KR20180006945A - 암 치료 및 예방용 백신 - Google Patents

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제니퍼 샨다 뷰엘
존 크리스토퍼 캐슬
로버트 벤자민 스테인
다니엘 루이스 레비
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아게누스 인코포레이티드
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Abstract

치료학적 백신 (예컨대, 암 백신)으로서 유용한 조성물, 및 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 조성물은 일반적으로 스트레스 단백질, 및 환자의 암에 존재하는 암-특이 돌연변이를 포함하는, 포스포펩티드 또는 포스포펩티드 모방체일 수 있는 적어도 하나의 합성 펩티드를 이용한다.

Description

암 치료 및 예방용 백신
본 발명은 암 생물학 분야, 및 더욱 구체적으로, 항암 백신을 사용하여 재발을 치료 및 억제시키는 것에 관한 것이다.
암 치료에서 면역요법이 중요한 도구가 되어 가고 있다. 한 면역요법 접근법은, 환자의 면역계가 암 세포를 표적화하고, 그를 파괴시키도록 그를 능동적으로 교육시키는, 암-특이 항원성 펩티드를 포함하는 치료학적 암 백신을 사용하는 것을 포함한다. 그러나, 상기 치료학적 암 백신 생성은 암-특이 항원성 펩티드의 이용가능성으로 인해 제한을 받는다.
따라서, 당업계에서는 암-특이 항원성 펩티드의 확인, 및 상기 펩티드를 포함하는 효과적인 항암 백신의 생성을 위한 개선된 방법이 요구되고 있다.
본 개시내용은 치료학적 백신 (예컨대, 암 백신)으로서 유용한 조성물, 및 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 조성물은 일반적으로 스트레스 단백질 및 환자의 암에 존재하는 암-특이 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 합성 항원성 펩티드를 사용한다. 본원에 개시된 방법은 특히 단지 미량의 대상체의 조직 (예컨대, 단일 세포 또는 엑소좀)만을 사용함으로써 치료학적 백신 (예컨대, 암 백신) 조성물이 제조될 수 있도록 한다는 점에서 이롭다.
한 측면에서, 본 개시내용은 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 (예컨대, 인간 MHC-결합 에피토프)를 포함하고, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프 (예컨대, 야생형 인간 MHC-결합 에피토프)만을 함유하는 20개 이하의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 제1 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하고, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 5개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 제1 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프, 예컨대, 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 조성물은 100개 이하의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 또는 20개; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 500 nM 이하의 IC50으로 MHC 분자에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 500 nM 이하의 IC50으로 MHC I 분자에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 1,000 nM 이하의 IC50으로 MHC II 분자에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 1,000 nM 이하의 IC50으로 MHC II 분자에 결합한다. 특정 실시양태에서, MHC 분자는 인간 MHC 분자이다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 암 세포로부터의 1개 초과의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 1개 초과의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 500 nM 미만의 IC50으로 1개 초과의 상이한 MHC 분자에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 500 nM 미만의 IC50으로 1개 초과의 상이한 MHC 분자에 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 단일 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 정상 세포와 비교하여 대상체의 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 대상체의 정상 세포와 비교하여 대상체의 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 아미노산 돌연변이 또는 유전자 융합 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 아미노산 돌연변이 또는 유전자 융합 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 0.05 초과의 대립유전자 빈도로 대상체의 종양에 존재한다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 변형된 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 변형된 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 아미노산은 측쇄 히드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His이다. 특정 실시양태에서, 변형된 아미노산은 측쇄 히드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His 아미노산의 모방체이다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 같은 적응증의 다중의 암들 간의 백만개의 맵핑된 리드당 킬로베이스의 전사체당 리드 (RPKM: Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped read)가 1 초과인 중앙 (median) 발현 수준을 가진다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 같은 적응증의 다중의 암들 간의 백만개의 맵핑된 리드당 킬로베이스의 전사체당 리드 (RPKM)가 1 초과인 중앙 발현 수준을 가진다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 종양에서 정규화된 돌연변이 함유 리드 계수 (NMRC: Normalized Mutation-containing Read Count)가 10 초과인 발현 수준을 가진다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 대상체의 종양에서 NMRC가 10 초과인 발현 수준을 가진다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 항원성 펩티드를 투여받은 대상체에서 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포 반응을 자극시킨다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 항원성 펩티드를 투여받은 대상체에서 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포 반응을 자극시킨다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도한다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 5 내지 50개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 5 내지 50개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 25 내지 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 25 내지 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 27 내지 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 27 내지 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 21 내지 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 21 내지 31개의 아미노산 길이이다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 아미노산 서열의 대략 중간에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 아미노산 서열의 대략 중간에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 27개의 아미노산 길이이고, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 27개의 아미노산 길이이고, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 29개의 아미노산 길이이고, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 29개의 아미노산 길이이고, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 31개의 아미노산 길이이고, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 31개의 아미노산 길이이고, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 화학적으로 합성된 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 화학적으로 합성된 펩티드이다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 그의 N- 또는 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함하고, 더욱 바람직하게, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 그의 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함하고/거나, 열 충격 단백질 결합 서열은 펩티드 링커를 통해 항원성 펩티드의 나머지 부분에 연결되어 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그의 N- 또는 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함하고, 더욱 바람직하게, 항원성 펩티드는 각각 그의 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함하고/거나, 열 충격 단백질 결합 서열은 펩티드 링커를 통해 항원성 펩티드의 나머지 부분에 연결되어 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 FFRK (서열번호 447)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 서열번호 439-446으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 서열번호 439이다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 C-말단에 서열번호 477의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 C-말단에 서열번호 477의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 N-말단에 서열번호 478의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 N-말단에 서열번호 478의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 i) 종양-특이 돌연변이를 포함하는 제1 부분; 및 ii) 열 충격 단백질 결합 서열, 및 임의적으로 펩티드 링커를 포함하는 제2 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 i) 종양-특이 돌연변이를 포함하는 제1 부분; 및 ii) 열 충격 단백질 결합 서열, 및 임의적으로 펩티드 링커를 포함하는 제2 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 27-31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 27개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 29개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 제1 부분은 제1 부분의 아미노산 서열의 대략 중간에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 27개의 아미노산 길이이고, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 29개의 아미노산 길이이고, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 제1 부분의 길이는 31개의 아미노산 길이이고, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다. 특정 실시양태에서, 제2 부분은 서열번호 439-446, 447, 477, 및 478로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 38개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 38개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 42개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 42개의 아미노산 길이이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 2개의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 또는 20개; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 각 복합체 중 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 적어도 1:1 (예컨대, 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 49:1, 최대 100:1까지)이다. 특정 실시양태에서, 각 복합체 중 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 1:1 이하 (예컨대, 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:50, 최소 1:100 이하까지)이다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 MYC, K-RAS, N-RAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, APC, CDC27, CDK4, 전립선 특이 항원, 알파-태아단백질, 유방 뮤신, gp100, g250, p53, MART-I, MAGE, BAGE, GAGE, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 11, 티로시나제 관련 단백질, 또는 RAD50의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 서열번호 1-478로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 서열번호 1-478로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 재조합 스트레스 단백질이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린 (calreticulin), 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 인간 hsc70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsp70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 인간 hsp70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 결합되어 있다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 공유적으로 결합되어 있다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양은 10 ㎍ 내지 600 ㎍이다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양은 25 ㎍이다.
특정 실시양태에서, 대상체에게 투여되었을 때, 각각의 복합체들은 대상체에서 세포 표면 상의 MHC 분자에 의해 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 제시하는 것을 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 애주번트를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 애주번트는 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 애주번트는 QS-21을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물 중 QS-21의 양은 10 ㎍, 25 ㎍, 또는 50 ㎍이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 대상체의 암 세포로부터의 게놈 DNA의 하나 이상의 엑솜 (exome)의 서열을 결정하는 단계; (b) 참조 게놈 DNA와 비교하였을 때, 돌연변이체 단백질을 코딩하는 하나 이상의 비-동의 (non-synonymous) 돌연변이체 대립유전자를 엑솜으로부터 확인하는 단계; (c) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 암 세포에서 발현되는지 여부를 측정하는 단계; (d) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도를 측정하는 단계; (e) 대상체의 하나 이상의 MHC 유형을 측정하는 단계; (f) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 돌연변이체 펩티드를 선별하는 단계로서, 여기서, 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도는 0.05 초과이고, 이는 대상체의 암 세포에서 발현되고, 여기서, 돌연변이체 펩티드는 대상체에게 투여되었을 때, 대상체의 MHC 분자 중 적어도 하나에 의해 제시될 수 있을 것으로 예상되는 것인 단계; 및 (g) 단계 (f)에서 선별된 펩티드를 하나 이상 포함하는 하나 이상의 펩티드를 합성하여 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 항원성 펩티드를 제조하는 단계를 포함하는, 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 (예컨대, 인간 MHC-결합 에피토프)를 포함하는 항원성 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자를 함유하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 암 세포에서 NMRC가 10 초과인 중앙 발현 수준을 가지는 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 다른 개체에서 같은 적응증의 암 세포에서 RPKM이 1 초과인 중앙 발현 수준을 가지는 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 결합 친화도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 결합 친화도는 컴퓨터 모델링에 의해 예측된다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 500 nM 미만인 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 부류 I 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 500 nM 미만인 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 부류 II 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 1,000 nM 미만인 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드는 특정 유형의 암의 특징이 되는 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩되는 것을 추가로 요구한다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별은 돌연변이체 펩티드가 유전자 융합 돌연변이, 또는 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이를 함유하는 것을 추가로 요구한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 (i) 돌연변이체 펩티드 중 예측된 MHC-결합 에피토프의 개수가 많을수록 순위는 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드 중에 존재하는 예측된 MHC-결합 에피토프의 개수; (ii) IC50이 낮을수록 순위는 더 높은 것인, 대상체의 MHC에의 결합에 대한 돌연변이체 펩티드의 IC50; (iii) 돌연변이체 펩티드의 야생형 등가물이 대상체의 정상 세포에서 발현되지 않는다면, 돌연변이체 펩티드 순위가 더 높은 것인, 대상체의 정상 세포 중의 돌연변이체 펩티드의 야생형 등가물의 발현의 존재 또는 부재; (iv) 안정성이 높을수록 순위가 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드의 C-말단의 대상체의 MHC에의 결합 안정성; 및/또는 (v) 돌연변이체 펩티드인 것으로 예측되는, 프로테아좀에 대한 기질이 우수할수록 순위가 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드의 프로테아좀 분해의 예측 동역학적 성질에 기초하여, 단계 (f)에서 선별된 돌연변이체 펩티드를 순위화하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 100개 이하의 (예컨대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개) 최고 순위 펩티드가 단계 (g)에서 합성된다.
특정 실시양태에서, 게놈 DNA는 대상체로부터의 종양 샘플 또는 체액으로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 게놈 DNA는 대상체로부터 수득된 엑소좀, 또는 순환 종양 세포로부터 단리된다. 특정 실시양태에서, 게놈 DNA는 대상체로부터 수득된 순환 종양 세포 DNA이다.
특정 실시양태에서, 엑솜의 서열은 차세대 서열분석에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 참조 게놈 DNA는 대상체의 정상 세포로부터의 게놈 DNA이고, 여기서, 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도는 단계 (d)에서 차세대 서열분석 리드 재맵핑에 의해 결정된다.
특정 실시양태에서, 비-동의 돌연변이체 대립유전자의 발현은 단계 (c)에서 대상체의 암 세포로부터 단리된 mRNA의 차세대 서열분석에 의해 결정된다.
특정 실시양태에서, 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자는 대상체에서 또는 적어도 1,000개의 게놈에서 발견되는 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)이 아니다.
특정 실시양태에서, 합성된 펩티드의 길이는 5 내지 50개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 합성된 펩티드의 길이는 25 내지 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 합성된 펩티드의 길이는 27 내지 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 합성된 펩티드의 길이는 21 내지 31개의 아미노산 길이이다.
특정 실시양태에서, 암 세포는 다발성 골수종 또는 다형성 아교모세포종 세포이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 항원성 펩티드 중 하나 이상의 것을 제조하였다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 항원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 모두 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조하였다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 의약으로서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본원에서는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 치료학적 백신으로서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 암 백신으로서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 대상체에서의 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 암을 앓는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 제1 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암을 앓는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암을 앓는 대상체에게 치료학상 유효량의 본원에 개시된 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 하기 실시양태는 상기 방법, 둘 모두에 그뿐만 아니라, 사용하기 위한 용도의 상기 조성물에도 동일하게 적용된다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 하나 이상의 것은 대상체 그 자신의 암 세포에 존재하는 것으로 확인된 것이다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 모두 대상체 그 자신의 암 세포에 존재하는 것으로 확인된 것이다.
특정 실시양태에서, 대상체로부터 충분하지 않은 양의 종양 세포가 이용가능한 바, 이를 통해 적어도 약 65% 순도로 정제된 적어도 150 ㎍의 스트레스 단백질을 종양 세포로부터 단리시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 인간 hsc70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsp70이다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 인간 hsp70이다. 특정 실시양태에서, 대상체의 종양의 습식 중량은 6 g 이하 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 g)이다.
특정 실시양태에서, 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도할 수 있는 조성물의 능력은 대상체에게 조성물을 투여하기 이전에 측정된다. 특정 실시양태에서, 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도할 수 있는 조성물의 능력은 대상체에게 조성물을 투여한 이후에 측정된다.
특정 실시양태에서, 조성물은 10 ㎍ 내지 600 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 25 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 240 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 조성물은 4주 동안 매주 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 4주간의 매주 투약 이후에, 적어도 2회분의 추가 용량의 조성물이 대상체에게 격주로 투여된다. 특정 실시양태에서, 총 적어도 6회분 용량의 조성물이 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 최종의 매주 또는 격주 투약 후 3개월째 부스터로서 추가로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 1년 동안 매 3개월마다 추가로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 레날리도마이드 (lenalidomide), 덱사메타손 (dexamethasone), 또는 시클로포스파미드 (cyclophosphamide)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제는 4-아미노-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미다미드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 체크포인트 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 체크포인트 항체는 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 사용하기 위한 용도의 제1 조성물은 대상체에게 레날리도마이드, 덱사메타손, 또는 시클로포스파미드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 사용하기 위한 용도의 제1 조성물은 대상체에게 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제다. 특정 실시양태에서, 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제는 4-아미노-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미다미드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 사용하기 위한 용도의 제1 조성물은 대상체에게 체크포인트 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 체크포인트 항체는 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 레날리도마이드, 덱사메타손, 또는 시클로포스파미드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 레날리도마이드, 덱사메타손, 또는 시클로포스파미드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 레날리도마이드, 덱사메타손, 또는 시클로포스파미드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 레날리도마이드, 덱사메타손, 또는 시클로포스파미드를 포함하는 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제를 포함하는 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 체크포인트 항체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 체크포인트 항체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 체크포인트 항체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 체크포인트 항체를 포함하는 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 대상체의 암과 동일한 유형의 암에서 빈번하게 발견되는 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물은 적어도 2개의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 또는 20개; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물 중의 스트레스 단백질은 재조합 스트레스 단백질이다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물 중의 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 화학적으로 합성된 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물 중의 항원성 펩티드는 각각 화학적으로 합성된 펩티드이다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는, 20개 이하의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물은 100개 이하의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 또는 20개; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 조성물은 제2 조성물과 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 조성물은 제2 조성물과 순차적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 투여 이전에 투여된다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나는 MYC, K-RAS, N-RAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, APC, CDC27, CDK4, 전립선 특이 항원, 알파-태아단백질, 유방 뮤신, gp100, g250, p53, MART-I, MAGE, BAGE, GAGE, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 11, 티로시나제 관련 단백질, 또는 RAD50의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 MYC, K-RAS, N-RAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, APC, CDC27, CDK4, 전립선 특이 항원, 알파-태아단백질, 유방 뮤신, gp100, g250, p53, MART-I, MAGE, BAGE, GAGE, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 11, 티로시나제 관련 단백질, 또는 RAD50의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 다발성 골수종 또는 다형성 아교모세포종이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 개시된 제2 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 개시된 제2 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 개시된 제2 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 기술된 제2 조성물을 포함하는 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 제1 조성물은 제2 조성물과 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제1 조성물은 제2 조성물과 순차적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 투여 이전에 투여된다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 치료학적 백신으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 개시된 제2 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 암 백신으로서 사용하기 위한 용도의 (a) 본 발명의 제1 조성물, 및 (b) 본원에 개시된 제2 조성물을 제공한다.
상기 조성물, 사용하기 위한 용도의 조성물, 및 방법 모두의 특정 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
상기 조성물, 사용하기 위한 용도의 조성물, 및 방법 모두의 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프는 인간 MHC-결합 에피토프이다.
상기 조성물, 사용하기 위한 용도의 조성물, 및 방법 모두의 특정 실시양태에서, MHC 분자는 인간 MHC 분자이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 스트레스 단백질 및 대상체의 암 세포로부터 유래된 제1 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 암을 앓거나, 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 면역화시키기 위한 면역원성 조성물로서, 여기서, 제1 펩티드는 대상체의 정상 세포가 아닌, 대상체의 암 세포에 존재하는 돌연변이체이고, 여기서, 제1 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다. 조성물은 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 MYC, KRAS, NRAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, APC, CDC27, CDK4, 전립선 특이 항원, 알파-태아단백질, 유방 뮤신, gp100, g250, p53, MART-I, MAGE, BAGE, GAGE, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 11, 티로시나제 관련 단백질, 및 RAD50로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이체 단백질로부터 유래된 제2 펩티드 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있고 (문헌 [Warren and Holt, Human Immunology, 2010. 71: p. 245-254] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조); 여기서, 제2 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않고, 여기서, 제1 펩티드는 MYC, K-RAS, N-RAS, T53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, APC, CDC27, CDK4, 전립선 특이 항원, 알파-태아단백질, 유방 뮤신, gp100, g250, p53, MART-I, MAGE, BAGE, GAGE, 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 11, 티로시나제 관련 단백질, 또는 RAD50으로부터 유래된 펩티드가 아니다. 예를 들어, 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 K-RAS로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 G13D, G12V, G12R, G12D, 또는 G12C 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 NPM1로부터 유래된 것일 수 있고, W288fs*12 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 H-RAS로부터 유래된 것일 수 있고, G12V 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 FGFR3로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 Y373C, S249C, R248C, 및 G697C중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 MSH6로부터 유래된 것일 수 있고, P1087fs*5 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 TP53으로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 R273H 또는 R248Q 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 EGFR로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 L858R 또는 E746_A750del 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 PIK3CA로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 H1047R 또는 E545K 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 ABL1로부터 유래된 것일 수 있고, T315I 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 CTNNB1로부터 유래된 것일 수 있고, 돌연변이 T41A, S45del, S45F, 또는 S37A 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 KIT로부터 유래된 것일 수 있고, D816V 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 HNF1A로부터 유래된 것일 수 있고, P291fs*51 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 JAK2로부터 유래된 것일 수 있고, V617F 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 BRAF로부터 유래된 것일 수 있고,V600E 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 IDH1로부터 유래된 것일 수 있고, R132H 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 N-RAS로부터 유래된 것일 수 있고, Q61R 또는 Q61K 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 RET로부터 유래된 것일 수 있고, M918T 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 PDGFRA로부터 유래된 것일 수 있고, D842V 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 MET로부터 유래된 것일 수 있고, Y1253D 돌연변이를 포함한다. 적어도 하나의 제2 펩티드는 돌연변이체 APC로부터 유래된 것일 수 있고, T1556fs*3 또는 S1341R 돌연변이 중 적어도 하나를 포함한다. 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 또는 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 애주번트는 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 포함할 수 있다. 제1 펩티드 중 하나는 번역 후 변형된 펩티드, 예컨대, 포스포펩티드일 수 있다. 조성물은 대상체의 암 세포로부터 유래된 제1 펩티드 중 적어도 하나에 대한 복수 개의 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 약 9-11개의 아미노산 내지 약 27-31개의 아미노산일 수 있다. 암은 예를 들어, 다발성 골수종 또는 아교모세포종일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 펩티드 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 번역 후 변형된 잔기는 모방체 잔기로 치환된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 펩티드 중 적어도 하나에서 적어도 하나의 인산화된 잔기는 포스포모방체 잔기로 치환된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 스트레스 단백질 및 대상체의 암 세포로부터 유래된 제1 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 용도의 면역원성 조성물로서, 여기서, 제1 펩티드는 대상체의 정상 세포가 아닌, 대상체의 암 세포에 존재하는 돌연변이체이고, 여기서, 제1 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 스트레스 단백질 및 대상체의 암 세포로부터 유래된 제1 펩티드 중 적어도 하나 및 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서, 제1 펩티드는 대상체의 정상 세포가 아닌, 대상체의 암 세포에 존재하는 돌연변이체이고, 여기서, 제1 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 스트레스 단백질 및 대상체의 암 세포로부터 유래된 제1 펩티드 중 적어도 하나를 포함하는, 암을 앓거나, 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 면역화시키는 방법에서 사용하기 위한 용도의 면역원성 조성물로서, 여기서, 제1 펩티드는 대상체의 정상 세포가 아닌, 대상체의 암 세포에 존재하는 돌연변이체이고, 여기서, 제1 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제1 조성물 및 (b) 애주번트를 포함하는 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 애주번트를 함유하는 제2 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하여 암을 앓는 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 암을 앓는 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다. 암은 예를 들어, 다발성 골수종 또는 아교모세포종일 수 있다. 사용하기 위한 용도의 본 발명의 방법, 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트는 레날리도마이드 또는 덱사메타손을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 시클로포스파미드 또한 투여될 수 있다. 또한, 사용하기 위한 용도의 본 발명의 방법, 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트는 체크포인트 항체 (예컨대, 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3) (이는 또한 모노클로날 항체일 수 있다)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 대상체는 또한 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제, 예컨대, 4-아미노-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미다미드를 투여받을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암으로부터 회복된 대상체에게 제1 측면의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암으로부터 회복된 대상체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 암으로부터 회복된 대상체를 면역화시키는 방법에서 사용하기 위한 용도의 본 발명의 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트에 관한 것이다. 암은 예를 들어, 다발성 골수종 또는 아교모세포종일 수 있다. 사용하기 위한 용도의 본 발명의 방법, 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트는 레날리도마이드 또는 덱사메타손을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 시클로포스파미드 또한 투여될 수 있다. 또한, 사용하기 위한 용도의 본 발명의 방법, 면역원성 조성물, 조성물, 키트 또는 부품들의 키트는 체크포인트 항체 (예컨대, 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3) (이는 또한 모노클로날 항체일 수 있다)를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 면역원성 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 레날리도마이드, 덱사메타손, 시클로포스파미드, 및 체크포인트 항체 (예컨대, 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3, 이는 모노클로날 항체일 수 있다)를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은
(a) 암을 앓는 대상체의 암 조직의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플 중에 존재하는 게놈 DNA의 엑솜을 서열분석하는 단계;
(c) 야생형 대조군과 비교하여 돌연변이체 단백질을 코딩하는 비-동의 체세포 돌연변이체 대립유전자를 샘플로부터 확인하는 단계;
(d) 상기 샘플, 또는 대상체의 암 조직으로부터의 새로운 샘플로부터의 mRNA를 서열분석하여 암에서 발현된 mRNA에 출현하는 단계 (c)에서 확인된 상기 체세포 돌연변이를 확인하는 단계;
(e) 샘플 중 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도를 측정하는 단계;
(f) 예컨대, 같은 적응증의 다른 암과 비교하여 돌연변이체 대립유전자의 중앙 발현 수준을 측정함으로써 샘플 중 돌연변이체 대립유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(g) 대상체의 MHC 유형을 결정하는 단계;
(h) 1) 대립유전자 빈도가 0.05 초과이고;
2) 같은 적응증의 모든 암들 간의 1 RPKM 유니트 초과인 중앙 발현 수준을 가지고;
3) 대상체 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 결합할 것으로 예측되는 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 선별하는 단계;
(i) 단계 (h)에서 선별된 돌연변이체 펩티드를 돌연변이 예측 개수에 의해 및 대상체의 MHC 유형에의 결합에 대한 IC50에 의해 순위화하는 단계; 및
(j) 각 펩티드는 단계 (i)에서 순위화된 펩티드들 중 하나를 포함하는 것인, 약 27-31개의 아미노산으로 이루어진 하나 이상의 펩티드를 합성하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체로부터 면역원성 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서, 야생형 대조군은 대상체로부터 단리된 건강한 조직 또는 세포일 수 있다. 하나 이상의 펩티드는 포스포펩티드일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 면역원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 암을 앓는 대상체의 암 조직의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플 중에 존재하는 게놈 DNA의 엑솜을 서열분석하는 단계;
(c) 야생형 대조군과 비교하여 돌연변이체 단백질을 코딩하는 비-동의 체세포 돌연변이체 대립유전자를 샘플로부터 확인하는 단계;
(d) 상기 샘플, 또는 대상체의 암 조직으로부터의 새로운 샘플로부터의 mRNA를 서열분석하여 암에서 발현된 mRNA에 출현하는 단계 (c)에서 확인된 상기 체세포 돌연변이를 확인하는 단계;
(e) 샘플 중 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도를 측정하는 단계;
(f) 예컨대, 같은 적응증의 다른 암과 비교하여 돌연변이체 대립유전자의 중앙 발현 수준을 측정함으로써 샘플 중 돌연변이체 대립유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(g) 대상체의 MHC 유형을 결정하는 단계;
(h) 1) 대립유전자 빈도가 0.05 초과이고;
2) 같은 적응증의 모든 암들 간의 1 RPKM 유니트 초과인 중앙 발현 수준을 가지고;
3) 대상체 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 결합할 것으로 예측되는 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 선별하는 단계;
(i) 단계 (h)에서 선별된 돌연변이체 펩티드를 돌연변이 예측 개수에 의해 및 대상체의 MHC 유형에의 결합에 대한 IC50에 의해 순위화하는 단계; 및
(j) 각 펩티드는 단계 (i)에서 순위화된 펩티드들 중 하나를 포함하는 것인, 약 27-31개의 아미노산으로 이루어진 하나 이상의 면역원성 펩티드를 확인하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체로부터의 면역원성 펩티드를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 암을 앓는 대상체의 암 조직의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플로부터 그 안에 포함된 주조직 적합성 복합체 (MHC)-펩티드 복합체 를 정제하는 단계;
(c) 정제된 MHC-펩티드 복합체로부터 그 안에 포함된 복수 개의 펩티드를 용리시키는 단계;
(d) 복수 개의 펩티드로부터 대상체의 암 조직의 샘플에서는 발견되지만, 정상 조직의 샘플에는 실질적으로 존재하지 않는 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 확인하는 단계;
(e) 각 펩티드는 단계 (d)에서 확인된 돌연변이체 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 것인, 하나 이상의 펩티드를 합성하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체로부터 면역원성 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 면역원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 암을 앓는 대상체의 암 조직의 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플로부터 그 안에 포함된 주조직 적합성 복합체 (MHC)-펩티드 복합체를 정제하는 단계;
(c) 정제된 MHC-펩티드 복합체로부터 그 안에 포함된 복수 개의 펩티드를 용리시키는 단계;
(d) 복수 개의 펩티드로부터 대상체의 암 조직의 샘플에서는 발견되지만, 정상 조직의 샘플에는 실질적으로 존재하지 않는 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 확인하는 단계; 및
(e) 각 펩티드는 단계 (d)에서 확인된 돌연변이체 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 것인, 하나 이상의 펩티드를 확인하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체로부터의 면역원성 펩티드를 확인하는 방법에 관한 것이다.
MHC는 부류 I 또는 부류 II MHC일 수 있다. 정상 조직의 샘플은 대상체로부터 단리된 것일 수 있다. 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드는 번역 후 변형된 펩티드일 수 있다. 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드 중의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 대상체의 암 조직에서는 번역 후 변형된 것일 수 있지만, 정상 조직에서는 번역 후 변형되지 않은 것이다. 번역 후 변형된 펩티드는 인산화된 것일 수 있다. 단계 (e)에서의 적어도 하나의 합성된 펩티드는 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드를 포함할 수 있다. 단계 (e)에서의 적어도 하나의 합성된 펩티드는 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드의 모방체를 포함할 수 있다. 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드는 인산화된 펩티드일 수 있고, 단계 (e)에서의 적어도 하나의 합성된 펩티드는 포스포펩티드 모방체일 수 있다. 단계 (d)에서 확인된 적어도 하나의 돌연변이체 펩티드 중의 인산화된 잔기는 단계 (e)에서의 적어도 하나의 합성된 펩티드 중의 비가수분해성 유사체로 치환될 수 있다. 하나 이상의 돌연변이체 펩티드는 단계 (d)에서 질량 분광법을 사용하여 대상체의 암 조직으로부터의 복수 개의 펩티드의 분자 구조를 측정하고, 복수 개의 펩티드의 분자 구조를 정상 조직에서 발견된 상응하는 펩티드와 비교하여 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 확인함으로써 확인할 수 있다.
단계 (d)에서 확인된 돌연변이체 펩티드(들)는
(f) 대상체의 MHC 유형을 결정하는 단계;
(g) 1) 대립유전자 빈도가 0.05 초과이고;
2) 같은 적응증의 모든 암들 간의 1 RPKM 유니트 초과인 중앙 발현 수준을 가지고;
3) 대상체 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 결합할 것으로 예측되는 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 선별하는 단계;
(h) 단계 (g)에서 선별된 돌연변이체 펩티드를 돌연변이 예측 개수에 의해, 암 세포 중 돌연변이체 펩티드의 빈도에 의해 및/또는 대상체의 MHC 유형에의 결합에 대한 IC50에 의해 순위화하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 단계 (e)에서의 합성을 위해 선별할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 면역원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 스트레스 단백질, 및 제2 면역원성 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 제1 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서, 제2 면역원성 펩티드는 암을 앓는 대상체의 암 세포에 존재하고, 번역 후 변형된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 단백질의 단편이고, 여기서, 제1 면역원성 펩티드는 자연적으로 발생된 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다. 대상체의 정상 세포는 돌연변이체 단백질의 정상 형태를 포함할 수 있고, 돌연변이체 단백질의 정상 형태는, 제2 면역원성 펩티드 중의 번역 후 변형된 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 돌연변이체 단백질의 정상 형태에서는 번역 후 변형된 것인 아닌 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함하는 것이다. 제1 면역원성 펩티드는, 제2 면역원성 펩티드 중 번역 후 변형된 적어도 하나의 잔기가 제1 면역원성 펩티드 중의 모방체 잔기로 치환된 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 제1 면역원성 펩티드 중의 모방체 잔기는 제2 면역원성 펩티드 중의 번역 후 변형된 상응하는 잔기보다 덜 불안정적일 수 있다. 제2 면역원성 펩티드 중 번역 후 변형된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 인산화된 것일 수 있다. 제2 면역원성 펩티드 중 적어도 하나의 인산화된 아미노산 잔기는 포스포-Ser, 포스포-Thr, 포스포-Tyr, 포스포-His, 포스포-Arg, 및 포스포-Lys로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 제1 면역원성 펩티드는, 제2 면역원성 펩티드 중 적어도 하나의 인산화된 잔기가 제1 면역원성 펩티드에서의 포스포모방체 잔기로 치환된 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 제1 면역원성 펩티드 중의 포스포모방체 잔기는 제2 면역원성 펩티드 중의 상응하는 인산화된 잔기의 비가수분해성 유사체일 수 있다. 펩티드의 길이는 8-50개의 아미노산 길이, 예컨대, 9-11개의 아미노산 길이 또는 27-31개의 아미노산 길이일 수 있다. 조성물은 myc, k-ras, n-ras, tp53, 및 kdm6A로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이체 단백질로부터 유래된 제3 면역원성 펩티드 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있고; 여기서, 제3 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서, 제1 면역원성 펩티드는 myc, k-ras, n-ras, t53, 또는 kdm6A로부터 유래된 펩티드가 아니다. 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합, 예컨대, hsc70 및 hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 또는 그의 돌연변이체 중 하나 이상의 것을 포함하는 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 측면의 조성물은 애주번트, 예컨대, 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 상기 측면의 조성물은 암을 앓는 대상체에게 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 조성물은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 치료학적 백신으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 암 백신으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이, (a) 스트레스 단백질 및 (b) 제2 면역원성 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 제1 면역원성 펩티드, 및 임의적으로, (c) 상기 기술된 바와 같은 제3 면역원성 펩티드 및/또는 애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하고, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 5개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 바람직하게, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않고/거나, 여기서, 조성물은 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 제1 조성물을 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, 특히, 인간 hsc70, 또는 hsp70, 특히, 인간 hsp70이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 결합되어 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 각 복합체에서 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 1:1 이하이고, 특히, 각 복합체에서 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 1:2, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 이하, 예컨대, 최대 1:100까지이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물 중 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 5 내지 50개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게, 25 내지 40개의 아미노산 길이, 가장 바람직하게, 27 내지 31개의 아미노산 길이이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이는 21-31개의 아미노산 길이이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물 중 항원성 펩티드는 각각 그 길이가 21 내지 31개의 아미노산 길이이다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 항원성 펩티드는 각각 열 충격 단백질 결합 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않고, 바람직하게, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 각각 단일 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나는 대상체의 정상 세포와 비교하여 대상체의 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 및 임의적으로 애주번트를 추가로 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 애주번트는 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 포함하고, 더욱더 바람직하게, 애주번트는 QS-21을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제2 면역원성 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 제1 면역원성 펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서, 제2 면역원성 펩티드는 암을 앓는 대상체의 암 세포에 존재하고, 번역 후 변형된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 단백질의 단편이고, 여기서, 제1 면역원성 펩티드는 자연적으로 발생된 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물에 관한 것이다. 대상체의 정상 세포는 돌연변이체 단백질의 정상 형태를 포함할 수 있고, 돌연변이체 단백질의 정상 형태는, 제2 면역원성 펩티드 중의 번역 후 변형된 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 돌연변이체 단백질의 정상 형태에서는 번역 후 변형된 것인 아닌 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함하는 것이다. 제1 면역원성 펩티드는, 제2 면역원성 펩티드 중 번역 후 변형된 적어도 하나의 잔기가 제1 면역원성 펩티드 중의 모방체 잔기로 치환된 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 제1 면역원성 펩티드 중의 모방체 잔기는 제2 면역원성 펩티드 중의 번역 후 변형된 상응하는 잔기보다 덜 불안정적일 수 있다. 제2 면역원성 펩티드 중 번역 후 변형된 적어도 하나의 아미노산 잔기는 인산화된 것일 수 있다. 제2 면역원성 펩티드 중 적어도 하나의 인산화된 아미노산 잔기는 포스포-Ser, 포스포-Thr, 포스포-Tyr, 포스포-His, 포스포-Arg, 및 포스포-Lys로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 제1 면역원성 펩티드는, 제2 면역원성 펩티드 중 적어도 하나의 인산화된 잔기가 제1 면역원성 펩티드에서의 포스포모방체 잔기로 치환된 것을 예외로 하는 제2 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 제1 면역원성 펩티드 중의 포스포모방체 잔기는 제2 면역원성 펩티드 중의 상응하는 인산화된 잔기의 비가수분해성 유사체일 수 있다. 펩티드의 길이는 8-50개의 아미노산 길이, 예컨대, 9-11개의 아미노산 길이 또는 27-31개의 아미노산 길이일 수 있다. 조성물은 myc, k-ras, n-ras, tp53, 및 kdm6A로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이체 단백질로부터 유래된 제3 면역원성 펩티드 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있고; 여기서, 제3 펩티드는 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서, 제1 면역원성 펩티드는 myc, k-ras, n-ras, t53, 또는 kdm6A로부터 유래된 펩티드가 아니다. 상기 측면의 조성물은 애주번트, 예컨대, 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 상기 측면의 조성물은 암을 앓는 대상체에게 상기 조성물 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 조성물은 의약으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 치료학적 백신으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 암 백신으로서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 조성물은 암 치료 방법에서 사용하기 위한 용도의 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이, (a) 스트레스 단백질 및 (b) 제2 면역원성 펩티드 또는 그의 모방체를 포함하는 제1 면역원성 펩티드, 및 임의적으로, (c) 상기 기술된 바와 같은 제3 면역원성 펩티드 및/또는 애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 방법에서 유용한 체세포 돌연변이 특징 규명 워크플로우를 도시한 것이다. (a)는 본원에 개시된 방법을 사용하여 종양-특이 돌연변이를 확인하는 예시적인 방법을 나타낸 개략도이다. (b)는 본원에 개시된 방법을 사용하여 작성된 변이체 콜 포맷(Variant Call Format: VCF)의 예시적인 주석화 방법을 나타낸 개략도이다. 메드게놈즈 배리에이션 앤드 뮤테이션 애너테이션 툴키트(MedGenome's Variation and Mutation Annotation Toolkit) (VariMAT; 미국 매사추세츠주 케임브리지)를 사용하여 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 유전자에 맵핑한다. 배리언트 이펙트 프레딕터(Variant Effect Predictor) (VeP; 문헌 [Bioinformatics. 2010 Aug 15;26(16):2069-70] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다))를 사용하여 변이체 부류 예측 (미스센스, 넌센스, 침묵, 정지-상실)을 수행하고, 1,000개의 게놈 프로젝트 보고된 SNP 및 indels, 및 다른 SNP 데이터베이스 중의 대립유전자 빈도에 기초하여 체세포 변이체를 확인한다. 각종 데이터베이스로부터의 데이터를 사용하여 각 변이체의 질환 관련성 또한 주석화한다. (c)는 NetMHCpan을 이용한, 9 및 10mer 펩티드 라이브러리의 MHC 분자에의 결합에 관한 인실리코 예측을 나타낸 개략도이다 (문헌 [Immunogenetics. 2009 Jan;61(1):1-13; PLoS One. 2007 Aug 29;2(8):e796] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
도 2는 본 발명의 면역원성 조성물에 포함시키기 위한 펩티드의 유래 기점이 되는 돌연변이를 측정하는 순위화 흐름을 보여주는 다이어그램이다. 종양 돌연변이를 확인하고 (좌측 상단 코너), 대립유전자 빈도가 > 0.05이고, 중앙 발현 수준이 예를 들어, 같은 적응증의 모든 종양들 간의 백만개의 맵핑된 리드당 킬로베이스의 전사체당 리드 (RPKM)가 1 초과인 돌연변이, 및 이어서, MHC에 결합할 것으로 예측되는 펩티드에 존재하는 돌연변이를 비롯한, (대각선 화살표를 따라 대각선 방향으로 진행하는) 돌연변이에 필터를 적용한다. 필터로부터 생성된 펩티드는 중앙부에 돌연변이를 포함하는 27개의 아미노산인 것으로 예측되며, 이어서, 이를 먼저 예측된 에피토프의 개수에 따라 순위화한 후, 이어서, MHC에의 결합에 대한 IC50에 의해 분류한다. 높은 순위의 펩티드를 합성하고, 본 발명의 면역원성 조성물, 예컨대, 백신에 포함시킨다.
도 3은 예측된 HLA-A*02:01 및 HLA-B*07:02 결합 친화도가 ≤150 nM인 신생-에피토프 9mer (a) 및 10mer (b) 펩티드 및 그의 천연 대응물의 산점도 세트이다.
도 4는 0일째 B16.F10 흑색종 세포 주사 후, 이어서, 3, 9, 및 15일째 하기의 것을 투여받은 6개의 C57BL/6 마우스 군에서의 종양 성장 곡선 세트이다: 1-3군: B16.F10 흑색종의 신생 에피토프를 함유하는 2개의 펩티드, B-16-M27 및 B-16-M30과 복합체를 형성한 Hsc70을 포함하는, 각각 3 ㎍, 10 ㎍ 및 30 ㎍의 조성물; 4군: 30 ㎍ Hsc70 단독; 5군: 3군의 것과 동일한 양의 펩티드 단독; 및 6군: 폴리(I:C)와 함께 100 ㎍ 각각의 펩티드.
도 5는 종양 시험감염 이후의, 종양 성장 곡선이 도 4에 도시되어 있는 마우스 군들 간의 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다.
도 6은 0일째 B16.F10 흑색종 세포 주사 후, 이어서, 3, 9, 및 15일째 하기의 것을 투여받은 6개의 C57BL/6 마우스 군에서의 종양 성장 곡선 세트이다: 1-3군: B-16-M27 및 B-16-M30 펩티드과 복합체를 형성한 Hsc70을 포함하는, 각각 3 ㎍, 10 ㎍ 및 30 ㎍의 조성물; 4군: 10 ㎍ QS-21 스티뮬론(Stimulon)® 애주번트를 포함하는, 3군과 동일한, 30 ㎍의 조성물; 5군: 30 ㎍ Hsc70 단독; 6군: 3군의 것과 동일한 양의 펩티드 단독; 및 7군: 폴리(I:C)와 함께 100 ㎍ 각각의 펩티드.
