CN115403681A - 生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用 - Google Patents

生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明中涉及生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用。该改性透明质酸具有如式I、式II或式III所示的分子结构，其中，R1、R2和R3可独立地选择氢原子、羟基、碳元素数不大于3的烷基、碳元素数不大于3的酮基及碳元素数不大于3的烷羟基，n为正整数。该改性透明质酸基于天然分子进行改性，改性过程简便，改性后能够被制作成水凝胶、微凝胶、乳胶等材料，可广泛应用于美容领域或医疗领域，尤其是基于该改性透明质酸制作的水凝胶具有优良的流变学和机械性能，细胞毒性低，异体排斥反应小，具有广阔地应用于美容注射应用前景。

Description

生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注 射材料上的应用
技术领域
本发明涉及透明质酸技术领域，尤其涉及生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用。
背景技术
透明质酸，又称玻尿酸，是一种酸性粘多糖，广泛存在于人体皮肤、角膜、关节液、细胞外基质中，具有保持水分、调节细胞渗透压、促进细胞自我修复和软骨形成等生理功能。透明质酸具有良好的生物相容性、降解性以及劲弹性，改性条件温和、工艺简单，可修饰位点多，其羟基、羧基和乙酰基都可用于修饰改性，因而其研究备受青睐。
尤其是以透明质酸为基本原料制备的水凝胶在美容整形注射材料、生物医用材料领域的应用受到广泛关注，例如，美容针，美容支撑材料，美容支撑体等等领域均具有广阔的应用前景。
然而现有的改性透明质酸材料的硬度、机械强度和稳定性受到了一定的限制；其稳定性较差、力学性能差；同时透明质酸为非抗原性，生物活性单一，容易引发炎症和异体排斥反应等不良效果，生物安全性不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的生物安全性注射用改性透明质酸，至少能够一定程度解决上述技术问题之一。
第一方面，本发明公开了一种改性透明质酸，具有如
Figure BDA0003834597280000011
Figure BDA0003834597280000021
所示的微观分子结构；其中，R1、R2和R3可独立地选择氢原子、羟基、碳元素数不大于3的烷基、碳元素数不大于3的酮基及碳元素数不大于3的烷羟基，n为正整数。
第二方面，本发明公开了第一方面涉及的改性透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
利用金属材料对透明质酸静电复合，促使透明质酸的侧链羧基电离而带负电；
利用带负电的透明质酸在N,N-二环己基碳酞亚胺和4-二甲氨基吡啶存在下分别与如
Figure BDA0003834597280000022
Figure BDA0003834597280000031
所示的化合物进行反应，经过纯化即可对应得到如式I、式II或式III所示的化合物，即为所述的改性透明质酸。
在本发明实施例中，所述制备方法采用了一反应装置进行，所述反应装置包括：
容器、阳电极、阴电极、电源及设置于所述容器内的有机纳滤膜，所述有机纳滤膜将所述容器内分隔为第一空间和第二空间，所述阳电极的一端插入至所述第一空间内、另一端连接所述电源的阳极处，所述阴电极的一端插入至所述第二空间内、另一端连接所述电源的阴极处，所述阳电极成格栅状并水平设置在所述第一空间内。
在本发明实施例中，所述制备方法具体包括：
在所述第一空间内加入被改性的透明质酸水溶液作为水相并使得所述阳电极处在水面位置，在所述第二空间加入等量的纯水，开启电源电解，使得透明质酸的侧链羧基电离而带负电；
关闭电源，继续于所述第一空间加入被反应液作为有机相，所述第二空间加入等量的纯水；其中，所述被反应液为包含N,N-二环己基碳酞亚胺和4-二甲氨基吡啶以及改性物的DMSO溶液，所述改性物为如式IV、式V或式VI所示的化合物；
反应结束后，将反应液抽滤除去不溶物，滤液用无水乙醇进行沉淀，离心即可得所述改性的透明质酸。
