JP5542687B2 - ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物 - Google Patents
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Description
Zは、直接結合、または2〜30個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し;
X1は、以下の式:
−NRb−R、
−NRb−COO−R、
−NRb−CO−R、
−NRb−CO−NRc−R、
−COO−R、
−O−COO−R、
−S−R、
−CO−Ya−S−R、
−O−CO−Yb−S−R、
−NRb−CO−Yb−S−R、および
−S−S−R、
により表される基から選択される疎水性基であり;
Ra、RbおよびRcは、それぞれ独立に、水素原子、C1−20アルキル、アミノC2−20アルキルおよびヒドロキシC2−20アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−O−および−NRf−から選択される1〜3個の基が挿入されていてもよく;
Rfは、水素原子、C1−12アルキル、アミノC2−12アルキルおよびヒドロキシC2−12アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−O−および−NH−から選択される1〜2個の基が挿入されていてもよく;
Rは、ステリル基であり;
Yは、C2−30アルキレン、または−(CH2CH2O)m−CH2CH2−であり、ここで、当該アルキレンは、−O−、−NRg−および−S−S−から選択される1〜5の基が挿入されていてもよく;
Rgは、水素原子、C1−20アルキル、アミノC2−20アルキルまたはヒドロキシC2−20アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−O−および−NH−から選択される1〜3個の基が挿入されていてもよく;
Yaは、C1−5アルキレンであり;
Ybは、C2−8アルキレンまたはC2−8アルケニレンであり;
mは、1〜100から選択される整数である]
で表される繰り返し単位を、1以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
Xは、−NRa−Y−NRb−COO−Rで表される疎水性基であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立に、水素原子およびC1−6アルキルから選択され;
Rは、ステリル基であり;
Yは、C2−30アルキレン、または−(CH2CH2O)m−CH2CH2−であり、
mは、1〜100から選択される整数である]
で表される繰り返し単位を、1以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
−NH−(CH2)mz−NH−R;
−NH−(CH2)mz−NH−COO−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−NH−COO−R;
−NH−(CH2)mz−COO−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−COO−R、
−NH−(CH2)mz−O−COO−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−O−COO−R、
−NH−(CH2)mz−S−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−S−R;
−NH−(CH2)mz−O−CO−CH(R8)−CH2−S−R;
−NH−(CH2)mz−NHCO−CH(R8)−CH2−S−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−NHCO−CH(R8)−CH2−S−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−O−CO−CH(R8)−CH2−S−R;および
−NH−(CH2)mz−S−S−R;
−Z−NRa−Y−NRb−COO−R
(ここで、mzは、2〜30の整数であり、R8は、水素原子またはメチル基であり、R、およびmは、本明細書で既に定義したとおりである)
で表される基から選択される。当該基は、好ましくは、
−NH−(CH2)mz−NH−COO−R;
−NH−(CH2CH2O)m−CH2CH2−NH−COO−R;および
−NH−(CH2)mz−S−S−R
(ここで、mz、R、およびmは、本明細書で既に定義したとおりである)
から選択される基である。
Xaは、ヒドロキシおよび−O−Q+から選択され;ここで、Q+は、カウンターカチオンである]
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体が提供される。本発明のヒアルロン酸誘導体に式(II)で表される繰り返し単位が2以上含まれる場合、当該繰り返し単位は同一であっても、異なっていてもよい。1つの態様において、本発明は、式(I)で表される繰り返し単位、および式(II)で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体を提供する。
Xbは、−NRe−Yb−Rdを表し;
Reは、水素原子またはC1−6アルキル基であり;
Rdは、水素原子、C1−6アルキル基または基−CO−C(R7)=CH2であり、
Ybは、−CH2−(CHR5)l−2−CH2−NH−、−CH2−(CHR6)p−2−CH2−O−、−(CH2)j−S−、−CH2−CH2−(Y3−CH2−CH2)z−S−、−CH2−CH2−(Y4−CH2−CH2)t−NH−または−CH2−CH2−(Y5−CH2−CH2)y−O−であり、
ここで、l、p、およびjは、それぞれ独立に2〜10から選択される整数であり、z、tおよびyは、それぞれ独立に1〜200から選択される整数であり、R5およびR6はそれぞれ独立に水素原子またはヒドロキシであり、R7は、水素原子またはメチル基であり、Y3、Y4およびY5は、それぞれ独立して、酸素原子または−NH−である]
で表される繰り返し単位をさらに含む、ヒアルロン酸誘導体が提供される。本発明の1つの態様において、上記式(I)、式(II)および式(III)で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸誘導体が提供され、さらに別の態様において、上記式(I)、式(II)および式(III)で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸誘導体が提供される。当該ヒアルロン酸誘導体は、血中滞留性向上の観点からは、好ましくは重量平均分子量が27kDa以下、より好ましくは18kDa以下の、式(II)で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として製造されうる。原料の重量平均分子量の下限は5kDa以上あればよい。当該分子量の好ましい範囲は5〜27kDaであり、さらに好ましくは5〜18kDaである。
架橋反応の他の事例としては、アミノ基を導入したヒアルロン酸誘導体(HA−AM)と、C2−20アルキレンの両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤(例えば、ビス[スルフォスクシンイミジル]スベレート(BS3)、エチレングリコール−ビス[スルフォスクシンイミジル]スクシネート(Sulfo−EGS)、ジメチルアジピミデート塩酸塩(DMA)など)とので縮合反応による架橋;HA−AMと、C2−20アルキレンの両端にホルミル基を有する架橋剤(例えば、グルタルアルデヒドなど)との架橋;ホルミル基を導入したヒアルロン酸誘導体(HA−ALD)と、C2−20アルキレンの両端にアミノ基を有する架橋剤(例えば、エチレンジアミン(EDA)など)との架橋;メルカプト基を導入したヒアルロン酸誘導体(HA−SH)の酸化条件下(例えば、テトラチオネートナトリウム(STT)存在下など)での酸化反応による架橋;HA−SHと、C2−20アルキレンの両端にマレイミド(MAL)基やメタクリロイル基などの不飽和結合を有する架橋剤(例えば、1,4−ビス−マレイミドブタン(BMB)、ジメタクリル酸エチレン(EDMA)など)とのマイケル付加反応による架橋;アクリロイル基およびメタクリロイル基などの不飽和結合を導入したヒアルロン酸誘導体と各種重合開始剤(例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム(KPS)/N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、Irgacure2959など)とのラジカル重合による架橋;ジアミン化合物(例えば、EDA、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチレンジアミン)など)共存下、縮合剤(例えば、N,N’−カルボニルジイミダゾール(CDI)、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン)−4−メチルモルホリウムクロライド(DMT-MM)、2−ベンゾトリアゾール−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム4フッ化ホウ酸塩(TBTU)、3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(HODhbt)、ベンゾトリアゾール−1−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム6フッ化リン酸塩(PyBOP)、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート(BOP)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)またはN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)など)による架橋が挙げられる。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