도 7은 종양 시험감염 이후의, 종양 성장 곡선이 도 6에 도시되어 있는 마우스 군들 간의 평균 종양 부피를 보여주는 그래프 세트이다.
도 8은 종양 시험감염 이후의, 종양 성장 곡선이 도 6에 도시되어 있는 마우스 군들 각각의 생존율(%)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 5x104개의 B16.F10 종양 세포를 피하로 주사맞고, 종양 시험감염 후 3, 9 및 15일째 명시된 작용제로 처리된 C57Bl/6 마우스 (n=11-12/군)에서의 종양 성장 곡선 세트이다. 종양 크기를 2-3일마다 사정하였다. 개별 마우스에서의 종양 성장 동력학적 성질을 시간 함수로서 플롯팅한다. 1군: PBS 단독; 2군: 펩티드 부재하의 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론®; 3군 및 4군: 18개의 펩티드 (M5, M12, M17, M20, M22, M24, M25, M27, M28, M29, M30, M36, M44, M45, M46, M47, M48, 및 M50)와 복합체를 형성한 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론® 애주번트를 포함하는, 각각 30 ㎍ 및 100 ㎍의 조성물.
도 10은 종양 시험감염 이후의, 종양 성장 곡선이 도 9에 도시되어 있는 마우스 군들간의 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다.
도 11은 5x104개의 B16.F10 종양 세포를 피하로 주사맞고, 종양 시험감염 후 3, 9 및 15일째 명시된 작용제로 처리된 C57Bl/6 마우스 (n=11-12/군)에서의 종양 성장 곡선 세트이다. 종양 크기를 2-3일마다 사정하였다. 개별 마우스에서의 종양 성장 동력학적 성질을 시간 함수로서 플롯팅한다. 1군: PBS 단독; 2군: 펩티드 부재하의 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론®; 3군 및 4군: 5개의 펩티드 (M22, M27, M44, M48, 및 M50)와 복합체를 형성한 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론® 애주번트를 포함하는, 각각 30 ㎍ 및 100 ㎍의 조성물.
도 12는 종양 시험감염 이후의, 종양 성장 곡선이 도 11에 도시되어 있는 마우스 군들간의 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다.
도 13은 QS-21 스티뮬론® 애주번트와 함께 조합하여 Hsc70-M27/M30 펩티드 복합체로 면역화되고, M27 및 M30 B16.F10 27mer, 그의 야생형 대응물 또는 펩티드 부재하의 것과 함께 배양된, 3마리의 마우스로부터의 비장세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 각 군 내의 5x105개의 비장세포당 IFN-γ 스폿 형성 세포 (SFC)의 평균 값을 보여주는 것이다. 각 막대는 대표 마우스로부터의 기술상 3마리가 한 조인 것을 나타낸다. 통계학적 유의도는 양측 스튜던츠 t 검정을 이용하여 측정된다 (*는 p<0.05를 나타내고; **는 p<0.005를 나타낸다).
도 14는 Hsc70의 샘플의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 크로마토그램이다.
도 15은 Hsc70 (실선), 및 기질 펩티드 (파선)와 조합된 Hsc70의 중첩된 SEC 크로마토그램 세트이다.
도 16은 Hsc70 (실선), 및 Hsc70:펩티드 몰비가 1:4 (파선), 1:10 (점선), 및 1:20 (파선 및 점선)인 Hsc70-M27-펩티드 복합체의 중첩된 SEC 크로마토그램 세트이다.
도 17은 Hsc70:펩티드 몰비의 함수로서, M27 펩티드와 복합체를 형성한 Hsc70의 비율(%)의 플롯이다.
도 18은 37℃에서 2 또는 3시간 동안의 인큐베이션 후의, Hsc70:펩티드 몰비의 함수로서, M27 펩티드와 복합체를 형성한 Hsc70의 비율(%)의 플롯이다.
도 19는 Hsc70 (실선), 및 그의 C-말단에서 펩티드 링커 (FFRK (서열번호 447))를 통해 고친화성 Hsc70 결합 서열 (NLLRLTG 서열번호 439)에 융합된 닭 오브알부민 펩티드 (SIINFEKL (서열번호 448)) (파선)와 1:10 Hsc70:펩티드 몰비로 조합된 Hsc70의 중첩된 SEC 크로마토그램 세트이다.
도 20은 Hsc70 (실선), 및 그의 C-말단에서 펩티드 링커 (FFRK (서열번호 447))를 통해 고친화성 Hsc70 결합 서열 (NLLRLTG (서열번호 439))에 융합된 닭 오브알부민 펩티드 (SIINFEKL (서열번호 448) (파선)와, 또는 그의 N-말단에서 동일한 펩티드 링커를 통해 고친화성 Hsc70 결합 서열에 융합된 동일한 닭 오브알부민 펩티드 (점선)와 1:2 Hsc70:펩티드 몰비로 조합된 Hsc70의 중첩된 SEC 크로마토그램 세트이다.
도 21은 Hsc70-펩티드 복합체 또는 펩티드 단독으로 면역화된 마우스로부터 단리된 비장세포의 IFN-γ 반응을 보여주는 그래프이다. 본 데이터는, 제1 및 제3 사분위수는 상자 단부에 위치하고, 중앙값은 상자 내부에 가로선으로 표시되어 있고, 최대값 및 최소값은 수염 단부에 위치하는 것인, 상자 및 수염(box-and-whisker) 플롯을 사용하여 제시되어 있다. 각각의 도트는 3마리의 마우스 각각의 비장세포가 이중으로 시딩된 ELISPOT 플레이트의 단일 웰을 나타낸다. ** 이원 ANOVA 검정 이용에 따르면, 통계학상 유의적이다 (p 값 <.05).
본 개시내용은 치료학적 백신 (예컨대, 암 백신)으로서 유용한 조성물, 및 상기 조성물 제조 방법을 제공한다. 본원에 개시된 조성물은 일반적으로 스트레스 단백질 및 환자의 암에 존재하는 암-특이 돌연변이를 포함하는 적어도 하나의 합성 항원성 펩티드를 이용한다. 본원에 개시된 방법은 특히 단지 미량의 대상체의 조직 (예컨대, 단일 세포 또는 엑소좀)을 사용하여 치료학적 백신 (예컨대, 암 백신) 조성물을 제조할 수 있도록 한다는 점에서 이롭다.
1. 항원성 펩티드를 확인하는 방법
본 발명의 방법은 일반적으로 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 항원성 펩티드를 확인하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프)과 관련하여 "돌연변이체"라는 용어는 대상체의 정상 또는 건강한 조직에서가 아닌, 대상체의 질환 조직 (예컨대, 암 세포)에서 발견되는 아미노산 돌연변이 (예컨대, 치환, 삽입, 또는 결실)를 함유하는 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프); 대상체의 정상 또는 건강한 조직에서가 아닌, 대상체의 질환 조직 (예컨대, 암 세포)에서 발견되는, 또는 그 반대인 경우의 아미노산 변형 (예컨대, 번역 후 변형, 예컨대, 인산화)을 함유하는 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프); 정상 또는 건강한 세포와 비교하여 암 세포에서 상이한 발현 프로파일을 가지는 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프) (예컨대, 정상 세포가 아닌 암 세포에서 발현되는 단백질); 또는 정상 세포 대비 질환 조직 (예컨대, 암 세포)에서 항원 제시 경로에서 다르게 프로세싱됨으로써, 이를 통해 상이한 펩티드가 MHC 분자에 의해 제시되는 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프)을 지칭한다. 대안적으로, 특정 실시양태에서, 돌연변이체 단백질 (또는 그의 펩티드 단편 또는 MHC-결합 에피토프)은 정상 조직 대비 암 세포에서 상승된 수준의 번역 후 변형 (예컨대, 인산화)을 보이는 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 면역원성 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 돌연변이체 단백질 (또는 그의 돌연변이체 펩티드 단편 또는 돌연변이체 MHC-결합 에피토프)에 존재할 수 있는 돌연변이는 제한 없이, 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실 돌연변이, 또는 유전자 융합 돌연변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "유전자 융합 돌연변이"란, 유전자 융합에 의해 코딩된 단백질의 변곡점 연결부 (예컨대, BCR-ABL 유전자 융합 변곡점 연결부)에 의해 형성된 신생-에피토프를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "MHC-결합 에피토프/에피토프들"이라는 용어는 상기 검정법 중 임의의 것에 의해 MHC 분자 (예컨대, 인간 MHC)에 결합하는 것으로 나타났거나, 또는 소프트웨어 프로그램에 결합할 것으로 예측되는 상기 에피토프를 지칭한다 (예컨대, 문헌 [SYFPEITHI, Rammensee, et al., Immunogenetics 50, 213-219, 1999] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 사용될 수 있는 다른 방법으로는 문헌 [Guan, P. et al., (2003) Applied Bioinformatics, 2: 63-66]; [Blythe, M. J. et al., (2002) Bioinformatics, 18: 434-439]; [Flower, D. R. and Doytchinova, I. A. (2002). Applied Bioinformatics, 1: 167-176]; [Yu, K. et al., (2002) Molecular Medicine, 8: 137-48]; [Brusic, V. et al., (2002) Immunology and Cell Biology, 80: 280-285]; [Jung, G. et al., (2001) Biologicals, 29: 179-181] (상기 문헌은 T 세포 에피토프 예측 프로그램 EPIPREDICT를 기술한다)]; [Kwok, W. W. et al., (2001) Trends in Immunology, 22: 583-588; Mallios, R. R. (2001) Bioinformatics, 17: 942-948]; [Romisch, K. (2001). Trends in Biochemical Sciences, 26: 531]; [Schirle, M. et al., (2001) Journal of Immunological Methods, 257: 1-16]; [Singh, H. and Raghava, G. P. S. (2001) Bioinformatics, 17: 1236-1237]; [Andersen, M. H. et al., (2000) Tissue Antigens, 55: 519-531]; [Buus, S. (1999). Current Opinion in Immunology, 11: 209-213]; [Mallios, R. R. (1999) Bioinformatics, 15: 432-439; Maffei, A. and Harris, P. E. (1998). Peptides, 19: 179-198]; 및 [Vita R. et al., Nucleic Acids Res. 2014 Oct 9. pii: gku938.] [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25300482 (상기 문헌은 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB) 3.0. (이는 www.iedb.org에서 이용가능)을 기술한다) (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, MHC-결합 에피토프와 관련하여 "야생형"이라는 용어는 야생형 아미노산 서열, 야생형 번역 후 변형을 가지고, 정상 세포와 비교하여 오직 암 세포에서만 발현되는 것이 아닌, 또는 암 세포에서 과다발현되는 것이 아닌 MHC-결합 에피토프를 지칭한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체로부터의 암 세포의 게놈 DNA의 엑솜을 서열분석하고, 비돌연변이화된 (야생형) 대조군 (예컨대, 대상체의 비-암 세포)과 비교하고, 돌연변이체 단백질을 코딩하는 비-동의 체세포 돌연변이체 대립유전자를 확인한다. 특정 실시양태에서, 동일한 대상체 샘플로부터의, 또는 동일한 대상체로부터의 새로운 암 세포 샘플로부터의 mRNA를 서열분석하여 암에서 발현된 mRNA에 출현하는 상기 체세포 돌연변이를 확인한다.
특정 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자의 발현 수준 또한 측정한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자에 상응하는 유전자에 대한 RNA RefSeq 데이터가 이용가능할 경우, 돌연변이체 대립유전자의 전사체의 발현을 정규화된 돌연변이 함유 리드 계수 (NMRC)에 의해 측정한다. NMRC는 돌연변이를 함유하는 cDNA로부터 수득된 차세대 염기서열 분석법(NGS: Next Generation Sequencing) 리드의 개수를 맵핑된 뉴클레오티드의 총 개수로 나눈 값에 정규화 인자로서 1010을 곱하여 얻은 값이다. 따라서, NMRC는 서열분석 실험에서 생성된 뉴클레오티드의 총 개수로 정규화된, 돌연변이를 함유하는 리드의 개수를 나타낸다. 　특정 실시양태에서, 정규화된 돌연변이 함유 리드 계수 (NMRC)가 10 초과인 돌연변이체 대립유전자가 항원성 펩티드 생성에 사용된다. 특정 실시양태에서, 정규화된 돌연변이 함유 리드 계수 (NMRC)가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 초과인 돌연변이체 대립유전자가 항원 펩티드 생성에 사용된다.
다른 실시양태에서, RNA RefSeq 데이터가 이용불가능할 경우, 같은 적응증의 암 중의 돌연변이체 대립유전자의 발현 수준은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 (예컨대, 더 캔서 게놈 아틀라스-캔서 게놈(The Cancer Genome Atlas - Cancer Genome) (TCGA: www.cancergenome.nih.gov); 더 인터내셔널 캔서 게놈 컨소시엄(The International Cancer Genome Consortium) (ICGC: www.icgc.org))로부터 추정되고, 돌연변이를 포함하는 전사체의 발현 중앙값은 백만개의 맵핑된 것 1개당 킬로베이스의 전사체당 리드 (RPKM)에 기초하여 측정된다. RNA-Seq 실험에서, cDNA 단편을 서열분석하고, 유전자로, 및 이상적으로는 개별 전사체로 맵핑한다. 적절히 정규화된, RNA-Seq 리드, 즉, RPKM이 전사체의 상대적인 존재비의 척도로서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, RPKM 리드가 1 초과인 돌연변이체 대립유전자가 항원 펩티드를 생성하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, RPKM 리드가 1 초과인 돌연변이체 대립유전자가 항원 펩티드를 생성하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, RPKM 리드가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 초과인 돌연변이체 대립유전자가 항원 펩티드를 생성하는 데 사용된다
특정 실시양태에서, 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도를 측정한다. 본원에서 사용되는 바, 돌연변이체 대립유전자와 관련하여, "대립유전자 빈도"라는 용어는 샘플 중 다른 대립유전자 (예컨대, 야생형 대립유전자) 대비의 돌연변이체 대립유전자의 상대적인 양 (분율 또는 백분율로서 표시)이다.
특정 실시양태에서, 대상체의 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형을 측정한다. 본원에 개시된 바와 같이, 대상체의 DNA의 서열분석을 비롯한, HLA 유형을 측정하는 임의의 수단이 사용될 수 있다.
대상체의 종양 세포에서 발현된 돌연변이체 대립유전자를 확인한 후, 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 (하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는) 하나 이상의 돌연변이체 펩티드를 예를 들어, 대립유전자 빈도가 0.05를 초과하는지, (예컨대, 같은 적응증의 모든 암들 간의) 1 RPKM 유니트 초과인 중앙 발현 수준을 가지는지, 및/또는 대상체의 HLA 분자 중 하나 이상의 것에 결합할 수 있는 예측되는 능력이 있는지에 기초하여 선별한다. 특정 실시양태에서, 선별된 돌연변이체 펩티드를 예를 들어, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 예측 개수에 의해 및/또는 대상체의 HLA 유형에 대한 예측 결합 친화도 (예컨대, IC50)에 의해 추가로 순위화한다. 본 발명의 방법에서 유용한 돌연변이 특징 규명 워크플로우가 도 1에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 각 펩티드가 상기 선별된 돌연변이체 펩티드들 중 하나 이상의 것을 포함하는 것인, 하나 이상의 항원성 펩티드 아미노산을 합성한다. 일단 합성되고 나면, 펩티드는 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 세포 표면 MHC 분자 상에 제시되었을 때, 합성된 항원성 펩티드가 T 세포에 의해 인식되는지 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
1.1. 차세대 염기서열 분석법
특정 실시양태에서, 핵산 (예컨대, 종양 DNA 및 mRNA)의 서열을 차세대 염기서열 분석법 (NGS)을 사용하여 결정한다. NGS는 "고도로 다중화된 앰플리콘 서열분석"로서 지칭되는 다수의 상이한 현대 서열분석 기술들을 기술하는 데 사용되는 일반 용어이다. 비록 서열 정보를 생성하는 화학법이 상이한 차세대 염기서열 분석법 플랫폼에 대하여 다양하게 존재할지라도, 그들 모두 매우 많은 서열분석 주형으로부터 서열 데이터 생성을 위한 공통된 특징을 공유하며, 그에 대해 서열분석 반응이 동시에 진행된다. 일반적으로, 스캐너를 사용하여 상기의 모든 서열분석 반응으로부터 데이터를 수집한 후, 컴퓨터 및 생물정보학 소프트웨어 프로그램을 사용하여 어셈블리하고, 분석한다. 서열분석 반응을 초병렬 또는 다중화 방식으로 수행하고, 판독하고, 어셈블리하고, 분석한다.
제한 없이, NGS 플랫폼은 454 FLX™ 또는 454 티타늄(TITANIUM)™ (로슈(Roche)), 초병렬 시그니처 서열분석(Massively Parallel Signature Sequencing) (링스 쎄라퓨틱스(Lynx Therapeutics)); 고체상, 가역성 염료-종결인자 서열분석 (솔렉사™ 게놈 애널라이저(SOLEXA™ Genome Analyzer)/일루미나(Illumina)), 헬리스코프™ 단일 분자 시퀀서(HELISCOPE™ Single Molecule Sequencer) (헬리스코프 바이오사이언시즈(Helicos Biosciences)), 및 솔리드™ DNA 시퀀서(SOLID™ DNA Sequencer) (라이프 테크놀러지즈(라이프 테크놀러지즈)/어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 장치), 이온 반도체(Ion semiconductor) 서열분석 (이온 토렌트(Ion Torrent)); DNA 나노볼 서열분석 (컴플리트 게노믹스(Complete Genomics)), 나노포어 엑소뉴클레아제 서열분석 (옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore)), 단일 분자, 실시간(Single Molecule, Real-Time: SMRT) 서열분석 기술상에 구축된 팩바이오 서열분석 시스템즈(PacBio Sequencing Systems) (파시픽 바이오시스템즈(Pacific Biosystems)), 합성에 의해 DNA 서열분석 (SBS: sequencing by synthesis) 기술 (인텔리전트 바이오시스템즈(Intelligent Biosystems))을 포함한다.
NGS의 한 예시적인 실시양태로 예를 들어, 고체상, 가역성 염료-종결인자 서열분석 (솔렉사™ 게놈 애널라이저/일루미나)을 포함한다. 일루미나 서열분석은 대략 100-150 bp를 판독한다. 다소 좀 더 긴 단편을 일반 어댑터에 라이게이션시키고, 어댑터를 사용하여 슬라이드에 어닐링시킨다. PCR을 수행하여 각 리드를 증폭시킴으로써 동일 리드에 대하여 다수의 카피를 가지는 스폿을 생성한다. 이어서, 이를 단일 가닥으로 분리시켜 서열분석한다. 슬라이드를 뉴클레오티드 및 DNA 폴리머라제에 플러딩시킨다(flooding). 상기 뉴클레오티드를 염기에 상응하는 색상으로 형광 표지한다. 상기 뉴클레오티드는 또한 종결인자도 포함하는 바, 이에 한번에 오직 1개의 염기만이 부가된다. 슬라이드의 영상을 촬영한다. 각 리드 위치에 부가된 염기를 나타내는 형광 신호가 존재하게 될 것이다. 이어서, 다음 사이클을 위해 슬라이드를 준비한다. 종결인자를 제거함으로써 다음 염기가 부가될 수 있도록 하고, 형광 신호를 제거하여 신호가 다음 영상을 오염시키지 않도록 한다. 한번에 1개의 뉴클레오티드가 부가되고, 그 사이에 영상화하면서 프로세스를 반복한다. 이어서, 컴퓨터를 사용하여 각 영상 중 각 부위의 염기를 검출하고, 이를 사용하여 서열을 구축한다.
NGS의 또 다른 예시적인 실시양태로는 예를 들어, 로슈 454 서열분석을 포함한다. 454 서열분석을 통해 일루미나보다 훨씬 더 긴 리드가 가능해진다. 일루미나와 같이, 염기 부가에 따라 광학 신호를 판독하여 한번에 다중의 리드를 서열분석함으로써 이를 수행한다. 일루미나에서와 같이, DNA 또는 RNA를 더 짧은 리드로, 이 경우에는 1 kb로 단편화시킨다. 일반 어댑터를 단부에 부가하고, 이를 비드에, 비드 1개당 DNA 단편 1개씩 어닐링한다. 이어서, 어댑터 특이 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 단편을 증폭시킨다. 이어서, 각 비드를 슬라이드의 단일 웰에 배치한다. 이로써, 각 웰은 단일 서열의 다수의 PCR 카피로 커버되는 단일 비드를 함유하게 될 것이다. 상기 웰은 또한 DNA 폴리머라제 및 서열분석 완충제도 함유한다. 슬라이드를 4개의 NTP 종 중 하나에 플러딩시킨다. 상기 뉴클레오티드가 서열에서 다음에 존재한다면, 이를 서열 리드에 부가한다. 상기 단일 염기가 반복된다면, 더 많이 부가될 것이다. 따라서, 본 발명자들이 구아닌 염기를 플러딩한다면, 서열 중 다음은 G이고, 1개의 G가 부가되겠지만, 서열의 다음 부분이 GGGG일 경우에는 4개의 Gs가 부가될 것이다. 상기 NTP 믹스를 세척하여 제거한다. 이제, 다음 NTP 믹스를 부가하고, 4개의 NTP에 걸쳐 프로세스를 반복한다. 이러한 종류의 서열분석을 통해 각 뉴클레오티드 세액에 대한 신호 밀도를 보여주는 각 서열 리드에 대한 그래프를 작성할 수 있다. 이어서, 서열을 컴퓨터 산정 방식으로 각 세액 중의 신호 밀도로부터 결정할 수 있다. 각 사이클마다 상이한 개수의 염기가 부가되는 바, 이에 본 발명자들이 454로부터 얻은 서열 리드는 모두 길이가 상이할 것이다.
NGS의 또 다른 예시적인 실시양태로는 예를 들어, 이온 토렌트 및 이온 프로톤(Ion proton) 서열분석을 포함한다. 일루미나 및 로슈의 454와 달리, 이온 토렌트 및 이온 프로톤 서열분석은 광학 신호를 이용하지 않는다. 대신, 이들은 dNTP의 DNA 중합체에의 부가가 H+ 이온을 방출한다는 사실을 이용한다. 다른 종류의 NGS에서와 같이, 입력 DNA 또는 RNA를 ~200 bp 길이로 단편화한다. 어댑터를 부가하고, 한 분자를 비드에 배치한다. 에멀젼 PCR에 의해 분자를 비드 상에서 증폭시킨다. 각 비드를 슬라이드의 단일 웰에 배치한다. 454와 같이, 슬라이드를 완충제 및 폴리머라제와 함께 한번에 NTP 1개씩 단일 dNTP 종에 플러딩시킨다. 방출되는 각 H+　 이온이 pH를 감소시키는 바, 각 웰의 pH를 검출한다. pH 변화를 통해 본 발명자들은 상기 염기가 서열 리드에 부가되었는지 여부, 및 몇개의 염기가 부가되었는지를 측정할 수 있다. dNTP를 세척하여 제거하고, 상이한 dNTP 종에 걸쳐 사이클링하여 프로세스를 반복한다. pH 변화가 있었다면, 이를 이용하여 (존재할 경우) 몇개의 염기가 각 사이클마다 부가되었는지를 측정한다.
NGS 플랫폼에 대한 설명은 또한 하기 문헌에서도 살펴볼 수 있다: 문헌 [Shendure, et al., "Next-generation DNA sequencing," Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145]; [Mardis, "The impact of next-generation sequencing technology on genetics," Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141]; [Su, et al., "Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics" Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333-43]; [Zhang et al., "The impact of next-generation sequencing on genomics", J Genet Genomics, 2011, 38(3):95-109]; [Quail et al. (2012). "A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers". BMC Genomics 13 (1): 341]; [Liu et al. (2012). "Comparison of Next-Generation Sequencing Systems". Journal of Biomedicine and Biotechnology (Hindawi Publishing Corporation) 2012: 1-11]; EBI: Next Generation Sequencing Practical Course (www.ebi.ac.uk EMBL-EBI 웹 사이트에서 공개적으로 이용가능) (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다).
1.2. 엑솜 서열분석 및 HLA 측정
NGS 플랫폼, 예컨대, 전체-엑솜 포획을 이용하는 일루미나 HiSeq를 이용하여 환자의 종양 및 생식계열 DNA 샘플의 서열분석을 달성할 수 있다. 예를 들어, 이제는 종양 돌연변이를 면역요법 임상 시험과 관련하여 신속하게 및 효과적으로 확인할 수 있으며, 이들 모두는 샘플 획득 후 수주 이내에 이루어질 수 있다 (문헌 [Br J Cancer, 2014. 111(8): p. 1469-75] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 추가로, 환자의 HLA 유형은 표준 NGS 엑솜 (DNA) 및 RNA-Seq (RNA) 프로파일링, 둘 모두로부터 동시에 결정될 수 있다 (문헌 [Genome Med, 2013. 4(12): p. 102; Genome Med, 2012. 4(12): p. 95] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 대안적으로, HLA 유형은 적절한 임상 검정법을 이용하여 결정될 수 있거나, 또는 행위별 수가제(fee-for-service) 제공자에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산을 (예컨대, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해) 환자의 종양 세포로부터 증폭시킬 수 있다. 이러한 증폭을 통해서 극소량의 샘플 (예컨대, 단일 세포 또는 엑소좀)의 사용 가능해질 수 있으며, 이는 종양 샘플로부터의 환자 자신의 펩티드 수거에 의존하여 면역원성 펩티드를 제조하는 선행 기술의 방법을 능가하는 본 발명의 한가지 이점이 된다.
1.3. 비-동의 체세포 돌연변이체 대립유전자 확인
NGS 서열분석으로부터의 뉴클레오티드 "리드"를 인간 게놈으로 맵핑한다. DNA 종양 리드를 생식계열 DNA 리드와 비교하여 생식계열 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)인 돌연변이를 확인하고, 이를 배제시키고, 종양-특이 돌연변이를 포함하는 종양 일배체형을 통계학적으로 확인한다. DNA 결정된 종양 돌연변이와 중첩되는 종양 RNA 리드를 조사하여 돌연변이 존재 및 돌연변이체 RNA 발현을 확인한다. 특별히 삽입 또는 결실 또는 유전자 융합이 검출된다면, 국소 NGS 리드 재맵핑을 수행한다. "리드 재맵핑"이란, 리드의 전체 게놈에 대한 초기 정렬 (맵핑) 이후에, 잠재적인 의사 거짓-양성 돌연변이 콜(call)을 제거하기 위해 고감도 정렬 알고리즘 (대개는 국소 리드 재맵핑으로 명명되는 프로세스)을 사용하여 그의 국소 게놈 영역 내에서 수행하는 리드의 재맵핑을 지칭한다. 추가로, 종양 중 DNA 돌연변이의 대립유전자 빈도에 따라, 및 웰콤 스터스트 생어 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute)에 의해 공개적으로 이용가능하게 만들어진, COSMIC (카탈로그 오브 소매틱 뮤테이션즈 인 캔서(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer)) 데이터베이스에 상기 돌연변이가 열거되어 있는지 여부에 따라 종양-특이 돌연변이를 평가한다. 무세포 DNA 검사 (cfDNA; 스위프트 바이오사이언시즈(Swift Biosciences)로부터 상업적으로 이용가능), 순환 종양 세포 (CTC), 및 순환 엑소좀 RNA (엑소좀 다이아그노스틱스(Exosome Diagnostics))를 비롯한, 액체 생검을 시험함으로써 추가의 종양-특이 돌연변이의 출현에 대한 발견 및 모니터링을 평가할 수 있다.
이어서, 데이터 프로세싱을 사용하여 RNA-Seq NGS 리드에 의해 제시된 바와 같이, 돌연변이가 종양에서 고수준으로 전사되었는지 여부, 단백질 코딩 전사체에 존재하는지 여부, 및 돌연변이가 단백질 코딩 서열에서 비-동의 돌연변이를 유발하는지 여부를 측정한다. 비록 백신 제조에는 필요하지 않지만, 돌연변이체 단백질의 기능 및 세포내 국재화, 단백질 변이의 분자적 결과, 및 단백질 변이의 예상되는 임상 결과를 비롯한, 다른 정보 또한 수득할 수 있다.
1.4. 돌연변이 함유 펩티드의 면역학적 특징 규명 및 순위화
특정 실시양태에서, 하기 표 1에 기재된 특징 규명 중 하나 이상의 것을 사용하여 돌연변이를 특징 규명한다. 돌연변이 함유 펩티드를 또한 표 1에 제시된 기준에 따라 순위화할 수 있으며, 이 프로세스는 도 2에 요약되어 있다. 성공적인 면역원성 조성물 제제를 위해 돌연변이 함유 펩티드를 순위화하는 데 표 1에 열거된 특징 규명 모두가 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 4개의 특징 규명이면 충분하다. 특정 실시양태에서, 추가의 리파인먼트를 위해 5, 6, 또는 7개의 특징 규명이 사용된다. 특정 실시양태에서, 표 1의 특징 규명 모두가 사용된다.
신생-항원 특징 규명 (돌연변이의 면역학적 특징 규명)
특징 규명 알고리즘 이론적 설명
인간 대 인간의 유전적 차이의 데이터베이스에서 발견되지 않는 돌연변이 ("SNP") 유사한 비체세포 돌연변이 회피
돌연변이 DNA 접합성 더 많은 종양 세포 중, 및 개별 세포 중 높은 존재비로 존재하는 돌연변이 선택
"조기 돌연변이" - 돌연변이 계통수 상의 위치 더 많은 종양 세포 중의 돌연변이 (조기 발생) 선택
특정 암 적응증 (예컨대, GBM)에서 발현되는 유전자 중의 돌연변이 종양 발현
RNA-Seq로 뒷받침되는 특정 종양 중의 돌연변이 종양 발현
특정 종양 중의 돌연변이체 대립유전자 발현 종양 발현
단백질 세포내 소기관 국재화 PSORT
(문헌 [Bioinformatics. 2010 Jul 1;26(13):1608-15*])		 MHC 부류 I 또는 II
프로테아좀 절단 NetChop
(문헌 [Immunogenetics., 57(1-2):33-41, 2005*])		 프로테아좀에 의해 절단된
에피토프
TAP 수송
pMHC 부류 I 결합 친화성 netMHCpan
(문헌 [Immunogenetics. 2009 Jan;61(1):1-13*]; [PLoS One. 2007 Aug 29;2(8):e796*])		 MHC 부류 I에의 결합
pMHC 부류 II 결합 친화성 netMHCpan MHC 부류 II에의 결합
pMHC 안정성 및 오프 속도 C 말단 안정성 (모델링) netMHCstab
(문헌 [Immunology. 2014 Jan;141(1):18-26*])		 MHC 상에 계속 존재
pMHC C 말단 안정성 MHC 상에 계속 존재
큰 MHC 결합 "델타"
(MUT 대 WT)		 내성 모면
병원체 HLA 리간드와 유사 내성 모면
자가, 벌지와 다른 돌연변이 내성 모면
TCR에 접근가능한 위치의 돌연변이 내성 모면
비자가 펩티드를 생성하는 Indel 내성 모면
27 aa 펩티드 중의 에피토프의 개수 높은 유용성
* 상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
1.5 포스포펩티드 돌연변이체 확인
특정 실시양태에서, 대상체의 암 세포로부터 확인된 돌연변이체 펩티드는 포스포펩티드이며, 여기서, 인산화된 잔기(들) (예컨대, Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 및/또는 His)는 대상체의 상응하는 정상 세포에서는 인산화된 것이 아니다 (또는 실질적으로는 더 적은 정도로 인산화된 것이다). 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 환자의 암 세포로부터 돌연변이체 포스포펩티드를 확인할 수 있다. 적합한 방법으로는 제한 없이, 문헌 [Meyer et al. J　Proteome　Res. 2009 Jul;8(7):3666-74. doi: 10.1021/pr800937k], 및 [Zarling et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 3;103(40):14889-94] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기재된 것을 포함한다. 일단 적합한 돌연변이체 펩티드를 확인하고 나면, 본 발명의 치료학적 조성물, 사용하기 위한 용도의 조성물, 및 방법에서 사용하기 위한 용도의 항원성 포스포펩티드 또는 포스포펩티드 모방체를 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같이) 합성할 수 있다.
2. 항원성 펩티드
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 각 항원성 펩티드는 대상체의 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인, 상이한 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 포함한다. 특히, 특정 실시양태에서, 본 발명은 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하고, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 5개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 제1 조성물에 관한 것이다. 돌연변이체 MHC-결합 에피토프는 대상체, 예컨대, 아교모세포종 (GBM) 또는 다발성 골수종 (MM)을 앓고 있거나, 또는 그로부터 회복된 대상체로부터의 것으로 확인된 것이다. 항원성 펩티드는 합성적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있거나, 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 항원성 펩티드는 암, 예컨대, GBM 또는 MM의 치료 및/또는 예방에 유용한 조성물 생성물을 위해 애주번트와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 항원성 펩티드를 포함하는 조성물은 면역원성을 띠고, 대상체에서 암에 대한 유익한 면역 반응을 일으키는 데 효과적이다.
MHC 분자는 부류 I 또는 부류 II 분자로 분류된다. 부류 II MHC 분자는 면역 반응을 개시하고, 지속시키는 데 관여하는 세포, 예컨대, 수지상 세포, B 림프구, 대식세포 등에서 주로 발현된다. 부류 II MHC 분자는 헬퍼 T 림프구에 의해 인식되고, 이는 헬퍼 T 림프구의 증식, 및 제시된 특정 면역원성 펩티드에 대한 면역 반응의 증폭을 유도한다. 부류 I MHC 분자는 거의 모든 유핵 세포 상에서 발현되고, 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인식되며, 이어서, 항원을 보유하는 세포를 파괴시킨다. 세포독성 T 림프구는 종양 거부에서 및 바이러스 감염 퇴치에서 특히 중요하다. CTL은 무손상 외부 항원 그 자체보다는 MHC 부류 I 분자에 결합된 펩티드 단편 형태의 항원을 인식한다. MHC 분자에 결합할 수 있는 펩티드의 능력은 각종의 상이한 방식으로, 예컨대, 항원 제시 억제에 의해 (문헌 [Sette, et al., J. Immunol. 141:3893, 1991] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 시험관내 어셈블린 검정법에 의해 (문헌 [Townsend, et al., Cell 62:285, 1990]), 및 돌연변이화된 세포, 예컨대, RMA.S를 이용하는 FACS 기반 검정법에 의해 (문헌 [Melief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)) 측정될 수 있다. MHC 부류 I 분자에 결합할 것으로 예측되는 MHC-결합 에피토프는 전형적으로 8 내지 11개의 잔기인 반면, MHC 부류 II 분자에 결합할 것으로 예측되는 MHC-결합 에피토프는 전형적으로 범위가 10 내지 20개의 잔기이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물에서 사용되는 항원성 펩티드의 길이는 5-50개의 아미노산 길이 (예컨대, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50개의 아미노산 길이)이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드의 길이는 5 내지 50개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드의 길이는 25 내지 40개, 27 내지 31개, 또는 21-31개의 아미노산 길이이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 확인된 항원성 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 종양 세포에서 발현된 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 독특한 펩티드는 맵핑된 RNA-Seq 리드에 의해 확인한다. 상기 확인된 펩티드는 또한 아미노산의 부가 또는 결실에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드의 항원성 또는 면역원성이 파괴되지 않는다면, 수개의 (1, 2, 3, 4, 또는 5개) 추가의 아미노산 잔기를 펩티드의 어느 한 단부 또는 양쪽 단부 모두에 부가하거나, 또는 그로부터 제거할 수 있다. 펩티드를 또한 특정 잔기, 예를 들어, MHC-결합 에피토프 내에 위치하는 잔기의 순서 또는 조성을 변경시킴으로써 변형시킬 수 있다. MHC 분자에의 결합에 필수적인 특정 아미노산 잔기, 예컨대, 중요한 접촉 부위에 있는 잔기 또는 에피토프에서 보존되는 잔기는 일반적으로 면역원성 활성에 대하여 유해 효과 없이 변경될 수는 없다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 항원성 펩티드의 아미노산 서열이 원래 확인된 펩티드와 적어도 50%, 60%, 70%, 또는 80% 유사한 것인, 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 돌연변이체 펩티드의 변이체인 항원성 펩티드를 제공한다. 바람직하게, 유사성은 90%이고, 가장 바람직하게, 95% 이상이다. 변이체는 확인된 아미노산 서열과 비교하여 대개는 또는 오직 아미노산의 보존적 치환만을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 있다 해도, 아미노산 치환은 펩티드의 에피토프 내에는 거의 존재하지 않는다.
서열 내의 아미노산의 보존적 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 보존적 치환이란, 아미노산 잔기를, 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 것으로, 예컨대, 한 소수성 잔기를 또 다른 것 대신으로, 또는 한 극성 잔기를 또 다른 것 대신으로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 상기 변형은 예컨대, 문헌 [Merrifield, Science 232:341-347 (1986)], [Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds. (New York, Academic Press), pp. 1-284 (1979)]; 및 [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984)] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은, 널리 공지된 펩티드 합성 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 열 충격 단백질에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 항원성 펩티드를 포함한다. 상기 아미노산 서열은 본원에서 "열 충격 단백질 결합 서열"로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 열 충격 단백질 (예컨대, hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 또는 칼레티쿨린)에 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 이하의 Kd로 결합한다. 열 충격 단백질 결합 서열의 길이는 전형적으로 5 내지 15개의 아미노산 잔기 길이이고, 상기 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 결합 서열은 본 발명에서 시험관내 또는 생체내에서의, 본 발명의 펩티드 MHC-결합 에피토프를 포함하는 펩티드의 세그먼트의 열 충격 단백질에의 비공유적 결합을 촉진시키는 데 사용된다. 다수의 상기 결합 서열은 MHC-결합 에피토프의 유래 기점이 되는 펩티드와 이종성이다. 다수의 단백질에 존재하는 이종성 충격 단백질 결합 부위가 사용될 수 있다. 상기 열 충격 단백질 결합 서열의 예는 미국 특허 번호 7,420,037 및 7,309,491, 및 PCT/US96/13363에 상응하는 PCT 공보 WO 97/06821, 문헌 [Blond-Elguindi, S. et al., "Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP." Cell 75:717-728 (1993)]; [Flynn, G. C. et al., "Peptide binding and release by proteins implicated as catalysts of protein assembly." Science 245:385-390 (1989)]; [Auger, I. et al., "HLA-DR4 and HLA-DR10 motifs that carry susceptibility to rheumatoid arthritis bind 70-kD heat shock proteins." Nature Medicine, 2:306-310 (1996)]; 및 [Gragerov, A. et al., "Different Specificity of DnaK-peptide binding." J. Molec. Biol. 235:848-854 (1994)]에 개시되어 있다. 열 충격 단백질 결합 서열의 요법은 예컨대, 문헌 [Moroi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2000, 97:3485]에 기술되어 있다 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다).
