de serinamida en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 12). Ya que el pico derivado de metilo de glutaminamida se traslapa con el pico (2H) derivado del colesterilo, se utilizó el valor obtenido al sustraer 2/3 del valor integrado en el pico de 0.7 ppm como pico derivado de metileno en glutaminamida para calcular la relación de introducción. Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico derivado del metileno (·OH2¾OONH2, 1.9 ppm; 2H) en glutaminamida, el valor obtenido al sustraer 2/2 del valor integrado del pico en 2.1 ppm del valor integrado de picos en 1.8 a 2.0 ppm se utilizó como pico derivado de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción.
EJEMPLO 3-7 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-metioninamida (MetNH2l v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-MetNH /Chol/FL HA-MetNH2-Chol/FL se obtuvo como sólido amarillo en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-metioninamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 129. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 12). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (-SCH3/ 2.1 ppm; 3H) en metioninamida, la relación de introducción de metioninamida en unidades HA se calcula de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 12). Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico derivado de metileno (-CH2SCH3, 1.9 ppm; 2H) en metioninamida, el valor obtenido al sustraer 2/3 del valor Integrado del pico en 2.1 ppm del valor Integrado del pico en 1.8 a 2.0 ppm se utilizó como el pico derivado de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción.
CUADRO 12 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AANF /Chol/FL v relación de introducción E3EMPLO COMPARATIVO 3-1 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con el ácido L-aiutámico v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Glu-Chol/FD HA-Glu se obtuvo como sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que el clorhidrato de dietil L-glutamato (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de etll L-alanlnato. El espectroxH-RMN como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 130. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metileno (-CH2CH2COOH, 2.4 ppm; 2H) en ácido glutámico, la relación de introducción de ácido glutámico en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 13). Ya que el pico derivado de acetilo en glucosamina se traslapa con el pico de otro metileno (-CH2CH2COOH, 2.1 ppm; 2H) derivado de ácido glutámico, el valor obtenido al sustraer el valor integrado del pico en 2.4 ppm del valor integrado de los picos en 1.8 a 2.2 ppm se utilizó como el pico derivado de acetilo en glucosamina para calcular la relación de introducción. Una sal TBA de HA-Glu (HA-Glu-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Glu-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectrc^H-RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 131. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 13).
EJEMPLO COMPARATIVO 3-2 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-triptófano GGGR? V 6-aminohexilcarbamato de colesterilo fHA-Trp-Chol/FLJ HA-Trp se obtuvo como un sólido blanco en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que clorhidrato de L-triptofanato de etilo (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-alaninato de etilo. El espectrc^H-RMN como se mide en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-3 se muestra en la figura 132. Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 2.0 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivados del anillo indol (-C8H6N, 7.8 ppm; 1H) en triptofano, la relación de introducción de triptofano en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 13). Una sal TBA de HA-Trp (HA-Trp-TBA) se obtiene como un sólido blanco en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4. Luego, se hizo reaccionar con clorhidrato de Chol-C6 y FL en un método similar al del ejemplo 1-4 para obtener el objetivo (HA-Trp-Chol/FL) como un sólido amarillo. El espectro^ -RMN medido en las mismas condiciones como aquellas descritas en el ejemplo 1-4 se muestra en la figura 133. La relación de introducción del grupo colesterilo se calculó en el método descrito en el ejemplo 1-4 (cuadro 13).
EJEMPLO COMPARATIVO 3-3 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-tirosina fTyr) v 6- aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-Tyr-Chol/FLJ HA-Tyr-Chol/FL 10k se obtuvo como sólido amarillo en un método similar al del ejemplo comparativo 1-3 excepto que HA-TBA producido a partir del material de inicio 10 kDa Ha-Na se utilizó. La relación de introducción de tirosina y un grupo de colesterilo se calculó por un método similar al del ejemplo comparativo 1-3 (cuadro 13).
