JP2018515519A - がんの処置および予防のためのワクチン - Google Patents

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Abstract

治療ワクチン（例えば、がんワクチン）として有用な組成物、およびそのような組成物を作製する方法が提供される。本明細書に開示される組成物は一般に、ストレスタンパク質および少なくとも１つの合成ペプチドを用い、このペプチドは患者のがんに存在するがん特異的突然変異を含むリンペプチドでもリンペプチド模倣物でもよい。

Description

本発明は、がん生物学の分野、さらに具体的には抗がんワクチンを使用する再発の処置および阻害に関する。
免疫療法は、がんの処置において重要なツールになりつつある。１つの免疫療法アプローチは、がん細胞を標的とし破壊するように患者の免疫系を積極的に教育するがん特異的抗原ペプチドを含む治療用がんワクチンの使用を伴う。しかし、そのような治療用がんワクチンの作製はがん特異的抗原ペプチドの利用能により制限される。
したがって、当技術分野では、がん特異的抗原ペプチドを同定する改良された方法およびこれらのペプチドを含む効果的な抗がんワクチンを創造することが必要とされている。
本開示は、治療ワクチン（例えば、がんワクチン）として有用な組成物およびそのような組成物を産生する方法を提供する。本明細書に開示される組成物は一般に、ストレスタンパク質および患者のがんに存在するがん特異的突然変異を含む少なくとも１つの合成抗原ペプチドを用いる。本明細書に開示される方法は、ほんの微量の対象組織（例えば、単細胞またはエキソソーム（exosome））を使用する治療ワクチン（例えば、がんワクチン）組成物の調製を可能にする点で特に有利である。
一態様では、本開示は、抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の組成物であって、複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つががん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープ（例えば、ヒトＭＨＣ結合エピトープ）を含み、組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープ（例えば、野生型ヒトＭＨＣ結合エピトープ）のみを含有する２０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の異なる抗原ペプチドを含む、前記組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の組成物であって、複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つががん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含み、組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する５以下の異なる抗原ペプチドを含む、前記組成物に関する。
ある特定の実施形態では、組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープ、例えば、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以下の異なる抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有するいかなる抗原ペプチドも含まない。
ある特定の実施形態では、組成物は、１００以下（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０；例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００）の異なる抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００以下の異なる抗原ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、５００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ分子に結合する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、５００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ Ｉ分子に結合する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、１０００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ ＩＩ分子に結合する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、１０００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ ＩＩ分子に結合する。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ分子はヒトＭＨＣ分子である。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、がん細胞由来の１よりも多い突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、がん細胞由来の１よりも多い突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、５００ｎＭ未満のＩＣ５０で１よりも多い異なるＭＨＣ分子に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、５００ｎＭ未満のＩＣ５０で１よりも多い異なるＭＨＣ分子に結合することができる。
ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは対象のがん細胞において発現されるが、対象の正常細胞においては発現されない。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは単一対象のがん細胞において発現されるが、対象の正常細胞においては発現されない。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、対象のがん細胞において、対象の正常細胞と比べて高いレベルで発現される。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、対象のがん細胞において、対象の正常細胞と比べて高いレベルで発現される。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、アミノ酸突然変異または遺伝子融合突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、アミノ酸突然変異または遺伝子融合突然変異を含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸突然変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である。ある特定の実施形態では、アミノ酸突然変異は０．０５より大きな対立遺伝子頻度で対象の腫瘍に存在する。
ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは改変アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは改変アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、改変アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、改変アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓアミノ酸の模倣物（mimetic）である。
ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、同じ徴候の複数のがんにわたり１ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ：マップされたリード１００万本あたりの転写物１キロベースあたりのリード数）よりも大きな発現レベル中央値を有する。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、同じ徴候の複数のがんにわたり１ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ：マップされたリード１００万本あたりの転写物１キロベースあたりのリード数）よりも大きな発現レベル中央値を有する。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、対象腫瘍において１０ＮＭＲＣ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅａｄ Ｃｏｕｎｔｓ：正規化突然変異含有リードカウント）よりも大きな発現レベルを有する。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、対象腫瘍において１０ＮＭＲＣよりも大きな発現レベルを有する。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、抗原ペプチドが投与される対象において１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを発現している腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を刺激する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、抗原ペプチドが投与される対象において１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを発現している腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を刺激する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、タンパク質の全アミノ酸配列を含まない。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、タンパク質の全アミノ酸配列を含まない。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、５から５０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、５から５０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、２５から４０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２５から４０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、２７から３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２７から３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、２１から３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２１から３１アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、アミノ酸配列の中央付近に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つはアミノ酸配列の中央付近に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは２７アミノ酸長であり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは２７アミノ酸長であり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは２９アミノ酸長であり、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは２９アミノ酸長であり、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは３１アミノ酸長であり、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは３１アミノ酸長であり、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９位に腫瘍特異的突然変異を有する。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、化学合成ペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、化学合成ペプチドである。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、熱ショックタンパク質結合配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、熱ショックタンパク質結合配列をさらに含む。一つの好ましい実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つはそのＮもしくはＣ終端に熱ショックタンパク質結合配列をさらに含み、さらに好ましくは、抗原ペプチドの少なくとも１つはそのＣ終端に熱ショックタンパク質結合配列をさらに含みおよび／または熱ショックタンパク質結合配列は、ペプチドリンカーを介して抗原ペプチドの残部に連結している。別の好ましい実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つはそのＮ−もしくはＣ終端に熱ショックタンパク質結合配列をさらに含み、さらに好ましくは、抗原ペプチドのそれぞれ１つはそのＣ終端に熱ショックタンパク質結合配列をさらに含みおよび／または熱ショックタンパク質結合配列は、ペプチドリンカーを介して抗原ペプチドの残部に連結している。一つの好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＦＦＲＫ（配列番号４４７）を含む。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、配列番号４３９〜４４６からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、配列番号４３９である。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、Ｃ終端に配列番号４７７のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、Ｃ終端に配列番号４７７のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つはＮ終端に配列番号４７８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つはＮ終端に配列番号４７８のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、ｉ）腫瘍特異的突然変異を含む第１の部分；ならびにｉｉ）熱ショックタンパク質結合配列、および、場合によりペプチドリンカーを含む第２の部分を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、ｉ）腫瘍特異的突然変異を含む第１の部分；ならびにｉｉ）熱ショックタンパク質結合配列、および、場合によりペプチドリンカーを含む第２の部分を含む。ある特定の実施形態では、第１の部分は２７〜３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１の部分は２７アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１の部分は２９アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１の部分は３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１の部分は、第１の部分のアミノ酸配列の中央付近に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、第１の部分は２７アミノ酸長であり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、第１の部分は２９アミノ酸長であり、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、第１の部分は３１アミノ酸長であり、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９位に腫瘍特異的突然変異を有する。ある特定の実施形態では、第２の部分は配列番号４３９〜４４６、４４７、４７７、および４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは３８アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは３８アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは４０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは４０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは４２アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは４２アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、組成物は少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０；例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００）の異なる抗原ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は少なくとも１対１（例えば、２対１、３対１、４対１、５対１、６対１、７対１、８対１、９対１、１０対１、１１対１、１２対１、１３対１、１４対１、１５対１、１６対１、１７対１、１８対１、１９対１、２０対１、３０対１、４０対１、４９対１、最大で１００対１）である。ある特定の実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、１対１またはそれ未満（例えば、約１対２、１対３、１対４、１対５、１対６、１対７、１対８、１対９、１対１０、１対１１、１対１２、１対１３、１対１４、１対１５、１対１６、１対１７、１対１８、１対１９、１対２０、１対５０、１対１００に至るまでまたはそれ未満）である。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、前立腺特異的抗原、アルファフェトプロテイン、胸ムチン、ｇｐｌ００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１１、チロシナーゼ関連タンパク質、またはＲＡＤ５０の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、配列番号１〜４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、配列番号１〜４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は組換えストレスタンパク質である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびその２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｃ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はヒトｈｓｃ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｐ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はヒトｈｓｐ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は抗原ペプチドに非共有結合している。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は抗原ペプチドに共有結合している。ある特定の実施形態では、組成物中のストレスタンパク質の量は１０μｇから６００μｇである。ある特定の実施形態では、組成物中のストレスタンパク質の量は２５μｇである。
ある特定の実施形態では、複合体のそれぞれ１つは、対象に投与された場合、対象の細胞表面でのＭＨＣ分子による１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープの提示を達成することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、アジュバンドをさらに含む。ある特定の実施形態では、アジュバンドはサポニンまたは免疫賦活性核酸を含む。ある特定の実施形態では、アジュバンドはＱＳ−２１を含む。ある特定の実施形態では、組成物中のＱＳ−２１の量は１０μｇ、２５μｇ、または５０μｇである。
別の態様では、本開示は、がん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープ（例えば、ヒトＭＨＣ結合エピトープ）を含む抗原ペプチドを製造する方法であって：（ａ）対象のがん細胞由来のゲノムＤＮＡの１つまたはそれ以上のエキソーム（exome）の配列を決定する工程；（ｂ）基準ゲノムＤＮＡと比べた場合、突然変異タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の非同義突然変異対立遺伝子をエキソームから同定する工程；（ｃ）工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子が対象のがん細胞で発現されているかどうかを判定する工程；（ｄ）工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定する工程；（ｅ）対象の１つまたはそれ以上のＭＨＣタイプを決定する工程；（ｆ）工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子によりコードされる突然変異ペプチドを選択する工程であって、突然変異対立遺伝子が０．０５よりも大きな対立遺伝子頻度を有し、対象のがん細胞で発現され、突然変異ペプチドが、対象に投与された場合、対象のＭＨＣ分子の少なくとも１つにより提示することができると予想される工程、および（ｇ）工程（ｆ）で選択されたペプチドの１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ以上のペプチドを合成し、それによってがん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む抗原ペプチドを製造する工程を含む、前記方法を提供する。
ある特定の実施形態では、方法は、工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子を含有するｍＲＮＡの発現レベルを決定する工程をさらに含む。
ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が対象のがん細胞において１０ＮＭＲＣよりも大きな発現レベル中央値を有することをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が他の個体の同じ徴候のがん細胞において１ＲＰＫＭよりも大きな発現レベル中央値を有することをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が対象の正常細胞で発現されないことをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、方法は、対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対する１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドの結合親和性を決定する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対する１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドの結合親和性はコンピュータモデリングにより予測される。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異対立遺伝子によりコードされる１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドが対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対して５００ｎＭ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが対象のＭＨＣクラスＩ分子の１つまたはそれ以上に対して５００ｎＭ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが対象のＭＨＣクラスＩＩ分子の１つまたはそれ以上に対して１０００ｎＭ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが特定のタイプのがんに特徴的である突然変異対立遺伝子によりコードされていることをさらに必要とする。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが遺伝子融合突然変異、またはアミノ酸挿入、欠失、もしくは置換突然変異を含有することをさらに必要とする。
ある特定の実施形態では、方法は、工程（ｆ）で選択される突然変異ペプチドを、（ｉ）突然変異ペプチドに存在する予測されるＭＨＣ結合エピトープの数、ここで、突然変異ペプチドで予測されるＭＨＣ結合エピトープの数が多くなるに従って、順位は高くなる；（ｉｉ）対象のＭＨＣに結合することに対する突然変異ペプチドのＩＣ５０、ここで、ＩＣ５０が低くなるに従って、順位は高くなる；（ｉｉｉ）対象の正常細胞中の突然変異ペプチドの野生型等価物の発現の有無、ここで、突然変異ペプチドの野生型等価物が対象の正常細胞では発現されていない場合、突然変異ペプチドの順位は高くなる；（ｉｖ）対象のＭＨＣへの突然変異ペプチドのＣ終端の結合の安定性、ここで、安定性が高くなるに従って、順位は高くなる；および／または（ｖ）突然変異ペプチドのプロテアソーム分解の予測される動態、ここで、突然変異ペプチドがなると予測されるプロテアソームに対する基質として良好であると予測されるに従って、順位は高くなる、に基づいて順位付けする工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、最高順位のペプチドの１００以下（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００）が工程（ｇ）で合成される。
ある特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡは対象由来の腫瘍試料または体液から単離される。ある特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡは対象から得られるエキソソーム、または循環している腫瘍細胞から単離される。ある特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡは対象から得られる循環している腫瘍細胞ＤＮＡである。
ある特定の実施形態では、エキソームの配列は次世代シーケンシングにより決定される。ある特定の実施形態では、基準ゲノムＤＮＡは対象の正常細胞由来のゲノムＤＮＡであり、突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度は次世代シーケンシングリード再マッピングにより工程（ｄ）で決定される。
ある特定の実施形態では、非同義突然変異対立遺伝子の発現は、対象のがん細胞から単離されるｍＲＮＡの次世代シーケンシングにより工程（ｃ）で決定される。
ある特定の実施形態では、工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子は、対象でまたは少なくとも１０００ゲノムで見出される一塩基多型（ＳＮＰ）ではない。
ある特定の実施形態では、合成ペプチドは５から５０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、合成ペプチドは２５から４０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、合成ペプチドは２７から３１アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、合成ペプチドは２１から３１アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、がん細胞は多発性骨髄腫または多形神経膠芽腫細胞である。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの１つまたはそれ以上は、本明細書に開示される方法を使用して製造された。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法により得ることができる抗原ペプチドを含む組成物に関する。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのすべては、本明細書に開示される方法を使用して製造された。
別の態様では、薬剤（medicament）として使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。別の態様では、がんの処置のための方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、治療ワクチンとして使用するための、本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、がんワクチンとして使用するための、本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、対象におけるがんの処置のための方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に開示される第１の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんの処置のための方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法であって、本明細書に開示される第１の組成物の有効量を対象に投与することを含む前記方法において使用するための本発明の第１の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本開示は、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に開示される第１の組成物の有効量を対象に投与することを含む前記方法を提供する。別の態様では、本開示は、がんを有する対象を処置する方法であって、本明細書に開示される第１の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む前記方法を提供する。以下の実施形態は、前述の方法の両方に、ならびに使用のための前述の組成物に等しく適用される。
ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの１つまたはそれ以上は対象自身のがん細胞に存在していると確認された。ある特定の実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのすべては対象自身のがん細胞に存在していると確認された。
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞から少なくとも約６５％純度まで精製されたストレスタンパク質の少なくとも１５０μｇの単離を可能にするために対象から入手できる腫瘍細胞の量では不十分である。
ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびその２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｃ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はヒトｈｓｃ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｐ７０である。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質はヒトｈｓｐ７０である。ある特定の実施形態では、対象は湿重量が６ｇまたはそれ未満（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｇ）である腫瘍を有する。
ある特定の実施形態では、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する組成物の能力は、対象への組成物の投与に先立って判定される。ある特定の実施形態では、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する組成物の能力は、対象への組成物の投与後に判定される。
ある特定の実施形態では、組成物は、１０μｇから６００μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、２５μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、２４０μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される。
ある特定の実施形態では、組成物は４週間の間、毎週１回対象に投与される。ある特定の実施形態では、４回の毎週投与の後、組成物の少なくとも２回のさらなる用量が対象に隔週で投与される。ある特定の実施形態では、合計で組成物の少なくとも６用量が投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、最終の週１回または隔週投与の３ヶ月後にブースターとしてさらに投与される。ある特定の実施形態では、組成物は少なくとも１年間３ヶ月毎にさらに投与される。
ある特定の実施形態では、方法は、レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドを対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤は４−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−１，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミドアミドを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、チェックポイント抗体を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、チェックポイント抗体は、抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、使用のための第１の組成物は、レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドを対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、使用のための第１の組成物は、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤は４−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−１，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミドアミドを含む。
ある特定の実施形態では、使用のための第１の組成物は、チェックポイント抗体を対象に投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、チェックポイント抗体は、抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドに関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドに関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドに関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）レナリドミド、デキサメタゾン、またはシクロホスファミドを含む組成物、キットまたはキットオブパーツ（kit-of-parts）に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤を含む組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）チェックポイント抗体に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）チェックポイント抗体に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）チェックポイント抗体に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）チェックポイント抗体を含む組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。
ある特定の実施形態では、方法は、抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第２の組成物であって、複合体はそれぞれ異なる抗原ペプチドを含み、異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つは対象のがんと同じタイプのがんに頻繁に見出される１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む、前記組成物を対象に投与することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、第２の組成物は少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０；例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００）の異なる抗原ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、第２の組成物中のストレスタンパク質は組換えストレスタンパク質である。
ある特定の実施形態では、第２の組成物中の抗原ペプチドの少なくとも１つは化学合成ペプチドである。ある特定の実施形態では、第２の組成物中の抗原ペプチドのそれぞれ１つは化学合成ペプチドである。
ある特定の実施形態では、第２の組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する２０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の異なる抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有するいかなる抗原ペプチドも含まない。
ある特定の実施形態では、第２の組成物は、１００以下（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０；例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００）の異なる抗原ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、第１の組成物は第２の組成物と同時に投与される。ある特定の実施形態では、第１の組成物は第２の組成物と逐次投与される。ある特定の実施形態では、第２の組成物は第１の組成物の投与に先立って投与される。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドの少なくとも１つは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、前立腺特異的抗原、アルファフェトプロテイン、胸ムチン、ｇｐｌ００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１１、チロシナーゼ関連タンパク質、またはＲＡＤ５０の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドのそれぞれ１つは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、前立腺特異的抗原、アルファフェトプロテイン、胸ムチン、ｇｐｌ００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１１、チロシナーゼ関連タンパク質、またはＲＡＤ５０の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。ある特定の実施形態では、がんは多発性骨髄腫または多形神経膠芽腫である。
ある特定の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に開示される第２の組成物に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に開示される第２の組成物に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、がんの処置のための方法において使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に開示される第２の組成物に関する。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に記載される第２の組成物を含む組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。
ある特定の実施形態では、第１の組成物は第２の組成物と同時に投与される。ある特定の実施形態では、第１の組成物は第２の組成物と逐次投与される。ある特定の実施形態では、第２の組成物は第１の組成物の投与に先立って投与される。
別の態様では、治療ワクチンとして使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に開示される第２の組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、がんワクチンとして使用するための、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）本明細書に開示される第２の組成物が本明細書で提供される。
前述の組成物、使用するための組成物、および方法のすべてのある特定の実施形態では、対象はヒト対象である。
前述の組成物、使用するための組成物、および方法のすべてのある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープはヒトＭＨＣ結合エピトープである。
前述の組成物、使用するための組成物、および方法のすべてのある特定の実施形態では、ＭＨＣ分子はヒトＭＨＣ分子である。別の態様では、本発明は、がんを有するまたはがんを有すると疑われる対象を免疫するための免疫原性組成物であって、ストレスタンパク質および対象のがん細胞由来の第１のペプチドの少なくとも１つを含み、第１のペプチドは対象のがん細胞においては突然変異であるが、対象の正常細胞においては突然変異ではなく、第１のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。組成物はアジュバンドをさらに含むことができる。組成物は、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、前立腺特異的抗原、アルファフェトプロテイン、胸ムチン、ｇｐｌ００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１１、チロシナーゼ関連タンパク質、およびＲＡＤ５０からなる群から選択される突然変異タンパク質に由来する第２のペプチドの少なくとも１つをさらに含むことが可能であり（Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｈｏｌｔ、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０年、７１：２４５〜２５４頁、参照によりその全体を本明細書に組み入れる）；第２のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まず、第１のペプチドは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、前立腺特異的抗原、アルファフェトプロテイン、胸ムチン、ｇｐｌ００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＲＴ−Ｉ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１１、チロシナーゼ関連タンパク質、またはＲＡＤ５０由来のペプチドではない。例えば、少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異Ｋ−ＲＡＳに由来し、突然変異Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、またはＧ１２Ｃの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＮＰＭ１に由来し、Ｗ２８８ｆｓ＊１２突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異Ｈ−ＲＡＳに由来し、Ｇ１２Ｖ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＦＧＦＲ３に由来し、突然変異Ｙ３７３Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、およびＧ６９７Ｃの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＭＳＨ６に由来し、Ｐ１０８７ｆｓ＊５突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＴＰ５３に由来し、突然変異Ｒ２７３ＨまたはＲ２４８Ｑの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＥＧＦＲに由来し、突然変異Ｌ８５８ＲまたはＥ７４６＿Ａ７５０ｄｅｌの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＰＩＫ３ＣＡに由来し、突然変異Ｈ１０４７ＲまたはＥ５４５Ｋの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＡＢＬ１に由来し、Ｔ３１５Ｉ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＣＴＮＮＢ１に由来し、突然変異Ｔ４１Ａ、Ｓ４５ｄｅｌ、Ｓ４５Ｆ、またはＳ３７Ａの少なくとも１つを含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＫＩＴに由来し、Ｄ８１６Ｖ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＨＮＦ１Ａに由来し、Ｐ２９１ｆｓ＊５１突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＪＡＫ２に由来し、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＢＲＡＦに由来し、Ｖ６００Ｅ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＩＤＨ１に由来し、Ｒ１３２Ｈ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異Ｎ−ＲＡＳに由来し、Ｑ６１ＲまたはＱ６１Ｋ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＲＥＴに由来し、Ｍ９１８Ｔ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＰＤＧＦＲＡに由来し、Ｄ８４２Ｖ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＭＥＴに由来し、Ｙ１２５３Ｄ突然変異を含むことができる。少なくとも１つの第２のペプチドは突然変異ＡＰＣに由来し、Ｔ１５５６ｆｓ＊３またはＳ１３４１Ｒ突然変異の少なくとも１つを含むことができる。ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、またはその２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択することができる。アジュバンドはサポニンまたは免疫賦活性核酸を含むことができる。第１のペプチドの１つは、リンペプチドのような翻訳後修飾ペプチドであることができる。組成物は、対象のがん細胞由来の第１のペプチドの少なくとも１つについて複数のペプチドを含むことができる。ペプチドは約９〜１１アミノ酸から約２７〜３１アミノ酸が可能である。がんは、例えば、多発性骨髄腫または神経膠芽腫が可能である。一実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つでの少なくとも１つの翻訳後修飾残基は模倣残基で置き換えられる。別の実施形態では、第１のペプチドの少なくとも１つでの少なくとも１つのリン酸化残基はリン酸化模倣残基で置き換えられる。