본 발명의 조성물에서 유용한 열 충격 단백질 결합 서열 중 한 예로는 서열: Hy(Trp/X)HyXHyXHy (여기서, Hy는 소수성 아미노산 잔기, 특히, 트립토판, 류신, 또는 페닐알라닌을 나타내고, X는 임의의 아미노산이다)를 가지는 칠량체 세그먼트가 있다. 상기 열 충격 단백질 결합 서열, 또는 다른 열 충격 단백질 결합 서열은 바람직하게는 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 단부 중 어느 하나에 존재한다. 임의적으로, 열 충격 단백질 결합 서열은 수개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩티드 링커 (예컨대, 미국 특허 번호 7,309,491 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이, 서열: 글리신-세린-글리신 또는 phe-phe-arg-lys를 가지는 트리펩티드 링커)에 의해 단부 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 상기 항원성 펩티드는 펩티드 결합에 의해 펩티드의 나머지 부분에 연결된 열 충격 단백질 결합 서열의 아미노산 잔기로 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 항원성 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 융합 펩티드로서 합성될 수 있다. 본원에 개시된 항원성 펩티드에 포함시키는 데 적합한 열 충격 단백질 결합 서열, 예컨대, 고친화성 열 충격 단백질 결합 서열로는 제한 없이, NLLRLTG (서열번호 439), NLLRLTGW (서열번호 440), HWDFAWPW (서열번호 441), HWDFAWP (서열번호 442), FYQLALTW (서열번호 443), FYQLALT (서열번호 444), RKLFFNLRW (서열번호 445), 및 RKLFFNLR (서열번호 446)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 열 충격 단백질 결합 서열을 포함하는 항원성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열의 길이는 5 내지 15개의 아미노산 길이이다. 본원에 개시된 항원성 펩티드에 포함시키는 데 적합한 열 충격 단백질 결합 서열로는 제한 없이, NLLRLTG (서열번호 439), NLLRLTGW (서열번호 440), HWDFAWPW (서열번호 441), HWDFAWP (서열번호 442), FYQLALTW (서열번호 443), FYQLALT (서열번호 444), RKLFFNLRW (서열번호 445), 및 RKLFFNLR (서열번호 446)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 NLLRLTG (서열번호 439)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 항원성 펩티드의 C-말단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 항원성 펩티드의 N-말단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 항원성 펩티드의 가운데 존재한다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 단부 중 어느 하나에 존재한다. 특정 실시양태에서, 열 충격 단백질 결합 서열은 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 단부 중 어느 하나에 링커를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커의 길이는 2 내지 10개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 FFRK (서열번호 447)이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 5 내지 50개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 25 내지 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 27 내지 31개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 8 내지 12개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프는 인산화된 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프는 포스포모방체 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 포스포모방체 잔기는 인산화된 잔기의 비가수분해성 유사체이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 8 내지 12개의 아미노산 길이이고, MHC-결합 에피토프는 인산화된 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 8 내지 12개의 아미노산 길이이고, MHC-결합 에피토프는 포스포모방체 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드의 길이는 15 내지 60개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드의 길이는 15 내지 40개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드의 길이는 30-60개의 아미노산 길이이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는, 27-31개의 아미노산 길이인, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열; 2-10개의 아미노산 길이인, 펩티드 링커, 예컨대, FFRK (서열번호 447); 및 5-15개의 아미노산 길이인, 열 충격 단백질 결합 서열, 예컨대, NLLRLTG (서열번호 439), NLLRLTGW (서열번호 440), HWDFAWPW (서열번호 441), HWDFAWP (서열번호 442), FYQLALTW (서열번호 443), FYQLALT (서열번호 444), RKLFFNLRW (서열번호 445), 및 RKLFFNLR (서열번호 446)을 포함하는 것으로서, 여기서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열, 펩티드 링커, 및 열 충격 단백질 결합 서열은 순차적으로 N-말단에서 C-말단, 또는 C-말단에서 N-말단으로 배열되어 있는 것인, 34-56개의 아미노산 길이, 예컨대, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 또는 56개의 아미노산 길이의 것이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는, 27개의 아미노산 길이인, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열; 펩티드 링커 FFRK (서열번호 447); 및 열 충격 단백질 결합 서열 NLLRLTG (서열번호 439)를 포함하는 것으로서, 여기서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열, 펩티드 링커, 및 열 충격 단백질 결합 서열은 순차적으로 N-말단에서 C-말단, 또는 C-말단에서 N-말단으로 배열되어 있는 것인, 38개의 아미노산 길이의 것이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 같은 길이의 두 펩티드가 측면에 위치하는 가운데에 돌연변이화된 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 27개의 아미노산 길이이고, 13개의 아미노산 길이인 두 펩티드가 측면에 위치하는 14번 위치에 돌연변이화된 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 29개의 아미노산 길이이고, 14개의 아미노산 길이인 두 펩티드가 측면에 위치하는 15번 위치에 돌연변이화된 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 31개의 아미노산 길이이고,15개의 아미노산 길이인 두 펩티드가 측면에 위치하는 16번 위치에 돌연변이화된 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는, 8-12개의 아미노산 길이인, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열; 2-10개의 아미노산 길이인, 펩티드 링커, 예컨대, FFRK (서열번호 447); 및 5-15개의 아미노산 길이인, 열 충격 단백질 결합 서열, 예컨대, NLLRLTG (서열번호 439), NLLRLTGW (서열번호 440), HWDFAWPW (서열번호 441), HWDFAWP (서열번호 442), FYQLALTW (서열번호 443), FYQLALT (서열번호 444), RKLFFNLRW (서열번호 445), 및 RKLFFNLR (서열번호 446)을 포함하는 것으로서, 여기서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열, 펩티드 링커, 및 열 충격 단백질 결합 서열은 순차적으로 N-말단에서 C-말단, 또는 C-말단에서 N-말단으로 배열되어 있는 것인, 15-37개의 아미노산 길이, 예컨대, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37개의 아미노산 길이의 것이다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는, 9개의 아미노산 길이인, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열; 펩티드 링커 FFRK (서열번호 447); 및 열 충격 단백질 결합 서열 NLLRLTG (서열번호 439)를 포함하는 것으로서, 여기서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열, 펩티드 링커, 및 열 충격 단백질 결합 서열은 순차적으로 N-말단에서 C-말단, 또는 C-말단에서 N-말단으로 배열되어 있는 것인, 20개의 아미노산 길이의 것이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프는 MHC 부류 I 결합 에피토프이다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 8-12개의 아미노산 길이이고, 인산화된 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 길이는 8-12개의 아미노산 길이이고, 포스포모방체 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 포스포모방체 잔기는 인산화된 잔기의 비가수분해성 유사체이다.
한 바람직한 실시양태에서, 항원성 펩티드는 각각 그의 N- 또는 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게, 항원성 펩티드는 각각 그의 C-말단에 열 충격 단백질 결합 서열을 포함하고/거나, 열 충격 단백질 결합 서열은 펩티드 링커를 통해 항원성 펩티드의 나머지 부분에 연결된다. 한 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 아미노산 서열 FFRK (서열번호 447)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항원성 펩티드는 C-말단에 아미노산 서열 FFRKNLLRLTG (서열번호 477)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 27-31개의 아미노산 길이 (예컨대, 27, 29, 또는 31개의 아미노산 길이)인, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열의 대략 가운데 정도의 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다 (예컨대, 종양-특이 돌연변이는 각각 27, 29, 또는 31개의 아미노산 펩티드의 대략 14, 15, 및 16번 위치에 존재한다).
특정 실시양태에서, 본 발명의 항원성 펩티드는 N-말단에 아미노산 서열 NLLRLTGFFRK (서열번호 478)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원성 펩티드는 27-31개의 아미노산 길이 (예컨대, 27, 29, 또는 31개의 아미노산 길이)인, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열의 대략 가운데 정도의 위치에 종양-특이 돌연변이를 가진다 (예컨대, 종양-특이 돌연변이는 각각 27, 29, 또는 31개의 아미노산 펩티드의 대략 14, 15, 및 16번 위치에 존재한다).
번역 동안 또는 번역 후, 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 또는 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 또는 단백질 분해 절단에 의해 변형된 항원성 펩티드의 유도체 또는 유사체도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것은, 유리 NH2- 기, 유리 COOH-- 기, OH-- 기, Trp-, Tyr-, Phe-, His-, Arg-, 또는 Lys-의 측쇄 기의 보호 또는 변형에 유용한 시약; 브롬화시안, 히드록실아민, BNPS-스카톨, 산, 또는 알칼리 가수분해에 의한 특이적인 화학적 절단; 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 효소적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신의 존재하에서의 대사 합성 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드 중의 인산화된 아미노산 잔기가 포스포모방체 기로 치환된 것인 포스포펩티드 모방체가 사용된다. 포스포모방체 기의 비제한적인 예로는 O-보라노포스포, 보로노, O-디티오포스포, 포스포라미드, H-포스포네이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티올레이트, 포스포디티올레이트 및 포스포로플루오리데이트를 포함하며, 상기 중 임의의 것은 Tyr, Thr, Ser, Arg, Lys, 또는 His 잔기 상에서 유도체화될 수 있다. 특정 실시양태에서, Asp 또는 Glu 잔기는 포스포모방체로서 사용된다. Asp 또는 Glu 잔기 또한 포스포모방체 기로서 작용할 수 있으며, 펩티드에서 포스포-Tyr, 포스포-Thr, 포스포-Ser, 포스포-Arg, 포스포-Lys 및/또는 포스포-His 잔기 대신으로 사용될 수 있다.
2.1. 화학적 합성에 의한 항원성 펩티드의 제조
펩티드 합성 사용을 포함하는 표준 화학 방법에 의해 항원성 펩티드를 합성할 수 있다. 종래 펩티드 합성 또는 당업계에 널리 공지된 다른 합성 프로토콜이 사용될 수 있다.
항원성 펩티드의 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 예를 들어, 문헌 [Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 합성될 수 있다. 합성 동안, 보호된 측쇄를 가지는 N-α-보호된 아미노산을 그의 C-말단에 연결된 성장 폴리펩티드에, 및 불용성 중합체 지지체, 즉, 폴리스티렌 비드에 단계식으로 부가한다. 그와 시약, 예컨대, 디시클로헥실카르보디이미드의 반응에 의해 활성화된 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실에 N-α-탈보호된 아미노산의 아미노 기를 연결시킴으로써 펩티드는 합성된다. 유리 아미노 기를 활성화된 카르복실에 부착시킴에 따라 펩티드 결합이 형성된다. 가장 보편적으로 사용되는 N-α-보호기로는 산성에 불안정한 Boc 및 염기성에 불안정한 Fmoc를 포함한다. 적절한 화학법, 수지, 보호기, 보호된 아미노산 및 시약에 관한 상세한 설명은 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌 [Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press], 및 [Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
추가로, 항원성 펩티드의 펩티드 유사체 및 유도체는 상기 기술된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 원하는 경우, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 치환 또는 부가로서 펩티드 서열 내로 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산으로는 통상의 아미노산의 D-이성질체, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, 디자이너 아미노산, 예컨대, β-메틸 아미노산, C-α-메틸 아미노산, 및 N-α-메틸 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 및 His의 측쇄 상에서 인산화된 펩티드는 적절한 측쇄 보호된 Fmoc-포스포 아미노산을 사용하여 Fmoc 고체상 합성으로 합성될 수 있다. 이러한 방식으로, 인산화된 및 인산화되지 않은 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 및 His 잔기의 조합을 포함하는 펩티드가 합성될 수 있다. 예를 들어, 스타에르카에르(Staerkaer) 등의 방법이 적용될 수 있다 (문헌 [1991, Tetrahedron Letters 32: 5389-5392]). 다른 방법 (특이적인 아미노산에 대한 일부의 것)이 문헌 [De Bont et al. (1987, Trav. Chim Pays Bas 106: 641, 642)], [Bannwarth and Trezeciak (1987, Helv. Chim. Acta 70: 175-186)], [Perich and Johns (1988, Tetrahedron Letters 29: 2369-2372)], [Kitas et al. (1990, J. Org. Chem. 55:4181-4187)], [Valerio et al. (1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33:428-438)], [Perich et al. (1991, Tetrahedron Letters 32:4033-4034)], [Pennington (1994, Meth. Molec. Biol. 35:195-2)], 및 [Perich (1997, Methods Enzymol. 289:245-266] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 상세하게 설명되어 있다.
포스포펩티드는 또한 먼저, 염기성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 세포 배양에 의해 상기 폴리펩티드를 제조한 후, 적절한 아미노산의 히드록실 기를 유기 합성 또는 인산화 효소를 이용하는 효소 방법을 사용하여 포스페이트 기에 의해 치환한다. 예를 들어, 세린 특이적 인산화인 경우, 세린 키나제가 사용될 수 있다.
항원성 펩티드 중 인산화된 아미노산 잔기가 포스포모방체 기로 치환된 것인 포스포펩티드 모방체 또한 합성될 수 있다. 포스포모방체 기의 비제한적인 예로는 O-보라노포스포, 보로노, O-디티오포스포, 포스포라미드, H-포스포네이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티올레이트, 포스포디티올레이트 및 포스포로플루오리데이트를 포함하며, 상기 중 임의의 것은 Tyr, Thr, Ser, Arg, Lys, 또는 His 잔기 상에서 유도체화될 수 있다. 특정 실시양태에서, Asp 또는 Glu 잔기는 포스포모방체로서 사용된다. Asp 또는 Glu 잔기 또한 포스포모방체 기로서 작용할 수 있으며, 펩티드에서 포스포-Tyr, 포스포-Thr, 포스포-Ser, 포스포-Arg, 포스포-Lys 및/또는 포스포-His 잔기 대신으로 사용될 수 있다.
생성된 펩티드의 정제는 종래 방법, 예컨대, 역상을 이용하는 분취용 HPLC, 겔 투과, 분배 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 달성된다. 적절한 매트릭스 및 완충제 선택은 당업계에 널리 공지되어 있는 바, 이에 본원에서는 상세하게 기술하지 않는다.
2.2. 재조합 DNA 기술을 이용한 항원성 펩티드의 제조
항원성 펩티드는 또한 당업계에 공지된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 항원성 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 아미노산 서열의 역 변형에 의해 수득될 수 있고, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 합성기 사용과 같은, 표준 화학 방법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 항원성 펩티드에 대한 코딩 정보는 특이적으로 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 PCR 방법을 사용하여 DNA 주형으로부터 수득될 수 있다. 항원성 펩티드의 변형물 및 단편은 항원적으로 등가인 분자를 제공하는 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 코딩 서열의 축퇴성에 기인하여, 항원성 단백질과 동일한 것 또는 그의 변형물을 코딩하는 DNA 서열이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 이는 서열 내에서 항원적으로 등가인 아미노산 잔기를 코딩하는 바, 이로써 침묵 또는 보존적 변이를 일으키는 것인 상이한 코돈의 치환에 의해 변경된 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항원성 펩티드를 코딩하는 핵산이 숙주 세포에서의 증식 및 발현을 위해 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
본원에서 고려되는 길이의 펩티드에 대한 코딩 서열은 화학 기술, 예를 들어, 문헌 [Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성될 수 있는 바, 이에 변형은 간단하게 적절한 염기(들)를 천연 펩티드 서열을 코딩하는 것 대신으로 치환함으로써 이루어질 수 있다. 이어서, 코딩 서열을 적절한 링커와 함께 제공하고, 당업계에서 일반적으로 이용가능한 발현 벡터로 라이게이션시키고, 벡터를 사용하여 적합한 숙주를 형질전환시킴으로써 원하는 펩티드 또는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 현재 다수의 상기와 같은 벡터 및 적합한 숙주 시스템이 이용가능하다. 펩티드 또는 융합 단백질 발현을 위해, 코딩 서열을 작동가능하게 연결된 출발 및 정지 코돈, 프로모터 및 종결인자 영역 및 일반적으로 복제 시스템과 함께 제공하여 원하는 세포 숙주에서의 발현을 위한 발현 벡터를 제공할 수 있을 것이다.
발현 구축물이란, 적절한 숙주 세포에서 펩티드가 발현될 수 있게 하는 하나 이상의 조절 영역과 작동가능하게 연결된 항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "작동가능하게 연결된"이란, 조절 영역 및 발현시키고자 하는 펩티드 서열이 전사, 및 궁극적으로 번역될 수 있도록 허용하는 방식으로 연결되어 있고, 배치되어 있는 회합 상태를 지칭한다.
펩티드의 전사에 필요한 조절 영역이 발현 벡터에 의해 제공될 수 있다. 그의 동족 개시 코돈이 없는 펩티드 유전자 서열을 발현시키고자 하는 경우, 번역 개시 코돈 (ATG) 또한 제공될 수 있다. 화합성인 숙주-구축물 시스템에서, 세포 전사 인자, 예컨대, RNA 폴리머라제는 발현 구축물 상의 조절 영역에 결합하여 숙주 유기체에서 펩티드 서열이 전사될 수 있도록 할 것이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 숙주 세포마다 달라질 수 있다. 일반적으로, RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고, 작동가능하게 회합된 핵선 서열의 전사를 촉진시킬 수 있는 프로모터가 요구된다. 상기 조절 영역은 전사 및 번역 개시에 관여하는 상기 5' 비코딩 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함할 수 있다. 코딩 서열에 대하여 3'인 비코딩 영역은 전사 종결 조절 서열, 예컨대, 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 함유할 수 있다.
조절 기능이 있는 DNA 서열, 예컨대, 프로모터를 펩티드 유전자 서열에 부착시키기 위해, 또는 펩티드 유전자 서열을 벡터의 클로닝 부위 내로 삽입시키기 위해, 적절한 화합성 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터를 당업계에 널리 공지된 기술에 의해 cDNA의 단부에 라이게이션시킬 수 있다 (문헌 [Wu et al., 1987, Methods in Enzymol 152:343-349] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 제한 효소로 절단한 후, 이어서, 라이게이션 이전에 역 분해시키거나, 또는단일 가닥 DNA 말단을 충전시켜 변형시킴으로써 블런트 말단을 생성할 수 있다. 대안적으로, 원하는 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머를 이용하여 PCR을 사용함으로써 DNA를 증폭시켜 원하는 제한 효소 부위를 DNA 단편에 도입할 수 있다.
조절 영역과 작동가능하게 연결된 항원성 펩티드 서열을 포함하는 발현 구축물을 추가의 클로닝 없이 펩티드의 발현 및 제조를 위하여 적절한 숙주 세포 내로 바로 직접 도입할 수 있다. 발현 구축물은 또한 예컨대, 상동성 재조합을 통한 DNA 서열의 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 촉진시키는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 이러한 경우, 숙주 세포에서 펩티드를 증식시키고, 발현시키기 위해 적절한 숙주 세포에 적합한 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용할 필요는 없다.
플라스미드, 코스미드, 파지, 파지미드 또는 변형된 바이러스를 비롯한, 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 전형적으로, 상기 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에서의 벡터의 증식을 위한 기능성 복제 기점, 펩티드 유전자 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커를 포함한다. 발현 벡터는 본 발명의 항원성 펩티드 중 하나 이상의 것에 대한 뉴클레오티드 서열을 보유하도록 구축될 수 있다. 발현 벡터는 박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 원핵성 또는 진핵성 유기체로부터 유래될 수 있는 화합성 숙주 세포와 함께 사용되어야 한다. 상기 숙주 세포는 예컨대, 본 발명의 항원성 펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단일 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써, 또는 본 발명의 상이한 항원성 펩티드를 코딩하는 다중 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 하나 이상의 항원성 펩티드를 발현하도록 형질전환시킬 수 있다.
박테리아 시스템에서, 항원성 펩티드를 제조할 수 있도록 다수의 발현 벡터가 이롭게 선택될 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 제약 조성물을 생성하기 위하여 상기 단백질을 대량으로 제조하고자 하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물을 고수준으로 발현될 수 있도록 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터로는, 융합 단백질이 제조될 수 있도록 펩티드 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 함께 프레임 내에 벡터 내로 개별적으로 라이게이션될 수 있는 것인 E. 콜라이(E. coli) 발현 벡터 pUR278 (문헌 [Ruther et al., 1983, EMBO J. 2, 1791] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다); pIN 벡터 (문헌 [Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109]; [Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem 264, 5503-5509] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)) 등을 포함한다. pGEX 벡터 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 상기 펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드에의 부착 후, 유리 글루타티온의 존재하에서의 용리에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 항원성 펩티드가 GST 모이어티로부터 유리될 수 있도록 하기 위해 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인된다.
대안적으로, 적절하게 프로세싱된 펩티드 복합체가 장기간 동안 고수율로 제조될 수 있도록 하기 위해서는 포유동물 세포에서 안정적인 발현이 바람직하다. 선별가능한 마커를 함유하는 벡터를 사용함으로써 펩티드 복합체를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 예로서, 발현 구축물 도입 후, 조작된 세포를 강화 배지 중에서 1-2일 동안 성장시킬 수 있고, 이후, 선별 배지를 교체한다. 발현 구축물 중의 선별가능한 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 최적으로는 세포가 그의 염색체 내로 발현 구축물을 안정적으로 통합할 수 있고, 배양물 중에서 성장할 수 있고, 세포주로 확장될 수 있게 한다. 상기 세포를 장기간 동안 배양할 수 있고, 그 기간 동안 펩티드는 연속적으로 발현된다.
온도, 인큐베이션 시간, 광학 밀도 및 배지 조성에 대한 표준 조건하에서 재조합 세포를 배양할 수 있다. 그러나, 재조합 세포를 성장시키기 위한 조건은 항원성 펩티드의 발현을 위한 조건과 상이할 수 있다. 펩티드 제조 증진을 위해 변형된 배양 조건 및 배지 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 그의 동족 프로모터와 함께 펩티드를 함유하는 재조합 세포를 열 또는 다른 환경적 스트레스, 또는 화학적 스트레스에 노출시킬 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 기술을 적용하여 펩티드 복합체 제조를 위한 최적의 조건을 확립시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 메티오닌을 코딩하는 코돈을 부가하여 펩티드 번역 개시를 위한 신호를 제공한다. 상기 메티오닌은 항원성 펩티드에 부착된 상태 그대로 유지될 수 있거나, 또는 메티오닌은 펩티드로부터 메티오닌의 절단을 촉매화시킬 수 있는 효소 또는 효소들 첨가에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 원핵생물 및 진핵생물, 둘 모두에서, N-말단 메티오닌은 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)에 의해 제거된다 (문헌 [Tsunasawa et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 5382-5391] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 메티오닌 아미노펩티다제는 E. 콜라이, 효모, 및 래트를 비롯한 수개의 유기체로부터 단리되고, 클로닝되었다.
펩티드는 공지 방법에 의해 박테리아, 포유동물, 또는 다른 숙주 세포 유형으로부터, 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, vol. 2, chapter 8, Coligan et al. (ed.), John Wiley & Sons, Inc.]; [Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual by Rowland et al., Little Brown & Co., June 1994] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
3. 열 충격 단백질 및 사용 방법
3.1. 열 충격 단백질
본 발명의 실시에서 유용한 것으로서, 본원에서는 상호교환적으로 스트레스 단백질로도 또한 지칭되는 열 충격 단백질은 다른 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있고, 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 존재하에서 또는 산성 조건하에서 결합된 단백질 또는 펩티드를 유리시킬 수 있는 임의의 세포 단백질로부터 선택될 수 있다. 세포가 스트레스성 자극에 노출되었을 때, 상기 단백질의 세포내 농도는 증가할 수 있다. 스트레스에 의해 유도되는 상기 열 충경 단백질 이외에도, HSP60, HSP70, HSP90, HSP100, sHSP, 및 PDI 패밀리는 또한 서열이 유사한, 예를 들어, 35% 초과의 아미노산 동일성을 가지되, 그의 발현 수준은 스트레스에 의해 변경되지 않는, 스트레스 유도성 HSP와 관련된 단백질을 포함한다. 그러므로, 스트레스 단백질 또는 열 충격 단백질 (HSP)의 정의는, 상기 패밀리의 구성원과 적어도 35% (예컨대, 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99%)의 아미노산 동일성을 가지며, 세포에서의 그의 발현 수준은 스트레스성 자극에 대한 반응으로 증진되는 것인, 다른 단백질, 그의 돌연변이체, 유사체, 및 변이체를 포함하는 것으로 고려된다.
상기 기술된 주요 HSP 패밀리 이외에도, 소포체 상주 단백질인 칼레티쿨린 또한 항원성 분자와 복합체를 형성하였을 때, 면역 반응을 유도하는 데 있어 유용한 또 다른 열 충격 단백질인 것으로 확인되었다 (문헌 [Basu and Srivastava, 1999, J. Exp. Med. 189:797-202]; 상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 스트레스 단백질로는 grp78 (또는 BiP), 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI), hsp110, 및 grp170을 포함한다 (문헌 [Lin et al., 1993, Mol. Biol. Cell, 4:1109-1119]; [Wang et al., 2001, J. Immunol., 165:490-497] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 이어서, 상기 패밀리의 다수의 구성원들은 영양 결핍, 대사 파괴, 산소 라디칼, 저산소증 및 세포내 병원균에 의한 감염을 비롯한, 다른 스트레스성 자극에 대한 반응으로 유도되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Welch, May 1993, Scientific American 56-64]; [Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420]; [Craig, 1993, Science 260:1902-1903]; [Gething, et al., 1992, Nature 355:33-45]; 및 [Lindqui; st, et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 패밀리 모두에 속하는 HSP/스트레스 단백질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다고 고려된다. 특정 실시양태에서, 스트레스 단백질은 펩티드-MHC 제시를 촉진시키는 임의의 샤프론 단백질을 포함한다. 적합한 샤프론 단백질로는 ER 샤프론, 예컨대, 타파신 (예컨대, 인간 타파신)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
주요 HSP는 스트레스를 받은 세포에 매우 높은 수준으로 축적될 수 있지만, 스트레스를 받지 않은 세포에는 낮은 수준 내지 중간 정도의 수준으로 존재한다. 예를 들어, 고도로 유도가능한 포유동물 hsp70은 표준 온도에서는 거의 검출불가능하지만, 열 충격시에는 세포에서 가장 활발하게 합성된 단백질들 중 하나가 된다 (문헌 [Welch, et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 그에 반해, hsp90 및 hsp60 단백질은 모두는 아니지만, 대부분의 포유동물 세포에서 표준 온도에서 풍부하게 존재하고, 열에 의해서 추가로 유도된다 (문헌 [Lai, et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-10]; [van Bergen en Henegouwen, et al., 1987, Genes Dev. 1:525-31] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
다양한 실시양태에서, 패밀리 내의 열 충격 단백질 또는 열 충격 단백질의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 낮은 정도 내지 중간 정도의 엄격한 조건하에서 HSP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와의 하이브리드화에 의해 확인 및 수득될 수 있다.
예로서, 낮은 엄격도의 조건을 사용하는 방법은 하기와 같다 (또한 문헌 [Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792] 참조). DNA를 함유하는 필터를 40℃에서 6 h 동안 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% 피콜(Ficoll), 1% BSA, 및 500 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에서 전처리한다. 하기와 같이 변형된 동일한 용액 중에서 하이브리드화를 수행한다: 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.2% BSA, 100 ㎍/ml 연어 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 술페이트. 필터를 40℃에서 18-20 h 동안 하이브리드화 혼합물 중에서 인큐베이션시킨 후, 이어서, 55℃에서 1.5 h 동안 2 x SSC, 25 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 함유하는 용액 중에서 세척한다. 세척액을 신선한 용액으로 대체하고, 60℃에서 추가로 1.5 h 동안 인큐베이션시킨다. 필터를 건식으로 블롯팅하고, 신호 검출을 위해 노출시킨다. 필요할 경우, 필터를 신호 검출 이전에 65-68℃에서 ⅓ 시간 동안 세척한다. 사용될 수 있는 낮은 엄격도의 다른 조건은 당업계에 (예컨대, 종간 하이브리드화에 사용되는 것으로서) 널리 공지되어 있다.
HSP가 사용되는 경우, HSP의 펩티드 결합 단편, 및 HSP의 기능상 활성인 유도체, 유사체, 및 변이체 또한 사용될 수 있다. "HSP 펩티드 결합 단편"이라는 용어는 펩티드와 비공유적으로 회합하여 복합체를 형성할 수 있고, 면역 반응을 유도할 수 있는 도메인을 포함하지만, 전장의 HSP는 아닌 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 사용된다. "HSP의 변이체"라는 용어는 펩티드와 비공유적으로 회합하여 복합체를 형성할 수 있고, 면역 반응을 유도할 수 있지만, HSP와 고도한 서열 유사성을 공유하는 것인 폴리펩티드를 지칭한다. 두 아미노산 서열 또는 핵산 서열 사이의 한 영역의 동일성을 측정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열을 정렬한다 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 중에 갭을 도입시킬 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 점유되어 있다면, 이때 상기 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다. 두 서열 사이의 동일성(%)은 서열이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, 동일성(%) = 동일한 중복 위치의 개수/위치의 총 개수 x 100%). 한 실시양태에서, 두 서열이 길이는 동일하다.
두 서열 사이의 동일성(%) 측정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비제한적인 예로는 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이 있다 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다). 상기 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 도입된다. NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이=12를 이용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행함으로써 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3을 이용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 갭이 있는 BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast는 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Altschul et al., 1997, 상기 문헌]). BLAST, 갭이 있는 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예로는 문헌 [Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이 있다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 도입된다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4가 사용될 수 있다. 갭을 허용하면서, 또는 허용하지 않고, 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 두 서열 사이의 동일성(%)을 측정할 수 있다. 동일성(%)을 산출할 때, 전형적으로는 오직 정확한 매치만 계수된다.
한 실시양태에서, 예를 들어, hsp70 및 hsc70 펩티드 결합 도메인 유도체 및 유사체를 디자인할 수 있다. Hsp70 펩티드 결합 부위의 3차원 구조를 컴퓨터 모델링함으로써, 펩티드 결합에 관여하지 않는 아미노산 잔기 또는 구조적으로 중요한 결정기가 야생형 잔기 대신으로 치환될 수 있는, hsc70 변이체를 비롯한 hsp70 패밀리의 구성원이 변이체를 디자인할 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 HSP 펩티드 결합 단편은, 그의 N-말단측 상에서 천연적으로 N-말단측 상에서 펩티드 결합 도메인 측면에 위치하는 가변적 개수의 아미노산과 인접해 있고, C-말단측 상에서 천연적으로 C-말단측 상에서 펩티드 결합 도메인 측면에 위치하는 가변적 개수의 아미노산과 인접해 있는 펩티드 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 2001/0034042 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 HSP의 펩티드 결합 단편을 참조할 수 있다.
천연적으로 발생된 HSP의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 서열 데이터베이스, 예컨대, 진뱅크(GenBank)에서 이용가능하다. 예를 들어, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 열 충격 단백질 HSP70 (열 충격 70 kDa 단백질 1A)은 하기 식별자 HGNC: 5232; 앙트래즈 진(Entrez Gene): 3303; 앙상블(Ensembl): ENSG00000204389; OMIM: 140550; 유니프로트KB(UniProtKB): P08107 및 NCBI 참조 서열: NM_005345.5를 가진다. 데이터베이스를 열람하고, 수탁 번호에 의해 관심의 대상이 되는 임의의 아미노산 서열 및 유전자 서열 데이터를 검색하는 데 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 앙트래즈(Entrez)가 사용될 수 있다. 예컨대, FASTA 및 BLAST와 같이, 정렬 스코어 및 통계치에 의해 유사 서열을 순위화하는 프로그램을 사용하여 질의 서열과 다양한 정도의 유사성을 가지는 서열을 확인하는 데 상기 데이터베이스 또한 검색될 수 있다. 본 발명의 HSP 펩티드 결합 단편 제조를 위해 사용될 수 있는 HSP의 비제한적인 예의 상기 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다: 인간 Hsp70, 진뱅크 수탁 번호 NM_005345 (문헌 [Sargent et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1968-1972]); 인간 Hsc70: 진뱅크 수탁 번호 P11142, Y00371; 인간 Hsp90, 진뱅크 수탁 번호 X15183 (문헌 [Yamazaki et al., Nucl. Acids Res. 17:7108]); 인간 gp96: 진뱅크 수탁 번호 X15187(문헌 [Maki et al., 1990, Proc. Natl. Acad Sci., 87: 5658-5562]); 인간 BiP: 진뱅크 수탁 번호 M19645; (문헌 [Ting et al., 1988, DNA 7: 275-286]); 인간 Hsp27, 진뱅크 수탁 번호 M24743; (문헌 [Hickey et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45]); 마우스 Hsp70: 진뱅크 수탁 번호 M35021 (문헌 [Hunt et al., 1990, Gene, 87:199-204]); 마우스 gp96: 진뱅크 수탁 번호 M16370 (문헌 [Srivastava et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3807-3811]); 및 마우스 BiP: 진뱅크 수탁 번호 U16277 (문헌 [Haas et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2250-2254]) (상기 참고 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다). 유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, "HSP 핵산 서열"이라는 용어는 천연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, HSP를 코딩하는 다른 축퇴성 DNA 서열들 모두 포함한다.
제약 제제 중의 HSP는 조직으로부터의 정제에 의해, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. HSP는 후속되는 시험관내에서의 하나 이상의 항원성 펩티드와의 복합체 형성을 위해 ATP의 존재하에서 또는 산성 조건 (pH 1 내지 pH 6.9)하에서 조직으로부터의 정제될 수 있다. 문헌 [Peng, et al., 1997, J. Immunol. Methods, 204:13-21]; [Li and Srivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151] (상기 참고 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. "정제된" 스트레스 단백질 또는 열 충격 단백질에는 세포 중, 세포 추출물 중, 세포 배양 배지 중, 또는 개체 중에서 상기 단백질과 회합되어 있는 물질이 실질적으로 없다.
주어진 HSP 또는 그의 펩티드 결합 도메인의 정의된 아미노산 또는 cDNA 서열을 사용하여 숙주 세포 내로 형질감염되고, 상기 세포에서 발현되는 유전자 구축물을 제조할 수 있다. 재조합 숙주 세포는, 숙주 세포에서 HSP 핵산 서열의 발현을 구동시키는 조절 영역(들)과 작동가능하게 연결된, HSP 또는 펩티드 결합 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열의 하나 이상의 카피를 함유할 수 있다. 재조합 HSP 유전자 또는 HSP 유전자의 단편을 생성하는 데 재조합 DNA 기술이 쉽게 사용될 수 있고, 상기 HSP 유전자 단편을 발현시키는 데 표준 기술이 사용될 수 있다. 본 발명의 HSP 또는 펩티드 결합 단편을 제조하는 데, cDNA 및 게놈 DNA를 비롯한, HSP 펩티드 결합 도메인을 코딩하는 임의의 핵산 서열이 사용될 수 있다. 펩티드 결합 도메인을 함유하는 HSP 유전자 단편을 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입하고, 숙주 세포 내로 도입하여 유전자 서열의 많은 카피를 생성할 수 있다. 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 박테리오파지, 예컨대, 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대, pBR322, pUC 플라스미드 유도체, 블루스크립트(Bluescript) 벡터 (스트라테이진(Stratagene)) 또는 pET 시리즈 벡터 (노바겐(Novagen))와 같은, 당업계에 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. DNA 서열 중 개별 뉴클레오티드를 변형시키는 데, 발현된 펩티드 서열에서 아미노산 치환(들)을 만들기 위한 목적으로, 또는 추가 조작을 촉진시키기 위하여 제한 부위를 생성/결실시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 돌연변이유발 기술이 사용될 수 있다.
HSP 또는 펩티드 결합 단편은 그의 발현이 이루어지는 세포로부터의 회수 및 정제를 촉진시키기 위해 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, HSP 또는 단편은 배양 배지 내로 분비될 수 있도록 소포체 막을 통과하는 그의 전위를 유도하는 신호 서열 리더 펩티드를 함유할 수 있다. 추가로, HSP 또는 단편은 항원성 펩티드 결합에 관여하지 않는 HSP 또는 단편의 임의의 일부분, 예컨대, 예를 들어, 카르복실 말단에 융합된 친화성 표지를 함유할 수 있다. 친화성 표지는 친화성 파트너 분자에의 결합에 의해 단백질의 정제를 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 각종의 친화성 표지, 예컨대, 면역글로불린 불변 영역, 폴리히스티딘 서열 (문헌 [Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST; 문헌 [Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), E. 콜라이 말토스 결합 단백질 (문헌 [Guan et al., 1987, Gene 67:21-30] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 및 각종의 셀룰로스 결합 도메인 (미국 특허 번호 5,496,934; 5,202,247; 5,137,819; 문헌 [Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)) 등이 사용될 수 있다.
상기 재조합 HSP 또는 단편은 면역 반응을 유도할 수 있는 그의 능력에 관하여 항원성 펩티드 결합 활성에 대하여 검정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klappa et al., 1998, EMBO J., 17:927-935] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 숙주 세포 또는 라이브러리 세포에서 제조된 재조합 HSP는 면역원성 조성물의 의도된 수혜자와 동일한 종의 것인 것이 바람직하다. 재조합 인간 HSP가 가장 바람직하다.
한 실시양태에서, 조직으로부터 단리된 HSP는 상이한 HSP, 예를 들어, hsp70 및 hsc70의 혼합물이다. 제약 조성물은 예를 들어, 문헌 [Dworniczak and Mirault, Nucleic Acids Res. 15:5181-5197 (1987)] 및 진뱅크 수탁 번호 P11142 및/또는 Y00371 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이 인간 hsc70 서열을 사용하여 재조합 DNA 방법에 의해 제조된 정제된 인간 hsc70을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, Hsp70 서열은 문헌 [Hunt and Morimoto Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (19), 6455-6459 (1985)] 및 진뱅크 수탁 번호 P0DMV8 및/또는 M11717 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같다.
다른 실시양태에서, 스트레스 단백질은 표적 항원성 펩티드에 대한 친화도가 천연 스트레스 단백질보다 큰, 돌연변이화된 스트레스 단백질이다. 상기 돌연변이화된 스트레스 단백질은 항원성 펩티드가 인산화된 경우, 포스포펩티드 모방체 (예컨대, 비가수분해성 유사체)인 경우, 또는 일부 다른 번역 후 변형을 가지는 경우에 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, 더욱더 바람직하게, 인간 hsc70이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsp70이고, 더욱더 바람직하게, 인간 hsp70이다. 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 또는 공유적으로 결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 결합된다. 한 바람직한 실시양태에서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양은 10 ㎍ 내지 600 ㎍, 예컨대, 25 ㎍이다.
3.2. 열 충격 단백질-펩티드 복합체의 제조
본원에 기술된 본 발명의 조성물 제조를 위해 시험관내에서 HSP과 항원성 펩티드의 집단의 복합체를 형성하는 예시적인 방법을 기술한다. 복합체 형성 반응을 통해 HSP와 펩티드 사이의 공유 결합이 형성될 수 있다. 복합체 형성 반응을 통해 HSP와 펩티드 사이의 비공유적인 회합이 형성될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 시험관내에서 형성된 복합체는 임의적으로 정제된다. 열 충격 단백질 및 항원성 펩티드의 정제된 복합체에는 세포 중, 또는 세포 추출물 중에서 상기 복합체와 회합되어 있는 물질이 실질적으로 없다. 정제된 열 충격 단백질 및 정제된 항원성 펩티드이 시험관내 복합체 형성 반응에 사용되는 경우, 열 충격 단백질 및 항원성 펩티드의 "정제된" 복합체라는 용어가 상기 복합체 형태가 아닌 유리 HSP 및 펩티드 또한 포함하는 조성물을 배제시키는 것은 아니다. 본 발명의 조성물의 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsc70, 더욱더 바람직하게, 인간 hsc70이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 hsp70이고, 더욱더 바람직하게, 인간 hsp70이다. 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 또는 공유적으로 결합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스트레스 단백질은 항원성 펩티드에 비공유적으로 결합된다. 한 바람직한 실시양태에서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양은 10 ㎍ 내지 600 ㎍, 예컨대, 25 ㎍이다.
복합체 형성 이전에, HSP를 ATP로 전처리하거나, 또는 산성 조건에 노출시켜 관심 HSP와 비공유적으로 결합될 수 있는 임의이 펩티드를 제거할 수 있다. 산성 조건은 pH 1-pH 2, pH 2-pH 3, pH 3-pH 4, pH 4-pH 5, pH 5-pH 6, 및 pH 6-pH 6.9 범위를 비롯한, pH 1 내지 pH 6.9 범위의 임의의 pH 수준이다. ATP 방법이 사용되는 경우, 문헌 [by Levy, et al., 1991, Cell 67:265-274] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이 아피라제를 첨가하여 과량의 ATP를 제거한다. 산성 조건이 사용되는 경우, pH 변형 시약을 첨가함으로써 완충제를 중성 pH로 재조정한다. 전체 항원성 펩티드, 또는 어느 한 펩티드 대 HSP의 몰비는 제한하는 것은 아니지만, 0.01:1, 0.02:1, 0.05:1. 0.1:1. 0.2:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 49:1, 최대 100:1까지를 비롯한, 0.01:1 내지 100:1인 임의의 비일 수 있다. 본 발명의 조성물의 한 실시양태에서, 각 복합체 중의 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 1:0.01 내지 1:100 범위일 수 있다. 본 발명의 조성물의 특정 실시양태에서, 각 복합체 중의 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 적어도 1:1 (예컨대, 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 49:1, 최대 100:1까지)이다. 본 발명의 조성물의 특정 실시양태에서, 각 복합체 중의 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비는 1:1 이하 (예컨대, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:50, 최소 1:100 이하까지). 시험관내에서의 펩티드 집단과 HSP의 비공유적인 복합체 형성에 관한 바람직한 예시적인 프로토콜은 하기에서 논의된다.