CUADRO 13 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AA-Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO 3-8 Síntesis de derivado de ácido hialurónico que no tiene etiqueta fluorescente Los derivados del ácido hialurónico se obtuvieron como sólido blanco en métodos descritos en el ejemplo 1-4 al ejemplo 1-18 y ejemplo 3-1 al ejemplo 3-7 y ejemplo comparativo 3-1 al ejemplo comparativo 3-3, excepto que 5-aminometilfluoresceina no se añadió y HA-Na que tiene un diferente peso molecular se utilizó como material de inicio. La relación de introducción del grupo colesterilo y la relación de introducción del aminoácido y amida del ácido amino se calculó en los mismos métodos como los descritos en los ejemplos correspondientes (cuadro 14-1, cuadro 14-2). El ácido hialurónico 5 kDa utilizado como material de inicio es de R&D Systems, Inc. y los otros ácidos hialurónicos utilizados como materiales de inicio son de Shiseido Co Ltd.
CUADRO 14-1 Cantidad de reactivo usado en la preparación de derivado de ácido hialurónico v relación de introducción CUADRO 14-2 de reactivo usado en la preparación de derivado de ácido hialurónico v relación de introducción EJEMPLO 4 Confirmación de retención In vivo en sangre v biodearadabilidad EJEMPLO 4-1 Recolección de las muestras biológicas de rata Que recibieron el derivado de HA Los compuestos obtenidos en ejemplos 3-1 a 3-7 y ejemplos comparativos 3-1 a 3-3 se administran intravenosamente a las ratas en una sola dosis de 10 mg/kg. La sangre de la vena yugular se colectó en 5 minutos, 2, 7, 24, 48, 72 y 168 horas después de la administración utilizando jeringas tratadas con heparina sódica y el plasma se obtuvo mediante centrifugación. Algunas muestras de sangre en ejemplos comparativos se colectaron también en 96 horas después de la administración. Estas muestras de plasma son criopreservadas a -20°C o menos hasta la medición. El hígado se extrajo 7 días después de la administración y se crioconservó a -20°C o menos hasta la medición.
EJEMPLO 4-2 Análisis de plasma de rata que ha recibido derivado de HA Las muestras de plasma se descongelaron y se diluyeron 2 veces con HR-b-CD (100 mM)/regulador de pH tris (500 mM, pH 9.0), se incubaron a 37°C durante 1 hora, y luego se midieron para las concentraciones de derivados de HA etiquetados fluorescentes con un lector de placas de 96 pozos (ARVO; límite de cuantificación: 0.4 mg/ml). Los cambios en las concentraciones de plasma de los derivados de HA etiquetados fluorescente se muestran en la figura 134 a la figura 143. Además, un parámetro farmacocinético (extrapolación del área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo (AUC¥)) se analizó por WinNonlin Ver.6.1 (Pharsight). Los valores se muestran en el cuadro 15. Además, las relaciones de AUC¥ a las muestras comparativas en donde el colesterol se introdujo en el mismo nivel, calculado por la siguiente expresión, se muestran en el cuadro 16.
[Fórmula 7] AUCoo de la muestra Relación de AUC¥ AUC¥ de la muestra comparativa correspondiente CUADRO 15 Parámetro farmacocinetico de derivado de HA etiquetado fluorescente CUADRO 16 Relación de AUC¥ Los derivados de HA (muestras 4-1 a 4-7) en que un aminoácido o amida de ácido amino y un grupo colesterilo se introducen en carboxi se revelaron para mantener las concentraciones plasmáticas mejores que las del derivado de HA (muestra comparativa 2-1) en que sólo un grupo colesterilo es introducido en carboxi. HA-Tyr-Chol-7%/FL 10k (muestra comparativa 4-3), así como HA-Tyr-Chol-6%/FL 99k (muestra comparativa 2-8) había disminuido la retención en la sangre en comparación con el derivado de HA en que sólo un grupo colesterilo es introducido en carboxi. Por otro lado, HA-Ala-Chol-7%/FL 99k (muestra 2-1) y HA-Ala-Chol-16%/FL 10k (muestra 2-7) ambos mantienen las concentraciones de plasma iguales o mejores que el derivado de HA en que sólo un grupo colesterilo es introducido en carboxi. Esto sugiere que la diferencia en la retención en la sangre de derivados de HA depende de la diferencia del aminoácido introducido en carboxi no está influenciada por (no dependiente de) el peso molecular del ácido hialurónico de material de inicio.
