CN103957930A - 癌症治疗用疫苗制剂 - Google Patents

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Abstract

【课题】提供一种以癌症治疗用疫苗明确地诱导杀伤性T细胞和辅助性T细胞的方法，该癌症治疗用疫苗将合成长肽作为疫苗抗原，其中，该合成长肽源自肿瘤特异性抗原蛋白质和/或病原体来源的抗原蛋白质，且同时含有CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和CD4阳性辅助性T细胞识别表位肽。【解决方法】将合成长肽与作为抗原传递系统的疏水化多糖类复合体化，再与免疫增强剂同时给药，由此能够实现以将合成长肽作为疫苗抗原的癌症治疗用疫苗对抗原特异性的杀伤性T细胞和辅助性T细胞的明确诱导。

Description

癌症治疗用疫苗制剂
技术领域
本发明涉及癌症的治疗法，特别涉及癌症治疗用疫苗。更详细而言，涉及包含作为疫苗抗原的合成长肽与作为抗原传递系统的疏水化多糖类以及刺激抗原提呈细胞的免疫增强剂的癌症治疗用疫苗制剂。
背景技术
关于对癌症的免疫应答的多年研究的结果明确了细胞性免疫在癌症宿主的肿瘤排斥中的重要性。特别是明确了CD8阳性细胞毒性T细胞(以下为杀伤性T细胞)是具有直接破坏肿瘤作用的效应细胞，CD4阳性辅助性T细胞(以下为辅助性T细胞)是增强杀伤性T细胞和抗原提呈细胞功能的重要的调节细胞，并且，以树突细胞为中心的抗原提呈细胞在向T细胞提呈抗原进行刺激的同时，通过各种辅刺激分子和细胞因子等将T细胞活化，如以下所述，确立了担负对肿瘤的细胞性免疫应答的各细胞的作用和位置(非专利文献1)。
来自肿瘤细胞的蛋白质或作为疫苗抗原所投与的蛋白质被树突细胞等抗原提呈细胞摄入后，被细胞内的蛋白酶组切断为各种长度的肽。生成的肽中，8～10个氨基酸的肽能够作为抗原表位肽被搭载于主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子，在细胞表面被提呈。杀伤性T细胞利用T细胞受体(T cell receptor，TCR)特异性识别该MHCⅠ类/抗原肽复合体而活化。活化的杀伤性T细胞识别在肿瘤细胞上也存在的MHCⅠ类/抗原肽复合体，使用颗粒蛋白酶和穿孔蛋白等效应分子破坏肿瘤细胞。
为了使杀伤性T细胞充分地活化，辅助性T细胞的作用非常重要(非专利文献2)。被树突细胞等抗原提呈细胞摄入的抗原蛋白质被细胞内的蛋白酶组切断为各种长度，其中，15～20个氨基酸的抗原肽与MHCⅡ类分子形成复合体，在抗原提呈细胞上被提呈。辅助性T细胞特异性识别该复合体而活化。活化的辅助性T细胞通过分泌干扰素(interferon，IFN)-γ和白细胞介素(interleukin，IL)-2等细胞因子，增强杀伤性T细胞的增殖和生存、功能。另外，辅助性T细胞通过CD40配体/CD40通路也具活化树突细胞的作用，被辅助性T细胞活化的树突细胞提高对杀伤性T细胞的刺激能力(非专利文献3)。目前众所周知，辅助性T细胞也具有增强B细胞的抗原特异性IgG抗体产生的作用。
这样，杀伤性T细胞通过树突细胞等抗原提呈细胞而被抗原特异性活化，辅助性T细胞作为进一步增强杀伤性T细胞和树突细胞双方作用的重要增强者而发挥作用。这3种免疫细胞在对肿瘤的细胞性免疫有效运作上缺一不可地存在。发明人报告了只刺激杀伤性T细胞而不活化辅助性T细胞的肽只诱导低劣的杀伤性T细胞，不显示治疗效果(非专利文献4)，在开发癌症治疗用疫苗中，怎样将这3种免疫细胞活化而使其有效地发挥功能成为重要的课题。
发明人曾经以杀伤性T细胞和辅助性T细胞的同时活化为目标，制作将肿瘤抗原蛋白质的重组全长蛋白质作为抗原的多价性癌症治疗用疫苗。在全长蛋白质中，包含杀伤性T细胞和辅助性T细胞分别识别的多种抗原肽，期待将两种T细胞同时活化。但是，外源性(细胞外)的抗原蛋白质通过MHCⅡ类途径活化辅助性T细胞容易进行，但通过MHCⅠ类路径活化杀伤性T细胞则难以进行。这是由抗原提呈细胞中的外源性抗原蛋白质的摄入和处理结构上的原因所产生的(非专利文献5)。
因此，在国内外，化学合成短链的肽，以杀伤性T细胞识别的8～10个残基的表位肽为主，作为疫苗在临床应用中进行大量的尝试。由于短链肽不经过抗原提呈细胞内的摄入和处理而与细胞表面的MHC分子直接结合，所以容易引起向T细胞的提呈。另外，重组全长蛋白质使用大肠杆菌和哺乳类细胞等生产并需要精制，在制造体系的构筑和品质管理中需要很多时间和劳力。与此相对，短链肽能够通过化学合成制造，与重组蛋白质的制造相比，具有简便的优点。