항원성 펩티드의 집단은 본 발명의 상이한 항원성 펩티드 종의 혼합물을 포함할 수 있다. 이어서, 혼합물을 적합한 결합 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4), 또는 20 mM 인산나트륨 (pH 7.2), 350 mM NaCl, 3 mM MgCl2 및 1 mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하는 완충제 중에서 4℃ 내지 50℃에서 15분 내지 3시간 동안 전처리된 HSP와 함께 인큐베이션시킨다. HSP와 화합성인 임의의 완충제가 사용될 수 있다. 이어서, 제제를 센트리콘 10(Centricon 10) 어셈블리 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌레리카))를 통해 원심분리하여 임의적으로 정제함으로써 임의의 비결합 펩티드를 제거한다. HSP와의 단백질/펩티드의 비공유적 회합은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 질량 분석법 (MS)에 의해 검정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 종양 특이 항원성 펩티드의 길이는 27개의 아미노산 길이이며 ("27mer"), 평균 분자량은 ~3,000 달톤이다. HSP70의 분자량이 70,000 달톤이라고 가정할 때, 암 환자를 치료하는 데 충분한 양으로 종양 특이 항원성 펩티드 및 HPS70의 복합체를 생성하기 위해서는 하기 물질이 요구될 것이다. 한 실시양태에서, 환자에게 240 ㎍ 용량의 HSP70을 12회에 걸쳐 투여하는 것이 의도된다고 가정할 때, 대략 3 mg HSP70이 요구된다. 한 실시양태에서, 10개의 27mer 펩티드가 HSP70와 복합체를 형성한다면, 전체 펩티드:단백질의 몰비가 1:1이라고 가정할 때, 복합체 형성 반응을 위해 요구되는 펩티드의 총량은 124 ㎍ (각 펩티드 12.4 ㎍씩)이다. 전체 펩티드:단백질의 몰비가 4:1인 것이 바람직하다면, 이때는 494 ㎍의 전체 펩티드가 요구된다. 특정 실시양태에서, HSP70 종은 재조합 인간 Hsc70 (rhHsc70)이다. 특정 실시양태에서, HSP70 종은 재조합 인간 Hsp70 (rhHsp70)이다. 특정 실시양태에서, rhHsc70을 2.7 mM 이염기성 인산나트륨, 1.5 mM 일염기성 인산칼륨, 150 mM NaCl (pH 7.2)을 포함하는 결합 완충제 중에서 37℃에서 60분 동안 항원성 펩티드의 혼합물과 함께 인큐베이션시킨다. 예시적인 대안적 결합 완충제는 인산칼륨 완충제, 또는 20 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5) 중 9% 수크로스, 또는 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2 및 1 mM ADP를 포함한다. 필요할 경우, HSP70-펩티드 결합 인큐베이션 혼합물을 임의적으로 센트리콘 10 어셈블리 (밀리포어)를 통해 1회 이상 원심분리하여 임의의 비결합 펩티드를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 총 300 ㎍의 HSP70을 필요로 하는 환자에게 25 ㎍ 용량의 HSP70을 12회에 걸쳐 투여한다. 한 실시양태에서, 10개의 27mer 펩티드가 HSP70와 복합체를 형성한다면, 전체 펩티드:단백질의 몰비가 1:1이라고 가정할 때, 복합체 형성 반응을 위해 요구되는 펩티드의 총량은 12.9 ㎍ (각 펩티드 1.29 ㎍씩)이다. 전체 펩티드:단백질의 몰비가 4:1인 것이 바람직하다면, 이때는 51.6 ㎍의 전체 펩티드가 요구된다.
HSP70 및 펩티드의 상기 기술된 양은 환자에게로의 백신 투여를 위해 필요한 예시된 최소량이며, 품질 관리 검사 및 특정의 규제 요건을 충족시키기 위한 목적으로 추가 물질이 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
특정 실시양태에서, HSP70-펩티드 복합체를 병상에서 환자에게 투여하기 직전에 QS-21 애주번트와 함께 혼합한다. 특정 실시양태에서, QS-21의 용량은 50 ㎍이다.
10개 미만 또는 10개 초과의 펩티드가 HSP70과 복합체를 형성하는 경우, 펩티드의 양은 상기 경우에 따라서 1:1, 4:1 또는 10:1인 바람직한 전체 펩티드:단백질 몰비를 유지시키기 위해 이에 따라 규모가 조정된다. 유사하게, HSP70과의 복합체 형성을 위해 길이가 27개의 아미노산 길이보다 더 짧거나, 또는 더 긴 펩티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다면, 각 펩티드의 분자량은 산출될 것이며, 각 펩티드의 양은 1:1, 4:1 또는 10:1인 바람직한 전체 펩티드:단백질 몰비를 유지시키기 위해 이에 따라 규모가 조정될 것이다.
대안적으로, 펩티드와의 gp96 또는 hsp90의 비공유적인 복합체 제조를 위해, 각 단백질의 분자량을 산출하고, 주어진 환자를 위한 전체 예상 투약 요건을 결정한다. 한 예에서, 12회분 용량의 gp96-펩티드 복합체 환자에게 투여하고자 하고, gp96의 용량은 25 ㎍이라고 가정할 때, 이때는 300 ㎍의 전체 단백질이 요구된다. 한 실시양태에서, 10개의 27mer 펩티드가 gp96과 복합체를 형성한다면, 전체 펩티드:단백질 (이 경우, gp96)의 몰비가 1:1이라고 가정할 때, 복합체 형성 반응을 위해 요구되는 펩티드의 총량은 9.4 ㎍ (각 펩티드 0.94 ㎍씩)이다. 전체 펩티드:단백질의 몰비가 4:1인 것이 바람직하다면, 이때는 37.5 ㎍의 전체 펩티드가 요구된다. 결합 완충제는 HSP70-펩티드 결합 반응에 대하여 기술된 것과 유사할 수 있다.
펩티드와의 복합체 형성 후, 면역원성 HSP 복합체를 예를 들어, 하기 기술되는 혼합형 림프구 표적 세포 검정법 (MLTC) 을 사용하여 임의적으로 검정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 복합체를 효소 결합 면역스폿 (ELISPOT) 검정법에 의해 측정한다 (문헌 [Taguchi T, et al., J Immunol Methods 1990; 128: 65-73] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 일단 HSP-펩티드 복합체를 단리시키고, 희석시키고 나면, 하기 논의되는 투여 프로토콜 및 부형제를 이용하여 동물 모델에서 임의적으로 상기 HSP-펩티드 복합체의 특징을 규명할 수 있다.
HSP 및 펩티드의 비공유적인 복합체 제조에 관한 대안으로서, 항원성 펩티드를 HSP에 공유적으로 부착시킬 수 있다.
HSP를 화학적 가교결합에 의해 펩티드에 공유적으로 커플링시킬 수 있다. 화학적 가교결합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 글루타르알데히드 가교결합이 사용될 수 있다. 글루타르알데히드 가교결합은 펩티드와 HSP의 공유적 복합체 형성을 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Barrios et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 1-2 mg의 HSP-펩티드 복합체를 2시간 동안 0.002% 글루타르알데히드 존재하에서 가교결합시킨다. 밤새도록 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)에 대해 투석하여 글루타르알데히드를 제거한다 (Lussow et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 대안적으로, 당업계에 공지된 조건하에서 자외선 (UV) 가교결합에 의해 HSP 및 펩티드를 가교결합시킬 수 있다.
대상체에게 투여하기 이전에 별개의 공유적 및/또는 비공유적 복합체 형성 반응으로부터의 HSP 및 항원성 펩티드의 복합체를 임의적으로 조합하여 조성물을 형성할 수 있다.
본원에 개시되는 바와 같이, 항원성 펩티드에 결합한 스트레스 단백질로 이루어진 임의 개수의 상이한 복합체가 단일 조성물에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드, (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 또는 20개의 항원성 펩티드; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 항원성 펩티드)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 20개 이하의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는다.
4. 제약 조성물
본 개시내용의 조성물은 암, 예컨대, 다발성 골수종 (MM) 예방 및 치료용의, 활성 성분으로서 상이한 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 단독으로 또는 하나 이상의 애주번트와 함께 조합하여 포함하는 본원에 기술된 본 발명의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 상기 제약 조성물은 백신 제제, 특히, 암 백신 제제로서 유용하다. 백신 제제는 안정적인 멸균성, 바람직하게는 주사가능한 제제를 생성하는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 스트레스 단백질/항원성 펩티드 복합체로 이루어진 복합체를 포함하는 조성물은 하나 이상의 애주번트와 함께 혼합된다. 다수의 상이한 애주번트가 본원에 개시된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 조성물(들) 및 애주번트(들)를 동일한 액량으로 함께 혼합할 수 있고, 조성물(들)은 하나 이상의 애주번트(들)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 전신용 애주번트 및 점막용 애주번트를 비롯한 각종의 애주번트가 사용될 수 있다. 전신용 애주번트는 비경구적으로 전달될 수 있는 애주번트이다. 전신용 애주번트는 데포 효과를 일으키는 애주번트, 면역계를 자극시키는 애주번트 및 상기 둘 모두를 수행하는 애주번트를 포함한다. 데포 효과를 일으키는 애주번트는 항원이 체내에서 천천히 방출되도록 함으로써 항원에의 면역 세포 노출을 연장시키는 애주번트이다. 이러한 부류의 애주번트로는 알룸 (예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄); 또는 광유, 비광유, 유중수 또는 유중수중유 에멀젼, 수중유 에멀젼, 예컨대, 셉픽 ISA(Seppic ISA) 시리즈의 몬타니드(Montanide) 애주번트 (예컨대, 몬타니드 ISA 720, 에어리퀴드(AirLiquide: 프랑스 파리)); MF-59 (스판 85(Span 85) 및 트윈 80으로 안정화된 수중 스쿠알렌 에멀젼; 케이론 코포레이션(Chiron Corporation: 미국 캘리포니아주 에머리빌)); 및 PROVAX (안정화 계면활성제 및 미셀 형성제를 함유하는 수중유 에멀젼; IDEC, 파마슈티칼즈 코포레이션(IDEC, Pharmaceuticals Corporation: 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 비롯한, 에멀젼 기반 제제를 포함한다.
다른 애주번트는 면역계를 자극시키고, 예를 들면, 면역 세포가 시토카인 또는 IgG를 생산하고 분비하게 한다. 이러한 부류의 애주번트로는 면역자극성 핵산, 예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드; Q. 사포나리아(Q. saponaria) 나무의 껍질로부터 정제된 사포닌, 예컨대, QS-21; 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠 (PCPP 중합체; 바이러스 리서치 인스티튜트(Virus Research Institute: 미국)); RNA 모방체 예컨대, 폴리이노신산:폴리시티딜산 (폴리 I:C) 또는 폴리-리신으로 안정화된 폴리 I:C (폴리-ICLC [힐토놀(Hiltonol)®; 온코비르, 인크.(Oncovir, Inc.)]; 지질다당류 (LPS)의 유도체, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A (MPL; 리비 이뮤노켐 리서치, 인크.(Ribi ImmunoChem Research, Inc.: 미국 몬태나주 해밀턴)), 무라밀 디펩티드 (MDP; 리비) 및 트레오닐-무라밀 디펩티드 (t-MDP; 리비); OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 이당류; OM 파마 SA(OM Pharma SA: 스위스 메이린)); 및 리슈마니아(Leishmania) 신장 인자 (정제된 리슈마니아 단백질; 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation: 미국 워싱턴주 시애틀))를 포함한다.
다른 전신용 애주번트는 데포 효과를 일으키고, 면역계를 자극시키는 애주번트이다. 이들 화합물은 전신용 애주번트의 상기 확인된 두 기능 모두를 가진다. 이러한 부류의 애주번트로는 ISCOM (혼합된 사포닌, 지질을 함유하고, 항원을 보유할 수 있는 공극이 있는 바이러스 크기의 입자를 형성하는 면역자극성 복합체; CSL: 호주 멜버른); MPL 및 QS-21을 함유하는 리포솜 기반 제제인 AS01 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline: 벨기에); AS02 (글락소스미스클라인, MPL 및 QS-21을 함유하는 수중유 에멀젼: 글락소스미스클라인 뤽상사르(GlaxoSmithKline Rixensart: 벨기에)); AS04 (글락소스미스클라인, 알룸 및 MPL 함유; GSK: 벨기에); CpG 올리고뉴클레오티드, MPL 및 QS-21을 함유하는 리포솜 기반 제제인 AS15 (글락소스미스클라인: 벨기에); 미셀을 형성하는 비이온성 블록 공중합체, 예컨대, CRL 1005 (폴리옥시에틸렌의 쇄 측면에 위치하는 소수성 폴리옥시프로필렌의 선형 쇄를 함유; 박스셀, 인크.(Vaxcel, Inc.: 미국 조지아주 노크로스)); 및 신텍스 애주번트 포뮬레이션(Syntex Adjuvant Formulation) (SAF, 트윈 80 및 비이온성 블록 공중합체를 함유하는 수중유 에멀젼; 신텍스 케미컬즈, 인크.(Syntex Chemicals, Inc.: 미국 콜로라도주 볼더))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 유용한 점막용 애주번트는 본 발명의 복합체와 함께 점막 표면에 투여되었을 때, 대상체에서 점막 면역 반응을 유도할 수 있는 애주번트이다. 점막용 애주번트로는 CpG 핵산 (예컨대, PCT 공개 특허 출원 WO 99/61056 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 박테리아 독소: 예컨대, 콜레라 독소 (CT), CT B 서브유니트 (CTB); CTD53 (Val → Asp); CTK97 (Val → Lys); CTK104 (Tyr → Lys); CTD53/K63 (Val → Asp, Ser → Lys); CTH54 (Arg → His); CTN107 (His → Asn); CTE114 (Ser → Glu); CTE112K (Glu → Lys); CTS61F (Ser → Phe); CTS 106 (Pro → Lys); 및 CTK63 (Ser → Lys)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 CT 유도체, 조눌라 오클루덴스(Zonula occludens) 독소 (zot), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 내독소, 불안정성 독소 (LT), LT B 서브유니트 (LTB); LT7K (Arg → Lys); LT61F (Ser → Phe); LT112K (Glu → Lys); LT118E (Gly → Glu); LT146E (Arg → Glu); LT192G (Arg → Gly); LTK63 (Ser → Lys); 및 LTR72 (Ala → Arg)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 LT 유도체, PT-9K/129G를 비롯한, 페르투시스(Pertussis) 독소, PT; 독소 유도체 (하기 참조); 지질 A 유도체 (예컨대, 모노포스포릴 지질 A, MPL); 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체; 박테리아 외부 막 단백질 (예컨대, 보렐리아 부그도페리(Borrelia burgdorferi)의 외부 표면 단백질 A (OspA) 지질단백질, 네이세리아 메닌기티디스( Neisseria meningitidis )의 외부 막 단백질); 수중유 에멀젼 (예컨대, MF59; 알루미늄 염 (문헌 [Isaka et al., 1998, 1999]); 및 사포닌 (예컨대, QS-21, 예컨대, QS-21 스티뮬론®, 안티제닉스 LLC(Antigenics LLC: 미국 매사추세츠주 렉싱턴)), ISCOM, MF-59 (스판 85 및 트윈 80으로 안정화된 수중 스쿠알렌 에멀젼; 케이론 코포레이션: 미국 캘리포니아주 에머리빌); 셉픽 ISA 시리즈의 몬타니드 애주번트 (예컨대, 몬타니드 ISA 720; 에어리퀴드: 프랑스 파리); PROVAX (안정화 계면활성제 및 미셀 형성제를 함유하는 수중유 에멀젼; IDEC 파마슈티칼즈 코포레이션: 미국 캘리포니아주 샌디에고); 신텍스 애주번트 포뮬레이션 (SAF; 신텍스 케미컬즈, 인크.: 미국 콜로라도주 볼더); 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠 (PCPP 중합체; 바이러스 리서치 인스티튜트: 미국) 및 리슈마니아 신장 인자 (코릭사 코포레이션: 미국 워싱턴주 시애틀)를 포함한다.
스트레스 단백질 및 항원성 펩티드의 복합체를 포함하는, 본원에 기술된 본 발명의 조성물은 여러 방식으로 애주번트와 함께 조합될 수 있다. 예를 들어, 상이한 펩티드를 먼저 함께 혼합하여 혼합물을 형성한 후, 스트레스 단백질 및/또는 애주번트 또는 애주번트들과 함께 복합체를 형성하여 조성물을 형성할 수 있다. 또 다른 예로서, 상이한 항원성 펩티드를 스트레스 단백질 및/또는 애주번트 또는 애주번트들과 함께 개별적으로 복합체를 형성한 후, 이어서, 생성된 스트레스 단백질/항원성 펩티드/애주번트 복합체 배치를 혼합하여 조성물을 형성할 수 있다. 애주번트는 스트레스 단백질 및 항원성 펩티드의 복합체를 포함하는 조성물 투여 이전에, 그 동안, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 애주번트, 및 스트레스 단백질 및 항원성 펩티드의 복합체를 포함하는 조성물의 투여는 동일한 또는 상이한 투여 부위에서 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항원성 펩티드는 열 충격 단백질과 복합체를 형성한다. 항원성 펩티드-HSP 복합체는 공유적 또는 비공유적인 것일 수 있다.
본원에 개시된 조성물에 첨가될 수 있는 애주번트(들)는 예를 들어, 사포닌및 면역자극성 핵산을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, HSP 및 항원성 펩티드를 포함하는 조성물에 첨가되는 제2 애주번트는 QS-21이다.
본 발명의 백신 제제의 효능이 최적화되는 펩티드의 농도는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있고, 예컨대, 대조군 제제, 예컨대, 펩티드 또는 스트레스 단백질만을 단독으로 하는 제제 대비의, 펩티드-스트레스 단백질 혼합물 또는 복합체에 대한 항체 또는 T 세포 반응에 의해 측정될 수 있다.
제약 조성물에서 사용되는 스트레스 단백질/항원성 펩티드 복합체 및 임의적으로 애주번트의 양은 항원성 펩티드, 스트레스 단백질, 및 애주번트의 화학적 성질 및 효능에 의존하여 달라질 수 있다. 전형적으로, 백신 제제 중의 항원성 펩티드, 스트레스 단백질, 및 애주번트의 출발 농도는 통상의 투여 경로, 예컨대, 근육내 주사를 사용하여 원하는 면역 반응을 일으키는 데 통상적으로 사용되는 양이다. 이어서, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 사정되는 바, 효과적인 보호 면역 반응이 달성될 수 있도록 본 발명의 제약 조성물 중에서 예컨대, 희석제를 사용하여 희석함으로써 항원성 펩티드, 스트레스 단백질, 및 애주번트의 농도를 조정한다.
제약 조성물은 임의적으로 동결건조된 제품으로서 제조될 수 있으며, 이어서, 상기 제품은 경구 투여용으로 제제화될 수 있거나, 또는 비경구적 투여를 위한 액체 형태로 재구성될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 벌크화제, 안정화제, 완충화제, 염화나트륨, 칼슘 염, 계면활성제, 항산화제, 킬레이트제, 다른 부형제, 및 그의 조합을 비롯한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 같은 다른 작용제를 함유하도록 추가로 제제화될 수 있다.
벌크화제는 백신 조성물의 동결건조된 제제의 제조에서 바람직하다. 상기 벌크화제는 동결건조된 제품의 결정질 부분을 형성하고, 이는 만닛톨, 글리신, 알라닌, 및 히드록시에틸 전분 (HES)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
안정화제는 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 작용제는 바람직하게는 1-4%인 양으로 존재한다. 염화나트륨은 본 제제 중에 바람직하게는 100-300 mM인 양으로 포함될 수 있거나, 또는 상기 언급된 벌크화제 없이 사용되는 경우에는 제제 중에 300-500 mM NaCl인 양으로 포함될 수 있다. 칼슘 염으로는 염화칼슘, 칼슘 글루코네이트, 칼슘 글루비오네이트, 또는 칼슘 글루셉테이트을 포함한다.
완충화제는 완충제로서 작용할 수 있는 능력이 있는, 임의의 생리학상 허용되는 화학적 엔티티 또는 화학적 엔티티들의 조합일 수 있으며, 이는 히스티딘, 인산칼륨, TRIS [트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄], 비스-트리스 프로판 (1,3-비스-[트리스-(히드록시메틸)메틸아미노]-프로판), PIPES [피페라진-N,N'-비스-(2-에탄술폰산)], MOPS [3-(N-모르폴리노)에탄술폰산], HEPES (N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄술폰산), MES [2-(N-모르폴리노)에탄술폰산], 및 ACES (N-2-아세트아미도-2-아미노에탄술폰산)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 완충화제는 10-50 mM의 농도로 포함된다. 염기 완충제의 구체적인 예로는 (i) PBS; (ii) 10 mM KPO4, 150 mM NaCl; (iii) 10 mM HEPES, 150 mM NaCl; (iv) 10 mM 이미다졸, 150 mM NaCl; 및 (v) 20 mM 시트르산나트륨을 포함한다. 사용될 수 있는 부형제로는 (i) 글리세롤 (10%, 20%); (ii) 트윈 50 (0.05%, 0.005%); (iii) 9% 수크로스; (iv) 20% 소르비톨; (v) 10 mM 리신; 또는 (vi) 0.01 mM 덱스트란 술페이트를 포함한다
존재할 경우, 계면활성제는 바람직하게는 0.1% 이하인 농도로 존재할 수 있고, 이는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 플루로닉 폴리올, 및 BRIJ 35 (폴리옥시에틸렌 23 라우렐 에테르)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 사용될 경우 항산화제는 제약 제제와의 사용을 위해 화합성이어야 하고, 바람직하게는 수용성이다. 적합한 항산화제로는 호모시스테인, 글루타티온, 리포산, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산 (트롤록스(Trolox)), 메티오닌, 소듐 티오술페이트, 플래티넘, 글리신-글리신-히스티딘 (트리펩티드), 및 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT)을 포함한다. 칼슘 염이 조성물에서 사용될 경우, 킬레이트제는 바람직하게는 칼슘보다 더 큰 친화도로 금속, 예컨대, 구리 및 철과 결합하여야 한다. 바람직한 킬레이터는 데페록사민이다.
당업계에 공지된 다수의 제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,763,401에는 15-60 mM 수크로스, 최대 50 mM NaCl, 최대 5 mM 염화칼슘, 65-400 mM 글리신, 및 최대 50 mM 히스티딘을 포함하는 치료학적 제제가 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료학적 제제는 인산칼륨 완충제 중의 9% 수크로스의 용액이다.
미국 특허 번호 5,733,873 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에는 0.01-1 mg/ml의 계면활성제를 포함하는 제제가 개시되어 있다. 상기 특허에는 하기 범위의 부형제를 가지는 제제가 개시되어 있다: 적어도 0.01 mg/ml, 바람직하게 0.02-1.0 mg/ml 양의 폴리소르베이트 20 또는 80; 적어도 0.1 M NaCl; 적어도 0.5 mM 칼슘 염; 및 적어도 1 mM 히스티딘. 더욱 바람직하게, 하기의 구체적인 제제 또한 개시되어 있다: (1) 0.1% PEG 4000 또는 19.9 mM 수크로스를 포함하거나, 또는 그의 부재하의 14.7-50-65 mM 히스티딘, 0.31-0.6 M NaCl, 4 mM 염화칼슘, 0.001-0.02-0.025% 폴리소르베이트 80; 및 (2) 20 mg/ml 만닛톨, 2.67 mg/ml 히스티딘, 18 mg/ml NaCl, 3.7 mM 염화칼슘, 및 0.23 mg/ml 폴리소르베이트 80.
저농도 또는 고농도의 염화나트륨 사용에 관하여 기술되었으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,877,608 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에는 상대적으로 저농도의 염화나트륨을 포함하는 제제, 예컨대, 0.5 mM-15 mM NaCl, 5 mM 염화칼슘, 0.2 mM-5 mM 히스티딘, 0.01-10 mM 리신 히드로클로라이드, 및 최대 10% 말토스, 10% 수크로스, 또는 5% 만닛톨을 포함하는 제제가 교시되어 있다.
미국 특허 번호 5,605,884 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에는 상대적으로 고농도의 염화나트륨을 포함하는 제제의 용도가 개시되어 있다. 상기 제제는 0.35 M-1.2 M NaCl, 1.5-40 mM 염화칼슘, 1 mM-50 mM 히스티딘, 및 최대 10% 당, 예컨대, 만닛톨, 수크로스, 또는 말토스를 포함한다. 0.45 M NaCl, 2.3 mM 염화칼슘, 및 1.4 mM 히스티딘을 포함하는 제제가 예시된다.
국제 특허 출원 WO 96/22107 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에는 당 트레할로스를 포함하는 제제, 예를 들어, (1) 0.1 M NaCl, 15 mM 염화칼슘, 15 mM 히스티딘, 및 1.27 M (48%) 트레할로스; 또는 (2) 0.011% 염화칼슘, 0.12% 히스티딘, 0.002% TRIS, 0.002% 트윈 80, 0.004% PEG 3350, 7.5% 트레할로스; 및 0.13% 또는 1.03% NaCl을 포함하는 제제가 기술되어 있다.
미국 특허 번호 5,328,694 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)는 100-650 mM 이당류 및 100 mM-1.0 M 아미노산, 예를 들어 (1) 0.9 M 수크로스, 0.25 M 글리신, 0.25 M 리신, 및 3 mM 염화칼슘; 및 (2) 0.7 M 수크로스, 0.5 M 글리신, 및 5 mM 염화칼슘을 포함하는 제제가 기술되어 있다.
5. 사용 방법
본원에 개시된 조성물은 암, 예를 들어, 다발성 골수종 치료 및/또는 예방을 위한, 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 포함한다. 조성물은 암 치료 또는 예방이 요구되는 개체 또는 대상체에 의한 사용을 위한 용도의 의약 및 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 상기 개체 또는 대상체는 동물, 바람직하게, 포유동물, 비인간 영장류, 및 가장 바람직하게, 인간이다. "동물"이라는 용어는 반려 동물, 예컨대, 고양이 및 개; 동물원 동물; 사슴, 여우 및 라쿤을 비롯한, 야생 동물; 말, 소, 양, 돼지, 칠면조, 오리 및 닭을 비롯한, 농장 동물, 가축 및 가금류, 및 실험실용 동물, 예컨대, 설치료, 토끼, 및 기니아 피그를 포함한다.
5.1. 암 치료
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 암 치료를 위한 다른 요법과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 암으로는 제한 없이, B 세포 림프종 (예컨대, B 세포 만성 림프구 백혈병, B 세포 비호지킨 림프종, 피부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종), 기저 세포 암종, 방광암, 아세포종, 뇌 전이, 유방암, 버킷 림프종, 암종 (예컨대, 선암종 (예컨대, 위식도 접합부의 선암종)), 자궁경부암, 결장암, 결장직장암 (결장암 및 직장암), 자궁내막 암종, 식도암, 유잉 육종, 소포성 림프종, 위암, 위식도 접합부 암종, 위장암, 아교모세포종 (예컨대, 다형성 아교모세포종, 예컨대, 새로 진단받았거나, 또는 재발성인 것), 신경교종, 두부경부암 (예컨대, 두부경부 편평 세포 암종), 간 전이, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 신장암 (예컨대, 신장 세포 암종 및 빌름스 종양), 후두암, 백혈병 (예컨대, 만성 골수구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병), 간암 (예컨대, 간 암종 및 간암종), 폐암 (예컨대, 비소세포 폐암 및 소세포 폐암), 림프아구성 림프종, 림프종, 외투 세포 림프종, 전이성 뇌 종양, 전이성 암, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 신경아세포종, 안구 흑색종, 구강인두 암, 골육종, 난소암, 췌장암 (예컨대, 췌관 선암종), 전립선암 (예컨대, 호르몬 불응성 (예컨대, 거세 저항성), 전이성, 전이성 호르몬 불응성 (예컨대, 거세 저항성, 안드로겐 비의존성)), 신장 세포 암종 (예컨대, 전이성), 타액선 암종, 육종 (예컨대, 횡문근육종), 피부암 (예컨대, 흑색종 (예컨대, 전이성 흑색종)), 연조직 육종, 고형 종양, 편평 세포 암종, 윤활막 육종, 고환암, 갑상선암, 이행 세포암 (요로 상피 세포암), 포도막 흑색종 (예컨대, 전이성), 사마귀모양 암종, 외음부암, 및 발텐스트롬 마크로글로불린혈증을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 암종 (예컨대, 선암종), 림프종, 아세포종, 흑색종, 육종, 또는 백혈병이다.
특정 실시양태에서, 암은 인간 육종 또는 암종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종 (예컨대, 전이성), 간암종, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 다형성 아교모세포종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 또는 망막아세포종이다.
특정 실시양태에서, 암은 급성 림프구 백혈병 또는 급성 골수구성 백혈병 (예컨대, 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병 (만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 또는 만성 림프구 백혈병); 호지킨 질환; 비호지킨 질환; 급성 골수양 백혈병; B 세포 림프종; T 세포 림프종; 역형성 대세포 림프종; 안구내 림프종; 소포성 림프종; 소장 림프종; 또는 비장 변연부 림프종이다.
특정 실시양태에서, 암은 다발성 골수종, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 위장 간질 종양, 두부 및/또는 경부암 (예컨대, 인두의 편평 세포 암종, 후두의 편평 세포 암종, 구강인두의 세포 암종, 또는 후두의 사마귀모양 암종), 자궁내막 간질 육종, 비만 세포 육종, 성인 연조직 육종, 자궁 육종, 메르켈 세포 암종, 요로 상피 세포 암종, 뇌 전이를 동반한 흑색종, 포도막 흑색종, 간 전이를 동반한 포도막 흑색종, 비소세포 폐암, 직장암, 또는 골수형성이상 증후군이다.
특정 실시양태에서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 흑색종, 기관지암, 방광암, 뇌암 또는 중추 신경계 암, 말초 신경계 암, 자궁암 또는 자궁내막암, 구강암 또는 인두암, 비호지킨 림프종, 갑상선암, 신장암, 담도암, 소장암 또는 맹장암, 타액선암, 갑상선암, 부신암, 편평 세포암, 중피종, 골암종, 흉선종/흉선 암종, 아교모세포종, 골수형성이상 증후군, 연조직 육종, DIPG, 선암종, 골육종, 연골육종, 백혈병, 또는 췌장암이다.
특정 실시양태에서, 암은 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 췌장암, 아교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암 (예컨대, 간 암종 및 간암종), 방광암, 유방암, 염증성 유방암, 메르켈 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 위암, 방광암, 자궁내막 암종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 타액선, 암종, 신장암 (예컨대, 신장 세포 암종 및 빌름스 종양), 기저 세포 암종, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 장액성 선암종 또는 각종 유형의 두부경부암이다. 특정 실시양태에서, 암은 섬유조직형성 흑색종, 염증성 유방암, 흉선종, 직장암, 항문암, 또는 수술에 의해 치료가능한 또는 비수술적 방식에 의해 치료가능한 뇌간 신경교종이다. 한 구체적인 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 암은 다형성 아교모세포종이다. 일부 실시양태에서, 다형성 아교모세포종은 재발성이다. 일부 실시양태에서, 다형성 아교모세포종은 새로 진단받은 것이다. 일부 실시양태에서, 다형성 아교모세포종은 비메틸화된 MGMT 프로모터를 가지는 대상체에 존재하는 것이다. 일부 실시양태에서, 다형성 아교모세포종은 베바시주맙 요법에 대하여 불응성인 것이다. 일부 실시양태에서, 다형성 아교모세포종은 베바시주맙 요법을 받지 않은 대상체에 존재하는 것이다.
특정 실시양태에서, 암은 다발성 골수종, 아교모세포종, 결장직장암, 간세포 암종, 육종, 두부경부암 (예컨대, 두부경부 편평 세포 암종), 유방암, 폐암, 및 흑색종이다.　
특정 실시양태에서, 암은 전이성이다.
본 발명의 조성물은 암이 검출되었을 때, 또는 재발 에피소드 이전 또는 그 동안에 투여될 수 있다.
투여는 암 또는 재발의 1차 징후 시점에 시작된 후, 적어도 증상이 실질적으로 약화될 때까지 및 그 이후의 기간 동안 부스팅 투약될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 치료학상 유효량의, 절제된 종양 조직으로부터 수집된 대표적인 항원 세트를 포함하는 자가 암 백신을 제조하기 위해, 종양 절제 수술을 받았고, 이로써, 불충분한 양의 절제된 종양 조직 (예컨대, 7 g 미만, 6 g 미만, 5 g 미만, 4 g 미만, 3 g 미만, 2 g 미만, 또는 1 g 미만의 절제된 종양 조직)을 가지고 있는 암을 앓는 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Expert Opin. Biol. Ther. 2009 Feb;9(2):179-86] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 암 백신 참조).
본 발명의 조성물은 또한 암 재발을 막기 위한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 조성물의 개체에게로의 예방적 투여가 추후의 암 재발을 막는 보호를 부여할 수 있다.
5.2. 조합 요법
조합 요법이란 본 발명의 조성물을 암을 예방 또는 치료하는 또 다른 방식과 함께 사용하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 추가 형태의 방식은 비HSP 방식, 예컨대, 성분으로서 HSP를 포함하지 않는 방식이다. 이러한 접근법은 보편적으로는 조합 요법, 보조 요법 또는 결합 요법 (상기 용어들은 상호교환적으로 사용된다)으로 명명된다. 조합 요법의 경우, 상가 효능 또는 상가 치료학적 효과가 관찰될 수 있다. 치료학적 효능이 상가 효능보다 더 큰 시너지 결과가 추구된다. 조합 요법 사용은 또한 단독으로 치료 방식을 투여하거나, 또는 본 발명의 조성물을 투여하는 것보다 더욱 우수한 치료학적 프로파일을 제공할 수 있다. 상가 효과 또는 시너지 효과를 통해서 어느 한 방식 또는 두 방식 모두의 투여량 또는 투약 빈도를 감소시킬 수 있고, 이로써, 유해 효과를 완화시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체는, 항원성 펩티드 (예컨대, 화학적으로 합성된 항원성 펩티드)에 결합된 정제된 스트레스 단백질 (예컨대, 재조합 스트레스 단백질)의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1의 환자 특이적 조성물로서, 여기서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 대상체의 암 세포에 존재하는 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 제1의 환자 특이적 조성물; 및 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제2 암 유형 특이적 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 대상체의 암과 동일한 유형의 암에서 빈번하게 발견되는 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 제2 암 유형 특이적 조성물로 이루어진 조합을 투여받는다. 제1 및 제2 조성물은 본원에 기술된 스트레스 단백질/항원성 펩티드 조성물의 특징들 중 임의의 하나 이상의 것을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "암에서 빈번하게 발견된다"라는 용어는 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프가 5% 초과의 암에서 관찰된다는 것을 지칭한다.
항원성 펩티드에 결합한 스트레스 단백질의 임의 개수의 상이한 복합체가 제2 조성물에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 항원성 펩티드; 예컨대, 약 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 항원성 펩티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물은 암에서 발견되는 myc, k-ras, n-ras, tp53, 또는 kdm6A의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 항원성 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는, 20개 이하의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 상이한 항원성 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는다.
제1 및 제2 스트레스 단백질/항원성 펩티드 조성물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 투여 이전에 투여된다.
다른 실시양태에서, 조합 요법은, 단독으로 투여된 치료 방식이 대상체를 치료하는 데에는 임상적으로 적절하지 않은 바, 이로써, 대상체는 추가의 효과적인 요법을 필요로 하고, 예컨대, 대상체는 조성물 투여 없이는 치료 방식에 무반응인, 치료 방식으로 치료를 받은 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료 방식을 받은 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 대상체는 요법에 대하여 반응은 하였지만, 부작용, 재발로 고생하거나, 내성이 발생한 것인 방법이 본 실시양태에 포함된다. 상기 대상체는 치료 방식을 단독으로 사용하는 치료에 대해서는 비반응성이거나, 불응성일 수 있다. 단독의 치료 방식에 대해서는 불응성인 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 본 발명의 방법에 의해 고려되는 바와 같이, 투여되었을 때, 치료 방식의 치료학적 효과를 개선시킬 수 있다. 치료 방식의 효과 측정은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생체내에서 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 상이한 암 백신을 포함하는 제2 치료 방식과 함께 조합하여 투여된다.
한 실시양태에서, 대상체에서 치료학적 이점을 일으키는 데에는 더욱 소량의 제2 치료 방식이 요구된다. 구체적인 실시양태에서, 제2 치료 방식의 양은 약 10%, 20%, 30%, 40% 및 50% 감소될 수 있다. 임의의 관찰가능한 치료학적 이점을 일으키지 못하는 범위의 양을 비롯한, 제2 치료 방식의 양은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동물 모델에서 수행되는 용량-반응 실험에 의해서 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 제2 치료 방식, 예컨대, 화학요법제와 함께 조합하여 투여된다. 예로는 항신생물제, 예컨대: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 히드클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 아드리아마이신; 알데스루킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비스안트렌 히드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나르 소듐; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 캄프토테신; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 히드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 콤브레타스타틴 a-4; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 다카 (n-[2-(디메틸-아미노)에틸]아크리딘-4-카르복스아미드); 닥티노마이신; 다우노루비신 히드클로라이드; 다우노마이신; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 돌라스타틴; 독소루비신; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 히드로클로라이드; 엘립티신; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 히드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 히드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에틸요오드유 i 131; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 히드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 5-fdump; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 겜시타빈; 겜시타빈 히드로클로라이드; 금 au 198; 호모캄프토테신; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-i a; 인터페론 감마-i b; 이프로플라틴; 이리노테칸 히드로클로랄이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 루프롤라이드 아세테이트; 리아로졸 히드로클로라이드; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 히드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메클로레타민 히드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 히드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜트라무스틴; 페플로이신술페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 히드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 히드로클로라이드; 피라조푸린; 리족신; 리족신 d; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 히드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 히드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 스트론튬 클로라이드 sr 89; 술로페누르; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티미탁; 티아조푸린; 티라파자민; 토무덱스; 탑53(top53); 토포테칸 히드로클로라이드; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 히드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈루로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 히드로클로라이드; 2-클로로데옥시아데노신; 2' 데옥시포르마이신; 9-아미노캄프토테신; 랄티트렉세드; N-프로파르길-5,8-디데아자폴산; 2클로로-2'-아라비노-플루오로-2'-데옥시아데노신; 2-클로로-2'-데옥시아데노신; 아니소마이신; 트리코스타틴 A; hPRL-G129R; CEP-751; 리노미드; 술푸르 머스타드; 질소 머스타드(메클로르 에타민); 시클로포스파미드; 멜팔란; 클로람부실; 이포스파미드; 부술판; N-메틸-N니트로소우레아 (MNU); N,N'-비스(2-클로로에틸)-N-니트로소우레아 (BCNU); N-(2-클로로에틸)-N'시클로헥실-N-니트로소우레아 (CCNU); N-(2-클로로에틸)-N'-(trans-4-메틸시클로헥실-N-니트로소우레아 (MeCCNU); N-(2-클로로에틸)-N-(디에틸)에틸포스포네이트-N-니트로소우레아 (포테무스틴); 스트렙토조토신; 디아카르바진 (DTIC); 미토졸로미드; 테모졸로미드; 티오테파; 미토마이신 C; AZQ; 아도젤레신; 시스플라틴; 카르보플라틴; 오르마플라틴; 옥살리플라틴; C1-973; DWA 2114R; JM216; JM335; 비스 (플래티넘); 토무덱스; 아자시티딘; 시타라빈; 젬시타빈; 6-메르캅토퓨린; 6-티오구아닌; 히포크산틴; 테니포시드 9-아미노 캄프토테신; 토포테칸; CPT-11; 독소루비신; 다우노마이신; 에피루비신; 다루비신; 미톡산트론; 로속산트론; 닥티노마이신 (악티노마이신 D); 암사크린; 피라졸로아크리딘; 올-트랜스 레티놀; 14-히드록시-레트로-레티놀; 올-트랜스 레티노산; N-(4-히드록시페닐) 레틴아미드; 13-시스 레티노산; 3-메틸 TTNEB; 9-시스 레티노산; 플루다라빈 (2-F-아라-AMP); 또는 2-클로로데옥시아데노신 (2-Cda)을 포함한다.