第三方面，本发明实施例公开了一种基于改性透明质酸的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
于2～8℃条件下，将权利要求1所述的改性透明质酸或权利要求2-5任一项所述的制备方法制得的改性透明质酸溶于水形成第一溶液；
先第一溶液中加入第一交联剂后，置于-15～-20℃处理后得到第二溶液；
向第二溶液中加入胶原蛋白肽水溶液和第二交联剂，再次置于-15～-20℃处理后，升温至室温即可得到所述水凝胶。
在本发明实施例中，所述第一交联剂选自乙二醇醚、乙二醇醚醋酸酯、丙二醇醚、丙二醇醚醋酸酯、丁基二乙二醇醚、单甲基烯丙基乙二醇醚和聚乙二醇醚中的至少一种；所述第二交联剂选自乙二胺、三乙胺、Β-羟基乙二胺和四乙二胺中的至少一种。
在本发明实施例中，胶原蛋白水溶液的浓度为2～4wt％，加入第一交联剂或加入第二交接剂后的处理时长均为10～24h。
第四方面，本发明实施例公开了基于第三方面涉及的方法制得的美容整形注射材料。
第五方面，本发明实施例公开了第一方面涉及的改性透明质酸在制备下述任一项产品中的应用，所述产品包括微凝胶、水凝胶、乳胶、美容面膜、美容整形注射材料和美容整形材料。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明中涉及改性透明质酸，基于天然分子进行改性，改性过程简便，改性后能够被制作成水凝胶、微凝胶、乳胶等材料，可广泛应用于美容领域或医疗领域，尤其是基于该改性透明质酸制作的水凝胶具有优良的流变学和机械性能，细胞毒性低，异体排斥反应小，具有广阔地应用于美容注射应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的用于改性透明质酸的反应装置的结构示意图。
图2为图1中的阳电极的立体示意图。
图3为本发明实施例提供的HA的1HNMR图。
图4为本发明实施例提供的HA-A1的1HNMR图。
图5为本发明实施例提供的HA-B1的1HNMR图。
图6为本发明实施例提供的HA-C1的1HNMR图。
图7为本发明实施例提供的对比例4制备的水凝胶微观形貌图。
图8为本发明实施例提供的实施例28制备的水凝胶微观形貌图。
图9为本发明实施例提供的实施例28粘附生长细胞生长7天的微观图。
图10为本发明实施例提供的实施例28粘附生长细胞生长7天的更微观细胞生长图。
图11为本发明实施例提供的实施例28在小鼠体内实验7天的组织切片图。
图12为本发明实施例提供的实施例28在小鼠体内实验60天的组织切片图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为更加深入地利用透明质酸的杰出的水溶性、保湿性和生物相容性，使其在高级化妆品和美容材料中发挥作用，本发明实施例公开了一种改性的透明质酸。
该改性透明质酸具有如
Figure BDA0003834597280000051
所示的微观分子结构；其中，R1、R2和R3可独立地选择氢原子、羟基、碳元素数不大于3的烷基、碳元素数不大于3的酮基及碳元素数不大于3的烷羟基，n为正整数。
例如，式I所示化合物可为
Figure BDA0003834597280000061
Figure BDA0003834597280000062
例如，式II所示化合物可为
Figure BDA0003834597280000063
Figure BDA0003834597280000071
例如，式III所示化合物的化合物可为
Figure BDA0003834597280000072
Figure BDA0003834597280000081
上述实施例提供的改性透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
利用金属材料对透明质酸静电复合，促使透明质酸的侧链羧基电离而带负电；
利用带负电的透明质酸在DCC和DMAP存在下分别与如
Figure BDA0003834597280000082
Figure BDA0003834597280000091
所示的化合物进行反应，经过纯化即可对应得到如式I、式II或式III所示的化合物，即为所述的改性透明质酸。
具体的，上述金属材料可选自铜、金或金铂合金。
式I、式II和式III所示化合物的制备和表征
对于上述改性的透明质酸的制备过程，以
Figure BDA0003834597280000092
所示的化合物为例，对其具体合成过程进行说明。