但是，包含短链肽的癌症治疗用疫苗被指出若干重要的课题。由于短链肽疫苗的大多数只包含杀伤性T细胞的识别表位肽，所以是不伴有辅助性T细胞活化的单价性疫苗，所诱导的细胞性免疫的质量和治疗效果不充分(非专利文献4)。如果将杀伤性T细胞和辅助性T细胞的识别肽分别作为短链肽合成，以它们的混合物组成疫苗，就有能够得到将杀伤性T细胞和辅助性T细胞同时活化而产生优良品质的杀伤性T细胞诱导和治疗效果的可能性。但是，此时由于杀伤性T细胞和辅助性T细胞的识别表位肽作为各自的成分被投与，所以，各自的树突细胞分别提呈各自的肽，不能实现杀伤性T细胞和辅助性T细胞的相互作用的可能性高(非专利文献3)。
另外，关于短链肽不经过向抗原提呈细胞内的摄入和处理而与细胞表面的MHC分子直接结合，也被指出问题(非专利文献6)。即，外源性的抗原蛋白质被树突细胞和巨噬细胞那样地具备辅刺激分子的专业的抗原提呈细胞所吞噬，在细胞内被加工，以适当的浓度和伴有共刺激的形式向T细胞进行抗原提呈，但由于短链肽不经过那样的过程而与细胞表面的MHC分子直接结合，所以抗原的摄入能力(吞噬能力)和抗原加工能力弱，即使在不表达辅刺激分子的一般的体细胞中，目的肽也大量且以不适当的形式被提呈，有可能导致免疫耐受。
鉴于包含这样的短链肽的疫苗的课题，近年，提出吸收了能够同时活化杀伤性T细胞和辅助性T细胞的全长蛋白质与制造容易而廉价的短链肽的各自的长处的长链合成肽(长肽)的有用性(非专利文献6)。长肽一般是包含至少各一个杀伤性T细胞和辅助性T细胞的识别表位肽的几十个残基的多肽。期待由摄取了长肽的抗原提呈细胞产生的杀伤性T细胞和辅助性T细胞的同时活化。另外，由于以长肽作为抗原的疫苗可以使用化学合成法，所以和短链肽同样具有制造比较容易的优点。
而且，长肽与短链肽不同，不能原样与MHC分子直接结合。长肽被树突细胞等摄入，经过在细胞内的加工，长肽中所包含的杀伤性T细胞和辅助性T细胞的识别表位肽与MHC分子形成复合体，以适当的浓度和样式向T细胞提呈。另外，在缺乏抗原摄入能力和处理能力的一般的体细胞中，由于长肽不能作为疫苗抗原发挥功能，所以，不会发生不适当地向T细胞的抗原提呈。
根据以上内容，可以期待将合成长肽制成疫苗抗原的癌症治疗用疫苗将杀伤性T细胞和辅助性T细胞同时活化的可能性，另一方面，可以期待成为能够比较廉价地制造的优异的癌症治疗药的可能性。但是，即使是将合成长肽作为疫苗抗原的癌症治疗用疫苗，由于将其单独给药时不能获得充分的T细胞活化，所以，为了将疫苗的效果最大化，树突细胞等抗原提呈细胞的有效活化是必须的。
为了进一步提高疫苗的免疫原性，一直以来使用免疫增强剂(佐剂)。来自菌体或病毒的各种物质，例如核酸(DNA和RNA)、蛋白质、脂多糖等作为免疫增强剂被使用，根据近年的研究，逐渐明确这些物质与树突细胞的活化所需要的细胞表面和细胞内部的Toll样受体结合，辅刺激分子(CD80和CD86)和MHC分子的表达上升，通过干扰素和细胞因子产生等显著提高对T细胞的刺激活性。另外，除了对Toll样受体的激动剂以外，也报告了紫杉烷类化合物等化学疗法剂具有活化树突细胞的作用(非专利文献7)、利用具有防止树突细胞获得免疫抑制活性的作用的信号传递抑制剂对于增强疫苗效果是有效的(非专利文献8)，那样的物质也具有能够作为免疫增强剂利用的可能性。
另外，发明人进行了通过如促进在树突细胞等抗原提呈细胞中的外源性抗原蛋白质通过MHCⅠ类路径的杀伤性T细胞活化(称为交叉呈递和交叉激活)这样的疫苗抗原传递系统的研究，在疏水化多糖类中发现了该功能(专利文献1)。例如，将作为肿瘤抗原蛋白质的HER2全长蛋白质与作为疏水化多糖类的一种的胆固醇支链淀粉(cholesterylpullulan，简称CHP)或胆固醇甘露聚糖(cholesteryl mannan，简称CHM)复合体化的疫苗制剂，在体外(in vitro)向人树突细胞给药时，不仅有效活化辅助性T细胞，也有效活化杀伤性T细胞，进而，向荷癌模型小鼠给药时，相比于将HER2全长蛋白质以单体给药的情况，表现出了优异的抗肿瘤效果(非专利文献9)。在使用作为其他的肿瘤抗原蛋白质的NY-ESO-1全长蛋白质时，也再现了同样的结果(非专利文献10)。但是，在分子量小的长肽中的有用性尚不明确。
另外，逐渐明确疫苗抗原传递系统的尺寸和表面电荷直接关系到疫苗性能而非常重要。现在，在作为广泛使用的疫苗抗原传递系统的脂质体中，有报告尺寸越大或越带有电荷，由疫苗产生的T细胞活化和抗体产生诱导就越高(非专利文献14～16)。但是，对于作为疫苗抗原传递系统的疏水化多糖类而言，那样的诸多条件尚不明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：专利第4033497号
专利文献2：日本特开昭61-69801号公报
专利文献3：日本特开平3-292301号公报
专利文献4：日本特开平7-97333号公报
非专利文献
非专利文献1：Ribas,A.et al.J.Clin.Oncol.2003；21(12):2415-2432.