다른 치료학적 화합물로는 20-pi-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐부라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관신생 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-등방화 결정 형태 형성 단백질-1; 항안드로겐제, 전립선 암종; 항에스트로겐제; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절 인자; 아폽토시스 조절제; 애푸린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자독소; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 바라놀; 바티매스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비스아지리디닐스페르민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 블레오마이신 A2; 블레오마이신 B2; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 술폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체 (예컨대, 10-히드록시-캄프토테신); 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복스아미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나제 억제제 (ICOS); 카스타노스페르민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린; 클로로퀸옥살린 술폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나제닌; 크램베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜타안트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클리시맙; 데시타빈; 데히드로디뎀닌 B;2'데옥시코포르마이신 (DCF); 데스로렐린; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지퀴온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스페르민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 디스코데르몰리드; 도코사놀; 도라세트론; 독시플루리딘; 드로록시펜; 드로나비놀; 듀오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에포틸론 (A, R=H; B, R=Me); 에피틸론; 에프리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로젠 효능제; 에스트로젠 길항제; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 4'-포스페이트 (에토포스); 엑세메스탄; 패드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 히드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니레릭스; 겔라티나제 억제제; 젬시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 호모해링토닌 (HHT); 히퍼리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터루킨; 아이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이리노테칸; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키노라이드; 카할라리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 레티난 술페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린; 레바미졸; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당류 펩티드; 친유성 플라티늄 화합물; 리스소클린아미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩티드; 메이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 매트리리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 멜바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 이페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매칭된 이중 가닥 RNA; 미트라신; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 융모성 성선 자극호르몬; 모노포스포릴 지질 A+미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기반 요법; 머스타드 항암제; 마이카페록시드 B; 마이코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손 + 펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산, 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화질소 조절제; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; 06-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구용 시토카인 유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 팔미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리술페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스 파미드; 페릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 히드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라미노겐 활성인자 억제제; 플라티늄 착체; 플라티늄 화합물; 플라티늄-트리아민 착체; 포도필로톡신; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글라딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기반 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 미세조류; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 퍼퓨린; 피라졸로아크리딘; 피리독실레이트 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화된 레텔립틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B 1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 노화 유래 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 억제제; 신호 전달 조절제; 단일 쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분열 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술피노신; 초활성 혈관작용 장 펩티드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라아클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 탈리도미드; 티오코라린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오퍼퓨린; 티라파자민; 티타노센 디클로라이드; 토포테칸; 톱센틴; 토레미펜; 전분화능 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 유베니멕스; 비뇨생식동 유래 성장 억제 인자; 유로키나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제, 예컨대, 4-아미노-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미다미드 (WO2006122150)가 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 항체 단편, 단일 쇄 항체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 항체와 함께 조합하여 사용된다. 개시된 조성물과 함께 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 항체로는 제한 없이, 면역 체크포인트 억제제인 것, 예컨대, 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3을 포함한다. 다른 면역 체크포인트 억제제로는 파조파닙, 베바시주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙/MK-3475, 피딜리주맙, MEDI0680 (AMP-514), AMP-224; BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A, MSB0010718C, 이필리무맙 또는 트레멜리무맙을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 생물학적 반응 조절제, 예를 들어, 시토카인과 함께 조합하여 사용된다. 상기의 한 실시양태에서, 시토카인은 본 발명의 조성물을 받고 있는 대상체에게 투여된다. 상기의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 시토카인과 함께 조합하여 화학요법제, 예컨대, 항바이러스제, 애주번트, 또는 또 다른 생물학적 반응 조절제를 받고 있는 대상체에게 투여된다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 시토카인(들)이 사용될 수 있고, 이는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFβ, G-CSF, GM-CSF, TGF-β, IL-15, IL-18, GM-CSF, INF-γ, INF-α, SLC, 내피 단핵구 활성화 단백질-2 (EMAP2), MIP-3α, MIP-3β, 또는 MHC 유전자, 예컨대, HLA-B7으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가로, 다른 예시적인 시토카인으로는 TNF-α-관련 아폽토시스-유도성 리간드 (TRAIL), TNF-α-관련 활성화-유도성 시토카인 (TRANCE), TNF-α-관련 아폽토시스의 약한 유도제 (TWEAK), CD40 리간드 (CD40L), 림포톡신 알파 (LT-α), 림포톡신 베타 (LT-β), OX40 리간드 (OX40L), Fas 리간드 (FasL), CD27 리간드 (CD27L), CD30 리간드 (CD30L), 41BB 리간드 (41BBL), APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, 및 AITR-L, 또는 그의 작용부를 포함하나, 이에 제한되지 않는, TNF 패밀리의 다른 구성원을 포함한다. TNF 패밀리에 관한 일반적인 리뷰에 대해서는 예컨대, 문헌 [Kwon et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:340-345] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 면역계의 각종 리간드, 수용체 및 신호 전달 분자의 효능제 또는 길항제인 하나 이상의 생물학적 반응 조절제와 함께 조합하여 사용된다. 예를 들어, 생물학적 반응 조절제로는 톨-유사(Toll-like) 수용체 (TLR-2, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9)의 효능제; LPS; 41BB, OX40, ICOS, 및 CD40의 효능제; 및 Fas 리간드, PD1, 및 CTLA-4의 길항제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 효능제 및 길항제는 항체, 항체 단편, 펩티드, 펩티도미메틱 화합물, 다당류, 및 소분자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 추가의 애주번트, 예컨대, 사포닌 및 면역자극성 핵산과 함께 조합하여 사용될 수 있다.
퀼라야(Quillaja) 사포닌은 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 나무의 껍질로부터 추출된 트리테르펜 글리코시드의 혼합물이다. 이는 장기간 동안 백신 애주번트로서 사용될 수 있는 면역 자극인자로서 인지되어 왔고 (문헌 [Campbell, J. B., and Peerbaye, Y. A., Res. Immunol. 143(5):526-530 (1992)] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 다수의 상업적으로 이용가능한 복합 사포닌 추출물이 애주번트로서 사용되어 오고 있다. 그의 강력한 애주번트 활성 및 낮은 독성에 기인하여, 사포닌, QS-21 ("스티뮬론®" 애주번트로서 상업적으로 이용가능)이 유용한 면역학적 애주번트인 것으로 확인되었다 (문헌 [Kensil, C. R. et al., "Structural and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. and Newman, M. J. eds., Plenum Press, New York (1995)] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). QS-21은 퀼라산의 복합 트리테르펜 글리코시드이다. QS-21은 지방산 도메인의 제2 지방 아실 유니트의 트리테르펜 탄소 3, 트리테르펜 탄소 28, 및 탄소 5에서 글리코실화된 것이다.
특정 실시양태에서, 개시된 조성물은 사포닌과 함께 조합된 항원성 펩티드와의 스트레스 단백질의 복합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 사포닌으로는 예를 들어, QS-21 또는 관련된 화합물 (미국 특허 번호 5,057,540; 5,273,965; 5,443,829; 5,650,398; 및 6,524,584 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시)을 포함한다. QS-21은 친수성 상호작용 크로마토그래피 (HILIC)를 사용하여 추가로 정제되었고, 화학적으로 상이한 화합물인 것으로 밝혀진 2개 피크, QS-21-V1 및 QS-21-V2로 분해되었다. 오브알부민 및 QS-21, QS-1-V1, 또는 QS-21-V2로 이루어진 백신으로 면역화된 C57BL/6 마우스에서, 개별 성분 QS-21-V1 및 QS-21-V2, 둘 모두 애주번트 효과에 있어서 IgG 하위부류 IgG1, IgG2b, 및 IgG2 뿐만 아니라, 전체 IgG 역가를 부스팅시키는 데 (미국 특허 번호 6,231,859 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시) (3:2 QS-21-V1 및 QS-21-V2 혼합물을 함유하는) 원래의 QS-21 피크와 유사하다.
다수의 면역자극성 핵산은 비메틸화된 CpG 모니프를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 척추동물 림프구에 대하여 유사 분열 유발성을 띠며, 면역 반응을 증진시키는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Woolridge, et al., 1997, Blood 89:2994-2998] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 올리고뉴클레오티드는 국제 특허 공개 번호 WO 01/22972, WO 01/51083, WO 98/40100 및 WO 99/61056 뿐만 아니라, 미국 특허 번호 6,207,646, 6,194,388, 6,218,371, 6,239,116, 6,429,199, 및 6,406,705 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 다른 종류의 면역자극성 올리고뉴클레오티드, 예컨대, YpG- 및 CpR-모티프를 함유하는 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드는 문헌 [Kandimalla et al. in "Effect of Chemical Modifications of Cytosine and Guanine in a CpG-Motif of Oligonucleotides: Structure-Immunostimulatory Activity Relationships." Bioorganic & Medicinal Chemistry 9:807-813 (2001)] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 점막 경로에 의해 투여되었거나 (저용량 투여 포함), 또는 고용량으로 비경구적 경로를 통해 투여되었을 때, 대개는 CpG 핵산이 하는 것만큼 항체 반응을 증강시키지만, 반응은 Th2로 편향된 것인 (IgG1>>IgG2a), CpG 디뉴클레오티드를 포함하지 않는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또한 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2001/0044416 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 활성을 측정하는 방법은 상기 특허 및 공개 문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한, 활성을 조절하기 위해 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 골격, 당, 뉴클레오염기 및 뉴클레오티드간 연결부 내에서 변형될 수 있다. 상기 변형은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 생리학상 허용되는 담체 중 애주번트, 예컨대, 적어도 하나의 면역자극성 올리고뉴클레오티드 또는 사포닌 (예컨대, QS-21)과 조합된, 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 가지는 상이한 항원성 펩티드와 스트레스 단백질의 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 QS-21과 함께 조합된, 하나 이상의 항원성 펩티드와 함께 복합체를 형성한 hsp70을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 올리고뉴클레오티드와 조합된, 하나 이상의 항원성 펩티드와 함께 복합체를 형성한 hsp70 또는 hsc70을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 QS-21 및 적어도 하나의 면역자극성 올리고뉴클레오티드와 조합된, 하나 이상의 항원성 펩티드와 함께 복합체를 형성한 hsp70 또는 hsc70을 포함한다.
5.3. 투여량
본원에 개시된 조성물의 투여량, 및 조합 요법이 투여된다면, 임의의 추가의 치료 방식, 예컨대, 애주번트의 투여량은 치료받는 대상체의 중량 및 일반적인 건강 상태 뿐만 아니라, 투여되는 백신 조성물의 양, 치료 빈도 및 투여 경로에 상당한 정도로 의존한다. 상기 용도에 효과적인 양은 또한 질환의 병기 및 중증도 및 처방하는 의사의 판단에 의존할 수 있지만, 일반적으로는 그 범위는 초기 면역화를 위해서는 (즉, 치료학적 투여를 위해서는), 70 kg 환자인 경우, 약 1.0 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍ (1 mg) (예를 들어, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000 ㎍ 포함)의 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나이고, 이어서, 부스팅 투여량은 환자 혈액 중 특이적인 CTL 활성을 측정함으로써 환자의 반응 및 상태에 의존하여 수주 내지 수개월에 걸쳐 부스팅 요법에 따라 약 1.0 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍의 조성물 (예를 들어, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000 ㎍ 포함)이다. 부위, 용량 및 빈도를 비롯한, 치료 요법을 계속하기 위한 요법은 초기 반응 및 임상적 판단에 의해 가이드될 수 있다. 투여량 범위 및 애주번트에 대한 요법은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Vogel and Powell, 1995, A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients; M. F. Powell, M. J. Newman (eds.), Plenum Press, New York, pages 141-228]을 참조할 수 있다.
바람직한 애주번트로는 QS-21, 예컨대, QS-21 스티뮬론®, 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함한다. QS-21에 대한 예시적인 투여량 범위는 1회 투여당 1 ㎍ 내지 200 ㎍이다. 다른 실시양태에서, QS-21에 대한 투여량은 1회 투여당 10, 25, 및 50 ㎍일 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원성 펩티드와 복합체를 형성한 열 충격 단백질 (HSP)을 포함하는 조성물의 투여량은 투여 경로 및 조성물 중 HSP의 유형에 의존한다. 예를 들어, 조성물 중 HSP의 양의 범위는 예를 들어, 1회 투여당 5 내지 1,000 ㎍ (1 mg)일 수 있다.
특정 실시양태에서, hsc70-, hsp70- 및/또는 gp96-항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 예를 들어, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 또는 1,000 ㎍이다.
특정 실시양태에서, hsc70-, gp96- 또는 hsp70-항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 1회 투여당 약 10 내지 600 ㎍ 범위이고, 조성물이 진피내로 투여될 경우, 약 5 내지 100 ㎍이다.
또 다른 실시양태에서, hsc70-, hsp70- 및/또는 gp96-항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물은 약 5 ㎍ 내지 약 600 ㎍, 또는 인간 환자의 경우, 약 5 ㎍ 내지 약 60 ㎍ 범위의 양으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 조성물의 투여량은 100 ㎍ 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물의 투여량은 약 5 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍, 또는 240 ㎍이다. 바람직하게, 스트레스 단백질 및 항원성 펩티드의 복합체를 포함하는 조성물은 정제된 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 환자에서 hsp-90 항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 약 5 내지 1,000 ㎍ 범위이다. 특정 실시양태에서, 조성물의 투여량은 5, 10, 20, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 또는 1,000 ㎍이다. 다른 실시양태에서, 조성물의 투여량은 100 ㎍이다. 특정 실시양태에서, 진피내 투여인 경우, hsp 90 항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 1회 투여당 약 5 내지 50 ㎍ 범위이다.
치료학적 요법의 한 실시양태에서, 더 작은 비인간 동물 (예컨대, 마우스 또는 기니아 피그)에서 효과적인 것으로 나타난 것과 실질적으로 등가인 투여량은 임의적으로는 상기 포유동물에서 및 인간에서의 상대적인 림프절 크기에 기초하여 50배 증가를 초과하지 않는 보정 계수를 감안하면, 인간 투여에 효과적이다. 구체적으로, 인간 투약을 위한 항원성 분자에 비공유적으로 결합된, 또는 그와 혼합된 스트레스 단백질 (또는 HSP)에 대한 종간 용량 반응 등가량은 마우스에서 관찰되는 치료학적 투여량과, 50배 증가를 초과하지 않는 단일 스케일링 비율의 곱으로서 추정된다.
또 다른 실시양태에서, 조성물의 투여량은 외삽에 의해 추정된 투여량보다 훨씬 더 적은 양일 수 있다. 한 실시양태에서, hsc70-항원성 펩티드 복합체, hsp70-항원성 펩티드 복합체 및/또는 gp96-항원성 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 예를 들어, 인간 환자인 경우, 약 2 ㎍ 내지 약 150 ㎍이고, 인간 투여량은 25 g 마우스에서 사용되는 것과 동일한 양이다. 인간 환자에서의 hsp-90 펩티드 복합체를 포함하는 조성물의 투여량은 약 10 내지 1,000 ㎍ 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물의 투여량은 약 20 ㎍이다.
상기 언급된 용량은 1회 또는 최대 1년 동안 또는 1년 동안에 걸쳐 반복적으로 예컨대, 매일, 격일로, 매주, 격주로, 또는 매월 제공될 수 있다. 용량은 바람직하게는 약 52주 이상의 기간 동안에 걸쳐 매 28일마다 1회씩 제공된다.
한 실시양태에서, 조성물은 추가의 치료 방식 또는 방식들과 상당히 동일한 시점에 대상체에게 투여된다. 이러한 방법을 통해 두 투여는 서로 1분 미만 내지 약 5분, 또는 최대 약 60분의 시간 프레임 내에서, 예를 들어, 같은 의사의 방문 시점에 수행된다.
또 다른 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 정확하게 동일한 시점에 투여된다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은, 본 발명의 복합체 및 추가의 치료 방식 또는 방식들이 함께 작용함으로써 그가 단독으로 투여되는 경우보다 증가된 이점을 제공할 수 있도록 하는 순서대로 및 시간 간격 이내에 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 원하는 치료학적 또는 예방적 결과를 제공하기 위해 시간상 충분히 가까운 시점에 투여된다. 각각은 동시에 또는 별개로, 임의의 적절한 형태로 및 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 복합체 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 상이한 투여 경로에 의해 투여된다. 대안적 실시양태에서, 각각은 동일한 투여 경로에 의해 투여된다. 조성물은 동일하거나, 또는 상이한 부위 ,예컨대, 팔 및 다리에 투여될 수 있다. 동시에 투여되는 경우, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 혼합되어 또는 동일한 투여 부위에 동일한 투여 경로에 의해 투여될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다.
다양한 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 1시간 미만의 간격을 두고, 약 1시간의 간격을 두고, 1시간 내지 2시간의 간격을 두고, 2시간 내지 3시간의 간격을 두고, 3시간 내지 4시간의 간격을 두고, 4시간 내지 5시간의 간격을 두고, 5시간 내지 6시간의 간격을 두고, 6시간 내지 7시간의 간격을 두고, 7시간 내지 8시간의 간격을 두고, 8시간 내지 9시간의 간격을 두고, 9시간 내지 10시간의 간격을 두고, 10시간 내지 11시간의 간격을 두고, 11시간 내지 12시간의 간격을 두고, 24시간 이하의 간격을 두고 또는 48시간 이하의 간격을 두고 투여된다. 다른 실시양태에서, 조성물 및 백신 조성물은 2 내지 4일의 간격을 두고, 4 내지 6일의 간격을 두고, 1주의 간격을 두고, 1 내지 2주의 간격을 두고, 2 내지 4주의 간격을 두고, 1개월의 간격을 두고, 1 내지 2개월의 간격을 두고, 또는 2개월 이상의 간격을 두고 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 둘 모두가 계속해서 활성을 띠는 시간 프레임으로 투여된다. 당업자는 투여되는 각 성분의 반감기를 측정함으로써 상기 시간 프레임을 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 4주 동안 매주 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 4주간의 매주 투약 후, 적어도 2회 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회)의 추가의 조성물의 투약이 대상체에게 격주로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 최종의 매주 또는 격주 투약 후 3개월째에 부스터로서 투여된다. 대상체의 여생 동안 (예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50년 이상) 매 3개월마다 부스터가 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 조성물의 총 투약 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회이다.
한 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 같은 환자 방문 시점 이내에 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 추가의 치료 방식 또는 방식들 투여 이전에 투여된다. 대안적인 구체적 실시양태에서, 조성물은 추가의 치료 방식 또는 방식들 투여 이후에 투여된다.
특정 실시양태에서, 조성물 및 추가의 치료 방식 또는 방식들은 순환 방식으로 대상체에게 투여된다. 순환 요법은 일정 기간 동안 조성물을 투여한 후, 일정 기간 동안 방식을 투여하고, 이러한 순차적 투여를 반복하는 것을 포함한다. 순환 요법은 요법들 중 하나 이상의 것에 대한 내성 발생을 감소시킬 수 있고/거나, 요법들 중 한 요법의 부작용을 막거나 또는 감소시킬 수 있고/거나, 치료 효능을 개선시킬 수 있다. 상기 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물 투여 후, 방식 투여를 4 내지 6일 후에, 바람직하게는, 2 내지 4일 후에, 더욱 바람직하게는, 1 내지 2일 후에 교대로 투여하며, 여기서, 상기 사이클은 원하는 횟수만큼 반복될 수 있는 것을 고려한다. 특정 실시양태에서, 조성물 및 방식은 3주 미만, 매 2주마다 1회, 매 10일마다 1회 또는 매주 1회인 사이클로 교대로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 방식 투여 후 1시간 내지 24시간의 시간 프레임 이내에 대상체에게 투여된다. 저속 또는 연속 방출형 방식의 전달 시스템이 사용된다면 시간 프레임은 수일 이상으로 추가로 연장될 수 있다.
5.4. 투여 경로
본원에 개시된 조성물은 임의의 원하는 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 상기 기술된 조성물을 도입시키는 데, 경구적, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 점막, 비내, 종양내, 및 림프절내 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 방법이 사용될 수 있다. 비점막 투여 경로로는 진피내 및 국소 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 점막 투여 경로로는 경구적, 직장 및 비강 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진피내 투여의 이점으로는 각각 더 적은 저용량 사용 및 빠른 흡수를 포함한다. 피하 또는 근육내의 이점으로는 각각 일부 불용서 현탁액 및 오일성 현탁액에 맞는 적합성을 포함한다. 점막 투여용 제제는 하기 기술되는 바와 같이 다양한 제제에서 적합하다.
용해도 및 투여 부위는 조성물의 투여 경로를 선택할 때 고려해야 하는 인자이다. 투여 모드는 상기 기술된 투여 경로를 포함하는 다중의 투여 경로들 사이에서 달라질 수 있다.
조성물이 수용성일 경우, 이때 조성물은 적절한 완충제, 예를 들어, 포스페이트 완충처리된 염수 또는 다른 생리학상 화합성인 용액, 바람직하게 멸균성인 것 중에서 제제화될 수 있다. 대안적으로, 조성물이 수성 용매 중에서 용해도가 낮을 경우, 이때 조성물은 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈, 또는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 흡입 또는 취입 (입 또는 코를 통한 것) 또는 경구적, 협측, 비경구적, 또는 직장 투여에 의한 투여용으로 제제화될 수 있다.
경구적 투여를 위해, 조성물은 액체 형태, 예를 들어, 액제, 시럽 또는 현탁제 형태일 수 있거나, 사용 전 물 또는 다른 적합한 비히클과의 재구성을 위한 약물 제품으로서 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 제약상 허용되는 첨가제, 예컨대, 현탁화제 (예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소 첨가 식용가능한 지방); 유화제 (예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예컨대, 아몬드유, 오일성 에스테르, 또는 분별화된 식물성 오일); 및 보존제 (예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용하여 종래 수단에 의해 제조될 수 있다. 조성물은 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 결합화제 (예컨대, 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예컨대, 락토스, 미정질 셀룰로스 또는 칼슘 인산수소칼슘); 윤활제 (예컨대, 스테아르산 마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예컨대, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤화제 (예컨대, 소듐 라우릴 술페이트)를 이용하여 종래 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐제와 같은 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다.
경구적 투여를 위한 조성물은 방출 조절형 방식 및/또는 시간이 정해진 방식으로 방출되도록 적합하게 제제화될 수 있다.
협측 투여를 위해, 조성물은 종래 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
제제는 주사에 의한, 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구적 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 제형으로, 예컨대, 앰플로 또는 다회 투약 용기로 제공될 수 있다. 제제는 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁제, 액제 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화 작용제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열원 무함유 물과의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
제제는 또한 예컨대, 종래 좌제용 베이스, 예컨대, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는, 직작용 제제, 예컨대, 좌제 또는 정체 관장제로 제제화될 수 있다.
앞서 기술된 제제 이외에도, 제제는 또한 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 상기 지속 작용 제제는 (예를 들어, 피하 또는 근육내) 임플란트에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체, 예를 들어, 난용성 염을 이용하여 제제화될 수 있다. 리포솜 및 에멀젼은 친수성 약물용의 전달 비히클 또는 캐리어인 것으로 널리 공지된 예이다.
흡입에 의한 투여인 경우, 조성물은 편의상, 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 사용하는, 가압식 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스트레이 제공 형태로 전달된다. 가압식 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예컨대, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴과 같은, 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하는 캡슐제 및 카트리지가 제제화될 수 있다.
5.5. 환자 ( 대상체 ) 평가
본원에 개시된 조성물로 치료받은 환자를 항-종양 면역 반응에 대하여 검사할 수 있다. 이와 관련하여, 환자로부터 말초 혈액을 수득하고, 항-종양 면역의 마커에 대하여 검정할 수 있다. 표준 실험실용 방법을 사용하여, 말초 혈액으로부터 백혈구를 수득하고, 상이한 면역 세포 표현형의 빈도, HLA 하위유형, 및 항-종양 면역 세포의 기능에 대하여 검정할 수 있다.
항-종양 반응에서 이펙터 면역 세포 대다수는 CD8+ T 세포이고, 따라서, HLA 부류 I 제한성인 것이다. 다른 종양 유형에서 면역요법적 전략법을 사용할 경우, HLA 부류 I 제한 항원을 인식하는 CD8+ 세포가 확장되는 것이 환자 대부분에서 관찰된다. 그러나, 예를 들어, 항원 제시 세포로서 작용할 수 있는, CD4+ T 세포 및 대식세포 및 수지상 세포를 비롯한 다른 세포 유형이 항-종양 면역 반응에 관여하다. 유세포 분석법을 사용하여 T 세포 (CD4+, CD8+, 및 Treg 세포), 대식세포, 및 항원 제시 세포 집단을 측정할 수 있다. 당업계의 통상의 방법, 예컨대, 문헌 [Boegel et al. Genome Medicine 2012, 4:102]에 기술된 방법 (seq2HLA)을 사용하여, 또는 트루사이트(TruSight)® HLA 서열분석 패널 (일루미나, 인크.)을 사용하여 HLA 유형 분류를 수행할 수 있다. CD8+ T 세포의 HLA 하위유형은 보체 의존성 미세세포독성 시험에 의해 측정될 수 있다.
항-종양 T 세포 반응의 증가 여부를 측정하기 위해, 효소 결합 면역스폿 검정법을 수행하여 IFNγ-생산 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 정량화할 수 있다. 상기 기술을 통해 항원 인식 및 면역 세포 기능에 대해 검정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신에 대해 임상적으로 반응하는 대상체에서는 종양 특이 T 세포 및/또는 IFNγ-생산 PBMC가 증가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유세포 분석법을 사용하여 면역 세포 빈도를 평가한다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 및 면역 세포 기능은 효소 결합 면역스폿 검정법을 사용하여 평가한다.
일부 실시양태에서, 검정법 패널을 수행하여 단독으로 사용된, 또는 표준 치료 (예컨대, 최대 외과적 적출, 방사선 요법, 및 다형성 아교모세포종용의 테모졸로미드를 이용한 동시 및 애주번트 화학요법)와 함께 조합하여 제공된 HSPPC-96에 대하여 생성된 면역 반응의 특징을 규명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정법 패널로는 하기 검사들 중 하나 이상의 것을 포함한다: 전혈 혈구수, 림프구 절대 계수, 단핵구수, CD4+CD3+ T 세포의 비율(%), CD8+CD3+ T 세포의 비율(%), CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T 세포 및 PBL 표면 마커의 다른 표현형 분류의 비율(%), 단백질 수준에서 염증 유발성 시토카인을 검출하기 위한 세포내 시토카인 염색, mRNA 수준에서 시토카인을 검출하기 위한 qPCR 및 T 세포 증식을 검정하기 위한 CFSE 희석.
대상체를 평가할 때, 다수의 다른 검사를 수행하여 대상체의 전반적인 건강 상태를 측정할 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플을 대상체로부터 수집하고, 혈액학적 성질, 응고 시간 및 혈청 생화학적 성질에 대해 분석할 수 있다. CBC에 대한 혈액학적 성질로는 적혈구수, 혈소판, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 백혈구 (WBC) 수와, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 및 단핵구에 대한 절대 계수를 제공하기 위한 WBC 감별을 포함할 수 있다. 혈청 생화학적 성질로는 알부민, 알칼리성 포스파타제, 아스파르테이트 아미노 트랜스퍼라제, 알라닌 아미노 트랜스퍼라제, 총 빌리루빈, BUN, 글루코스, 크레아티닌, 칼륨 및 나트륨을 포함할 수 있다. 프로타임(Protime: PT) 및 부분 트롬보플라스틴 시간 (PTT) 또한 검사할 수 있다. 하기 검사 중 하나 이상의 것 또한 수행할 수 있다: 항-갑상선 (항-마이크로솜 또는 티로글로불린) 항체 검사, 항-핵 항체에 대한 사정, 및 류마토이드 인자. 소변 검사를 수행하여 소변 중 단백질, RBC, 및 WBC 수준을 평가할 수 있다. 또한, 조직적합성 백혈구 항원 (HLA) 상태 측정을 위한 채혈을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 전 기간 동안 1회 이상 방사선 종양 평가를 수행하여 종양 크기 및 상태를 평가한다. 예를 들어, 수술 전 30일 이내에, 수술 후 48시간 이내에 (예컨대, 적출 비율을 평가하기 위해), 1차 백신 접종 전 1주 (최대 14일) (예컨대, 기준선 평가로서), 및 특정 지속 기간 동안 그 이후부터 대략 매 8주마다 종양 평가 스캔을 수행할 수 있다. MRI 또는 CT 영상화를 사용할 수 있다. 전형적으로, 기준선 사정에 사용되는 것과 동일한 영상화 방식이 각 종양 평가 방문시 사용된다.
6. 키트
본원에 개시된 예방적 및 치료학적 방법을 수행하기 위한 키트 또한 제공한다. 키트는 임의적으로 키트의 각종 구성 부품의 사용 방법에 관한 설명서를 동반할 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 키트는 상이한 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기로서, 여기서, 각 항원성 펩티드는 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 제1 용기; 및 제1 용기 중의 펩티드 투여 이전, 그와 동시에, 또는 그 이후에 투여되었을 때, 항원성 펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 애주번트 또는 애주번트들을 함유하는 제2 용기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 상이한 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기로서, 여기서, 각 항원성 펩티드는 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 제1 용기; 애주번트 또는 애주번트들을 함유하는 제2 용기; 및 제2 치료 방식을 함유하는 제3 용기를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 키트는, 각 항원성 펩티드가 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 상이한 항원성 펩티드에 결합된 스트레스 단백질의 복합체를 포함하는 조성물 및 애주번트를 한 용기에 함유하는 용기, 및 제2 치료 방식을 함유하는 제2 용기; 또는 추가의 애주번트, 예컨대, 사포닌, 제한하는 것은 아니지만, QS-21, 예컨대, QS-21 스티뮬론® (안티제닉스 LLC(Antigenics LLC))을 포함한다. 추가의 용기는 조합하여 사용될 수 있는 추가의 치료 방식을 위해 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 용기 중의 조성물은 각 항원성 펩티드가 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 상이한 항원성 펩티드에 결합된 열 충격 단백질의 복합체 형태의 것이다.
특정 실시양태에서, 용기 중의 조성물 및 애주번트는 암을 치료하거나, 또는 그의 재발을 예방하는 데 효과적인, 미리 결정된 양으로 존재한다. 원하는 경우, 조성물은 조성물의 하나 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 동반할 수 있다.
실시예
실시예 1: 저장된 인간 다발성 골수종 (MM) 형질 세포 샘플 중에서의 체세포 돌연변이 확인
마운트 시나이 메디컬 센터의 혈액학상의 악성 종양 조직 뱅크(Mount Sinai Medical Center's Hematological Malignancies Tissue Bank: 미국 플로리다주 마이애미 비치)에 저장된 50개 초과의 MM 샘플의 사전에 주석화된 RNA 및 전체 엑솜-서열분석 (WES)에 기초하여 본 발명자들은 19개의 샘플에 대한 비-동의 돌연변이 목록을 작성하였다. 돌연변이를 컴퓨터에 의해 특징 규명하고, 면역학적 검정법에서 시험하기 위해 10개의 샘플 각각에 대하여 최대 48개의 펩티드를 합성한다.
실시예 2: 뮤린 MM 종양 세포주에서 확인된 체세포 돌연변이
본 발명자들은 MOPC315.BM에 대한 모체 세포주인, 즉시 이용가능한 MOPC315의 엑솜을 프로파일링하였다. B16F10 (962개의 비-동의 돌연변이) 및 CT26 (1,688개)에 관한 본 발명자들의 연구, 및 MC-38 (4,285개) 및 TRAMP-C1 (949개)에 관한 공개된 연구와 유사하게, 본 발명자들은 BALB/c 게놈과 비교하여 1,764개의 비-동의 체세포 점 돌연변이 (SNV)를 확인하였다. 상기 SNV는 1,539개의 유전자에 존재한다 (문헌 [Cancer research. Mar 1 2012;72(5):1081-1091]; [Nature. Nov 27 2014;515(7528):572-576]; [BMC genomics. 2014;15:190] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 본 발명자들은 MOPC315 돌연변이 함유 펩티드의 잠재적 면역원성을 산출하였다. 이어서, 본 발명자들은 3개의 필터를 적용하여 면역원성이거나, 또는 종양 억제인 것으로 예측되는 것으로 보고된 특징을 함유하는 신생-에피토프를 확인하였다. 상기 필터는 (i) 멜만(Mellman) 및 동료에 의해 기술된 바와 같은, T 세포 수용체에 접근가능한 위치 (P3-P7)에 위치하는 신생-에피토프 중의 점 돌연변이 (문헌 [Nature. Nov 27 2014;515(7528):572-576]); (ii) 시리바스타바(Srivastava) 및 동료에 의해 기술된 바와 같은, 예측 신생-에피토프와 그의 정상 대응물 사이의 최대 친화도 차이 (문헌 [The journal of experimental medicine. Oct 20 2014;211(11):2231-2248] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)); 및 (iii) NetMHCpan 알고리즘을 사용하였을 때, H-2Kd, H-2Dd 또는 H-2Ld HLA 대립유전자에 대한 친화도가 < 150 nM인 것이었다.
실시예 3: MM 환자의 PBMC는 예측 신생- 에피토프를 인식하는 T 세포를 함유한다.
백신 접종을 받지 않은 MM 환자의 PBMC는 차세대 서열분석에 의해 확인된 신생-에피토프를 인식하는 T 세포를 함유하는 것으로 입증되고 있다. 이러한 입증을 통해 "기준선"에서의 돌연변이화된 종양 항원 인식 정도를 확립하면서, (a) 백신 접종 이전의 기준선과 비교하여 다양한 예측 신생-에피토프에 대하여 특이적인 T 세포 빈도의, 백신 유도성 증가 및 (b) 기준선에서 인식되지 못한 항원에 대한 반응의 백신 유도성 유도에 관한 1상 임상 시험을 위한 단계를 설정할 수 있다. CD4/CD8-고갈된 PBMC에 의해 천연적으로 선별된 에피토프로 프로세싱한 후, HLA 제한 대립유전자를 미리 정의할 필요 없이, 추정의 돌연변이화된 에피토프를 함유하는 펩티드를 풀링하고, 이를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포를 독립적으로 CD4 및 CD8 T 세포를 자극시킬 수 있다 (문헌 [J. Immunol . Feb 1 2003;170(3):1191-1196] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 전문적 및 비전문적 항원 제시 세포, 둘 모두 오직 천연적으로 프로세싱된 에피토프만이 확실하게 T 세포에 제시될 수 있도록 긴 펩티드의 흡수 및 프로세싱을 필요로 하며, 여기서, 돌연변이는 HLA 결합 또는 T 세포 인식에 중요할 수 있다. 긴 펩티드는 1) 긴 펩티드는 선형 에피토프에 대한 항체 인식을 촉진시킨다는 관찰 결과 (문헌 [Methods Mol . Biol . 2009;520:11-19] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)); 2) 긴 펩티드는 CD8 T 세포에 의해 인식되도록 하기 위해서는 대개는 프로테아좀 의존성 방식으로 천연적으로 HLA 부류 I 제한 에피토프로 프로세싱되어야 한다는 관찰 결과 (문헌 [J. Immunol . Feb 1 2003;170(3):1191-1196] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)); 및 3) 긴 펩티드가 CD4 T 세포의 최적의 표적이라는 관찰 결과 (문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. Jul 9 2003;100(15):8862-8867] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다))에 기초하여 제공된 본 실시예에서 사용된다.
면역학적 검정법에서 인식에 대하여 시험된 펩티드의 합성을 위한 근거
MM의 특징이 되는 서브클론 환자내 돌연변이 이종성 및 돌연변이 선택의 불확실성에 대해 다루기 위해 MM ASV 개별화된 백신은 최대 48개의 환자 특이 및 종양 특이 신생 항원을 포함한다 (문헌 [Cancer cell. Jan 13 2014;25(1):91-101] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 대부분의 환자의 경우, 그의 종양에서 발견되는 발현된 비-동의 돌연변이 모두를 포함한다. 마운트 시나이의 혈액학상의 악성 종양 조직 뱅크의 MM 형질 세포 샘플로부터 작성된 돌연변이 목록의 분석을 사용하여 최대 48개까지의 각 샘플에 대한 합성을 위한 돌연변이체 펩티드를 확인한다. 각 펩티드는 중앙부에 점 돌연변이가 있는 31mer로 구성된다. 긴 펩티드를 통해 항원 제시 세포 (APC)에 의한 프로세싱이 이루어질 수 있고, 이를 통해 각 대상체에서 발현될 수 있는 최대 6개까지의 대립유전자에 대한 HLA 부류 I 또는 II 결합 에피토프를 나타낼 수 있는 더 짧은 단편을 생성할 수 있다. 각 펩티드가 단일 점 돌연변이를 함유하는 것인, 긴 합성 펩티드로 이루어진 풀을 각 펩티드의 비돌연변이화된 대응물과 함께 합성하고, T 세포 및 항원 제시 세포의 공급원으로서 벌크 자가 PBMC를 사용하여 T 세포 기능 검정법으로 시험한다. 가능할 경우, T 세포에 의해 인식되는 최소 신생-에피토프를 정의한다.
방법
i. 사전 감작화
혈액학상의 악성 종양 조직 뱅크는, 각 MM 환자에 대한 주석화된 RNA 및 WES 데이터가 이용가능한 것인 상기 환자로부터의 총 ~2-4 x 107개의 PBMC를 함유하는 2개의 녹색 탑 튜브를 보유하고 있다. 먼저, 생체내에서 악성 세포의 인식에 의해 프라이밍된 신생-에피토프에 대한 면역 반응을 확장시키도록 디자인된, 단일의 시험관내 사전 감작화를 수행한다. 세포를 해동시키고, PBMC를 단리시키고, 분취하고, 사전 감작화 단계에서 사용하거나, 또는 추후 사용을 위해 냉동시킨다. 사전 감작화를 위해, 1x107개를 31mer 펩티드의 풀을 포함하는 24 웰 플레이트에서 배양한다. NGS 데이터에서 ≤ 48개의 돌연변이인 것으로 나타난 환자의 경우, 긴 펩티드가 모든 돌연변이에 대하여 생성되고, 이는 감작화에 사용된다. > 48개의 돌연변이인 것으로 확인된 경우, 48개의 돌연변이의 무작위 선택에 기초한 감작화를 위해 최대 48개의 펩티드를 합성한다. 감작화에 사용되는 펩티드 풀의 크기 및 조성은, 배양 플레이트 중에서 펩티드의 용해도가 유지되도록 각종 펩티드의 생화학적 특징에 기초하여 결정된다. IL-2 및 IL-7의 존재하에서 10-20일 동안 사전 감작화를 수행한다. 양성 대조군으로서, PBMC의 서브세트를 회상 바이러스 항원, 예컨대, CEF 펩티드 풀로 사전 감작화시킨다. 펩티드에 대한 기존의 CD8 T 세포 반응은 대략 10일째에 최대치에 이르는 것으로 예상되는 반면, CD4 T 세포는 대략 배양 20일째에 최대치에 도달하는 것으로 예상되며, 반복된 샘플링 및 기능 검사를 통해 확실하게 최적으로 검출할 수 있다.
ii. ELISPOT 및 세포내 시토카인 염색 (ICS) 검정법
이어서, 어느 펩티드 풀이 자가 T 세포에 의해 인식되는지 확인하기 위해, 사전 감작화 배양물로부터 수거된 벌크 림프구를 사용하여 IFN-γ 효소 결합 면역스폿 (ELISPOT) 검정법을 수행한다. 자가 EBV-형질전환된 B 세포 (B-EBV) 및/또는 PHA-확장된 T 세포 (T-APC)를 항원 제시 세포로서 사용하고, 사전 감작화에 사용된 것과 동일한 펩티드의 더욱 소량의 서브풀을 이용하여 밤새도록 펄싱한다 (대안적으로, 표적 세포가 한정되어 있는 경우, 세포 배양물을 나누고, 펩티드의 서브풀로 감작화시킨다). 자극받지 않은 세포가 음성 대조군으로서의 역할을 한다. CEF 펩티드 풀은 양성 대조군 항원으로서 포함되며, PHA/PMA-이오노마이신은 세포의 전체 생존가능성 및 생존을 사정하는 데 사용된다. IFN-γ 분비 림프구를 나타내는 스폿을 CTL 면역스폿 분석기 및 소프트웨어 (쉐이커 하이츠(Shaker Heights: 미국 오하이오주))를 사용하여 정량화한다. 유의적인 것으로 간주되기 위해서는 항원 특이성 IFN-γ 반응은 50,000개의 세포 중 50개 초과이고, 대조군인, 펄싱되지 않은 표적 세포를 통해 수득된 스폿 개수보다 적어도 3개 더 많은 스폿 계수를 가져야 한다.
관찰된 임의의 반응성을 확인하고, ELISPOT 검정법에서 긴 펩티드의 서브풀에 대해 반응하는 T 세포의 표현형 (CD4+ 또는 CD8+)을 확인하기 위해, CD8, CD4 및 IFN-γ에 대한 mAb를 사용하여 사전 감작화 배양물로부터의 남은 세포를 이용하여 ICS를 수행한다. 양성 반응은 > 0.5%이고, 대조군인, 펄싱되지 않은 표적 세포의 경우에 수득된 비율(%)의 >3배인 것으로 정의될 것이다. 일부 경우에서, 항원 특이 T 세포의 빈도는 특이성을 보이는 세포주를 추가 분석을 위해 냉동보관할 수 있게 허용할 정도로 충분히 높을 수 있다.
iii. 반응성 림프구의 특이성
신생-에피토프를 함유하는 펩티드의 하나 이상의 풀에 대한 반응성을 예비 스크린에서 확인하고, 인식에 대하여 펩티드를 개별적으로 시험함으로써 상기 풀을 데콘볼루션한다. T 세포 반응이 신생-에피토프 특이성인지 확인하기 위해, 각 돌연변이체 펩티드를 그의 비돌연변이체 (즉, 야생형) 대응물 펩티드와 함께 시험한다. 본 실험을 위해 상기 기술된 바와 같이, 사전 감작화 배양 후, 이어서, ELISPOT 검정법 및 ICS를 사용한다.
iv. 최소 CD8 + T 세포 신생- 에피토프 확인
상기 기술된 스크린을 "통과"한 31mer 펩티드의 개수, 및 세포 뱅크로부터 회수된 PBMC의 개수에 의존하여, 검정법 시리즈를 수행함으로써 인식되는 최소의 T 세포 신생-에피토프를 확인한다. HLA 부류 I 결합 펩티드의 크기는 유한적인 반면 (전형적으로 9, 10 또는 11mer), HLA 부류 II 결합 펩티드의 길이는 상당히 다양할 수 있기 때문에, 최소 에피토프 확인은 오직 부류 I 결합 펩티드에만, 및 따라서, 오직, 상기 기술된 ICS 검정법에서 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 것으로 밝혀진 상기 31mer에 대해서만 중점적으로 이루어진다. 각각의 양성 31mer의 경우, 점 돌연변이가 추정의 에피토프의 각 위치에 배치되어 있는 것인 모든 가능한 9, 10 및 11mer이 합성된다. 상기 짧은 펩티드에 대한 비돌연변이화된 대응물이 대조군으로서 시험된다. 이 경우, 60개의 펩티드가 합성되어야 한다 (각 추정의 신생-에피토프 및 그의 그의 비돌연변이화된 대응물에 대하여 9개의 9mer, 10개의 10mer 및 11개의 11mer). 자극 항원으로서 동족 돌연변이체 31mer 펩티드를 사용하여 세포 확장 단계를 달성한다. 이어서, 먼저 짧은 돌연변이체 펩티드의 풀을 이용하여 ELISPOT 검정법을 수행한다. 상기 기술된 바와 같이, 이어서, 양성 풀을 데콘볼루션하고, 상기 단계에서 대조군으로서 대응물 비돌연변이화된 펩티드를 사용하여 인식에 대해 개별적으로 시험할 수 있다. 관찰된 빈도에 의존하여, ELISPOT 검정법에서 T 세포에 의한 인식에 대해 개별적으로 짧은 펩티드를 시험하기 이전에 시험관내에서 반복적으로 자극시키는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 펩티드 반응성 세포의 분류 및 동종이계 피더 및 PHA를 이용하는 단일특이적 세포주의 비특이적 확장을 허용하는 IFN-γ 및/또는 다른 바람직한 시토카인을 측정하는 검정법을 이용하여 항원 특이 T 세포 강화를 시도한다.