E3EMPLO 4-3 Análisis del hígado de rata que ha recibido derivado de HA A aproximadamente 1 g de muestra de hígado se agregó regulador de pH tris (10 mM, pH 9.0) y la muestra se homogeneizó usando perlas. Se agregó una solución de pronasa 4 mg/ml y la mezcla se incubó a 37°C durante la noche. Después de la centrifugación, la muestra es 2 veces diluida con HR-b-CD (100 mM)/regulador de pH tris (500 mM, pH 9.0), además se incubó a 37°C durante 1 hora, y luego se filtró, y se analizó por cromatografía de exclusión de tamaño en condiciones descritas abajo. Además, el hígado de una rata sin ninguna administración de muestra se trató de manera similar y las mezclas de este y las muestras antes de la administración se analizaron similarmente como un estándar.
Condiciones del análisis por cromatografía de exclusión de tamaño Análisis de columna: TSKgel G5000PWXL (Tosoh Corporation) Temperatura de columna: 25°C Fase móvil: HR-b-CD (10 mM)/tris regulador de pH (50 mM, pH 9.0) Velocidad de flujo: 0.5 ml/min Detección: Ex 494 nm/Em 515 nm Volumen de inyección: 50 m? Los resultados se muestran en la figura 144 a la figura 153. Los cromatogramas se normalizaron con los respectivos picos más altos. Mientras el derivado de HA del ejemplo comparativo 1-2 (HA-EDOBEA-Ac/FL, figura 91) no se encontró que se convierte en moléculas de peso molecular más bajo en el hígado, todos los compuestos administrados de los derivados de HA de los ejemplos se detectaron para convertirse en moléculas de peso molecular más bajo. Basado en esto, se considera que los derivados de HA de la presente invención tienen una biodegradabilidad y se excretan en la orina o heces del cuerpo después de la degradación en el cuerpo.
EJEMPLO 5 Formulación de liberación controlada que tiene propiedad de precipitación sensible a la concentración de sal EJEMPLO 5-1 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-tirosinamida (TvrNH·) v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-TvrNH?/Chol/FD HA-TyrNH2-Chol/FL se obtuvo como una solución amarilla en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-tirosinamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro de H-RMN del producto obtenido mediante la medición de un producto secado por congelación en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 154. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 17). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (-COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de hidroxifenilo (-CH6H4OH, 6.8, 7.2 ppm; 4H) en tirosina, la relación de introducción de tirosinamida en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 17).
EJEMPLO 5-2 Síntesis de derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-triotofanamida v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-TrpNH^/Chol/FLI HA-TrpNH2-Chol/FL se obtuvo como una solución amarilla en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-triptofanamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro de^-RMN del producto obtenido mediante la medición de un producto secado por congelación en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 155. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 17). Basado eri el valor integrado del pico derivado de acetilo (--COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor Integrado de picos derivados del anillo indol (~C8H6N, 7.6 ppm; 1H) en triptofanamida, la relación de introducción de triptofanamida en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 17).
EJEMPLO 5-3 Síntesis del derivado de HA etiquetado fluorescente modificado con L-fenilalaninamida (PheNHT) v 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (HA-PheNH^/Chol/FLJ HA-PheNH2-Chol/FL se obtuvo como una solución amarilla en un método similar al del ejemplo 1-5 excepto que el clorhidrato de L-fenilalaninamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-treoninamida. El espectro de^-RMN del producto obtenido mediante la medición de un producto secado por congelación en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestra en la figura 156. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 17). Basado en el valor integrado del pico derivado de acetilo (--COCH3, 1.8 ppm; 3H) en glucosamina y el valor integrado de picos derivado de fenilo (-C6H5, 7.2 a 7.4 ppm; 5H) en fenilalanina, la relación de introducción de fenilalaninamida en unidades de HA se calculó de manera similar al ejemplo 1-4 (cuadro 17).