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための、ストレスタンパク質および対象のがん細胞由来の第１のペプチドの少なくとも１つを含む免疫原性組成物であって、第１のペプチドは対象のがん細胞において突然変異であるが、対象の正常細胞においては突然変異ではなく、第１のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。
別の態様では、本発明は、ストレスタンパク質および対象のがん細胞由来の第１のペプチドの少なくとも１つおよびアジュバンドを含む免疫原性組成物であって、第１のペプチドは対象のがん細胞において突然変異であるが、対象の正常細胞においては突然変異ではなく、第１のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。
別の態様では、本発明は、がんを有するまたはがんを有すると疑われる対象を免疫するための方法で使用するための、ストレスタンパク質および対象のがん細胞由来の第１のペプチドの少なくとも１つを含む免疫原性組成物であって、第１のペプチドは対象のがん細胞において突然変異であるが、対象の正常細胞においては突然変異ではなく、第１のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。組成物はアジュバンドをさらに含むことができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の第１の組成物、および（ｂ）アジュバンドを含む組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の第１の組成物を含有する第１の容器、およびアジュバンドを含有する第２の容器を含むキットに関する。
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を処置するために第１の態様の免疫原性組成物を対象に投与することを対象とする。ある特定の実施形態では、本発明は、がんを有する対象におけるがんの処置のための方法において使用するための本発明の免疫原性組成物、組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。がんは、例えば、多発性骨髄腫または神経膠芽腫が可能である。使用するための本発明の方法、免疫原性組成物、組成物、キットまたはキットオブパーツはレナリドミドまたはデキサメタゾンを投与することをさらに含むことができる。さらに、シクロホスファミドを投与してもよい。または、使用するための本発明の方法、免疫原性組成物、組成物、キットまたはキットオブパーツは、チェックポイント抗体（抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３のような）（これはモノクローナル抗体であってもよい）を投与することをさらに含んでよい。または、対象には、４−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−１，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミドアミドのようなインドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤を投与することもできる。
別の態様では、本発明は、がんから回復している対象を免疫する方法であって、第１の態様の免疫原性組成物を対象に投与することを含む前記方法を対象とする。ある特定の実施形態では、本発明は、がんから回復している対象を免疫するための方法で使用するための本発明の免疫原性組成物、組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。がんは、例えば、多発性骨髄腫または神経膠芽腫が可能である。使用するための本発明の方法、免疫原性組成物、組成物、キットまたはキットオブパーツは、レナリドミドまたはデキサメタゾンを投与することをさらに含むことができる。さらに、シクロホスファミドを投与してもよい。または、使用するための本発明の方法、免疫原性組成物、組成物、キットもしくはキットオブパーツは、チェックポイント抗体（抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３のような）（これはモノクローナル抗体であってもよい）を投与することをさらに含んでもよい。
別の態様では、本発明は、第１の態様の免疫原性組成物および使用するための説明書を含むキットを対象とする。キットは、レナリドミド、デキサメタゾン、シクロホスファミド、およびチェックポイント抗体（抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３のような、これはモノクローナル抗体であってもよい）をさらに含むことができる。
別の態様では、本発明は、がんに罹っている対象由来の免疫原性ペプチドを製造する方法であって、
（ａ）対象のがん組織の試料を得る工程；
（ｂ）試料中に存在するゲノムＤＮＡのエキソームを配列決定する工程；
（ｃ）野生型対照と比べた場合の突然変異タンパク質をコードする非同義体細胞突然変異対立遺伝子を試料から同定する工程；
（ｄ）試料または対象のがん組織由来の新しい試料由来のｍＲＮＡを配列決定し、がんにおいて発現されるｍＲＮＡに現れ工程（ｃ）で同定された体細胞突然変異を同定する工程；
（ｅ）試料中の突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定する工程；
（ｆ）例えば、同じ徴候の他のがんと比べて、突然変異対立遺伝子の発現レベル中央値を決定することにより、試料中の突然変異対立遺伝子の発現レベルを決定する工程；
（ｇ）対象のＭＨＣタイプを決定する工程；
（ｈ）１）０．０５よりも大きな対立遺伝子頻度を有し；
２）同じ徴候のすべてのがんにわたって１ＲＰＫＭ単位よりも大きな発現レベル中央値を有し；
３）対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に結合すると予測される
突然変異対立遺伝子によりコードされる１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを選択する工程；
（ｉ）予測される突然変異の数により、および対象のＭＨＣタイプに結合するＩＣ５０により工程（ｈ）で選択された突然変異ペプチドの順位付けをする工程；ならびに
（ｊ）約２７〜３１アミノ酸の１つまたはそれ以上のペプチドであって、それぞれのペプチドが工程（ｉ）で順位付けされたペプチドの１つを含む前記ペプチドを合成する工程
を含む前記方法を対象とする。そのような方法では、野生型対照は対象から単離された健康組織でも細胞でも可能である。１つまたはそれ以上のペプチドはリンペプチドで可能である。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法により得ることができる免疫原性ペプチドを含む組成物に関する。
別の態様では、本発明は、がんに罹っている対象由来の免疫原性ペプチドを同定する方法であって、
（ａ）対象のがん組織の試料を得る工程；
（ｂ）試料中に存在するゲノムＤＮＡのエキソームを配列決定する工程；
（ｃ）野生型対照と比べた場合の突然変異タンパク質をコードする非同義体細胞突然変異対立遺伝子を試料から同定する工程；
（ｄ）試料または対象のがん組織由来の新しい試料由来のｍＲＮＡを配列決定し、がんにおいて発現されるｍＲＮＡに現れ工程（ｃ）で同定された体細胞突然変異を同定する工程；
（ｅ）試料中の突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定する工程；
（ｆ）例えば、同じ徴候の他のがんと比べて、突然変異対立遺伝子の発現レベル中央値を決定することにより、試料中の突然変異対立遺伝子の発現レベルを決定する工程；
（ｇ）対象のＭＨＣタイプを決定する工程；
（ｈ）１）０．０５よりも大きな対立遺伝子頻度を有し；
２）同じ徴候のすべてのがんにわたって１ＲＰＫＭ単位よりも大きな発現レベル中央値を有し；
３）対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に結合すると予測される
突然変異対立遺伝子によりコードされる１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを選択する工程；
（ｉ）予測される突然変異の数により、および対象のＭＨＣタイプに結合するＩＣ５０により工程（ｈ）で選択された突然変異ペプチドの順位付けをする工程；ならびに
（ｊ）約２７〜３１アミノ酸の１つまたはそれ以上の免疫原性ペプチドであって、それぞれのペプチドが工程（ｉ）で順位付けされたペプチドの１つを含む前記ペプチドを同定する工程
を含む前記方法を対象とする。
別の態様では、本発明は、がんに罹っている対象由来の免疫原性ペプチドを製造する方法であって、
（ａ）対象のがん組織の試料を得る工程；
（ｂ）そこに含まれる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体を試料から精製する工程；
（ｃ）精製ＭＨＣ−ペプチド複合体からそこに含まれる複数のペプチドを溶出する工程；（ｄ）複数のペプチドから、対象のがん組織の試料中には見出されるが正常組織の試料には実質的に存在しない１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを同定する工程；および
（ｅ）それぞれのペプチドが工程（ｄ）で同定された突然変異ペプチドまたはその模倣物を含む１つまたはそれ以上のペプチドを合成する工程
を含む前記方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法により得ることができる免疫原性ペプチドを含む組成物に関する。
別の態様では、本発明は、がんに罹っている対象由来の免疫原性ペプチドを同定する方法であって、
（ａ）対象のがん組織の試料を得る工程；
（ｂ）そこに含まれる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体を試料から精製する工程；
（ｃ）精製ＭＨＣ−ペプチド複合体からそこに含まれる複数のペプチドを溶出する工程；（ｄ）複数のペプチドから、対象のがん組織の試料中には見出されるが正常組織の試料には実質的に存在しない１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを同定する工程；および
（ｅ）それぞれのペプチドが工程（ｄ）で同定された突然変異ペプチドまたはその模倣物
を含む１つまたはそれ以上のペプチドを同定する工程
を含む前記方法を対象とする。
ＭＨＣはクラスＩでもクラスＩＩ ＭＨＣでも可能である。正常組織の試料は対象から単離することができる。工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチドは翻訳後修飾ペプチドであり得る。工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチド中の少なくともつのアミノ酸残基は、対象のがん組織では翻訳後修飾されるが正常組織では翻訳後修飾されない。翻訳後修飾ペプチドはリン酸化される。工程（ｅ）での少なくとも１つの合成ペプチドは、工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチドを含むことができる。工程（ｅ）での少なくとも１つの合成ペプチドは、工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチドの模倣物を含むことができる。工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチドはリン酸化ペプチドであり得、工程（ｅ）での少なくとも１つの合成ペプチドはリンペプチド模倣物であり得る。工程（ｄ）で同定された少なくとも１つの突然変異ペプチド中のリン酸化された残基は、工程（ｅ）での少なくとも１つの合成ペプチド中の非加水分解性類似物で置き換えることができる。１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドは、質量分析を使用して対象のがん組織由来の複数のペプチドの分子構造を決定し、複数のペプチドの分子構造を正常組織中に見出される対応するペプチドと比較して１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを同定することにより、工程（ｄ）で同定することができる。
工程（ｄ）で同定された突然変異ペプチド（複数可）は、
（ｆ）対象のＭＨＣタイプを決定する工程；
（ｇ）１）０．０５よりも大きな対立遺伝子頻度を有し；
２）同じ徴候のがんすべてにわたって１ＲＰＫＭ単位よりも大きな発現レベル中央値を有し；
３）対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に結合すると予測される
突然変異対立遺伝子によりコードされる１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドを選択する工程；
（ｈ）予測される突然変異の数により、がん細胞中の突然変異ペプチドの出現頻度により、および／または対象のＭＨＣタイプに結合するＩＣ５０により工程（ｇ）で選択される突然変異ペプチドを順位付けする工程
を含む方法を使用して工程（ｅ）での合成のために選択することができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法により得ることができる免疫原性ペプチドを含む組成物に関する。
別の態様では、本発明は、ストレスタンパク質および第２の免疫原性ペプチドまたはその模倣物を含む第１の免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物であって、第２の免疫原性ペプチドはがんを有する対象のがん細胞に生じる突然変異タンパク質の断片であり、翻訳後修飾されている少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、第１の免疫原性ペプチドは天然に存在するタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。対象の正常細胞は突然変異タンパク質の正常な形態を含むことができ、突然変異タンパク質の正常な形態は、アミノ酸残基のうち第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つが突然変異タンパク質の正常な形態では翻訳後修飾されていないことを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含む。第１の免疫原性ペプチドは、第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つの残基が第１の免疫原性ペプチドにおいては模倣残基で置き換えられていることを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含むことができる。第１の免疫原性ペプチド中の模倣残基は第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている対応する残基ほど不安定ではないことが可能である。第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つのアミノ酸残基はリン酸化することができる。第２の免疫原性ペプチド中の少なくとも１つのリン酸化されたアミノ酸残基は、リン−Ｓｅｒ、リン−Ｔｈｒ、リン−Ｔｙｒ、リン−Ｈｉｓ、リン−Ａｒｇ、およびリン−Ｌｙｓからなる群から選択することができる。第１の免疫原性ペプチドは、第２の免疫原性ペプチドにおいて少なくとも１つのリン酸化された残基が第１の免疫原性ペプチドにおいてはリン模倣残基で置き換えられていることを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含むことができる。第１の免疫原性ペプチド中のリン模倣残基は第２の免疫原性ペプチド中の対応するリン酸化された残基の非加水分解性類似物であることが可能である。ペプチドは、９〜１１アミノ酸または２７〜３１アミノ酸長のような、８〜５０アミノ酸長であり得る。組成物は、ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ、ｎ−ｒａｓ、ｔｐ５３、およびｋｄｍ６Ａからなる群から選択される突然変異タンパク質に由来する第３の免疫原性ペプチドの少なくとも１つをさらに含むことができ、第３のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まず、第１の免疫原性ペプチドはｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ、ｎ−ｒａｓ、ｔｐ５３、またはｋｄｍ６Ａに由来するペプチドではない。ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびｈｓｃ７０とｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、またはその突然変異体の１つまたはそれ以上を含む組合せのような、その２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択することができる。これらの態様の組成物は、サポニンまたは免疫賦活性核酸のようなアジュバンドをさらに含むことができる。これらの態様の組成物は、がんを有する対象を処置する方法であって、これらの組成物のいずれかを対象に投与することを含む前記方法において使用することができる。さらなる態様では、組成物は薬剤としての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物は治療ワクチンとしての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物はがんワクチンとしての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物はがんの処置のための方法における使用を目的とする。さらなる態様では、本発明は、（ａ）ストレスタンパク質および（ｂ）上記の第２の免疫原性ペプチドまたはその模倣物を含む第１の免疫原性ペプチド、ならびに場合により、（ｃ）上記の第３の免疫原性ペプチドおよび／またはアジュバンドを含む組成物に関する。
本発明は、抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の組成物であって、複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つががん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含み、組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する５以下の異なる抗原ペプチドを含み、好ましくは、組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有するいかなる抗原ペプチドも含まず、および／または組成物が１００以下の異なる抗原ペプチドを含む、前記第１の組成物に関する。一好ましい実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｃ７０、特にヒトｈｓｃ７０、またはｈｓｐ７０、特にヒトｈｓｐ７０である。さらなる好ましい実施形態では、ストレスタンパク質は抗原ペプチドに非共有結合している。別の好ましい実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は１対１またはそれ未満であり、特に、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は１対２、１対４、１対５、１対１０、１対２０、１対５０、または最大１対１００のようなそれ未満である。別の好ましい実施形態では、組成物中の抗原ペプチドのそれぞれ１つは５から５０アミノ酸長、さらに好ましくは２５から４０アミノ酸長、最も好ましくは２７から３１アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物中の抗原ペプチドの少なくとも１つは２１〜３１アミノ酸長である。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物中の抗原ペプチドのそれぞれ１つは２１〜３１アミノ酸長である。一好ましい実施形態では、本発明の組成物中の抗原ペプチドのそれぞれ１つは、熱ショックタンパク質結合配列を含む。別の好ましい実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは対象のがん細胞において発現されるが、対象の正常細胞においては発現されず、好ましくは、突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは対象のがん細胞において発現されるが、対象の正常細胞においては発現されない。別の好ましい実施形態では、突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、対象のがん細胞において、対象の正常細胞と比べて高いレベルで発現される。