1、方法
1)为促使透明质酸带负电，本发明采用了如图1所示的反应装置进行实验，将透明质酸溶于水置于容器10中，并在容器10的两端分别分别插入阴电极14和阳电极12，并在外部将阴电极14和阳电极12提供供电电压，例如供电电压为36～100V，阳电极材料采用金，阴电极采用铝。
2)利用带负电的透明质酸在N,N一二环己基碳酰亚胺(简称DCC)和4-二甲氨基吡啶(简称DMAP)存在下分别与如式
Figure BDA0003834597280000101
所示化合物进行反应，即可得到上述化合物。
具体如：
图1中还设置有一个有机纳滤膜13，其将容器分隔成两部分，其中一部分插入阳电极12与外部电源11的阳极连接，另一部分插入阴电极14与外部电源11的阴极连接。该有机纳滤膜13可选自聚二甲基硅氧烷类纳滤膜、聚酰亚胺纳滤膜、聚丙烯腈纳滤膜、聚吡咯烷酮改性纳滤膜、聚酰胺纳滤膜或聚亚胺酯纳滤膜中的一种。
具体的，可在插入阳电极一部分的容器内放入改性透明质酸溶液，而插入阴电极一部分的容器内仅仅盛入超纯水。从而在给阳电极和阴电极之间施加电压时，阳电极表面或其附近能够聚集大量的待负电的透明质酸，以利于进一步反应的；而且由于有机纳滤膜的截留作用，使得透明质酸本身不可能移动至插入阴电极的容器一侧。
进一步的，在插入阳电极一侧中添加
Figure BDA0003834597280000102
反应物及DDC和DMAP以进行反应。其中，
Figure BDA0003834597280000103
(简称A1)为甾体皂苷元类化合物，其为天源来源化合物，比如来源于薯蓣皂苷元或剑麻皂苷元，可以利用双氧水直接氧化这一甾体皂苷元得到。
一个具体的制备过程如下，该过程在如图1所示的装置中进行：
1)将1.0g HA(透明质酸，粘均分子量：1000～1500Da)溶于去离子水形成1wt％的溶液，加入至图中插入有阳电极的一部分容器中，另一部分对应加入等量的超纯水；开启电源，促使电极间的电压为54V，大约5min后；关闭电源，再在插入有阳电极的一侧加入被反应液，被反应液为DCC、DMAP以及A1的DMSO溶液，同时将容器置于55℃水浴中反应48h，此过程维持。其中，A1与HA的摩尔比大于10:1，DDC与HA的摩尔比大于15:1，DMAP与HA的摩尔比大于10:1。例如，A1加入量为2.3g，DCC加入量为2.0633g，DMAP的加入量为0.8145g。
2)反应结束后，将反应液抽滤除去不溶物，滤液用无水乙醇进行沉淀，离心。用DMSO溶解离心所得固体，转入透析袋(MWCO＝3500Da)，用氯化钠溶液透析1d再用去离子水透析7～8d，冷冻干燥即可得到改性的透明质酸(如HA-A1)。
由于阳电极一侧为水相，在加入DMSO溶液中，其为有机相，促使二者发生分层，而带负电的HA均分布在水相中，进一步的实施例中，如图2所示，阳电极12被配置在两相分界处，并且阳电极被配置成水平的格栅状，促使阳电极上方的有机相能够与水相充分接触，并且与阳电极附近的带负电的HA充分反应，提升反应速率。
因此，在上述实施例中，阳电极一侧先加入的HA溶液应该刚好促使阳电极位于液面表面，待电解5min后，再在阳电极一侧加入DMSO溶液，而在阴电极一侧加入等量的超纯水溶液。
如此，使用图1中所示的装置在电解条件下对HA进行A1改性，其改性更加彻底。为此，本发明还提供了一对比例，具体如下：
1)将1.0g HA(粘均分子量：1000～1500Da)溶于去离子水形成1wt％的溶液，在溶液中加入3.0g强酸性阳离子交换树脂，搅拌5h后过滤除去强酸性阳离子交换树脂。滤液用25％的四丁基氢氧化铵(TBA-OH)调节pH至7.0～7.1，冷冻干燥得HA与四丁基氢氧化铵复配物HA-TBA。
2)称取0.5g HA-TBA溶于15mL无水DMSO，搅拌至完全溶解后加入2.0633g DCC和0.8145g DMAP，再称取2.3g A1加入到上述反应液中，在60℃下反应48h。
3)反应结束后，将反应液抽滤除去不溶物，滤液用无水乙醇进行沉淀，离心。用15mL DMSO溶解离心所得固体，转入透析袋(MWCO＝3500Da)，用氯化钠溶液透析1d天后，再用去离子水透析7～8d，冷冻干燥即可得到改性的透明质酸HA-A1。
2、改性透明质酸的表征
FTIR表征：将HA、A1粉末和冷冻干燥后的HA-A1粉末分别用全反射红外进行表征。