CUADRO 17 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-AANH2/Chol/FL v relación de introducción EJEMPLO COMPARATIVO 5-1 Síntesis del derivado de HA f HA-TyrNh modificado conL-tirosinamida fTyrNHV) Una solución de HA-TBA (99 kDa) sintetizada a partir del material de inicio HA-Na en el ejemplo 1-3 de DMSO anhidro se preparó. Posteriormente, clorhidrato de L-tirosinamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se añadió en 5 equivalentes de mol por unidad de HA. El cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMT-MM) entonces se agregó en 3 equivalentes de mol por unidad de HA. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se dializó contra una solución acuosa de NaCI 0.15 M y con agua ultrapura en este orden. La precipitación se produjo durante la diálisis y el objetivo no se obtuvo como una solución acuosa.
EJEMPLO COMPARATIVO 5-2 Síntesis de derivados de HA ÍHA-TrpNH^ modificado con L-triPtofanamida (TrpNH ) La síntesis se llevó a cabo en un método similar al del ejemplo comparativo 5-1 excepto que el clorhidrato de L-triptofanamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-tirosinamida. La precipitación se produjo durante la diálisis y el objetivo no se obtuvo como una solución acuosa.
EJEMPLO COMPARATIVO 5-3 Síntesis del derivado de HA (HA-PheNH ) modificado con L-fenilalaninamida fPheNH^ La síntesis se llevó a cabo en un método similar del ejemplo comparativo 5-1 excepto que el clorhidrato de L-fenilalaninamida (WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) se utilizó en lugar de clorhidrato de L-tirosinamida. HA-PheNH2 se obtuvo como un sólido blanco.
EJEMPLO 5-4 Las propiedades de disolución de los derivados de HA sintetizados en el ejemplo 5-1, ejemplo 5-2, ejemplo comparativo 5-1 y ejemplo comparativo 5-2 después de diálisis contra agua se muestran en la cuadro 18.
CUADRO 18 Propiedad de disolución de derivado de HA al agua Se encontró que la 5-1 y la muestra 5-2, en que un grupo esterilo se introdujo, son más dispersos en el agua que la muestra comparativa 5-1 y la muestra comparativa 5-2, en que no se introduce ningún grupo esterilo, a pesar de la hidrofobicidad que tiene el grupo esterilo.
EJEMPLO 5-5 Evaluación de la propiedad de precipitación depende de la concentración de sal A soluciones acuosas (ultrapure water) de derivados de HA (99k HA-TyrNH^Chol-6%/FL, 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-PheNHz/Chol^/o/FL, 99k HA-AlaNH2/Chol-6%/FL) obtenidos en el ejemplo 5-1, ejemplo 5-2, ejemplo 5-3, y ejemplo 3-3 se agregó una solución de regulador de pH concentrada para que la composición final de las soluciones de regulador de pH es 10 mM PB y 150 mM NaCI y la concentración de los derivados de HA es 4.5 mg/ml. Las soluciones se incubaron a 37°C durante 20 minutos y se centrifugaron a 2000 G durante 1 minuto. Los sobrenadantes se midieron para intensidad de fluorescencia con un lector de placas de 96 pozos (ARVO). Las concentraciones de derivados de HA etiquetados fluorescentes se calcularon utilizando un estándar para calcular los porcentajes de residuo a las cantidades iniciales utilizadas (cuadro 19). HA-Chol-6%/FL 99k (muestra comparativa 5-3) obtenido en el ejemplo comparativo 1-1 se sometió a operaciones similares. Los resultados de las muestras comparativas 5-1 y 5-2 son los resultados descritos en W02010/053140.
CUADRO 19 Cantidad residual de derivado de HA en condición a 150 nM NaCI W02010/053140 describe que HA-Chol-6%/FL 50k (muestra comparativa 5-1) se disuelve en condiciones de concentración de sal baja (agua ultrapura) y en una concentración salina fisiológica (150 mM NaCI). También se mostró por este experimento que Ha-Chol-6%/FL 99k (muestra comparativa 5-3) también muestra un comportamiento similar. Mientras tanto, se confirmó que 99k HA-PheNH2/Chol-6%/FL (muestra 5-3) muestra el comportamiento dependiente de la concentración salina en que es disuelta en condiciones a concentraciones de sal bajas (agua ultrapura) y precipitada en una concentración salina fisiológica (150 mM NaCI). Este resultado sugiere el uso posible de derivado de HA de la presente invención como un portador en formulaciones que precipitan debajo de la piel después de la administración, mediante la preparación de soluciones de concentración salina baja hecha isotónica con azúcar o lo similar. Además, el desempeño de precipitación (cantidad de residuos: 1% o menos) fue significativamente mayor que los valores reportados previamente en derivados de HA (muestra comparativa 5-2: HA-Chol-7%/FL 50 k: 22.6%). 22.6%). 99k HA-TyrNH2/Chol-6%/FL (muestra 5-1) y 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL (muestra 5-2) también muestran el comportamiento de precipitación dependiente de la concentración de la sal similarmente a 99k HA-TrpNH2/Chol-6%/FL (muestra 5-3) y se muestra que son útiles en las formulaciones que tienen una propiedad de precipitación dependiente de la concentración de sal.
