BR112021012784A2

BR112021012784A2 - Formulação de vacina contra o câncer

Info

Publication number: BR112021012784A2
Application number: BR112021012784-4A
Authority: BR
Inventors: Hiroshi Shiku; Kazunari Akiyoshi; Tai Hirakura; Tsuyoshi Shimoboji; Takashi Nakai; Sayan Chuanoi; Hideyuki Togawa
Original assignee: Mie University; Kyoto University; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-09-21
Also published as: EP3919072A1; US20220160849A1; WO2020158771A1; EP3919072A4; JPWO2020158771A1; CN113329764A

Abstract

formulação de vacina contra o câncer. a presente invenção refere-se a uma preparação de vacina para uso na prevenção e/ou tratamento de câncer, a preparação contendo um complexo de um antígeno e um derivado de ácido hialurônico, no qual um grupo hidrofóbico foi introduzido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “FOR- MULAÇÃO DE VACINA CONTRA O CÂNCER”.

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a uma formulação de vacina para uso na prevenção e/ou tratamento de um câncer, compreenden- do um complex de um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido, e um antígeno.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Uma formulação de vacina para uso na prevenção e/ou tra- tamento de um câncer foi reportada que compreende um polissacarí- deo hidrofobizado tal como pululan transportando colesterol (CHP) ou manan transportando colesterol (CMP), e um antígeno (Literatura de Patente 1). Além disso, uma formulação de vacina para tratamento de câncer foi reportada que compreende um complexo de um polissacarí- deo hidrofobizado tal como CHP, e um antígeno de peptídeo de cadeia longa sintetizado tendo uma pluralidade de epítopos de reconhecimen- to de célula T, e um agente de imunopotenciação (Literaturas de Pa- tente 2 e 3).

[003] Estas formulações de vacina são com base nos princípios de que antígenos fagocitizados por células apresentando antígeno são clivados em peptídeos de vários tamanhos por proteassoma intracelu- lar, protease, ou peptidase e carregados como peptídeos de epítopo antigenic sobre maiores moléculas de classe I de complexo de histo- comptibilidade (MHC) ou moléculas de classe II de MHC sobre a su- perfície celular para formar complexos, que são por sua vez especifi- camente reconhecidos por células T citotóxicas (CTL, CD8+) ou células T auxiliares (CD4+) de modo que estas células sejam ativadas (Litera- tura de Não Patente 1).

[004] Entretanto, foi reportado que um derivado de ácido hialurô- nico obtido introduzindo um grupo tendo um grupo colesterila como um grupo hidrofóbico ao ácido hialurônico forma finas partículas por asso- ciação em água e forma um complex com um fármaco (Literatura de Patente 4). Foi também reportado que um derivado de ácido hialurôni- co obtido por conversão de um grupo carboxila da porção de ácido glucurônico de ácido hialurônico em um grupo amida através da rea- ção com um aminoácido particular, e também introduzindo um grupo esterila que é um grupo hidrofóbico aos grupos carboxila restante tem ambas as características de biodegradabilidade e retenção em san- gue, e um complex do derivado de ácido hialurônico e um fármaco tem características favoráveis como uma composição farmacêutica (Litera- tura de Patente 5).

LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA DE PATENTE

[005] [Literatura de Patente 1] Publicação Internacional No. WO 1998/009650 [Literatura de Patente 2] Publicação Internacional No. WO 2013/031882 [Literatura de Patente 3] Publicação Internacional No. WO 2015/050158 [Literatura de Patente 4] Publicação Internacional No. WO 2010/053140 [Literatura de Patente 5] Publicação Internacional No. WO 2014/038641

LITERATURA DE NÃO PATENTE

[006] [Literatura de Não Patente 1] ACS Nano Vol. 8, p. 9209-9218, 2014

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[007] Há uma demanda por uma formulação de vacina que tem uma maior função do que aquelas das formulações de vacina já rela-

tadas contendo CHP. Particularmente, é desejável desenvolver uma formulação de vacina contra o câncer tendo características de células T citotóxicas (CTL) específicas para o antígeno marcadamente induto- ras ou um efeito antitumoral elevado.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[008] O presente inventor conduziu estudos diligentes para solu- cionar estes problemas e, consequentemente, completou a presente invenção ao descobrir que uma formulação de vacina compreendendo um complexo de um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hi- drofóbico introduzido, e um antígeno, induz CTL acentuadamente es- pecífico do antígeno e tem atividade antitumoral elevada.

[009] Especificamente, a presente invenção refere-se a um com- plexo que é formado pelo fechamento de um antígeno por meio de as- sociação espontânea em uma solução aquosa, melhora o acúmulo do antígeno no linfonodo e induz acentuadamente CTL específico do an- tígeno, um complexo com alto nível de atividade antitumoral, uma for- mulação de vacina compreendendo o complexo e métodos de produ- ção para o mesmo. A presente invenção também se refere a um com- plexo que é formado fechando um antígeno através de uma melhor dispersão em água, melhora o acúmulo do antígeno no linfonodo e in- duz acentuadamente CTL específico do antígeno, uma formulação de vacina que compreende o complexo e métodos de produção para o mesmo.

[0010] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma formula- ção de vacina para uso na prevenção e/ou tratamento de um câncer de acordo com qualquer um de [1] a [13] e [15] a [27], um complexo para o uso n A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[14] e [28], e um método para produzir o complexo de acordo com [29] como segue.

[0011] [1] Uma formulação de vacina para uso na prevenção ou tratamento de um câncer, compreendendo um derivado de ácido hialu- rônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido, e um antígeno, em que o derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hi- drofóbico introduzido é a seguinte: um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo me- nos uma unidade de repetição representada pela fórmula (I):

[0012] [Fórmula 1] 図 em que R1, R2, R3, e R4são cada qual independentemente seleciona- dos de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila e C1-6 alquilcarbo- nila; R5 é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1-6 alquilcarboni- la; Z representa uma ligação direta, ou um ligante de peptídeo tendo de 2 a 30 resíduos de aminoácido arbitrário; X1 é um grupo hidrofóbico selecionado de grupos represen- tados pelas seguintes Fórmulas: -NRb-R, -NRb-COO-R, -NRb-CO-R, -NRb-CO-NRc-R, -COO-R, -O-COO-R, -S-R, -CO-Ya-S-R, -O-CO-Yb-S-R,

-NRb-CO-Yb-S-R, e -S-S-R; Ra, Rb e Rc são cada qual independentemente selecionados de um átomo de hidrogênio, C1-20 alquila, amino-C2-20alquila e hidróxi- C2-20 alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NRf- são opcionalmente inseridos; Rfé selecionado deum átomo de hidrogênio, C1-12 alquila, amino-C2-12 alquila e hidróxi-C2-12 alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, 1 ou 2 grupos cada qual independentemente se- lecionado de -O- e -NH- são opcionalmente inseridos; R é um grupo esterila; Y é C2-30 alquileno, ou -(CH2CH2O)m-CH2CH2-, em que no- alquileno, de 1 a 5 grupos cada qual independentemente selecionado de -O-, -NRg- e -S-S- são opcionalmente inseridos; Rg é selecionado de um átomo de hidrogênio, C1-20 alquila, amino-C2-20alquila ou hidróxi-C2-20alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente inseridos; Ya é C1-5 alquileno; Yb é C2-8 alquileno ou C2-8 alquenileno; e m é um número inteiro selecionado de 1 a 100; ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma uni- dade de repetição representada pela fórmula (II):

[0013] [Fórmula 2] 図 em que R1a, R2a, R3a, e R4a são cada qual independentemente selecio-

nados de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila, e C1-6 alquilcar- bonila; R5a é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1-6 alquilcarboni- la; X1aé hidróxi, -O-Q+, C1-6 alcóxi, -NR7R8, ou -NR9-Z1-Z2; Q+ representa um contracátion; R6a, R7, R8, e R9 são cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, e C1-6 alquila; Raa é um átomo de hidrogênio, ou C1-6 alquila, em que aal- quila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos cada qual independentemente selecionado de hidróxi, carbóxi, carbamoila, C1- 6alquiltio, arila, e heteroarila, em que a arila é opcionalmente substituí- da por um ou mais grupos hidróxi; Z1 é C2-30 alquileno, ou -(CH2CH2O)ma-CH2CH2-, em que no- alquileno, de 1 a 5 grupos cada qual independentemente selecionado de-O-, -NRga- e -S-S- são opcionalmente inseridos, e ma é um número inteiro selecionado de 1 a 100; Z2 é selecionado de grupos representados pelas seguintes Fórmulas: -NRba-Z3, -NRba-COO-Z3, -NRba-CO-Z3, -NRba-CO-NRca-Z3, -COO-Z3, -CO-NRca-Z3, -O-CO-NRca-Z3, -O-COO-Z3, -S-Z3, -CO-Za-S-Z3, -O-CO-Zb-S-Z3,

-NRba-CO-Zb-S-Z3, e -S-S-Z3; Rba e Rca são cada qual independentemente selecionados de um átomo de hidrogênio, C1-20alquila, amino-C2-20alquilaehidróxi-C2- 20alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NRfa- são opcionalmente inseridos; Rfa é independentemente selecionado deum átomo de hi- drogênio, C1-12alquila, amino-C2-12alquilaehidróxi-C2-12alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, 1 ou 2 grupos cada qual in- dependentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente inse- ridos; Rga é independentemente selecionado deum átomo de hi- drogênio, C1-20alquila, amino-C2-20alquilaehidróxi-C2-20alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente in- seridos; Z3 é um grupo esterila; Za é C1-5 alquileno; e Zb é C2-8 alquileno ou C2-8 alquenileno, o derivado de ácido hialurônico, quando não compreenden- do uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) em que X1a é -NR9-Z1-Z2, também compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (III):

[0014] [Fórmula 3] 図 em que R1b, R2b, R3be R4bsão cada qual independentemente selecio-

nados de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila, e C1-6 alquilcar- bonila; R5b é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1-6 alquilcarboni- la; e X2 é -NR9-Z1-Z2, em que R9, Z1, e Z2são como já definidos.

[0015] [2] A formulação de vacina de acordo com [1], em que o de- rivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido também compreende uma unidade de repetição representada pela fórmula (IIIc):

[0016] [Fórmula4] 図 em que R1c, R2c, R3ce R4c são cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila e C1-6 alquilcar- bonila; R5c é selecionado deum átomo de hidrogênio, formila e C 1- 6alquilcarbonila;e Xc é selecionado de hidróxi e -O-Q+, em que Q+ representa um contracátion.

[0017] [3] A formulação de vacina de acordo com [1] ou [2], em que a formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que uma relação da unidade de repetição representada pela fórmula (I) para unidades de repetição de dissacarídeo presente é de 5 a 50%.

[0018] [4] A formulação de vacina de acordo com [1] ou [2], em que a formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), em que uma relação de uma unidade de dissacarídeo compreen- dendo o grupo -NR9-Z1-Z2 para unidades de repetição de dissacarídeo presente é de 5 a 50%.

[0019] [5] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [3], em que aFormulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição represen- tada pela fórmula (I), em que Z é uma ligação direta, Y é C2-10 alquile- no, X1é -NH-COO-R, e R é um grupo colesterila.

[0020] [6] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1], [2] and [4], em que a Formulação de vacina compreende um deri- vado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), em que Z1 é C2-10 alquileno, Z2 é -NH- COO-Z3, e Z3 é um grupo colesterila.

[0021] [7] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [6], em que o derivado de ácido hialurônico é produzido usando- se ácido hialurônico composto apenas de uma unidade de dissacarí- deo representada pela fórmula (IIIc) definida na reivindicação 2, em que quando todos os R1c, R2c, R3c, e R4c são átomos de hidrogênio, R5c é acetila, e Xc é -O-Na+, um peso molecular médio ponderal é de 5 qui- lodaltons a 200 quilodaltons.

[0022] [8] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [7], em que o derivado de ácido hialurônico e o antígeno formam um complexo.

[0023] [9] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [8] para administração em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante.

[0024] [10] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [9], em que o antígeno é um peptídeo antigênico ou uma proteína antigênica.

[0025] [11] A formulação de vacina de acordo com [10], em que o peptídeo antigênico compreende dois ou mais epítopos de reconheci- mento de célula T citotóxica CD8-positivo ou epítopos de reconheci- mento de célula T auxiliar CD4-positivo.

[0026] [12] A formulação de vacina de acordo com [11], em que o peptídeo antigênico possui um ligante de aminoácido entre os epíto- pos.

[0027] [13] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [12] para administração em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer.

[0028] [14] Um complexo formado de um derivado de ácido hialu- rônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou a Fórmula (II) de acordo com qualquer um de [1] a [7], e um antígeno que é usado em uma vacina para o uso na prevenção ou tratamento de um câncer.

[0029] [15] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [3], [5] e [7] a [13], em que a Formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo menos uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que Y é - (CH2)n1- ou -(CH2CH2O)m1-CH2CH2-, n1 é um número inteiro de 2 a 15, em1 é um número inteiro de 1 a 4.

[0030] [16] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [3], [5], [7] a [13] e [15], em que a Formulação de vacina compre- ende um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo menos uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que Y é - (CH2)n1-.

[0031] [17] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [3], [5], [7] a [13], [15], e [16], em que a Formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo menos uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que Y é -(CH2)n1, e n1é 2, 6, 8, ou 12.

[0032] [18] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [17] para administração em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante, em que o adjuvante é i) uma substância ativando um receptor imune inato (receptor de reconhecimento pa- drão), ii) uma substância de estimulação de célula apresentando antí- geno, ou iii) uma substância tendo um efeito de inibição, a aquisição de atividade imunossupressora por células apresentando antígeno.

[0033] [19] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [18] para administração em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante, em que o adjuvante é CpG oligo DNA, poliIC, QuilA, QS21, Sting, lipídeo monofosforila, R848, imiquimode, ou MPL.

[0034] [20] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [19], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o peptídeo antigênico compreende um ou mais de cada um dos epíto- pos de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivoe epítopos de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivo.

[0035] [21] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [20], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 8 a

120.

[0036] [22] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [21], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 8 a

50.

[0037] [23] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [22], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 16 a

80.

[0038] [24] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [23], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 23 a

60.

[0039] [25] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [24] para administração em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, em que o anticorpo é um anticorpo inibindo um sinal imunossupressor de tumor, ou pelo menos um tipo de anticorpo ativando um sinal coesti- mulatório de imunócitos.

[0040] [26] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [25] para administração em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, em que o anticorpo é um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-OX40, ou um anticorpo anti-4- 1BB.

[0041] [27] A formulação de vacina de acordo com qualquer um de

[1] a [13] e [15] a [26] para administração em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, em que o anticorpo é um anticorpo anti-PDL1.

[0042] [28] Um complexo formado de um derivado de ácido hialu- rônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ouaFórmula (II) de acordo com qualquer um de [15] a [17], e um antígeno que é usado em uma vacina para o uso na prevenção ou tratamento de um câncer.

[0043] [29] Um método para produzir um complexo de um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido, e um an- tígeno, compreendendo a etapa de misturar um derivado de ácido hia- lurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou aFórmula (II) de acordo com qualquer um de [1] a [7] e

[15] a [17] com um peptídeo antigênico que é usado em uma vacina para o uso na prevenção ou tratamento de um câncer em uma solu- ção.

[0044] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para prevenir e/ou tratar um câncer de acordo com qualquer um de

[30] a [46], e o uso de acordo com qualquer um de [47] a [63] como segue.

[0045] [30] Um método para prevenir e/ou tratar um câncer, com- preendendo administrar uma Formulação de vacina compreendendo um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de re- petição representada pela fórmula (I) ou a Fórmula (II), e um antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [7] e [15] a [17] a um indivíduo.

[0046] [31] O método de acordo com [30], em que o derivado de ácido hialurônico e o antígeno formam um complexo.

[0047] [32] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante.

[0048] [33] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico ou uma proteína antigênica.

[0049] [34] O método de acordo com [33], em que o peptídeo anti- gênico compreende dois ou mais epítopos de reconhecimento de célu- la T citotóxica CD8-positivo ou epítopos de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivo.

[0050] [35] O método de acordo com [34], em que o peptídeo anti- gênico possui um ligante de aminoácido entre os epítopos.

[0051] [36] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer.

[0052] [37] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante, e o adjuvante é i) uma substância ativando um receptor imune inato (receptor de reconhecimento padrão), ii) uma substância de estimulação de célula apresentando antígeno, ou iii) uma substân- cia tendo um efeito de inibir a aquisição da atividade imunossupresso- ra por células apresentando antígeno.

[0053] [38] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante, e o adjuvante é CpG oligo DNA, poliIC, QuilA, QS21, Sting, lipídeo monofosforila, R848, imiquimode, ou MPL.

[0054] [39] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o peptídeo antigênico compreende um ou mais de cada um dos epítopos de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivoe epítopos de reconhecimento de célula T auxiliar CD4- positivo.

[0055] [40] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptí- deo antigênico é de 8 a 120.

[0056] [41] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptí- deo antigênico é de 8 a 50.

[0057] [42] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptí- deo antigênico é de 16 a 80.

[0058] [43] O método de acordo com [30], em que o antígeno é um peptídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptí- deo antigênico é de 23 a 60.

[0059] [44] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anti- corpo inibindo um sinal imunossupressor de tumor, ou pelo menos um tipo de anticorpo ativando um sinal coestimulatório de imunócitos.

[0060] [45] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anti- corpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-OX40, ou um anticorpo anti-4-1BB.

[0061] [46] O método de acordo com [30], em que a Formulação de vacina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anti- corpo anti-PDL1.

[0062] [47] Uso de um derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou a Fórmula (II), e um antígeno de acordo com qualquer um de [1] a [7] e

[15] a [17] na produção de uma Formulação de vacina para uso na prevenção ou tratamento de um câncer.

[0063] [48] Uso de acordo com [47], em que o derivado de ácido hialurônico e o antígeno formam um complexo.

[0064] [49] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adju- vante.

[0065] [50] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico ou uma proteína antigênica.

[0066] [51] Uso de acordo com [50], em que o peptídeo antigênico compreende dois ou mais epítopos de reconhecimento de célula T ci- totóxica CD8-positivo ou epítopos de reconhecimento de célula T auxi- liar CD4-positivo.

[0067] [52] Uso de acordo com [51], em que o peptídeo antigênico possui um ligante de aminoácido entre os epítopos.

[0068] [53] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anti-

corpo para o uso no tratamento de câncer.

[0069] [54] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adju- vante, e o adjuvante é i) uma substância ativando um receptor imune inato (receptor de reconhecimento padrão), ii) uma substância de esti- mulação de célula apresentando antígeno, ou iii) uma substância tendo um efeito de inibir a aquisição de atividade imunossupressora por célu- las apresentando antígeno.

[0070] [55] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de adju- vante, e o adjuvante é CpG oligo DNA, poliIC, QuilA, QS21, Sting, lipí- deo monofosforila, R848, imiquimode, ou MPL.

[0071] [56] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico, e o peptídeo antigênico compreende um ou mais de cada um dos epítopos de reconhecimento de célula T citotóxica CD8- positivoe epítopos de reconhecimento de célula T auxiliar CD4- positivo.

[0072] [57] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 8 a 120.