실시예 4: 오토신박스 ( AutoSynVax )™의 생물학적 활성을 하나 이상의 뮤린 MM 모델, 예컨대, 5TMM 시리즈 또는 MOPC에서 시험한다.
암 신생-에피토프를 함유하는 펩티드와 복합체를 형성한 HSP를 포함하는 오토신박스™ (ASV™) 조성물의 생물학적 활성을 MOPC315.BM 뮤린 MM 모델에서 시험한다. MOPC315.BM은 인간 질환의 여러 특징을 닮은, BALB/c 마우스와 동계인 뮤린 악성 형질 세포주이다. 이는 골수를 이식시키고, 정맥내 주사에 도입되었을 때에는 용해성 골 질환을 유발하고, ELISA에 의해 혈청 중에서 측정될 수 있는 IgA 람다 M-단백질을 분비한다. 상기 모델은 이디오타입 백신 전략법을 연구하는 데 사용되어 왔고, BALB/c 마우스에서 람다 경쇄의 초가변 영역 중 신생-에피토프인 펩티드 91-101이 강력한 CD4+ T 세포 면역을 유도할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 모체 세포주인 MOPC315에 대해 전체 엑솜 서열분석을 수행하였고, 예비 돌연변이 목록을 확인하였다. 본 실시예에서는 MOPC315.BM에 대해 WES를 수행하여 RNAseq를 확인하여 전사체 중 돌연변이 발현을 확인한다. 확인된 돌연변이의 개수가 모체 세포주에서 관찰된 것과 유사하다고 가정할 때, MOPC315.BM ASV 대용물에서 사용하기 위한 모든 상응하는 긴 펩티드를 합성하는 것은 불가능하다. 이는 모델에 대하여 인정된 한계이다. 대신, 필터 선택을 적용하여 후보 긴 펩티드 목록을 최대 48개로 좁힌다. 각 펩티드는 중앙부에 점 돌연변이가 있는 31mer로 구성된다. 48개의 긴 펩티드와 Hsc70의 복합체를 형성하고, QS-21 스티뮬론®과 혼합하여 대용물 ASV 백신을 생성한다. 이어서, BALB/c 배경에서의 ASV에 대한 최적의 투약을 확인하고, 단독인 경우, 및 레날리도마이드와의 조합인 경우, 이 둘 모두의 면역학적 효능을 사정하는 실험을 수행한다. 실험은 용량 결과, 성분 활성, 및 조합 사정에 대해 순서대로 진행되었다. 백신 접종 스케줄은 동물 모델에서 시험된 유사한 합성 긴 펩티드 기반 백신 제제에 기초한다 (문헌 [Vaccine. Nov 3 2011;29(47):8530-8541]). 레날리도마이드와의 조합으로, 면역원성 연구에 이어서, 예방적 종양 보호 연구가 및 요법 연구가 이루어진다.
방법
i. 재조합 Hsc70 , 및 MOPC315.BM ASV 대용물 백신에 포함시키기 위한 긴 펩티드 선택
MOPC315.BM에서는 다수의 돌연변이가 발현되는 것으로 예상되기 때문에, 대용물 백신에 포함시키기 위한 펩티드를 선별하는 것에 관한 불가지론적 접근법은 불가능하다. 대신, 필터, 예컨대, 모체 세포주, MOPC315에 대하여 상기 기술된 3가지 필터를 적용하여, 3개의 BALB/c 대립유전자 모두를 나타내는 것인, (조합시, 최대 총 48개에 이르는) 각각 16개의 펩티드로 이루어진 3개 군을 선별할 수 있다.
ii. 면역원성 연구
본 실험을 통해 BALB/c 배경에서의 ASV의 MOPC315.BM 대용물에 대한 최적의 투약을 확인하고, 단독인 경우, 및 레날리도마이드와의 조합인 경우, 이 둘 모두의 면역학적 효능을 사정한다. 실험은 용량 결과, 백신 성분 활성, 및 조합 사정에 대해 순서대로 진행된다. 백신 접종 스케줄은 동물 모델에서 시험된 유사한 백신 제제에 기초한다 (문헌 [Vaccine. Nov 3 2011;29(47):8530-8541] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)).
(a) MOPC315.BM ("MOPC") ASV 용량 결과.
4마리의 암컷 BALB/c 마우스로 이루어진 군은 1 및 8일째 진피내 주사에 의해 용량을 단계적으로 증가시켜 가면서 ASV를 받는다. 한 군은 양성 대조군으로서 MOPC 람다 경쇄 이디오타입 λ2로부터의 잔기 91-101을 함유하는 펩티드로 제제화된 ASV (Id ASV)를 받고 (문헌 [The EMBO journal. Jul 1989;8(7):1947-1952] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)), 백신 접종을 받지 않은 마우스는 음성 대조군으로서의 역할을 한다. ASV 제제는 Hsc70 대 전체 펩티드 혼합물의 몰비가 1:1인 몰비로 48개의 합성 31mer 펩티드 (천연적으로 발생된 잔기가 측면에 위치하는, 중앙부의 체세포 돌연변이)와 복합체를 형성한 10, 30, 또는 100 ㎍의 Hsc70이다. 복합체를 주사 이전에 총 부피 100 ㎕의 멸균 염수 중에서 10 ㎍ QS-21 스티뮬론®과 혼합한다. 백신 접종 이전 및 각 실험 종료시, 안와후방 출혈에 의해 각 대상체로부터 100 ㎕의 전혈을 수득하고, 체액성 면역 반응에 대한 잠재적 추후 분석을 위해 혈청을 냉동보관한다. 대상체를 15일째 안락사시키고, 기계적 파쇄에 의해 전체 비장 세포를 회수하고, ACK 완충제에 의해 적혈구를 용해한다. 상기 기술된 바와 같은 시험관내 재자극 및 ELISPOT 검정법에 의해 T 세포 면역을 사정한다. 이를 통해 생체내 면역원성 및 후속 실험을 위한 최적의 용량이 확립될 것이다.
(b) 백신 성분 사정.
상기 파트 (a)에서 확립된 최적의 용량을 이용하여 각 성분으로 4마리의 시험 대상체로 이루어진 군에 백신 접종함으로써 각 백신 성분의 상대적인 기여를 사정한다. 백신 접종 스케줄은 상기 파트 (a)에 기술된 바와 같다. 군은 MOPC ASV (스티뮬론® 포함), QS-21 스티뮬론®을 포함하지 않는 MOPC ASV, QS-21 스티뮬론®을 포함하는 MOPC 펩티드 (Hsc70 미포함), MOPC 펩티드 단독, MOPC Id ASV 또는 비처리 대조군을 포함한다. 기술된 바와 같이 항원 특이 T 세포 반응을 사정한다.
(c) MOPC315.BM에 대한 레날리도마이드 활성에 관한 시험관내 분석.
시험관내에서 8-포인트 용량 곡선 생존가능성 검정법에 의해 MOPC315.BM 세포에 대한 레날리도마이드의 직접적인 활성을 측정한다. 96 웰 플레이트에서 MOPC315.BM의 삼중 웰을 레날리도마이드의 용량을 증가시켜 가면서 레날리도마이드와 함께 공동 배양하고, 40 hr째에 알라마르 블루(Alamar Blue) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)) 형광에 의해 세포 생존가능성을 정량화한다. 10 μm 보르테조밉은 세포독성에 대한 양성 대조군으로서의 역할을 한다. HP D3000 디스펜서 (휴렛-패커드, 인크.(Hewlett-Packard, Inc.; 미국 캘리포니아주 팔로 알토))를 이용하여 자동화된 분취량의 DMSO 중의 10 mM 레날리도마이드 스톡 용액에 의해 8-포인트 용량 곡선을 작성한다. 레날리도마이드 및 대조군을 플레이트에 무작위로 분배하여 에지 효과를 제거하고, 분석하기 전에 40 hr째의 알라마르 블루 형광을 데콘볼루션한다. 상기 데이터는 추가 분석을 위한 추정 LD50 농도를 제공한다. 상기 LD50을 이전 백신 접종 모델로부터의 생리학적 용량 수준과 비교하여 MOPC315.BM.30-32에 대한 추정의 단일 작용제 활성 수준 미만인 표적 용량을 확인한다.
(d) 생체내에서의 ASV 면역 프라이밍을 촉진시키는 데 있어서의 레날리도마이드의 활성
동물 모델에서 MOPC ASV에 의한 면역 프라이밍을 촉진시키는 데 있어서의 레날리도마이드의 활성을 사정한다. 4마리의 대상체로 이루어진 군에 복강내 (IP) 주사 (멸균 염수에 희석된 10 mM DMSO 스톡)에 의해 (상기 파트 (c)에서 확인된) MOPC ASV 또는 Id ASV를 단독으로 또는 최적화된 용량의 레날리도마이드와 함께 투여하여 백신 접종한다. 비처리 마우스가 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 앞서 기술된 바와 같이 면역학적 효능을 사정한다.
(e) MOPC ASV 유도성 Ag 특이 면역의 기능상 특징 규명
백신 접종에 대한 세포성 면역 반응의 상세한 특징 규명을 수행하기 위해, 10마리의 마우스로 이루어진 코호트에 레날리도마이드를 공동 투여하면서, MOPC ASV 또는 Id ASV로 백신 접종하고; 백신 접종을 받지 않은 마우스는 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 전체 비장세포를 풀링하고, CD4 및 CD8 T 세포를 항체-접합된 자기 비드 분류에 의해 분리하고, 전체 펩티드 풀로 재자극시킨다. 확장된 T 세포 풀을 분석을 위해 분류한다. 상기 기술된 바와 같이 매트릭스 ELISPOT 검정법에 의해 특이적 신생-에피토프에 대한 T 세포 반응의 빈도를 확인한다. 상기 집단을 재자극 및 IFN-γ, TNFα, 퍼포린, 그랜자임, IL-4, 및 IL-5 발현에 대한 ICS/유세포 분석법에 의해 기능상의 특징 규명을 수행한다. 자극을 위해 돌연변이화된 펩티드 또는 야생형 펩티드를 사용하여 ELISPOT 검정법에 의해 돌연변이화된 신생-에피토프 레퍼토리에 대한 특이성을 확인한다. 에피토프-특이 T 세포를 단리시키고, IFN-γ 포획에 의해 서브클로닝한다.
LDH (락테이트 데히드로게나제) 방출 검정법에 의해 OPC에 대한 세포독성 활성을 사정하고; 자가, 펩티드-펄싱된 표적 세포 및 완충제 용해가 양성 대조군이고, 펄싱되지 않은 세포가 음성 대조군이다. MOPC 또는 다른 BALB/c 광유 유도성 형질 세포 세포주, 예컨대, HOPC 1F/12 및 RPC5.4 (ATCC; 미국 버지니아주 매너서스)에 대한 세포독성 검정법에 의해 MOPC 신생-에피토프 레퍼토리에 대한 특이성을 사정한다. MOPC에 대하여 기술된 바와 같이 WES 및 분석에 의해 상기 세포주에의 잠재적인 교차 반응성 돌연변이의 돌연변이에 대해 사정한다.
iii. 예방적 종양 보호 연구:
(a) 종양 시험감염 최적화.
꼬리 정맥 주사에 의해 세포의 개수를 단계적으로 증가시켜 가면서 그를 도입함으로써 생체내 모델링을 위해 MOPC315.BM 세포의 개수를 최적화시킨다. 세포를 RPMI 배지 중에서 3회에 걸쳐 세척하고, 재현탁시켜 100 ㎕의 총 부피 중 표적 세포 로드를 전달한다. 기준선에서 및 7일 간격으로 안와후방 출혈에 의해 100 ㎕의 전혈을 획득하고, 혈청을 IgA ELISA 및 면역고정을 위해 단리시켜 질환 진행의 마커로서 M-스파이크를 추적한다. 시험 동물을 척주에서의 발병전 질병 부담의 지표인 뒷다리 마비에 대해 관찰하고, 이러한 이벤트 발생시 안락사시킨다. 탈회, 파라핀 포매, 및 골수 중 CD138+ 형질 세포, CD3+ 림프구의 형태 및 면역조직화학적 (IHC) 평가를 위한 절편화를 위해 부검시 대퇴골 및 척주를 회수한다. 생존 곡선을 플롯팅하여 사망률이 100%가 되는 최소 종양 시험감염 용량을 확인한다.
(b) 레날리도마이드 생체내 용량 최적화.
MOPC에 대한 단일 작용제 활성을 최소화하고, MOPC ASV와의 공동 자극성 활성을 최대화시키기 위해 레날리도마이드 투약을 최적화한다. 10마리의 마우스로 이루어진 코호트는 MOPC 종양 시험감염을 최적화된 용량으로 받는다. 종양 이식이 이루어질 수 있도록 3일 경과 후, 시험 대상체는 상기 (ii) (d)에서 확인된 용량에 근접한 용량 중심으로 3개의 상이한 용량 수준의 레날리도마이드 (멸균 염수 중에서 희석된 10 mM DMSO 스톡)를 매주 복강내 (IP) 투여로 받는다. 레날리도마이드 없이 종양 시험감염된 마우스는 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 시험 동물을 IgA 수준 및 뒷다리 마비에 대하여 모니터링하고, 부검 표본의 병리 및 IHC에 의해 종양 부하를 확인한다. 카플란-마이어(Kaplan-Meyer) 생존 곡선을 작성하여 배경 대비 생존을 유의적으로 연장시키지 않는 최대 레날리도마이드 용량 수준을 확인한다.
(c) MOPC ASV 및 레날리도마이드 항-종양 면역의 예방적 모델.
1 및 8일째에 12마리의 암컷 BALB/c 마우스로 이루어진 코호트에 MOPC ASV+레날리도마이드 또는 대조군 (MOPC Id ASV 양성 대조군, 최적화된 용량의 레날리도마이드 단독 및 비처리 마우스 음성 대조군)을 백신 접종한 후, 이어서, 15일째에 꼬리 정맥 주사에 의해 100 ㎕ 멸균 염수 중에 현탁된 MOPC315.BM 세포의 최적화된 시험감염을 받는다. 비처리된, 종양을 보유하는 동물이 음성 대조군으로서의 역할을 한다. 매주 수행되는 출혈 및 IgA ELISA에 의해, 및 신체 검사에 의해 종양 성장을 추적한다. 뒷다리 마비가 검출되었을 때 동물을 안락사시키고, 음성 대조군의 마지막 대상체가 발병전 마일스톤에 도달하였을 때, 남은 대상체 모두 안락사시킨다. 시험 동물 및 비처리 대조군 동물에 대하여 카플란-마이어 생존 곡선을 작성한다. 각 실험 종료시, 상기 기술된 바와 같이 Ag 특이 면역, 에피토프 특이성, 세포독성, 및 Th 표현형을 사정하기 위해 전체 비장세포를 회수한다. 부검 표본을 IHC에 의해 종양 부하 및 골수 내로의 T 세포 침윤에 대하여 조사한다.
(d) MOPC ASV 및 레날리도마이드의 치료학적 모델.
10마리의 대상체로 이루어진 코호트는 종양 시험감염을 받고, 3일 경과 후, 상기 (iii) (c)에서와 같이 매주 MOPC ASV+레날리도마이드 또는 대조군으로 백신 접종을 받는다. IgA ELISA 및 신체 검사에 의해 종양 성장을 추적하고, 기술된 바와 같이 비장세포 및 골수에 대하여 사후 분석 평가를 수행한다.
실시예 5: 재발성 MM을 앓는 환자에서의 ASV의 인간 임상 시험에서의 최초의 1상의 적절한 물질의 제조
유자격 환자는 재발성 MM을 앓는 환자이며, 최대 4회의 선행 치료 후 이식 자격이 있다. 환자는 표준 치료 ImiDs 및/또는 저용량의 경구용 시톡산(Cytoxan)과 조합된 백신으로 치료받는다. 종점으로는 안전성, 면역 반응, 및 항-MM 요법에 대한 백신의 상가 효능의 신호를 포함한다. 면역 모니터링과 관련하여, 종적 바이오마커 연구를 수행하여 백신에 대한 면역학적 반응을 확인하고, 종양 진화를 추적한다. 백신 접종 이전 및 이후에 혈액 및 잠재적으로 골수 샘플을 채취하고, 예컨대, 신생-에피토프-특이 T 세포 표현형, TCR 레퍼토리 및 돌연변이체 유전자의 발현 수준의 변화에 대하여 검정한다. 형질 세포 엑소좀 또한 상기 분석 중 일부에 대한 편리하고, 유용한 공급원이 될 수 있다. MM 환자가 시험에 등록하고, 전 과정의 백신 접종으로 치료를 받은 후, 면역 모니터링 및 종양 진화 추적을 뒷받침하는 연구를 수행한다.
방법
i. 임상 시험 디자인
I상 연구에서 재발성 다발성 골수종을 앓는 환자 (n=~30)에서의 안전성, 실행가능성 및 면역학적 반응을 사정한다. 본 연구의 목적은 안전성, 약동학적 성질, 임상 반응 및 백신에 대한 면역학적 반응을 평가하고자 하는 것이다. 필수적인 포함 기준은 1) 1회 이상이되, 4회 이하의 선행 치료 요법 이후의 재발성 MM, 2) 측정가능한 질환 (혈청 M-단백질 2 0.5 gm/dL 또는 포함된 혈청 유리 경쇄 (sFLC) 2,100 mg/L 및 비정상적인 sFLC 비 (<0.26 또는 >1.65) 또는 소변 M-단백질 2 200 mg/24시간), 3) 말초 혈액 절대 림프구 계수 21,000/㎕인 것으로 입증되는 적절한 면역학적 예비능, 4) Hgb 28.0 gm/dL 및 plt 250,000/㎕, 및 5) ECOG PS 22이다. 배제 기준은: 1) 다발성 골수종에 대한 백신 면역요법을 이용하는 선행 요법을 받은 경우, 2) 자가면역 질환의 병력이 있는 경우, 3) 선행 동종이계 조혈 줄기 세포 이식을 받은 경우, 4) 공지된 HIV 또는 활동성 Hep B 또는 C가 있는 경우, 및 5) 5년 이내에, 진행성 질환에 대한 증거가 없는 비-흑색종 피부암, 상피내 암종 (표재성 방광암), 자궁경부 상피내 종양, 또는 기관 국환된 전립선암을 제외한, 속발성 악성 종양을 동시에 앓은 경우이다.
환자는 백신 제조의 기초가 되며, 조직 전달로부터 8주가 소요될 것으로 예상되는 NGS를 위해 조직 획득과 동시에 스크리닝 시점에서 골수 생검을 받는다. 등록 환자는 각 28일 주기 (주기 1 및 2)의 1-21일째 매일 경구적으로 레날리도마이드 25 mg, 1일 2회에 걸쳐 경구적으로 시클로포스파미드 50 mg, 및 1-7일째 매일 경구적으로 프레드니손 20 mg을 이용한 중간 요법을 받는다. 시클로포스파미드는 보편적으로 다발성 골수종용으로 레날리도마이드 및 덱사메타손과 함께 조합하여 사용되는 알킬화제이다 (문헌 [American journal of hematology. Aug 2011;86(8):640-645]; [British journal of haematology. May 2007; 137(3):268-269]). 그의 직접적인 세포독성 효과 이외에도, 저용량의 시클로포스파미드는 동물 모델 및 인간 연구에서 Treg의 빈도를 감소시키고, 수지상 세포 성숙화 및 Th1/Th17 T 세포 표현형을 통한 면역 프라이밍을 위해 바람직한 환경을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Cancer immunology, Immunotherapy: CII. May 2013;62(5):897-908]; [Blood. Jun 3 2010;115(22):4384-4392]; [Journal of Immunology. Mar 1 2006;176(5):2722-2729]; [Cancer research. Feb 1 2011;71(3):661-665] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 치료학적 종양 백신과 함께 기계적으로 규칙적인 또는 저용량의 시클로포스파미드에 관한 조기 단계의 임상 시험을 통해 우수한 면역학적, 및 일부 경우에서는 임상적 효능과의 연관성이 입증되었다 (문헌 [Cancer immunology, immunotherapy : CII. May 2012;61(5):629-641; Cancer immunology, immunotherapy : CII. Jan 2013;62(1):171-182; Nature medicine. Aug 2012;18(8):1254-1261] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)). 그러므로, 레날리도마이드, 저용량의 경구용 시클로포스파미드, 및 프레드니손의 조합이 ASV를 이용한 백신 접종 이전의 중간 요법을 위한 합리적 선택이다. 삼중 조합은 심지어 앞서 레날리도마이드 및 덱사메타손을 받은 환자에서도 조차 상가 효과를 제공한다. 본 작용제들의 면역억제성 효과를 완화시키면서, 확실하게는 시험의 백신 부분에 진입한 환자가 적어도 3주 동안은 글루코코르티코이드에 노출되지 않도록 하기 위해 프레드니손은 각 28일 주기의 첫째 주에만 투여된다.
환자는 28일 주기 3의 1, 8, 15, 및 22일째에 진피내 주사에 의해 ASV를, 및 1-21일째에 매일 경구적으로 레날리도마이드 25 mg을 받은 후, 각각의 후속 주기 동안 매달 백신을 투약받으면서, 동시에 각 28일 주기의 1일째부터 21일째까지 경구적으로 [PO] 레날리도마이드 25 mg을 투약받는다 (C4부터 C12까지). 이는 1년의 치료 동안에 걸쳐 총 15회의 백신 투여로 구성된다. 환자는 계속해서 매회 백신 접종 이전에 저용량의 시클로포스파미드를 받는다. 일단 프로토콜의 백신 부분이 완료되고 나면 (C12), 대상체는 계속해서 C12까지 각 28일 주기의 1-21일째에 매일 경구적으로 레날리도마이드 25 mg을 받는다. 레날리도마이드에 대해서는 원인이 될 수 있는 독성에 대한 프로토콜에 명시된 용량을 보류하거나, 또는 감소시킬 수 있다. 혈전 예방, 비스포스포네이트, 및 조혈 성장 인자를 비롯한, 임상적으로 필요한 동시 약물 투여가 허용될 수 있다. 대상체는 C12 (연구 종료) 이후에 완전한 병기 재분류 및 면역학적 사정을 받는다. PFS 사정을 위해 24개월 동안 매 3개월마다 후속 방문이 계속해서 수행된다.
면역원성, 약동학적 성질 (PK), 및 약력학적 성질 (PD)을 평가한다. 안전성 평가는 유해 사례 (AE) 및 중증 AE의 빈도, 중증도 및 약물 조합과의 관계를 포함하고, 이를 연구 약물의 최종 투약 후 최대 60일까지 사정한다. 면역학적 사정은 (1) 백신 이전, (2) 4회에 걸친 매주 투약 이후에; (3) 그 이후 격월로 또는 최종 연구 방문 시점에 완성될 것이다. 2차 목적으로서 객관적 반응 (OR, 엄격한 완전 관해, 완전 관해, 매우 우수한 부분 관해 (VGPR), 및 PR 포함), 질환 진행, 및 재발을 평가하고, 이를 각 주기 종료시 또는 연구 종료 방문시에 사정한다. 국제 골수종 워킹 그룹(International Myeloma Working Group: IMWG) 기준에 따라 반응을 사정한다.
실시예 6: 데이터베이스로부터 도출된 MM 신생- 에피토프
메드게놈(MedGenome: 미국 매사추세츠주 케임브리지)와 함께 작업하면서, 본 발명자들은 공개된 정보원 및 비공개된 TCGA 및 ICGC 연구로부터 확인된 MM에서의 체세포 돌연변이의 그들의 수동식으로 큐레이터된 데이터베이스 (OncoMD)에 대해 의문을 제기하였다. OncoMD는 원시 NGS fastq 파일을 신속하게 프로세스하여 체세포 돌연변이를 확인하는 광범위한 컴퓨터 워크플로우 및 다양한 게놈 및 생물정보학적 데이터를 조합하여 종양 돌연변이 프로파일 및 발현 시그니처를 확인하는 주석화 엔진을 가진다. MM에 특이적인 4,505개의 독특한 큐레이터된 돌연변이 데이터에 관한 요약은 하기 표 2에 제시되어 있다. 중요하게, 데이터베이스는 또한 MM 적응증에서의 큐레이션 프로세스의 정확도를 언급하는 MM에서 악성 진행과 연관이 있는 유전자 (예컨대, MYC , KRAS , NRAS , TP53, 및 KDM6A) 중의 돌연변이도 보고한다. 큐레이터된 데이터베이스 중의 대부분의 돌연변이는 413개의 샘플 중 오직 단 한번 존재한다. 이는 게놈 중에서 무작위적으로 발생하는 다수의 패신저 돌연변이를 나타내는 것이며, 돌연변이의 무작위적인 성질은 왜 생성된 신생-에피토프가 대체로 개별적으로 종양 특이적인지 그 이유를 설명한다.
OncoMD에 존재하는 다발성 골수종 돌연변이에 관한 요약
연구수1 샘플 총 개수2 독특한 돌연변이의 총 개수3 비-동의 체세포 돌연변이를 포함하는 유전자 개수 중앙값 (범위)4 빈번하게
돌연변이화되는 유전자5
71 413 4,505 38.5 (1 - 463) KRAS , NRAS , BRAF FAM46C
16번의 연구를 통해 전체 엑솜 및 전체 게놈 서열분석이 보고되었고, 65번의 연구를 통해 1개 이하의 서열분석이 보고되었다.
2 서열분석된 샘플.
3 모든 연구로부터의 유전자 중의 독특한 체세포 돌연변이 (NGS로부터 3,888개 및 다른 연구로부터 617개)
4 6번의 NGS 연구에서 보고된 데이터로부터 산출됨.
5 빈번하게 돌연변이화된 유전자란, ≥ 8% 샘플에서 돌연변이화된 유전자로서 정의됨.
MM에서의 4,505개의 독특한 돌연변이로부터, NetMHCpan을 이용하여 신생-에피토프 및 12개의 HLA 대립유전자에 대한 친화도를 예측하였다 (도 1). 신생-에피토프 크기는 9 및 10mer으로 제한되었다. 일반적으로, IC50 < 150 nM인 펩티드는 강한 정도 내지 중간 정도의 결합제인 것으로 간주된 반면, <500 nM은 약한 결합제이다. 대표적인 산출이 HLA-A*02:01에 대하여 IC50 < 150 nM인 362개의 9mer, 및 IC50 < 50 nM인 192개의 9mer이 예측되었다는 것을 나타낸다. 하기 표 3에는 IC50 < 50 nM인, 실제 예측된 신생-에피토프가 열거되어 있다. IC50 < 150 nM인 모든 펩티드에 대하여 HLA-A*02:01 및 HLA-B*07:02 경우에서의 예측된 9mer 및 10mer 신생-에피토프의 친화도와 그의 비돌연변이화된 대응물을 비교하여 산점도를 작성하였다 (도 3). OncoMD에서 큐레이터된 MM 샘플의 경우, 신생-에피토프/정상 대응물 쌍 사이의 예측 친화도 또한 유사한 것으로 관찰된다 (표 3 및 도 3). 표 3에서, 펩티드 서열은 소문자로 제시되어 있되, 단, 예외적으로, 돌연변이체 펩티드 서열 (제2 열)에서 돌연변이화된 아미노산 및 돌연변이화된 위치에서 천연 펩티드 서열 (제6 열)에서 일반적으로 발견되는 아미노산은 괄호 안에 대문자로 제시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 7: 아교모세포종 ( GLB ) 신생- 에피토프
본원에 개시된 방법을 사용하여 3명의 대상체에 대하여 면역원성 조성물 (백신)로의 도입을 위한 것으로서 길이가 31개의 아미노산 길이인 최대 24개의 펩티드를 확인하였다. 하기 표 4에는 3명의 대상체 모두에 대한 데이터가 요약되어 있고, 하기 표 5-7에는 각 대상체 (각각 환자 A, B, 및 C)에 대하여 요약되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 8: 암-특이 돌연변이체 펩티드 확인
I. 주조직 적합성 복합체 (MHC) 부류 I 및 부류 II, 둘 모두에 상응하는 인간 백혈구 항원 (HLA) 단백질을 단리시킨다. 사용되는 방법에 의존하여, 면역친화성 정제를 이용하여 다양한 수준의 특이성으로 HLA를 단리시킬 수 있다 (예컨대, 문헌 [Seward et al. Mol Cell Proteomics . 2011 Mar;10(3):M110.002477] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 예를 들어, W6/32 항체를 이용하여 집합적으로 MHC 부류 I HLA 서브 풀을 나타내는 HLA-A, -B 및 -C 단백질을 단리시킬 수 있다. 유사하게, L243 항체를 이용하여 HLA-DR 단백질을 단리시킬 수 있다. 표적 HLA 결합 펩티드를 함유하는 조직을 균질화시킨 후, 이어서, 조직 균질액을, 관심의 대상이 되는 HLA 분자에 대한 적절한 항체를 함유하는 면역친화성 칼럼 상으로 통과시킨다. 칼럼 결합 HLA 분자를 적절히 세척한 후, 항체 결합 단백질 및 그의 회합된 펩티드를 저 pH 세척으로 유리시킨다. 상기 용출액을 저분자량 컷오프 필터를 이용하여 한외 여과시킴으로써 유리 펩티드가 단백질로부터 분리되어 통과할 수 있도록 한다. 이어서, 생성된 펩티드 분획을 농축시키고, 적절한 용매 시스템 (예컨대, 물 중 0.1% v/v 트리플루오로아세트산으로 이루어진 용매 A)으로 옮긴 후, 모세관 또는 나노 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 칼럼 상에 로딩한다. 이어서, 용매 구배 (예를 들어, 10% → 55% 용매 B: 80% 아세토니트릴 20% 물 중 0.1% 포름산)를 사용하여 90분 동안에 걸쳐 칼럼 결합 펩티드를 용출시킨다.
구배 동안 펩티드가 용출됨에 따라, 펩티드를 질량 분석법 (MS)에 의해 분석한다. 질량 분석법 분석은 전형적으로 전자 분무 이온화 (ESI) 및 일부 형태의 하이브리드 탠덤 질량 분석기, 예컨대, 분석시 모체 이온 및 단편, 둘 모두의 질량을 고도로 정확하게 측정할 수 있는, 4중극 비행 시간 (QTOF) 또는 4중극-오비트랩 질량 분석기 상에서의 질량 분석을 사용하여 수행된다. 상기 질량 분석법 분석은 전형적으로 분석되는 펩티드의 서열이 명백하게 정의되도록 또는 그에 준하도록 무손상 피분석물의 모체 질량 및 단편의 질량을 제공할 것이다.
이어서, 생물정보학적 방법을 사용하여 펩티드 서열을 분석하고, 상기 서열이 정상 (야생형) 또는 돌연변이체 (비정상) 단백질 서열인지 여부를 측정한다. 추가로 또는 대안적으로, 이환 조직으로부터 수득된 서열을 동일 환자로부터의 정상적인 (비-암) 조직, 또는 적합한 대조군 (예컨대, 또 다른 대상체로부터의 샘플 또는 정상적인 조직 샘플로부터의 공지된 펩티드의 데이터베이스)의 분석에 의해 결정된 서열과 비교한다. 정상 조직 및 이환 조직, 둘 모두의 서열분석에 의해 MS에 의해 확인된 서열을 개별 환자의 게놈의 게놈 분석에 의해 결정된 단백질 서열을 비교함으로써 추가로 분석할 수 있다.
II. 정상 또는 비정상적인 조직에 직접적으로 상응하는, 천연의 비변형된 펩티드 서열을 분석하는 것 이외에도, 번역 후 변형 (PTM)된 MHC 결합 펩티드에 대한 분석에도 착수할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Seward 상기 문헌 동일]; 및 [Drouin et al. Arthritis Rheum. 2013 Jan;65(1):186-96.] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 번역 후 변형에 관한 분석은 정확한 전구체 질량 측정 및 충동 유도 해리를 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Seward 상기 문헌 동일] 참조). 적절한 소프트웨어를 사용하여 펩티드 코어 서열 및 관련된 PTM 및 그의 위치를 확인할 수 있다. 확인될 수 있는 PTM 범위로는 산화된 메티오닌, 아미노-말단 글루타민 및 글루탐산으로부터의 피로글루탐산, 및 글루타민 및 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 확인될 수 있는 추가의 PTM으로는 Ser 또는 Thr에서의 O-N-아세틸글루코사민; Lys 또는 아미노 말단에서의 아세틸화; 카르복실 말단에서의 아미드화; Arg → 시트룰린; S-시스테이닐화; S-시스테이닐글리신; S-글루타티오닐화; Lys 또는 아미노 말단에서의 당화; S-호모시스테이닐화; Cys, Lys, 또는 His에서의 4-히드록시-5-노네날; Lys에서의 말론디알데히드; Lys 또는 Arg에서의 메틸화; Cys에서의 산화; 및 Ser, Thr, 또는 Tyr에서의 인산화를 포함한다. 데이터베이스 검색을 통해 확인된 모든 확인 내용은 최적으로 수동 방식에 의해 확인된다.
III. PTM 범위에 대해 MHC 결합 펩티드를 분석하는 것 이외에도, MHC 결합 펩티드의 선행 분류에 착수하여 분석된 펩티드 풀을 구체적인 PTM으로 강화시킬 수 있다. 예를 들어, 포스페이트 모이어티를 함유하는 펩티드를 상기 접근법으로 분석할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Zarling et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 3;103(40):14889-94] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 전체 MHC 결합 펩티드를 예컨대, 상기 기술된 것과 같은 방식으로 단리시킨다. 이어서, 생성된 전체 펩티드 풀을 메틸화시켜 카르복실레이트 기 (예컨대, C-말단 COOH, 및 측쇄 Asp 및 Glu COOH)를 그에 상응하는 메틸 에스테르로 전환시킬 수 있다. 이어서, 메틸화된 펩티드 풀을 Fe3 +-고정화된 금속-친화성 크로마토그래피 칼럼 상으로 통과시킨다. 세척 후, 인산화된 펩티드는 칼럼 상에 유지되고, 이어서, 이를 약산으로 세척하여 (예컨대, 묽은 아스코르브산) 용출시키고, 이를 RP-HPLC 칼럼에 직접 적용시킨다. 이어서, 용매 구배를 이용하여 상기 포스포펩티드 분획을 추가의 RP-HPLC 칼럼을 통해 용출시켜 질량 분석기로 옮기고, 분석하여 모체 이온 및 단편 MS/MS 데이터를 수득함으로써 코어 펩티드 서열 및 포스포-변형 위치를 확인할 수 있도록 한다.
상기 접근법의 변형법으로 (예컨대, 문헌 [Zarling 상기 문헌 동일] 참조), 단일 분석으로 두 샘플 (예컨대, 정상 조직 및 이환 조직, 또는 2개의 상이한 세포주)의 비교에 착수할 수 있다. 단일 샘플을 2부로 나누고, d0- 또는 d4-메탄올로 메틸화하여 가벼운 및 무거운 안정적 동위 원소 표지를 가지는 2부를 얻는다. 상이한 동위 원소 표지를 가지는 상기 기술된 바와 같이 샘플을 조합하고, 고정화된 금속-친화성 크로마토그래피에 의해 포스포펩티드를 강화시키고, LC-MS에 의해 분석한다. 포스포펩티드에 대한 신호는 질량 스펙트럼에서 분자 중 카르복실레이트 기 1개당 3 m/z 단위로 분리된 이중선으로 나타난다. 한 샘플 또는 그 나머지 다른 샘플에 대해 독특한 포스포펩티드는 단일항으로 나타난다.
Xcalibur 소프트웨어 (써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corporation))에서 이용가능한 크로마토그램의 3차원 시각적 표시를 사용하여 데이터 분석을 수행한다. MS/MS 스펙트럼의 수동식 해석, 정확한 질량 측정, 및 MASCOT 시퀀스 쿼리(MASCOT Sequence Query) (www.matrixscience.com/home.html)의 조합에 의해 펩티드 서열을 결정한다. 상응하는 합성 펩티드에 대한 MS/MS 스펙트럼을 기록함으로써 서열을 확인한다. 인간 단백질에 대한 nr 및 RefSeq 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 검색함으로써 확인된 펩티드 서열에 대한 단백질 공급원을 수득한다.
당업계의 숙련가는 상기 언급된 기술은 변형될 수 있고, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 유용한 돌연변이체 펩티드 (예컨대, 포스포펩티드)를 확인하는 데 도움이 되는 다른 기술이 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 방법은 예를 들어, 문헌 [Meyer et al. J 　 Proteome 　 Res. 2009 Jul;8(7):3666-74]; WO2013177593; WO1992021033; WO2011149909; WO2014036562; WO2015034519; WO2014039675; WO 2014093855; 및 US7,026,167 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
실시예 9: B16.F10 흑색종에서 ASV 조성물의 종양-보호 활성
B16.F10 흑색종 중의 두 예측된 신생-에피토프인 B16-M27 및 B16-M30 (문헌 [Kreiter et al., Nature 520[7549]:692-6 [2015]])을 함유하는 ASV 조성물의 치료학적 효능을 B16.F10 흑색종에서 시험하였다. M27 및 M30의 서열은 하기 표 8에 제시되어 있다.
물질
· 코닝(Corning) 175 ㎠ 세포 배양 플라스크, 카탈로그 번호 431080, 로트 번호 05415006.
· FBS, 게미니 바이오-프로덕츠(Gemini Bio-Products), 카탈로그 100-106, 로트 A96A00Y.
· PBS, 코닝, 카탈로그 번호 21-040-CV, 로트 21040344.
· 펜-스트렙(Pen-Strep), 기브코(Gibco), 카탈로그 15140-122, 로트 1665601.
· L-글루타민, 기브코, 카탈로그 25030-081, 로트 1627656.
· 2 메르캅토에탄올, 기브코, 카탈로그 21985-023, 로트 1628448.
· RPMI1640, 기브코, 카탈로그 10-040-CV, 로트 10040609.
· 완전 배지 조성: 450 ml RPMI-1640, 50 ml FBS, 5ml 펜-스트렙, 5 ml L-글루타민 및 500 ul의 2 메르캅토에탄올.
· TrpLE™ 익스프레스(TrpLE™ Express) (트립신), 써모 피셔(Thermo Fisher)
방법
i. B16.F10 세포의 세포 배양 및 종양 시험감염:
B16.F10 세포 (ATCC; P7) 바이알을 해동시키고, 15 ml 원뿔형 튜브 중 미리 가온된 완전 RPMI 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 25℃에서 4분 동안 1500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 신선한 완전 배지 중에 재현탁시키고, 175 ㎠ 플라스크 중에서 37℃하에 50 mL 완전 배지에서 배양하였다. 전면생장률이 >80%가 될 때까지 세포를 격일로 현미경으로 관찰하였다.
세포 전면생장률이 >80%에 도달하였을 때, 배지를 수거하고, 10 mL의 미리 가온된 PBS를 첨가하였다. PBS를 수거한 후, 5mL의 TrpLE™ 익스프레스를 플라스크에 첨가하여 세포를 표면으로부터 탈착시켰다. 플라스크를 37℃에서 5분 동안 트립신과 함께 인큐베이션시켰다. 신선한 완전 배지 20 mL를 이용하여 트립신 반응을 정지시켰다. 10 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 상하로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 50 mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고, 25℃에서 4분 동안 1500 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 신선한 완전 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 175 ㎠ 플라스크 4개에서 1:20의 비로 배양하였다.