EJEMPLO 5-6 Evaluación de la propiedad de precipitación debajo de piel en rata Los compuestos obtenidos desde derivados de HA etiquetados fluorescentes (99k HA-TyrNH2/Chol-6%/FL, 99k HA-TrpNHj/Chol^/o/FL, y 99k HA-PheNH2/Chol-6%/FL) obtenidos en ejemplo 5-1, ejemplo 5-2 y ejemplo 5-3 se administraron subcutáneamente a las ratas en una dosis única (solución de sacarosa) de 10 mg/kg. Los sitios de la administración se verificaron 7 días después de la administración. Se confirmó que los derivados de HA etiquetados fluorescentes se precipitó y permaneció.
EJEMPLO 5-7 Síntesis de derivado de ácido hialurónico que no tiene etiqueta fluorescente Los derivados del ácido hialurónico se obtuvieron como un sólido blanco en métodos descritos en el ejemplo 5-1 al ejemplo 5-3, excepto que no se añade 5-aminometilfluoresceina y HA-Na que tiene un peso molecular diferente se utilizó como material de inicio. La relación de introducción de grupo colesterilo y la relación de introducción del aminoácido y amida del ácido amino se calcularon en métodos como los descritos en los ejemplos correspondientes (cuadro 20).
CUADRO 20 Cantidad de reactivo usado en la preparación de derivado de ácido hialurónico v relación de introducción EJEMPLO 6 Evaluación de capacidad de encapsulamiento deL fármaco EJEMPLO 6-1 Encapsulamiento de paclitaxel fPTXl A las soluciones acuosas (agua ultrapura) de los derivados de HA obtenidos en el ejemplo 1-4 y ejemplo 1-21 y ejemplo 3-8 y ejemplo 5-7 se agregó Paclitaxel (10 mg/ml, solución en metanol) para que la concentración de paclitaxel final 100 pg/mL y la concentración de los derivados de HA es 1.0 mg/ml. Las mezclas se dejaron reposar durante la noche a 4°C y luego se centrifugó a 4700 G durante 10 minutos. A 100 mI de alícuotas de los sobrenadantes se añadieron 100 mL de 50% de acetonitrilo y 50 mI de 100 mM HR-b-CD y las mezclas se analizaron por cromatografía de fase inversa en las siguientes condiciones.
Condiciones del análisis por cromatografía de fase inversa Análisis de columna: PLRP-S 1,000 Á (Agilent), temperatura de columna: 40°C Fase móvil A: Solución acuosa de TFA 0.1%, fase móvil B: Solución de acetonitrilo TFA 0.1% Gradiente: B 5% ® B 95% (3.4 minutos) Velocidad de flujo: 2 ml/min Detección: UV 254 nm Volumen de inyección: 30 m? Las concentraciones de paclitaxel en los sobrenadantes calculadas usando un estándar se muestran en la figura 157 a la figura 160. Mientras que la solubilidad de paclitaxel en la ausencia de derivados de HA es de 0.6 mg/mL, mejora de la solubilidad del paclitaxel se confirmaron significativamente en presencia de derivados de HA. Esto sugiere que los compuestos de peso molecular bajo poco solubles tales como paclitaxel se encapsulan en derivados de HA.