非专利文献2：Shiku,H.Int.J.Hematol.2003；77(5):435-8.
非专利文献3：Behrens,G.et al.Immunol.Cell Biol.2004；82(1):84-90.
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非专利文献5：Shen L.&Rock K.L.Curr.Opin.Immunol.2006；18(1):85-91.
非专利文献6：Melief,C.J.M.,&van der Burg,S.H.Nature Rev.Cancer,2008；8(5)：351-360.
非专利文献7：Byrd-Leifer,C.A.,et al.Eur.J.Immunol.2001；31(8):2448-57.
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非专利文献9：Gu,X.G.,et al.Cancer Res.,1998；58(15):3385-90.
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非专利文献12：Akiyoshi,K.,et al.J.Proc.Japan.Acad.,1995；71(71B):15.
非专利文献13：Nishikawa,T.,et al.Macromolecules.1994；27(26):7654-59.
非专利文献14：Brewer,J.M.,et al.J.Immunol.1998；161:4000-7.
非专利文献15：Henriksen-Lacey,M.,et al.J.Controlled Release.2011；154(2):131-7.
非专利文献16：Nakanishi,T.,et al.J.Controlled Release.1999；61:233-40.
发明内容
发明要解决的课题和用于解决课题的方案
发明人制作了同时包含源自肿瘤特异性抗原蛋白质和/或病原体来源的蛋白质的杀伤性T细胞和辅助性T细胞的识别表位的长肽，研究了最大限度地带来对癌症的治疗效果的方法。其结果，经过发明人的深入研究，发现通过将作为抗原传递系统的疏水化多糖类的CHP与合成长肽复合体化，再与免疫增强剂并用，在小鼠模型中能够诱导显著的杀伤性T细胞和辅助性T细胞的活化，从而基本上完成了本发明。
这样，用于解决上述课题的本发明涉及的癌症治疗用疫苗制剂的特征在于，其由包含1种以上的合成长肽与疏水化多糖类的复合体的药剂和1种以上的免疫增强剂构成，其中，该合成长肽源自肿瘤特异性抗原蛋白质和/或病原体来源的抗原蛋白质，且同时含有CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和CD4阳性辅助性T细胞识别表位。
此时，上述合成长肽优选是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～120个氨基酸构成的多肽。另外，上述合成长肽优选是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～80个氨基酸构成的多肽。另外，上述合成长肽优选是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～40个氨基酸构成的多肽。
另外，上述CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位优选是肿瘤特异性抗原蛋白质的氨基酸序列的一部分。
另外，上述CD4阳性辅助性T细胞识别表位优选是肿瘤特异性抗原蛋白质的氨基酸序列的一部分。
此时，上述肿瘤特异性抗原蛋白质优选选自MAGE家族或NY-ESO-1、SPANX家族、HER2、WT1、hTERT、RHAMM、生存素。
另外，上述CD8阳性辅助性T细胞识别表位优选是病原体来源的蛋白质的氨基酸序列的一部分。
另外，上述CD4阳性辅助性T细胞识别表位优选是病原体来源的蛋白质的氨基酸序列的一部分。
此时，上述病原体来源的抗原蛋白质选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒、人嗜T淋巴细胞病毒、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒。
另外，上述疏水化多糖类的构成多糖类优选是支链淀粉或甘露聚糖。
另外，上述疏水化多糖类的疏水基优选是胆固醇。
另外，上述疏水化多糖类优选是非离子性的。
另外，上述疏水化多糖类与合成长肽的复合体化后的粒径优选小于180nm。另外，上述疏水化多糖类和合成长肽的复合体化后的粒径更优选为100nm以下。
另外，上述免疫增强剂优选是Toll样受体的激动剂。此时，上述Toll样受体的激动剂优选是多聚IC RNA或CpG寡聚DNA。
另外，上述免疫增强剂优选是将抗原提呈细胞活化的化学疗法剂。此时，将上述抗原提呈细胞活化的化学疗法剂优选是紫杉烷类化合物或蒽环类化合物。
另外，上述免疫增强剂优选是具有防止抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂。此时，上述具有防止抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂优选是JAK/STAT的抑制物质或IDO的抑制物质。