1H-NMR表征：HA溶于重水、HA-A1溶于氖代DMSO均形成20mg/mL溶液，在400MHz，25℃氮气气氛下进行化合物结构表征。
改性率：收集反应液中的A1成分，利用液相色谱法检测反应液中剩余的A1量，计算改性率，改性率＝(A1初始量-A1剩余量)/A1分子量/被改性HA单位摩尔数×100％，其中被改性HA单位摩尔数为参加反应HA所具有的其重复单元的摩尔数，例如，上述使用了1.0gHA，其粘均分子量去1500Da，其参见反应的HA重复单元的摩尔数即为(1/1500)×(1500/776.6486)≈0.0013mol。
2、结果
图2是HA、A1和HA-A1的红外谱图，与纯HA的红外谱图对比，HA-A1的红外谱图在2975cm-1处出现的吸收峰归属于A1上苯环的特征吸收峰；在1704cm-1处新生成吸收峰归属于酷化反应新生成酷键C＝O的伸缩振动峰；在1169cm-1处出现的吸收峰归属于C-O-C的伸缩振动峰，初步证明HA改性成功。
利用核磁氢谱对HA-A1结构进一步表征。结果见图3-6，对比图3和图4发现，与HA的1H-NMR图对比，HA-A1的氢谱图在δ为6.72处出现五元不饱和环上-CH的质子峰，5.27处出现六元不饱和环上-CH的质子峰，证明A1成功疏水改性HA。同样地，分别对比图3和图5，图3和图6，亦能分别证明B1和C1分别成功改性了HA。
利用HA-A1上苯环的质子峰面积与HA上-CH3质子峰面积的积分比计算可得不同合成条件下HA-A1的改性率，其中HA-A1，经过结果的优化发现，A1与HA的摩尔比大于10:1，DDC与HA的摩尔比大于15:1，DMAP与HA的摩尔比大于10:1时，能够获得加大的改性率。
同时，本发明实施例还利用上述合成方法，分别制备了不同类型的式I、式II和式III所示化合物，分别即为HA-A、HA-B和HA-C。用于改性的化合物物分别为A1，A2、A3，B1，B2、B3，C1，C2、C3。其中，A2的分子结构为
Figure BDA0003834597280000121
A3的分子结构为
Figure BDA0003834597280000122
B1的分子结构为
Figure BDA0003834597280000123
B2的分子结构为
Figure BDA0003834597280000124
B3的分子结构为
Figure BDA0003834597280000125
C1的分子结构为
Figure BDA0003834597280000126
C2的分子结构为
Figure BDA0003834597280000131
C3的分子结构为
Figure BDA0003834597280000132
表1
Figure BDA0003834597280000133
由表1可知，对于不同的改性化合物，在被改性的透明质酸分子量增大过程中，改性率均有所下降。
水凝胶
本发明实施例进一步研究了利用上述改性的透明质酸，制备了一种水凝胶，该水凝胶的制备方法包括以下步骤：于2～8℃条件下，将上述实施例公开的改性透明质酸溶于水形成第一溶液；先第一溶液中加入第一交联剂后，置于-15～-20℃处理后得到第二溶液；向第二溶液中加入胶原蛋白肽水溶液和第二交联剂，再次置于-15～-20℃处理后，升温至室温即可得到所述水凝胶。
其中，第一交联剂选自乙二醇醚(简称GE)、乙二醇醚醋酸酯(简称GEA)、丙二醇醚(简称PE)、丙二醇甲醚醋酸酯(简称MPA)、丁基二乙二醇醚(简称BDE)、单甲基烯丙基乙二醇醚(简称EMPO)和聚乙二醇醚(简称mPEG)中的至少一种；第二交联剂选自乙二胺(简称EEA)、三乙胺(简称TEA)、Β-羟基乙二胺(简称GE)和四乙二胺(简称BHEEA)中的至少一种。
其中，胶原蛋白水溶液的浓度为2～4wt％，加入第一交联剂或加入第二交接剂后的处理时长均为10～24h为佳。
在具体的实施例中使用了不同类型的第一交联剂、第二交联剂，不同的处理时长，具体的实施例列入表2中。
尽管由表1可知，高分子量的透明质酸被上述类型的改性率低，但是将如实施例1-27制备的改性透明质酸采用本实施例的方法制备水凝胶时，过低分子量制备的改性HA难以有效形成水凝胶，其最终产物并不为凝胶状，结果如表1所示，“+”表示可制备成型水凝胶，“－”表示不能。
故而，本实施方式进一步使用的改性透明至酸分别为实施例3、实施例12和实施例21制备水凝胶，均具有较高的分子量和较大改性率。并设置了对比例1-3，分别对应采用相同的改性透明质酸，经过上述相同的制备过程，仅仅在于其第一交联剂采用聚乙二醇双丙烯酸酯(简称PEGDA)，第二交联剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(简称NHS)。