Xcは、ヒドロキシおよび−O−Q+、から選択され;ここで、Q+は、カウンターカチオンであり;
R1cは、
−CO−C(R21)=CH2、
−CH2CH(OH)−R22−Y1、
−CH(CH2OH)−R22−Y1、
−CONH−R23−Y1、
−CO−R23−Y1、
−CONH−CH2CH2−(X21−CH2CH2)n3−Y1、および
−CO−CH2CH2−(X21−CH2CH2)n4−Y1から選択され、
X21は、OおよびSから選択され:
n3およびn4は、それぞれ1〜50の整数を表し;
Y1は、アミノ、メルカプト、ホルミル、−X14−CO−C(R18)=CH2から選択され、
R21は、水素原子またはC1−6アルキルから選択され;
R22およびR23は、2価のC2−50炭化水素基または2価のC2−50ポリアルキレンオキシ基であり、前記2価のC2−50炭化水素基は、1〜10個の−O−が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分が形成されていてもよく;
X14は、OおよびN(R19)から選択され;
R18は水素原子またはC1−6アルキルであり;
R19は水素原子またはC1−6アルキルである]
で表される繰り返し単位をさらに含む、本明細書で定義したヒアルロン酸誘導体が提供される。当該側面の1つの態様において、当該ヒアルロン酸誘導体は、上記式(I)、式(II)および式(IV)で表される繰り返し単位のみから;または上記式(I)、式(II)、式(III)および式(IV)で表される繰り返し単位のみから構成される。
(a)本明細書で定義した疎水性基を有するヒアルロン酸誘導体を製造する工程;
(b)得られたヒアルロン酸誘導体を水相に溶解または分散させる工程;
(c)得られたヒアルロン酸誘導体水溶液または分散液に薬物を加え、薬物担持微粒子を形成させる工程;
を含む、医薬組成物の製造方法が提供される。当該医薬組成物が沈殿物の場合は、さらに以下の工程:
(d)塩物質を加え、薬物担持微粒子を沈殿させる工程
を加えてもよい。上記各工程は、W/Oエマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。工程(c)において水相中で形成した微粒子または工程(d)において得られた沈殿を乾燥して(例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥などによる)固化し、さらに必要に応じて粉砕、乾燥、洗浄工程などを行って、固体として目的の医薬組成物を得てもよい。
−CONRa−Y−NRbH + Hal−R、
−CONRa−Y−NRbH + Hal−COOR、
−CONRa−Y−NRbH + HOCO−R、
−CONRa−Y−NRbH + Hal−CO−R、
−CONRa−Y−NRb−COOH + HNRc−R、
−CONRa−Y−NRb−CO−NRcH + Hal−R、
−CONRa−Y−NRbH + HOCO−NRc−R、
−CONRa−Y−NRbH + Hal−CO−NRc−R、
−CONRa−Y−COOH + HO−R、
−CONRa−Y−OH + Hal−COO−R、
−CONRa−Y−OCOOH + HO−R、
−CONRa−Y−OCOOH + Hal−R、
−CONRa−Y−OCO−Hal + HO−R、
−CONRa−Y−SH + Hal−R、
−CONRa−Y−Hal + HS−R、
−CONRa−Y−CO−Ya−Hal + HS−R
−CONRa−Y−CO−Ya−SH + Hal−R、
−CONRa−Y−O−CO−CH=CH2 + HS−R、
−CONRa−Y−NRb−CO−CH(CH3)=CH2 + HS−R、
−CONRa−Y−SH + HS−R、
−COZ−OH + HNRa−Y−NRb−COO−R、
−COZ−NRa−Y−NRbH + Hal−COO−R
(式中、Ra、Rb、Rc、Y、Ya、Yb、およびZは本明細書で既に定義したとおりであり、Halは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す)。
−NH−(CH2)p1−O−CO−C(R17)=CH2;
−NH−(CH2)p1−O−CO−CH(R17)−CH2−S−CH2−CH(OH)−CH(OH)−CH2−SH;
−NH−(CH2)p1−SH;
−NH−(CH2)p1−NH−CO−C(R17)=CH2;
−NH−(CH2)p1−NH−C(=NH)−(CH2)3−SH;
−NH−(CH2)p1−NH−CO−(CH2)r−SH;
−NH−(CH2)p1−NH−CO−CH(R17)−CH2−S−CH2−CH(OH)−CH(OH)−CH2−SH;
−NH−(CH2)p1−NH−CO−CH(NH2)−CH2−SH;
−NH−(CH2)p1−NH−CO−CH(NH2)−(CH2)2−SH;
−NH−NH−CO−(CH2)4−CO−NH−NH−C(=NH)−(CH2)3−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−O−CO−C(R17)=CH2;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−O−CO−CH(R17)−CH2−S−CH2−CH(OH)−CH(OH)−CH2−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−CO−C(R17)=CH2;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−C(=NH)−(CH2)3−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−CO−(CH2)r−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−CO−CH(R17)−CH2−S−CH2−CH(OH)−CH(OH)−CH2−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−CO−CH(NH2)−CH2−SH;
−NH−(CH2−CH2−O)q−CH2−CH2−NH−CO−CH(NH2)−(CH2)2−SH;
−NH−CH(CO2H)−(CH2)−SH;
−NH−CH(CO2H)−(CH2)2−SH;および
−NH−CH(CO2H)−(CH2)2−CONH−CH(CONH−CH2−CO2H)−CH2−SH
(ここで、R17は、水素原子またはC1−6アルキル基であり、p1は2〜10の整数、qは1〜200の整数、rは1〜3の整数を、それぞれ表す)から選択される]
に変換することで、分子内あるいは他分子を含めた分子間で架橋させてゲル化することもできる。
ヒアルロン酸誘導体のN−アセチルグルコサミン部分の6位のヒドロキシと、薬物のカルボキシ基または薬物に導入したカルボキシ基との反応;
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基と、薬物のカルボキシ基または薬物に導入したカルボキシ基との反応;
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノ基と、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、NHSエステルおよびエポキシドなどに変換された薬物との反応;
薬物のアミノ基または薬物に導入したアミノ基と、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、カルボニル、NHSエステルおよびエポキシドに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応;
ヒアルロン酸誘導体のアミノ基と、カルボニル基を有するまたは導入された薬物(アルデヒドおよびケトンなど)とのシッフ塩基形成ならびに還元的アミノ化反応;
薬物のアミノ基または薬物に導入したアミノ基と、修飾によりカルボニル基が導入されたヒアルロン酸誘導体とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応;
ヒアルロン酸誘導体に導入したメルカプト基と、不飽和結合を有する化合物(マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど)、ハロゲン化物(クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど)またはチオールである薬物または修飾により当該化合物に変換された薬物との反応;および