在本发明中，长肽是指具有以下特征的多肽，即，包含肿瘤特异性抗原蛋白质和/或病原体来源的抗原蛋白质中所含有的T细胞识别表位至少2个以上。T细胞识别表位只要是肿瘤特异性抗原蛋白质或病原体来源的抗原蛋白质中所含有的就可以，可以选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-B1、MAGE-B2等MAGE家族分子和NY-ESO-1分子、LAGE、SAGE家族分子、XAGE家族分子、SPANX家族分子、HER2、WT1、hTERT、RHAMM、生存素等肿瘤特异抗原蛋白质中所含有的T细胞识别表位，并且可以选自乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒、人乳头瘤病毒(16型、18型，此外也可以选自31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、68型、69型、73型、82型等)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒等病原体的抗原蛋白质中所含有的T细胞识别表位。在T细胞识别表位中，有杀伤性T细胞识别的CTL表位和辅助性T细胞识别的Th表位。本发明的长肽优选同时包含CTL表位和Th表位各一个以上，但也可以将包含CTL表位的长肽和包含Th表位的长肽单独使用或组合使用。
关于长肽的长度，当为22个氨基酸以下时，因与MHC分子直接结合而产生免疫耐受，因此不能发挥本发明的效果，故而不优选。另外，当比120个氨基酸长时，也不能充分得到本发明的效果，故而不优选。具体而言，优选23～120个氨基酸，更优选23～80个氨基酸，更加优选23～40个氨基酸。该长肽也可以组合2种以上使用。
本发明中所使用的疏水化多糖类，例如可以通过非专利文献11～非专利文献12、专利文献2～专利文献4等中记载的本身已知的方法制造。
对于疏水化多糖类中的多糖类而言，只要糖残基是糖苷键结合的高分子，就没有特别限定。作为构成多糖类的糖残基，例如，可以使用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖等单糖类或来自二糖类或寡糖类的残基。糖残基既可以是1,2-、1,3-、1,4-或1,6-糖苷键结合，其结合也可以是α-或β-型结合的任意一种。另外，多糖类可以是直链状或支链状的任意一种。作为糖残基，优选葡萄糖残基，作为多糖类，可以使用来自天然或合成的支链淀粉(pullulan)、右旋糖酐、直链淀粉、支链淀粉(amylopectin)或甘露聚糖，优选使用甘露聚糖或支链淀粉(pullulan)等。作为多糖类的平均分子量，可以使用50000～150000的分子量。
作为疏水基，例如，每100个单糖希望导入1～5个(重量比5％以下)1根链和2根链的烷基或固醇残基，更优选每100个单糖导入1～3个(重量比3％以下)。但是，疏水基不受上述基团的限定，可以根据被封入的抗原分子量和等电点而适当选择封入率好的疏水基。作为固醇残基，例如，可以列举胆固醇、豆固醇、β-谷固醇、羊毛固醇、麦角固醇残基等，可以优选使用胆固醇残基。另外，作为烷基，可以优选使用碳原子数20以下的烷基，更优选使用碳原子数10～18的烷基，这些可以是直链或支链的任意一种。
作为疏水化多糖类，例如，优选构成多糖类的糖单位每100个有1～5个糖单位的一级羟基以下式(1)：-O-(CH2)mCONH(CH2)nNH-CO-O-R(1)(式中，R表示烷基或固醇残基；m表示0或1；n表示任意的正整数)表示。其中，作为烷基或固醇残基，可以优选使用上述的烷基或固醇残基，n优选为1～8。
另外，作为疏水化多糖类，也可以是如在专利文献4中记载的那样的通过接头结合的疏水化多糖类。
另外，作为疏水化多糖类，优选是非离子性的，在与长肽复合体化后，在生理条件下的ζ电位优选为－2.0mV～+2.0mV。在与长肽复合体化后，在生理条件下的粒径优选小于180nm，更优选为100nm以下。
长肽和疏水化多糖类的复合体，在室温或低温混合长肽和疏水化多糖类的集合体微粒后，可以通过各种色谱技术精制(非专利文献13)。这样操作得到的长肽和疏水化多糖类的复合体可以作为本发明的疫苗制剂直接使用，但也可以根据需要按照通常方法施加灭菌等的操作。
作为免疫增强剂，只要是具有增强抗原提呈细胞活性的作用的药剂即可，更具体而言，可以选自Toll样受体的激动剂和其它抗原提呈细胞刺激剂、具有抑制抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂。作为Toll样受体的激动剂，可以选自非活化菌体和菌体提取物、核酸、脂多糖、脂肽、合成低分子化合物等，可以优选使用CpG寡聚DNA和多聚IC RNA、单磷酸类脂和脂肽等。作为抗原提呈细胞刺激剂，可以使用紫杉烷类药物和蒽环类药物。作为具有抑制抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂，可以选自JAK/STAT的抑制物质和吲哚脱氧酶(IDO)的抑制物质、色氨酸脱氧酶(TDO)的抑制物质等。在该抑制物质中，除了对该因子具有拮抗作用的化合物以外，也包含该因子的中和抗体、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和反义DNA。
本发明的癌症治疗用疫苗可以通过任意方法给药，但优选通过适当的非口服路径，例如静脉内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪组织内、乳腺组织内、吸入或经由肌肉内的路径的注射或以点鼻药等形态的经由粘膜路径的方法等给药。