一个具体的实施例37中，于2～8℃条件下，称取上述实施例公开的改性透明质酸如实施例4制备的HA-A115g溶解于超纯水中形成50ml的第一溶液，需要向第一溶液中加入50mL的GEA，与第一溶液混溶后置于-15～-20℃处理后处理23h；然后再向体系中加入牛键I型胶原蛋白(平均分子量超过29.8kDa，纯度大于98％，北京博奥瑞京科技发展有限公司提供)的水溶液100ml，其质量浓度为3wt％，及EEA 0.025mg，再次置于-15～-20℃处理48h后，升温至室温即可得到所述水凝胶。当制成的水凝胶可以成型时，在缓慢升温至室温时，可将其倒入用于成型的模具中，制成成型的产品。
表2中实施例38-45及对比例1-3可参照此过程和反应物、第一交联剂和第二交联剂的用量进行。对比例1-3中，第二交联剂用量具体为：EDC 0.02～0.025mg，0.0035～0.004mg NHS。
对比例4采用是未改性的透明质酸与实施例37相同的方法制备水凝胶。
对比例5制备的水凝胶采用如下方法进行：
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2～4h，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；
2)配制质量浓度为1％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，pH值调至5.0～5.5，室温搅拌24小时，得到溶液；其中，透明质酸分子量为170kDa。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基哇琳的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的3倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:l，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌12～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为20kDa的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物(简称LLys-HA)。
4)将LLys-HA采用实施例37的方法，利用LLys-HA和牛键I型胶原蛋白制备水凝胶。
表2
Figure BDA0003834597280000151
水凝胶性能表征
一、材料与方法
1、水凝胶的粘弹性测定
将水凝胶样品静置于哈克流变仪(HAAKE RheoStress 600，德国Thermo FisherScientific Inc)平板上40分钟，设置流变应力为10Pa，角频率(ω)范围为1-100rad/s，测定储能模量(G')和损耗模量(G")，得到储能模量(G')和损耗模量(G")随角频率(ω)的变化曲线。
复合剪切模量(|G*|)难易程度，剪切模量值越大，的粘弹性。表征了材料抵抗剪切应变的材料的刚性越强。复合粘度(|η*|)可用于表征材料的粘弹性；
Figure BDA0003834597280000161
|η*|＝|G*|/ω。
2、水凝胶的力学强度测定
水凝胶的力学强度通过应力扫描模式测定，将完全交联的水凝胶置于流变仪平板上，设定流变频率为1Hz，测定储能模量(G')和损耗模量(G")随剪切应力(τ)的变化曲线。
3、水凝胶的溶胀行为研究
水凝胶的溶胀率是指水凝胶溶胀所吸收的溶剂的质量与干凝胶质量的比，本章用称重法测量水凝胶的溶胀率。将干燥的水凝胶样品称重后置于37℃的PBS溶液中并恒温。每隔一段时间，取出水凝胶样品并用润湿滤纸吸干其表面的溶液后称重。水凝胶的溶胀率(SR)＝(Ws－W0)/W0×100％；式中，WS为不同时刻溶胀后水凝胶的质量，Wo为溶胀前干凝胶的质量。平行测定三次。
4、水凝胶的降解行为研究
水凝胶的降解行为通过干凝胶样品失重百分数来表征，将其置于含有不同浓度的二硫苏糖醇(DTT，1～10mmo1/L)PBS溶液及不同浓度(0.5～1.5wt％)PBS的溶液中，按照下述方法测定水凝胶在不同浓度的还原性缓冲介质中的降解行为。