薬物に導入したメルカプト基と、修飾により、不飽和結合を有する化合物(マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど)、ハロゲン化物(クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど)またはチオールに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応。
−R、
−Y−NRb−R、
−Y−NRb−COO−R、
−Y−NRb−CO−R、
−Y−NRb−CO−NRc−R、
−Y−COO−R、
−Y−O−COO−R、
−Y−S−R、
−Y−CO−Ya−S−R、
−Y−O−CO−Yb−S−R、
−Y−NRb−CO−Yb−S−R、および
−Y−S−S−R
(R、Y、Rb、Rc、YaおよびYbは、前記にて定義した通りである)
に変換することもできる。
−R、
−CO−Y−NRb−COO−R、
−OCO−Y−NRb−COO−R、
−CO−NRa−Y−NRb−COO−R、
−CO−Y−COO−R、
−OCO−Y−COO−R、
−CO−NRa−Y−COO−R、
−CO−Y−OCOO−R、
−OCO−Y−OCOO−R、
−CO−NRa−Y−OCOO−R、
−CH2CH(OH)−O−R、
−CH(CH2OH)−OR、および
−CH2CHRh−SO2−OR
(R、Y、Ra、Rbは、前記にて定義した通りであり、Rhは、水素原子またはC1−6アルキルである)
に変換することにより、ヒアルロン酸またはその塩にステリル基を有する疎水性基を導入することもできる。
(Ra、Y、Rb、R、RcおよびYbは明細書中に定義されたとおりであり、X1aは、以下の式:
−R、
−COO−R、
−CO−R、
−CO−NRc−R、又は
−CO−Yb−S−R、
を表す)
に変換することもできる。当該ペプチドリンカーは、N末端にて基X1aに結合する。
(実施例1−1)コレステリル 6−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の調製
コレステリルクロロホルメート(3.37g、7.5mmol)の無水ジクロロメタン(20mL)の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン(TEA、1.05mL)を加えて撹拌した。氷冷下で、6−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノヘキサン(1.12mL、5mmol)を滴下して加え、そのまま氷冷下で30分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチル:n−ヘキサン=1:4)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
(実施例1−2)コレステリル 2−アミノエチルカーバメート塩酸塩の調製
6−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノヘキサンの代わりに2−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノエタン(0.79mL、5mmol)を用い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーの溶離液に酢酸エチル:n−ヘキサン=1:2を用いたこと以外は実施例1−1と同様の方法で行い、コレステリル 2−アミノエチルカーバメート(Chol−C2)の塩酸塩(2.3g)を得た。生成物の1H−NMRスペクトル(JNM−ECA500 日本電子株式会社製;EtOH−d6)を図2に示す。
(実施例1−3)コレステリル 8−アミノオクチルカーバメート塩酸塩の調製
8−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノオクタン(1.21g、5mmol)の無水ジクロロメタン(100mL)および無水トルエン(200mL)の溶液に、アルゴン雰囲気下、TEA(0.7mL)を加えて撹拌した。氷冷下、コレステリルクロロホルメート(2.66g、6mmol)の無水ジクロロメタン溶液を滴下し、そのまま氷冷下で30分間攪拌後、室温に昇温して一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチル:n−ヘキサン=1:4)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
(実施例1−4)コレステリル 12−アミノドデシルカーバメート塩酸塩の調製
6−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノヘキサンの代わりに12−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−1−アミノドデカン(1.59g、5mmol)を用いたこと以外は実施例1−1と同様の方法で行い、コレステリル 12−アミノドデシルカーバメート(Chol−C12)の塩酸塩(1.0g)を得た。生成物の1H−NMRスペクトル(JNM−ECA500 日本電子株式会社製;EtOH−d6)を図4に示す。
(実施例2−1)カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム(TBA)塩化
DOWEX(登録商標)50WX−8−400(アルドリッチ社製)を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で3回程度洗浄した。40wt%テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液(TBA−OH)(アルドリッチ社製)を樹脂のカチオン交換能に対し約1.5倍モル等量加え、30分間撹拌した。余剰のTBA−OH溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、TBA塩化したカチオン交換樹脂を得た。
(実施例2−2)HAのTBA塩の調製
分子量27kDa、50kDaおよび100kDaのヒアルロン酸ナトリウム塩(HA−Na、資生堂株式会社製)をそれぞれ15mg/mLの濃度で超純水に溶解した。実施例2−1でTBA塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をHAユニット(ユニット分子量401.3)のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で5倍モル等量添加した。15分間撹拌した後、0.45μmのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のTBA塩(HA−TBA)を白色固体として得た。
(実施例2−3)コレステリル基を導入したHA誘導体の調製
(実施例2−3−1)コレステリル 6−アミノヘキシルカーバメートを導入したHA誘導体の調製
実施例2−2で調製した、HA−Na(50kDa)を出発原料とするHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、実施例1−1で調製したChol−C6塩酸塩をHA−TBAユニットに対して以下の表1に示す比率で各溶液に添加した。次に、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)をHA−TBAユニットに対して以下の表1に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、0.3M 酢酸アンモニア/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超純水の順で透析(スペクトラポア4、分画分子量(MWCO):12k〜14kDa)し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物(HA−C6−Chol)を白色固体として得た。
実施例2−2で調製した、HA−Na(50kDa)を出発原料とするHA−TBAを10mg/mLで無水DMSOに溶解した。その後、実施例1−2で調製したChol−C2塩酸塩をHA−TBAユニットに対して以下の表2に示す比率で各溶液に添加した。次に、DMT−MMをHA−TBAユニットに対して以下の表2に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に0.3Mとなるように硝酸ナトリウムを加え、イソプロピルアルコール(IPA)を加えて生じた沈殿を回収し、IPA、エタノール洗浄後に、超純水に溶解し、0.15M NaCl水溶液、超純水の順で透析(スペクトラポア4、分画分子量(MWCO):12k−14kDa)した。得られた透析液を凍結乾燥してHA−C2−Cholを白色固体として得た。なお、HA−C2−Cholは、上記反応溶液に、実施例2−3−1と同様の処理(0.3M 酢酸アンモニア/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超純水の順で透析して得られた透析液を凍結乾燥すること)を施すことによっても得ることができる。実施例2−3−1に記載と同じ条件で測定した生成物(導入率8%)の1H−NMRスペクトルを図7に示す。また、実施例2−3−1記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表2に示す。
Chol−C2塩酸塩の代わりに実施例1−3で調製したChol−C8塩酸塩を用い、以下の表3に示す比率でChol−C8塩酸塩ならびにDMT−MMを添加したこと以外は実施例2−3−2と同様の方法で行い、HA−C8−Cholを白色固体として得た。実施例2−3−1記載と同じ条件で測定した生成物(導入率7%)の1H−NMRスペクトルを図8に示す。また、実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表3に示す。