本发明的癌症治疗用疫苗通常作为将上述有效成分，即合成长肽与疏水化多糖类的复合体和免疫增强剂成分分别制成制剂的试剂盒，能够制成为适合于皮下、静脉内、肌肉内的非口服剂型的制剂。诱导目的免疫所需要的本发明的癌症治疗用疫苗制剂的给药量可以适当决定，例如，作为通常的给药量，作为合成长肽，以0.1mg/次～5mg/次左右的量为基准给药。在给药部位中，实质上使两种制剂的有效成分同时共存是非常重要的，因此，希望实质上同时或连续地将两种制剂给药。以2～20次进行给药是适当的。给药间隔从1～12周选择，但在治疗后期有时选择更长的给药间隔。
发明的效果
根据本发明，能够提供癌症治疗效果极高的癌症治疗用疫苗。
附图说明
图1：制备了来自肿瘤特异性蛋白质MAGE-A4的氨基酸序列的40个氨基酸(aa)的合成长肽(MAGE-A4p264:40)与疏水化多糖类的一种的CHP(在支链淀粉中每100个单糖导入1.7个胆固醇基，平均分子量100000)的复合体(CHP-MAGE-A4p264:40复合体)。将MAGE-A4p264:40或CHP-MAGE-A4p264:40复合体和作为免疫增强剂的CpG寡聚DNA同时对小鼠进行皮下给药(1周间隔，2次)。在最末次给药的1周后回收脾脏细胞，通过细胞内细胞因子染色法测定了对合成长肽中所包含的表位特异性的CD8阳性杀伤性T细胞(图1A)或CD4阳性辅助性T细胞(图1B)的频度。
图2：作为免疫增强剂，使用多聚IC RNA，进行了与图1同样的实验。黑柱表示抗原特性性CD8阳性杀伤性T细胞的频度，白柱表示抗原特异性CD4阳性辅助性T细胞的频度。
图3：作为合成长肽，使用来自作为小鼠肿瘤抗原的突变型ERK2(mERK2)的氨基酸序列的37aa的合成长肽mERK2p121:37，进行了与图2同样的实验。数值表示抗原特异性CD8阳性杀伤性T细胞的频度。
图4：作为疏水化多糖，制备了CHP、CHP-NH2(在支链淀粉中每100个单糖导入1.2个胆固醇基和13个氨基的疏水化多糖，平均分子量100000)、CHP-COOH(在支链淀粉中每100个单糖导入1.2个胆固醇基和27个羧基的疏水化多糖，平均分子量100000)和CHESG(在糖原中每100个单糖导入0.8个胆固醇基，平均分子量2100000)，使用分别与合成长肽MAGE-A4p264:40复合体化的物质，进行了与图1同样的实验。在表1中表示各疏水化多糖-合成长肽复合体的粒径和ζ电位。
图5：使用来自MAGE-A4的氨基酸序列的40aa、80aa或120aa的合成长肽(MAGE-A4p264:40、MAGE-A4p264:80、MAGE-A4p264:120)，进行了与图1同样的实验。p264:80和p264:120分别由p264:40的2次或3次重复序列构成。
图6：使用来自mERK2的氨基酸序列的37aa或74aa的合成长肽(mERK2p121:37、mERK2p121:74)，进行了与图1同样的实验。p121:74是p121:37的2次重复序列。
图7：将MAGE-A4p264:40或CHP-MAGE-A4p264:40复合体与CpG寡聚DNA对BALB/c小鼠同时皮下给药。在7日后，皮下移植将MAGE-A4基因稳定导入的小鼠大肠癌细胞CT26。在图表中表示此后的每个个体的肿瘤面积推移。在MAGE-A4p264:40/CpG寡聚DNA给药组和CHP-MAGE-A4p264:40复合体/CpG寡聚DNA给药组这两者中，与磷酸缓冲生理食盐水(PBS)给药组相比较，确认了肿瘤增殖的显著抑制(p＜0.0001)，但CHP-MAGE-A4p264:40复合体/CpG寡聚DNA给药组的增殖抑制效果显著。
图8：将mERK2p121:37或CHP-mERK2p121:37复合体与CpG寡聚DNA同时对BALB/c小鼠皮下给药。在7日后，皮下移植表达mERK2蛋白质的小鼠纤维肉肿细胞CMS5a。在图表中表示此后的每个个体的肿瘤增殖的推移。只在CHP-mERK2p121:37复合体/CpG寡聚DNA给药组中，与PBS给药组相比较确认了肿瘤增殖的显著抑制(p＜0.03)。
具体实施方式
接着，参照附图说明本发明的实施方式，但本发明的技术范围不受这些实施方式的限定，可以不改变发明要点而以各种方式实施。另外，本发明的技术范围涉及到均等的范围。
＜材料和方法＞
(1)材料
BALB/c小鼠(雌性，5周龄)从日本SLC购入，在三重大学医学部动物中心饲养。在1周时间驯化后用于实验。关于使用小鼠的试验计划得到了三重大学医学部伦理委员会的承认。合成长肽从GenScript公司、Scrum公司或者Biologica公司购入。合成长肽的序列如下：MAGE-A4p264:40(氨基酸序列(序列序号1))：GSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP，包含作为杀伤性T细胞表位序列的从第2位的S到第10位的L的9个氨基酸序列(序列序号2：SNPARYEFL)。包含作为辅助性T细胞表位的从第22位的V到第37位的16个氨基酸序列(序列序号3：VKVLEHVVRVNARVRI))。MAGE-A4p264:80(氨基酸序列(序列序号4)：GSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP，p264:40的2次重复序列)。MAGE-A4p264:120(氨基酸序列(序列序号5)：GSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP，p264:40的3次重复序列)。mERK2p121:37(氨基酸序列(序列序号6)：NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT，包含作为杀伤性T细胞表位序列的从第16位的Q到第24位的L的9个氨基酸序列(序列序号7：QYIHSANVL)，包含作为辅助性T细胞表位序列的从第13位的R到第29位的K的17个氨基酸序列(序列序号8：RGLQYIHSANVLHRDLK))。