상기 기술된 바와 같이 마우스 (C57BL/6; 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories))에게로의 주사 당일 세포를 수거하였다. 세포를 무혈청 PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, PBS 중에 1.5　x　105개의　세포/mL인 농도로 재현탁시켰다. 마우스당 100 ㎕의 세포를 피하로 주사하였다. 총 60마리의 마우스에 주사하였다. 종양 시험감염 후 12일째를 시작으로 매 2-3일마다 종양 부피 (㎣)을 측정하였다.
ii. ASV 조성물 제조 및 치료군:
M27 및 M30 흑색종 돌연변이를 함유하는 2개의 27mer 펩티드를 이용하여 ASV 조성물을 제조하였다. 군당 12마리의 마우스 각각에 대하여 마우스당 200 ㎕ 투여 중 3 ㎍, 10 ㎍, 또는 30 ㎍인 ASV 투여량을 위해 Hsc70:펩티드 몰비 1:10으로 0.4 mM HEPES, 20 mM KCl 중에서 Hsc70 (바이오메이 아게(Biomay AG)) 및 펩티드의 혼합물을 제조하였다. Hsc70 단독 (30 ㎍), 펩티드 단독 (6.6 ㎍ 각각의 펩티드 [30 ㎍ ASV 중에 존재하는 양에 등가량]), 및 펩티드 + 폴리(I:C) (100 ㎍ 각각의 펩티드, 50 ㎍ 폴리 [I:C]) 투여를 위한 것으로 제시된 바와 같은 대조군 샘플 또한 제조하였다.
각 군에 대하여, 각 펩티드에 대한 펩티드-Hsc70 복합체를 개별적으로 제조한 후, 추후에 혼합하였다. 치료군은 하기와 같았다:
Figure pct00016
마우스당 총 3회의 주사를 위한 분취물을 제조하고, 분취물을 냉동시키기 전에 2시간 동안 37℃에서 Hsc70-펩티드 복합체를 인큐베이션시켰다. 치료군 6군의 경우, 폴리(I:C)를 마우스 주사 이전에 유리 펩티드에 첨가하였다.
종양 시험감염 후 3, 9 및 15일째 종양으로부터 가장 먼 원위부에 마우스당 200 ul의 치료학적 용량을 피하로 주사하였다.
결과:
Hsc70 단독을 이용한 요법과 비교하였을 때, 마우스당 10 ㎍ 및 30 ㎍ 용량의 ASV를 이용한 요법은 유의적인 종양 보호를 제공하였다 (종양 세포 주사 후 최대 16일째까지의 종양 성장 곡선을 보여주는 도 4; 각 플롯의 우측 하단에 표시된 박스안의 수치는 16일째에도 여전히 살아있는 마우스의 마리수를 나타내는 것이다). 구체적으로, "혼합 모델" 검정을 사용하였을 때, 종양은 음성 대조군 (Hsc70 또는 펩티드 단독)보다 유의적으로 더욱 느린 속도로 성장하였다 (p < 0.005; Hsc70 및 펩티드 단독인 대조군과 유의적인 차이를 보이는 군은 별표로 표시되어 있다). 10 및 30 ㎍ ASV 용량으로 치료받은 마우스 (2군 및 3군)에서의 종양 성장 속도는 양성 대조군 (펩티드 + 폴리[I:C])에서의 것과 유의적으로 상이하지 않았다. 각 치료군에서의 마우스들 간의 평균 종양 부피는 도 5에 제시되어 있다.
실시예 10: B16.F10 흑색종에서의, QS -21 스티뮬론 ® 을 포함 및 포함하지 않는, 2개의 신생-에피토프를 포함하는 ASV 조성물의 상이한 치료학적 용량에 관한 시험.
사포닌 애주번트 QS-21 스티뮬론® 애주번트의 존재 및 부재하에서, 실시예 9에 기술된 M27 및 M30 신생-에피토프를 함유하는 ASV 조성물의 치료학적 효능을 B16.F10 흑색종에서 시험하였다. QS-21 스티뮬론®의 존재 및 부재하에서 실시예 9에 기술된 종양 거부 검정법을 반복하였고, 본 실시예에서는 Hsc70:펩티드 몰비 1:20으로 Hsc70-펩티드 복합체를 제조하였다.
방법:
실시예 9에 기술된 방법을 반복하되, 단, 예외적으로, 7개의 C57BL/6 마우스 군에의 투여를 위해 하기 ASV 조성물 및 대조군 샘플을 제조하였다. 군당 12마리의 마우스 각각에 대하여 마우스당 200 ㎕ 투여 중 3 ㎍, 10 ㎍, 또는 30 ㎍인 ASV 투여량을 위해 Hsc70:펩티드 몰비 1:20으로 0.4 mM HEPES, 20 mM KCl 중에서 Hsc70 및 펩티드의 혼합물을 제조하였다. Hsc70 단독 (30 ㎍), 펩티드 + QS-21 스티뮬론® (13.3 ㎍ 각각의 펩티드 [30 ㎍ ASV 중에 존재하는 양에 등가량], Hsc70 비함유), 및 펩티드 + 폴리(I:C) (100 ㎍ 각각의 펩티드) 투여를 위한 것으로 제시된 바와 같은 대조군 샘플 또한 제조하였다. 치료군은 하기와 같았다:
Figure pct00017
결과:
Hsc70 단독을 이용한 요법과 비교하였을 때, 마우스당 10 ㎍, 30 ㎍, 및 30 ㎍ + 10 ㎍ QS-21 스티뮬론® 용량의 ASV를 이용한 요법은 유의적인 종양 보호를 제공하였다 (종양 세포 주사 후 최대 16일째까지의 종양 성장을 보여주는 도 6). (30 ㎍ ASV에 존재하는 것과 동일한 양의) 펩티드 단독 및 QS-21 스티뮬론® (6군)을 이용한 요법 또한 유의적인 보호를 제공하였다. 각 치료군에서의 마우스들 간의 평균 종양 부피는 도 7에 최대 18일째까지 제시되어 있다. 치료군에서 상응하는 생존 효과가 관찰되었으며, Hsc70 단독인 것과 비교하였을 때, ASV 투여량 모두 생존을 연장시켰다 (도 8). (30 ㎍ ASV에 존재하는 것과 동일한 양의) 펩티드 단독 및 QS-21 스티뮬론® (6군)으로 치료받은 마우스에서도 또한 생존 연장이 관찰되었다.
실시예 11: ASV -치료받은 마우스에서의 신생- 에피토프 특이 T 세포 반응의 분석
B16.F10 흑색종 종양 세포로 시험감염하고, 실시예 9 및 10에 기술된 M27 및 M30 B16.F10 신생-에피토프를 포함하는 ASV로 치료한 후, C57BL /6 마우스에서 신생-에피토프에 대한 T 세포 반응을 분석한다. 마우스를 실시예 10에 기술된 바와 같이 종양 세포로 시험감염하고, ASV 샘플을 투여한다. 종양 시험감염 후 22일째, 마우스 비장세포를 수거하고, ELISPOT 검정법을 수행하여 T 세포 반응을 프로빙한다 .
물질:
· ACK 용해 완충제, 라이프 테크놀러지즈, 카탈로그 번호 A10492-01, 로트 번호 1701378.
· FBS, 게미니 바이오-프로덕츠, 카탈로그 100-106, 로트 A96A00Y
· 70 ㎛ 세포 스트레이너, 코닝, 카탈로그 번호 431751, 로트 111666.
· PBS, 코닝, 카탈로그 번호 21-040-CV, 로트 21040344.
· 델리케이트 오퍼레이팅 시저스(Delicate Operating Scissors) 4.75" 스트레이트 샤프/샤프(Straight Sharp/Sharp), 로보즈(Roboz), 카탈로그 번호 RS-6702.
· BD ELISPOT 플레이츠(BD ELISPOT Plates), 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니(Becton, Dickinson & Co), 카탈로그 번호 51-2447KC.
· BD NA/LE 정제된 항-마우스 IFN-γ 포획 항체 (멸균), 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니, 카탈로그 번호 51-2525KC, 로트 번호 5044579, 스톡 농도 1 mg/mL, 최종 농도 5 ㎍/mL로 사용하기 위해 멸균 PBS 중 1:200으로 희석된 것.
· 비오티닐화된 항-마우스 IFN-γ 검출 항체, 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니, 카탈로그 번호 51-1818KZ, 로트 번호 5044578, 스톡 농도 0.5 mg/mL, 최종 농도 2 ㎍/mL를 위해 PBS + 10% FBS 중 1:250으로 희석된 것.
· 스트렙타비딘-HRP, 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니, 카탈로그 번호 51-9000209, 로트 번호 5163509, 100x 스톡 농도, 최종 농도를 위해 PBS + 10% FBS 중 1:100으로 희석된 것.
· AEC 기질 세트 10 플레이트, 벡톤, 디킨슨 & 컴퍼니, 카탈로그 번호 551951, 로트 번호 6011786, 50x 스톡 농도; 최종 작업 농도를 위해 각 1 mL씩의 AEC 기질로 희석된 ACE 크로모겐 1 방울 (20 ㎕).
· 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis)로부터의 콘카나발린 A (Con A) 세포 배양물 등급 - 5mg, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich). 카탈로그 번호 C0412-5MG, 로트 번호 SLBN5209V, 최종 농도 5 ㎍/mL로 희석된 것.
· 트윈-20, 시그마 알드리치, 카탈로그 번호 P5927-500ML, 로트 번호 043K01541, 최종 농도 of 0.05%로 PBS 중 희석된 것.
· T 세포 배지 (TCM):
Figure pct00018
방법:
-1일째 (종양 시험감염 전날), 50 ㎕의 IFN-γ 포획 항체를 10 mL 멸균 PBS 중에서 희석하고, 100 ㎕의 희석된 항체를 96 웰 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다.
다음날 (0일째), 항체 용액을 폐기하고, 플레이트를 완전 T 세포 배지로 세척하고, 각 웰을 (10% FBS를 함유하는) 완전 T 세포 배지 (TCM)로 충전시켜 실온에서 적어도 2시간 동안 플레이트를 차단한다. 2시간 후, 차단 완충제를 폐기한다.
마우스 10마리를 희생시키고, 그의 비장을 수거한다. 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 비장을 프로세싱하고, 비장당 1 mL ACK 용해 완충제를 사용하여 적혈구를 용해시킨다. 몇분이 경과한 후, 완전 배지를 첨가하고, 혼합물을 스핀 다운시키고, 5 x 106개의 세포/mL 농도의 단일 세포 현탁액으로서 재현탁시킨다. 나이브 마우스를 희생시키고, 비장세포를 수거하고, 동일한 방식으로서 재현탁시킨다. 나이브 비장세포 중 절반을 항원 제시 세포로서 작용하도로고 30분 동안 방사선 조사하고 (3,000 rad), 나머지 절반은 대조군으로서 사용하기 위해 저장한다. 방사선 조사 후, 세포를 10 x 106개의 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다.
완전 T 세포 배지 중의 각 마우스로부터의 비장세포를 ELISPOT 플레이트의 각 열에 100 ㎕ TCM 중 500,000개의 세포로 시딩한다. 방사선 조사를 받은 비장세포를 3개 군으로 나눈다: 제1군은 어떤 펩티드도 받지 않고 (음성 대조군), 제2군은 5 ㎍/mL의 펩티드 M27로 펄싱되고, 제3군은 5 ㎍/mL의 M30으로 펄싱된다. 각 조건에 대하여 이중으로 상기 방사선 조사를 받은 비장세포를 100 ㎕ TCM 중 1,000,000개의 세포인 농도로 각 마우스의 비장세포에 상응하는 웰에 첨가한다. 양성 대조군으로서 각 마우스에 대한 한 웰을 최종 농도 5 ㎍/mL의 콘카나발린 A (Con A)로 자극시킨다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 2일 동안 인큐베이션시킨다.
2일 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트의 내용물을 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕ 탈이온수 (DI)로 2회에 걸쳐 세척한다. 물로 2회 세척한 후, 웰을 200 ㎕의, PBS 중 0.05% 트윈 (PBS-T)으로 3회에 걸쳐 세척한다. 세척 후, 40 ㎕의 비오티닐화된 IFN-γ 검출 항체를 PBS 중 10% FBS 10 mL에서 희석하고, 100 ㎕의 희석된 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다.
2시간 후, 항체 용액을 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의 PBS-T로 3회에 걸쳐 세척한다. 세척 후, 100 ㎕의 스트렙타비딘-HRP를 PBS 중 10% FBS 9.9 mL에서 희석한다. 100 ㎕의 효소 접합체 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다.
1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 효소 접합체 용액을 폐기하고, 플레이트를 200 ㎕의, PBS 중 0.05% 트윈 (PBS-T)으로 4회에 걸쳐 세척한다. 4회째 세척 후, 플레이트를 200 ㎕의 PBS (트윈 비포함)로 2회에 걸쳐 세척한다. AEC 크로모겐 10 방울을 10 mL AEC 기질로 희석하여 현상액 최종 기질 용액을 제조한다. 100　㎕의 최종 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, (과도하게 현상되지 않도록 하면서, 스폿이 출현할 때까지) 약 20분 동안 계속해서 반응이 일어나도록 한다. 반응을 정지시키기 위해 웰을 DI 수로 수회에 걸쳐 세척한다. 세척 후, 플레이트를 완전히 건조시키고, 암실에서 밤새도록 건조시킨다. 다음날, 플레이트를 CTL 이뮤노스폿 S6 마크로애널라이저(CTL ImmunoSpot S6 MacroAnalyzer) 플레이트 판독기 (셀룰라 테크놀러지 리미티드(Cellular Technology Limited)) 및 연관된 소프트웨어 면역스폿 5.1.36을 사용하여 분석한다.
실시예 12: B16.F10 흑색종에서 추가의 ASV 조성물의 종양-보호 활성
B16.F10 흑색종 중의 18개의 예측된 신생-에피토프를 함유하는 ASV 조성물의 치료학적 효능을 B16.F10 흑색종 마우스 모델에서 시험하였다. 18개의 펩티드를 긴 펩티드 (27mer) (하기 표 8)로서 합성하고, 재조합 인간 Hsc70 (rhHsc70)과 복합체를 형성시킨다. 이어서, 복합체를 생 B16.F10 종양 세포로 시험감염된 마우스에서 치료학적 효능에 대해 시험하였다. 면역원성 사정을 위해 종양을 보유하지 않는 C57BL/6 마우스로 이루어진 별개의 코호트는 18개의 펩티드 중 2개 (M27 및 M30; 하기 표 8 참조)와 복합체를 형성한 Hsc70으로 면역화시켰다.
Figure pct00019
물질 및 방법
i. B16.F10 종양 세포 배양 및 종양 시험감염:
저계대수의 (P7) B16.F10 세포 (ATCC)를 조직 배양물로부터 수거하고, 무혈청 PBS 중에서 세척하고, 5 x 105개의 세포/mL인 농도로 PBS 중에 재현탁시켰다. 3일 전 옆구리를 면도한 C57Bl/6 마우스의 면도 부위에 100 ㎕ 중 5x104개의 세포를 피하로 주사하였다.
ii. 합성 B16.F10 펩티드:
CS 바이오(CS Bio)에 의해 중앙부에 점 돌연변이가 있는 27mer로서 18개의 면역원성 B16.F10 종양 신생-에피토프를 합성하였다 (표 8). 펩티드를 분말 형태로 받았고, 이를 25 - 100 mg/ml 범위의 농도로 100% DMSO 중에 용해시켰다.
iii. 종양을 보유하는 마우스의 치료를 위한 오토신박스 백신 대용물의 조성:
B16.F10 펩티드의 냉동 스톡을 작업 농도로 PBS 중에 희석한 후, 동몰량의 18개의 펩티드 풀을 생성하였다. 펩티드 풀을 전체 펩티드:단백질 몰비 1:1로 rh-Hsc70과 혼합하였다. 따라서, 각각의 펩티드는 1/18:1 몰비로 제시되었다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 마우스에 주사할 때까지 얼음 상에 놓았다.
iv. 종양을 보유하지 않는 마우스에서의 면역원성 연구를 위한 Hsc70 -펩티드 복합체의 조성:
분취량의 rhHsc70을 각 M27 및 M30 B16.F10 펩티드와 펩티드:단백질 몰비 10:1로 혼합하여 종양을 보유하지 않는 마우스의 면역화에 사용되는 백신 물질을 제조하였다. 두 복합체를 별개로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 혼합하고, 마우스에 주사할 때까지 얼음 상에 놓았다.
v. 백신 투여 및 종양 성장 동력학적 성질 사정:
종양을 보유하는 마우스 (군당 n=11-12)를 주사 직전에 10 ㎍ QS-21 스티뮬론® 애주번트와 혼합된 30 또는 100 ㎍ (Hsc70의 양을 지칭) 오토신박스 백신으로 치료하였다. 음성 대조군으로서, 2개의 마우스 군은 비히클 (PBS) 또는 펩티드 부재하의 100 ㎍ Hsc70 및 10 ㎍ QS-21 스티뮬론®의 혼합물로 처리하였다. 양성 대조군으로서, 한 마우스 군을 50 ㎍ 폴리 (I:C) 애주번트와 혼합된, 고용량의 M22, M27, M30, M44, M48 및 M50 펩티드 (각각 50-100 ㎍씩)로 구성된 풀로 처리하였다. 종양 시험감염 후 3, 9 및 15일째 종양 정반대쪽 옆구리 상에 200 ㎕ 중에서 치료물을 피하로 투여하였다. 3-4주 동안에 걸쳐 매 2-3일마다 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 사정하고, 시간 함수로서 종양 부피를 플롯팅하였다. 종양 부피는 하기 공식을 사용하여 측정하였다: (L x [W2]) ÷ 2 (여기서, L은 종양의 장축 길이이고, W는 종양 너비이다).
종양을 보유하지 않는 마우스를 주사 직전에 10 ㎍ QS-21 스티뮬론® 애주번트와 혼합된 M27 펩티드 및 M30 펩티드와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70을 이용하여 1주 간격을 두고 2회에 걸쳐 면역화시켰다. 마우스 대조군은 (a) 펩티드 부재하에서 10 ㎍ QS-21 스티뮬론®과 혼합된 30 ㎍ Hsc70 또는 (b) 50 ㎍ 폴리 (I:C) 애주번트 중 각각의 두 펩티드 100 ㎍으로 면역화시켰다.
vi. 면역원성 사정:
종양을 보유하지 않는 마우스에서의 면역원성 연구를 위해, RBC 용해 후 비장세포로부터 단핵구 세포를 제조하고, 5 ㎍/ml의 각 펩티드의 존재하에 96 웰 플레이트의 웰당 5 x 105개의 세포로 시딩하였다. 양성 대조군으로서 비장세포를 최종 농도 5 ㎍/mL의 콘카나발린 A (Con A)로 자극시켰다. 배양물을 41시간 동안 인큐베이션시키고, ELISPOT 플레이트 판독기 (이뮤노스폿 2.0, 셀룰라 테크놀러지즈 리미티드(Cellular Technologies Limited))를 사용하여 IFN-γ 생산 T 세포를 계수하였다.
결과
종양 부피에 대한 유의적인 치료 대 시간 상호작용에 관한 선형 혼합 모델 검정을 사용하여 PBS 또는 펩티드 부재하의 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론®의 혼합물로 처리된 마우스와 비교하였을 때 (p<0.01), QS-21 스티뮬론® 애주번트와 혼합된 30 또는 100 ㎍ 오토신박스 백신을 이용한 치료는 B16.F10 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장을 유의적으로 지연시킨 것으로 관찰되었다 (도 9 및 10). 상기의 달성된 종양 성장 억제 정도는 폴리 (I:C) 애주번트와 함께 투여된 고용량의 6개의 펩티드 풀로 구성된 양성 대조군 (나타내지 않음)과 동일하였다. 폴리 (I:C)와 함께 투여된 50-100 ㎍의 각각의 6개의 펩티드와 비교하였을 때, 30 및 100 ㎍ 오토신박스 백신 군에는 단지 72 및 240 ng의 각각의 18개의 펩티드가 존재하는 바, 상기와 같은 관찰 결과는 상당한 효능으로 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론®이 후속되는 프로세싱 및 신생-에피토프 특이 T 세포에의 제시를 위해 펩티드를 항원 제시 세포에 전달하였다는 것을 입증하였다.
18개의 펩티드 중 5개, 즉, M22, M27, M44, M48, 및 M50을 함유하는 ASV 조성물을 합성하고, 상기 기술된 것과 유사한 연구에서 B16.F10 흑색종을 시험하였다. 18-펩티드 ASV 조성물과 유사하게, QS-21 스티뮬론® 애주번트와 함께 조합하여 투여되었을 때 5-펩티드 ASV 조성물 (30 또는 100 ㎍)은 PBS 또는 펩티드 부재하의 Hsc70 및 QS-21 스티뮬론®의 혼합물로 처리된 마우스와 비교하였을 때, B16.F10 종양을 보유하는 마우스에서 종양 성장을 저속화시켰다 (도 11 및 12).
종양을 보유하지 않는 마우스에서의 면역원성 사정을 위해, 2차 면역화 후 1주째에 Hsc70-M27/M30 B16.F10 펩티드 복합체 + QS-21 스티뮬론® 백신 군으로부터 마우스 3마리를 희생시켜 IFN-γ ELISPOT 검정법을 이용하여 펩티드에 대한 T 세포 반응이 검출될 수 있는지 여부를 검정하였다. 3마리의 마우스 중 2마리에서 유의적인 반응이 검출되었다 (도 13). 양성 대조군 백신 (폴리 (I:C) 애주번트 중 M27/M30 펩티드)에 대한 반응 또한 3마리의 마우스 중 2마리에서 관찰된 반면, 펩티드 부재하의 Hsc70/QS-21 스티뮬론®의 혼합물로 면역화된 마우스에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다 (나타내지 않음).
실시예 13: 크기 배제 크로마토그래피에 의한 Hsc70 -펩티드 복합체 형성에 관한 연구
시험관내에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 Hsc70-펩티드 복합체 형성을 조사하였다. Hsc70은 크기 배제 칼럼 상에서 2개의 주요 피크로 분해되는데, 한 피크는 그의 단량체 형태에 상응하고, 나머지 다른 한 피크는 올리고머 형태에 상응한다 (도 14). Hsc70은 펩티드 결합시 입체구조적으로 변화되고 (문헌 [Zhuravleva and Gierasch, P.N.A.S . 112[22]:E2865-73 [2015]]), 이로써, 펩티드 결합 형태에 상응하는 새 피크가 SEC 크로마토그램 상에 출현하게 된다 (도 15). 크로마토그램 상의 Hsc70 형태에 상응하는 각 피크의 표면적을 측정함으로써, 펩티드와 복합체를 형성하는 Hsc70의 비율(%)을 측정할 수 있다. Hsc70 및 시험 펩티드를 Hsc70/펩티드 몰비 1:4, 1:10, 1:20, 및 1:50으로 조합한 후, 이어서, SEC에 의해 생성된 혼합물을 분해하여 복합체 형성 정도를 측정함으로써 Hsc70 대 펩티드의 몰비가 Hsc70-펩티드 복합체 형성에 미치는 효과를 측정하였다. 본 실험에서 사용된 펩티드는 문헌 [Kreiter et al., Nature 520(7549):692-6 (2015)]에 기술된 바와 같은 (또는 실시예 9-11에 기술된), B16-F10 흑색종-특이적 돌연변이를 함유하는 면역원성 펩티드 B16-M27 ("M27")이었다. 마우스에서 고도의 면역원성을 띠는 아미노산 서열 SIINFEKL (서열번호 448) (문헌 [Zehn et al, Nature 458:211-214 [12 March, 2009]])을 가지는 닭 오브알부민 펩티드에 고친화성 Hsc70-결합 펩티드 서열을 첨부하는 것이 복합체 형성에 미치는 효과도 시험하였다. 고친화성 Hsc70 결합 서열, NLLRLTG (서열번호 439)을 오브알부민 펩티드의 C- 또는 N-말단에 첨부하고, 미국 특허 번호 7,309,491에 개시된 바와 같이, 서열 FFRK (서열번호 447)를 가지는 링커에 의해 오브알부민 펩티드에 연결하였다.
물질 및 방법:
최종 부피 50 ㎕의 20 mM HEPES 및 200 mM KCL을 함유하는 반응 완충제 중 7 μM의 재조합 인간 Hsc70 (진뱅크 수탁 번호 P11142.1) (바이오메이 아게)을 이용하여 표준 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 반응물을 37℃에서 1 또는 2시간 동안 인큐베이션시키고, 2 min 동안 13,000 RPM으로 원심분리하였다. 반응 생성물 (10 ㎍)을 TSK겔 슈퍼SW3000(TSKgel SuperSW3000), 4 ㎛ 입자 크기, 25 nm 공극 크기 겔 여과 크로마토그래피 칼럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)) 상에서 분해하였다. 펩티드를 함유하는 반응물을 위해, 펩티드를 Hsc70:펩티드 몰비 1:4, 1:10, 1:20, 및 1:50으로 반응 혼합물에 포함시켰다. 적절한 피크의 표면적을 측정함으로써 각 반응 혼합물 중 펩티드와 복합체를 형성한 Hsc70의 비율(%)을 산출하였다.
결과:
도 16에 제시된 바와 같이, M27 펩티드과 복합체를 형성한 Hsc70의 비율(%)은 M27 펩티드 대 Hsc70의 몰비가 증가함에 따라 증가하였다. Hsc70:펩티드 몰비가 1:4일 때에는 오직 20%의 Hsc70만이 M27 펩티드에 결합한 반면, 비가 1:10일 때에는 대략 40%의 Hsc70이 복합체를 형성한다. 복합체를 형성한 Hsc70의 비율은 추가로 Hsc70:펩티드 몰비 1:20 (대략 50%) 및 1:50 (대략 65%)에서도 점진적으로 증가하였다 (도　17). 인큐베이션 시간을 2시간에서 3시간으로 연장시켰을 때, 복합체 형성은 단지 소량 증가한 것이 관찰되었다 (도 18).
Hsc70과, 링커 FFRK (서열번호 447)를 통해 그의 C-말단에 융합된 고친화성 Hsc70 결합 펩티드 서열 NLLRLTG (서열번호 439)를 가지는 오브알부민 펩티드 SIINFEKL (서열번호 448) 사이의 복합체 형성을 분석하였을 때, 90% 초과의 Hsc70이 펩테드와 복합체를 형성하였다 (도 19; Hsc70:펩티드 몰비 1:10으로 시험됨; 전장의 펩티드 서열은 SIINFEKLFFRKNLLRLTG (서열번호 449)이다). 두 경우 모두에서 링커 FFRK (서열번호 447)를 통해 연결된, 오브알부민 펩티드의 N- 및 C-말단에 고친화성 Hsc70 결합 서열을 배치하였을 때의 유사 효과도 시험하였다. N-말단과 비교하였을 때, C-말단에 NLLRLTG (서열번호 439)가 배치되었을 때, 복합체 형성 정도는 유의적으로 더 컸다 (Hsc70:펩티드 몰비가 1:2인 반응 혼합물의 크로마토그램을 보여주는 도 20; 비가 1:5일 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다). C-말단 고친화성 Hsc70 결합 서열을 포함하는 시험 펩티드의 서열은 SIINFEKLFFRKNLLRLTG (서열번호 449)이고, N-말단 고친화성 Hsc70 결합 서열을 포함하는 시험 펩티드의 서열은 NLLRLTGFFRKSIINFEKL (서열번호 450)이었다.
실시예 14: 고친화성 Hsc70 결합 펩티드 서열을 함유하는 ASV 조성물
본 실시예에서는 고친화성 Hsc70 결합 서열에 연결된 항원성 펩티드를 함유하는 ASV 조성물을 생성하였다.
물질 및 방법
i. B16.F10 종양 신생- 에피토프 및 고친화성 Hsc70 결합 펩티드를 포함하는 그의 변형:
B16.F10 흑색종 세포주의 종양 신생-에피토프를 나타내는 것으로서, 대안적으로는, 그의 C-말단에의 링커 서열 FFRK (서열번호 447) 및 고친화성 Hsc70 결합 펩티드 NLLRLTG (서열번호 439)의 부가로 변형된 것인, 하기 4개의 펩티드를 95% 순도로 합성하였다 (보스톤 오픈 랩스(Boston Open Labs: 미국 매사추세츠주 케임브리지):
M27: REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD (서열번호 458)
M30: PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL (서열번호 461)
M27-Jav: REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDFFRKNLLRLTG (서열번호 469)
M30-Jav: PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLFFRKNLLRLTG (서열번호 470).
ii. Hsc70 -M27/M30 펩티드 복합체 생성:
상기 열거된 펩티드를 개별적으로 37℃에서 1시간 동안 Hsc70과 인큐베이션시켜 비공유 Hsc70-펩티드 복합체를 형성하였다. M27 및 M30의 경우, 펩티드를 20:1 몰 과량 (펩티드:Hsc70)으로 Hsc70에 첨가한 반면, M27-Jav 및 M30-Jav의 경우, 펩티드를 4:1 몰 과량으로 첨가하였다. 인큐베이션 후, 혼합물을 4℃에서 PBS 중에서 10배로 희석하고, 30 kDa MW 컷 오프 밀리포어(Millipore)® 아미콘(Amicon)® 원심분리 필터를 사용하여 농축시킴으로써 Hsc70-펩티드 복합체를 복합체를 형성하지 않은, 유리 펩티드로부터 분리하였다. 유지된 복합체 Hsc70-M27 및 Hsc70-M30을 풀링한 후, 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하여 펩티드가 로딩된 Hsc70 분자의 비율을 정량화하였다. 사십 삼 퍼센트 (43%)의 Hsc70 분자에 M27/M30 펩티드가 로딩된 것으로 관찰되었다. Hsc70-M27-Jav 및 Hsc70-M30-Jav 복합체에 대해서도 동일하게 풀링, 여과 및 SEC 분석 단계를 수행한 결과, 73%의 Hsc70 분자에 펩티드가 로딩된 것으로 관찰되었다.
iii. 백신 투여 및 면역원성 사정:
C57Bl/6 마우스 (n=10/군)의 면도한 옆구리에 5x104개의 B16.F10 종양 세포를 피하로 접종하고, 종양 시험감염 후 3, 9 및 15일째 하기 백신 물질로 처리하였다:
1군: 5 ㎍ QS-21 스티뮬론® + 5 ㎍ MPL (인비보겐(InvivoGen: 미국 캘리포니아주 샌디에고)) 애주번트와 혼합된 100 ㎍ M27 + 100 ㎍ M30
2군: M27-Jav/M30-Jav와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70
3군: 5 ㎍ QS-21 스티뮬론® + 5 ㎍ MPL 애주번트와 혼합된, M27-Jav/M30-Jav와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70
4군: M27/M30과 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70
5군: 2.6 ㎍ M27-Jav/M30-Jav (1.3 ㎍ 각각의 펩티드).
종양 시험감염 후 22일째, 백신 면역원성 사정을 위해 각각의 상기 5개 군으로부터 마우스 3마리씩 안락사시키고, 비장세포를 수거하였다. 면역원성 연구에서의 음성 대조군으로서 나이브 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포 또한 수거하였다.
면역원성 연구를 위해, RBC 용해 후 비장세포로부터 단핵구 세포를 제조하고, 5 ㎍/ml의 하기의 각 펩티드의 존재하에 96 웰 플레이트의 웰당 5 x 105개의 세포로 시딩하였다.
M27: REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD (서열번호 458)
M30: PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL (서열번호 461)
야생형 M27: REGVELCPGNKYETRRHGTTHSLVIHD (서열번호 471)
야생형 M30: PSKPSFQEFVDWEKVSPELNSTDQPFL (서열번호 472).
양성 대조군으로서 비장세포를 최종 농도 10 ㎍/mL의 콘카나발린 A (Con A)로 자극시켰다. 배양물을 41시간 동안 인큐베이션시키고, ELISPOT 플레이트 판독기 (이뮤노스폿 2.0, 셀룰라 테크놀러지즈 리미티드)를 사용하여 IFN-γ 생산 T 세포를 계수하였다.
결과
도 21에 제시된 바와 같이, M27-Jav/M30-Jav와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70 (2군)으로 면역화된 마우스로부터 단리된 비장세포는 14번 위치에 야생형 잔기를 함유하는 동일 펩티드에의 노출시와 비교하였을 때, 돌연변이체 M27 및 M30 펩티드의 혼합물에의 노출시 유의적으로 더 많은 IFN-γ를 분비하였다 (이원 ANOVA에 의해 p 값 <.05). 상기 Hsc70-펩티드 복합체에의 QS-21 스티뮬론® 및 MPL 애주번트 첨가 (3군)가 반응을 증강시키지는 못했다 (나타내지 않음). QS-21 스티뮬론®/MPL 애주번트 존재하의 고용량의 M27 및 M30 돌연변이체 펩티드 (1군)로 면역화시켰을 때, 유의적인 IFN-γ 생산이 유도되었다 (나타내지 않음).
M27-Jav/M30-Jav와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70 (2군)으로 면역화되고, 돌연변이체 M27 및 M30 펩티드로 자극받은 마우스의 비장세포에 의한 IFN-γ 분비가, 고친화성 HSP70 결합 서열을 함유하지 않으며, M27/M30 펩티드와 복합체를 형성한 30 ㎍ Hsc70 (4군)으로 면역화된 마우스의 비장세포의 반응보다 유의적으로 더 컸다 (이원 ANOVA에 의해 p 값 <0.05). 본 데이터는 고친화성 Hsc70 결합 도메인이 없는, Hsc70 및 종양 신생-에피토프의 복합체와 비교하여, 상기 고친화성 Hsc70 결합 도메인을 함유하는 Hsc70 및 종양 신생-에피토프의 복합체의 면역원성이 증강되어 있다는 것을 입증한다.
Hsc70 부재하의 M27-Jav 및 M30-Jav 펩티드 (5군)로 면역화된 마우스에서 최소의 IFN-γ 분비가 관찰되었다. 유사하게, M27/M30 돌연변이체 또는 야생형 펩티드에 노출된 나이브 (면역화되지 않은) 마우스의 비장세포로부터는 IFN-γ 분비가 관찰되지 않았다.
본 연구에서 고친화성 Hsc70 결합 도메인을 함유하지 않는, Hsc70 및 the M27/M30 펩티드 사이의 복합체는 항원 특이 면역반응을 유도하지 않은 반면 (도 21), 상기 복합체는 선행 실험에서는 유도하였다는 점은 (도 13) 주목할 만하다. 어느 이론으로도 제한됨 없이, 상기와 같은 차이는 QS-21 스티뮬론® 애주번트가 본 현행 실험에서는 존재하지 않았지만, 선행 실험에서는 존재하였다는 것으로 설명될 수 있다.
실시예 15: 포스포펩티드 에피토프를 함유하는 ASV 조성물
인산화된 세린 잔기를 함유하는 4개의 펩티드 (하기 표 9)를 95% 순도로 합성하였다 (진스크립트(GenScript: 미국 매사추세츠주 케임브리지)). 펩티드는 그의 C-말단 또는 N-말단에의 링커 서열 FFRK (서열번호 447) 및 고친화성 HSP 결합 펩티드 서열 NLLRLTG (서열번호 439)의 부가로 변형된, CDC25 또는 IRS-2 항원의 HLA-A*02:01 결합 에피토프를 포함한다. 상기 펩티드를 개별적으로 37℃에서 1시간 동안 Hsc70과 4:1 몰 과량 (펩티드:Hsc70)으로 인큐베이션시켜 비공유 Hsc70-펩티드 복합체를 형성하였다. 인큐베이션 후, 복합체를 SEC에 의해 분석하여 펩티드가 로딩된 Hsc70 분자의 비율을 정량화하였다. 본 결과는 하기 표 9에 제시되어 있다.