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤および場合により、アジュバンドをさらに含む。一好ましい実施形態では、アジュバンドはサポニンまたは免疫賦活性核酸を含み、さらに好ましくは、アジュバンドはＱＳ−２１を含む。
別の態様では、本発明は、第２の免疫原性ペプチドまたはその模倣物を含む第１の免疫原性ペプチドを含む免疫原性組成物であって、第２の免疫原性ペプチドはがんを有する対象のがん細胞に生じる突然変異タンパク質の断片であり、翻訳後修飾されている少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、第１の免疫原性ペプチドは天然に存在するタンパク質の全アミノ酸配列を含まない、前記免疫原性組成物を対象とする。対象の正常細胞は突然変異タンパク質の正常な形態を含むことができ、突然変異タンパク質の正常な形態は、アミノ酸残基のうち第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つが突然変異タンパク質の正常な形態では翻訳後修飾されていないことを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含む。第１の免疫原性ペプチドは、第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つの残基が第１の免疫原性ペプチドにおいては模倣残基で置き換えられていることを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含むことができる。第１の免疫原性ペプチド中の模倣残基は第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている対応する残基ほど不安定ではないことが可能である。第２の免疫原性ペプチドにおいて翻訳後修飾されている少なくとも１つのアミノ酸残基はリン酸化することができる。第２の免疫原性ペプチド中の少なくとも１つのリン酸化されたアミノ酸残基は、リン−Ｓｅｒ、リン−Ｔｈｒ、リン−Ｔｙｒ、リン−Ｈｉｓ、リン−Ａｒｇ、およびリン−Ｌｙｓからなる群から選択することができる。第１の免疫原性ペプチドは、第２の免疫原性ペプチドにおいて少なくとも１つのリン酸化された残基が第１の免疫原性ペプチドにおいてはリン模倣残基で置き換えられていることを除いて、第２の免疫原性ペプチドを含むことができる。第１の免疫原性ペプチド中のリン模倣残基は第２の免疫原性ペプチド中の対応するリン酸化された残基の非加水分解性類似物であることが可能である。ペプチドは、９〜１１アミノ酸または２７〜３１アミノ酸長のような、８〜５０アミノ酸長であり得る。組成物は、ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ、ｎ−ｒａｓ、ｔｐ５３、およびｋｄｍ６Ａからなる群から選択される突然変異タンパク質に由来する第３の免疫原性ペプチドの少なくとも１つをさらに含むことができ、第３のペプチドはタンパク質の全アミノ酸配列を含まず、第１の免疫原性ペプチドはｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ、ｎ−ｒａｓ、ｔｐ５３、またはｋｄｍ６Ａに由来するペプチドではない。これらの態様の組成物は、サポニンまたは免疫賦活性核酸のようなアジュバンドをさらに含むことができる。これらの態様の組成物は、がんを有する対象を処置する方法であって、これらの組成物のいずれかを対象に投与することを含む前記方法において使用することができる。さらなる態様では、組成物は薬剤としての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物は治療ワクチンとしての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物はがんワクチンとしての使用を目的とする。さらなる態様では、組成物はがんの処置のための方法における使用を目的とする。さらなる態様では、本発明は、（ａ）ストレスタンパク質および（ｂ）上記の第２の免疫原性ペプチドまたはその模倣物を含む第１の免疫原性ペプチド、ならびに場合により、（ｃ）上記の第３の免疫原性ペプチドおよび／またはアジュバンドを含む組成物に関する。
図１は、本発明の方法において有用な体細胞突然変異の特徴付けのワークフローを示す。（Ａ）は、本明細書に開示される方法を用いて腫瘍特異的突然変異を特定する例示的な方法の概略図である。（Ｂ）は、本明細書で開示される方法を使用して作成されたＶａｒｉａｎｔ Ｃａｌｌ Ｆｏｒｍａｔ（ＶＣＦ）ファイルのアノテーションの例示的な方法の概略図である。ＭｅｄＧｅｎｏｍｅのＶａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＶａｒｉＭＡＴ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、遺伝子に単一ヌクレオチド改変体（ＳＮＶ）をマッピングする。Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｆｆｅｃｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＶｅＰ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０年８月１５日；２６（１６）：２０６９〜７０、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）を用いて、改変体クラス予測（ミスセンス、ナンセンス、サイレント、ストップロス）を行い、体細胞改変体を、１０００ゲノムプロジェクトで報告されたＳＮＰおよびｉｎｄｅｌならびに他のＳＮＰデータベースにおける対立遺伝子頻度に基づいて特定する。様々なデータベースのデータを使用して、各改変体の疾患関連性にもアノテーションする。（Ｃ）は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００９年１月；６１（１）：１〜１３；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００７年８月２９日；２（８）：ｅ７９６）を用いて９マーおよび１０マーのペプチドライブラリーをＭＨＣ分子へ結合することに関するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測の概略図である。 図２は、本発明の免疫原性組成物に含めるためのペプチドが誘導される突然変異を決定するための順位付けフローを示す図である。腫瘍の突然変異が特定され（左上の隅）、突然変異（斜め矢印に沿って対角に進む）にフィルターを適用しており、これには、例えば、その徴候の全ての腫瘍にまたがって百万マッピング読み取り（ＲＰＫＭ）単位あたりの転写物の１キロベースあたり１つの読み取りを超える、＞０．０５の中央発現レベルの突然変異対立遺伝子の頻度、次いでＭＨＣに結合すると予測されるペプチドに存在する突然変異が含まれる。フィルターから得られるペプチドは、突然変異を中心とする２７アミノ酸と予測され、次に順位付けされ、最初は、予測されるエピトープの数に応じ、次いでＭＨＣへのＩＣ５０結合によって選別される。より高位にランクされたペプチドを合成して、本発明の免疫原性組成物、例えばワクチンに含める。 図３は、ネオエピトープ９マー（Ａ）および１０マー（Ｂ）のペプチドおよびそれらの天然の対応物の散乱プロットのセットであり、予測されるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２結合親和性は≦１５０ｎＭである。 図４は、０日目にＢ１６．Ｆ１０黒色腫細胞を注射した後、以下を３、９および１５日目に投与した６つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける１セットの腫瘍増殖曲線である：第１〜３群：Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫にネオエピトープを含む２つのペプチドＢ−１６−Ｍ２７およびＢ−１６−Ｍ３０と複合体形成したＨｓｃ７０を含む組成物をそれぞれ３μｇ、１０μｇおよび３０μｇ；第４群：３０μｇのＨｓｃ７０単独；第５群：第３群と等量のペプチド単独；ならびに第６群：ポリ（Ｉ：Ｃ）を有する各ペプチド１００μｇ。 図５は、腫瘍増殖曲線が図４に示されているマウスの群にまたがる腫瘍チャレンジ後の平均腫瘍体積を示すグラフである。 図６は、０日目にＢ１６．Ｆ１０黒色腫細胞を注射した後、以下を３、９および１５日目に投与した７つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける１セットの腫瘍増殖曲線である：第１〜３群：Ｂ−１６−Ｍ２７およびＢ−１６−Ｍ３０ペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０を含む組成物をそれぞれ３μｇ、１０μｇおよび３０μｇ；第４群：第３群と同じ組成物を３０μｇと１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバント；第５群：３０μｇのＨｓｃ７０単独；第６群：第３群と等量のペプチド単独；ならびに第７群：ポリ（Ｉ：Ｃ）を有する各ペプチド１００μｇ。 図７は、腫瘍増殖曲線が図６に示されているマウスの群にまたがる腫瘍チャレンジ後の平均腫瘍体積を示す１セットのグラフである。 図８は、腫瘍増殖曲線が図６に示されているマウスの各群における、腫瘍チャレンジ後の生存パーセンテージを示すグラフである。 図９は、５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後３、９および１５日目に示された薬剤で処置したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝１１〜１２／群）における１セットの腫瘍増殖曲線である。２〜３日ごとに腫瘍サイズを評価した。個々のマウスにおける腫瘍増殖動態を、時間の関数としてプロットする。第１群：ＰＢＳ単独；第２群：Ｈｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（ペプチドなし）；第３群および第４群：１８個のペプチド（Ｍ５、Ｍ１２、Ｍ１７、Ｍ２０、Ｍ２２、Ｍ２４、Ｍ２５、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３６、Ｍ４４、Ｍ４５、Ｍ４６、Ｍ４７、Ｍ４８、およびＭ５０）と複合体形成したＨｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントを含む組成物をそれぞれ３０μｇおよび１００μｇ。 図１０は、腫瘍増殖曲線が図９に示されているマウスの群にまたがる腫瘍チャレンジ後の平均腫瘍体積を示すグラフである。 図１１は、５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍チャレンジ後３、９および１５日目に示された薬剤で処置したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝１１〜１２／群）における１セットの腫瘍増殖曲線である。２〜３日ごとに腫瘍サイズを評価した。個々のマウスにおける腫瘍増殖動態を、時間の関数としてプロットする。第１群：ＰＢＳ単独；第２群：Ｈｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（ペプチドなし）；第３群および第４群：５つのペプチド（Ｍ２２、Ｍ２７、Ｍ４４、Ｍ４８、およびＭ５０）と複合体形成したＨｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントを含む組成物をそれぞれ３０μｇおよび１００μｇ。 図１２は、腫瘍増殖曲線が図１１に示されているマウスの群にまたがる腫瘍チャレンジ後の平均腫瘍体積を示すグラフである。 図１３は、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントと組み合わされたＨｓｃ７０−Ｍ２７／Ｍ３０ペプチド複合体で免疫した３匹のマウス由来の脾細胞であって、Ｍ２７およびＭ３０ Ｂ１６．Ｆ１０の２７マー、それらの野生型対応物とともに、またはペプチドなしで培養された、脾細胞の応答を示す棒グラフである。各群内の５×１０５個の脾細胞あたりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均値を示す。各バーは、代表的なマウスの技術的な三つ組みを表す。統計学的有意性は、両側のスチューデントｔ検定を用いて測定する（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．００５を示す）。 図１４は、Ｈｓｃ７０の試料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）クロマトグラムである。 図１５は、Ｈｓｃ７０（実線）および基質ペプチドと組み合わされたＨｓｃ７０（破線）の重ね合わせた１セットのＳＥＣクロマトグラムである。 図１６は、１：４（破線）、１：１０（点線）および１：２０（１点破線）のＨｓｃ７０：ペプチドモル比におけるＨｓｃ７０（実線）およびＨｓｃ７０−Ｍ２７−ペプチド複合体の重ね合わせた１セットのＳＥＣクロマトグラムである。 図１７は、Ｈｓｃ７０：ペプチドモル比を関数とする、Ｍ２７ペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０のパーセンテージのプロットである。 図１８は、３７℃で２時間または３時間のいずれかのインキュベーション後のＨｓｃ７０：ペプチドモル比を関数とする、Ｍ２７ペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０のパーセンテージのプロットである。 図１９は、Ｈｓｃ７０（実線）および高親和性Ｈｓｃ７０結合配列（ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９））に対して、ペプチドリンカー（ＦＦＲＫ（配列番号４４７））を介して、そのＣ末端に融合されたニワトリオボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４４８））と１：１０のＨｓｃ７０：ペプチドモル比で組み合わされたＨｓｃ７０（破線）の重ね合わせた１セットのＳＥＣクロマトグラムである。 図２０は、Ｈｓｃ７０（実線）および高親和性Ｈｓｃ７０結合配列（ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９））に対して、ペプチドリンカー（ＦＦＲＫ（配列番号４４７））を介して、そのＣ末端で融合された、ニワトリオボアルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４４８））（破線）または高親和性Ｈｓｃ７０結合配列に対して、同じペプチドリンカーを介して、そのＮ末端で融合された同じニワトリオボアルブミンペプチド（点線）のいずれかと、１：２のＨｓｃ７０：ペプチドモル比で組み合わされたＨｓｃ７０の重ね合わせた１セットのＳＥＣクロマトグラムである。 図２１は、Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体またはペプチド単独で免疫したマウスから単離した脾細胞のＩＦＮ−γ応答を示すグラフである。データは、箱髭図を用いて示されており、ここでは第１および第３の四分位数が箱の端にあり、中央値は箱の内部に水平線で示され、最大値および最小値は髭の端部である。各ドットは、３匹のマウスのそれぞれの脾細胞を二重に播種したＥＬＩＳＰＯＴプレートの単一ウェルを示す。＊＊は、二元ＡＮＯＶＡ検定を用いて統計的に有意であった（ｐ値＜０．０５）。
本開示は、治療ワクチン（例えばがんワクチン）として有用な組成物、およびこのような組成物を生産する方法を提供する。本明細書において開示される組成物は、概して、ストレスタンパク質、および患者のがんに存在するがん特異的突然変異を含む少なくとも１つの合成抗原ペプチドを利用する。本明細書において開示される方法は、微量の対象組織（例えば、単細胞またはエキソソーム）を使用して治療ワクチン（例えばがんワクチン）組成物を調製することを可能にするという点で特に有利である。
１．抗原ペプチドを同定する方法
本発明の方法は、概して、がん細胞に由来する１つまたはそれ以上の突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む抗原ペプチドの同定を伴う。
本明細書において使用される場合、用語「突然変異体」は、タンパク質（またはペプチド断片もしくはそのＭＨＣ結合エピトープ）の文脈では、対象の疾患組織（例えばがん細胞）において見られるが対象の正常もしくは健康な組織においては見られないアミノ酸突然変異（例えば、置換、挿入、もしくは欠失）を含有するタンパク質（もしくはそのペプチド断片もしくはＭＨＣ結合エピトープ）；対象の疾患組織（例えばがん細胞）において見られるが対象の正常もしくは健康な組織においては見られない（もしくは逆の場合も同様）アミノ酸修飾（例えば、リン酸化などの翻訳後修飾）を含有するタンパク質（もしくはそのペプチド断片もしくはＭＨＣ結合エピトープ）；正常もしくは健康な細胞と比較してがん細胞において異なる発現プロフィールを有するタンパク質（もしくはそのペプチド断片もしくはＭＨＣ結合エピトープ）（例えば、がん細胞で発現されるが正常細胞では発現されないタンパク質）；または疾患組織（例えばがん細胞）と正常細胞とで抗原提示経路において異なってプロセシングされて、ＭＨＣ分子によって提示される異なるペプチドを生じさせるタンパク質（もしくはそのペプチド断片もしくはＭＨＣ結合エピトープ）を指す。あるいは、ある特定の実施形態では、突然変異体タンパク質（またはそのペプチド断片もしくはＭＨＣ結合エピトープ）は、正常組織と比較してがん細胞において高いレベルの翻訳後修飾（例えばリン酸化）を示すタンパク質である。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって得ることができる免疫原性ペプチドを含む組成物に関する。突然変異体タンパク質（またはその突然変異体ペプチド断片もしくは突然変異体ＭＨＣ結合エピトープ）に存在し得る突然変異には、限定はしないが、アミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失突然変異、または遺伝子融合突然変異が含まれる。本明細書において使用される場合、「遺伝子融合突然変異」は、遺伝子融合体によってコードされるタンパク質の切断点ジャンクション（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合切断点ジャンクション）によって形成される新エピトープを指す。
本明細書において使用される場合、用語「ＭＨＣ結合エピトープ」は、上記のアッセイのいずれかによってＭＨＣ分子（例えばヒトＭＨＣ）を結合することが示される、またはソフトウェアプログラム（例えばＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０、２１３〜２１９，１９９９、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）によってＭＨＣ分子（例えばヒトＭＨＣ）を結合すると予測されるエピトープを指す。使用することができる他の方法には、Ｇｕａｎ，Ｐ．ら、（２００３）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２：６３〜６６；Ｂｌｙｔｈｅ，Ｍ．Ｊ．ら、（２００２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１８：４３４〜４３９；Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．およびＤｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ，Ｉ．Ａ．（２００２）．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１：１６７〜１７６；Ｙｕ，Ｋ．ら、（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８：１３７〜４８；Ｂｒｕｓｉｃ，Ｖ．ら、（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８０：２８０〜２８５；Ｊｕｎｇ，Ｇ．ら、（２００１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、２９：１７９〜１８１（Ｔ細胞エピトープ予測プログラムＥＰＩＰＲＥＤＩＣＴを記載している）；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．ら、（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２２：５８３〜５８８；Ｍａｌｌｉｏｓ，Ｒ．Ｒ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７：９４２〜９４８；Ｒｏｍｉｓｃｈ，Ｋ．（２００１）．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６：５３１；Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．ら、（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５７：１〜１６；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．およびＲａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７：１２３６〜１２３７；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｈ．ら、（２０００）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５５：５１９〜５３１；Ｂｕｕｓ，Ｓ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１：２０９〜２１３；Ｍａｌｌｉｏｓ，Ｒ．Ｒ．（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１５：４３２〜４３９；Ｍａｆｆｅｉ，Ａ．およびＨａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｅ．（１９９８）．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１９：１７９〜１９８；ならびにＶｉｔａ Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４年１０月９日．ｐｉｉ：ｇｋｕ９３８．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２５３００４８２（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで入手可能なｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）３．０．について記載している）（これらの各々は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）において開示されている方法が含まれる。
本明細書において使用される場合、ＭＨＣ結合エピトープの文脈での用語「野生型」は、野生型アミノ酸配列、野生型翻訳後修飾を有し、がん細胞においてのみ発現されないか、または正常細胞と比較してがん細胞で過剰発現する、ＭＨＣ結合エピトープを指す。
本発明の方法のある特定の実施形態では、対象から得たがん細胞のゲノムＤＮＡのエキソームが配列決定され、非突然変異（野生型）対照（対象の非がん細胞など）と比較され、そして突然変異体タンパク質をコードする非同義の体細胞突然変異体対立遺伝子が同定される。ある特定の実施形態では、同一の対象試料から、または同一の対象から得た新たながん細胞試料から得たｍＲＮＡが配列決定されて、がんで発現するｍＲＮＡにおいて見られるその体細胞突然変異が同定される。