mERK2p121:74(氨基酸序列(序列序号9)：NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNTNDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT，重复2次p121:37的序列)。合成长肽从Sigma-Genosys购入。肽的氨基酸序列如下。MAGE-A4p265(氨基酸序列(序列序号2)：SNPARYEFL)、mERK29m(氨基酸序列(序列序号7)：QYIHSANVL)。CHP从(株)日油购入。CHP-NH2的合成如下进行，即，以DMSO为溶剂，在氮气氛围下使CHP与1,1’-羰基二咪唑反应后，加入乙二胺使之反应。将反应液透析精制后冷冻干燥，得到CHP-NH2。CHP-COOH的合成如下进行，即，以DMSO为溶剂，在氮气氛围下，以N,N-二甲基-4-氨基吡啶为催化剂，使CHP与琥珀酸酐反应。反应后，将生成物再沉淀和透析后冷冻干燥，得到CHP-COOH。CHESG的合成如下进行，即，以DMSO为溶剂，在氮气氛围下，以二月桂酸二丁基锡为催化剂，使酶合成糖原与胆固醇异氰酸酯反应。反应后，将生成物再沉淀和透析后冷冻干燥，得到CHESG。作为免疫增强剂，多聚IC RNA从Oncovir公司购入。CpG寡聚DNA从Hokkaido System Science购入。咪喹莫特从Sigma-Aldrich购入。FITC标记抗CD4单克隆抗体(克隆RM4-5)、PerCP-Cy5.5标记抗CD8单克隆抗体(克隆53-6.7)、APC标记抗IFNγ抗体(克隆XMG1.2)、PE标记抗IL-2抗体(克隆JES6-5H4)从eBioscience或BD Biosciences购入。
(2)疏水化多糖与合成长肽的复合体的制作
合成长肽以10mg/mL的浓度溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。疏水化多糖以10mg/mL的浓度溶解在含有6M尿素的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)中。相对1mL(10mg)的合成长肽溶液，添加20mL(200mg)的疏水化多糖溶液，在暗处室温静置一夜。移入透析装置(分子量截断值：3500，Thermo Fisher Scientific公司生产)，相对作为透析外液的容积比100倍以上的含有0.6M尿素的PBS，在室温中从2小时透析一夜。接着，相对作为透析外液的容积比100倍以上的含有0.06M尿素的PBS，在室温中从2小时透析一夜。再相对作为透析外液的容积比100倍以上的PBS，在室温中从2小时透析一夜。回收透析内液，测定UV吸收(280nm)，求出合成长肽的最终浓度。疏水化多糖类-合成长肽复合体的粒径使用动态光散射光度计(Zetasizer，Malvern Instruments公司生产)测定，采用Z-Average值。ζ电位采用ζ电位测定装置(SZ-100，堀場制作所生产)测定。
(3)给药方法
将疏水化多糖类-合成长肽复合体和免疫增强剂对小鼠同时给药。给药以1周间隔在小鼠的背部皮下注射2次。对于给药量而言，每次投与疏水化多糖类-合成长肽复合体作为合成长肽相当于给药0.1mg。免疫增强剂CpG寡聚DNA或多聚IC RNA均在疏水化多糖类-合成长肽复合体给药部位的附近每次皮下注射0.05mg。
(4)小鼠免疫细胞的分离精制
在最末次给药的1周后，以下述要领从给药小鼠中分离脾脏细胞。从小鼠中分离脾脏，以RPMI1640培养基洗净并脱血。使用载玻片将脾脏磨碎后，在RPMI1640培养基中回收游离的细胞。离心分离(400×g，5分钟，4℃)后除去上清液，加入2mL的ACK溶液处理细胞1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，离心分离(400×g，5分钟，4℃)。除去上清液，将细胞悬浮在适当量的RPMI1640培养基中。计数细胞数后，悬浮在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，使细胞浓度为1×107个/mL。
(5)细胞内细胞因子染色
将分离得到的脾脏细胞以每孔5×106个/0.5mL添加在24孔培养板(Nunc)中。作为再刺激用的肽，以10μM的浓度添加MAGE-A4p264、MAGE-A4p265或mERK29m，以37℃、5％CO2培养6小时。此后，每孔添加50μL在含有10％FBS的RPMI1640培养基中稀释了10倍的BD GoldiPlugTM(BD生命科学)，以37℃、5％CO2培养6小时。回收细胞，移入96孔圆底微孔培养板(Nunc)。离心分离(1200rpm，1分钟，4℃)除去上清液后，在每孔50μL的染色用缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白的PBS)中悬浮。以制造商推荐量添加FITC标记抗CD8单克隆抗体或FITC标记抗CD4单克隆抗体，混合后，在4℃暗处静置15分钟。以200μL染色用缓冲液洗净2次细胞后，添加100μL的BDCytofix/CytopermTM缓冲液(BD Biosciences)，非常轻柔地混合。在室温暗处静置20分钟后，以100μL的BD Perm/WashTM缓冲液(BDBiosciences)洗净2次。向细胞中加入添加了各种抗细胞因子抗体的50μL的BD Perm/Wash TM缓冲液，轻柔悬浮后，在室温暗处静置15分钟。以100μL的BD Perm/WashTM缓冲液(BD Biosciences)洗净2次细胞后，在200μL染色用缓冲液中重新悬浮，移入圆底聚苯乙烯管(BDBiosciences)。