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본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시양태에 의해 범주를 제한하고자 하지 않는다. 사실상, 기술된 것 이외에도, 본 발명의 다양한 변형은 상기 기술내용 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 그러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> AGENUS INC. <120> VACCINES FOR TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER <130> IPA171179-US <150> 62/161,053 <151> 2015-05-13 <150> 62/205,591 <151> 2015-08-14 <150> 62/257,458 <151> 2015-11-19 <150> 62/307,592 <151> 2016-03-14 <160> 478 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Leu Leu Asp Tyr Ser Val Pro Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Leu Ala Glu Val Pro His Arg Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Leu Leu Ser Lys Tyr Val Pro Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Leu Ser Thr Ser Val Pro Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Leu Gly Glu His Ile Ile Glu Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Leu Phe Glu Phe Leu Phe Leu Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Leu Leu Asp Ile Ser Phe Phe Ala 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asn Leu Trp Gln 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413 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 413 Tyr Arg Arg Ser Gln Ile Ser Met Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gln Arg 1 5 10 15 Thr Leu Phe Ser Thr Glu Glu Glu Pro Ser Lys Leu Leu Val Gln 20 25 30 <210> 414 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 414 Tyr Ala Ile Ile Ser Thr Ser Pro Ser Asn Ala Ala Ala Met Ala Ser 1 5 10 15 Ser Thr Ala Val Ser Val Val Ser Asp Ser Ile Lys Val Gln Pro 20 25 30 <210> 415 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 415 Thr Ser Val Val Val Lys Ser Ile Pro Ala Ser Ser Pro Gly Ala Val 1 5 10 15 Thr His Ile Met Gln Gln Ala Leu Ser Ser His Thr Ala Phe Thr 20 25 30 <210> 416 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 416 Gly Ser Leu Val Arg Val Ile Gln Arg Ala Gly Leu Val Phe Pro Lys 1 5 10 15 Met Glu Ala Tyr Ala Val Ser Pro Gly Arg Met Arg Gln Phe Asp 20 25 30 <210> 417 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 417 Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg His 1 5 10 15 Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro 20 25 30 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25 30 <210> 423 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 423 Val Thr Met Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Ile Gly Lys Leu Thr Ile 1 5 10 15 Leu Gln Leu Gln His Leu Phe Met Ile Leu Ala Ser Pro Arg Tyr 20 25 30 <210> 424 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 424 Leu Val Glu Asp Pro Glu Arg Pro Ala Cys Ala Pro Ala Ala Pro Cys 1 5 10 15 Leu Gln Met His His Val Ala Gln Val Leu Arg Glu Leu Leu Gly 20 25 30 <210> 425 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 425 Leu Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Glu Ala Val Asp Ile Ser Ser Lys Cys 1 5 10 15 Met Met Lys Glu Val Leu Ser Thr Gly Gln Gly Asn Thr Glu Val 20 25 30 <210> 426 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 426 Pro Asn Met Asp Tyr Lys Asn Gly Glu His His Ser Pro Ser His Val 1 5 10 15 Ile His Asn Tyr Ser Ala Ala Pro Gly Met Phe Asn Ser Ser Leu 20 25 30 <210> 427 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 427 Val Val Lys Leu Arg Asn Ala Gly His Ala Cys Tyr Leu His Lys Pro 1 5 10 15 Gln His Phe His Leu Val Leu Leu Ala Phe Leu Asp His Leu 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Thr Tyr 20 25 30 <210> 433 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 433 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Asn 1 5 10 15 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr 20 25 30 <210> 434 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 434 Lys Glu Asn Leu Glu Ala Leu Gln Arg Pro Thr Leu Leu His Leu Thr 1 5 10 15 His Gly Lys Val Lys Glu Phe Tyr Ser Tyr Gln Asn Glu Ala Val 20 25 30 <210> 435 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 435 Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Glu 1 5 10 15 Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln 20 25 30 <210> 436 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 436 Glu Gln Thr Glu Lys Glu Cys Leu Asn Gln Leu Ala Arg Val Thr Pro 1 5 10 15 Met Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Leu Gln Leu Lys Ala Ala Val 20 25 30 <210> 437 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 437 Lys Ala Phe Thr Arg Val Asn Tyr Leu Thr Gln His Gln Lys Ile Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Glu Lys Pro His Glu Cys Lys Glu Cys Gly Lys Ala Phe 20 25 30 <210> 438 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 438 Arg Ala Val Ala Ser Gly Val Lys Ala Arg Arg Pro Ser Val Thr Pro 1 5 10 15 Leu Val Trp Asp Asp Met Val Arg Asp Leu Pro Glu Asp Gln Leu 20 25 30 <210> 439 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 439 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly 1 5 <210> 440 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 440 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Trp 1 5 <210> 441 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 441 His Trp Asp Phe Ala Trp Pro Trp 1 5 <210> 442 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 442 His Trp Asp Phe Ala Trp Pro 1 5 <210> 443 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 443 Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr Trp 1 5 <210> 444 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 444 Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr 1 5 <210> 445 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 445 Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Trp 1 5 <210> 446 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 446 Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg 1 5 <210> 447 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 447 Phe Phe Arg Lys 1 <210> 448 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 448 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 449 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 449 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Phe Phe Arg Lys Asn Leu Leu Arg 1 5 10 15 Leu Thr Gly <210> 450 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 450 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Phe Phe Arg Lys Ser Ile Ile Asn Phe 1 5 10 15 Glu Lys Leu <210> 451 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M5 <400> 451 Phe Val Val Lys Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe Ala Phe Thr 1 5 10 15 Ala Asp Leu Arg Ser Asn Thr Gly Gly Gln Ala 20 25 <210> 452 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M12 <400> 452 Thr Pro Pro Pro Glu Glu Ala Met Pro Phe Glu Phe Asn Gly Pro Ala 1 5 10 15 Gln Gly Asp His Ser Gln Pro Pro Leu Gln Val 20 25 <210> 453 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M17 <400> 453 Val Val Asp Arg Asn Pro Gln Phe Leu Asp Pro Val Leu Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser 20 25 <210> 454 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M20 <400> 454 Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Met Asp 1 5 10 15 Glu Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met 20 25 <210> 455 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M22 <400> 455 Pro Lys Pro Asp Phe Ser Gln Leu Gln Arg Asn Ile Leu Pro Ser Asn 1 5 10 15 Pro Arg Val Thr Arg Phe His Ile Asn Trp Asp 20 25 <210> 456 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M24 <400> 456 Thr Ala Val Ile Thr Pro Pro Thr Thr Thr Thr Lys Lys Ala Arg Val 1 5 10 15 Ser Thr Pro Lys Pro Ala Thr Pro Ser Thr Asp 20 25 <210> 457 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M25 <400> 457 Ser Thr Ala Asn Tyr Asn Thr Ser His Leu Asn Asn Asp Val Trp Gln 1 5 10 15 Ile Phe Glu Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Lys 20 25 <210> 458 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M27 <400> 458 Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg 1 5 10 15 His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp 20 25 <210> 459 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M28 <400> 459 Asn Ile Glu Gly Ile Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Lys Pro Phe Leu 1 5 10 15 Val Asn Asn Lys Ile Asn Lys Ile Glu Asn Ile 20 25 <210> 460 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M29 <400> 460 Ile Pro Ser Gly Thr Thr Ile Leu Asn Cys Phe His Asp Val Leu Ser 1 5 10 15 Gly Lys Leu Ser Gly Gly Ser Pro Gly Val Pro 20 25 <210> 461 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M30 <400> 461 Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser 1 5 10 15 Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu 20 25 <210> 462 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M36 <400> 462 Cys Gly Thr Ala Phe Phe Ile Asn Phe Ile Ala Ile Tyr His His Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ala Ile Pro Phe Gly Thr Met Val Ala 20 25 <210> 463 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M44 <400> 463 Glu Phe Lys His Ile Lys Ala Phe Asp Arg Thr Phe Ala Asn Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro Met Val Val Phe Ala Thr Pro Gly Met 20 25 <210> 464 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M45 <400> 464 Glu Cys Arg Ile Thr Ser Asn Phe Val Ile Pro Ser Glu Tyr Trp Val 1 5 10 15 Glu Glu Lys Glu Glu Lys Gln Lys Leu Ile Gln 20 25 <210> 465 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M46 <400> 465 Asn His Ser Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Val Met Ser 1 5 10 15 Arg Glu Thr Thr Asp Thr Asp Thr Ala Asp Gln 20 25 <210> 466 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M47 <400> 466 Gly Arg Gly His Leu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Ile Val Gly Lys Gln 1 5 10 15 Val Leu Leu Gly Arg Lys Val Val Val Val Arg 20 25 <210> 467 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M48 <400> 467 Ser His Cys His Trp Asn Asp Leu Ala Val Ile Pro Ala Gly Val Val 1 5 10 15 His Asn Trp Asp Phe Glu Pro Arg Lys Val Ser 20 25 <210> 468 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M50 <400> 468 Gly Phe Ser Gln Pro Leu Arg Arg Leu Val Leu His Val Val Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ala Glu Arg Leu Ala Arg Ala Glu Glu 20 25 <210> 469 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M27-Jay <400> 469 Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg 1 5 10 15 His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp Phe Phe Arg Lys Asn 20 25 30 Leu Leu Arg Leu Thr Gly 35 <210> 470 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M30-Jay <400> 470 Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser 1 5 10 15 Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu Phe Phe Arg Lys Asn 20 25 30 Leu Leu Arg Leu Thr Gly 35 <210> 471 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild Type M27 <400> 471 Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Thr Arg Arg 1 5 10 15 His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp 20 25 <210> 472 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type M30 <400> 472 Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Lys Val Ser 1 5 10 15 Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu 20 25 <210> 473 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing phosphorylated serine residue <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Phosphorylated Serine <400> 473 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Phe Phe Arg Lys Gly Leu Leu Gly Ser 1 5 10 15 Pro Val Arg Ala 20 <210> 474 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing phosphorylated serine residue <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Phosphorylated Serine residue <400> 474 Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Phe Phe Arg Lys Asn Leu Leu 1 5 10 15 Arg Leu Thr Gly 20 <210> 475 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing phosphorylated serine residue <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Phosphorylated serine residue <400> 475 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Phe Phe Arg Lys Arg Val Ala Ser Pro 1 5 10 15 Thr Ser Gly Val 20 <210> 476 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide containing phosphorylated serine residue <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phosphorylated serine residue <400> 476 Arg Val Ala Ser Pro Thr Ser Gly Val Phe Phe Arg Lys Asn Leu Leu 1 5 10 15 Arg Leu Thr Gly 20 <210> 477 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 477 Phe Phe Arg Lys Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly 1 5 10 <210> 478 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 478 Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Phe Phe Arg Lys 1 5 10

Claims (147)

  1. 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제1 조성물로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하고, 여기서, 조성물은 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 5개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인, 제1 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 500 nM 이하의 IC50으로 MHC 분자에 결합하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 500 nM 이하의 IC50으로 MHC I 분자에 결합하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 1,000 nM 이하의 IC50으로 MHC II 분자에 결합하는 것인 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 분자가 인간 MHC 분자인 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 암 세포로부터의 1개 초과의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 500 nM 미만의 IC50으로 1개 초과의 상이한 MHC 분자에 결합하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프가 각각 단일 대상체의 암 세포에서는 발현되지만, 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 대상체의 정상 세포와 비교하여 대상체의 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 아미노산 돌연변이 또는 유전자 융합 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 아미노산 치환, 결실 또는 삽입인 것인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 아미노산 돌연변이가 0.05 초과의 대립유전자 빈도로 대상체의 종양에 존재하는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 변형된 아미노산을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 변형된 아미노산이 측쇄 히드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His인 것인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 변형된 아미노산이 측쇄 히드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His 아미노산의 모방체인 것인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 같은 적응증의 다중의 암들 간의 백만개의 맵핑된 리드당 킬로베이스의 전사체당 리드(Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads: RPKM)가 1 초과인 중앙 발현 수준을 가지는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프가 각각 같은 적응증의 다중의 암들 간의 백만개의 맵핑된 리드당 킬로베이스의 전사체당 리드 (RPKM)가 5 초과인 중앙 발현 수준을 가지는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 적어도 하나가 대상체의 종양에서 정규화된 돌연변이 함유 리드 계수(Normalized Mutation-containing Read Counts: NMRC)가 10 초과인 발현 수준을 가지는 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프가 각각 대상체의 종양에서 NMRC가 50 초과인 발현 수준을 가지는 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 항원성 펩티드를 투여받은 대상체에서 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 T-세포 반응을 자극시키는 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 항원성 펩티드를 투여받은 대상체에서 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 T-세포 반응을 자극시키는 것인 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도하는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 단백질의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 각각의 길이가 5 내지 50개의 아미노산인 것인 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 각각의 길이가 25 내지 40개의 아미노산인 것인 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 각각의 길이가 27 내지 31개의 아미노산인 것인 조성물.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 각각의 길이가 21-31개의 아미노산인 것인 조성물.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 아미노산 서열의 대략 중간에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 27개의 아미노산 길이이고, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 29개의 아미노산 길이이고, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 31개의 아미노산 길이이고, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 화학적으로 합성된 펩티드인 것인 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 각각 열 충격 단백질 결합 서열을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 열 충격 단백질 결합 서열이 항원성 펩티드의 N- 또는 C-말단에 위치하는 것인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 열 충격 단백질 결합 서열이 항원성 펩티드의 C-말단에 위치하는 것인 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 열 충격 단백질 결합 서열이 펩티드 링커를 통해 항원성 펩티드의 나머지 부분에 연결되어 있는 것인 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 펩티드 링커가 서열번호 447의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 열 충격 단백질 결합 서열이 서열번호 439-446으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 열 충격 단백질 결합 서열이 서열번호 439인 것인 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 열 충격 결합 서열이 항원성 펩티드의 C-말단에 위치하는 것인 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 C-말단에 서열번호 477의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  46. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가
    i) 종양-특이 돌연변이를 포함하는 제1 부분, 및
    ii) 열 충격 단백질 결합 서열, 및 임의적으로 펩티드 링커를 포함하는 제2 부분을 포함하는 것인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 제1 부분의 길이가 27-31개의 아미노산인 것인 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 제1 부분의 길이가 27개의 아미노산인 것인 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 제1 부분의 길이가 29개의 아미노산인 것인 조성물.
  50. 제46항에 있어서, 제1 부분의 길이가 31개의 아미노산인 것인 조성물.
  51. 제47항에 있어서, 제1 부분이 제1 부분의 아미노산 서열의 대략 중간에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 제1 부분의 길이가 27개의 아미노산 길이이고, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 제1 부분의 길이가 29개의 아미노산 길이이고, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  54. 제51항에 있어서, 제1 부분의 길이가 31개의 아미노산 길이이고, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19번 위치에 종양-특이 돌연변이를 가지는 것인 조성물.
  55. 제51항에 있어서, 제2 부분이 서열번호 439-446, 447, 477, 및 478로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  56. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 38개의 아미노산인 것인 조성물.
  57. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 40개의 아미노산인 것인 조성물.
  58. 제37항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나의 길이가 42개의 아미노산인 것인 조성물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 적어도 10개의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 각 복합체 중 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비가 적어도 1:1인 것인 조성물.
  61. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 각 복합체 중 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비가 1:1 이하인 것인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 각 복합체 중 스트레스 단백질 대 항원성 펩티드의 몰비가 1:2, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 이하인 것인 조성물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 MYC, K-RAS, N-RAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, 또는 APC의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 서열번호 1-478로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 재조합 스트레스 단백질인 것인 조성물.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsc70인 것인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 스트레스 단백질이 인간 hsc70인 것인 조성물.
  69. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsp70인 것인 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 스트레스 단백질이 인간 hsp70인 것인 조성물.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 항원성 펩티드에 비공유적으로 결합되어 있는 것인 조성물.
  72. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 단백질이 항원성 펩티드에 공유적으로 결합되어 있는 것인 조성물.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양이 10 ㎍ 내지 600 ㎍인 것인 조성물.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 스트레스 단백질의 양이 25 ㎍인 것인 조성물.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여 시, 각각의 복합체가 대상체에서 세포 표면 상의 MHC 분자에 의해 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 제시하는 것을 달성할 수 있는 것인 조성물.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  77. 제49항에 있어서, 애주번트가 사포닌 또는 면역자극성 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  78. 제49항에 있어서, 애주번트가 QS-21을 포함하는 것인 조성물.
  79. 제51항에 있어서, 조성물 중 QS-21의 양이 10 ㎍, 25 ㎍, 또는 50 ㎍인 것인 조성물.
  80. 하기 단계를 포함하는, 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 항원성 펩티드를 제조하는 방법:
    (a) 대상체의 암 세포로부터의 게놈 DNA의 하나 이상의 엑솜의 서열을 결정하는 단계;
    (b) 참조 게놈 DNA와 비교 시, 돌연변이체 단백질을 코딩하는 하나 이상의 비-동의 돌연변이체 대립유전자를 엑솜으로부터 확인하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 암 세포에서 발현되는지 여부를 측정하는 단계;
    (d) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도를 측정하는 단계;
    (e) 대상체의 하나 이상의 MHC 유형을 측정하는 단계;
    (f) 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩된 돌연변이체 펩티드를 선별하는 단계로서,
    여기서, 돌연변이체 대립유전자는 0.05 초과의 대립유전자 빈도를 갖고, 대상체의 암 세포에서 발현되며,
    여기서, 돌연변이체 펩티드는 대상체에게 투여 시, 대상체의 MHC 분자 중 적어도 하나에 의해 제시될 수 있을 것으로 예상되는 것인 단계; 및
    (g) 단계 (f)에서 선별된 펩티드를 하나 이상 포함하는 하나 이상의 펩티드를 합성하여 암 세포로부터의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 항원성 펩티드를 제조하는 단계.
  81. 제80항에 있어서, 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자를 함유하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 암 세포에서 NMRC가 10 초과인 발현 수준을 가지는 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 다른 개체에서 같은 적응증의 암 세포에서 RPKM이 1 초과인 중앙 발현 수준을 가지는 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  84. 제81항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 돌연변이체 대립유전자가 대상체의 정상 세포에서는 발현되지 않는 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 결합 친화도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 결합 친화도가 컴퓨터 모델링에 의해 예측되는 것인 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 500 nM 미만인 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 부류 I 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 500 nM 미만인 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  89. 제80항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드의 대상체의 MHC 부류 II 분자 중 하나 이상의 것에 대한 IC50이 1,000 nM 미만인 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  90. 제80항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드는 특정 유형의 암의 특징이 되는 돌연변이체 대립유전자에 의해 코딩되는 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  91. 제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 펩티드 선별이 돌연변이체 펩티드가 유전자 융합 돌연변이, 또는 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이를 함유하는 것을 추가로 요구하는 것인 방법.
  92. 제80항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 돌연변이체 펩티드 중 예측된 MHC-결합 에피토프의 개수가 많을수록 순위는 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드 중에 존재하는 예측된 MHC-결합 에피토프의 개수;
    (ii) IC50이 낮을수록 순위는 더 높은 것인, 대상체의 MHC에의 결합에 대한 돌연변이체 펩티드의 IC50;
    (iii) 돌연변이체 펩티드의 야생형 등가물이 대상체의 정상 세포에서 발현되지 않는다면, 돌연변이체 펩티드 순위가 더 높은 것인, 대상체의 정상 세포 중의 돌연변이체 펩티드의 야생형 등가물의 발현의 존재 또는 부재;
    (iv) 안정성이 높을수록 순위가 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드의 C-말단의 대상체의 MHC에의 결합 안정성; 및/또는
    (v) 돌연변이체 펩티드인 것으로 예측되는, 프로테아좀에 대한 기질이 우수할수록 순위가 더 높은 것인, 돌연변이체 펩티드의 프로테아좀 분해의 예측 동역학에 기초하여, 단계 (f)에서 선별된 돌연변이체 펩티드를 순위화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 20개 이하의 최고 순위 펩티드가 단계 (g)에서 합성되는 것인 방법.
  94. 제80항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 DNA가 대상체로부터의 종양 샘플 또는 체액으로부터 단리된 것인 방법.
  95. 제80항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 DNA가 대상체로부터 수득된 엑소좀, 또는 순환 종양 세포로부터 단리된 것인 방법.
  96. 제80항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 DNA가 대상체로부터 수득된 순환 종양 세포 DNA인 것인 방법.
  97. 제80항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 엑솜의 서열이 차세대 서열분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  98. 제80항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 게놈 DNA가 대상체의 정상 세포로부터의 게놈 DNA이고, 여기서, 돌연변이체 대립유전자의 대립유전자 빈도는 단계 (d)에서 차세대 서열분석 리드 재맵핑에 의해 결정되는 것인 방법.
  99. 제80항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 비-동의 돌연변이체 대립유전자의 발현이 단계 (c)에서 대상체의 암 세포로부터 단리된 mRNA의 차세대 서열분석에 의해 결정되는 것인 방법.
  100. 제80항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 확인된 돌연변이체 대립유전자가 대상체에서 또는 적어도 1,000개의 게놈에서 발견되는 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)이 아닌 것인 방법.
  101. 제80항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 합성된 펩티드의 길이가 5 내지 50개의 아미노산인 것인 방법.
  102. 제80항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 합성된 펩티드의 길이가 25 내지 40개의 아미노산인 것인 방법.
  103. 제80항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 합성된 펩티드의 길이가 27 내지 31개의 아미노산인 것인 방법.
  104. 제80항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 다발성 골수종 또는 다형성 아교모세포종 세포인 것인 방법.
  105. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 하나 이상의 것이 제80항 내지 제104항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 제조된 것인 조성물.
  106. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 모두 제80항 내지 제104항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 제조된 것인 조성물.
  107. 암을 앓는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제79항, 제105항 또는 제106항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체에서 항원성 펩티드에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 방법.
  108. 암을 앓는 대상체에게 치료학상 유효량의 제1항 내지 제79항, 제105항 또는 제106항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 중 하나 이상의 것이 대상체 그 자신의 암 세포에 존재하는 것으로 확인된 것인 방법.
  110. 제107항 또는 제108항에 있어서, 돌연변이체 MHC-결합 에피토프 모두 대상체 그 자신의 암 세포에 존재하는 것으로 확인된 것인 방법.
  111. 제107항 또는 제108항에 있어서, 충분하지 않은 양의 종양 세포가 종양 세포로부터 적어도 약 65% 순도로 정제된 적어도 150 ㎍의 스트레스 단백질의 단리가 가능하도록 대상체로부터 이용가능한 것인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린, 그의 돌연변이체, 및 그의 둘 이상의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsc70인 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 스트레스 단백질이 인간 hsc70인 것인 방법.
  115. 제112항에 있어서, 스트레스 단백질이 hsp70인 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 스트레스 단백질인 인간 hsp70인 것인 방법.
  117. 제107항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 종양의 습식 중량이 6 g 이하인 것인 방법.
  118. 제107항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도하는 조성물의 능력이 대상체에게 조성물을 투여하기 이전에 측정되는 것인 방법.
  119. 제107항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 단리된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 T 세포의 시험관내 증식을 유도하는 조성물의 능력이 대상체에게 조성물을 투여한 이후에 측정되는 것인 방법.
  120. 제107항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 10 ㎍ 내지 600 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  121. 제107항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 25 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 투여되는 것인 방법.
  122. 제107항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 240 ㎍의 스트레스 단백질을 포함하는 단위 용량으로 투여되는 것인 방법.
  123. 제107항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 4주 동안 매주 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  124. 제107항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 4주간의 매주 투약 이후에, 적어도 2회분의 추가 용량의 조성물이 대상체에게 격주로 투여되는 것인 방법.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 총 적어도 6회분 용량의 조성물이 투여되는 것인 방법.
  126. 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 최종의 매주 또는 격주 투약 후 3개월째 부스터로서 추가로 투여되는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 조성물이 적어도 1년 동안 매 3개월마다 추가로 투여되는 것인 방법.
  128. 제107항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 레날리도마이드 (lenalidomide), 덱사메타손, 시클로포스파미드, 인터루킨-2, 코비메티닙 (cobimetinib), 다브라페닙 (dabrafenib), 다카르바진 (dacarbazine), 탈리모겐 라허파렙벡 (talimogene laherparepvec), 재조합 인터페론 알파-2b, 페그인터페론 알파-2b (peginterfereon alfa-2b), 트라메티닙 (trametinib), 또는 베무라페닙 (vemurafenib)을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  129. 제107항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  130. 제129항에 있어서, 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제가 4-아미노-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N'-히드록시-1,2,5-옥사디아졸-3-카르복시미다미드를 포함하는 것인 방법.
  131. 제107항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 체크포인트 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  132. 제131항에 있어서, 체크포인트 항체가 항-GITR, 항-OX40, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 항-TIM-3, 및 항-LAG-3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  133. 제107항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 항원성 펩티드에 결합된 정제된 스트레스 단백질의 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계로서, 여기서, 복합체는 각각 상이한 항원성 펩티드를 포함하고, 여기서, 상이한 항원성 펩티드는 각각 대상체의 암과 동일한 유형의 암에서 빈번하게 발견되는 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  134. 제133항에 있어서, 제2 조성물이 적어도 5개의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 제2 조성물 중의 스트레스 단백질이 재조합 스트레스 단백질인 것인 방법.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물 중의 항원성 펩티드가 각각 화학적으로 합성된 펩티드인 것인 방법.
  137. 제133항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는, 5개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  138. 제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 오직 야생형 MHC-결합 에피토프만을 함유하는 항원성 펩티드는 포함하지 않는 것인 방법.
  139. 제133항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 100개 이하의 상이한 항원성 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  140. 제133항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물이 제2 조성물과 동시에 투여되는 것인 방법.
  141. 제133항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물이 제2 조성물과 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  142. 제133항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물이 제1 조성물 투여 이전에 투여되는 것인 방법.
  143. 제107항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드 중 적어도 하나가 MYC, K-RAS, N-RAS, TP53, KDM6A, NPM1, H-RAS, FGFR3, MSH6, TP53, EGFR, PIK3CA, ABL1, CTNNB1, KIT, HNF1A, JAK2, BRAF, IDH1, RET, PDGFRA, MET, 또는 APC의 하나 이상의 돌연변이체 MHC-결합 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  144. 제107항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 다발성 골수종, 다형성 아교모세포종, 또는 흑색종인 것인 방법.
  145. 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, MHC-결합 에피토프가 인간 MHC-결합 에피토프인 것인 방법 또는 조성물.
  146. 제4항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 분자가 인간 MHC 분자인 것인 방법 또는 조성물.
  147. 제10항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 것인 방법 또는 조성물.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7114477B2 (ja) 2015-12-16 2022-08-08 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 新生抗原の特定、製造、および使用
BR112018074463A2 (pt) 2016-05-27 2019-03-06 Agenus Inc. anticorpos anti-tim-3 e métodos de uso dos mesmos.
WO2018094569A1 (zh) 2016-11-22 2018-05-31 深圳华大基因研究院 多肽及其应用
EP3571200B8 (en) 2017-01-17 2022-08-03 HepaRegeniX GmbH Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death
KR102629972B1 (ko) 2017-04-13 2024-01-29 아게누스 인코포레이티드 항-cd137 항체 및 이의 사용 방법
CA3062061A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Agenus Inc. Anti-tigit antibodies and methods of use thereof
AU2018266162A1 (en) * 2017-05-10 2020-01-02 Nantomics, Llc Circulating RNA for detection, prediction, and monitoring of cancer
AU2018348165A1 (en) 2017-10-10 2020-05-21 Gritstone Bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
AU2018373154A1 (en) 2017-11-22 2020-07-02 Gritstone Bio, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
EP3784688A2 (en) * 2018-04-26 2021-03-03 Agenus Inc. Heat shock protein-binding peptide compositions and methods of use thereof
CN113039612A (zh) * 2018-08-28 2021-06-25 赛科维有限两合公司 分级和/或选择肿瘤特异性新抗原的方法
EP3618071A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-04 CeCaVa GmbH & Co. KG Methods for selecting tumor-specific neoantigens
CN110917341A (zh) * 2018-09-20 2020-03-27 天津贝罗尼生物科技有限公司 一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法
KR20210065171A (ko) * 2018-09-27 2021-06-03 백시바디 에이에스 네오에피토프의 선택 방법
CN109438570B (zh) * 2018-11-28 2021-07-20 生命谷（海南）生物科技股份有限公司 肿瘤相关基因fgfr3突变短肽及其应用
CN109517053B (zh) * 2018-11-28 2021-10-08 生命谷（海南）生物科技股份有限公司 肿瘤相关基因ret突变短肽及其应用
CN112687325B (zh) * 2019-01-29 2024-01-26 杭州纽安津生物科技有限公司 针对靶向药物阿雷替尼、色瑞替尼、克唑替尼的多肽疫苗组合及其设计方法
WO2020221783A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Vaccibody As Methods for pre-selection of neoepitopes
CA3148253A1 (en) * 2019-07-24 2021-01-28 Agenus Inc. Antigenic polypeptides and methods of use thereof
CR20220076A (es) 2019-08-30 2022-06-24 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd96 y sus métodos de uso
CN112002374B (zh) * 2020-06-14 2022-04-22 北京臻知医学科技有限责任公司 基于深度学习的mhc-i表位亲和力预测方法
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
CA3202227A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Think Therapeutics, Inc. Compositions and methods for optimized peptide vaccines
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
WO2022115415A1 (en) * 2020-11-24 2022-06-02 Providence Health & Services - Oregon T cell receptors specific for a mutant form of the ret oncogene and uses thereof
CN112608992B (zh) * 2020-12-21 2022-05-10 黄志玲 一种msh6突变基因及其应用
CN113173985A (zh) * 2021-03-24 2021-07-27 深圳市新靶向生物科技有限公司 一种与结直肠癌驱动基因突变相关的抗原肽及其应用
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
WO2024036068A1 (en) * 2022-08-12 2024-02-15 Amazon Technologies, Inc. Tumor cell identification by mapping mutations in bulk dna sequences to single cell rna sequences
WO2024054892A1 (en) * 2022-09-09 2024-03-14 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic peptides

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4761470A (en) 1985-12-16 1988-08-02 Merck & Co., Inc. Immunogenic synthetic peptide capable of eliciting herpes simplex virus neutralizing antibody
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5605884A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Factor VIII formulations in high ionic strength media
US4877608A (en) 1987-11-09 1989-10-31 Rorer Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media
US5137819A (en) 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
US5232833A (en) 1988-09-14 1993-08-03 Stressgen Biotechnologies Corporation Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants
GB8915019D0 (en) 1989-06-30 1989-08-23 Matthews Ruth C Medicaments
DE4001451A1 (de) 1990-01-19 1991-08-01 Octapharma Ag Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix
US5348945A (en) 1990-04-06 1994-09-20 Wake Forest University Method of treatment with hsp70
US5188964A (en) 1990-04-12 1993-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and kit for the prognostication of breast cancer patient via heat shock/stress protein determination
DE4143467C2 (de) 1991-05-17 1995-02-09 Max Planck Gesellschaft Peptidmotiv und dessen Verwendung
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
EP0636248A4 (en) 1992-04-14 1996-11-13 Univ Duke METHOD FOR DETECTING P53 AND HSP70 COMPLEX CONTAINING TUMORS.
US5650398A (en) 1992-07-02 1997-07-22 Cambridge Biotech Corporation Drug delivery enhancement via modified saponins
US5273965A (en) 1992-07-02 1993-12-28 Cambridge Biotech Corporation Methods for enhancing drug delivery with modified saponins
HU220194B (hu) 1992-10-02 2001-11-28 Genetics Institute Inc. Koagulációs faktor VIII-at tartalmazó készítmény és eljárás előállítására
US5496934A (en) 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
US5750119A (en) 1994-01-13 1998-05-12 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
US5961979A (en) 1994-03-16 1999-10-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens
DE69535905D1 (de) 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
GB9501040D0 (en) 1995-01-19 1995-03-08 Quadrant Holdings Cambridge Dried composition
CA2229595A1 (en) 1995-08-18 1997-02-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for treatment of cancer and infectious diseases and compositions useful in same
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
US5837251A (en) 1995-09-13 1998-11-17 Fordham University Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases
CA2231998A1 (en) 1995-09-13 1997-03-20 Fordham University Therapeutic and prophylactic methods using heat shock proteins
DE19602985A1 (de) 1996-01-27 1997-07-31 Max Delbrueck Centrum Tumorzellimpfstoff für die Immuntheraphie von malignen Tumoren
RS50101B (sr) 1996-02-24 2009-01-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh., Farmaceutski preparati za imunomodulaciju
US5763401A (en) 1996-07-12 1998-06-09 Bayer Corporation Stabilized albumin-free recombinant factor VIII preparation having a low sugar content
AU4502797A (en) 1996-10-01 1998-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Immunological therapy for cancer
US6231859B1 (en) 1996-12-02 2001-05-15 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Saponin adjuvant compositions
US6017540A (en) 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5830464A (en) 1997-02-07 1998-11-03 Fordham University Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998040100A1 (en) 1997-03-10 1998-09-17 Ottawa Civic Loeb Research Institute USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE AS AN ADJUVANT
US6977074B2 (en) 1997-07-10 2005-12-20 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
EP1003548B1 (en) 1997-07-10 2006-05-10 Mannkind Corporation Device for inducing a ctl response
EP0893507A1 (en) 1997-07-25 1999-01-27 Institut Gustave Roussy Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment
DE69840962D1 (de) 1997-08-29 2009-08-20 Antigenics Inc Adjuvant qs-21 enthaltende zusammensetzungen mit polysorbate oder cyclodextrin als hilfsmittel
EP1030819A4 (en) 1997-09-30 2001-11-21 Cel Sci Corp IMMUNOGENOUS CONJUGATED POLYPEPTIDES FOR THE TREATMENT OF HERPES-SIMPLEX VIRUS
US6007821A (en) 1997-10-16 1999-12-28 Fordham University Method and compositions for the treatment of autoimmune disease using heat shock proteins
JP2002501722A (ja) 1997-10-31 2002-01-22 スローン−ケターリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 熱ショックタンパク質結合性コンジュゲートペプチド
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
WO1999047641A1 (en) 1998-03-20 1999-09-23 Genzyme Corporation Compositions and methods for gene-based vaccines to provoke t cell responses
DE69935507T2 (de) 1998-04-03 2007-12-06 University Of Iowa Research Foundation Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
NO315238B1 (no) 1998-05-08 2003-08-04 Gemvax As Peptider som stammer fra leserammeforskyvingsmutasjoner i TBF<beta>II- eller BAX-genet, og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse,nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slikenukleinsy
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
AU773204C (en) 1998-08-10 2005-05-19 Antigenics Llc Compositions of CPG and saponin adjuvants and methods thereof
US6451316B1 (en) 1998-10-05 2002-09-17 University Of Conneticut Health Center Methods for generating antigen-reactive T cells in vitro
EA003634B1 (ru) 1998-10-05 2003-08-28 Фармэкса А/С Новые способы терапевтической вакцинации
US6475490B1 (en) 1998-10-19 2002-11-05 Fordham University Compositions and methods for promoting tissue repair using heat shock proteins
WO2000025813A1 (en) 1998-10-29 2000-05-11 Dana-Farber Cancer Institute CANCER IMMUNOTHERAPHY AND DIAGNOSIS USING UNIVERSAL TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS, INCLUDING hTERT
UA77152C2 (en) 1999-09-25 2006-11-15 Method for stimulation of immune response using nucleic acid-containing immunostimulating compositions, method for treatment of cancer and method for treatment or prophylaxis of allergy or asthma
JP2003527352A (ja) 2000-01-13 2003-09-16 アンティジェニクス インコーポレーテッド Ｃｐｇおよびサポニンの自然免疫刺激化合物、ならびにそれらの方法
AU3108001A (en) 2000-01-20 2001-12-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
US20010034042A1 (en) 2000-01-20 2001-10-25 Srivastava Pramod K. Complexes of peptide-binding fragments of heat shock proteins and their use as immunotherapeutic agents
GB0004547D0 (en) 2000-02-23 2000-04-19 Immunobiology Ltd Screening method for novel vaccine candidates and compositions obtained thereby
US20020044948A1 (en) 2000-03-15 2002-04-18 Samir Khleif Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens
EP1284986A4 (en) 2000-04-17 2005-08-24 James E Rothman COMPLEXIZING PROTEIN ANTIGENES AND HEAT SHOCK PROTEINS BY JAVELIN
US7449557B2 (en) 2000-06-02 2008-11-11 University Of Connecticut Health Center Complexes of alpha (2) macroglobulin and antigenic molecules for immunotherapy
US7186515B1 (en) 2000-06-02 2007-03-06 University Of Connecticut Health Center Alpha(2) macroglobulin receptor as a heat shock protein receptor and uses thereof
US7132109B1 (en) 2000-10-20 2006-11-07 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to increase immune response
KR20040064688A (ko) 2001-08-20 2004-07-19 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터 암 또는 전염병 치료에 유용한 열 충격 단백질 또는알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물 제조 방법
US20040071656A1 (en) * 2001-12-26 2004-04-15 Felix Wieland Modulation of heat-shock-protein-based immunotherapies
US7026167B2 (en) 2001-12-28 2006-04-11 University Of Virginia Patent Foundation Systems and methods for the analysis of protein phosphorylation
KR20040105736A (ko) 2002-02-28 2004-12-16 안티제닉스 아이엔씨 스트레스 단백질의 올리고머화에 기초한 방법 및 산물
US6984389B2 (en) 2002-04-25 2006-01-10 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality
AU2003231098A1 (en) 2002-04-25 2003-11-10 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality
JP2005533015A (ja) 2002-05-02 2005-11-04 ユニバーシティー オブ コネティカット ヘルス センター 抗体療法の有効性を増強するための熱ショックタンパク質の使用
US20050221350A1 (en) 2002-05-29 2005-10-06 Toni Weinschenk Method for identifying immunoreactive peptides
WO2004033657A2 (en) 2002-10-07 2004-04-22 Antigenics, Inc. Heat shock protein binding fragments of cd91, and uses thereof
US7420037B2 (en) * 2003-02-13 2008-09-02 Antigenics Inc. Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies
JP2006514088A (ja) 2003-02-20 2006-04-27 ユニバーシティー オブ コネティカット ヘルス センター 癌および感染症の治療における熱ショックタンパク質またはα−２−マクログロブリンを含む組成物の使用方法
ATE491463T1 (de) 2003-02-20 2011-01-15 Univ Connecticut Health Ct Verfahren zur herstellung von alpha (2) makroglobulin-antigen-molekül-komplexen
WO2004091493A2 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Antigenics, Inc. Improved heat shock protein-based vaccines and immunotherapies
CN1816348A (zh) * 2003-04-11 2006-08-09 抗基因公司 改良的基于热休克蛋白的疫苗和免疫治疗
US7309491B2 (en) * 2003-04-11 2007-12-18 Antigenics Inc. Heat shock protein-based vaccines and immunotherapies
JP2007505147A (ja) 2003-09-12 2007-03-08 アンティジェニクス インコーポレーテッド 単純ヘルペスウイルス感染の治療および予防用ワクチン
US7811828B2 (en) 2004-01-28 2010-10-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for identifying and quantifying of tumuor-associated
US20090214494A1 (en) 2005-03-29 2009-08-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Cancer Vaccines and Therapeutic Methods
JP5435938B2 (ja) 2005-05-09 2014-03-05 ヴァクソン バイオテック ワクチン接種のための天然ペプチド及びそれらの最適化された誘導体の使用
EA026785B1 (ru) 2005-05-10 2017-05-31 Инсайт Холдингс Корпорейшн Модуляторы индоламин 2,3-диоксигеназы и способы их применения
US9732131B2 (en) 2006-02-27 2017-08-15 Calviri, Inc. Identification and use of novopeptides for the treatment of cancer
WO2007101227A2 (en) 2006-02-27 2007-09-07 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Identification and use of novopeptides for the treatment of cancer
WO2008027800A2 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Method for enhancing the efficacy of antigen specific tumor immunotherapy
AT504160A1 (de) 2006-09-11 2008-03-15 Ralf Dr Kircheis Verwendung einer mehrkomponenten-tumorvakzine
US9487574B2 (en) 2006-09-21 2016-11-08 Vaxil Biotherapeutics Ltd. Antigen specific multi epitope vaccines
US7998486B2 (en) 2006-10-25 2011-08-16 Newlink Genetics Corporation Enhanced immunogenicity of tumor associated antigens by addition of alphaGal epitopes
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
WO2008100598A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Mannkind Corporation A method for enhancing t cell response
US8140270B2 (en) 2007-03-22 2012-03-20 National Center For Genome Resources Methods and systems for medical sequencing analysis
ES2676630T3 (es) 2008-02-14 2018-07-23 Life Sciences Research Partners Vzw Control inmunogénico de tumores y células tumorales
DE602008000891D1 (de) 2008-04-30 2010-05-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Neuartige Formulierungen von Tumor-assoziierten Peptiden, welche an menschliche Leukozytenantigene der Klasse I oder II für Impfungen binden
JP2009273377A (ja) 2008-05-12 2009-11-26 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk Ｍｈｃクラスｉ分子と結合し癌細胞の表面に表出されるペプチド候補の選択方法
CA2757524A1 (en) 2009-04-03 2010-10-07 Agenus Inc. Methods for preparing and using multichaperone-antigen complexes
CN102459322B (zh) 2009-06-09 2015-11-25 瓦克松生物技术公司 用于免疫治疗的hla-b*0702共有表位的鉴定、优化与应用
GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
KR102017898B1 (ko) 2010-05-14 2019-09-04 더 제너럴 하스피톨 코포레이션 종양 특이적 신생항원을 확인하는 조성물 및 방법
AU2011255463A1 (en) 2010-05-21 2012-11-01 University Of Miami Cancer treatment
WO2011149909A2 (en) 2010-05-24 2011-12-01 Hunt Donald F Class i mhc phosphopeptides for cancer immunotherapy and diagnosis
US9646134B2 (en) 2010-05-25 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Bambam: parallel comparative analysis of high-throughput sequencing data
WO2011149534A2 (en) 2010-05-25 2011-12-01 The Regents Of The University Of California Bambam: parallel comparative analysis of high-throughput sequencing data
US8340685B2 (en) 2010-08-25 2012-12-25 The Nielsen Company (Us), Llc Methods, systems and apparatus to generate market segmentation data with anonymous location data
CA2823621C (en) 2010-12-30 2023-04-25 Foundation Medicine, Inc. Optimization of multigene analysis of tumor samples
NZ730355A (en) * 2011-05-24 2022-10-28 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Individualized vaccines for cancer
WO2012159643A1 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
EP2752198A4 (en) 2011-08-31 2015-05-06 Univ Mie PREPARATION OF VACCINE FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2013158611A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Agenus Inc. Methods and compositions for the treatment of glioblastomas
CA2886218A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Phosimmune, Inc. Identification of mhc class i phospho-peptide antigens from breast cancer utilizing shla technology and complementary enrichment strategies
CN104487979A (zh) 2012-05-25 2015-04-01 拜尔健康护理有限责任公司 用于预测肽的免疫原性的系统和方法
EP2869842A1 (en) * 2012-07-06 2015-05-13 Novartis AG Immunogenic compositions and uses thereof
JP2015533473A (ja) 2012-07-12 2015-11-26 ペルシミューン，インコーポレイテッド 個別のがんワクチン及び適応免疫細胞療法
GB201214007D0 (en) 2012-08-07 2012-09-19 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes
EP2891099A4 (en) 2012-08-28 2016-04-20 Broad Inst Inc DETECTION OF VARIANTS IN SEQUENCING DATA AND CALIBRATION
CA2883569A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 University Of Virginia Patent Foundation Target peptides for immunotherapy and diagnostics
EP2892544A4 (en) 2012-09-05 2016-11-02 Univ Virginia Patent Found TARGET PEPTIDES FOR THERAPY AND DIAGNOSIS OF COLORECTAL CARCINOMAS
AU2013323368B2 (en) 2012-09-28 2019-03-21 The University Of Connecticut Identification of tumor-protective epitopes for the treatment of cancers
EP3417874A1 (en) 2012-11-28 2018-12-26 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
EP3756687A3 (en) 2012-12-13 2021-03-24 University Of Virginia Patent Foundation Target peptides for ovarian cancer therapy and diagnostics
US20160045594A1 (en) 2013-03-27 2016-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Directed immune stimulation
JP6702855B2 (ja) 2013-04-07 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 個別化された新生物ワクチンの組成物及び方法
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
WO2014200910A2 (en) 2013-06-10 2014-12-18 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
WO2015013461A2 (en) 2013-07-26 2015-01-29 Sequenta, Inc. Cancer vaccination with antigen evolution
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
WO2015034519A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 University Of Virginia Patent Foundation Target peptides for immunotherapy and diagnostics
AU2014360198B2 (en) 2013-12-06 2020-06-18 The Broad Institute, Inc. Formulations for neoplasia vaccines
NZ721908A (en) 2013-12-20 2022-12-23 Massachusetts Gen Hospital Combination therapy with neoantigen vaccine
MX2016008771A (es) 2014-01-02 2016-12-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Determinantes de respuesta del cancer a la inmunoterapia.
US20150315247A1 (en) 2014-05-04 2015-11-05 David Charles Binder High-affinity peptide-based anticancer vaccination to overcome tumor resistance to immunostimulatory antibodies and to identify TCRs that can be used successfully in adoptive T cell therapy
GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-06-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
JP2017528143A (ja) 2014-09-10 2017-09-28 ザ ユニバーシティ オブ コネチカット 癌の治療のための免疫防御ネオエピトープ同定
EP3193892A4 (en) 2014-09-14 2018-09-12 Washington University Personalized cancer vaccines and methods therefor
WO2017088080A1 (es) 2015-11-25 2017-06-01 Natural Response S.A. Método para la obtención de saponinas a partir de plantas

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