Chol−C2塩酸塩の代わりに実施例1−4で調製したChol−C12塩酸塩を用い、以下の表4に示す比率でChol−C12塩酸塩ならびにDMT−MMを添加したこと以外は実施例2−3−2と同様の方法で行い、HA−C12−Cholを白色固体として得た。実施例2−3−1記載と同じ条件で測定した生成物(導入率7%)の1H−NMRスペクトルを図9に示す。また、実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表4に示す。
実施例2−3−1〜2−3−4で得られたHA誘導体を1mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。それぞれをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供してHA誘導体の保持時間の変化から会合体形成を観察した(図10−1〜10−4)。
SECの条件を以下に示す。
カラム:G3000SWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:示差屈折率。
実施例2−3−1〜2−3−4で得られたHA誘導体を1mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。それぞれ70μLに対してヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HP−β−CD)PBS溶液(33mM、30μL)加え、37℃にて1時間インキュベートした。各試料をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供して、保持時間の変化からHA誘導体の会合体の崩壊を観察した(図11−1〜11−4)。
カラム:G3000SWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:10mM HP−β−CD/PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:示差屈折率
実施例2−3−1〜2−3−4で得られたHA誘導体を1mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。また、比較例として、実施例2−2において原料として用いたHA−Na(分子量:50kDa)、ならびにプルラン(分子量100kDa)の100単糖あたり1.38個の−CONH−(CH2)6−NHCOO−コレステリル基が、そのヒドロキシに導入されているコレステリル導入プルラン(CHP;商品名PUREBRIGHT CP−100T、日本油脂株式会社製)を1mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。
カラム:G4000SWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:UV(280nm)。
カラム:QC−PAK−GFC300(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1.2mL/分
注入量:20μL
検出:UV(280nm)。
実施例5において37℃にて24時間インキュベートした試料(200μL)に対し、それぞれヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HP−β−CD)PBS溶液(50mM、50μL)加え、さらに37℃にて1時間インキュベートした。各試料をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。複合体から放出されたEPOを含むフリーEPO濃度(算出にはEPO標準試料から作成した検量線を用いた)をEPOピーク面積から算出し、回収率(%;フリーEPO重量/当初EPO重量×100)を以下に示す表6に記載した。代表的なクロマトグラムを図12下段に示す。
カラム:G4000SWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:10mM HP−β−CD/PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:UV(280nm)
(実施例7−1)生理塩濃度下中での挙動
実施例2−3−1で得られたHA誘導体を6mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。最終緩衝液組成が10mM PB(pH7.4)、150mM NaClとなるように濃縮緩衝液を加え、HA誘導体濃度を4.5mg/mLとした。37℃にて20分間インキュベート後、2000Gにて1分間遠心分離し、上澄みをHP−β−CD/PBS溶液(250mM)にて二倍希釈し、2時間インキュベート後、SECに供した。検出されたHA誘導体のピーク面積から当初使用量に対するHA誘導体の溶液中の残存率を算出した。HA誘導体の疎水性基導入率に対して残存率をプロットしたものを図13に示す。
カラム:QC−PAK−GFC200(東ソー株式会社製)
溶離液:10mM HP−β−CD/PBS(pH7.4)
流速:1.2mL/分
注入量:20μL
検出:示差屈折率
(実施例7−2)HA誘導体の分散性におけるNaCl濃度の影響
実施例2−3−1で得られたHA誘導体を6mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。最終緩衝液組成が10mM PB、0mM NaClならびに10mM PB,50mM NaClとなるように濃縮緩衝液を加え、HA誘導体濃度を4.5mg/mLとした。37℃にて20分間インキュベート後、2000Gにて1分間遠心し、上澄みをHP−β−CD/PBS溶液(250mM)にて二倍希釈し、2時間インキュベート後、SECに供した。検出されたHA誘導体のピーク面積から当初使用量に対するHA誘導体の溶液中の残存率を算出した。塩濃度に対して残存率を各HA誘導体についてプロットしたものを図14に示す。なお、SECの測定条件は実施例7−1と同じである。
表7に示した、実施例2−3−1で得られたHA誘導体を、4mg/mL濃度で蒸留水(超純水)に溶解した。エリスロポエチン水溶液(1mg/mL、25μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(50μL)を加え、さらにHA誘導体(4mg/mL、25μL)を加えた。37℃にて2時間インキュベート後、2000Gにて遠心分離し、上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、上澄みに存在するHA誘導体・EPO複合体のピーク面積、および複合体に取り込まれなかったフリーのEPOのピーク面積を求めた。さらに、本実験で添加したEPO単独のピーク面積およびHA誘導体単独のピーク面積を求めるために、別途溶液を調製しサイズ排除クロマトグラフィーに付した。添加したEPO単独のピーク面積およびHA誘導体単独のピーク面積の和に対する、上澄みに存在するHA誘導体・EPO複合体のピーク面積およびフリーのEPOのピーク面積の和の割合を残存率として算出した(表7)。なお、この実験系においては、EPOは、フリーの状態では、遠心後でも、全て上澄み中に存在し、沈殿することはない。
カラム:QC−PAK−GFC300(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1.2mL/分
注入量:20μL
検出:UV(215nm)
(実施例9−1)コレステリル 8−アミノ−3,6−ジオキサオクチルカーバメート塩酸塩の調製
コレステリルクロロホルメート(1.7g、4.7mmol)の無水ジクロロメタン(50mL)の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン(TEA、0.53mL)を加えて撹拌した。氷冷下で、8−(t−ブトキシカルボニル)アミノ−3,6−ジオキサオクチルアミン(0.59mL、2.5mmol)を滴下して加え、そのまま氷冷下で30分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:酢酸エチル:n−ヘキサン=1:1)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
(実施例9−2)コレステリル 8−アミノ−3,6−ジオキサオクチルカーバメートにより修飾したHA誘導体の調製
Chol−C6塩酸塩の代わりに実施例9−1で調製したChol−EO2塩酸塩を用い、以下の表8に示す比率でChol−EO2塩酸塩ならびにDMT−MMを添加したこと以外は実施例2−3−1と同様の方法で行い、HA−EO2−Cholを固体として得た。実施例2−3−1記載と同じ条件で測定した生成物(導入率7%)の1H−NMRスペクトルを図17に示す。また、実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表8に示す。