将干燥至恒重的水凝胶样品浸泡在37℃的PBS溶液中并恒温。每隔一段时间，取出水凝胶样品冷冻干燥至恒重。水凝胶的降解率(PD)＝(Wi－Wd)/Wi×100％；式中，Wi为降解前干凝胶的初始质量，Wd为降解后干凝胶的质量。平行测定三次。
5、水凝胶的微观形貌
用扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶的内部形貌。将冻干水凝胶用液氮冷冻处理后，用刀片截取断面，并将其粘附在导电胶带上，用传统溅射技术在断面镀金。用日本日立公司TM-1000扫描电镜观测样品，扫描电压为15kV。
6、水凝胶中细胞的形态观察
将上述实施例和对比例制备的无菌凝胶薄片放在24孔细胞培养板中，每孔加入1mLα-MEM完全培养基使材料完全浸润。加入30μL人表皮角质形成细胞(普诺赛)悬液，接种密度为3×106个/mL。培养7d后移除培养基，PBS清洗，避光条件下，将样品浸泡在0.05mg/mLFDA中染色20min PBS漂洗后用荧光倒置显微镜观察表面细胞的生长形态。凝胶落田胞复合物取出，用2.5％(质量分数)戊二醛的PBS溶液4℃固定过夜，PBS洗后以梯度乙醇脱水处理，然后置于通风厨自然干燥4h，再真空干燥2h，表面喷金，用扫描电子显微镜观察。
7、体内免疫排异与体内降解实验
将该水凝胶薄片切成0.4cm×0.4cm×0.2cm的小块，乙醇消毒后用无菌生理盐水充分溶胀。小鼠麻醉、脱毛后，无菌条件下切开背部皮肤长约1cm，将在每只小鼠皮下组织植入一块水凝胶。植入后7、14和60d分别随机处死5只小鼠，观察植入部位组织变化，并用福尔马林液进行组织固定，切片，HE染色，光学显微镜下观察炎症反应大小和材料降解情况。
9、统计学数据处理
数据分析中检验及单因素方差分析均使用SPSS13.0统计软件进行。
二、结果
1、粘弹学性能
表4
实施例 G'(Pa) G"(Pa) |G*|(Pa) |η*|(Pa) YieldStress(kPa)
实施例28 3561 23 3561 356 4.629
实施例29 3432 25 3432 343 4.462
实施例30 3634 21 3634 363 4.724
实施例31 4013 32 4013 401 5.056
实施例32 3975 27 3975 398 5.009
实施例33 3945 24 3945 395 4.971
实施例34 4355 35 4355 436 6.533
实施例35 4431 32 4431 443 6.647
实施例36 4367 36 4367 437 6.551
对比例1 3212 214 3219 322 3.630
对比例2 3724 237 3732 373 4.208
对比例3 3957 345 3972 397 4.471
对比例4 1752 156 1759 176 1.980
对比例5 2134 108 2137 214 2.411
表4表明了在剪切应力为10Pa，角频率为10rad/s时的各种水凝胶的流变性能，其中实施例28-36的储能模量均大于对比例，损耗模量均小于对比例，进而计算的复合剪切模量和复合粘度也表现出相同的趋势。具体而言，对比例1相对于实施例28-30，对比例2相对于实施例31-33，对比例3相对于实施例34-36，由于其第一交联剂和第二交联剂的选择，其交联形成的网络结构促使其损耗模量的显著增加，将促使其整体的复合剪切模量增加，促使其水凝胶表现出更突出的剪切变稀的特性，降低了其流变性能，不利于作为注射材料应用。而对比例4和对比例5的复合剪切模量和复合粘度则远低于实施例，流变性能均不及本发明实施例所制得的水凝胶。
2、水凝胶的力学强度分析
在外界施加给水凝胶的剪切应力较小时，水凝胶的储能模量和损耗模量基本不变，此阶段水凝胶的内部结构完整，去除外界剪切应力后，水凝胶能够恢复原状；当外界剪切应力持续增加到某一值时，水凝胶的储能模量和损耗模量迅速降低，此时水凝胶的内部结构完全被破坏，去除外界剪切应力，水凝胶结构不能恢复，此时对应的剪切应力即为水凝胶的屈服强度。因此，屈服应力值的大小可以用来表征水凝胶的力学强度。如表4最后一列可知，同样地，对比例1相对于实施例28-30，对比例2相对于实施例31-33，对比例3相对于实施例34-36，由于其第一交联剂和第二交联剂的选择，其屈服应力显著降低，使得对比例1、2、3制备的水凝胶的力学性能不差，不利于其成型。