[0073] [58] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 8 a 50.

[0074] [59] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 16 a 80.

[0075] [60] Uso de acordo com [47], em que o antígeno é um pep- tídeo antigênico, e o número de resíduos de aminoácido no peptídeo antigênico é de 23 a 60.

[0076] [61] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va-

cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anti- corpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anticor- po inibindo um sinal imunossupressor de tumor, ou pelo menos um tipo de anticorpo ativando um sinal coestimulatório de imunócitos.

[0077] [62] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anti- corpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anticor- po anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-OX40, ou um anticorpo anti-4-1BB.

[0078] [63] Uso de acordo com [47], em que a Formulação de va- cina é administrada em combinação com pelo menos um tipo de anti- corpo para o uso no tratamento de câncer, e o anticorpo é um anticor- po anti-PDL1.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0079] O uso da formulação de vacina compreendendo um com- plexo de um derivado de ácido hialurônico com um grupo hidrofóbico introduzido e um antígeno de acordo com a presente invenção melho- ra o acúmulo do antígeno para o linfonodo, permite a indução marcada de CTL específicos para o antígeno e permite a potenciação de um efeito anticâncer por imunidade. O complexo e a formulação de vacina da presente invenção também têm características excelentes em se- gurança, particularmente segurança em administração a longo prazo, porque o derivado de ácido hialurônico usado também é excelente em segurança.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0080] A Figura 1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é como se segue:

NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, CpG: células do baço derivadas de um camundongo que recebeu um peptí- deo antigênico (mERK2 p121) e CpG oligo DNA, CHP+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que recebeu um complexo de CHP (CHP-80T; 80 k) e o peptídeo antigênico, e CpG oligo DNA, 99k41+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6- Chol-41%), e CpG oligo DNA.

[0081] A Figura 2-1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de to- das as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação de célula T CD8+. Cada amostra é a seguinte: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, 99k41: cé- lulas do baço derivadas de um camundongo que recebeu um comple- xo de um peptídeo antigênico (mERK2 p121) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) , 99k41+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e o derivado de HA, e CpG oligo DNA, 99k41+poliIC: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e o deri- vado de HA, e poliIC, 99k41+QuilA: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e o derivado de HA, e QuilA, 99k41+sting: células do baço derivadas de um camun- dongo dado um complexo do peptídeo antigênico e o derivado de HA, e Sting.

[0082] Figura 2-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD4+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD4+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação de célula T CD4+. Cada amostra é igual à da Figura

2-1.

[0083] Figura 3-1 é um gráfico que mostra a razão entre o núme- ro de células CD8+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é a seguinte: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, 99k41+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que rece- beram um complexo de um peptídeo antigênico (mERK2 p121) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) e CpG oligo DNA, 99k41+R848: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e o derivado de HA, e R848, 99k41+MPL: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e derivado de HA e MPL.

[0084] Figura 3-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD4+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD4+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação de célula T CD4+. Cada amostra é igual à da Figura 3-1.

[0085] Figura 4 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando MAGE-A4 p265 foi usado como um peptí- deo para estimulação de célula T CD8+. Cada amostra é como se se- gue: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, peptídeo+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um peptídeo antigênico (MAGE-A4 p264) e CpG oligo DNA, CHP/Wt+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que re- cebeu um complexo de CHP (80 k) e o peptídeo antigênico e CpG oli-

go DNA, 99k41/Wt+CpG: células do baço derivadas de um camundon- go que recebeu um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6 -Chol-41%) e CpG oligo DNA.

[0086] Figura 5 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando MAGE-A4 p265 foi usado como um peptí- deo para estimulação de célula T CD8+. Cada amostra é como se se- gue: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, CHP/Wt: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo de CHP (80 k) e um peptídeo antigênico (MAGE-A4 p264), 99k41/Wt: células do baço derivadas de um camundongo com um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6- Chol-41%).

[0087] Figura 6 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando MAGE-A4 p265 foi usado como um peptí- deo para estimulação de célula TCD8+. Cada amostra é como se se- gue: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, 99k41/Wt+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que receberam um complexo de um peptídeo antigênico (MAGE-A4 p264) e um derivado de HA (99k HA-C6 -Chol-41%), e CpG oligo DNA, 99k41/LLLL+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo de um peptídeo antigênico (MAGE-A4 p264-4L) e o deri- vado de HA, e CpG oligo DNA, 99k41/WWWW+CpG: células do baço derivadas de um camundongo com um complexo de um peptídeo anti- gênico (MAGE-A4 p264-4W) e o derivado de HA e CpG oligo DNA.

[0088] Figura 7-1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando TRP1 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é cocmo se segue: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, CHP/6Y+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que re- cebeu um complexo de CHP e um peptídeo antigênico (TRP2TRP1gp100-6Y) e CpG oligo DNA, 99k43/6Y+CpG: células de baço derivadas de um camundongo com um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[0089] Figura 7-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando TRP2 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é igual à da Figura 7-1.

[0090] Figura 7-3 é um gráfico que mostra a razão entre o núme- ro de células CD8+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando gp100 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é igual à da Figura 7-1.

[0091] Figura 8-1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando TRP1 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é como se segue: NT: células do baço derivadas de um camundongo não tratado, 99k43/6G+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que recebeu um complexo de um peptídeo antigênico (TRP2TRP1gp100- 6G) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%), e CpG oligo DNA, 99k43/6Y+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo de um peptídeo antigênico (TRP2TRP1gp100-6Y) e o derivado de HA, e CpG oligo DNA, 99k43/4L+CpG: células de baço derivadas de um camundongo que recebeu um complexo de um pep- tídeo antigênico (TRP2TRP1gp100-4L) e o derivado de HA, e CpG oli- go DNA, 99k43/6L+CpG: células de baço derivadas de um camundon- go que recebeu um complexo de um peptídeo antigênico (TRP2TRP1gp100-6L) e o derivado de HA, e CpG oligo DNA.

[0092] Figura 8-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando TRP2 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é igual à da Figura 8-1.

[0093] Figura 8-3 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células de baço derivadas de camundongo C57BL/6 (ordenado) quando gp100 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD8+. Cada amostra é igual à da Figura 8-1.

[0094] Figura 9-1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando AH1 foi usado como um peptídeo para es- timulação de células T CD8+. Cada amostra é como se segue: NT: cé- lulas do baço derivadas de um camundongo não tratado, CHP/6Y+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que re- cebeu um complexo de CHP e um peptídeo antigênico (AH1gp70-6Y) e CpG oligo DNA, 99k43/6Y+CpG: células de baço derivadas de um camundongo com um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[0095] Figura 9-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD4+ produtoras de interferon gama para o número de todas as células CD4+ em células de baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando gp70 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD4+. Cada amostra é igual à da Figura 9-1.

[0096] Figura 10-1 é um gráfico que mostra a razão entre o nú- mero de células CD8+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando AH1 foi usado como um peptídeo para es- timulação de células T CD8+. Cada amostra é como se segue: NT: cé- lulas do baço derivadas de um camundongo não tratado, CHP/6L+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que re- cebeu um complexo de CHP e um peptídeo antigênico (AH1gp70-6L) e CpG oligo DNA, 99k43/6L+CpG: células de baço derivadas de um camundongo aos quais foi dado um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[0097] Figura 10-2 é um gráfico que mostra a razão entre o nú- mero de células CD4+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD4+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando gp70 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD4+. Cada amostra é igual à da Figura 10-

1.

[0098] A Figura 11-1 é um gráfico que mostra a razão entre o número de células CD8+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD8+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando AH1 foi usado como um peptídeo para es- timulação de células T CD8+. Cada amostra é como se segue: NT: cé- lulas do baço derivadas de um camundongo não tratado, 99k43/6G+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que receberam um complexo de um peptídeo antigênico (AH1gp70-6G) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%), e CpG oligo DNA, 99k43/6Y+CpG: células do baço derivadas de um camundongo dado um complexo de um peptídeo antigênico (AH1gp70-6Y) e o derivado de HA, e CpG oligo DNA, 99k43/4L+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que recebeu um complexo de um peptídeo anti- gênico (AH1gp70-4L) e o derivado de HA, e CpG oligo DNA, 99k43/6L+CpG: células do baço derivadas de um camundongo que recebeu um complexo de um peptídeo antigênico (AH1gp70-6L) e o derivado de HA, e CpG oligo DNA.

[0099] Figura 11-2 é um gráfico que mostra a razão entre o nú- mero de células CD4+ produtoras de interferon gama e o número de todas as células CD4+ em células do baço derivadas de camundongo BALB/c (ordenado) quando gp70 foi usado como um peptídeo para estimulação de células T CD4+. Cada amostra é igual à da Figura 11-

1.

[00100] Figura 12-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo BALB/c com fi- brossarcoma de camundongo CMS5a (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, peptídeo: um grupo de camundongo com um peptídeo antigênico (mERK2 p121) e CpG oligo DNA, emulsão: um grupo de camundongo com uma for- mulação de emulsão produzida a partir do peptídeo antigênico e CpG oligo DNA, CHP: um grupo de camundongo dado um complexo de CHP e o peptídeo antigênico, e CpG oligo DNA, 99k41: um grupo de camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) e CpG oligo DNA.

[00101] Figura 12-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo BALB/c portador de fibrossarcoma de camundongo CMS5a (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 12-1.

[00102] Figura 13-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongos BALB/c com fi-

brossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, CpG: um grupo de camundongo com CpG oligo DNA, CHP: um grupo de camundongo com um complexo de CHP e um peptídeo antigênico (mERK2 p121), e CpG oligo DNA, 99k41: um grupo de camundongos que recebeu um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) e CpG oligo DNA.

[00103] Figura 13-2 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo BALB/c portador de fibrossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 13-1.

[00104] Figura 14-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongos BALB/c com fi- brossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, aCTLA4/aPD1/aPDL1: um grupo de camundongo dado um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD1 e um anticorpo anti-PDL1, 99k41: um grupo de camundongo dado um complexo de um peptídeo antigê- nico (mERK2 p121) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) e CpG oligo DNA.

[00105] Figura 14-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo BALB/c portador de fibrossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 14-1.

[00106] Figura 15-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo BALB/c portador de fibrossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, aC-TLA4/aPDL1/aOX40/a4-1BB: um grupo de camundongo com um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-OX40 , e um anticorpo anti-4-1BB, 99k41: um grupo de camun- dongo dado um complexo de um peptídeo antigênico (mERK2 p121) e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-41%) e CpG oligo DNA, 99k41+aCTLA4/aPDL1/aOX40/a4-1BB: um grupo de camundongo da- do um complexo do peptídeo antigênico e o derivado de HA, CpG oligo DNA e um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PDL1, um anticor- po anti-OX40 e um anti-4-1BB anticorpo.

[00107] Figura 15-2 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo BALB/c portador de fibrossarcoma de camundongo CMS5a (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 15-1.

[00108] Figura 16-1 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongos BALB/c portado- res de CT26 de células de câncer colorretal de camundongo (ordena- do). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, emulsão: um grupo de camundongo com uma formula- ção de emulsão produzida a partir de um peptídeo antigênico (AH1gp70-6L) e CpG oligo DNA, CHP: um grupo de camundongo com um complexo de CHP e o peptídeo antigênico e CpG oligo DNA, 99k43: um grupo de ratinho dado um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[00109] Figura 16-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongos BALB/c portando CT26 de células de câncer colorretal de camundongo (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 16-1.

[00110] Figura 17-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo C57BL/6 com me- lanoma B16F10 de camundongo (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, CHP: um grupo de camundongo com um complexo de CHP e um peptídeo anti- gênico (TRP2TRP1gp100-6Y) e CpG oligo DNA, 99k43: um grupo de camundongo com um complexo peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[00111] Figura 17-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo C57BL/6 com melanoma B16F10 de camundongo (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 17-1.

[00112] Figura 18-1 é um gráfico que mostra a intensidade de fluo- rescência por célula de linfonodo de camundongo BALB/c 24 horas após a administração da amostra em um teste de migração de linfono- do. Cada amostra de administração é como se segue: NT: nenhuma amostra adicionada, LPA: um peptídeo antigênico (mERK2 p121 mar- cado com fluorescência (conjugado com fluoresceína)), CHP: um complexo de CHP e o peptídeo antigênico, 10k17: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-C6-Chol-17%), 10k25: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-C6-Chol-25%), 10k42: um complexo do peptídeo antigênico e um HA derivado (10k HA-C6-Chol-42%), 50k23: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (50k HA-C6-Chol-23%), 50k43: um complexo do peptídeo antigênico e um HA derivado (50k HA-C6-Chol- 43%), 99k24: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-24%), 99k43: um complexo do peptídeo antigêni- co e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-43%).

[00113] Figura 18-2 é um gráfico que mostra a intensidade de fluo- rescência por célula de linfonodo de camundongo BALB/c 72 horas após a administração da amostra em um teste de migração de linfono- do. Cada amostra de administração é igual à da Figura 18-1.

[00114] Figura 19 é um gráfico que mostra a intensidade de fluo- rescência por célula de linfonodo de camundongo BALB/c 24 horas após a administração da amostra em um teste de migração de linfono- do. Cada amostra de administração é como se segue: NT: nenhuma amostra adicionada, peptídeo: um peptídeo antigênico (mERK2 p121 marcado com fluorescência (conjugado com fluoresceína)), 99k41: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6- Chol-41%), 10kHA-Ala-Chol30: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Ala-C6-Chol-30%), 10kHA-Ser-Chol28: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Ser- C6-Chol-28%), 10kHA-Gly-Chol32: um complexo do peptídeo antigêni- co e um derivado de HA (10k HA-Gly-C6-Chol-32%), 10kHA- Thr- Chol32: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Thr-C6-Chol-32%), 10kHA-Asn-Chol20: um complexo do pep- tídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA- Asn-C6-Chol-20%), 10kHA-Asp-Chol32: um complexo do peptídeo antigênico e um deriva- do de HA (10k HA-Asp-C6-Chol-32%), 10kHA-Phe-Chol31: um com- plexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Phe-C6- Chol-31%), 10kHA-Tyr-Chol32: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Tyr-C6-Chol-32%), 10kHA-Ile-Chol28: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Ile-C6- Chol-28%), 10kHA-Leu -Chol31: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Leu-C6-Chol-31%), 10kHA-Val-Chol32: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA- Val-C6 -Chol-32%), 10kHA-Trp-Chol24: um complexo do peptídeo anti- gênico e um derivado de HA (10k HA-Trp-C6-Chol-24%), 10kHA-Gln- Chol32: um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Gln-C6-Chol-32%), 10kHA-Glu-Chol32: um complexo do pep- tídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-Glu-C6-Chol-32%).

[00115] Figura 20-1 é um gráfico que mostra mudanças no volume médio do tumor de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (ordenado). Cada grupo é como se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, 99k42: um grupo de camundongo com um complexo de um peptídeo antigêni- co e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-42%) e CpG oligo DNA, 50k42: um grupo de camundongo que recebeu um complexo do peptí- deo antigênico e um derivado de HA (50k HA-C6-Chol-42%) e CpG oligo DNA, 10k43: um grupo de camundongo recebeu um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (10k HA-C6-Chol-43%) e CpG oligo DNA.

[00116] Figura 20-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (n = 5) (or- denado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 20-

1.

[00117] Figura 21-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (ordenado). Cada grupo é co- mo se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, 10kHA-Ala-Chol30: um grupo de camundongo com um complexo de um peptídeo antigênico e um derivado de HA modificado com aminoá- cido (10k HA-Ala-C6-Chol-30%), e CpG oligo DNA, 10kHA-Gln-Chol32: um grupo de camundongo dado um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA modificado com aminoácido (10k HA-Gln-C6- Chol-32%) e CpG oligo DNA.

[00118] Figura 21-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo C57BL/6 com melanoma B16F10 de camundongo (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 21-1.

[00119] Figura 22-1 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (ordenado). Cada grupo é co-

mo se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, 99k42+PoliIC: um grupo de camundongo com um complexo de um peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-42%) e po- liIC.

[00120] Figura 22-2 é um gráfico que mostra as mudanças no vo- lume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (n = 5) (or- denado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 22-

1.

[00121] Figura 23-1 é um gráfico que mostra as alterações no vo- lume médio do tumor de um grupo de camundongo C57BL/6 portador de melanoma B16F10 de camundongo (ordenado). Cada grupo é co- mo se segue: controle: um grupo de camundongo sem amostra, 99k42+Sting: um grupo de camundongo com um complexo de um pep- tídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-42%) e um agonista de Sting, 99k42+R848: um grupo de camundongo que rece- beu um complexo do peptídeo antigênico e um derivado de HA (99k HA-C6-Chol-42%) e R848. Figura 23-2 é um gráfico que mostra as mudanças no volume do tumor de cada indivíduo de um grupo de camundongo C57BL/6 com mela- noma B16F10 de camundongo (n = 5) (ordenado) em uma base de grupo. Cada grupo é igual ao da Figura 23-1.

[00122] Figura 24-1 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ específicas de TRP2 para o número de todas as célu- las CD8+ em tumor derivado de camundongo portador de me-lanoma B16F10 de camundongo ou linfonodo (ordenado) quando H-2Kb TRP- 2 Tetrâmero-SVYDFFVWL-APC foi usado como um tetrâmero. Cada amostra é como se segue: NT: células derivadas de um camundongo com câncer não tratado, 99k41: células derivadas de um camundongo com câncer que recebeu um complexo de um peptídeo antigênico

(TRP2TRP1gp100-6Y) e um derivado de HA (99k HA-C6- Chol-41%) e CpG oligo DNA.

[00123] Figura 24-2 é um gráfico que mostra a razão do número de células CD8+ específicas de gp100 para o número de todas as célu- las CD8+ em tumor derivado de camundongo portador de melanoma B16F10 de camundongo ou linfonodo (ordenado) quando H-2Db gp100 Tetrâmero-EGSRNQDWL-PE foi usado como um tetrâmero. Cada amostra é como se segue: NT: células derivadas de um camun- dongo com câncer não tratado, 99k41: células derivadas de um ca- mundongo com câncer que recebeu um complexo de um peptídeo an- tigênico (TRP2TRP1gp100-6Y) e um derivado de HA (99k HA-C6- Chol-41%) e CpG oligo DNA.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[00124] A seguir, a presente invenção será descrita mais especifi- camente.

[00125] O complexo de um derivado de ácido hialurônico com um grupo hidrofóbico introduzido e um antígeno de acordo com a presente invenção é um complexo de um derivado de ácido hialurônico compre- endendo pelo menos uma unidade dissacarídeo (que também é uma unidade de repetição) representado pela fórmula (I), ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo menos uma unidade de dis- sacarídeo (que também é uma unidade de repetição) representada pela fórmula (II) e um antígeno. O complexo pode ser usado para pro- duzir a formulação de vacina da presente invenção. A presente especi- ficação também inclui a descrição de um método para produzir o com- plexo de um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido e um antígeno de acordo com a presente invenção. Definição

[00126] O termo "grupo esterila" no presente documento descrito não é particularmente limitado, desde que o grupo tenha um esqueleto esteroide. Neste contexto, exemplos do esteroide incluem especifica- mente colesterol, desidrocolesterol, coprostanol, coprosterol, colesta- nol, campestanol, ergostanol, estigmastanol, coprostanol, estigmaste- rol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simiarenol, ácido biliar (ácido co- lesterol, ácido litocólico, ácido hiodesoxicólico, ácido quenodeoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido apocólico, ácido cóli- co, ácido desidrocólico, ácido glicocólico e ácido taurocólico), testoste- rona, estradiol, progesterona, cortisol, cortisona, aldosterona, corticos- terona e deoxicorticosterona. Exemplos do grupo esterila incluem um grupo colesterila, um grupo estigmasterila, um grupo lanosterila, um grupo ergosterila, um grupo colanoila e um grupo coloila e preferivel- mente incluem um grupo colesterila (particularmente, um grupo colest- 5-en-3-ila representado pela seguinte fórmula) e um grupo colanoila (particularmente, um grupo 5-colan-24-oila representado pela seguin- te fórmula). [Fórmula 5] 図

[00127] Neste contexto, dois asteriscos representam uma posição de ligação.