ある特定の実施形態では、突然変異体対立遺伝子の発現レベルも判定される。突然変異体対立遺伝子に対応する遺伝子についてのＲＮＡ ＲｅｆＳｅｑデータが入手可能である、ある特定の実施形態では、突然変異体対立遺伝子の転写産物の発現が、正規化された突然変異含有リード数（ＮＭＲＣ）によって判定される。ＮＭＲＣは、突然変異を含有するｃＤＮＡから得られた次世代シーケンシング（ＮＧＳ）リードの数を、マッピングされたヌクレオチドの総数で割り、それに正規化係数として１０１０をかけたものである。このようにして、ＮＭＲＣは、シーケンシング実験で得られたヌクレオチドの総数に対して正規化された、突然変異を含有するリードの数に相当する。ある特定の実施形態では、１０より大きい正規化された突然変異含有リード数（ＮＭＲＣ）を有する突然変異体対立遺伝子を使用して、抗原ペプチドが生成される。ある特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、または９より大きい正規化された突然変異含有リード数（ＮＭＲＣ）を有する突然変異体対立遺伝子を使用して、抗原ペプチドが生成される。
ＲＮＡ ＲｅｆＳｅｑデータが利用不可能である他の実施形態では、同一の徴候のがんにおける突然変異体対立遺伝子の発現レベルは、公開されているデータベース（例えば、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ−Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ（ＴＣＧＡ：ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）；Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＣＧＣ：ｗｗｗ．ｉｃｇｃ．ｏｒｇ））から推定され、突然変異を含む転写産物の発現中央値は、１００万マッピング数あたりの転写産物キロベースあたりのリード（ＲＰＫＭ）に基づいて判定される。ＲＮＡ−Ｓｅｑ実験において、ｃＤＮＡ断片はシーケンシングされ、遺伝子に、理想的には個別の転写産物にマッピングし戻される。適切に正規化されたＲＮＡ−Ｓｅｑリード、すなわちＲＰＫＭは、転写産物の相対量の評価基準として使用することができる。ある特定の実施形態では、１を超えるＲＰＫＭリードを有する突然変異体対立遺伝子を使用して抗原ペプチドが生成される。ある特定の実施形態では、１を超えるＲＰＫＭリードを有する突然変異体対立遺伝子を使用して抗原ペプチドが生成される。一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０を超えるＲＰＫＭリードを有する突然変異体対立遺伝子を使用して抗原ペプチドが生成される。
ある特定の実施形態では、突然変異体対立遺伝子の対立遺伝子頻度が判定される。本明細書において使用される場合、突然変異体対立遺伝子に関する用語「対立遺伝子頻度」は、試料内の他の対立遺伝子（例えば野生型対立遺伝子）に対する突然変異体対立遺伝子の相対量である（画分またはパーセンテージで表される）。
ある特定の実施形態では、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型が判定される。本明細書において開示される対象のＤＮＡのシーケンシングを含む、ＨＬＡ型を判定するためのあらゆる手段を使用することができる。
対象の腫瘍細胞において発現される突然変異体対立遺伝子を同定した後、突然変異体対立遺伝子によってコードされる１つまたはそれ以上の突然変異体ペプチド（１つまたはそれ以上の突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む）が、例えば、０．０５を超える対立遺伝子頻度、１を超えるＲＰＫＭ単位の発現中央値レベル（例えば、同一の徴候の全てのがんにわたる）、および／または対象のＨＬＡ分子の１つまたはそれ以上に結合する予測される能力を有することに基づいて選択される。ある特定の実施形態では、選択された突然変異体ペプチドは、例えば、予測される突然変異体ＭＨＣ結合エピトープの数によって、および／または対象のＨＬＡ型への予測される結合親和性（例えばＩＣ５０）によって、さらにランク付けされる。本発明の方法において有用な、突然変異の特徴付けのワークフローを図１に示す。
ある特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の抗原ペプチドアミノ酸が合成され、各ペプチドは、前述の選択された突然変異体ペプチドの１つまたはそれ以上を含む。合成されると、ペプチドは本発明の免疫原性組成物において使用することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、合成された抗原ペプチドが細胞表面ＭＨＣ分子上に提示された場合にＴ細胞によって認識されるかどうかを判定することをさらに含む。
１．１．次世代シーケンシング
ある特定の実施形態では、核酸（例えば、腫瘍ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）の配列は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して判定される。ＮＧＳは、「高度多重化アンプリコンシーケンシング」と呼ばれる多くの異なる近代的シーケンシング技術を説明するために使用される一般名称である。配列情報を得るための化学は異なる次世代シーケンシングプラットフォームによって変わるが、それらの全ては、複数のシーケンシング反応が同時に行われる非常に大きい数のシーケンシング鋳型から配列データを得るという共通の特徴を有している。通常、これらのシーケンシング反応の全てから得られるデータは、スキャナーを使用して回収され、次いで集められ、コンピュータおよびバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムを使用して分析される。シーケンシング反応は、大規模に同時のまたは多重の様式で行われ、リードされ、集められ、そして分析される。
ＮＧＳプラットフォームには、限定はしないが、４５４ ＦＬＸ（商標）または４５４ ＴＩＴＡＮＩＵＭ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ＳＯＬＥＸＡ（商標）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＳＯＬＩＤ（商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）機器、イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ナノポアエキソヌクレアーゼシーケンシング（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に依拠するＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、および合成によるＤＮＡシーケンシング（ＳＢＳ）技術（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。
ＮＧＳの典型的な実施形態には、例えば、固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ＳＯＬＥＸＡ（商標）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）が含まれる。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、およそ１００〜１５０ｂｐをリードする。多少長めの断片がジェネリックアダプターにライゲーションされ、そのアダプターを使用してスライドにアニーリングされる。ＰＣＲを行って各リードが増幅され、同一のリードの多くのコピーを有するスポットが生じる。これらは次いで一本鎖に分離されて配列決定される。スライドにヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼが流される。これらのヌクレオチドは、塩基に対応する色で蛍光標識される。これらはまたターミネーターも有し、そのため、一度に付加される塩基は１つだけである。スライドの画像が撮影される。各リード位置に、付加された塩基を示す蛍光シグナルがあることとなる。スライドは次いで、次のサイクルのために準備される。ターミネーターは除去されて次の塩基の付加が可能になり、蛍光シグナルは除去されて、シグナルによる次の画像の汚染が予防される。このプロセスは反復され、一度に１つのヌクレオチドが付加され、その間に画像化される。コンピュータを次いで使用して、各画像の各部位にある塩基が検出され、これらの塩基を使用して配列が構築される。
ＮＧＳの別の典型的な実施形態には、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４シーケンシングが含まれる。４５４シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａよりもはるかに長いリードを可能にする。Ｉｌｌｕｍｉｎａのように、４５４シーケンシングは、塩基が付加される際の光学的シグナルを読んで一度に複数のリードをシーケンシングすることによってこれを行う。Ｉｌｌｕｍｉｎａにおけるように、ＤＮＡまたはＲＮＡは、より短いリードに、このケースでは最大１ｋｂに断片化される。ジェネリックアダプターが末端に付加され、これらはビーズあたり１ＤＮＡ断片でビーズにアニーリングされる。断片は次いで、アダプター特異的プライマーを使用してＰＣＲによって増幅される。各ビーズは次いで、スライドの単一ウェル内に置かれる。したがって、各ウェルは、単一配列の多くのＰＣＲコピーで覆われた単一のビーズを含有することになる。ウェルはまた、ＤＮＡポリメラーゼおよびシーケンシング緩衝液を含有する。スライドに、４つのＮＴＰ種の１つが流される。このヌクレオチドが配列内で次にある場合、このヌクレオチドは配列リードに付加される。この単一塩基が反復する場合、さらなるその塩基が付加される。したがって、グアニン塩基を流し、配列における次の塩基がＧである場合、１つのＧが付加されるが、配列の次の部分がＧＧＧＧである場合、４つのＧが付加される。このＮＴＰミックスは洗い流される。次のＮＴＰミックスが付加され、このプロセスが反復され、４つのＮＴＰにわたってサイクルされる。この種のシーケンシングによって、各ヌクレオチド洗浄液についてのシグナル密度を示す、各配列リードのグラフが作成される。配列は次いで、各洗浄液内のシグナル密度から計算的に判定することができる。４５４から得られた配列リードの全ては異なる長さであり、それは、異なる数の塩基が各サイクルで付加されるためである。
ＮＧＳの別の典型的な実施形態には、例えば、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔおよびＩｏｎ ｐｒｏｔｏｎシーケンシングが含まれる。ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＲｏｃｈｅ ４５４とは異なり、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔおよびＩｏｎ ｐｒｏｔｏｎシーケンシングは光学的シグナルを使用しない。その代わりに、これらは、ＤＮＡポリマーへのｄＮＴＰの付加によってＨ＋イオンが放出されるという事実を利用する。他の種のＮＧＳにおけるように、インプットＤＮＡまたはＲＮＡは、約２００ｂｐの長さに断片化される。アダプターが付加され、１つの分子がビーズ上に置かれる。分子はエマルジョンＰＣＲによってビーズ上で増幅される。各ビーズは、スライドの単一のウェル内に置かれる。４５４のように、スライドに、単一種のｄＮＴＰが一度に１つのＮＴＰで、緩衝液およびポリメラーゼと共に流される。放出された各Ｈ＋イオンがｐＨを低下させるため、ｐＨがそれぞれのウェルにおいて検出される。ｐＨの変化によって、その塩基が配列リードに付加されたかどうか、およびそのいくつが付加されたかどうかを判定することが可能になる。ｄＮＴＰは洗い流され、このプロセスが反復され、異なるｄＮＴＰ種にわたってサイクルされる。ｐＨの変化は、存在する場合、いくつの塩基（存在する場合）が各サイクルで付加されたかどうかを判定するために使用される。
ＮＧＳプラットフォームの説明はまた、参照によってその各々の全体を組み入れる：Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００８、第２６巻、第１０号、１１３５〜１１４５；Ｍａｒｄｉｓ、「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００７、第２４巻、第３号、１３３〜１４１頁；Ｓｕら、「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ、２０１１、１１（３）：３３３〜４３；Ｚｈａｎｇら、「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」、Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１１、３８（３）：９５〜１０９；Ｑｕａｉｌら、（２０１２）．「Ａ ｔａｌｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ」．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３（１）：３４１；Ｌｉｕら、（２０１２）．「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｉｎｄａｗｉ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２０１２：１〜１１；ＥＭＢＬ−ＥＢＩのウェブサイトｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで公開されている、ＥＢＩ：Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅにおいても見ることができる。
１．２．エキソームシーケンシングおよびＨＬＡ判定
患者の腫瘍および生殖細胞系のＤＮＡ試料のシーケンシングは、全エキソームキャプチャを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑなどのＮＧＳプラットフォームを使用して行うことができる。例えば、腫瘍突然変異は今や、免疫療法臨床試験の背景において、試料入手の数週間以内に全て迅速かつ効果的に同定することができる（Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０１４．１１１（８）：１４６９〜７５頁、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。さらに、患者のＨＬＡ型は、標準的ＮＧＳエキソーム（ＤＮＡ）およびＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＲＮＡ）プロファイリングの両方から同時に判定することができる（Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ、２０１３．４（１２）：１０２頁；Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ、２０１２．４（１２）：９５頁、参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる）。あるいは、ＨＬＡ型は、適切な臨床アッセイを使用して判定することができるか、または個別支払いのプロバイダーによって行われる。ある特定の実施形態では、核酸は、患者の腫瘍細胞から（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）増幅することができる。この増幅は、非常に小さな試料（例えば、単細胞またはエキソソーム）の使用を可能にし、腫瘍試料から患者自身のペプチドを採取することに依存する先行技術の免疫原性ペプチド生産方法に対する本発明の１つの利点である。
１．３．非同義の体細胞突然変異体対立遺伝子の同定
ＮＧＳシーケンシングから得られたヌクレオチド「リード」は、ヒトゲノムにマッピングされる。ＤＮＡ腫瘍リードは生殖細胞系ＤＮＡリードと比較されて、生殖細胞系の一塩基多型（ＳＮＰ）である突然変異が同定および排除され、腫瘍特異的突然変異を含む腫瘍ハプロタイプが統計的に同定される。ＤＮＡ判定された腫瘍突然変異にオーバーラップする腫瘍ＲＮＡリードを調べて、突然変異の存在および突然変異体ＲＮＡの発現が確認される。局所的なＮＧＳリード再マッピングを、挿入または欠失または遺伝子融合が検出される場合には特に行う。「リード再マッピング」は、ゲノム全体までの最初のリードアラインメント（マッピング）後の、潜在的な擬陽性（spurious false-positive）突然変異細胞を排除するための、高感度アラインメントアルゴリズムを使用する、それらの局所的ゲノム領域内での（局所的リード再マッピングと呼ばれることが多いプロセス）、リード再マッピングを指す。さらに、腫瘍特異的突然変異は、腫瘍におけるＤＮＡ突然変異の対立遺伝子頻度に従って評価され、突然変異がＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）データベースにおいてリストされている場合には、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって公開される。さらなる腫瘍特異的突然変異の出現についての発見およびモニタリングは、無細胞ＤＮＡ試験（ｃｆＤＮＡ；Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで市販されている）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、および循環エキソソームＲＮＡ（Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む液体生検の試験によって評価することができる。
データ処理を次いで使用して、突然変異が腫瘍において高レベルで転写されるかどうか（ＲＮＡ−Ｓｅｑ ＮＧＳリードによって示される）、突然変異がタンパク質をコードする転写産物において生じるかどうか、および突然変異がタンパク質コード配列における非同義の突然変異を生じさせるかどうかが判定される。ワクチンの製造には必須ではないが他の情報もまた得ることができ、これには、突然変異体タンパク質の機能および細胞内局在化、タンパク質変化の分子的結果、ならびにタンパク質変化の予想される臨床的結果が含まれる。
１．４．免疫学的特徴付けおよび突然変異含有ペプチドのランク付け
ある特定の実施形態では、突然変異は、表１に示す特徴付けの１つまたはそれ以上を使用して特徴付けされる。突然変異含有ペプチドもまた、表１に示す基準に従ってランク付けすることができ、そのプロセスは図２にまとめられている。表１にリストする特徴付けの全てが、免疫原性組成物の製剤化を成功させるために、突然変異含有ペプチドのランク付けに必要であるわけではない。例えば、ある特定の実施形態では、４つの特徴付けで十分である。ある特定の実施形態では、５つ、６つ、または７つの特徴付けが、さらなる絞り込みのために使用される。ある特定の実施形態では、表１における特徴付けの全てが使用される。
Figure 2018515519
１．５ ホスホペプチド突然変異体の同定
ある特定の実施形態では、対象のがん細胞から同定される突然変異体ペプチドはホスホペプチドであり、ここで、リン酸化された残基（例えば、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、および／またはＨｉｓ）は、対象の対応する正常細胞においてはリン酸化されていない（または、実質的に低い程度までしかリン酸化されていない）。突然変異体ホスホペプチドは、当技術分野において知られているあらゆる方法を使用して患者のがん細胞から同定することができる。適切な方法には、限定はしないが、参照によってその各々の全体を組み入れる、Ｍｅｙｅｒら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００９年７月；８（７）：３６６６〜７４．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｐｒ８００９３７ｋ、およびＺａｒｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６年１０月３日；１０３（４０）：１４８８９〜９４において説明されているものが含まれる。適切な突然変異体ペプチドが同定されると、抗原性ホスホペプチドまたはホスホペプチド模倣体を、本発明の治療用組成物の使用、使用するための組成物、および方法のために合成することができる（例えば、本明細書において記載されるように）。
２．抗原ペプチド
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される組成物は、異なる抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含み、各抗原ペプチドは、対象のがん細胞の１つまたはそれ以上の突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む。特に、ある特定の実施形態では、本発明は、抗原ペプチドに結合した精製されたストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の組成物であって、各複合体が異なる抗原ペプチドを含み、異なる抗原ペプチドの各々ががん細胞に由来する１つまたはそれ以上の突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含み、かつ組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する５つ以下の異なる抗原ペプチドを含む、第１の組成物に関する。突然変異体ＭＨＣ結合エピトープは、膠芽腫（ＧＢＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）に罹患しているかまたはそれから回復している対象などの対象から同定される。抗原ペプチドは、合成によってもしくは組換えＤＮＡ技術によって調製することができるか、または天然由来源から単離することができる。抗原ペプチドは、ＧＢＭまたはＭＭなどのがんの治療および／または予防に有用な組成物を得るために、アジュバントと組み合わせて使用することができる。抗原ペプチドを含む組成物は免疫原性であり、対象におけるがんに対する有利な免疫応答を引き起こすために効果的である。