分子量10kDaのHA−Na(資生堂社製)を原料とし、実施例2−2と同様の方法で調製したHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、2−アミノエチル 2−ピリジル ジスルフィド塩酸塩(Py−SS−AM、トロント社製)をHA−TBAユニットに対して以下の表9に示す比率で各溶液に添加した。次に、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(DMT−MM)をHA−TBAユニットに対して以下の表9に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらに、チオコレステロール(Chol−SH、シグマアルドリッチ社製)を以下の表9に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液に0.3Mとなるように硝酸ナトリウムを加え、イソプロピルアルコール(IPA)を加えて生じた沈殿を回収し、IPA洗浄後、減圧乾燥し、目的物(HA−SS−Chol)を白色固体として得た。実施例2−3−1に記載と同じ条件で測定した1H−NMRスペクトルを図18に示す。また、実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表9に示す。
実施例2−2で調製した、HA−Na(50kDa)を出発原料とするHA−TBAを10mg/mLで無水DMSOに溶解した。その後、実施例1−2で調製したChol−C2塩酸塩をHA−TBAユニットに対して以下の表10に示す比率で各溶液に添加した。次に、DMT−MMをHA−TBAユニットに対して以下の表10に示す比率で加え、室温で4時間撹拌した。さらにアミノエチル メタクリレート(AEMA、ポリサイエンス社製)塩酸塩、DMT−MMを以下の表10に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、HA−C2−Chol/AEMAを白色固体として得た。実施例2−3−1に記載と同じ条件で測定した1H−NMRスペクトルを図19に示し、実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表10に示す。また、5.6ppmと6.0ppmにおけるメタクリロイル基由来のシグナルの平均値から下式により算出したHAユニットに対するメタクリル基の導入率を表10に示す。
以下の方法により、本発明のHA誘導体に低分子化合物を導入し、蛍光標識化HA誘導体を得た。実施例2−2で調製した、HA−Na(50kDa)を出発原料とするHA−TBAを10mg/mLで無水DMSOに溶解した。その後、実施例1−1で調製したChol−C6塩酸塩をHA−TBAユニットに対して以下の表11に示す比率で各溶液に添加した。次に、DMT−MMをHA−TBAユニットに対して以下の表11に示す比率で加え、室温で4時間撹拌した。さらに5−アミノメチルフルオレセイン(FL、インビトロジェン社製)塩酸塩、DMT−MMを以下の表11に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、目的物(HA−C6−Chol/FL)を黄色固体として得た。実施例2−3−1に記載と同じ条件で測定した1H−NMRスペクトルから実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表11に示す。また、フルオレセインの導入率は494nmにおけるモル吸光係数80000M−1cm−1から算出した。なお、FLによる標識は、FLのアミノ基とHA−TBAのカルボキシ基とのアミド結合形成により行われた。
分子量10kDaのHA−Naを原料とし、実施例2−2と同様の方法で調製したHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、実施例1−1で調製したChol−C6塩酸塩をHA−TBAユニットに対して以下の表12に示す比率で各溶液に添加した。次に、DMT−MMをHA−TBAユニットに対して以下の表12に示す比率で加え、室温で2時間撹拌した。さらに5−アミノメチルフルオレセイン(FL)塩酸塩、DMT−MMを以下の表12に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらにエタノールアミン(HO−C2)塩酸塩もしくはプロパノールアミン(HO−C3)塩酸塩、DMT−MMを以下の表12に示す比率で加え、室温で5時間撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、HA−C6−Chol/C2−OH/FLもしくはHA−C6−Chol/C3−OH/FLを黄色固体として得た。測定溶媒としてDMSO−d6を用いた1H−NMRスペクトル(JNM−ECA500 日本電子株式会社製)を図20(HA−C6−Chol/C2−OH/FL)に示す。実施例2−3−1に記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率ならびに、グルコサミンのアミド基由来NHCOとChol−C6、HO−C2もしくはHO−C3、FLのアミド基由来(NH)からChol−C6、HO−C2もしくはHO−C3、FLの総導入率を算出した。これを表12に示す。
実施例2−3−1と同じ条件にて、各種分子量のHA−TBAを用い、各種コレステリルカーバメートにより修飾したHA誘導体を調製した。コレステリル基を導入したHA誘導体の試薬使用量と合成結果を表13に示す。原料のヒアルロン酸は、すべて資生堂社製のものを用いた。
実施例12と同じ条件にて各分子量のHA−TBAを用い、各種コレステリルカーバメートと5−アミノメチルフルオレセイン(FL)により修飾したHA誘導体を調製した。FLの使用量も実施例12と同様とした。原料のヒアルロン酸は、5kDaのみR&Dシステム社製を用い、それ以外は資生堂社製のものを用いた。
実施例12の5−アミノメチルフルオレセイン(FL)塩酸塩の代わりにHilyte FluorTM750 amine(Hilyte)TFA塩を用いた以外は同様の条件にて操作を行い、標題のHA誘導体(HA−C6−Chol/Hilyte)を調製した。添加したモル比は表15に示す。また、Hilyte FluorTM750 amine TFA塩添加後に実施例13と同様にエタノールアミン塩酸塩を反応させ、HA−C6−Chol/C2−OH/Hilyteを調製した。添加したモル比は表15に示す。導入率は実施例12ならびに実施例13と同様の方法にて算出した。なお、Hilyte FluorTM750 amineによる標識は、Hilyte FluorTM750 amineのアミノ基がHA−TBAのカルボキシ基とアミド結合を形成することにより行われた。
実施例12ならびに実施例15で合成したHA誘導体のPBS溶液(0.25mg/mL)を調製し、粒子サイズを動的光散乱法(DLS)にて測定した。測定装置にはゼータサイザーナノZS(Malvern社製)を用いた。z平均粒子サイズを表16に示す。また、50k HA−C6−Chol−22%/FLの サイズ分布を図21に示す。
(実施例18−1)リゾチーム
実施例5と同様にして、リゾチーム(Lys:Lysozyme from chicken egg white、シグマ社製)を、表17に示すHA誘導体およびCHPと複合化させた。Lys水溶液(4mg/mL、25μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(50μL)を加え、さらにHA誘導体またはCHP(4mg/mL、25μL)を加えた。37℃にて24時間インキュベート後、6000Gにて遠心分離し、フリーLysの全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーLysの量を求め、複合体に含まれるLysの量を算出した。さらに、HA誘導体およびCHPの単位重量当たりの複合体に含まれるLysの量(複合化%;(複合体中のLys重量/HA誘導体重量)×100)を求めた。結果を以下の表17に示し、グラフを図22−1に示す。
カラム:G3000PWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:2×PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:UV(280nm)。
(実施例18−2)エキセンディン−4
実施例5と同様にしてエキセンディン−4(Ex−4、アメリカンペプタイド社製)と表18に示すHA誘導体およびCHPを複合化させた。Ex−4水溶液(3.31mg/mL、30.2μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(44.8μL)を加え、さらにHA誘導体またはCHP(4mg/mL、25μL)を加えた。37℃にて24時間インキュベート後、6000Gにて遠心分離し、フリーEx−4の全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーEx−4の量を求め、複合体に含まれるEx−4の量を算出した。さらに、HA誘導体およびCHPの単位重量当たりの複合体に含まれるEx−4の量(複合化%;(複合体中のEx−4重量/HA誘導体重量)×100)を求めた。結果を以下の表18に示し、グラフを図22−2に示す。
カラム:QC−PAK−GFC200(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1.2mL/分
注入量:50μL
検出:UV(280nm)。
(実施例18−3)ヒト成長ホルモン