EJEMPLO 6-2 Encapsulación de ciclosporina (ciclosporina A: CyAI A las soluciones acuosas (agua ultrapura) de los derivados de HA obtenidos en el ejemplo 1-4 y ejemplo 1-21 y el ejemplo 3-8 y el ejemplo 5-7 se agregó ciclosporina (10 mg/ml, solución en metanol) para que la concentración de ciclosporina final sea de 300 mg/mL y la concentración de los derivados de HA sea de 1.0 mg/ml. Las mezclas se dejaron reposar durante la noche a 4°C y luego se centrifugó a 4700 G durante 30 minutos. A 100 mI de alícuotas de los sobrenadantes se añadieron 100 mI de 50% de acetonitrilo y 50 mI de 100 mM HR-b-CD y las mezclas se analizaron por cromatografía de fase inversa en las condiciones descritas en el ejemplo 6-1. Se realizó la detección en UV 210 nm. Las concentraciones de ciclosporina en los sobrenadantes calculados usando un estándar se muestran en la figura 161 a la figura 164. Mientras que la solubilidad de la ciclosporina en la ausencia de derivados de HA es 28 mg/mL, la mejora de la solubilidad de la ciclosporina se confirmó significativamente en presencia de derivados de HA. Esto sugiere que los péptidos poco solubles tal como la ciclosporina se encapsulan en derivados de HA.
EJEMPLO 7 Prueba de liberación in vitro EJEMPLO 7-1 Prueba del lanzamiento de paclitaxel A una solución acuosa (agua ultrapura) de HA-Ala-Chol-41% 10k obtenido en el ejemplo 1-21 se agregó Paclitaxel (10 mg/ml, solución en metanol) para que la concentración final de paclitaxel sea 100 mg/ml y la concentración de los derivados de HA sea 1.0 mg/ml. La mezcla se dejó reposar a 4°C durante la noche. Paclitaxel libre se eliminó a 4°C con una membrana de diálisis (3,000 MWCO). Los complejos de derivado de HA/paclitaxel resultantes se colocaron en una membrana de diálisis (3,000 MWCO) y se incubaron a 37°C con PBS. La concentración de paclitaxel en la membrana de la diálisis se cuantificó en el tiempo por análisis de cromatografía de fase inversa para confirmar la liberación. Las cantidades de paclitaxel retenidas en la membrana de diálisis se muestran en la figura 165. Este resultado indica que derivados de HA pueden usarse como portadores de liberación controlada.
EJEMPLO 7-2 Prueba de liberación de cidosporina La prueba se llevó a cabo en un método descrito en el ejemplo 7-1, excepto que la cidosporina A se utilizó en lugar de paclitaxel para confirmar la liberación de la cidosporina. Las cantidades de cidosporina retenidas en la membrana de diálisis se muestran en la figura 166. Este resultado muestra que derivados de HA pueden usarse como portadores de liberación controlada.
EJEMPLO 8 Síntesis de HA-AA-Chol que tiene enlazador diferente HA-AA-Chols (cuadro 21) que tiene diferentes enlazadores se obtuvieron como sólido en un método similar al del ejemplo 1-4 excepto que colesterilo 2-aminoetilcarbamato (Chol-C2), colesterilo 12-dodecilaminohexilcarbamato (Chol-C12) o colesterilo 8-amlno-3,6-dioxaoctilcarbamato (Chol-E02) se usó en lugar de 6-aminohexilcarbamato de colesterilo (Chol-C6). Colesterilo 2-aminoetilcarbamato, colesterilo 12-dodec¡laminohex¡lcarbamato, y colesterilo 8-amino-3,6-dioxaoctilcarbamato se sintetizaron en los métodos descritos en W02010/053140. Los espectros de^-RMN de los productos medidos en las mismas condiciones como las descritas en el ejemplo 1-5 se muestran en la figura 167 a 172. La relación de introducción del grupo colesterilo en unidades de HA se calculó en el mismo método que se describe en el ejemplo 1-5 (cuadro 21).
CUADRO 21 Enlazador en la preparación de derivado de ácido hialurónico v relación de introducción EJEMPLO 9 Síntesis de ácido HA-Ala-Colánico EJEMPLO 9-1 Síntesis de N-(2-aminoet¡n 5B-colanoamida Metil 5p-colanato (esteraloides, 100 pg) se disolvió en etilendiamina (6 mi) y la solución se calentó a reflujo a 130°C durante 4 horas. Después de la destilación bajo presión reducida, el residuo se disolvió en diclorometano y se lavó con agua ultrapura. El solvente se destiló bajo presión reducida para obtener aminoetil 5p-colanoamida.