ＭＨＣ分子は、クラスＩまたはクラスＩＩ分子として分類される。クラスＩＩのＭＨＣ分子は、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージなどの、免疫応答の開始および維持に関与する細胞で主に発現される。クラスＩＩのＭＨＣ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖および提示された特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘発する。クラスＩのＭＨＣ分子は、ほとんど全ての有核細胞で発現され、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、その後、抗原担持細胞を破壊する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍拒絶およびウイルス感染との闘いにおいて特に重要である。ＣＴＬは、無傷の外来抗原自体よりも、ＭＨＣクラスＩ分子に結合したペプチド断片の形態の抗原を認識する。ペプチドの、ＭＨＣ分子を結合する能力は、抗原提示の阻害（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３８９３、１９９１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み立てアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ ６２：２８５、１９９０）、およびＲＭＡ．Ｓなどの突然変異細胞を使用するＦＡＣＳに基づくアッセイ（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３、１９９１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）などの、様々な異なる手段で測定することができる。ＭＨＣクラスＩ分子に結合すると予測されるＭＨＣ結合エピトープは、典型的には８から１１の間の残基であり、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合すると予測されるＭＨＣ結合エピトープは、典型的には１０から２０残基の範囲である。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書において開示される組成物において使用される抗原ペプチドは、長さが５〜５０の間のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０アミノ酸）である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは、長さが５から５０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは、長さが２５から４０、２７から３１、または２１〜３１アミノ酸である。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法によって同定される抗原ペプチドを包含する。例えば、腫瘍細胞において発現される突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む固有のペプチドが、マッピングされたＲＮＡ−Ｓｅｑリードによって同定される。このような同定されたペプチドはまた、アミノ酸の付加または欠失によって修飾することができる。例えば、いくつかの（１、２、３、４、または５つの）さらなるアミノ酸残基を、抗原ペプチドの抗原性または免疫原性が破壊されなければ、ペプチドのいずれかの末端または両末端に付加するかまたはそこから除去することができる。ペプチドはまた、ある特定の残基、例えばＭＨＣ結合エピトープ内に位置する残基の、順序または組成を改変することによって修飾することができる。ＭＨＣ分子への結合に必須のある特定のアミノ酸残基、例えば重要な接触部位にあるアミノ酸残基、またはエピトープ内の保存された残基が、通常は免疫原性活性に対する有害作用を伴わずに改変されることはないことは容易に理解される。
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書において開示される方法を使用して同定される突然変異体ペプチドの改変体である抗原ペプチドであって、そのアミノ酸配列が元々同定されたペプチドに少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％類似している抗原ペプチドを提供する。好ましくは、類似性は９０％、最も好ましくは９５％またはそれ以上である。改変体は、同定されたアミノ酸配列に対するアミノ酸の保存的置換がほとんどであるか、またはそれのみを含む。アミノ酸置換のいずれかがペプチドのエピトープ内で生じる場合は好ましくはわずかである。
配列内でのアミノ酸の保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。保存的置換は、アミノ酸残基を生物学的におよび／または化学的に類似の別のアミノ酸残基で置き換えること、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基で置き換えること、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような修飾は、例えば、参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１〜３４７（１９８６）、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１〜２８４頁（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ）、第２版（１９８４)において記載されているような周知のペプチド合成手順を使用して行うことができる。
さらに別の実施形態では、本発明は、熱ショックタンパク質に結合するアミノ酸配列を含む抗原ペプチドを包含する。このようなアミノ酸配列は、本明細書において、「熱ショックタンパク質結合配列」と呼ばれる。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、またはそれ以下のＫｄで熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、またはカルレティキュリン）に結合する。熱ショックタンパク質結合配列は、典型的には長さが５から１５アミノ酸残基であり、当技術分野において周知である。このような結合配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの、本発明のペプチドＭＨＣ結合エピトープを含むペプチドのセグメントの、熱ショックタンパク質への非共有結合を容易にするために、本発明において利用される。多くのこのような結合配列は、ＭＨＣ結合エピトープが由来する元であるペプチドに対して異種である。多くのタンパク質に存在する異種のショックタンパク質の結合部位を使用することができる。このような熱ショックタンパク質結合配列の例は、米国特許第７，４２０，０３７号および米国特許第７，３０９，４９１号、ならびにＰＣＴ／ＵＳ９６／１３３６３に対応するＰＣＴ公開ＷＯ９７／０６８２１、Ｂｌｏｎｄ−Ｅｌｇｕｉｎｄｉ，Ｓ．ら、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐａｎｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＢｉＰ．」Ｃｅｌｌ ７５：７１７〜７２８（１９９３）；Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ａｓ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３８５〜３９０（１９８９）；Ａｕｇｅｒ，Ｉ．ら、「ＨＬＡ−ＤＲ４ ａｎｄ ＨＬＡ−ＤＲ１０ ｍｏｔｉｆｓ ｔｈａｔ ｃａｒｒｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｂｉｎｄ ７０−ｋＤ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：３０６〜３１０（１９９６）；およびＧｒａｇｅｒｏｖ，Ａ．ら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤｎａＫ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．」Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３５：８４８〜８５４（１９９４）において開示されている。熱ショックタンパク質結合配列の使用は、例えば、参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる、Ｍｏｒｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００，９７：３４８５において記載されている。
本発明の組成物において有用な熱ショックタンパク質結合配列の１つの例は、配列：Ｈｙ（Ｔｒｐ／Ｘ）ＨｙＸＨｙＸＨｙを有する七量体セグメントであり、式中、Ｈｙは疎水性アミノ酸残基、特にトリプトファン、ロイシン、またはフェニルアラニンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。このような熱ショックタンパク質結合配列、または他の熱ショックタンパク質結合配列は、好ましくは、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列の末端のいずれか一方に存在する。場合により、熱ショックタンパク質結合配列は、いくつかのアミノ酸からなる短いペプチドリンカー（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる米国特許第７，３０９，４９１号において開示されている、配列：グリシン−セリン−グリシンまたはｐｈｅ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｌｙｓを有するトリペプチドリンカー）によって末端のいずれか一方に連結することができる。このような抗原ペプチドは、ペプチド結合によってペプチドの残り部分に連結された熱ショックタンパク質結合配列のアミノ酸残基で化学的に合成することができる。あるいは、このような抗原ペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって融合ペプチドとして合成することができる。本明細書において開示される抗原ペプチドに含めるのに適切な熱ショックタンパク質結合配列、例えば、高親和性熱ショックタンパク質結合配列には、限定はしないが、ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）、ＮＬＬＲＬＴＧＷ（配列番号４４０）、ＨＷＤＦＡＷＰＷ（配列番号４４１）、ＨＷＤＦＡＷＰ（配列番号４４２）、ＦＹＱＬＡＬＴＷ（配列番号４４３）、ＦＹＱＬＡＬＴ（配列番号４４４）、ＲＫＬＦＦＮＬＲＷ（配列番号４４５）、およびＲＫＬＦＦＮＬＲ（配列番号４４６）が含まれる。
ある特定の実施形態では、本発明は、熱ショックタンパク質結合配列を含む抗原ペプチドを包含する。一部の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、長さが５から１５アミノ酸である。本明細書において開示される抗原ペプチドに含めるのに適切な熱ショックタンパク質結合配列には、限定はしないが、ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）、ＮＬＬＲＬＴＧＷ（配列番号４４０）、ＨＷＤＦＡＷＰＷ（配列番号４４１）、ＨＷＤＦＡＷＰ（配列番号４４２）、ＦＹＱＬＡＬＴＷ（配列番号４４３）、ＦＹＱＬＡＬＴ（配列番号４４４）、ＲＫＬＦＦＮＬＲＷ（配列番号４４５）、およびＲＫＬＦＦＮＬＲ（配列番号４４６）が含まれる。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列はＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）である。一部の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドのＣ末端にある。一部の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドのＮ末端にある。一部の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドの中央にある。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列の末端のいずれか一方にある。ある特定の実施形態では、熱ショックタンパク質結合配列は、リンカーを介してＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列の末端のいずれか一方に連結される。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは長さが２から１０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはＦＦＲＫ（配列番号４４７）である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが５から５０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが２５から４０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが２７から３１アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが８から１２アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープは、リン酸化された残基を含む。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープは、リン酸化模倣残基を含む。ある特定の実施形態では、リン酸化模倣残基は、リン酸化された残基の加水分解不可能な類似体である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが８から１２アミノ酸であり、ＭＨＣ結合エピトープは、リン酸化された残基を含む。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが８から１２アミノ酸であり、ＭＨＣ結合エピトープはリン酸化模倣残基を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは長さが１５から６０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは長さが１５から４０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは長さが３０〜６０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣ結合エピトープを含む長さが２７〜３１アミノ酸のアミノ酸配列；長さが２〜１０アミノ酸のペプチドリンカー、例えばＦＦＲＫ（配列番号４４７）；ならびに長さが５〜１５アミノ酸の熱ショックタンパク質結合配列、例えば、ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）、ＮＬＬＲＬＴＧＷ（配列番号４４０）、ＨＷＤＦＡＷＰＷ（配列番号４４１）、ＨＷＤＦＡＷＰ（配列番号４４２）、ＦＹＱＬＡＬＴＷ（配列番号４４３）、ＦＹＱＬＡＬＴ（配列番号４４４）、ＲＫＬＦＦＮＬＲＷ（配列番号４４５）、およびＲＫＬＦＦＮＬＲ（配列番号４４６）を含有する、長さが３４〜５６アミノ酸、例えば、長さが３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、または５６アミノ酸であり、ここで、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列、ペプチドリンカー、および熱ショックタンパク質結合配列は、Ｎ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端まで連続的に配置されている。特定の実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣ結合エピトープ；ペプチドリンカーＦＦＲＫ（配列番号４４７）；および熱ショックタンパク質結合配列ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）を含む長さが２７アミノ酸のアミノ酸配列を含有する、長さが３８アミノ酸であり、ここで、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列、ペプチドリンカー、および熱ショックタンパク質結合配列は、Ｎ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端まで連続的に配置されている。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、等しい長さの２つのペプチドが隣接した中央部の突然変異残基を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は長さが２７アミノ酸であり、長さが１３アミノ酸の２つのペプチドが隣接した１４位の突然変異残基を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は長さが２９アミノ酸であり、長さが１４アミノ酸の２つのペプチドが隣接した１５位の突然変異残基を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は長さが３１アミノ酸であり、長さが１５アミノ酸の２つのペプチドが隣接した１６位の突然変異残基を含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣ結合エピトープ；長さが２〜１０アミノ酸のペプチドリンカー、例えばＦＦＲＫ（配列番号４４７）；ならびに長さが５〜１５アミノ酸の熱ショックタンパク質結合配列、例えば、ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）、ＮＬＬＲＬＴＧＷ（配列番号４４０）、ＨＷＤＦＡＷＰＷ（配列番号４４１）、ＨＷＤＦＡＷＰ（配列番号４４２）、ＦＹＱＬＡＬＴＷ（配列番号４４３）、ＦＹＱＬＡＬＴ（配列番号４４４）、ＲＫＬＦＦＮＬＲＷ（配列番号４４５）、およびＲＫＬＦＦＮＬＲ（配列番号４４６）を含む、長さが８〜１２アミノ酸のアミノ酸配列を含有する、長さが１５〜３７アミノ酸、例えば、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７アミノ酸であり、ここで、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列、ペプチドリンカー、および熱ショックタンパク質結合配列は、Ｎ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端まで連続的に配置されている。特定の実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣ結合エピトープ；ペプチドリンカーＦＦＲＫ（配列番号４４７）；および熱ショックタンパク質結合配列ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）を含む長さが９アミノ酸のアミノ酸配列を含有する、長さが２０アミノ酸であり、ここで、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列、ペプチドリンカー、および熱ショックタンパク質結合配列は、Ｎ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端まで連続的に配置されている。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープはＭＨＣクラスＩ結合エピトープである。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが８〜１２アミノ酸であり、リン酸化された残基を含む。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、長さが８〜１２アミノ酸であり、リン酸化模倣残基を含む。ある特定の実施形態では、リン酸化模倣残基は、リン酸化された残基の加水分解不可能な類似体である。
好ましい一実施形態では、抗原ペプチドの各々は、熱ショックタンパク質結合配列をそのＮ末端またはＣ末端で含み、さらに好ましくは、抗原ペプチドの各々は、熱ショックタンパク質結合配列をそのＣ末端で含みかつ／または熱ショックタンパク質結合配列は、ペプチドリンカーを介して抗原ペプチドの残り部分に連結される。好ましい一実施形態では、ペプチドリンカーはアミノ酸配列ＦＦＲＫ（配列番号４４７）を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の抗原ペプチドは、アミノ酸配列ＦＦＲＫＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４７７）をＣ末端で含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドはさらに、突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む長さが２７〜３１アミノ酸（例えば、長さが２７、２９、または、３１アミノ酸）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、腫瘍特異的突然変異をアミノ酸配列のほぼ中央で有する（例えば、腫瘍特異的突然変異は、２７、２９、または３１アミノ酸ペプチドのそれぞれ約１４、１５、および１６位にある）。
ある特定の実施形態では、本発明の抗原ペプチドは、アミノ酸配列ＮＬＬＲＬＴＧＦＦＲＫ（配列番号４７８）をＮ末端で含む。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドはさらに、突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含む長さが２７〜３１アミノ酸（例えば、長さが２７、２９、または３１アミノ酸）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＭＨＣ結合エピトープを含むアミノ酸配列は、腫瘍特異的突然変異をアミノ酸配列のほぼ中央で有する（例えば、腫瘍特異的突然変異は、２７、２９、または３１アミノ酸ペプチドのそれぞれ約１４、１５、および１６位にある）。
本発明の範囲内に含まれるものは、翻訳の間または後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、または、既知の保護基／遮断基もしくはタンパク質分解性の切断による誘導体化によって修飾される、抗原ペプチドの誘導体または類似体である。多くの化学的修飾のいずれかを、限定はしないが、遊離ＮＨ２基、遊離ＣＯＯＨ−基、ＯＨ−基、側鎖Ｔｒｐ−、Ｔｙｒ−、Ｐｈｅ−、Ｈｉｓ−、Ａｒｇ−、またはＬｙｓ−の保護または修飾に有用な試薬；臭化シアン、ヒドロキシルアミン、ＢＮＰＳ−Ｓｋａｔｏｌｅ、酸、またはアルカリでの加水分解による特異的化学的切断；トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による酵素切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成などを含む、既知の技術によって行うことができる。
ある特定の実施形態では、ホスホペプチド模倣体が利用され、この場合、抗原ペプチド内のリン酸化されたアミノ酸残基がリン酸化模倣基で置き換えられる。リン酸化模倣基の非限定的な例には、Ｏ−ボラオホスホ、ボロノ、Ｏ−ジチオホスホ、ホスホルアミド、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート、ホスホロチオレート、ホスホジチオレート、およびホスホロフルオリデートが含まれ、このいずれも、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓ残基上で誘導体化することができる。ある特定の実施形態では、ＡｓｐまたはＧｌｕ残基がリン酸化模倣体として使用される。ＡｓｐまたはＧｌｕ残基もまたリン酸化模倣基として機能し、ペプチド内のホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ｔｈｒ、ホスホ−Ｓｅｒ、ホスホ−Ａｒｇ、ホスホ−Ｌｙｓおよび／またはホスホ−Ｈｉｓ残基の代わりに使用することができる。
２．１．化学合成による抗原ペプチドの生産
抗原ペプチドは、ペプチド合成装置の使用を含む標準的な化学的方法によって合成することができる。従来のペプチド合成または当技術分野において周知の他の合成プロトコールを使用することができる。