実施例5と同様にしてヒト成長ホルモン(hGH:ジェノトロピン(登録商標)注射用)と表19に示すHA誘導体およびCHPを複合化させた。hGHはジェノトロピン(登録商標)を透析によりリン酸緩衝液(10mM、pH7.4)に溶媒置換したものを用いた。hGH水溶液(3.5mg/mL、14.3μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(60.4μL)を加え、さらにHA誘導体またはCHP(4mg/mL、25μL)を加えた。37℃にて24時間インキュベート後、6000Gにて遠心分離し、フリーhGHの全て、および分散性複合体が存在する上澄みをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの結果から複合体中に取り込まれずに水溶液中に残存するフリーhGHの量を求め、複合体に含まれるhGHの量を算出した。さらに、HA誘導体の単位重量当たりの複合体に含まれるhGHの量(複合化%;(複合体中のEx−4重量/HA誘導体重量)×100)を求めた。結果を以下の表19に示し、グラフを図22−3に示す。
カラム:QC−PAK−GFC300(東ソー株式会社製)
溶離液:PBS(pH7.4)
流速:1.2mL/分
注入量:30μL
検出:UV(280nm)。
(実施例18−4)HA修飾物のEPO複合化量2
実施例5と同様の方法にて表20に示すHA誘導体のEPO複合化を行い、複合化%を算出した。グラフを図22−4に示す。
(実施例19−1)Alexa−EPOの調製
炭酸緩衝液(0.3M、pH9.0)に緩衝液置換したEPO水溶液にAlexa Fluor(登録商標)488 5−TFP(インビトロジェン社製)を1mg滴下し、室温にて1時間攪拌した。PD−10カラムによるゲルろ過精製の後、リン酸緩衝液(10mM、pH7.4)にて透析精製(7000MWCO透析膜)を行い、Alexa Fluor(登録商標)488で蛍光標識されたEPO(Alexa−EPO)溶液を得た。なお、Alexa Fluor(登録商標)488による標識は、Alexa Fluor(登録商標)488のカルボキシ基とEPOのアミノ基がアミド結合することで達成されている。
(実施例19−2)HA誘導体のAlexa−EPO徐放効果
実施例19−1で得られたAlexa−EPO溶液(3.34mg/mL、10μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(90μL)を加え、さらにHA誘導体(6mg/mL、100μL)を加えた。HA誘導体にはHA−C6−Chol−7%、HA−C6−Chol−15%およびHA−C12−Chol−7%を用いた(原料として用いたHA−Naの分子量は、いずれも50kDaである)。37℃にて24時間インキュベートし、そのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品全量に対して20mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA:シグマ社製)/PBS溶液(200μL)を加え、経時的に遠心後、上澄み(100μL)を採り、フレッシュなBSA/PBS溶液(100μL)を加えた。上澄みをHP−β−CD水溶液(100mM)にて二倍希釈し、37℃にて1時間インキュベート後、SECに供し、Alexa−EPOの濃度を算出し、Alexa−EPOのリリース量を計算した。結果を図23−1に示す。
カラム:G3000SWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:10mM HP−β−CD/PBS(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:50μL
検出:蛍光検出494/525
いずれのHA誘導体においても徐放効果があることが示され、さらにコレステリル基の導入率は7%よりも15%、スペーサーはC6よりもC12の方が徐放効果があることが明らかとなった。
(実施例19−3)リリース溶液のBSA濃度の影響
実施例19−1で得られたAlexa−EPO溶液(3.34mg/mL、10μL)に対して最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(133.3μL)を加え、さらにHA−C12−Chol−7%(6mg/mL、16.7μL)を加えた(原料として用いたHA−Naの分子量は、50kDaである)。37℃にて24時間インキュベートし、そのまま凍結乾燥した。凍結乾燥品全量に対して20mg/mL、10mg/mL、0mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA:シグマ社製)/PBS溶液(200μL)を加え、経時的に遠心後、上澄み100μLを採り、フレッシュなBSA/PBS溶液(100μL)を加えた。上澄みをHP−β−CD水溶液(100mM)にて二倍希釈し、37℃にて1時間インキュベート後、SECに供し、Alexa−EPOの濃度を算出し、Alexa−EPOのリリース量を計算した。結果を図23−2に示す。SEC条件は実施例19−2と同じである。
〔比較例1〕hGHのラットにおける薬物動態試験
表21に示した用量で、hGH溶液を25G針を用いて正常ラット(SD、6週齢、オス)の皮下ならびに尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行い、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンを加えた。得られた血液は血漿分離し、hGH濃度をELISAキット(ロシュアプライドサイエンス社製)にて測定した。皮下ならびに尾静脈投与時のhGHの血漿中濃度推移を図24に示した。また、薬物動態パラメーター(血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値(AUC∞)および平均滞留時間(MRT))をWinNonlin Ver.5.0.1(Pharsight社製)によって解析し、その値を表21に示した。
(実施例20−1)hGHとHA誘導体との複合体の沈殿凍結乾燥品の調製
実施例2−3−1および実施例14で得られたHA誘導体(6mg/mL、3.375mL)にhGH(4.31mg/mL、0.940mL)を加え、37℃にて1時間インキュベートした。さらに最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(0.185mL)を加え、室温にて1時間インキュベートした。沈殿が確認された。30分間遠心後、上澄み(2.25mL)を取り除き、スクロース水溶液(150mg/mL、1.125mL)を加え、よく分散した後に凍結乾燥した。上澄みに含まれるフリーのhGH量をSECから算出し、複合化%を算出した。また、凍結乾燥品を一定量採り、そこに含まれるhGH量から回収率を算出した。結果を表22に示す。
(実施例20−2)hGH/HA誘導体複合体(沈殿品)の調製
HA−C6−Chol−14%(6mg/mL、0.583mL;原料として用いたHA−Naの分子量は50kDa)にhGH(4.84mg/mL、0.145mL)を加え、37℃にて1時間インキュベートした。さらに最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS(0.147mL)を加え、室温にて1時間インキュベートした。沈殿が確認された。4℃にて保存した。
(実施例20−3)hGH/HA誘導体複合体(溶液)の調製
HA−C6−Chol−14%(6mg/mL、0.583mL;原料として用いたHA−Naの分子量は50kDa)にhGH(4.84mg/mL、0.145mL)ならびに最終濃度が82mg/mLとなるようにスクロース水溶液(0.147mL)を加え、37℃にて1時間インキュベートした。沈殿は確認されなかった。4℃にて保存した。
(実施例20−4)hGH/HA誘導体複合体のラット皮下投与での徐放試験
実施例20−1〜20−3で調製したhGH/HA誘導体複合体を表23−1に示す容量で25G針を用いて正常ラット(SD、6週齢、オス)の皮下に投与した。実施例20−1で調製した凍結乾燥品は、投与直前にPBSに懸濁させて投与した。投与前の製剤を図25に示す。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行い、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンを加えた。得られた血液は血漿分離し、hGH濃度をELISAキット(ロシュアプライドサイエンス社製)にて測定した。各種hGH/HA誘導体複合体投与時のhGHの血漿中濃度推移−および比較例1のhGH溶液の血漿中濃度推移を併せて図26−1〜27−2に示した。また、薬物動態パラメーター(血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値(AUC∞)および平均滞留時間(MRT))をWinNonlin Ver.5.0.1(Pharsight社製)によって解析し、その値を表23−2に示した。またMRTのグラフを図28に示す。
〔比較例2〕5−アミノメチルフルオレセインにより修飾したHA誘導体(HA−FL)、および5−アミノメチルフルオレセインとエタノールアミンにより修飾したHA誘導体(HA−C2−OH/FL)の薬物動態試験
(比較例2−1)10kDaおよび50kDaのHA−Naを用いたHA−FLの調製
分子量10kDaのHA−Naおよび分子量50kDaのHA−Naを原料とし、実施例2−2と同様の方法で調製したHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、5−アミノメチルフルオレセイン(FL)塩酸塩、DMT−MMをHA−TBAユニットに対してそれぞれ4.4%、4.0%の比率(モル%)で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、目的物(10k HA−FLおよび50k HA−FL)を、それぞれ黄色固体として得た。