[00128] O termo "C1-20 alquila" no presente documento descrito sig- nifica um grupo alquila linear ou ramificado com 1 a 20 átomos de car- bono. Exemplos do mesmo incluem "C1-4 alquila" tal como metila, etila, n-propila, i-propila, n-butila, s-butila, i-butila, e t-butila e ainda incluem n-pentila, 3-metilbutila, 2-metilbutila, 1-metilbutila, 1-etilpropila, n- hexila, 4-metilpentila, 3-metilpentila, 2-metilpentila, 1-metilpentila, 3- etilbutila, e 2-etilbutila. O C1-20 alquila também inclui "C1-12 alquila" ten-

do 1 a 12 átomos de carbono e "C 1-6 alquila" tendo 1 a 6 átomos de carbono.

[00129] O termo "C1-6 alquila" no presente documento descrito signi- fica um grupo alquila linear ou ramificado com 1 a 6 átomos de carbo- no. Exemplos do mesmo incluem "C1-4 alquila" tal como metila, etila, n- propila, i-propila, n-butila, s-butila, i-butila, e t-butila.

[00130] O termo "C1-6 alquilcarbonila" no presente documento des- crito significa um grupo alquilcarbonila cuja porção alquila já é mencio- nada C1-6 alquila. Exemplos do mesmo incluem "C1-4 alquilcarbonila" tal como acetila, propionila, n-propilcarbonila, i-propilcarbonila, n- butilcarbonila, s-butilcarbonila, i-butilcarbonila, e t-butilcarbonila.

[00131] O termo "C1-6 alcóxi" no presente documento descrito signi- fica um grupo alquilóxi cuja porção alquila já é mencionada C1-6 alquila. Exemplos do mesmo incluem "C1-4 alcóxi" tal como metóxi (H3C-O-), etóxi, n-propóxi, i-propóxi, n-butóxi, s-butóxi, i-butóxi, e t-butóxi.

[00132] O termo "C1-6 alquiltio" no presente documento descrito sig- nifica um grupo alquiltio cuja porção alquila já é mencionada C1-6 alqui- la. Exemplos do mesmo incluem metiltio (H3C-S-), etiltio, n-propiltio, i- propiltio, n-butiltio, s-butiltio, i-butiltio, e t-butiltio e preferivelmente inclui metiltio.

[00133] O termo "amino-C2-20 alquila" no presente documento des- crito significa um grupo alquila linear ou ramificado com 2 a 20 átomos de carbono e com um grupo amino como substituinte. O grupo amino pode ser posicionado, por exemplo, em um átomo de carbono terminal do grupo alquila. A amino-C2-20 alquila também inclui "amino-C2-12 al- quila" tendo de 2 a 12 átomos de carbono.

[00134] O termo "hidróxi-C2-20 alquila" no presente documento des- crito significa um grupo alquila linear ou ramificado tendo 2 a 20 áto- mos de carbono e tendo um grupo hidróxi como um substituinte. O grupo hidróxi pode ser posicionado, por exemplo, em um átomo de carbono terminal do grupo alquila. A hidróxi-C2-20 alquila também inclui "hidróxi-C2-12 alquila" tendo 2 a 12 átomos de carbono.

[00135] O termo "C2-30 alquileno" no presente documento descrito significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente linear ou ramifi- cado possuindo 2 a 30 átomos de carbono. Exemplos do mesmo in- cluem etileno e propileno e incluem C2-20 alquileno, C2-8 alquileno, e um grupo-(CH2)n- (em que n é 2 a 30, preferivelmente 2 a 20, mais preferi- velmente 2 a 15).

[00136] O termo "C1-5 alquileno" no presente documento descrito significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente linear ou ramifi- cado possuindo 1 a 5 átomos de carbono. Exemplos do mesmo inclu- em metileno, etileno (etano-1,2-di-ila e etano-1,1-di-ila), propileno (propano-1,1-di-ila e propano-1,2-di-ila), butano-1,4-di-ila e pentano- 1,5-di-ila.

[00137] O termo "C2-10 alquileno" no presente documento descrito significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente linear ou ramifi- cado com 2 a 10 átomos de carbono. Exemplos do mesmo incluem etileno (etano-1,2-di-il e etano-1,1-di-il), propileno (propano-1,1-di-ila, propano-1,2-di-ila e propano-1,3-di-ila), butano-1,4-di-ila, pentano-1,5- di-ila, hexano-1,6-di-ila, heptano-1,7-di-ila e octano-1,8-di-ila. O "C2-10 alquileno" inclui "C2-8 alquileno" tendo 2 a 8 átomos de carbono e "C2-6 alquileno" tendo 2 a 6 átomos de carbono.

[00138] O termo "C2-8 alquileno" no presente documento descrito significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente linear ou ramifi- cado com 2 a 8 átomos de carbono. Exemplos do mesmo incluem eti- leno (etano-1,2-di-il e etano-1,1-di-il), propileno (propano-1,1-di-ila, propano-1,2-di-ila e propano-1,3-di-ila), butano-1,4-di-ila, pentano-1,5- di-ila, hexano-1,6-di-ila, heptano-1,7-di-ila e octano-1,8-di-ila.

[00139] O termo "C2-8 alquenileno" no presente documento descrito significa um grupo hidrocarboneto saturado divalente linear ou ramifi-

cado possuindo 2 a 8 átomos de carbono e contendo uma ou mais li- gações duplas. Exemplos do mesmo incluem -CH=CH-, -C(CH3)=CH-, 2-buteno-1,4-di-ila, hepta-2,4-dieno-1,6-di-ila e octa-2,4,6 -trieno-1,8- di-ila. Se isomeria geométrica estiver presente, os respectivos isôme- ros e suas misturas também estão incluídos nos mesmos.

[00140] Na presente invenção, a "arila" significa um grupo carbocí- clico aromático, por exemplo, um grupo carbocíclico aromático com 6 a 14 átomos de carbono. Os exemplos de arila incluem fenila e naftila (1- naftila e 2-naftila). Exemplos de arila substituída por um ou mais gru- pos hidróxi incluem 4-hidroxifenila.

[00141] Na presente invenção, o "heteroarila" significa um grupo cíclico aromático contendo um ou mais heteroátomos selecionados a partir de um átomo de nitrogênio, um átomo de oxigênio e um átomo de enxofre como átomos constituintes do anel e pode ser parcialmente saturado. O anel pode ser monocíclico ou heteroarila bicíclica conden- sado com um anel benzeno ou um anel de heteroarila monocíclica. O número de átomos que constituem o anel é, por exemplo, 4 a 15, pre- ferivelmente 5 a 14, mais preferivelmente 6 a 10. Exemplos de hetero- arila incluem furila, tienila, pirrolila, imidazolila, pirazolila, tiazolila, isoti- azolila, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, triazolila, tetra- zolila, piridila, pirimidila, piridazinila, pirazinila, triazinila, benzofuranila, benzotienila, benzotiadiazolila, benzotiazolila, benzoxazolila, benzoxa- diazolila, benzimidazolila, indolila, isoindolila indazolila, quinolila, iso- quinolila, cinnolinila, quinazolinila, quinoxalinila, benzodioxolila, indoli- zinila, imidazopiridila e preferivelmente indol-2-ila.

[00142] Exemplos do "grupo hidrocarboneto divalente C2-50" no pre- sente documento descritos incluem, mas não estão particularmente limitados a, grupos alquileno lineares, ramificados, cíclicos e parcial- mente cíclicos, grupos alquenileno e grupos alquinileno tendo 2 a 50 átomos de carbono. Cada um desses grupos pode ser um anel aromá-

tico divalente ou pode conter um anel aromático como uma porção da estrutura.

[00143] O "C2-50 polialquilenóxi divalente" no presente documento descrito não é particularmente limitado e um grupo alquileno em uma unidade de repetição pode ser linear ou ramificado. Exemplos do "C2-50 polialquilenóxi divalente" incluem um grupo C2-50 polietilenóxi divalente, um grupo C3-48 polipropilenenóxi e um grupo C3-48 polibutilenóxi. Cada um desses grupos pode estar ligado a outro grupo por meio de um átomo de oxigênio ou um átomo de carbono. Exemplos do grupo polie- tilenóxi C2-50 incluem -O(CH2CH2O)1-25-, -(CH2CH2O)1-25-, -(OCH2CH2)1- 25-, e -(CH2CH2O)1-24-(CH2CH2)-.

[00144] O termo "substância de sal" no presente documento des- crito não é particularmente limitado, desde que a substância de sal se- ja matéria inorgânica solúvel em água. Exemplos do mesmo incluem: sais de cálcio, tais como cloreto de cálcio e fosfato de cálcio; sais de magnésio, tais como sulfato de magnésio e cloreto de magnésio; sais de alumínio, tais como sulfato de alumínio e cloreto de alumínio; sais de potássio, como sulfato de potássio, carbonato de potássio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, brometo de potássio e iodeto de po- tássio; sais de sódio, tal como bicarbonato de sódio, carbonato de só- dio, sulfato de sódio, nitrato de sódio, cloreto de sódio, brometo de só- dio, iodeto de sódio, silicato de sódio, fosfato trissódico, fosfato dissó- dico, borato de sódio, acetato de sódio e citrato de sódio; e sais de lí- tio, tais como cloreto de lítio, brometo de lítio, iodeto de lítio e carbona- to de lítio, e preferivelmente incluem cloreto de sódio, fosfato trissódi- co, fosfato dissódico, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

[00145] O termo "antígeno" no presente documento descrito refere- se a uma substância que inicia a imunidade. O antígeno é, por exem- plo, uma substância que pode induzir a ativação de linfócitos, como células T ou B, por meio da apresentação por células apresentadoras de antígeno no linfonodo ou no baço. O termo "proteína antigênica" refere-se a um antígeno que é uma proteína. O "peptídeo antigênico" refere-se a um antígeno que é um peptídeo. Por exemplo, o peptídeo antigênico é uma porção de uma sequência de aminoácidos contida na proteína antigênica e compreende um epítopo de reconhecimento de células T. Uma pluralidade de epítopos de reconhecimento de células T pode ser combinada.

[00146] O termo "adjuvante" no presente documento descrito refe- re-se a uma substância que potencializa a reação imune em um indiví- duo por administração ao indivíduo em combinação com uma vacina contendo um antígeno.

[00147] Derivado de ácido hialurônico compreendendo a unidade de repetição representada pela fórmula (I)

[00148] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) é composto substancialmente por (1) uma unidade de repetição da fór- mula (I); ou (2) unidades de repetição da fórmula (I) e da fórmula (IIIc).

[00149] Quando o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) compreende duas ou mais unidades de repetição da fórmula (I), as unidades de re- petição podem ser iguais ou diferentes. O derivado de ácido hialurôni- co pode ser modificado em uma posição diferente da unidade de repe- tição da fórmula (I). Por exemplo, um grupo hidróxi pode ser convertido em -O(C1-6 alquila), -O(formila) ou -O( C1-6 alquilcarbonila), etc., e um grupo carboxila pode ser convertido em um grupo amida ou um grupo éster ou pode formar um sal.

[00150] De acordo com um aspecto, o grupo -Z-N(Ra)Y-X1 na fór- mula (I) é selecionado a partir de grupos representados pelas seguin- tes fórmulas:

-NH-(CH2)mz-NH-R; -NH-(CH2)mz-NH-COO-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R; -NH-(CH2)mz-COO-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-COO-R; -NH-(CH2)mz-O-COO-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-COO-R; -NH-(CH2)mz-S-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-S-R; -NH-(CH2)mz-O-CO-CH(R10)-CH2-S-R; -NH-(CH2)mz-NHCO-CH(R10)-CH2-S-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NHCO-CH(R10)-CH2-S-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-CO-CH(R10)-CH2-S-R; -NH-(CH2)mz-S-S-R; e -Z-NRa-Y-NRb-COO-R em que mz é um número inteiro de 2 a 30, R10 é um átomo de hidro- gênio ou um grupo metila, e R e m são como já definidos no presente documento. O grupo é preferivelmente um grupo selecionado de -NH-(CH2)mz-NH-COO-R; -NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R; e -NH-(CH2)mz-S-S-R em que mz, R e m são conforme já definidos no presente documento.

[00151] Em um aspecto preferido, Z na fórmula (I) é uma ligação direta. Em um aspecto, quando Z na fórmula (I) é um ligante de peptí- deo, X1 é -NRb-COO-R.

[00152] Exemplos específicos de Y na fórmula (I) incluem - CH2CH2O-CH2CH2-S-S-CH2CH2O-CH2CH2-, -(CH2CH2O)2-CH2CH2-S- S-CH2CH2O-CH2CH2-, -CH2CH2O-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2- e -(CH2CH2O)2-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2-.

[00153] Ya na fórmula (I) é preferivelmente -CH2- e -CH2-CH2-.

[00154] Yb na fórmula (I) é preferivelmente -CH2-CH2-, - CH(CH3)CH2-, 2-buteno-1,4-di-il, hepta-2,4-dieno-1,6-di-il ou octa- 2,4,6-trieno-1,8-di-il, mais preferivelmente -CH2-CH2- ou -CH(CH3)CH2.

[00155] Em um aspecto, Z na fórmula (I) é um ligante peptídico re- presentado por -NH-[CH(-Za)-CONH]n-1-CH(-Za)-CO-, em que n é um número inteiro de 2 a 30, e cada Za representa independentemente um substituinte em um -aminoácido representado por H2N-CH(-Za)- COOH. O ligante de peptídeo se liga em seu N terminal a um grupo carboxila da fração de ácido glucurônico e se liga em seu C terminal ao grupo -N(-Ra)-Y-X1. Exemplos dos aminoácidos que podem ser usados como resíduos de aminoácidos do ligante peptídico incluem - aminoácidos, por exemplo, aminoácidos naturais (L), tais como alani- na, arginina, asparagina (Asn), ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina (Gly), histidina, isoleucina, leucina (Leu), lisina, metionina, fenilalanina (Phe), prolina, serina, treonina, triptofano, tiro- sina e valina e suas formas D. Cada -aminoácido, incluindo aminoá- cidos sintetizados, pode ser usado. Especificamente, os exemplos de Za incluem -CH3, H2NC(NH)NH(CH2)3-, e H2NCOCH2-. n Z pode ser igual ou diferente. n é um número inteiro de 2 a 30, preferivelmente 2 a 10, mais preferivelmente 2 a 4. Os exemplos preferidos do ligante pep- tídico incluem, -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, e -Phe- Gly-.

[00156] Exemplos específicos do grupo -Z-N(Ra)Y-X1 na fórmula (I) incluem -NH-(CH2)2-NH-CO-colesterila, -NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH- (CH2)3-NH-COO-colesterila, -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH- COO-colesterila, -NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-COO-colesterila, -NH- (CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-COO-colesterila, -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(- (CH2)3-NH2)-COO-colesterila, -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH- (CH2)3-NH2)-COO-colesterila, -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-

CO-NH-colesterila, -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-CO- colesterila, e -NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-colesterila. Em um aspecto preferido do grupo -Z-N(Ra)Y-X1, cada de Ra, Rb e Rc é um átomo de hidrogênio, Y é C2-30 alquileno linear ou -(CH2CH2O)m- CH2CH2-, e Ya é C1-5 alquileno linear, ou Yb é C2-8 alquileno linear ou C2-8 alquenileno linear.

[00157] Em um aspecto, no grupo Z-N(Ra)Y-X1, Z é uma ligação direta, Ra é um átomo de hidrogênio, Y é, por exemplo, C2-12 alquileno, preferivelmente C2-6 alquileno, mais preferivelmente C6 alquileno, X1 é -NRb-COO-R, Rb é um átomo de hidrogênio, e R é um grupo colesteri- la.

[00158] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) com- preende ainda uma unidade de repetição representada pela fórmula (IIIc). Quando duas ou mais unidades de repetição representadas pela fórmula (IIIc) estão contidas, as unidades de repetição podem ser iguais ou diferentes.

[00159] Q+ na fórmula (IIIc) não é particularmente limitado, desde que Q+ seja um contra-cátion que forma um sal com um grupo carboxi- la em água. Q+ divalente ou de valência superior forma um sal com uma pluralidade de grupos carboxila de acordo com a valência. Exem- plos do contra-cátion incluem: íons metálicos, como íons de lítio, íons de sódio, íons de rubídio, íons de césio, íons de magnésio e íons de cálcio; e íons de amônio representados pela fórmula: N+RjRkRlRm (em que Rj, Rk, Rl e Rm são, cada um, independentemente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio e C1-6 alquila), e preferivelmente in- cluem íons de sódio, íons de potássio e íons de tetra-alquilamônio (por exemplo, íons de tetra-n-butilamônio). Rj, Rk, Rl e Rm são preferivel- mente os mesmos grupos selecionados de C1-6 alquila, e são preferi- velmente grupos n-butila.

[00160] Todos dos grupos R1, R2, R3, e R4 na fórmula (I), e R1a, R2a, R3a e R4a na fórmula (IIIc) são preferivelmente átomos de hidrogênio. Ambos Ra e Rb são preferivelmente átomos de hidrogênio.

[00161] O grupo R5 na fórmula (I) é preferivelmente acetila.

[00162] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) é com- posto substancialmente por unidades de repetição das fórmulas (I) e (IIIc). No derivado de ácido hialurônico, por exemplo, 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, de unidades de repetição de dissacarídeo consistindo de ácido D- glucurônico e N-acetilglucosamina contida no derivado são unidades de repetição da fórmula (I) ou (IIIc). Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico é composto apenas de unidades repetidas represen- tadas pela fórmula (I) e pela fórmula (IIIc).

[00163] Y definido na fórmula (I) pode ser, por exemplo, -(CH2)na- (em que na é selecionado a partir de números inteiros de 2 a 20, prefe- rivelmente 2 a 15, mais preferivelmente 2 a 12) e é preferivelmente -(CH2)2-, -(CH2)6-, -(CH2)8- ou -(CH2)12-, mais preferivelmente -(CH2)6-. Tal Y é preferido do ponto de vista da formação de precipitação e dis- persão estável mencionada posteriormente.

[00164] De acordo com um aspecto, no derivado de ácido hialurôni- co compreendendo uma unidade de repetição representada pela fór- mula (I), a taxa de introdução do grupo hidrofóbico em unidades de repetição de dissacarídeo presentes no derivado é, por exemplo, 1 a 50%, preferivelmente 7 a 50%, mais preferivelmente 17 a 50%, ainda mais preferivelmente 20 a 45%. Quando a taxa de introdução cai den- tro da faixa descrita acima, o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) pode formar eficientemente um complexo com o antígeno em uma solução.