抗原ペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドは、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９によって記載されているものに類似の手順を使用して、固相ペプチド合成によって合成することができる。合成の間、保護された側鎖を有するＮ−α−保護されたアミノ酸が、そのＣ末端によって連結している成長中のポリペプチド鎖、および不溶性のポリマー担体、すなわちポリスチレンビーズに段階的に付加される。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護されたアミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化されたＮ−α−保護されたアミノ酸のα−カルボキシル基に連結することによって、合成される。活性化したカルボキシルへの遊離アミノ基の付着によって、ペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるＮ−α−保護基には、酸に不安定なＢｏｃおよび塩基に不安定なＦｍｏｃが含まれる。適切な化学、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸、および試薬の詳細は、当技術分野において周知である（参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９９３、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）。
さらに、抗原ペプチドのペプチド類似体および誘導体は、上記に記載するように化学的に合成することができる。必要に応じて、非古典的なアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、置換または付加としてペプチド配列内に導入することができる。非古典的なアミノ酸には、限定はしないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザインアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、およびＮ−α−メチルアミノ酸が含まれる。
Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓの側鎖でリン酸化されたペプチドは、適切な側鎖保護されたＦｍｏｃ−ホスホアミノ酸を使用するＦｍｏｃ固相合成で合成することができる。この方法で、リン酸化されたおよびリン酸化されていないＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓ残基の組合せを有するペプチドを合成することができる。例えば、Ｓｔａｅｒｋａｅｒらの方法を適用することができる（１９９１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３２：５３８９〜５３９２）。他の手順（一部は特異的アミノ酸のため）は、Ｄｅ Ｂｏｎｔら、(１９８７、Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ Ｐａｙｓ Ｂａｓ １０６：６４１、６４２）、ＢａｎｎｗａｒｔｈおよびＴｒｅｚｅｃｉａｋ（１９８７、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１７５〜１８６）、ＰｅｒｉｃｈおよびＪｏｈｎｓ（１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９：２３６９〜２３７２）、Ｋｉｔａｓら（１９９０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４１８１〜４１８７）、Ｖａｌｅｒｉｏら（１９８９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３３：４２８〜４３８）、Ｐｅｒｉｃｈら（１９９１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３２：４０３３〜４０３４）、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ（１９９４、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３５：１９５〜２）、ならびにＰｅｒｉｃｈ（１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：２４５〜２６６、参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる）において詳述されている。
ホスホペプチドはまた、塩基性ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸で形質転換された細胞を最初に培養することによって生産することができる。このようなポリペプチドを細胞培養によって生産した後、適切なアミノ酸のヒドロキシル基を、有機合成またはリン酸化酵素を用いる酵素的方法を使用してリン酸基によって置換する。例えば、セリン特異的なリン酸化のケースでは、セリンキナーゼを使用することができる。
ホスホペプチド模倣体もまた合成することができ、この場合、抗原ペプチド内のリン酸化されたアミノ酸残基がリン酸化模倣基で置き換えられる。リン酸化模倣基の非限定的な例には、Ｏ−ボラオホスホ、ボロノ、Ｏ−ジチオホスホ、ホスホルアミド、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート、ホスホロチオレート、ホスホジチオレート、およびホスホロフルオリデートが含まれ、このいずれも、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓ残基上で誘導体化することができる。ある特定の実施形態では、ＡｓｐまたはＧｌｕ残基がリン酸化模倣として使用される。ＡｓｐまたはＧｌｕ残基もまたリン酸化模倣基として機能し、ペプチド内のホスホ−Ｔｙｒ、ホスホ−Ｔｈｒ、ホスホ−Ｓｅｒ、ホスホ−Ａｒｇ、ホスホ−Ｌｙｓ、および／またはホスホ−Ｈｉｓ残基の代わりに使用することができる。
得られたペプチドの精製は、逆相を使用する分取ＨＰＬＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、および／またはイオン交換クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用して行われる。適切なマトリクスおよび緩衝液の選択は、当技術分野において周知であり、したがって、本明細書では詳述しない。
２．２．組換えＤＮＡ技術を使用する抗原ペプチドの生産
抗原ペプチドはまた、当技術分野において知られている組換えＤＮＡ法によって調製することができる。抗原ペプチドをコードする核酸配列は、アミノ酸配列の逆翻訳によって得ることができ、オリゴヌクレオチド合成装置の使用などの標準的な化学的方法によって合成することができる。あるいは、抗原ペプチドのコード情報は、特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ方法論を使用してＤＮＡ鋳型から得ることができる。抗原ペプチドの変型および断片は、抗原的に同等の分子をもたらす置換、挿入、または欠失によって作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、同一の抗原性タンパク質または抗原性タンパク質の変型をコードするＤＮＡ配列を本発明の実施において使用することができる。これらには、限定はしないが、配列内の抗原的に同等なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変される、ひいてはサイレントなまたは保存的な変化をもたらす、ヌクレオチド配列が含まれる。抗原ペプチドをコードする核酸は、宿主細胞における増殖および発現のために発現ベクターに挿入することができる。
本明細書において検討される長さのペプチドについてのコード配列は、化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）のホスホトリエステル法によって合成することができるため、修飾は、天然のペプチド配列をコードする塩基を適切な塩基で置換することによって簡単に行うことができる。コード配列は次いで適切なリンカーを付けられ、当技術分野において一般的に利用可能な発現ベクター内にライゲーションされ、ベクターは、所望のペプチドまたは融合タンパク質を生産するために適切な宿主を形質転換するために使用される。多くのこのようなベクターおよび適切な宿主系は、現在利用可能である。ペプチドまたは融合タンパク質の発現のために、コード配列には、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供するための、作動可能に連結している開始コドンおよび停止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域、ならびに通常は複製系がつけられる。
発現構築物は、適切な宿主細胞におけるペプチドの発現を可能にする１つまたはそれ以上の調節領域と作動可能に連結している抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。「作動可能に連結した」は、調節領域および発現されるペプチド配列が、転写および最終的には翻訳を可能にするような方法で連結され位置する、関連を指す。
ペプチドの転写に必要な調節領域は、発現ベクターによって提供される。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）もまた、その同族開始コドンを欠くペプチド遺伝子配列が発現される場合には、提供される。適合性である宿主−構築物系において、ＲＮＡポリメラーゼなどの細胞転写因子は、発現構築物上の調節領域に結合して、宿主生物内のペプチド配列の転写に影響する。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、宿主細胞ごとに変化し得る。通常、ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、作動可能に関連した核酸配列の転写を促進し得る、プロモーターが必要である。このような調節領域には、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などの、転写および翻訳の開始に関与する５'非コード配列が含まれる。コード配列の３'側の非コード領域は、ターミネーターおよびポリアデニル化部位などの転写終結調節配列を含有する。
プロモーターなどの調節機能を有するＤＮＡ配列をペプチド遺伝子配列に付着させるため、またはペプチド遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、適切な適合性の制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを、当技術分野において周知の技術によって、ｃＤＮＡの末端にライゲーションすることができる（Ｗｕら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：３４３〜３４９、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。制限酵素での切断の後に、戻し消化すること（digesting back）または一本鎖ＤＮＡ末端を埋め込むことによる、平滑末端を生じさせるための修飾を、ライゲーションの前に行うことができる。あるいは、所望の制限酵素部位を含有するプライマーを用いるＰＣＲの使用によるＤＮＡの増幅によって、所望の制限酵素部位をＤＮＡ断片内に導入することができる。
調節領域と作動可能に連結している抗原ペプチド配列を含む発現構築物は、さらなるクローニングを行わずに、ペプチドの発現および生産のために適切な宿主細胞内に直接導入することができる。発現構築物はまた、例えば相同組換えを介する、宿主細胞のゲノム内へのＤＮＡ配列の組み込みを容易にするＤＮＡ配列を含有する。この場合、宿主細胞においてペプチドを増幅または発現させるために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを使用する必要はない。
プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または修飾されたウイルスを含む様々な発現ベクターを使用することができる。典型的には、このような発現ベクターは、適切な宿主細胞におけるベクターの増殖のための機能的複製起点、ペプチド遺伝子配列の挿入のための１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたはそれ以上の選択マーカーを含む。発現ベクターは、本発明の抗原ペプチドの１つまたはそれ以上についてのヌクレオチド配列を有するように構築することができる。発現ベクターは、限定はしないが細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、およびヒトを含む原核生物または真核生物に由来する適合性の宿主細胞と共に使用しなければならない。このような宿主細胞は、例えば、本発明の抗原ペプチドのいずれかをコードする１つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列を含有する単一の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによって、または本発明の異なる抗原ペプチドをコードする複数の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによって、１つまたはそれ以上の抗原ペプチドを発現するように形質転換することができる。
細菌系において、多くの発現ベクターを、抗原ペプチドを生産するために有利に選択することができる。例えば、医薬組成物の生成などのために大量のこのようなタンパク質を生産する場合、精製が容易な高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、ペプチドコード配列がｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクター内に個別にライゲーションされ、その結果融合タンパク質を生産する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ Ｊ．２、１７９１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６４、５５０３〜５５０９、参照によってその各々の全体を本明細書に組み入れる）などが含まれる。ｐＧＥＸベクターもまた、これらのペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用することができる。通常、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着およびその後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製される。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、したがって、抗原ペプチドがＧＳＴ部分から放出される。
あるいは、長期では、的確に処理されたペプチド複合体の高い収量、哺乳動物細胞における安定な発現が好ましい。ペプチド複合体を安定的に発現する細胞系は、選択マーカーを含有するベクターを使用して操作することができる。例えば、発現構築物の導入の後、操作された細胞を強化培地内で１〜２日成長させることができ、次いで、選択培地に移す。発現構築物における選択マーカーによって、選択に対する耐性が付与され、細胞が発現構築物をそれらの染色体に安定的に組み込むこと、および培養物において成長すること、および細胞系に増殖することが最適に可能になる。このような細胞は、ペプチドが連続的に発現している間、長期にわたって培養することができる。
組換え細胞は、標準的な温度、インキュベーション時間、光学密度、および培地組成の条件下で培養することができる。しかし、組換え細胞の成長のための条件は、抗原ペプチドの発現の条件とは異なる。修正された培養条件および培地はまた、ペプチドの生産を増強するために使用することができる。例えば、ペプチドとその同族プロモーターとを含有する組換え細胞は、熱もしくは他の環境ストレス、または化学的ストレスに晒すことができる。当技術分野において知られているあらゆる技術を適用して、ペプチド複合体を生産するための最適な条件を確立することができる。
本発明の一実施形態では、メチオニンをコードするコドンが抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に付加されて、ペプチドの翻訳を開始するためのシグナルが提供される。このメチオニンは抗原ペプチドに付着したままであるか、または、メチオニンを、ペプチドからのメチオニンの切断を触媒し得る酵素（複数可）の添加によって除去することができる。例えば、原核生物および真核生物の両方で、Ｎ末端のメチオニンは、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）（Ｔｓｕｎａｓａｗａら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、５３８２〜５３９１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）によって除去される。メチオニンアミノペプチダーゼは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、およびラットを含むいくつかの生物から単離およびクローニングされている。
ペプチドは、細菌、哺乳動物、もしくは他の宿主細胞型から、または培養培地から、既知の方法によって回収することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２巻、第８章、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｃｏ．、１９９４年７月を参照されたい、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。
３．熱ショックタンパク質および使用方法
３．１．熱ショックタンパク質
本発明の実施において有用な、ストレスタンパク質として本明細書において互換的にも言及される熱ショックタンパク質は、他のタンパク質またはペプチドに結合可能であり、かつ結合したタンパク質またはペプチドを、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下または酸性条件下で放出可能である、任意の細胞タンパク質から選択され得る。このようなタンパク質の細胞内濃度は、細胞がストレスの多い刺激に曝された場合に増大し得る。ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、ｓＨＳＰ類、およびＰＤＩファミリーは、ストレスによって誘発される熱ショックタンパク質に加えて、例えば、３５％を超えるアミノ酸同一性を有する（但しその発現レベルはストレスによって変化しない）、配列類似性で、ストレス誘発性ＨＳＰに関連するタンパク質も含む。したがって、ストレスタンパク質または熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の定義には、細胞内の発現レベルがストレスのある刺激に応答して増強されるこれらのファミリーのメンバーと比較して、少なくとも３５％（例えば、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％）のアミノ酸同一性を有する、他のタンパク質、その突然変異体、類似物および改変体を包含することが考えられる。
上記の主要なＨＳＰファミリーに加えて、小胞体常在タンパク質であるカルレティキュリンもまた、抗原性分子と複合体形成した場合に免疫応答を誘発するのに有用なさらに別の熱ショックタンパク質として特定されている（ＢａｓｕおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８９：７９７〜２０２；参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。本発明で使用することができる他のストレスタンパク質としては、ｇｒｐ７８（またはＢｉＰ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ｈｓｐ１１０、およびｇｒｐ１７０（Ｌｉｎら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、４：１１０９〜１１１９；Ｗａｎｇら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６５：４９０〜４９７、それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）が挙げられる。これらのファミリーの多くのメンバーは、栄養素の欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、低酸素、および細胞内病原体による感染を含む、他のストレスのある刺激に応答して誘導されることが後に見出された。（Ｗｅｌｃｈ、１９９３年５月、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、５６〜６４；Ｙｏｕｎｇ、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：４０１〜４２０；Ｃｒａｉｇ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：１９０２〜１９０３；Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５５：３３〜４５；およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔら、１９８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２２：６３１〜６７７（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）を参照のこと）。これらのファミリーの全てに属するＨＳＰ／ストレスタンパク質は、本発明の実施において使用することができると考えられる。ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質は、ペプチド−ＭＨＣ提示を容易にする任意のシャペロンタンパク質を包含する。適切なシャペロンタンパク質としては、限定するものではないが、ＥＲシャペロン、例えば、タパシン（例えば、ヒトタパシン）が挙げられる。
主要なＨＳＰは、ストレス細胞において非常に高いレベルに蓄積し得るが、ストレスを受けていない細胞では、低〜中レベルで生じる。例えば、高誘発性哺乳動物ｈｓｐ７０は、常温ではほとんど検出できないが、熱ショック時に細胞内で最も活発に合成されるタンパク質の１つとなる（Ｗｅｌｃｈら、１９８５、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０１：１１９８−１２１１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。対照的に、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ６０タンパク質は、哺乳動物細胞の全てではないがほとんどにおいて常温で豊富であり、熱によりさらに誘導される（Ｌａｉら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２８０２〜１０；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１：５２５〜３１、それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。