(比較例2−2)10kDaのHA−Naを用いたHA−C2−OH/FLの調製(その1)
分子量10kのHA−Naを原料とし、実施例2−2と同様の方法で調製したHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、エタノールアミン(HO−C2)塩酸塩、DMT−MMを以下の表24に示す比率で加え、室温で4時間撹拌した。さらに、5−アミノメチルフルオレセイン(FL)塩酸塩、DMT−MMを以下の表24に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、目的物(10k HA−C2−OH/FL)を黄色固体として得た。測定溶媒としてDMSO−d6を用いた1H−NMRスペクトル(JNM−ECA500 日本電子株式会社製)から実施例13に記載の式にて算出したグルコサミンのアミド基由来NHCOと、C2−OH、FLのアミド基由来NHCOからC2−OH、FLの総導入率を算出した。これを表24に示す。
分子量10kのHA−Naを原料とし、実施例2−2と同様の方法で調製したHA−TBAの、無水DMSO溶液(10mg/mL)を調製した。その後、5−アミノメチルフルオレセイン(FL)塩酸塩、DMT−MMを以下の表25に示す比率で加え、室温で一晩撹拌した。さらにエタノールアミン(C2−OH)塩酸塩、DMT−MMを以下の表25に示す比率で加え、室温で5時間撹拌した。以降は実施例2−3−1と同様の方法によって処理し、目的の10k HA−C2−OH/FLを黄色固体として得た。比較例2−2と同様の方法にてC2−OH、FLの総導入率を算出した。これを表25に示す。
表26に示した用量で、比較例2−1〜2−3で調製した蛍光標識HA誘導体を、25G針を用いて正常ラット(SD、6週齢、オス)の尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、HP−β−CD(100mM)/トリス緩衝液(500mM、pH9.0)溶液にて2倍希釈し、37℃にて1時間インキュベート後、96穴プレートリーダー(ARVO)にて蛍光標識HA誘導体濃度を測定した。蛍光標識HA誘導体の血漿中濃度推移を図29に示した。また、薬物動態パラメーター(血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値(AUC∞))をWinNonlin Ver.5.0.1(Pharsight社製)によって解析し、その値を表26に示した。
(実施例21−1)血漿中濃度推移におけるHA分子量の影響
表27に示した用量で、実施例12ならびに実施例15で調製した蛍光標識HA誘導体を25G針を用いて正常ラット(SD、6週齢、オス)の尾静脈に投与した。投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行った。得られた血液は血漿分離し、HP−β−CD(100mM)/トリス緩衝液(500mM、pH9.0)溶液にて2倍希釈し、37℃にて1時間インキュベート後、96穴プレートリーダー(ARVO)にて蛍光標識HA誘導体濃度を測定した。蛍光標識HA誘導体の血漿中濃度推移を図30−1に示した。また、薬物動態パラメーター(血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値(AUC∞))をWinNonlin Ver.5.0.1(Pharsight社製)によって解析し、その値を表28に示した。表28のAUC∞を原料のHA−Naの分子量に対してプロットしたグラフを図30−2に示す。
(実施例21−2)血漿中濃度推移におけるリンカーの影響
表29に示す実施例15で調製したリンカーの異なる蛍光標識HA誘導体を実施例21−1と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図31に示した。また、実施例21−1と同様の方法にて薬物動態パラメーター(AUC∞)を算出し、その値を表30に示した。
(実施例21−3)血漿中濃度推移におけるChol導入率の影響
表31に示す実施例12および実施例15で調製したChol導入率の異なる蛍光標識HA誘導体を実施例21−1と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図32−1、図32−2に示した。また、実施例21−1と同様の方法にて薬物動態パラメーター(AUC∞)を算出し、その値を表32に示した。
(実施例21−4)血漿中濃度推移(HA−Chol/C2−OH/FL)
表33に示す実施例13で調製したC2−OHとCholにて高度に修飾した蛍光標識HA誘導体を実施例21−1と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図33に示した。また、実施例21−1と同様の方法にて薬物動態パラメーター(AUC∞)を算出し、その値を表34に示した。
(実施例21−5)皮下投与後のHA誘導体の血漿中濃度推移
表35に示す蛍光標識HA誘導体を皮下から投与したことを除くと実施例21−1と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図34−1、34−2に示した。また、実施例21−1と同様の方法にて薬物動態パラメーター(AUC∞)を算出し、その値を表36に示した。
(実施例21−6)ヒアルロン酸先行投与による血漿中濃度推移の影響
投与する20分前に30mgのヒアルロン酸ナトリウム(1000k、300k、100k、50k、10kをそれぞれ6mg含む混合物)を尾静脈から投与した後に、表34に示す蛍光標識HA誘導体を尾静脈から投与したことを除くと実施例21−1と同様の方法で薬物動態試験を行い、血漿中濃度推移を図35−1および図35−2に示した。また、実施例21−1と同様の方法にて薬物動態パラメーター(AUC∞、MRT)を算出し、その値を表38に示した。
カラム:G5000PWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:HP−β−CD(10mM)/トリス緩衝液(500mM、pH9.0) 流速:0.5mL/分
注入量:50μL
検出:蛍光494/515
血漿サンプルのピークが投与前サンプルのピーク位置と同じであることから、プレートリーダーで検出された蛍光はHA−Chol−FLの分解物に由来するものではないことが示唆された。
(実施例21−8)尿サンプルのSEC分析
実施例21−1ならびに比較例2−4のラット薬物動態試験と同時に尿サンプルも採取した。尿サンプル50μLに対し、HP−β−CD(100mM)/トリス緩衝液(500mM、pH9.0)溶液(50μL)を加え、37℃にて1時間インキュベート後、SEC分析を行った。クロマトグラムを図37−1〜37−5に示す。
カラム:G5000PWXL(東ソー株式会社製)
溶離液:HP−β−CD(10mM)/トリス緩衝液(500mM、pH9.0)溶液
流速:0.5mL/分
注入量:50μL
検出:蛍光494/515
尿サンプルのピークが投与前サンプルのピーク位置より後ろで溶出していることから、HA−Chol−FLは何らかの経路によって、分解されていることが示唆された。よってHA−Chol−FLは生分解性かつ血中滞留性の良い粒子を形成することが示された。生分解性であることは安全性の観点から非常に有用である。
実施例2−3−2〜2−3−4で得られたHA誘導体を用いたほかは実施例7と同じ方法によって残存率を算出した。HA誘導体の疎水性基導入率に対して残存率をプロットしたものを図38に示す。
実施例14で調製した10k HA−C6−Chol−15%、ならびに実施例2−3−1で調製した50k HA−C6−Chol−15%の水溶液(6mg/mL、100μL)に対し、ドキソルビシン(DOX)水溶液(10mg/mL、4μL、和光純薬製)を加え、最終濃度が1×PBSとなるように濃縮PBS溶液を96μL加えた。DOX水溶液の代わりに超純水を加えたものをコントロールとした。室温にて1時間インキュベート後、限外ろ過器(マイクロコン、分画分子量10,000)にて遠心ろ過し、ろ液をHPLC(逆相、RP)に供した。HA誘導体と複合化していないフリーのDOXが検出される。クロマトグラムを図39に示す。
カラム:cadenza CD−C18(インタクト社製)
溶離液A:超純水、0.1% TFA
溶離液B:アセトニトリル、0.1% TFA
グラジエント:B5%→B95%(8分)
流速:0.75mL/分
注入量:10μL
検出:UV480
本発明のHA誘導体をドキソルビシンと混合することによって、複合体を形成することが明らかとなった。
ヌードマウス(BALB−nu/nu、メス、7週齢)にヒト乳癌由来MDA−MB−213細胞切片(2mm×2mm×2mm)を皮下移植し、ゼノグラフトマウスを作成した。17日後、腫瘍サイズ、体重にて群分けし(解析ソフト:ANTES、体重18.8〜24.3g、腫瘍サイズ215mm3〜360mm3)、実施例16で調製したHilyte標識HA誘導体および50k HA−Hilyte(FL塩酸塩の代わりにHilyte TFA塩を用いた以外は比較例2−1と同様の方法で調製)を表39に示す容量で尾静脈投与した。In vivo イメージング装置(NightOWL983、ベルトールド社製)を用いて、6時間後にゼノグラフトマウスを撮影した(700/780nm、0.5msec)。また24時間後に腫瘍を取り出し、同様にIn vivo imaging装置で撮影した。撮影したデータはすべて解析ソフト(Indigo)にて解析した。6時間後のIn vivo イメージング図を図40に示す。また、腫瘍から得られた光量をグラフ化したものを図41に示す。