[00165] Neste contexto, a taxa de introdução do grupo hidrofóbico é calculada de acordo com a seguinte expressão: [Expressão 1] (Taxa de in- (O número de unidades de repetição de dissaca- trodução do rídeo tendo um grupo hidrofóbico introduzido)  = grupo hidro- (O número de unidades de repetição de dissaca- 100 fóbico) rídeo apresentadas)

[00166] Neste contexto, as "unidades de repetição de dissacarídeo presentes no derivado" incluem uma unidade de repetição da fórmula (I), em que um grupo hidrofóbico é introduzido pela conversão de um grupo carboxila em um grupo amida e uma unidade de repetição da fórmula (IIIc) em que nenhum grupo hidrofóbico é introduzido. A taxa de introdução pode ser controlada por condições de reação, por exemplo, a razão de um reagente e pode ser determinada, por exem- plo, por medição de NMR.

[00167] O derivado de ácido hialurônico compreendendo uma uni- dade de repetição representada pela fórmula (I) é preferivelmente sin- tetizado usando ácido hialurônico composto apenas de uma unidade de repetição representada pela fórmula (IIIc) ou um derivado deste como um material de partida, em que quando todos de R1c, R2c, R3c, e R4c são todos átomos de hidrogênio, R5c é acetila, e Xc é -O-Na+, um peso molecular médio ponderal é, por exemplo, 1 kDa a 500 kDa, pre- ferivelmente 3 kDa a 500 kDa, mais preferivelmente 5 kDa a 200 kDa. Em um aspecto, o peso molecular médio ponderal do material de par- tida é preferivelmente 1 kDa a 1000 kDa, mais preferivelmente 3 kDa a 200 kDa, do ponto de vista da formação de complexo com o antígeno. O peso molecular médio ponderal do material de partida é preferivel- mente 1 kDa a 1000 kDa, mais preferivelmente 3 kDa a 500 kDa, ain- da mais preferivelmente 5 kDa a 200 kDa, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 150 kDa, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00168] Em geral, o ácido hialurônico e um derivado do mesmo são difíceis de obter como produtos individuais. Portanto, seus pesos mo- leculares são calculados como pesos moleculares médios numéricos ou pesos moleculares médios ponderais. Na presente invenção, é cal- culado um peso molecular médio ponderal. Vários métodos conheci- dos na técnica, por exemplo, um método de dispersão de luz, um mé- todo de pressão osmótica e um método de viscosidade, descritos em Seiichi Nakahama, et al., "Essential Polymer Science" (publicado por Kodansha Ltd., ISBN4-06- 153310-X) podem ser usados como méto- dos para medir o peso molecular médio ponderal. Um peso molecular médio de viscosidade no presente documento descrito também pode ser medido por um método geralmente usado no campo técnico ao qual a presente invenção pertence, tal como o uso de um viscosímetro Ubbelohde. No caso de usar um ácido hialurônico comercialmente dis- ponível e um derivado do mesmo tendo um peso molecular claramente especificado, o valor numérico claramente específico pode ser usado como um peso molecular.

[00169] No derivado de ácido hialurônico compreendendo uma uni- dade de repetição da fórmula (I), o grupo hidrofóbico é introduzido pela conversão de um grupo carboxila de ácido glucurônico como um dos sacarídeos do dissacarídeo que constituem a unidade de repetição em um grupo amida. A cinética in vivo de uma formulação a ser produzida usando o derivado de ácido hialurônico pode ser controlada ajustando o grau de modificação do derivado de ácido hialurônico.

[00170] Quando a taxa de modificação do grupo carboxila da por- ção de ácido glucurônico do derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição da fórmula (I) é alta, a ligação a um receptor de ácido hialurônico incluindo CD44 é suprimida de modo que o ácido hialurônico derivado serve como um transportador de fármaco (incluindo uma vacina) que permanece por muito tempo no corpo.

Além disso, cada órgão, incluindo linfonodo e células, pode ser direci- onado pela introdução de um elemento de direcionamento ao derivado de ácido hialurônico. Exemplos do elemento de direcionamento inclu- em peptídeos específicos de tecido alvo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, aptâmeros, peptídeos RGD contra células cancerígenas, ácido fólico, anisamida, transferrina, galactose para o fígado e tocofe- rol.

[00171] A taxa de modificação do grupo carboxila com o grupo hi- drofóbico, isto é, a taxa de introdução do grupo hidrofóbico, da fração de ácido glucurônico do derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição de fórmula (I) é preferivelmente 4 a 60%, mais preferivelmente 5 a 50%, ainda mais preferivelmente 7 a 50%, ainda mais preferivelmente 7 a 45%, do ponto de vista da formação de complexo com o antígeno. A taxa é preferivelmente 6 a 60%, mais pre- ferivelmente 17 a 50%, ainda mais preferivelmente 20 a 50%, ainda mais preferivelmente 20 a 45%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00172] A combinação do peso molecular do material de partida e a taxa de introdução do grupo hidrofóbico para o derivado de ácido hia- lurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) é preferivelmente 3 kDa a 500 kDa e 4 a 60%, mais preferi- velmente 3 kDa a 200 kDa e 6 a 50%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 200 kDa e 6 a 50%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 150 kDa e 6 a 45%, do ponto de vista da formação do complexo com o an- tígeno. A combinação é preferivelmente 3 kDa a 500 kDa e 4 a 60%, mais preferivelmente 3 kDa a 200 kDa e 6 a 50%, ainda mais preferi- velmente 5 kDa a 200 kDa e 6 a 50%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 150 kDa e 20 a 45%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo. A combinação é preferivelmente 3 kDa a 200 kDa e 4 a 60%, mais preferivelmente 3 kDa a 200 kDa e 6 a 50%,

ainda mais preferivelmente 5 kDa a 200 kDa e 6 a 50%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 150 kDa e 17 a 45%, do ponto de vista de dispersão estável. A combinação é preferivelmente 5 kDa a 27 kDa e 2 a 50%, mais preferivelmente 5 kDa a 27 kDa e 8 a 35%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 18 kDa e 8 a 35%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 18 kDa e 8 a 35%, ainda preferivelmente 5 kDa a 18 kDa e 15 a 22%, do ponto de vista da melhoria na retenção no sangue. A com- binação é preferivelmente 5 kDa a 300 kDa e 2 a 30%, mais preferi- velmente 5 kDa a 50 kDa e 2 a 22%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 27 kDa e 2 a 22%, ainda mais preferivelmente 5 kDa a 27 kDa e 7 a 22%, do ponto de vista da gelificação.

[00173] Derivado de ácido hialurônico compreendendo unidade de repetição representada pela fórmula (II)

[00174] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) é composto substancialmente por (1) uma unidade de repetição da fór- mula (II); (2) unidades de repetição da fórmula (II) e da fórmula (III); (3) unidades de repetição da fórmula (II) e da fórmula (IIIc); ou (4) unida- des de repetição da fórmula (II), da fórmula (III) e da fórmula (IIIc). No derivado de ácido hialurônico, por exemplo, 80% ou mais, preferivel- mente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, de unidades de repetição de dissacarídeo consistindo de ácido D-glucurônico e N- acetilglucosamina contida no derivado são unidades de repetição da fórmula (II), (III) ou (IIIc). Em um aspecto, o derivado de ácido hialurô- nico é composto apenas por (1) uma unidade de repetição da fórmula (II); (2) unidades de repetição da fórmula (II) e da fórmula (III); (3) uni- dades de repetição da fórmula (II) e da fórmula (IIIc); ou (4) unidades de repetição da fórmula (II), da fórmula (III) e da fórmula (IIIc).

[00175] A razão de uma unidade de dissacarídeo particular para unidades de repetição de dissacarídeo presentes no derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) significa a razão da unidade de dissacarídeo particular para todas as unidades de dissacarídeo contidas em uma determinada quantidade de derivado de ácido hialurônico compreendendo uma uni- dade de repetição representada pela fórmula (II), que é um polissaca- rídeo tendo unidades de dissacarídeo como unidades de repetição.

[00176] Na fórmula (II) que representa uma unidade de dissacarí- deo contida no derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), todos de R1a, R2a, R3a, e R4a são preferivelmente átomos de hidrogênio. R5a é preferivel- mente um átomo de hidrogênio ou alquilcarbono C1-6, mais preferivel- mente um átomo de hidrogênio ou acetila, ainda mais preferivelmente acetila. Nas fórmulas (III) e (IIIc) que representam unidades de dissa- carídeo contidas no derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), todos de R1b, R2b, R3b e R4b, e R1c, R2c, R3c e R4c são preferivelmente átomos de hi- drogênio. Cada um de R5b e R5c é preferivelmente um átomo de hidro- gênio ou C1-6 alquilcarbono, mais preferivelmente um átomo de hidro- gênio ou acetila. Ainda mais preferivelmente, ambas essas porções são acetila.

[00177] Exemplos específicos de Raa na fórmula (II) incluem um átomo de hidrogênio, metila, hidroximetila, 1-hidroxietila, carbamoilme- tila, carboximetila, 1-metilpropila, 2-metilpropila, isopropila, 2- carboxietila, 2-metiltioetila, 2-carbamoiletila, fenilmetila, (4- hidroxife- nil)metila e indol-3-ilmetila.

[00178] Quando o grupo -CHRaa- serve como centro assimétrico, respectivos isômeros ópticos e suas misturas também estão incluídos no mesmo. H2N-CHRaa-COOH (aminoácido) preferivelmente forma uma configuração L (natural).

[00179] Na fórmula (II), R6a, R7, R8, e R9 são cada um independen-

temente, por exemplo, um átomo de hidrogênio ou metila. Preferivel- mente, todas essas porções são átomos de hidrogênio.

[00180] A forma do grupo -CHRaa-CO-X1a na fórmula (II) é, por exemplo, um grupo -CHRaa-COOH. Exemplos específicos do grupo incluem os seguintes grupos. [Fórmula 6] 図

[00181] Neste contexto, cada asterisco representa uma posição de ligação para -NR6a- (o mesmo vale para a descrição abaixo).

[00182] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-COOH incluem os seguintes grupos. [Fórmula 7] 図

[00183] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-COOH incluem os seguintes grupos. [Fórmula 8]

図

[00184] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-COOH incluem os seguintes grupos. [Fórmula 9] 図

[00185] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-COOH incluem os seguintes grupos. [Fórmula 10] 図

[00186] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-COOH incluem os seguintes grupos do ponto de vista da liberação do complexo ao linfo- nodo. [Fórmula 11]

[00187] Mais exemplos preferidos do mesmo incluem os seguintes grupos. [Fórmula 12]

[00188] Ainda mais exemplos preferidos do mesmo incluem os se- guintes grupos. [Fórmula 13]

[00189] Todos os grupos -CHRaa-COOH mencionados acima po- dem ser convertidos parcial ou totalmente em um grupo -CHRaa- CONH-Z1-Z2. Exemplos do grupo -Z1-Z2 são como mencionados poste- riormente.

[00190] Outra forma do grupo -CHRaa-CO-X1a na fórmula (II) é, por exemplo, um grupo -CHRaa-CONH2. Exemplos específicos do grupo incluem os seguintes grupos. [Fórmula 14] 図

OH CONH2 CONH2 CONH2 CONH2 CONH2 HO H2NOC * * * * * CONH2 CONH2 CONH2 CONH2 HO2C * * * * HO2C CONH2 S CONH2 H2NOC CONH2 * * * CONH2 CONH2 CONH2 * HO * N *

H

[00191] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 15]

図

[00192] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 16] 図

[00193] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 17] 図

[00194] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 18]

図

[00195] Estes grupos também são grupos preferidos pelo fato de possuírem características de biodegradabilidade e retenção no san- gue.

[00196] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 também in- cluem os seguintes grupos do ponto de vista de ter características de biodegradabilidade e retenção no sangue. [Fórmula 19] 図

[00197] Mais exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 também incluem os seguintes grupos do ponto de vista de ter características de biodegradabilidade e retenção no sangue. [Fórmula 20] 図

[00198] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem os seguintes grupos do ponto de vista da dispersibilidade mais adequada em água pura. [Fórmula 21]

図

[00199] Estes dois grupos também são exemplos preferidos do pon- to de vista de um material de base para uma formulação de injeção para administração subcutânea contínua.

[00200] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH2 incluem o seguinte grupo do ponto de vista de um material de base para uma formulação de injeção para administração subcutânea contínua. [Fórmula 22] 図

[00201] R7 é mais preferivelmente um átomo de hidrogênio ou meti- la, ainda mais preferivelmente um átomo de hidrogênio.

[00202] O carbóxi definido nas fórmulas (II), (III) e (IIIc) pode formar um sal representado pela fórmula -COO-Q+. Neste contexto, Q+ não é particularmente limitado, desde que Q+ seja um contra-cátion que for- ma um sal com carbóxi em água. Q+ divalente ou de valência superior forma um sal com uma pluralidade de grupos carbóxi de acordo com a valência. Exemplos do contra-cátion incluem: íons metálicos, tal como íons de lítio, íons de sódio, íons de rubídio, íons de césio, íons de magnésio e íons de cálcio; e íons de amônio representados pela fór- mula: N+RjRkRlRm (em que Rj, Rk, Rl e Rm são, cada um, independen- temente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio e C1-6 alqui- la), e preferivelmente incluem íons de sódio, íons de potássio e íons tetra-alquil-lamônio (por exemplo, íons tetra-n-butilamônio). Rj, Rk, Rl e Rm são preferivelmente os mesmos grupos selecionados de C1-6 alqui- la, e são preferivelmente grupos n-butila.

[00203] Uma forma alternativa do grupo -CHRaa-CO-X1a na fórmula (II) é, por exemplo, um grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2. Exemplos específi-

cos do grupo incluem os seguintes grupos. [Fórmula 23] 図

[00204] Outros exemplos específicos do grupo incluem os seguin- tes grupos. [Fórmula 24] 図

[00205] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 25] 図

[00206] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 26] 図

[00207] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2 incluem os seguintes grupos. [Fórmula 27] 図

[00208] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2 incluem os seguintes grupos do ponto de vista da liberação do complexo ao linfonodo. [Fórmula 28]

[00209] Mais exemplos preferidos do grupo incluem os seguintes grupos. [Fórmula 29]

[00210] Ainda mais exemplos preferidos do mesmo incluem os se- guintes grupos. [Fórmula 30]

[00211] Exemplos preferidos do grupo -CHRaa-CONH-Z1-Z2 incluem os seguintes grupos do ponto de vista de ter características de biode- gradabilidade e retenção no sangue. [Fórmula 31] 図

[00212] Exemplos do grupo -Z1-Z2 incluem um grupo -(C2-10 alqui- leno)-NH-COO-Z3. Exemplos do mesmo também incluem um grupo - (C2-12 alquileno)-NH-COO-Z3. Neste contexto, exemplos do C2-12 alqui- leno preferivelmente incluem -(CH2)2-, -(CH2)6-, -(CH2)8-, -(CH2)10- e - (CH2)12- e mais preferivelmente incluem -(CH2)2- e -(CH2)6-. Exemplos do grupo -Z1-Z2 incluem um grupo -(CH2CH2O)ma-CH2CH2-NH-Z3. Nes- te contexto, ma é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 3. Exemplos específicos de ma preferi- dos incluem 2. Exemplos do grupo -Z1-Z2 preferivelmente incluem um grupo -(hexano-1,6-di-il)-NH-COO-Z3, um grupo -(etano-1,2-di-il)-NH- COO-Z3 e um grupo -(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-Z3, mais preferivelmen- te inclui um grupo -(hexano-1,6-di-il)-NH-COO-colesterila, um grupo - (etano-1,2-di-il)-NH-COO-colesterila e um grupo -(CH2CH2O)2- CH2CH2-NH- colanoila, e ainda mais preferivelmente inclui um grupo - (hexano-1,6-di-il)-NH-COO-colesterila. Exemplos de Z1, Z2, e do grupo -Z1-Z2 também incluem aqueles que correspondem a Y, X1, e o grupo - Y-X1, respectivamente, no derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I). Exem- plos do grupo -CO-NRca-Z3 e do grupo -O-CO-NRca-Z3 incluem os res- pectivos grupos em que Rca é um átomo de hidrogênio.

[00213] Em um aspecto, no derivado de ácido hialurônico compre-

endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), o grupo X1a é -NR9-Z1-Z2, R9 é um átomo de hidrogênio, Z1 é, por exem- plo, C2-12 alquileno, preferivelmente C2-6 alquileno, mais preferivelmen- te C6 alquileno, Z2 é -NRba-COO-Z3, Rba é um átomo de hidrogênio, e Z3 é um grupo esterila; e o grupo Raa é um átomo de hidrogênio, ou C1- 6 alquila, em que o alquila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de hidróxi, carbóxi, carbamoila, C1-6 alquiltio, arila e heteroarila, em que o arila é opcionalmente substituído por um ou mais grupos hidróxi.

[00214] Exemplos específicos do grupo Raa preferivelmente incluem metila, hidroximetila, um átomo de hidrogênio, 1-hidroxietila, carba- moilmetila, carboximetila, benzila, (4-hidroxifenil)metila, 1-metilpropila, 2-metilpropila, isopropila, indol-3-ilmetila, 2-carbamoletila e 2- carboxietila, mais preferivelmente inclui metila, hidroximetila, 1- hidroxietila, 1-metilpropila e 2-carbamoiletila, ainda mais preferivelmen- te inclui metila e 2-carbamoletila, do ponto de vista da liberação do complexo ao linfonodo.

[00215] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) prefe- rivelmente também compreende uma unidade de repetição represen- tada pela fórmula (III). Em um aspecto mais preferido, X1a na fómula (II) e X2 na fórmula (III) são os mesmos. Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição represen- tada pela fórmula (II) pode compreender uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), uma unidade de repetição representada pela fórmula (III) e uma unidade de repetição representada pela fórmu- la (IIIc), em que X1a é -NR9-Z1-Z2.

[00216] De acordo com um outro aspecto alternativo, no derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição repre- sentada pela fórmula (II), a relação da unidade de repetição da fórmula

(II) e/ou da fórmula (III) tendo um grupo -NR9-Z1-Z2 (doravante, tam- bém referido como um grupo hidrofóbico) às unidades de repetição de dissacarídeo presentes (taxa de introdução do grupo hidrofóbico) pode ser de 3 a 50%.

[00217] Neste contexto, a taxa de introdução do grupo hidrofóbico é calculada de acordo com a seguinte expressão: [Expressão 2] (O número de unidades de repetição de dissacarídeo ten- (Taxa de intro- do um grupo hidrofóbico introduzido) dução do grupo = 100 (O número de unidades de repetição de dissacarídeo hidrofóbico) apresentadas)

[00218] Neste contexto, as "unidades de repetição de dissacarídeo presentes no derivado" incluem unidades de repetição da fórmula (II) e da fórmula (III), e uma unidade de repetição da fórmula (IIIc). A taxa de introdução pode ser controlada por condições de reação, por exemplo, a razão de um reagente e pode ser determinada, por exemplo, por medição de NMR.