3、水凝胶的溶胀及降解性能研究
溶胀率是水凝胶的重要性能之一，在一定程度上关系到水凝胶所包覆物质与外界环境的交换速度。水凝胶的溶胀性能与水凝胶的交联度及水凝胶的三维网状结构的完整性有着密切的联系。
表5
Figure BDA0003834597280000181
表5分示出了上述各实施例和对比例的平衡溶胀率SRbal及达到平衡溶胀率时间，并且还示出了对应的最大降解率PDmax及达到最大降解率的时间。
其中，实施例28-30的平衡溶胀率低于对比例1，达到平衡溶胀率时间高于对比例1，说明实施例28-30其更加的凝胶流变性能，交联更加致密，反而不利于溶胀。而比较实施例28-30的最大降解率时发现，其远低于对比例1，并且在在两种降解溶剂中(含有DTT的PBS(DTT/PBS)及PBS溶液)中均能具有源大于对比例1的达到最大降解率的时间。这也表明，正由实施例28-30获得的水凝胶具有此种致密和优异的流变性能和机械性能，促使其能够在还原性溶液和盐溶液中长期保持其三维结构。而这种性能，对于在医用注射用材料或者体内支撑材料中将发挥重要作用。另外，实施例31-36也表现相同的溶胀和降解性能。
4、水凝胶的微观形貌
水凝胶的断面SEM图如图2-8所示。所有水凝胶都具有相互连通的孔结构，但孔壁结构存在明显差异，实施例28的孔结构更致密，对比例1和对比例5孔结构输送，且其孔壁存在较多的断层，结构不连接，由此可见，本发明实施例制备的水凝胶具有更佳的微观结构，可归因于其高的交联密度，也与流变学性能测试得出的其力学强度最好的结果相符合；这为其作为美容整形注射材料或者支撑材料提供了结构条件。
5、水凝胶的细胞生物相容性评价结果
图6显示了细胞在凝胶表面粘附的形态。水凝胶与细胞共培养7d后，细胞长满整个表面，FDA染色可以观察到细胞呈现出伸展的状态。图7的扫描电子显微镜的结果进一步说明该水凝胶安全无毒，适合细胞粘附和生长。表明该水凝胶的浸提液对细胞没有毒性，能够为细胞生长提供安全的环境。
6、水凝胶的体内实验结果
水凝胶植入皮下7d后，凝胶完全和皮肤组织粘附在一起，材料周围有少量炎症细胞浸润；7d后炎症细胞消失；第60d时水凝胶保持基本的形状，并未降解，小鼠无其他副反应。这表明水凝胶可吸收，降解过程中产生一定的炎症反应，降解产物最终可被机体免疫系统清除，炎症消失。
细胞毒性和植入排斥反应是评价一种材料生物安全性的重要评价指标。本研究的水凝胶是由天然高分子材料和合成高分子组成，其理化性质(力学性能和生物学性能等)与细胞外基质类似，另外凝胶质量的95％以上是水，具有一定的细胞相容性和组织相容性。
透明质酸(玻尿酸)HA广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。
然而正是由于透明质酸具有上述的这些优点，吸收迅速、降解速度快等，导致了透明质酸材料的硬度、机械强度和稳定性受到了一定的限制；其稳定性较差、力学性能差；同时透明质酸为非抗原性，生物活性单一，容易引发炎症和异体排斥反应等不良效果。
乳胶及防晒霜
经过本发明实施例制备的低分子量改性难以制备有效的水凝胶，但是其能够作为制备化妆品，例如防晒霜等制备原料。
例如，将HA-A1溶于无水DMSO形成10mg/mL的溶液，以15L/min的速率将超水滴加到1mL的HA-A1溶液中，当达到临界水含量时，加入大量超纯水搅拌(以固定胶体粒子，转入透析袋进行透析，获得HA-A1胶体粒子分散液，冷冻干燥得HA-A1胶体粒子粉末。
防晒霜的制备：选取合适的油相(白油、棕搁酸异辛酯以及小麦胚芽油)、水相(超纯水和甘油)和乳化剂(吐温-80和HA-A1胶体粒子)，将HA-A1胶体粒子溶于水相，吐温-80溶于油相，在60℃下，搅拌溶解油相、水相和乳化剂，在600r/min的搅拌速度下，将A相(油相及油溶性乳化剂)加入到B相(水相及水溶性乳化剂)中，搅拌50min后，冷却至40℃，加入其它组分，在300r/min的搅拌速度下缓慢冷却至室温，制得化妆品防晒霜。
防晒性测试：利用紫外吸光度法中的石英板法来测定防晒化妆品的防晒效果。将相同质量化妆品防晒霜按照相同的手法涂抹于载体的医用胶带上，放置一段时间后，利用紫外分光光度计对化妆品防晒霜的紫外吸收(A)进行测试，计算其紫外透过率(T)，T＝1/l0A。
表7
实施例 被改性HA分子量 改性化合物 T
实施例37 1000～1500Da A1 45.6％
实施例38 1000～1500Da B2 44.8％