(6)流式细胞术分析
细胞在流式细胞仪(FACS CantoⅡ，BD生命科学)中，使用附属的分析软件(FACSDiva)进行分析。
(7)肿瘤排斥试验
以下述要领将MAGE-A4基因稳定导入的小鼠大肠癌细胞CT26细胞株或表达mERK2的小鼠纤维肉肿CMS5a细胞株进行皮下移植。在PBS中洗净在T75瓶(Nunc公司)中培养的CT26细胞株或CMS5a细胞株后，以含有0.5％胰蛋白酶的PBS剥离细胞，在含有10％FBS的RPMI1640培养基中回收细胞。离心分离(400×g，5分钟，4℃)后，除去上清液，在RPMI1640培养基中洗净2次后，以1×106个/100μL的浓度在RPMI1640重新悬浮，以100μL/个体的量对BALB/c小鼠进行皮下移植。此后，经时地测定肿瘤面积。
(8)统计分析
在肿瘤排斥试验中的数据比较使用MS Excel(Microsoft)，通过Student t检验进行。
＜试验结果＞
在图1的图表中表示通过将合成长肽与疏水化多糖类复合体化，再将免疫增强剂同时给药，实现了将合成长肽作为抗原的特异性杀伤性T细胞和辅助性T细胞的明确诱导。即使将来自肿瘤特异性蛋白质MAGE-A4的40个氨基酸(aa)的合成长肽(MAGE-A4p264:40)单独地向小鼠给药，对该肽特异性的杀伤性T细胞和辅助性T细胞也不被诱导。即使与该肽同时投与作为免疫增强剂的CpG寡聚DNA(Toll样受体9激动剂)，目的T细胞也不被诱导。但是，如果将该肽作为与疏水化多糖类的一种的CHP的复合体，再和CpG寡聚DNA同时给药，就能够明确地观察到抗原特异性杀伤性T细胞和辅助性T细胞的诱导。当仅投与CHP-MAGE-A4p264:40复合体时，不引起那样的T细胞诱导。由此可知，与疏水化多糖CHP复合体化之后，长肽疫苗就能够最大限度地享受作为免疫增强剂的CpG寡聚DNA的增强效果。
作为免疫增强剂，取代CpG寡聚DNA，使用多聚IC RNA(Toll样受体3激动剂)进行了与图1同样的试验。依然是CHP-合成长肽复合体的免疫增强剂的效果比合成长肽单体显著(图2)。这提示了对于增强由CHP-合成长肽复合体的给药所产生的免疫诱导的免疫增强剂而言，只要是Toll样受体激动剂等能够活化抗原提呈细胞的免疫增强剂，就可以全部广泛地利用。
即使将合成长肽从源自MAGE-A4蛋白质的p264:40变更为源自mERK2蛋白质的p121:37(37aa)，与图2同样的结果也被再现(图3)。这表示由CHP-合成长肽复合体和免疫增强剂的同时给药所产生的明确的免疫诱导不受特定序列的合成长肽的限定。
为了研究疏水化多糖的尺寸和电荷对疫苗性能的影响效果，将CHP变更为CHP-NH2、CHP-COOH或CHESG，进行了与图1同样的试验(图4)。非离子性的CHP通过化学修饰成为离子性的是CHP-NH2和CHP-COOH(表1)。但是，CHP-COOH与合成长肽复合体化后，ζ电位接近于0，事实上变为非离子性。CHESG是将糖链部分变为糖原而增大了粒径(表1)。试验的结果为，由CpG寡聚DNA产生的增强效果在与CHP-NHx或CHESG复合体化的长肽疫苗的给药组中明显地减弱。在与CHP-COOH复合体化的长肽疫苗给药组中，由CpG寡聚DNA产生的增强效果减弱不显著。由此明确，本发明中使用的疏水化多糖满足在与合成长肽复合体化后是非离子性，且粒径小于180nm、优选小于100nm左右的条件为佳。有报告在使用脂质体的现有的疫苗抗原传递系统中，尺寸越大或越带电，由疫苗产生的免疫诱导越优异(非专利文献14～16)。但是，就本发明的疏水化多糖的情况而言，明确了与长肽的复合体后的尺寸越小或在复合体后是非离子性的为佳，完全不同于现有的脂质体的情况。
[表1]
将长肽的长度从40aa变更为80aa或120aa，进行了与图1同样的试验(图5)。80aa或120aa的长肽序列分别是40aa长肽的2次或3次重复。无论哪种长度的长肽与CHP的复合体都诱导了目的杀伤性T细胞应答，但由CpG寡聚DNA产生的增强效果随着长肽的氨基酸长度变长而减弱。由此开始可以明确，本发明中使用的长肽的长度为120aa以下，优选为80aa以下，更优选为40aa以下。
将长肽从源自MAGE-A4蛋白质的长肽变更为源自mERK2蛋白质的长肽，进行了与图5同样的试验(图6)。和图5同样，由CpG寡聚DNA产生的增强效果随着长肽的氨基酸长度变长而减弱。
在移植了表达MAGE-A4蛋白质的小鼠大肠癌细胞CT26的荷癌小鼠模型中，与PBS给药组比较，能够在CHP-MAGE-A4p264:40复合体和CpG寡聚DNA的同时给药组中确认显著的肿瘤增殖抑制效果(p＜0.0001)，相比于MAGE-A4p264:40和CpG寡聚DNA的同时给药组，增殖抑制效果也显著地优异(p＜0.05)(图7)。该结果与在图1中表示的各疫苗的抗原特异性T细胞的诱导能力的一致性良好。
在移植了表达mERK2蛋白质的小鼠纤维肉肿细胞CMS5a的荷癌小鼠模型中，与PBS给药组比较，能够在CHP-mERK2p121:37复合体和CpG寡聚DNA的同时给药组中确认显著的增殖抑制效果(p＜0.03)(图8)。另一方面，在mERK2p121:37和CpG寡聚DNA的同时给药组中，不能确认显著的增殖抑制效果。
以上的结果明确显示，在合成长肽单体、合成长肽和免疫增强剂同时给药、疏水化多糖-合成长肽复合体的单体给药时，抗原特异性杀伤性T细胞和辅助型T细胞的诱导都是不充分的，不能期待作为癌治疗用疫苗的治疗效果，另一方面，如果将疏水化多糖-合成长肽复合体与免疫增强剂同时给药，疫苗就可以最大限度地享受免疫增强剂的作用，能够实现抗原特异性T细胞活化并体现对肿瘤的治疗效果。另外，本发明明确了最大限度地发挥效果所需要的疏水化多糖的物理化学性质和长肽的肽长。