[00219] A taxa de introdução do grupo hidrofóbico no derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição represen- tada pela fórmula (II) é, por exemplo, 3 a 50%, preferivelmente 5 a 40%, mais preferivelmente 5 a 35%, ainda mais preferivelmente 5 a 25%, ainda mais preferivelmente 5 a 20%, ainda mais preferivelmente 5 a 10%. A taxa é preferivelmente de 3 a 60%, mais preferivelmente 7 a 50%, ainda mais preferivelmente 18 a 45%, ainda mais preferivel- mente 20 a 35%, do ponto de vista da formação do complexo com o antígeno. A taxa é preferivelmente 3 a 60%, mais preferivelmente 7 a 50%, ainda mais preferivelmente 18 a 45%, ainda mais preferivelmen- te 20 a 35%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00220] Em um aspecto, no derivado de ácido hialurônico compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), X1a na fórmula (II) é -NR9-Z1-Z2. Neste caso, a relação da unidade de dis- sacarídeo da fórmula (II) para unidades de repetição de dissacarídeo presentes no derivado de ácido hialurônico é, por exemplo, 70% ou mais, preferivelmente 75% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, de o ponto de vista de ter características de biodegradabilidade e retenção no sangue. O limite superior pode ser 100% ou menos. A faixa da relação é, por exemplo, 70 a 100%, preferivelmente 75 a 100%, mais preferivelmente 90 a 100%. A relação é, por exemplo, 10% ou mais, preferivelmente 20% ou mais, mais preferivelmente 50% ou mais, ainda mais preferivelmente 70% ou mais, ainda mais preferi- velmente 90% ou mais, do ponto de vista de ter características de for- mação de complexo com o antígeno. O limite superior pode ser 100% ou menos. A faixa da relação é, por exemplo, de 10 a 100%, preferi- velmente 20 a 100%, mais preferivelmente 50 a 100%, ainda mais pre- ferivelmente 70 a 100%, ainda mais preferivelmente 90 a 100%. A re- lação é, por exemplo, 10% ou mais, preferivelmente 20% ou mais, mais preferivelmente 50% ou mais, ainda mais preferivelmente 70% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, do ponto de vista de ter características de transferência do complexo para o linfonodo. O limite superior pode ser 100% ou menos. A faixa da relação é, por exemplo, de 10 a 100%, preferivelmente 20 a 100%, mais preferivel- mente 50 a 100%, ainda mais preferivelmente 70 a 100%, ainda mais preferivelmente 90 a 100%. O derivado de ácido hialurônico compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) po- de compreender ainda uma unidade de repetição representada pela fórmula (III).

[00221] Em um aspecto, o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) não compreende uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), em que X1 é -NR9-Z1-Z2. Neste caso, a soma da relação da unidade de repetição representada pela fórmula (II) e a relação da unidade de re- petição representada pela fórmula (III) para as unidades de repetição de dissacarídeo presentes é, por exemplo, 70 a 100%, preferivelmente 80 a 100%, mais preferivelmente 90 a 100%. A soma é, por exemplo, 7 a 100%, preferivelmente 20 a 100%, mais preferivelmente 30 a 100%, do ponto de vista da formação do complexo com o antígeno. A soma é, por exemplo, 20 a 100%, preferivelmente 30 a 100%, mais preferivelmente 70 a 100%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00222] Neste contexto, no derivado de ácido hialurônico compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), a relação da unidade de repetição representada pela fórmula (III) para as unidades de repetição de dissacarídeo presentes é preferivelmente de 3 a 50%, mais preferivelmente 5 a 40%, ainda mais preferivelmente 5 a 35%, ainda mais preferivelmente 5 a 25%, ainda mais preferivel- mente 5 a 20%, ainda mais preferivelmente 5 a 10%. A relação é pre- ferivelmente de 3 a 60%, mais preferivelmente 7 a 50%, ainda mais preferivelmente 18 a 45%, ainda mais preferivelmente 20 a 35%, do ponto de vista da formação do complexo com o antígeno. A proporção é preferivelmente de 3 a 60%, mais preferivelmente de 7 a 50%, ainda mais preferivelmente de 18 a 45%, ainda mais preferivelmente de 20 a 35%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00223] No derivado de ácido hialurônico compreendendo uma uni- dade de repetição representada pela fórmula (II), a relação da unidade de repetição representada pela fórmula (II) para as unidades de repeti- ção de dissacarídeo presentes é preferivelmente 20 a 97%, mais pre- ferivelmente 30 a 95 %, ainda mais preferivelmente 35 a 95%, ainda mais preferivelmente 45 a 95%, ainda mais preferivelmente 50 a 95%, ainda mais preferivelmente 60 a 95%. A relação é, por exemplo, 7 a 100%, preferivelmente 20 a 100%, mais preferivelmente 30 a 100%,

do ponto de vista da formação do complexo com o antígeno. A relação é, por exemplo, de 20 a 100%, preferivelmente de 30 a 100%, mais preferivelmente de 70 a 100%, do ponto de vista da transferência do complexo para o linfonodo.

[00224] Exemplos dos métodos para produzir o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) e o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) incluem métodos descritos nas Publicações Internacionais Nos. WO 2010/053140 e WO 2014/038641.

[00225] De acordo com um aspecto, uma característica do derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição repre- sentada pela fórmula (I) ou o derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) é que o derivado de ácido hialurônico forma uma partícula fina por associa- ção em água. Considera-se que a associação espontânea ocorre na água através da interação hidrofóbica do grupo hidrofóbico introduzido de modo que uma partícula fina é formada, embora o evento não seja particularmente limitado a isso. Explorando tais características, o deri- vado de ácido hialurônico pode ser usado como um transportador para uma vacina, um transportador de liberação de linfonodo, um transpor- tador de liberação sustentada no sangue ou um transportador de dire- cionamento. O tamanho de partícula da partícula fina não é particular- mente limitado e é, por exemplo, 1 m ou menor, preferivelmente 500 nm ou menor, mais preferivelmente 200 nm ou menor, ainda mais pre- ferivelmente 100 nm ou menor, ainda mais preferivelmente 50 nm ou menor. Exemplos dos métodos para formar as partículas finas do deri- vado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) e o derivado de ácido hialurônico com- preendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II)

incluem métodos descritos nas Publicações Internacionais Nos. WO 2010/053140 e WO 2014/038641.

[00226] O ácido hialurônico ou um sal do mesmo ou um derivado do mesmo pode ser usado como um material de partida para a produ- ção do derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) e o derivado de ácido hialurô- nico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II). Exemplos do sal de ácido hialurônico podem incluir sais de metais alcalinos, tais como sais de sódio, sais de potássio e sais de lítio. O sal é particularmente preferível um sal de sódio que é frequen- temente utilizado como medicamento. O ácido hialurônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser produzido pelo uso de vários métodos conhecidos na técnica, tal como um método de ob- tenção de extratos derivados de organismos de crista de galo, sob a pele de suíno, etc., e um método de fermentação biológica, ou pode ser obtido através da compra de um produto disponível comercialmen- te (por exemplo, de Denka Co., Ltd., Shiseido Co., Ltd., Seikagaku Corp. e R&D Systems, Inc.).

[00227] O antígeno no complexo formado com a partícula fina do derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repeti- ção representada pela fórmula (I) ou o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) pode ser liberado do complexo pela degradação ou rompimento da partícula fina do derivado do ácido hialurônico e a substituição do antí- geno por um biocomponente como a albumina, após a administração. A velocidade desta liberação pode ser controlada pela taxa de introdu- ção do grupo hidrofóbico, peso molecular ou taxa de introdução de aminoácidos do derivado de ácido hialurônico. A velocidade de libera- ção do antígeno pode ser controlada pela reticulação química e gelifi- cação do derivado de ácido hialurônico de acordo com um método descrito na Publicação Internacional No. WO 2010/053140. Além dis- so, a velocidade de liberação do antígeno pode ser controlada pela conjugação do derivado de ácido hialurônico com o antígeno de acor- do com um método descrito na Publicação Internacional No. WO 2010/053140. Antígeno

[00228] Exemplos do antígeno que é usado para a produção de uma formulação de vacina através da formação de um complexo com o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repe- tição representada pela fórmula (I) ou o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) incluem peptídeos antigênicos e proteínas antigênicas, e DNA e mRNA que codificam qualquer uma dessas sequências de antígenos. O antígeno é preferivelmente um peptídeo antigênico ou uma proteína antigênica, mais preferivelmente um peptídeo antigênico.

[00229] O antígeno pode ser um antígeno de câncer. O antígeno de câncer é um antígeno frequentemente expresso em células canceríge- nas e, em alguns casos, é expresso apenas por células cancerígenas. O antígeno de câncer pode ser expresso dentro das células cancerí- genas ou na superfície das células cancerígenas.

[00230] A proteína antigênica que pode ser usada na presente in- venção pode ser selecionada a partir de, mas não limitada a, MART- 1/Melan-A, gp100, proteína de ligação à adenosina desaminase (ADAbp), FAP, ciclofilina b, antígeno colorretal associado (CRC) - C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionário (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, antígeno específico da próstata (PSA), P SA-1, PSA-2, PSA-3, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), recep- tor de células T/cadeia CD3-zeta, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-

B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8 and GAGE- 9, BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, -fetoproteína, E- caderina, -catenina, -catenina, -catenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína coli adenomatosa polipose (APC), fodrina, conexina 37, idiotipo Ig, p15, gp75, gangliosídeo GM2, gangliosídeo GD2, proteína do papilomavírus humano, antígeno tumo- ral família Smad, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA ) -1, glicogênio fosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL- 40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, CD20 e c-erbB-2.

[00231] A sequência completa da proteína antigênica pode ser usa- da, ou uma sequência da mesma tendo uma deleção parcial pode ser usada.

[00232] O peptídeo antigênico é um peptídeo antigênico compreen- dendo um ou mais epítopos de reconhecimento de células T citotóxi- cas CD8-positivas e/ou epítopos de reconhecimento de células T auxi- liares CD4-positivas nas sequências de proteínas antigênicas. Em um aspecto, o peptídeo antigênico é um peptídeo antigênico que compre- ende preferivelmente dois ou mais epítopos do ponto de vista de ser carregado em uma molécula de MHC de classe I ou uma molécula de MHC de classe II através da degradação em células apresentadoras de antígeno. Especificamente, os exemplos do peptídeo antigênico incluem peptídeos antigênicos compreendendo epítopos de proteína antigênica de células tumorais.

[00233] Em um aspecto, o peptídeo antigênico tem, por exemplo, 8 a 120 aminoácidos, preferivelmente 8 a 80 aminoácidos, mais preferi- velmente 15 a 80 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 16 a 80 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 23 a 80 aminoácidos, ainda preferivelmente 23 a 60 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 23 a 50 aminoácidos.

[00234] Em um aspecto, o peptídeo antigênico é um peptídeo anti- gênico compreendendo um ou mais de cada um dos epítopos de reco- nhecimento de células T citotóxicas positivas para CD8 e epítopos de reconhecimento de células T auxiliares positivas para CD4 do ponto de vista de induzir a ativação de células T citotóxicas (CTL ) por células T auxiliares.

[00235] Em um aspecto, quando dois ou mais epítopos estão conti- dos, um ligante de aminoácido pode ser disposto entre os epítopos. O ligante tem, por exemplo, 2 a 10 aminoácidos, preferivelmente 4 a 10 aminoácidos, mais preferivelmente 4 a 8 aminoácidos. Exemplos de aminoácidos para uso no ligante incluem glicina (G), tirosina (Y), leuci- na (L) e triptofano (W). Os aminoácidos são preferivelmente tirosina (Y), leucina (L) ou triptofano (W). Exemplos específicos do ligante de aminoácido incluem -YYYY- (4Y), -LLLL- (4L), -WWWW- (4W), -GGGGGG- (6G), -YYYYYY- (6Y), -LLLLLL- (6L), -WWWWWW- (6W), -YYYYYYYY- (8Y), -LLLLLLLL- (8L) e -WWWWWWWW- (8W). 6Y, 6L e 6W são preferidos. Complexo

[00236] O complexo de um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido e um antígeno de acordo com a presente invenção pode ser produzido pela mistura de um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) com um antí- geno em uma solução apropriada. Exemplos da solução usada inclu- em água, solução salina, várias soluções tampão, soluções de açúcar, DMSO, etanol, DMF e suas combinações. A substituição do solvente ou da solução tampão pode ser realizada por um método tal como a diálise.

[00237] O complexo da presente invenção pode ser produzido, por exemplo, pela mistura de uma partícula fina de um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada por a fórmula (II) com um an- tígeno. A partícula fina do derivado de ácido hialurônico e o antígeno formam um complexo, que pode ser usado como o complexo do deri- vado de ácido hialurônico e o antígeno, embora o evento não seja par- ticularmente limitado a ele. Alternativamente, o complexo do derivado de ácido hialurônico e o antígeno pode ser formado encerrando o antí- geno na partícula fina do derivado de ácido hialurônico. O complexo inclui o antígeno encerrado na partícula fina do derivado de ácido hia- lurônico. No anticorpo nele contido, o antígeno é revestido com o deri- vado de ácido hialurônico.

[00238] Exemplos do método de formação de complexo incluem um método de adição de uma solução de antígeno a uma partícula fina formada antecipadamente, de um derivado de ácido hialurônico com- preendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I) ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representado pela fórmula (II). Neste método, a partícula fina formada do derivado de ácido hialurônico e o antígeno forma um com- plexo por meio de interação, como interação hidrofóbica, interação ele- trostática ou ligação de hidrogênio. A interação ocorre na superfície da partícula fina ou no interior da partícula fina. Condições como um sol- vente, uma concentração de sal, pH, uma temperatura, um tempo e a adição de um desnaturante não são particularmente limitadas e podem ser apropriadamente selecionadas de modo que o antígeno forme um complexo de forma estável com altos rendimentos. Dependendo, por exemplo, de uma concentração de sal ou pH no momento da formação do complexo, o grau de intumescimento ou densidade da partícula fina do derivado de ácido hialurônico varia, e o estado de ionização do an- tígeno também varia. Portanto, as condições adequadas podem ser utilizadas apropriadamente de acordo com uma combinação das mesmas. Quando o complexo é formado sob uma baixa concentração de sal, uma densidade de partícula fina pode ser diminuída e a quanti- dade do complexo formado pode ser aumentada através do uso de repulsão eletrostática entre grupos carboxila de derivados de ácido hialurônico, ou um complexo com um antígeno de alto peso molecular pode ser formado. Após a formação do complexo, a repulsão eletrostá- tica é enfraquecida pela elevação da concentração de sal. A densida- de de partículas finas é, portanto, elevada de modo que as redes de gel são menores do que o tamanho do antígeno. Como resultado, o antígeno é firmemente retido e sua liberação pode ser retardada. A este respeito, a concentração de sal pode ser ajustada para uma con- centração de sal fisiológico. A irradiação ultrassônica pode ser realiza- da usando um homogeneizador ultrassônico ou um aparelho de irradi- ação ultrassônica focado em um único ponto para miniaturização ou uniformização de tamanho. A irradiação ultrassônica pode ser realiza- da após a mistura do derivado de ácido hialurônico com o antígeno ou pode ser realizada apenas no derivado de ácido hialurônico. Antígenos não complexados livres podem ser separados e removidos por um mé- todo de diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[00239] Em outro método de formação de complexo, o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição represen- tada pela fórmula (I) ou o derivado de ácido hialurônico compreenden- do uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) pode ser dissolvido em um solvente orgânico polar aprótico tal como DMSO ou DMF e misturado com o antígeno, seguido por substituição com água, uma solução aquosa de sal ou qualquer uma das várias soluções aquosas de soluções tampão para realizar a formação de partículas finas e a formação de complexos ao mesmo tempo.

A substituição po- de ser realizada, por exemplo, por diálise.

A irradiação ultrassônica pode ser realizada usando um homogeneizador ultrassônico ou um aparelho de irradiação ultrassônica focado em um único ponto para miniaturização ou uniformização de tamanho.

A irradiação ultrassônica pode ser realizada após a mistura do derivado de ácido hialurônico com o antígeno ou pode ser realizada apenas no derivado de ácido hialurônico.

Além disso, a irradiação ultrassônica pode ser realizada antes ou após a diálise.

O antígeno complexado com o derivado de ácido hialurônico por este método tem menos probabilidade de ser li- berado do complexo.

Condições para misturar o derivado de ácido hia- lurônico com o antígeno, como uma espécie de solvente, uma concen- tração de sal, pH, uma temperatura, um tempo, a adição de um desna- turante, uma concentração de derivado de ácido hialurônico, uma con- centração de antígeno e a relação entre o derivado de ácido hialurôni- co e o antígeno não são particularmente limitados e podem ser seleci- onados de forma apropriada de modo que o antígeno forme um com- plexo de forma estável com rendimentos elevados.

Condições para substituição com água, uma solução aquosa de sal ou qualquer uma das várias soluções aquosas de soluções tampão, tal como uma espé- cie de solvente, uma concentração de sal, pH, uma temperatura, um tempo, o número de execuções, a presença ou ausência de adição de um desnaturante, uma concentração de derivado de ácido hialurônico, uma concentração de antígeno e a razão entre o derivado de ácido hialurônico e o antígeno não são particularmente limitados e podem ser selecionados apropriadamente de modo que o antígeno forme um complexo de forma estável com rendimentos elevados.

O tamanho das partículas finas também é obtido conforme pretendido, selecionando apropriadamente essas condições.

Antígenos não complexados livres podem ser separados e removidos por um método de diálise ou cro- matografia de exclusão de tamanho (SEC).

[00240] Quando o complexo é uma partícula, seu tamanho de partí- cula não é particularmente limitado e é, por exemplo, 20 a 200 nm, preferivelmente 20 a 100 nm, mais preferivelmente 20 a 50 nm, do ponto de vista da transferência ao linfonodo. Formulação de vacina

[00241] O complexo pode ser usado para produzir a formulação de vacina da presente invenção, especificamente, uma formulação de va- cina para uso na prevenção e/ou tratamento de um câncer.

[00242] A formulação de vacina da presente invenção pode ser ad- ministrada por via oral, extraintestinal, intranasal, intravaginal, intraocu- lar, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intracutânea, intraperito- neal, cavidade articular, intracerebral ou intraoral. Preferivelmente, a formulação da vacina pode ser administrada por via subcutânea, in- tramuscular, intravenosa ou intracutânea.

[00243] A formulação de vacina da presente invenção pode ser ad- ministrada como uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como diluente, um agente umectante, um emulsificante, um dispersante, um auxiliar, um antisséptico, um tampão, um aglutinante, e/ou um estabilizante, em qualquer forma apropriada de acordo com uma via de administração pretendida. A via de administração pode ser uma via parenteral ou po- de ser uma via oral.