'H-RMN (CDCI3): d = 0.64 (3H, s, CH3), 0.91 (3H, s, CH3), 0.92 (3H, d, CH3) 2.0-2.3 (2H, m, COCH2), 2.8 (2H, m, CH2CH2NHCO), 3.3 (2H, m, CH^NHCO), 5.9 (1H, br, NHCO).
EJEMPLO 9-2 Síntesis del ácido HA-Ala-colánico Una solución (10 mg/ml) de HA-Ala-TBA sintetizada en un método similar al del ejemplo 1-4 en DMSO anhidro se preparó. Posteriormente, a alícuotas de la solución se añadió aminoetil 5p-colanoamida preparado en el ejemplo 9-1 en las relaciones a las unidades de HA-Ala-TBA que se muestran en la cuadro 22 posterior. DMT-MM entonces se agregó a HA-Ala-TBA en la relaciones que se muestran en el cuadro 22 siguiente. Las soluciones de reacción se dializaron contra una solución mezclada de 1/1 de metanol/agua, una solución acuosa de NaCI 0.15 M, y agua ultrapura en este orden. Los dializados resultantes se secan por congelación para obtener el objetivo (HA-Ala-CA) como un sólido blanco.
Un ejemplo representativo de espectros de ^-RMN (el producto que se produce desde el material de inicio 99 kDa HA y tiene una relación de introducción del ácido colánico del 13%) utilizando DMSO-d6 como un solvente de medición se muestra en la figura 173. Basado en el valor integrado del pico derivado acetilo (COCH3, 1.6 a 2.0 ppm; 3H) en la glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo (CH3, 0.6 ppm; 3H) en el grupo de colesterilo, la relación de introducción de ácido colánico en unidades de HA se calculó de acuerdo con la siguiente expresión (cuadro 22). Ya que picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm que incluyen el pico derivado de acetilo glucosamina se traslapa con picos (7H) derivados del grupo de ácido colánico, el valor obtenido al sustraer 7/3 del valor integrado del pico (0.6 ppm) derivado de metilo en el grupo de ácido colánico del valor integrado de picos alrededor de 1.6 a 2.0 ppm (es decir, valor integrado (1.6 a 2.0 ppm) -valor integrado (0.7 ppm) c 7/3) se usó como el valor integrado de acetilo derivado de HA para calcular la relación de introducción.
[Exp. 8] Valor integrado de metilo derivado de ácido colánico (0.6 Relación de introducción del ppm) % del grupo de ácido . xlOO Valor integrado de acetilo derivado de HA colánico (1.6 a 2.0 ppm, valor después de la corrección) CUADRO 22 Cantidad de reactivo usado en la preparación de HA-Ala-CA v relación de introducción

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1 - Un derivado del ácido hialurónico que comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (I): [Fórmula química 1] [donde R1, R2, R3, y R4 se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci. 6, formilo, y alquilcarbonilo de Ci.6; R5 es un átomo de hidrógeno, formilo, o alquilcarbonilo de Ci-6; X1 es hidroxi, -O-Q+, alcoxi de C1-6, -NR7R8, o -NR^Z^Z2; Q+ representa un contracatión; R6, R7, R8, y R9 se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno y alquilo de C1-6; R3 es un átomo de hidrógeno o alquilo de C1-6, en donde el alquilo se puede sustituir independientemente por uno o más grupos seleccionados de hidroxi, carboxi, carbamoilo, alquiltio de Ci-6, arilo, y heteroarilo, en donde el arilo se puede sustituir con uno o más grupos hidroxi; Z1 es alquileno de C2.3o o -(CH2CH2O)m-CH2CH2-, en donde en el alquileno 1 a 5 grupos se seleccionan independientemente de -O-, -ÑR9-, y -S-S- se pueden insertar, y m es un número entero seleccionado de 1 a 100; Z2 se selecciona de los grupos representados por las siguientes fórmulas: -NRb-Z3,-NRb-COO-Z3, -NRb-CO-Z3, -NRb-CO-NRc-Z3, -COO-Z3, -CO-NRc-Z3, -0-CO-NRc-Z3, -O-COO-Z3, -S-Z3, -CO-Za-S-Z3, -0-CO-Zb-S-Z3, -NRb-CO-Zb-S-Z3, y -S-S-Z3; Rb y Rc se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-20, aminoalquilo de C2-20, e hidroxialquilo de C2.20, en donde en los radicales alquilo de los grupos 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de -O- y -NRf- se pueden insertar; Rf se selecciona independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-12, aminoalquilo de C2-i2, e hidroxialquilo de C2-i2, y en los radicales