实施例39 1000～1500Da C3 46.1％
对比例6 1000～1500Da 未改性HA 75.1％
对比例7 1000～1500Da LLys 81.0％
表7中，实施例37、实施例38和实施例39分别对应采用了实施例1、实施例13和实施例25制备的改性透明质酸进行制备防晒霜，而对比例6采用未改性透明质酸、对比例7采用L-赖氨酸改性的透明质酸(如对比例5的方法)，这些实施例和对比例中的透明质酸分子量均相同。结果显示，实施例37-39制备的防晒霜具有较大的具有紫外吸收效果，而对比例6、7具有较高的透过率，防晒效果差。这可能与本发明实施例对透明质酸进行了改性，促使其侧量产生了有利于紫外吸收作用的基团，达到了增强防晒的效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种生物安全注射用改性透明质酸，其特征在于，具有如
Figure FDA0003834597270000011
所示的微观分子结构；其中，R1、R2和R3可独立地选择氢原子、羟基、碳元素数不大于3的烷基、碳元素数不大于3的酮基及碳元素数不大于3的烷羟基，n为正整数。
2.权利要求1所述的生物安全注射用改性透明质酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用金属材料对透明质酸静电复合，促使透明质酸的侧链羧基电离而带负电；
利用带负电的透明质酸在N,N-二环己基碳酞亚胺和4-二甲氨基吡啶存在下分别与如
Figure FDA0003834597270000012
所示的化合物进行反应，经过纯化即可对应得到如式I、式II或式III所示的化合物，即为所述的改性透明质酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用了一反应装置进行，所述反应装置包括：
容器、阳电极、阴电极、电源及设置于所述容器内的有机纳滤膜，所述有机纳滤膜将所述容器内分隔为第一空间和第二空间，所述阳电极的一端插入至所述第一空间内、另一端连接所述电源的阳极处，所述阴电极的一端插入至所述第二空间内、另一端连接所述电源的阴极处，所述阳电极成格栅状并水平设置在所述第一空间内。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：
在所述第一空间内加入被改性的透明质酸水溶液作为水相并使得所述阳电极处在水面位置，在所述第二空间加入等量的纯水，开启电源电解，使得透明质酸的侧链羧基电离而带负电；
关闭电源，继续于所述第一空间加入被反应液作为有机相，所述第二空间加入等量的纯水；其中，所述被反应液为包含N,N-二环己基碳酞亚胺和4-二甲氨基吡啶以及改性物的DMSO溶液，所述改性物为如式IV、式V或式VI所示的化合物；
反应结束后，将反应液抽滤除去不溶物，滤液用无水乙醇进行沉淀，离心即可得所述改性的透明质酸。
5.一种基于改性透明质酸的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
于2～8℃条件下，将权利要求1所述的生物安全注射用改性透明质酸或权利要求2-4任一项所述的制备方法制得的生物安全注射用改性透明质酸溶于水形成第一溶液；
先第一溶液中加入第一交联剂后，置于-15～-20℃处理后得到第二溶液；
向第二溶液中加入胶原蛋白肽水溶液和第二交联剂，再次置于-15～-20℃处理后，升温至室温即可得到所述水凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一交联剂选自乙二醇醚、乙二醇醚醋酸酯、丙二醇醚、丙二醇醚醋酸酯、丁基二乙二醇醚、单甲基烯丙基乙二醇醚和聚乙二醇醚中的至少一种；所述第二交联剂选自乙二胺、三乙胺、Β-羟基乙二胺和四乙二胺中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，胶原蛋白水溶液的浓度为2～4wt％，加入第一交联剂或加入第二交接剂后的处理时长均为10～24h。
8.基于权利要求5-7任一项所述的制备方法制得的美容整形注射材料。
9.一种权利要求1所述的改性透明质酸在制备下述任一项产品中的应用，所述产品包括微凝胶、水凝胶、乳胶、美容面膜、美容整形注射材料和美容整形材料。
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