[00244] A formulação de vacina da presente invenção pode ser ad- ministrada em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante. O adjuvante usado pode ser uma substância que tem um efeito de po- tencializar a atividade de células apresentadoras de antígeno e é mais especificamente selecionado a partir de uma substância que ativa um receptor imune inato (receptor de reconhecimento de padrão) e outras substâncias estimulantes de células apresentadoras de antígeno e uma substância tendo um efeito de inibir a aquisição de atividade imu- nossupressora por células apresentadoras de antígeno. O receptor imune inato é classificado em receptor tipo Toll (TLR), receptor de lec- tina tipo C (CLR), receptor tipo NOD (NLR), receptor tipo RIG-I (RLR) e sensor de DNA citoplasmático. O adjuvante que é um agonista do re- ceptor imune inato pode ser selecionado a partir de células microbia- nas inativadas, um extrato de célula microbiana, um ácido nucleico, um lipopolissacarídeo, um lipopeptídeo, um composto sintético de bai- xo peso molecular e semelhantes. Preferivelmente, oligo DNA CpG, RNA poliIC, imidazoquinolina (por exemplo, R848 e imiquimode), sa- ponina (por exemplo, QuilA e QS21), um agonista STING (por exem- plo, di-GMP cíclico), monofosforil lipídeo, um lipopeptídeo ou seme- lhante é usado. Um fármaco taxano ou um fármaco antraciclina pode ser usado como o adjuvante que é um agente estimulador de células apresentador de antígeno. O adjuvante que é um agente que tem um efeito de inibir a aquisição de atividade imunossupressora por células apresentadoras de antígeno é selecionado a partir de uma substância que inibe JAK/STAT, uma substância que inibe a indol dioxigenase (IDO), uma substância que inibe a triptofano dioxigenase (TDO), e se- melhantes. Estas substâncias inibidoras incluem compostos com um efeito antagonista sobre os fatores, bem como anticorpos neutralizan- tes, RNA de interferência pequeno (siRNA) e DNA antisenso contra os fatores.

[00245] O adjuvante que é usado para a formulação de vacina da presente invenção é preferivelmente um adjuvante que é um agonista do receptor imune inato, mais preferivelmente um agonista do receptor tipo Toll (TLR) ou sensor de DNA citoplasmático. O agonista de TLR é preferivelmente oligo DNA CpG, RNA poliIC, imidazoquinolina, tal co- mo R848 ou imiquimode, saponina, tal como QuilA ou QS21, um ago-

nista STING ou monofosforil lipídeo.

[00246] O adjuvante e a formulação da vacina podem ser adminis- trados como formulações separadas ou podem ser administrados co- mo uma formulação. O adjuvante pode ser conjugado, para uso, com o derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repeti- ção representada pela fórmula (I) por um método descrito na Publica- ção Internacional No. WO 2010/053140. Para administração em com- binação, a quantidade da formulação de vacina da presente invenção administrada é, por exemplo, 0,01 a 100 mg/dose, preferivelmente 0,1 a 50 mg/dose, mais preferivelmente, por exemplo, 0,1 a 20 mg/dose, e a quantidade de adjuvante administrada é, por exemplo, 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg de peso cor- poral, mais preferivelmente 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal. O adju- vante pode ser administrado ao mesmo tempo que na formulação da vacina da presente invenção (incluindo o caso em que o adjuvante es- tá contido na formulação da vacina), ou o adjuvante e a formulação da vacina podem ser administrados em tempos diferentes. Para adminis- tração em tempos diferentes, preferivelmente, um do adjuvante e a formulação da vacina são administrados, e o outro é administrado, por exemplo, dentro de 1 minuto a 5 horas, preferivelmente dentro de 1 minuto a 1 hora, a partir de então.

[00247] A formulação de vacina da presente invenção pode ser administrada em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo para o uso no tratamento de câncer. O anticorpo é, por exemplo, um anticorpo inibindo um sinal imunossupressor de tumor, ou pelo menos um tipo de anticorpo ativando um sinal coestimulatório de imunócitos, preferivelmente um anticorpo inibindo um sinal imunossupressor de tumor ou um anticorpo ativando um sinal coestimulatório de imunóci- tos. Especificamente, o anticorpo é pelo menos um tipo de anticorpo selecionado de um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PDL1, um anticorpo anti-OX40, e um anticorpo anti-4- 1BB. Para administração em combinação, a quantidade da Formula- ção de vacina da presente invenção administrada é, por exemplo, de 0,01 a 100 mg/dose, preferivelmentede 0,1 a 50 mg/dose, mais prefe- rivelmentede 0,1 a 20 mg/dose, e uma quantidade do anticorpo admi- nistrado é, por exemplo, de 0,01 a 200 mg/kg de peso corporal, prefe- rivelmentede 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal, mais preferivelmente- de 1 a 40 mg/kg de peso corporal. O anticorpo pode ser administrado ao mesmo tempo como na Formulação de vacina da presente inven- ção (incluindo o caso onde o anticorpo está contido na Formulação de vacina) ou no anticorpo e a Formulação de vacina pode ser adminis- trada em momentos diferentes. Para administração em momentos dife- rentes, preferivelmente, um dos anticorpos e a Formulação de vacina são administrados, e o outro é administrado, por exemplo, dentro de 1 minuto a 24 horas, preferivelmentedentro de 1 minuto a 5 horas, de- pois disso.

[00248] A Formulação de vacina da presente invenção pode ser administrada em combinação com o adjuvante e o anticorpo. Neste caso, a quantidade da Formulação de vacina da presente invenção administradaé, por exemplo, de 0,01 a 100 mg/dose, preferivelmente- de 0,1a 50 mg/dose, mais preferivelmente, por exemplo, de 0,1a 20 mg/dose,uma quantidade do adjuvante administrado é, por exemplo, de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal, preferivelmentede 0,1a 50 mg/kgde peso corporal, mais preferivelmentede 0,1a 10 mg/kgde peso corporal, e uma quantidade do anticorpo administrado é, por exemplo, de 0,01 a 200 mg/kgde peso corporal, preferivelmentede 0,1a 100 mg/kgde peso corporal, mais preferivelmentede 1 a 40 mg/kgde peso corporal. O adjuvante e o anticorpo podem ser administrados ao mes- mo tempo como na Formulação de vacina da presente invenção (inclu- indo o caso onde o adjuvante e o anticorpo estão contidos na Formu-

lação de vacina), ou o adjuvante e o anticorpo e a Formulação de va- cina podem ser administradosem momentos diferentes. Para adminis- tração em momentos diferentes, preferivelmente, todas as Formula- ções de vacina, o adjuvante, e o anticorpo são administrados, por exemplo, dentro de 1 minuto a 24 horas, preferivelmente dentro de 1 minuto a 5 horas.

EXEMPLOS

[00249] Mais adiante, os aspectos específicos preferidos da presen- te invenção serão descritos como Exemplos.

[00250] [Exemplo 1] Síntese de derivado de ácido hialurônico (HA)

[00251] Os derivados de HA foram sintetizados pelo método des- crito na Publicação Internacional nº WO 2010/053140 ou WO 2014/038641.

[00252] [Exemplo 2] Obtenção de antígeno Os peptídeos antigênicos foram adquiridos de Sigma- Genosys LP.

[00253] mERK2 p121 (sequência de aminoácido: NDHI- AYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT (SEQ ID NO: 1)) A sequência continha uma sequência de 9 aminoácidos (SEQ ID NO: 2: QYIHSANVL) de Q na posição 16 a L na posição 24 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T cito- tóxica CD8-positivo, e uma sequência de 17 aminoácidos (SEQ ID NO: 3: RGLQYIHSANVLHRDLK) de R na posição 13 a K na posição 29 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T auxili- ar CD4-positivo.

[00254] MAGE-A4 p264 (sequência de aminoácido: GSNPARYE- FLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 4)) A sequência continha uma sequência de 9 aminoácidos (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL) de S na posição 2 a L na posição 10 como uma se- quência de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-

positivoe uma sequência de 16 aminoácidos (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI) de V na posição 22 a I na posição 37 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivo.

[00255] MAGE-A4 p265 (sequência de aminoácido: SNPARYEFL (SEQ ID NO: 7)).

[00256] MAGE-A4 p285 (sequência de aminoácido: VKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 8)).

[00257] TRP2TRP1gp100-6G (sequência de aminoáci- do:SVYDFFVWLGGGGGGTWHRYHLLGGGGGGEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 9)).

[00258] A sequência continha TRP2 (sequência de aminoácido: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (sequência de aminoácido: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)), e gp100 (sequência de aminoácido: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) fornecido abaixo como sequências de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 G.

[00259] TRP2TRP1gp100-6Y (sequência de aminoácido: SVYDFFVWLYYYYYYTWHRYHLLYYYYYYEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 10)).

[00260] A sequência continha TRP2 (sequência de aminoácido: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (sequência de aminoácido: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)), e gp100 (sequência de aminoácido: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) fornecido abaixo como sequências de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 Y.

[00261] TRP2TRP1gp100-4L (sequência de aminoácido: SVYDFFVWLLLLLTWHRYHLLLLLLLEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 11)).

[00262] A sequência continha TRP2 (sequência de aminoácido: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (sequência de aminoácido:

TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)), e gp100 (sequência de aminoácido: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) fornecido abaixo como sequências de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 4 L.

[00263] TRP2TRP1gp100-6L (sequência de aminoácido: SVYDFFVWLLLLLLLTWHRYHLLLLLLLLEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 12)).

[00264] A sequência continha TRP2 (sequência de aminoácido: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (sequência de aminoácido: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)), e gp100 (sequência de aminoácido: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) fornecido abaixo como sequências de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 L.

[00265] TRP2 (sequência de aminoácido: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)).

[00266] TRP1 (sequência de aminoácido: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)).

[00267] gp100 (sequência de aminoácido: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)).

[00268] AH1gp70-6G (sequência de aminoácido: LVQFIK- DRISVVQAGGGGGGSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 16)).

[00269] A sequência continha gp70 (sequência de aminoácido: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) fornecido abaixo como um epí- topo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivoe AH1 (se- quência de aminoácido: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) fornecido abaixo como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 G.

[00270] AH1gp70-6Y (sequência de aminoácido: LVQFIK- DRISVVQAYYYYYYSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 17)).

[00271] A sequência continha gp70 (sequência de aminoácido: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) fornecido abaixo como um epí- topo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivoe AH1 (se- quência de aminoácido: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) fornecido abaixo como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 Y.

[00272] AH1gp70-4L (sequência de aminoácido: LVQFIK- DRISVVQALLLLSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 18)).

[00273] A sequência continha gp70 (sequência de aminoácido: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) fornecido abaixo como um epí- topo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivoe AH1 (se- quência de aminoácido: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) fornecido abaixo como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 4 L.

[00274] AH1gp70-6L (sequência de aminoácido: LVQFIK- DRISVVQALLLLLLSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 19)).

[00275] A sequência continha gp70 (sequência de aminoácido: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) fornecido abaixo como um epí- topo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivoe AH1 (se- quência de aminoácido: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) fornecido abaixo como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T citotóxica CD8-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 6 L.

[00276] AH1 (sequência de aminoácido: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)).

[00277] gp70 (sequência de aminoácido: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)).

[00278] MAGE-A4 p264-4L (sequência de aminoácido: GSN-

PARYEFLWGPRALLLLLYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 22)).

[00279] A sequência continha uma sequência de 9 aminoácidos (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL) de S na posição 2 a L na posição 10 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T cito- tóxica CD8-positivoe uma sequência de 16 aminoácidos (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI) de V na posição 22 a I na posição 37 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 4 L.

[00280] MAGE-A4 p264-4W (sequência de aminoácido: GSN- PARYEFLWGPRALWWWWYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 23)).

[00281] A sequência continha uma sequência de 9 aminoácidos (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL) de S na posição 2 a L na posição 10 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T cito- tóxica CD8-positivo e uma sequência de 16 aminoácidos (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI) de V na posição 22 a I na posição 37 como uma sequência de epítopo de reconhecimento de célula T auxiliar CD4-positivo, e os epítopos foram conectados por meio de 4 W.

[00282] [Exemplo 3] Produção de complexo de derivado de HÁ e antígeno (Exemplo 3-1) Preparação de complexo de antígeno e derivado de HA Cada derivado de HA (99k HA-C6-Chol-42%, etc.) foi dissolvido em 12 mg/mL em água ultrapura, e ultrassonicação (fabricado por Covaris Inc., E220X) foi realizada. Cada peptídeo antigênico foi dissolvido em 50 mg/mL em DMSO. A solução do peptídeo antigênico em DMSO foi adicionada à solução de derivado de HA aquosa, e a mistura foi ultras- sonicada durante 30 minutos em um sonicador tipo de banho.O resul- tante foi transferido a um kitde diálise (Slide-A-Lyzer, corte de peso molecular: 3,5 K) e dializado contra uma solução tamponada por car-

bonato a 5 mM (pH 9), uma solução tamponada por fosfato a 10 mM (pH 7), e uma solução tamponada por fosfato a 10 mM (pH 7) conten- do 10% de sacarose nesta ordem. A concentração de peptídeo antigê- nico foi quantificada por análise de cromatografia de fase reversa sob as condições abaixo fornecidas. A concentração foi ajustada de 250 a 500 g/mL para preparar uma solução de administração.Se a concen- tração não alcançou o pretendido, a solução foi concentrada com um concentrador de ultrafiltração (Vivaspin 6, 5000 MwCO, Sartorius AG). O derivado de HA foi sintetizado como descrito nos Exemplos 1 e 2 da Publicação Internacional nº WO 2010/053140 A1. Por exemplo, 99k HA-C6-Chol-42% mostrado na Tabela 1 do Exemplo 4-1 denota um derivado de HÁ da Fórmula (I) em que Z é uma ligação direta, R aé um átomo de hidrogênio, Y é C6alquileno, X1é -NRb-COO-R, Rbé um áto- mo de hidrogênio,e R é um grupo colesterila (isto é, carbamato de co- lesteril 6-aminoexila foi introduzido); o peso molecular médio ponderalé 99 kDa; e a taxa de introdução do grupo colesterila é de 42%.Também, um derivado de HA em que a taxa de introdução do grupo colesterila é de 41% é designado como 99k HA-C6-Chol-41%, e um derivado de HA em que a taxa de introdução do grupo colesterila é de 43% é designado como 99k HA-C6-Chol-43%.

[00283] Condições de análise de cromatografia de fase reversa Coluna analítica: PLRP-S 1000 angstroms (Agilent Techno- logies, Inc.) Temperatura de coluna: 40C Fase móvel A: 0,1% de solução de TFA aquosa, fase móvel B: 0,1% de solução de TFA em acetonitrila Taxa de fluxo: 2 mL/min Detecção: UV 254 nm Volume de injeção: 50 L [Exemplo comparativo 1] Produção do complex de CHP e antígeno

[00284] Um complexo foi preparado de acordo com a Publicação Internacional nºWO 2015/050158. Pululan modificado por colesterol (abreviação: CHP) (CHP-80T; 1 a 2 moléculas decolesterol foram in- troduzidas por 100 monossacarídeos) foi obtido de NOF Corp. CHP foi dissolvido em uma concentração de 10 mg/mL em salina tamponada por fosfato (PBS) contendo 6 M de ureia. Uma solução de um peptídeo antigênico em DMSO foi adicionada à solução de CHP, e a mistura foi deixada durante a noite em temperatura ambiente no escuro. A solu- ção misturada foi transferida a uma membrana de diálise (corte de pe- so molecular: 3.500, Thermo Fisher Scientific Inc.) e dializada a 4C durante 2 horas durante a noite contra PBS contendo 0,6 M de ureia em uma relação de volume de 100 vezes ou mais como uma solução externa da membrana de diálise. Subsequentemente, o resultante foi dializado a 4C durante 2 horas durante a noite contra PBS contendo 0,06 M de ureia em uma relação de volume de 100 vezes ou mais co- mo uma solução externa da membrana de diálise. Novamente, o resul- tante foi dialisado a 4C durante 2 horas durante a noite contra PBS em uma relação de volume de 100 vezes ou mais como uma solução externa da membrana de diálise. Após a recuperação de uma solução interna da membrana de diálise, a concentração de antígeno foi quan- tificada pelo método descrito no Exemplo 3-1. A concentração foi ajus- tada para preparar uma solução de administração. Se a concentração não alcançou o pretendido, a solução foi concentrada com um concen- trador de ultrafiltração (Vivaspin 6, 5000 MwCO, Sartorius AG). [Exemplo 4] Teste de indução de célula T específica de antígeno Método Experimental

[00285] O complexo do peptídeo antigênico e do derivado de HA preparado no Exemplo 3-1 ou o complexo de CHP e do peptídeo anti- gênico preparado no Exemplo comparativo 1 foi subcutaneamente administrado em uma quantidade correspondente a 0,05 a 0,1 mg do antígeno ao lado direito traseirode cada camundongo BALB/c (fêmea, Japão SLC, Inc.; peso corporal: 15 a 25 g) ou camundongo C57BL/6 (fêmea, Japão SLC, Inc.; peso corporal: 15 a 25 g). No caso da admi- nistração de um adjuvante (CpG oligo DNA (ODN1668, fabricado por InvivoGen), 0,05 mg), o adjuvante foi subsequentemente administrado subcutaneamente próximo ao sítio de administração. O número de do- ses éde 2, e o intervalo entre as doses foi de 1 semana.1 semana após a administração final, células do baço foram separadas do ca- mundongo recipiente pelos seguintes procedimentos: o baço foi isola- do do camundongo e lavado com meio RPMI1640 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), e o sangue foi removido. O baço foi moído, e as células liberadas foramem seguida recuperadas no meio RPMI1640 contendo FBS. Após a centrifugação (300  g, 5 min, 4C), o sobrena- dante foi removido, ede 1 a 2 mL de uma solução ACK (fabricada por Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionado às células. 1 minuto mais tarde, 30 mL de meio RPMI1640 contendo FBS foi adicionado a ela, e a mis- tura foi centrifugada (300  g, 5 min, 4C). O sobrenadante foi removi- do, e 10 mL de meio RPMI1640 contendo FBS foi adicionado às célu- las, seguido por tratamento de filtro usando-se 40 m de filtro de célula e centrifugação (300  g, 5 min, 4C). O sobrenadante foi removido, e 20 mL de meio RPMI1640 contendo FBS foi adicionado às células, se- guido por centrifugação (300  g, 5 min, 4C). O sobrenadante foi re- movido, e as células foram suspensas em uma quantidade apropriada de meio RPMI1640 contendo FBS. O número de células foi contado, e as células foram em seguida suspensas em uma densidade celular de 2  107 células/mL em meio RPMI1640 contendo FBS.

[00286] As células do baço do camundongo foram adicionadas em 5  106 células/0,4 mL por cavidade a uma placa de cultura de 24 ca- vidades (Nunc). 50 L de 100 g/mL de peptídeo para estimulação de célula T foi adicionado a cada cavidade, e as células foram cultivadas a 37C durante 30 minutos sob 5% de CO2. Em seguida, GolgiPlug (BD Biosciences) diluído 100 vezes com meio RPMI1640contendo FBS foi adicionado a 50 L por cavidade, e as células foram cultivadas a 37C durante 5 horas sob 5% de CO2. As células foram recuperadas e transferidas a uma microplaca de base em V de 96 cavidades (Nunc). Um sobrenadante foi removido por centrifugação (2000 rpm, 2 min, 4C;o mesmo é verdadeiro para as condições abaixo). Em segui- da, as células foram suspensas em 200 L de um tampão para man- chamento (PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA)) por cavidade.

Um sobrenadante foi removido por centrifugação.