実施例11で調製した(50k)HA−C2−Chol−8%/AEMA−27%を超純水にて溶解し(40mg/mL、100μL)、トリエタノールアミン(TEA、1.3μL)を加えて混合後、ジチオトレイトール(DTT、100mg/mL、2.0μL)を加え、500μLチューブにて37℃でインキュベートした。24時間後、チューブから取り出したところ、ゲル化していることが確認された。これを図42に示す。
実施例2−2で調製した、HA−Na(50kDa)を出発原料とするHA−TBA 68.26mgを無水DMSOに溶解した。そこに脱水ピリジンに溶解させたコレステリル N−(6−イソシアネートヘキシル)カーバメート(CHI、4.15mg)を滴下し、窒素下、80℃にて9.5時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチルにて再沈殿後、遠心分離にて回収した。得られた白色固体を再度DMSOに溶解し、0.3M NaCl溶液、蒸留水、10mM HCl溶液、蒸留水に対して透析し(Slide−A−Lyzer、分画分子量3500Da、PIERCE社製)、得られた透析液を凍結乾燥し、50k HA−O−C6−Cholを得た。測定溶媒としてDMSO−d6を用いた1H−NMRスペクトル(500MHz Bruker社製)から実施例2−3−1記載の式にて算出したHAユニットに対するコレステリル基の導入率を表40に示す。
実施例26で調製した50k HA−O−C6−Chol−1%および99k HA−O−C6−Chol−2%を用い、溶媒として超純水に溶解した他は実施例17と同様の方法にてDLS測定を行った。z平均粒子サイズを表41に示す。
Claims (18)
- 疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体であって、式(I):
Zは、直接結合、または2〜30個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し;
X1は、以下の式:
−NRb−R、
−NRb−COO−R、
−NRb−CO−R、
−NRb−CO−NRc−R、
−COO−R、
−O−COO−R、
−S−R、
−CO−Ya−S−R、
−O−CO−Yb−S−R、
−NRb−CO−Yb−S−R、および
−S−S−R、
により表される基から選択される疎水性基であり;
Ra、RbおよびRcは、それぞれ独立に、水素原子、C1−20アルキル、アミノC2−20アルキルおよびヒドロキシC2−20アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−O−および−NRf−から選択される1〜3個の基が挿入されていてもよく;
Rfは、水素原子、C1−12アルキル、アミノC2−12アルキルおよびヒドロキシC2−12アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−O−および−NH−から選択される1〜2個の基が挿入されていてもよく;
Rは、コレステリル基であり;
Yは、C2−30アルキレン、または−(CH2CH2O)m−CH2CH2−であり、ここで、当該アルキレンは、−O−、−NRg−および−S−S−から選択される1〜5の基が挿入されていてもよく;
Rgは、水素原子、C1−20アルキル、アミノC2−20アルキルまたはヒドロキシC2−20アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−O−および−NH−から選択される1〜3個の基が挿入されていてもよく;
Yaは、C1−5アルキレンであり;
Ybは、C2−8アルキレンまたはC2−8アルケニレンであり;
mは、1〜100から選択される整数である]
で表される繰り返し単位を1以上含む、前記ヒアルロン酸誘導体。 - 式(II):
Xaは、ヒドロキシおよび−O−Q+、から選択され;ここで、Q+は、カウンターカチオンである]
で表される繰り返し単位さらに含む、請求項1に記載のヒアルロン酸誘導体。 - 存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が7〜42%である、請求項1または2に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が7〜15%、または18〜42%である、請求項3に記載のヒアルロン酸誘導体。
- Yが、−(CH2)2−、−(CH2)6−、−(CH2)8−、および−(CH2)12−から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 重量平均分子量が27kDa以下である、請求項2の式(II)で表される繰り返し単位から実質的になるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として製造することを特徴とする、請求項1〜5に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 存在する二糖の繰り返し単位に対する前記疎水性基の導入率が2〜50%である、請求項6に記載のヒアルロン酸誘導体。
- Yが、−(CH2)n1−または−(CH2CH2O)m1−CH2CH2−であり、ここでn1は2〜15の整数であり、m1は1〜4の整数である、請求項6または7に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 式(III):
Xbは、−NRe−Yb−Rdを表し; Reは、水素原子またはC1−6アルキルであり;
Rdは、水素原子、C1−6アルキルまたは基−CO−C(R7)=CH2であり;
Ybは、−CH2−(CHR5)l−2−CH2−NH−、−CH2−(CHR6)p−2−CH2−O−、−(CH2)j−S−、−CH2−CH2−(Y3−CH2−CH2)z−S−、−CH2−CH2−(Y4−CH2−CH2)t−NH−または−CH2−CH2−(Y5−CH2−CH2)y−O−であり、
l、p、およびjは、それぞれ独立に2〜10から選択される整数であり、z、tおよびyは、それぞれ独立に1〜200から選択される整数であり、R5およびR6はそれぞれ独立に水素原子またはヒドロキシであり、R7は、水素原子またはメチルであり、Y3、Y4およびY5は、それぞれ独立して、−O−または−NH−である]
で表される繰り返し単位をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体。 - Xbが、−NRi−(CH2)n2−OHであり、ここで、RIは、水素原子であり、n2は2〜10から選択される整数である、請求項9に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 存在する二糖の繰り返し単位に対する式(II)で表される繰り返し単位の割合が50%以下である、請求項9または10に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 式(IV):
Xcは、ヒドロキシおよび−O−Q+、から選択され;ここで、Q+は、カウンターカチオンであり;
R1cは、
−CO−C(R21)=CH2、
−CH2CH(OH)−R22−Y1、
−CH(CH2OH)−R22−Y1、
−CONH−R23−Y1、
−CO−R23−Y1、
−CONH−CH2CH2−(X21−CH2CH2)n3−Y1、および
−CO−CH2CH2−(X21−CH2CH2)n4−Y1から選択され、
X21は、OおよびSから選択され:
n3およびn4は、それぞれ1〜50の整数を表し;
Y1は、アミノ、メルカプト、ホルミル、−X14−CO−C(R18)=CH2から選択され、
R21は、水素原子またはC1−6アルキルから選択され;
R22およびR23は、2価のC2−50炭化水素基または2価のC2−50ポリアルキレンオキシ基であり、前記2価のC2−50炭化水素基は、1〜10個の−O−が挿入されて一部にポリアルキレンオキシ部分が形成されていてもよく;
X14は、OおよびN(R19)から選択され;
R18は水素原子またはC1−6アルキルであり;
R19は水素原子またはC1−6アルキルである]
で表される繰り返し単位をさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体。 - 式(I)で表される1以上の繰り返し単位;および式(II)、式(III)または式(IV)で表される1以上の繰り返し単位から実質的になる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 水中で会合により微粒子を形成する、請求項1〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体を担体として含む医薬組成物。
- 薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のヒアルロン酸誘導体に、1以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体。
- 薬物が、薬理活性を有するタンパク質またはペプチドである、請求項15または16に記載の医薬組成物。
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