alquilo de los grupos 1 a 2 grupos seleccionados independientemente de -O- y -NH- se pueden insertar; R9 se selecciona independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-20, aminoalquilo de C2-2o, o hidroxialquilo de C2-20, y en los radicales alquilo de los grupos 1 a 3 seleccionados independientemente de -O- y -NH- se pueden insertar; Z3 es un grupo esterilo; Za es alquileno de Ci- 5 ; y Zb es alquileno de C2.8 o alquenileno de C2.8], en donde si el derivado de ácido hialurónico comprende unidades de no repetición representadas por la fórmula (I), donde X1 es -NR^-Z2, entonces el derivado de ácido hialurónico además comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (II): [Fórmula química 2] [donde Rla, R2a, R3a, y R4a se seleccionan independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6, formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; R5a es un átomo de hidrógeno, formilo, o alquilcarbonilo de Ci. 6; y X2 es -NR^-Z2, donde R9, Z1, y Z2 son como se definieron antes].
2 - El derivado de ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende adicionalmente una unidad de repetición representada por la fórmula (llb): [Fórmula química 3] [donde Rlb, R2b, R3b, y R4b se seleccionan cada uno independientemente de un átomo de hidrógeno, alquilo de Ci-6, formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; R5b se selecciona de un átomo de hidrógeno, formilo, y alquilcarbonilo de Ci-6; y Xb se selecciona de hidroxi y -O-Q+, donde Q+ representa un contracatión].
3.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque X1 es - R^Z^Z2 en la fórmula (I).
4- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque un porcentaje de la unidad de disacárido representada por la fórmula (I) en unidades de repetición de disacárido existentes es del 70 al 100 %.
5.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque un porcentaje de la unidad de disacárido que comprende el grupo -NR^Z^Z2 en unidades de repetición de disacárido existentes es del 3 al 50 %.
6.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque comprende unidades de no repetición representadas por la fórmula (I), en donde X1 es -NR^-Z2.
7.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, y 6, caracterizado además porque una suma de los porcentajes de la unidad de repetición representada por (I) y la unidad de repetición representada por la fórmula (II) en unidades de repetición de disacárido existentes es del 70 al 100 %.
8.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque el derivado de ácido hialurónico es producido mediante el uso de ácido hialurónico que consta exclusivamente de la unidad de disacárido representada por la fórmula (Ilb) según la reivindicación 2, y tiene un peso molecular promedio en peso de 3 kilo Daltons a 1,500 kilo Daltons cuando Rlb, R2b, R3b, y R4b son todos átomos de hidrógeno, Rsb es acetilo, y Xb es -O-INa+.
9 - El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque Z1 es alquileno de C2-i0, Z2 es -NH-COO-Z3, y Z3 es un grupo colesterilo.
10.- El derivado de ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque el derivado de ácido hialurónico se obtiene por la reacción de un derivado de ácido hialurónico que comprende una unidad de repetición representada por la fórmula (Ilb) y una unidad de repetición representada por la fórmula (la), [Fórmula química 4] [donde Xa se selecciona de hidroxi, -0-Q+, alcoxi de Ci-6, y -l\IR7R8 y R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Q+, y Ra son como se definen en la reivindicación 1], con un compuesto representado por la fórmula posterior, HNF^-Z^Z2, [donde R9, Z1, y Z2 son como se definen en la reivindicación 1].
11 - Una composición farmacéutica que comprende el derivado del ácido hialurónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un fármaco.
12.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque el fármaco se lleva formando un complejo con el derivado de ácido hialurónico.
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