Em segui- da, 50 L de uma solução contendo um anticorpo anti-CD8 fluorescen- temente marcado (fabricado por Invitrogen Corp.) e um anticorpo anti- CD4 fluorescentemente marcado(BD Biosciences) foi adicionado a ca- da cavidade e misturado, e a placa foi em seguida deixada descansar a 4C durante 15 minutos no escuro. 150 L de um tampão para man- chamento foi adicionado a cada cavidade.

Um sobrenadante foi remo- vido por centrifugação, e as células foram em seguida também lavadas com 200 L de um tampão para manchamento. 100 L de tam- pãoCytofix/Cytoperm (BD Biosciences) foi adicionado a cada cavidade e suavemente misturado.

A placa foi deixada descansar em tempera- tura ambiente durante 20 minutos no escuro, e as células foramem se- guida também lavadas duas vezes com um tampão para manchamen- to. 200 L de um tampão para manchamento foi adicionado a cada cavidade e refrigerado durante a noite com luz protegida.

Um sobre- nadante foi removido por centrifugação.

Em seguida, 200 L de tam- pão Perm/Wash (BD Biosciences) foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada descansarem temperatura ambiente durante 3 minu- tos com luz protegida.

Um sobrenadante foi removido por centrifuga- ção.

Em seguida, 50 L de tampão Perm / Wash suplementado com cada anticorpo anticitocina foi adicionado às células para suspensão suave, e a placa foi deixada descansar em temperatura ambientedu- rante 15 minutos no escuro. As células foram lavadas com 150 L de tampão Perm/Wash, em seguida ressuspensas em 200 L de um tam- pão para manchamento, e transferidas a um tubo de poliestireno de base circular (BD Biosciences). As células foram analisadas em um citômetro de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences) usando-se um sof- tware analítico anexado (FACSDiva). (Exemplo 4-1) Teste de indução de célula T usando-se peptídeo mERK2

[00287] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito noExemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 1 duas vezes. O adjuvante usado foi CpG oligo DNA (ODN1668, fabricado por InvivoGen). A Figura 1 exibe a relação do número de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 1] Tabela 1. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose mERK2 p121 CpG CpG Nenhum 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 CpG CHP+CpG CHP-80T;80k 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 CpG 99k41+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg

[00288] Uso do derivado de HA como um veículo foi confirmado ser capaz de induzir as células T em um nível elevado. (Exemplo 4-2) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo mERK2 (efeito adjuvante - 1)

[00289] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 2 duas vezes. O adjuvante usado foi CpG oligo DNA (ODN1668, fabricado por InvivoGen), poliIC (HMW VacciGrade,

fabricado por InvivoGen), QuilA (fabricado por InvivoGen), ou um ago- nista Sting (2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp), fabricado por InvivoGen). A Figu- ra 2-1 exibe a relação do número de células CD8+ produzindo interfe- ron gama para o número de todas as células CD8 +quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD8+. A Figura 2-2 exibe a relação do número de células CD4+ produ- zindo interferon gama para o número de todas as células CD4+quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para estimulação da célula T CD4+. [Tabela 2] Tabela 2. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose mERK2 p121 99k41 99k HA-C6-Chol-41% Nenhum 0,1 mg mERK2 p121 CpG 99k41+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 PoliIC 99k41+PoliIC 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 QuilA 99k41+QuilA 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 Sting 99k41+Sting 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg Uso de qualquer um dos adjuvantes foi confirmado ser capaz de indu- zir as células T. (Exemplo 4-3) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo mERK2 (efeito adjuvante - 2)

[00290] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 3 duas vezes. O adjuvante usado foi CpG oligo DNA (ODN1668, fabricado por InvivoGen), R848 (VacciGrade, Vacci- Grade, fabricado por InvivoGen), ou MPL (MPLAs VacciGrade, fabri- cado por InvivoGen). A Figura 3-1 exibe a relação do número de célu- las CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as célu- las CD8+quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo para a es- timulação da célula T CD8+. A Figura 3-2 exibe a relação do número de células CD4+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD4+quando mERK2 p121 foi usado como um peptídeo pa- ra a estimulação da célula T CD4+. [Tabela 3] Tabela 3. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose mERK2 p121 CpG 99k41+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 R848 99k41+R848 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg mERK2 p121 MPL 99k41+MPL 99k HA-C6-Chol-41% 0,1 mg 0,05 mg

[00291] O uso de qualquer um dos adjuvantes foi confirmado ser capaz de induzir as células T. (Exemplo 4-4) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo MAGE-A4 p264

[00292] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 4 duas vezes. A Figura 4 exibe a relação do núme- ro de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de to- das as células CD8+quando o MAGE-A4 p265 foi usado como um pep- tídeo para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 4] Tabela 4. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose MAGE-A4 p264 CpG peptide+CpG Nenhum 0,075 mg 0,05 mg MAGE-A4 p264 CpG CHP/Wt+CpG CHP-80T;80k 0,075 mg 0,05 mg MAGE-A4 p264 CpG 99k41/Wt+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,075 mg 0,05 mg

[00293] O uso do derivado de HA foi confirmado ser capaz de in- duzir as células T em um nível elevado. (Exemplo 4-5) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo MAGE-A4 p264 (sem adjuvante)

[00294] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 5 duas vezes. A Figura 5 exibe a relação do núme-

ro de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de to- das as células CD8+quando o MAGE-A4 p265 foi usado como um pep- tídeo para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 5] Tabela 5. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose MAGE-A4 p264 CHP/Wt CHP-80T;80k Nenhum 0,075 mg MAGE-A4 p264 99k41/Wt 99k HA-C6-Chol-41% Nenhum 0,075 mg

[00295] O uso do derivado de HÁ como um veículo foi confirmado ser capaz de induzir as células T em um nível elevado mesmo quando nenhum adjuvante foi usado. (Exemplo 4-6) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo MAGE-A4 p264

[00296] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 6 duas vezes. A Figura 6 exibe a relação do núme- ro de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de to- das as células CD8+quando o MAGE-A4 p265 foi usado como um pep- tídeo para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 6] Tabela 6. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose MAGE-A4 p264 CpG 99k41/Wt+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,075 mg 0,05 mg MAGE-A4 p264-4L CpG 99k412/LLLL+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,075 mg 0,05 mg MAGE-A4 p264-4W CpG 99k41/WWWW+CpG 99k HA-C6-Chol-41% 0,075 mg 0,05 mg

[00297] O uso do peptídeo contendo qualquer um dos ligantees de aminoácido foi descoberto ser capaz de induzir as células T em um nível elevado. (Exemplo 4-7) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo TRP2TRP1gp100

[00298] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no

Exemplo 4 usando-se camundongos C57BL/6 e administrando cada amostra da Tabela 7 duas vezes.As Figuras 7-1, 7-2, e 7-3 exibem a relação do número de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+quando o TRP1, TRP2, e gp100, respectivamente, foram usados como peptídeos para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 7] Tabela 7. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose TRP2TRP1gp100-6Y CpG CHP/6Y+CpG CHP-80T;80k 0,1 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-6Y CpG 99k43/6Y+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg

[00299] O uso do derivado de HA como um veículo foi confirmado ser capaz de induzir as células T em um nível elevado para cada um de TRP1, TRP2, e gp100. (Exemplo 4-8) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo TRP2TRP1gp100

[00300] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos C57BL/6 e administrando cada amostra da Tabela 8 duas vezes. As Figuras 8-1, 8-2, e 8-3 exibem a relação do número de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+quando TRP1, TRP2, e gp100, res- pectivamente, foram usados como peptídeos para a estimulação da célula T CD8+. [Tabela 8] Tabela 8. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose TRP2TRP1gp100-6G CpG 99k43/6G+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-6Y CpG 99k43/6Y+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-4L CpG 99k43/4L+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-6L CpG 99k43/6L+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg

[00301] O uso de qualquer ligante de peptídeo foi descoberto ser capaz de induzir as células T em um nível elevado. (Exemplo 4-9) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo- AH1gp70

[00302] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 9 duas vezes. A Figura 9-1 exibe a relação do nú- mero de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+ quando AH1 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD8+. A Figura 9-2 exibe a relação do nú- mero de células CD4+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD4+ quando gp70 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD4+. [Tabela 9] Tabela 9. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose AH1gp70-6Y CpG CHP/6Y+CpG CHP-80T;80k 0,1 mg 0,05 mg AH1gp70-6Y CpG 99k43/6Y+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg

[00303] O uso do derivado de HA foi confirmado ser capaz de in- duzir as células T em um nível elevado para cada um de AH1 e gp70. (Exemplo 4-10) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo- AH1gp70

[00304] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 10 duas vezes. A Figura 10-1 exibe a relação do número de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+ quando AH1 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD8+. A Figura 10-2 exibe a relação do nú- mero de células CD4+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD4+ quando gp70 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD4+. [Tabela 10]

Tabela 10. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose AH1gp70-6L CpG CHP/6L+CpG CHP-80T;80k 0,1 mg 0,05 mg AH1gp70-6L CpG 99k43/6L+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg

[00305] O uso do derivado de HA foi confirmado ser capaz de in- duzir as células T em um nível elevado para cada um de AH1 e gp70. (Exemplo 4-11) Teste de indução de célula T usando-se o peptídeo- AH1gp70

[00306] O teste foi conduzido de acordo com o método descrito no Exemplo 4 usando-se camundongos BALB/c e administrando cada amostra da Tabela 11 duas vezes. A Figura 11-1 exibe a relação do número de células CD8+ produzindo interferon gama para o número de todas as células CD8+ quando AH1 foi usado como um peptídeo para estimulação da célula T CD8+. A Figura 11-2 exibe a relação do núme- ro de células CD4+ produzindo interferon gama para o número de to- das as células CD4+ quando gp70 foi usado como um peptídeo para a estimulação da célula T CD4+. [Tabela 11] Tabela 11. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Abreviação Veículo Dose Dose AH1gp70-6G CpG 99k43/6G+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg AH1gp70-6Y CpG 99k43/6Y+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg AH1gp70-4L CpG 99k43/4L+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg AH1gp70-6L CpG 99k43/6L+CpG 99k HA-C6-Chol-43% 0,1 mg 0,05 mg

[00307] O uso das espécies de peptídeo contendo qualquer um dos ligantees de aminoácido foi descoberto ser capaz de induzir as células T em um nível elevado. [Exemplo 5] Teste de desenvolvimento de tumor em camundongo Método Experimental

[00308] Uma linhagem celular CMS5a de fibrossarcoma de ca- mundongo expressando mERK2, uma linhagem celular CT26 de célula de câncer colorretal expressando AH1 e gp70, ou uma linhagem celu- lar B16F10 de melanoma de camundongo expressando TRP2, TRP1, e gp100 foi subcutaneamente transplantada. A linhagem celular CMS5a e a linhagem celular CT26 foram cada qual subcutaneamente transplantada em uma quantidade de 1  106células cultivadas/100 L/indivíduo a cada camundongo BALB/c (fêmea; peso corporal: de 15 a 25 g). A linhagem celular B16F10 foi subcutaneamente transplantada em uma quantidade de 2  105 células cultivadas/100 L/indivíduo a cada camundongo C57BL/6 (fêmea; peso corporal: de 15 a 25 g). Em seguida, os volumes de tumor foram medidos com o passar do tempo. (Exemplo comparativo 5-1) Preparação de Formulação de emulsão

[00309] Uma emulsão foi produzida de um peptídeo antigênico, 0,5 mL de um adjuvante incompleto de Freund (fabricado por Invivo- Gen), e 0,5 mL de salina usando-se duas seringas de vidro resistente com acessórios de bloqueio conectados através de um conector de seringa. A concentração de peptídeo antigênico foi ajustada a 0,5 mg/mL. (Exemplo 5-1) CMS5a de fibrossarcoma de camundongo

[00310] Cada amostra da Tabela 12 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 12 aos camundongos car- regando CMS5a de fibrossarcoma de camundongo preparado pelo método descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvi- mento de tumor de camundongo. A Figura 12-1 mostra as mudanças no volume médio de tumor, e a Figura 12-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 12] Tabela 12. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de administração (após Abreviação Veículo Dose Dose otransplante) mERK2 p121 CpG Peptídeo Nenhum Dia 4, dia 11 0,05 mg 0,05 mg mERK2 p121 CpG Emulsão Emulsão Dia 4, dia 11 0,05 mg 0,05 mg CHP CHP-80T;80k mERK2 p121 CpG Dia 4, dia 11

0,05 mg 0,05 mg mERK2 p121 CpG 99k41 99k HA-C6-Chol-41% Dia 4, dia 11 0,05 mg 0,05 mg

[00311] O grupo derivado de HA (99k41) mostrou ter um efeito su- pressivo de desenvolvimento de tumor elevado quando comparado com o grupo de peptídeo, o grupo de emulsão, e o grupo CHP. (Exemplo 5-2) CMS5a de fibrossarcoma de camundongo

[00312] Cada amostra da Tabela 13 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 13 aos camundongos car- regando CMS5a de fibrossarcoma de camundongo preparado pelo método descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvi- mento de tumor de camundongo. A Figura 13-1 mostra as mudanças no volume médio de tumor, e a Figura 13-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 13] Tabela 13. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de aministração (após o Abreviação Veículo Dose Dose transplante) CpG CpG Nenhum Nenhum Dia 4, dia 11 0,05 mg mERK2 p121 CpG CHP CHP-80T;80k Dia 4, dia 11 0,05 mg 0,05 mg mERK2 p121 CpG 99k41 99k HA-C6-Chol-41% Dia 4, dia 11 0,05 mg 0,05 mg

[00313] O grupo derivado de HA (99k41) mostrou ter um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor quando comparado com o grupo CpG sozinho e o grupo CHP. (Exemplo 5-3) CMS5a de fibrossarcoma de camundongo

[00314] Cada amostra da Tabela 14 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 14 aos camundongos car- regando CMS5a de fibrossarcoma de camundongo preparado pelo método descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvi- mento de tumor de camundongo. Os anticorpos foram intraperitoneal- mente administrados. A Figura 14-1 mostra as mudanças no volume médio de tumor, e a Figura 14-2 mostra as mudanças em cada indiví- duo. O anticorpo anti-CTLA4, o anticorpo anti-PD1, e o anticorpo anti-

PDL1 foram cada qual obtidos da Célula Bio X. [Tabela 14] Tabela 14. Amostra de administração Espécies de Espécies de Dose de espécies de anticorpos Dia de aministra- Abreviação Veículo peptídeo, adjuvante, ção (após o Dose Dose transplante) Anti-CTLA4 anticorpo (0.2 Dia 7, dia 11, dia aCTLA4/aPD1/aPDL1 Nenhum Nenhum Nenhum mg)+Anti-PD1 anticorpo (0.2 14, dia 18 mg)+Anti-PDL1 anticorpo (0.2 mg) 99k HA-C6-Chol- mERK2 p121 CpG 99k41 Nenhum Dia 7, dia 13 41% 0,05 mg 0,05 mg

[00315] O grupo derivado de HA (99k41) exibiu um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor até pela administração do dia 7, e o efeito foi mostrado ser maior do que aquele dos anticorpos. (Exemplo 5-4) CMS5a de fibrossarcoma de camundongo

[00316] Cada amostra da Tabela 15 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 15 aos camundongos car- regando CMS5a de fibrossarcoma de camundongo preparado pelo método descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvi- mento de tumor de camundongo. Os anticorpos foram intraperitoneal- mente administrados. A Figura 15-1 mostra as mudanças no volume médio de tumor, e a Figura 15-2 mostra as mudanças em cada indiví- duo. O anticorpo anti-CTLA4, o anticorpo anti-PDL1, o anticorpo anti- OX40, e o anticorpo anti-4-1BB foram cada qual obtidos da Célula Bio X. [Tabela 15] Tabela 15. Amostra de administração Espécies de Espécies de anticorpos, dose Espécies de peptídeo, Dia de aministração Abreviação Veículo adjuvante, Dose (após o transplante) Dose Anti-CTLA4 anticorpo (0.2 mg)+Anti- aC- PDL1 anticorpo (0.2 mg)+Anti-OX40 Dia 7, dia 11, dia TLA4/aPDL1/aOX40/a4- Nenhum Nenhum Nenhum anticorpo (0.2 mg)+Anti-4-1BB 14, dia 18 1BB anticorpo (0.2 mg) 99k HA-C6-Chol- mERK2 p121 CpG 99k41 Nenhum Dia 7, dia 13 41% 0,05 mg 0,05 mg Anti-CTLA4 anticorpo (0.2 mg)+Anti- 99k42: Dia 7, dia 99k41+aCTLA4/aPDL1/aO 99k HA-C6-Chol- mERK2 p121 CpG PDL1 anticorpo (0.2 mg)+Anti-OX40 13, anticorpo: Dia 7, X40/a4-1BB 41% 0,05 mg 0,05 mg anticorpo (0.2 mg)+Anti-4-1BB dia 11, dia 14, dia anticorpo (0.2 mg) 18

[00317] O derivado de HA (99k41) mostrou ter um maior efeito su- pressivo de desenvolvimento de tumor com base no peptídeo mERK2 por combinação com os anticorpos (aCTLA4/aPDL1/aOX40/a4-1BB). (Exemplo 5-5) Célula CT26 de câncer colorretal de camundongo

[00318] Cada amostra da Tabela 16 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 16 aos camundongos car- regando a célula CT26 de câncer colorretal de camundongo, prepara- da pelo método descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de de- senvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 16-1 mostra as mu- danças no volume médio de tumor, e a Figura 16-2 mostra as mudan- ças em cada indivíduo. [Tabela 16] Tabela 16. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de aministração (após o Abreviação Veículo Dose Dose transplante) AH1gp70-6L CpG Emulsão Emulsão Dia 9, dia 16, dia 23 0,05 mg 0,05 mg AH1gp70-6L CpG CHP CHP-80T;80k Dia 9, dia 16, dia 23 0,05 mg 0,05 mg AH1gp70-6L CpG 99k43 99k HA-C6-Chol-43% Dia 9, dia 16, dia 23 0,05 mg 0,05 mg

[00319] O grupo derivado de HA (99k43) mostrou ter um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor quando comparado com o grupo de Emulsão e o grupo CHP. (Exemplo 5-6) B16F10 de melanoma de camundongo

[00320] Cada amostra da Tabela 17 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 17 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo, preparada pelo méto- do descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 17-1 mostra as mudanças no vo- lume médio de tumor, e a Figura 17-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 17] Tabela 17. Amostra de administração Espécies de Espécies de peptídeo, Dia de aministração (após Abreviação Veículo adjuvante, Dose o transplante) Dose TRP2TRP1gp100-6Y CpG CHP CHP-80T;80k Dia 10, dia 13, dia 17 0,05 mg 0,05 mg

TRP2TRP1gp100-6Y CpG 99k43 99k HA-C6-Chol-43% Dia 10, dia 13, dia 17 0,05 mg 0,05 mg

[00321] O grupo derivado de HA (99k43) mostrou ter um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor quando comparado com o grupo CHP. [Exemplo 6] Liberação de linfonodo Método Experimental