根据本发明，能够提供癌症治疗效果极高的癌症治疗用疫苗。

Claims (22)

1.一种癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
其含有包含1种以上的合成长肽与疏水化多糖类的复合体的药剂和1种以上的免疫增强剂，其中，该合成长肽源自肿瘤特异性抗原蛋白质和/或病原体来源的抗原蛋白质，且同时含有CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和CD4阳性辅助性T细胞识别表位。
2.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述合成长肽是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～120个氨基酸构成的多肽。
3.如权利要求2所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
当所述合成长肽使用全部氨基酸序列中22个以下的连续氨基酸序列时，能够在CD8阳性细胞毒性T细胞中产生免疫耐受、消耗、功能不全。
4.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述合成长肽是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～80个氨基酸构成的多肽。
5.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述合成长肽是含有至少2种以上的T细胞识别表位的、由23～40个氨基酸构成的多肽。
6.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位是肿瘤特异性抗原蛋白质的氨基酸序列的一部分。
7.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述CD4阳性辅助性T细胞识别表位是肿瘤特异性抗原蛋白质的氨基酸序列的一部分。
8.如权利要求17所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述肿瘤特异性抗原蛋白质选自MAGE家族、NY-ESO-1、SPANX家族、HER2、WT1、hTERT、RHAMM或生存素。
9.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述CD8阳性辅助性T细胞识别表位是病原体来源的蛋白质的氨基酸序列的一部分。
10.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述CD4阳性辅助性T细胞识别表位是病原体来源的蛋白质的氨基酸序列的一部分。
11.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述病原体来源的抗原蛋白质选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒、人嗜T淋巴细胞病毒、人疱疹病毒8型、人免疫缺陷病毒。
12.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述疏水化多糖类的构成多糖类是支链淀粉或甘露聚糖。
13.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述疏水化多糖类的疏水基是胆固醇。
14.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述疏水化多糖类是非离子性的。
15.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述疏水化多糖类与合成长肽的复合体化后的粒径为180nm以下。
16.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述疏水化多糖类与合成长肽的复合体化后的粒径为100nm以下。
17.如权利要求16所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述免疫增强剂是Toll样受体的激动剂。
18.如权利要求17所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述Toll样受体的激动剂是多聚IC RNA或CpG寡聚DNA。
19.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述免疫增强剂是将抗原提呈细胞活化的化学疗法剂。
20.如权利要求19所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
将所述抗原提呈细胞活化的化学疗法剂是紫杉烷类化合物或蒽环类化合物。
21.如权利要求1所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
所述免疫增强剂是具有防止抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂。
22.如权利要求21所述的癌症治疗用疫苗制剂，其特征在于：
具有防止所述抗原提呈细胞获得免疫抑制活性的作用的药剂是JAK/STAT的抑制物质或IDO的抑制物质。
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