[00322] Cada amostra preparada pelo método descrito no Exem- plo 3 foi subcutaneamente administrada ao lado direito traseiro de ca- da camundongo BALB/c (peso corporal: de 15 a 25 g) usando-se mERK2 p121 fluorescentemente marcado (fluoresceína-conjugada). 24 horas após e 72 horas mais tarde, o linfonodo inguinal direito foi colhido, manchado com um anticorpo anti-CD11b e um anticorpo anti- F4/80, e em seguida analisado para captação do peptídeo fluorescen- temente marcado em células F4/80+CD11b+por citometria de fluxo. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences) usando-se software analítico anexado (FACSDiva). (Exemplo 6-1) Liberação de linfonodo de vários derivados de HA

[00323] Cada amostra descrita na Tabela 18 foi administrada e analisada pelo método descrito no Exemplo 6 para conduzir um teste de migração de linfonodo. A Figura 18-1 mostra a intensidade de fluo- rescência por célula 24 horas mais tarde, e a Figura 18-2 mostra in- tensidade de fluorescência por célula 72 horas mais tarde. [Tabela 18] Tabela 18. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Abreviação Veículo Adjuvante Dose MERK2 p121 fluorescentemente marcado Peptídeo Nenhum Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado CHP CHP-80T;80k Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10k17 10k HA-C6-Chol-17% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10k25 10k HA-C6-Chol-25% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10k42 10k HA-C6-Chol-42% Nenhum 0,05 mg 50k23 50k HA-C6-Chol-23% MERK2 p121 fluorescentemente marcado Nenhum

0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 50k43 50k HA-C6-Chol-43% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 99k24 99k HA-C6-Chol-24% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 99k43 99k HA-C6-Chol-43% Nenhum 0,05 mg

[00324] O grupo derivado de HA mostrou transferir mais mERK2 ao linfonodo quando comparado com o grupo depeptídeo group e o grupo CHP. (Exemplo 6-2) Liberação de linfonodo de vários derivados de HA modi- ficados por aminoácido

[00325] Cada amostra descrita na Tabela 19 foi administrada e analisada pelo método descrito no Exemplo 6 para conduzir um teste de migração de linfonodo. A Figura 19 mostra a intensidade de fluo- rescência por célula 24 horas mais tarde. Os derivados de HA modifi- cados por aminoácido foram sintetizados como descrito no Exemplo 1 da Publicação Internacional nº WO 2014/038641. Por exemplo, 10kHA-Ala-C6-Chol-30% da Tabela 19 abaixo denota um derivado de HA da Fórmula (II) em que Raaé metila (C1alquila), R6a é um átomo de hidrogênio, X1a é -NR9-Z1-Z2, R9 é um átomo de hidrogênio, Z1 é C6 al- quileno, Z2 é -NRba-COO-Z3, Rba é um átomo de hidrogênio, e Z3é um grupo colesterila (isto é, alaninae carbamato de colesteril 6-amino- hexila foram introduzidos); o peso molecular médio ponderalé de 10 kDa; e a taxa de introdução do grupo colesterila é de 30%. Os deriva- dos de HA modificados por aminoácido sintetizadosão descritos no Exemplo 3-8 da Publicação Internacional nº WO 2014/038641. [Tabela 19] Tabela 19. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Abreviação Veículo Adjuvante Dose MERK2 p121 fluorescentemente marcado Peptídeo Nenhum Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 99k41 99k HA-C6-Chol-41% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Ala-Chol30 10kHA-Ala-C6-Chol-30% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Ser-Chol28 10kHA-Ser-C6-Chol-28% Nenhum 0,05 mg 10kHA-Gly-Chol32 10kHA-Gly-C6-Chol-32% MERK2 p121 fluorescentemente marcado Nenhum

0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Thr-Chol32 10kHA-Thr-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Asn-Chol20 10kHA-Asn-C6-Chol-20% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Asp-Chol32 10kHA-Asp-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Phe-Chol31 10kHA-Phe-C6-Chol-31% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Tyr-Chol32 10kHA-Tyr-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Ile-Chol28 10kHA-Ile-C6-Chol-28% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Leu-Chol31 10kHA-Leu-C6-Chol-31% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Val-Chol32 10kHA-Val-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Trp-Chol24 10kHA-Trp-C6-Chol-24% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Gln-Chol32 10kHA-Gln-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg MERK2 p121 fluorescentemente marcado 10kHA-Glu-Chol32 10kHA-Glu-C6-Chol-32% Nenhum 0,05 mg

[00326] O grupo de derivado de HA modificado por aminoácido mostrou transferir mERK2 ao linfonodo. [Exemplo 7] Teste de desenvolvimento de tumor em camundongo (Exemplo 7-1) B16F10 de melanoma de camundongo

[00327] Cada amostra da Tabela 20 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 20 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo preparado pelo méto- do descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 20-1 mostra as mudanças no vo- lume médio de tumor, e a Figura 20-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 20] Tabela 20. Amostra de administração Espécies de adju- Espécies de peptídeo, Dia de aministração (após o trans- Abreviação Veículo vante, Dose plante) Dose TRP2TRP1gp100-6Y CpG 99k42 99k HA-C6-Chol-42% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 21 0,05 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-6Y CpG 50k42 50k HA-C6-Chol-42% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 21 0,05 mg 0,05 mg TRP2TRP1gp100-6Y CpG 10k43 10k HA-C6-Chol-43% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 21 0,05 mg 0,05 mg

[00328] O grupo derivado de HA (50k42) e o grupo derivado de HA (10k43), os quais diferenciam no peso molecular de HA do grupo de derivado de HA (99k42), também mostraram ter um elevado efeito su- pressivo de desenvolvimento de tumor, como no grupo derivado de HA (99k42). (Exemplo 7-2) B16F10 de melanoma de camundongo

[00329] Cada amostra da Tabela 21 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 21 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo preparado pelo méto- do descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 21-1 mostra as mudanças no vo- lume médio de tumor, e a Figura 21-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 21] Tabela 21. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de aministração (após o Abreviação Veículo Dose Dose transplante) 10kHA-Ala-C6-Chol- TRP2TRP1gp100-6Y CpG 10kHA-Ala-Chol30 Dia 10, dia 14, dia 17, dia 20 30% 0,05 mg 0,05 mg 10kHA-Gln- 10kHA-Gln-C6-Chol- TRP2TRP1gp100-6Y CpG Dia 10, dia 14, dia 17, dia 20 Chol32 32% 0,05 mg 0,05 mg

[00330] Os grupos de derivado de HA modificado por aminoácido (10kHA-Ala-Chol30 e 10kHA-Gln-Chol32) também mostraram ter um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor. (Exemplo 7-3) B16F10 de melanoma de camundongo

[00331] Cada amostra da Tabela 22 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 22 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo preparado pelo méto- do descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 22-1 mostra as mudanças no vo- lume médio de tumor, e a Figura 22-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 22] Tabela 22. Amostra de administração Espécies de Espécies de peptídeo, Dia de aministração (após o Abreviação Veículo adjuvante, Dose transplante) Dose

TRP2TRP1gp100-6Y PoliIC 99k42+PoliIC 99k HA-C6-Chol-42% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 21 0,05 mg 0,05 mg

[00332] Uso de poliIC como um adjuvante mostrou também produ- zir um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tumor. (Exemplo 7-4) B16F10 de melanoma de camundongo

[00333] Cada amostra da Tabela 23 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 23 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo preparado pelo méto- do descrito no Exemplo 5 para conduzir um teste de desenvolvimento de tumor de camundongo. A Figura 23-1 mostra as mudanças no vo- lume médio de tumor, e a Figura 23-2 mostra as mudanças em cada indivíduo. [Tabela 23] Tabela 23. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de aministração (após o Abreviação Veículo Dose Dose transplante) TRP2TRP1gp100-6Y Sting 99k42+Sting 99k HA-C6-Chol-42% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 20 0,05 mg 0,015 mg TRP2TRP1gp100-6Y R848 99k42+R848 99k HA-C6-Chol-42% Dia 10, dia 14, dia 17, dia 20 0,05 mg 0,05 mg

[00334] Uso de Sting ou R848 como um adjuvante também mos- trou produzir um elevado efeito supressivo de desenvolvimento de tu- mor. [Exemplo 8] Análise de linfonodo e tumor

[00335] Cada amostra da Tabela 24 foi subcutaneamente adminis- trada com a frequência descrita na Tabela 24 aos camundongos car- regando B16F10 de melanoma de camundongo preparado pelo méto- do descrito no Exemplo 5. Nos dias 12, 14, e 18 após a administração, o tumor e o linfonodo (de um total de 4 localizações das porções infra- auxiliares direita e esquerda e as porções inguinais direita e esquerda) foram colhidas para conduzirem um ensaio tetrâmero (mencionado mais tarde). O linfonodo e o tumor colhidos de 2 animais foram reuni- dos, e duas amostras (de 4 animais) por grupo foram analisadas. A Figura 24-1 exibe a relação do número de células CD8+específicas de antígeno TRP-2 para o número de células CD8+, e a Figura 24-2 exi-

bem a relação do número de células CD8+específicas de antígeno gp100 para o número de células CD8+. [Tabela 24] Tabela 24. Amostra de administração Espécies de peptídeo, Espécies de adjuvante, Dia de aministração (após Abreviação Veículo Dose Dose o transplante) TRP2TRP1gp100-6Y CpG 99k41 99k HA-C6-Chol-41% Dia 10, dia 13, dia 17 0,05 mg 0,05 mg

[00336] Foi mostrado que as células CD8+específicas de antígeno TRP-2 e as células CD8+específicas de antígeno gp100 invadiram o tumor e o linfonodo. Isto indica que o efeito antitumor trazido pelo deri- vado de HA é causado pelas células CD8 específicas de antígeno. Ensaio Tetrâmero

[00337] Cada amostra de tecido de tumor colhida foi colocada em uma placa de 6 cavidades contendo 1 mL/cavidade de RPMI-1640, cortada em 2 mm quadrado ou menor com tesouras, e em seguida re- cuperadas em tubo-C gentleMACS (Miltenyi Biotech). Após a adição de Mistura de enzima (Miltenyi Biotech), a placa foi carregada em Dis- sociador gentleMACS (Miltenyi Biotech), e a amostra foi dividida. Em seguida, a placa foi incubada a 37C durante 40 minutos e novamente carregada em dissociador gentleMACS, e a amostra foi dividida. A suspensão celular obtida foi passada através de um filtro e em seguida centrifugada (300  g, 5 min, 4C), e ospelletsforam suspensos em tampão MACS (Miltenyi Biotech) para preparar uma suspensão celu- lar.

[00338] O linfonodo colhido foi triturado usando-se a cauda do ci- lindro interno de uma seringa para preparar uma suspensão celular.

[00339] 5  107 células/mL da suspensão de célula de tumor ou a suspensão celular de linfonodo foi adicionado a 20 L/cavidade a uma microplaca de base em V de 96 cavidades. Um reagente de bloqueio de FcR de camundongo diluído 50 vezes foi adicionado a 10 L/cavidade e reagido a 4C durante 5 minutos. H-2Kb TRP-2 Tetrâ-

mero-SVYDFFVWL-APC (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL)) ou H-2Db gp100 Tetrâmero-EGSRNQDWL-PE (MBL) foi adici- onado a 10 L/cavidade e reagido a 4C durante 30 minutos com luz protegida.

O tampão MACS foi adicionado a 200 L/cavidade, e um sobrenadante foi removido por centrifugação (310 a 400  g, 5 min, 4C). Esta operação foi repetida duas vezes.

A seguir, uma solução de anticorpo contendo um anticorpo anti-CD8 fluorescentemente marca- do(MBL) foi adicionado a 20 L/cavidade e reagido a 4C durante 30 minutos com luz protegida.

O tampão MACS foi adicionado a 200 L/cavidade,e um sobrenadante foi removido por centrifugação (310 a 400  g, 5 min, 4C). Esta operação foi repetida duas vezes.As células foram suspensas pela adição de tampão MACS a 200 L/cavidade, e analisadas em um citômetro de fluxo (BD LSRFortessa X-20, BD Bios- ciences) usando-se umsoftware analítico anexado (FACSDiva).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação de vacina para uso na prevenção ou trata- mento de um câncer, caracterizada pelo fato de que compreende um derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido, e um antígeno, em que o derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidro- fóbico introduzido é o seguinte: um derivado de ácido hialurônico compreendendo pelo menos uma unidade de repetição representada pela fórmula (I): [Fórmula 1] 図 em que R1, R2, R3, e R4são cada qual independentemente seleciona- dos de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila e C1- 6alquilcarbonila; R5 é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1-6 alquil- carbonila; Z representa uma ligação direta, ou um ligante de pep- tídeo tendo de 2 a 30 resíduos de aminoácido arbitrário; X1 é um grupo hidrofóbico selecionado de grupos re- presentados pelas seguintes Fórmulas: -NRb-R, -NRb-COO-R, -NRb-CO-R, -NRb-CO-NRc-R, -COO-R, -O-COO-R,

-S-R, -CO-Ya-S-R, -O-CO-Yb-S-R, -NRb-CO-Yb-S-R, e -S-S-R; Ra, Rbe Rc são cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, C1-20 alquila, amino-C2-20 alquila e hidróxi-C2-20 alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e - NRf- são opcionalmente inseridos; Rf é selecionado deum átomo de hidrogênio, C1-12 al- quila, amino-C2-12 alquilaehidróxi-C2-12 alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, 1 ou 2 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente inseridos; R é um grupo esterila; Y é C2-30 alquileno, ou -(CH2CH2O)m-CH2CH2-, em que noalquileno, de 1 a 5 grupos cada qual independentemente seleciona- do de -O-, -NRg- e -S-S- são opcionalmente inseridos; Rg é selecionado deum átomo de hidrogênio, C1-20 al- quila, amino-C2-20 alquila ou hidróxi-C2-20 alquila,em que na porção al- quila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independen- temente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente inseridos; Ya é C1-5 alquileno; Yb é C2-8 alquileno ou C2-8 alquenileno; e m é um número inteiro selecionado de 1 a 100; ou um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II):

[Fórmula 2]

図 em que R1a, R2a, R3a, e R4a são cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila, e C1-6 alquilcar- bonila; R5a é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1-6 alquil- carbonila; X1a é hidróxi, -O-Q+, C1-6 alcóxi, -NR7R8, ou -NR9-Z1-Z2; Q+ representa um contracátion; R6a, R7, R8, e R9 são cada qual independentemente selecionados de um átomo de hidrogênio, e C1-6 alquila; Raa é um átomo de hidrogênio, ou C1-6 alquila, em que a alquila éopcionalmente substituída por um ou mais grupos cada qual independentemente selecionado de hidróxi, carbóxi, carbamoila, C1-6 alquiltio, arila, e heteroarila, em que a arila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos hidróxi; Z1 é C2-30 alquileno, ou -(CH2CH2O)ma-CH2CH2-, em que noalquileno, de 1 a 5 grupos cada qual independentemente sele- cionado de-O-, -NRga- e -S-S- são opcionalmente inseridos, e ma é um número inteiro selecionado de 1 a 100; Z2 é selecionado de grupos representados pelas se- guintes Fórmulas: -NRba-Z3, -NRba-COO-Z3, -NRba-CO-Z3, -NRba-CO-NRca-Z3, -COO-Z3,

-CO-NRca-Z3, -O-CO-NRca-Z3, -O-COO-Z3, -S-Z3, -CO-Za-S-Z3, -O-CO-Zb-S-Z3, -NRba-CO-Zb-S-Z3, e -S-S-Z3; Rba e Rca são cada qual independentemente seleciona- dos de um átomo de hidrogênio, C1-20alquila, amino-C2- 20alquilaehidróxi-C2-20alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NRfa- são opcionalmente inseridos; Rfa é independentemente selecionado deum átomo de hidrogênio, C1-12 alquila, amino-C2-12 alquilaehidróxi-C2-12 alquila, em que na porção alquila de cada um dos grupos, 1 ou 2 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente in- seridos; Rga é independentemente selecionado deum átomo de hidrogênio, C1-20 alquila, amino-C2-20alquilaehidróxi-C2-20alquila,em que na porção alquila de cada um dos grupos, de 1 a 3 grupos cada qual independentemente selecionado de -O- e -NH- são opcionalmente in- seridos; Z3 é um grupo esterila; Za é C1-5 alquileno; e Zb é C2-8 alquileno ou C2-8 alquenileno, o derivado de ácido hialurônico, quando não compre- endendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II) em que X1a é -NR9-Z1-Z2, também compreendendo uma unidade de repeti- ção representada pela fórmula (III):

[Fórmula 3] 図 em que R1b, R2b, R3be R4bsão cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, C1-6alquila,formila,e C1- 6alquilcarbonila; R5b é um átomo de hidrogênio, formila, ou C1- 6alquilcarbonila; e X2 é -NR9-Z1-Z2, em que R9, Z1, e Z2são como já defi- nidos.

2. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tendo um grupo hidrofóbico introduzido também compreende uma unidade de repetição representada pela fórmula (IIIc): [Fórmula 4] 図 em que R1c, R2c, R3c e R4csão cada qual independentemente selecio- nados de um átomo de hidrogênio, C1-6 alquila, formila e C1- 6alquilcarbonila; R5c é selecionado deum átomo de hidrogênio, formila e C1-6 alquilcarbonila; e Xc é selecionado de hidróxi e -O-Q+, em que Q+ representa um contracátion.

3. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a Formulação de vacina compre- ende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que uma relação da unidade de repetição representada pela fórmula (I) para unidades de repetição de dissacarídeo presente é de 5 a 50%.

4. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a Formulação de vacina compre- ende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), em que uma relação de uma unidade de dissacarídeo compreendendo o grupo -NR9-Z1-Z2para unidades de repetição de dissacarídeo presente é de 5 a 50%.

5. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a Formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreendendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (I), em que Z é uma ligação direta, Y é C2-10 alquileno, X1é -NH-COO-R, e R é um gru- po colesterila.

6. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4, caracterizada pelo fato de que a Formulação de vacina compreende um derivado de ácido hialurônico compreen- dendo uma unidade de repetição representada pela fórmula (II), em que Z1é C2-10 alquileno, Z2 é -NH-COO-Z3, e Z3é um grupo colesterila.

7. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de queo derivado de ácido hialurônico é produzido usando-se ácido hialurônico composto apenas de uma unidade de dissacarídeo representada pela fórmula (IIIc) defi- nido na reivindicação 2, em que quando todos os R1c, R2c, R3c, e R4csão átomos de hidrogênio, R5c é acetila, e Xcé -O-Na+, um peso mo- lecular médio ponderalé de 5 quilodaltons a 200 quilodaltons.

8. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o derivado de áci- do hialurônico e o antígeno formam um complexo.

9. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que se destina à admi- nistração em combinação com pelo menos um tipo de adjuvante.

10. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um peptídeo antigênico ou uma proteína antigênica.

11. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antigênico compreende dois ou mais epítopos de reconhecimento de célula T citotóxica CD8- positivo ou epítopos de reconhecimento de célula T auxiliar CD4- positivo.

12. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de queo peptídeo antigênico possui um li- gante de aminoácido entre os epítopos.

13. Formulação de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que se destina à ad- ministração em combinação com pelo menos um tipo de anticorpo pa- ra o uso no tratamento de câncer.

14. Complexo formado de um derivado de ácido hialurôni- co, caracterizado pelo fato de que compreende uma unidade de repe- tição representada pela fórmula (I) ou a Fórmula (II) como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um antígeno que é usado em uma vacina para o uso na prevenção ou tratamento de um câncer.