種々の実施形態において、熱ショックタンパク質のファミリーまたは熱ショックタンパク質の改変体内の熱ショックタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、低〜中程度のストリンジェンシー条件下でＨＳＰをコードするヌクレオチド配列を含むプローブとのハイブリダイゼーションによって特定および取得することができる。
例として、このような低ストリンジェンシー条件を使用する手順は、以下のとおりである（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６７８９〜６７９２も参照のこと）。ＤＮＡを含むフィルターは、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４０℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、以下の改変を有する同じ溶液中で行う：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）の硫酸デキストラン。フィルターを、ハイブリダイゼーション混合物中で、４０℃で１８〜２０時間インキュベートし、次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含む溶液中で、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と交換し、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾燥させ、シグナル検出のために曝露する。必要であれば、シグナル検出の前にフィルターを６５〜６８℃で３回洗浄する。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件（例えば、異種間ハイブリダイゼーションのために使用される）は、当該技術分野において周知である。
ＨＳＰが使用される場合、ＨＳＰのペプチド結合断片ならびにＨＳＰの機能的に活性な誘導体、類似物、および改変体もまた使用してもよい。「ＨＳＰペプチド結合断片」という用語は、ペプチドと非共有結合的に会合して複合体を形成し得、免疫応答を誘発し得るドメインを含むが、全長のＨＳＰではないポリペプチドを指して用いられる。「ＨＳＰの改変体」という用語は、ペプチドと非共有結合的に会合して複合体を形成し、免疫応答を誘発することができるが、ＨＳＰと高度の配列類似性を共有するポリペプチドを指す。２つのアミノ酸配列または核酸配列間の同一性の領域を決定するために、配列を最適比較目的のために整列させる（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入してもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されるならば、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いても達成し得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４〜２２６８のアルゴリズムであって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３−５８７７（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）において改変されるアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得てもよい。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得てもよい。比較目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２に記載のように利用してもよい。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠隔の関係を検出する反復検索を行ってもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、前出）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してもよい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いてもよい。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容するか否かを問わず、上記と同様の技術を用いて決定してもよい。同一性パーセントの計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。
一実施形態では、例えば、ｈｓｐ７０およびｈｓｃ７０ペプチド結合ドメイン誘導体および類似物を設計してもよい。Ｈｓｐ７０ペプチド結合部位の３次元構造をコンピュータモデリングすることにより、ｈｓｃ７０改変体を含むｈｓｐ７０ファミリーのメンバーの改変体を設計してもよく、ここでは、ペプチド結合にも構造的に重要な決定基にも関与しないアミノ酸残基は、野生型残基に置き換えてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明のＨＳＰペプチド結合断片は、Ｎ末端側でペプチド結合ドメインに天然に隣接する可変数のアミノ酸とＮ末端側で隣接しており、Ｃ末端側でペプチド結合ドメインに天然に隣接する可変数のアミノ酸とＣ末端側で隣接している、ペプチド結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２００１／００３４０４２（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載されているＨＳＰのペプチド結合断片を参照のこと。
天然に存在するＨＳＰのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースにおいて一般に入手可能である。例えば、ホモサピエンスの熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０（熱ショック７０ｋＤａプロテイン１Ａ）は、以下の識別子を有する：ＨＧＮＣ：５２３２；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３３０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２０４３８９；ＯＭＩＭ：１４０５５０；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０８１０７およびＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５３４５．５。Ｅｎｔｒｅｚのようなコンピュータプログラムを使用して、データベースを閲覧し、任意のアミノ酸配列および目的の遺伝子配列データを受託番号で検索してもよい。これらのデータベースを検索して、アラインメントスコアおよび統計値によって同様の配列をランク付けする、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴなどのプログラムを使用して、クエリー配列に対する種々の程度の類似性を有する配列を特定してもよい。本発明のＨＳＰペプチド結合断片の調製に使用することができるＨＳＰの非限定的な例のそのようなヌクレオチド配列は、以下のとおりである：ヒトＨｓｐ７０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５３４５、Ｓａｒｇｅｎｔら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：１９６８〜１９７２；ヒトＨｓｃ７０：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１１１４２、Ｙ００３７１；ヒトＨｓｐ９０、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５１８３、Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：７１０８；ヒトｇｐ９６：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５１８７、Ｍａｋｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．、８７：５６５８〜５５６２；ヒトＢｉＰ：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１９６４５；Ｔｉｎｇら、１９８８、ＤＮＡ、７：２７５〜２８６；ヒトＨｓｐ２７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２４７４３；Ｈｉｃｋｅｙら、１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：４１２７〜４５；マウスＨｓｐ７０：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２１、Ｈｕｎｔら、１９９０、Ｇｅｎｅ、８７：１９９〜２０４；マウスｇｐ９６：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１６３７０、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：３８０７〜３８１１；およびマウスＢｉＰ：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６２７７、Ｈａａｓら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：２２５０〜２２５４（これらの文献の各々は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。遺伝暗号の縮重に起因して、「ＨＳＰ核酸配列」という用語は、天然に存在するヌクレオチド配列を指すだけでなく、ＨＳＰをコードする他の全ての縮重ＤＮＡ配列も包含する。
医薬調製物中のＨＳＰは、組織からの精製によって、または組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。ＡＴＰの存在下または酸性条件下（ｐＨ１〜ｐＨ６．９）で組織からＨＳＰを、その後の１つ以上の抗原ペプチドへのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体形成のために精製してもよい。Ｐｅｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４：１３−２１；ＬｉおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：３１４３−３１５１（これらの参考文献の各々は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）を参照のこと。「精製された」ストレスタンパク質または熱ショックタンパク質は、細胞内、細胞抽出物中、細胞培養培地中、または個体内のタンパク質に関連する物質を実質的に含まない。
所与のＨＳＰまたはそのペプチド結合ドメインの規定されたアミノ酸またはｃＤＮＡ配列を用いて、宿主細胞にトランスフェクトされて発現される遺伝子構築物を作製してもよい。組換え宿主細胞は、宿主細胞中のＨＳＰ核酸配列の発現を駆動する調節領域（複数可）と作動可能に連結された、ＨＳＰまたはペプチド結合断片をコードする配列を含む核酸配列の１つ以上のコピーを含んでもよい。組換えＤＮＡ技術は、組換えＨＳＰ遺伝子またはＨＳＰ遺伝子の断片を生成するために容易に利用可能であり、標準的技術を用いてそのようなＨＳＰ遺伝子断片を発現させることができる。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＨＳＰペプチド結合ドメインをコードする任意の核酸配列を用いて、本発明のＨＳＰまたはペプチド結合断片を調製してもよい。遺伝子配列の多くのコピーが生成されるように、ペプチド結合ドメインを含むＨＳＰ遺伝子断片を、適切なクローニングベクターに挿入して、宿主細胞に導入してもよい。限定するものではないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２などのプラスミド、ｐＵＣプラスミド誘導体、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＥＴシリーズのベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの当該技術分野で公知の多数のベクター宿主系を使用してもよい。当該技術分野で公知の任意の突然変異誘発技術を使用して、発現されたペプチド配列中でアミノ酸置換（複数可）を行う目的で、またはさらなる操作を容易にするために制限部位を作製／欠失させるために、ＤＮＡ配列中の個々のヌクレオチドを改変してもよい。
ＨＳＰまたはペプチド結合断片は、それらが発現される細胞からの回収および精製を容易にするために融合タンパク質として発現されてもよい。例えば、ＨＳＰまたは断片は、培養培地への分泌のために小胞体膜を横切ってその転位を指向させるシグナル配列リーダーペプチドを含んでもよい。さらに、ＨＳＰまたは断片は、ＨＳＰの任意の部分に融合された親和性標識、または結合抗原ペプチドに関与しない断片（例えば、カルボキシル末端など）を含んでもよい。親和性標識を使用して、親和性パートナー分子に結合することによって、タンパク質の精製を容易にしてもよい。免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Ｐｅｔｔｙ、１９９６、Ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ＆Ｗｉｌｅｙｓ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Ｓｍｉｔｈ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、４：２２０−２２９、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）、Ｅ．ｃｏｌｉのマルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎら、１９８７、Ｇｅｎｅ、６７：２１〜３０、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）、および種々のセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４号、第５，２０２，２４７号、第５，１３７，８１９号；Ｔｏｍｍｅら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、７：１１７−１２３、それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）など、当該技術分野で公知の種々の親和性標識を使用してもよい。
そのような組換えＨＳＰまたは断片は、免疫応答を誘発する能力に関して、抗原ペプチド結合活性についてアッセイしてもよい（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｋｌａｐｐａら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．、１７：９２７〜９３５を参照のこと）。宿主細胞またはライブラリー細胞中で産生された組換えＨＳＰは、免疫原性組成物の意図されたレシピエントと同じ種であることが好ましい。組換えヒトＨＳＰが最も好ましい。
一実施形態では、組織から単離されたＨＳＰは、異なるＨＳＰ、例えばｈｓｐ７０およびｈｓｃ７０の混合物である。医薬組成物は、例えば、ＤｗｏｒｎｉｃｚａｋおよびＭｉｒａｕｌｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：５１８１−５１９７（１９８７）に記載されているようなヒトｈｓｃ７０配列、ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１１１４２および／またはＹ００３７１（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）を用いて、組換えＤＮＡ法によって産生された精製ヒトｈｓｃ７０を含んでもよい。ある特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０配列は、ＨｕｎｔおよびＭｏｒｉｍｏｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２（１９）、６４５５〜６４５９（１９８５）ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ０ＤＭＶ８および／またはＭ１１７１７（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載されるとおりである。
他の実施形態では、ストレスタンパク質は、天然のストレスタンパク質よりも大きい標的抗原ペプチドに対する親和性を有する突然変異ストレスタンパク質である。このような突然変異ストレスタンパク質は、抗原ペプチドがリン酸化されているかもしくはホスホペプチド模倣物（非加水分解性類似物など）であるか、または他のいくつかの翻訳後修飾を有する場合に有用であり得る。
本発明の組成物の好ましい実施形態において、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびそれらの２つ以上の組合せからなる群より選択される。１つの好ましい実施形態では、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、さらにより好ましくはヒトｈｓｃ７０である。別の好ましい実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｐ７０であり、さらに好ましくはヒトｈｓｐ７０である。ストレスタンパク質は、抗原ペプチドに非共有結合されても、または共有結合されてもよい。好ましい実施形態では、ストレスタンパク質は、抗原ペプチドに非共有結合されている。１つの好ましい実施形態では、組成物中のストレスタンパク質の量は、１０μｇ〜６００μｇ、例えば２５μｇである。
３．２．熱ショックタンパク質−ペプチド複合体の調製
本明細書に記載の本発明の組成物を調製するための、ＨＳＰを抗原ペプチド集団とｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成するための例示的な方法を記載する。複合体形成反応は、ＨＳＰとペプチドとの間の共有結合の形成を生じ得る。複合体形成反応は、ＨＳＰとペプチドとの間の非共有結合的会合の形成を生じ得る。種々の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された複合体は、場合により精製される。熱ショックタンパク質と抗原ペプチドとの精製複合体は、細胞中、または細胞抽出液中のこのような複合体に関連する物質を実質的に含まない。精製された熱ショックタンパク質および精製された抗原ペプチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体形成反応において使用される場合、熱ショックタンパク質および抗原ペプチドの「精製された」複合体という用語は、複合体に含まれない遊離ＨＳＰおよびペプチドをも含む組成物を排除しない。本発明の組成物の好ましい実施形態において、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびそれらの２つ以上の組合せからなる群より選択される。１つの好ましい実施形態では、ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、さらにより好ましくはヒトｈｓｃ７０である。別の好ましい実施形態では、ストレスタンパク質はｈｓｐ７０であり、さらに好ましくはヒトｈｓｐ７０である。ストレスタンパク質は、抗原ペプチドに非共有結合しても、または共有結合していてもよい。好ましい実施形態では、ストレスタンパク質は、抗原ペプチドに非共有結合している。１つの好ましい実施形態において、組成物中のストレスタンパク質の量は、１０μｇ〜６００μｇ、例えば２５μｇである。
複合体形成の前に、ＨＳＰをＡＴＰで前処理するか、または酸性条件に曝して、目的のＨＳＰと非共有結合的に会合し得る任意のペプチドを除去してもよい。酸性条件は、ｐＨ１〜ｐＨ２、ｐＨ２〜ｐＨ３、ｐＨ３〜ｐＨ４、ｐＨ４〜ｐＨ５、ｐＨ５〜ｐＨ６、およびｐＨ６〜ｐＨ６．９の範囲を含む、ｐＨ１〜ｐＨ６．９の範囲の任意のｐＨレベルである。ＡＴＰ手順が使用される場合、余分なＡＴＰは、Ｌｅｖｙら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６７：２６５〜２７４（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載されるように、アピラナーゼの添加によって調製物から除去される。酸性条件を使用する場合、緩衝液は、ｐＨ改変試薬の添加によって中性ｐＨに再調整される。全抗原ペプチドまたは任意の１つのペプチドとＨＳＰのモル比は、限定するものではないが、０．０１：１、０．０２：１、０．０５：１、０．１：１、０．２：１、０．５：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、４９：１、最大１００：１を含む、０．０１：１〜１００：１の任意の範囲であってもよい。本発明の組成物の一実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、１：０．０１〜１：１００の範囲であってもよい。本発明の組成物のある特定の実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、少なくとも１：１（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、４９：１、最大１００：１）である。本発明の組成物のある特定の実施形態では、それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、１：１以下（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：５０、１：１００またはそれ未満）である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＰとのペプチドの集団の非共有結合複合体形成のための好ましい例示的プロトコールを、以下に考察する。
抗原ペプチドの集団は、本発明の異なる抗原ペプチド種の混合物を含んでもよい。次いで、混合物を、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）のような適切な結合緩衝液、または２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、３５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液中で、４〜５０℃で１５分間〜３時間、前処理したＨＳＰと共にインキュベートする。ＨＳＰと適合性である任意の緩衝液を使用してもよい。次いで、任意の未結合のペプチドを除去するために、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０アセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）による遠心分離によって、調製物を場合により精製する。タンパク質／ペプチドとＨＳＰとの非共有結合的会合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または質量分析（ＭＳ）によってアッセイしてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の腫瘍特異的抗原ペプチドは、長さが２７アミノ酸（「２７マー」）であり、約３０００ダルトンの平均分子量を有する。ＨＳＰ７０の分子量が７０，０００ダルトンであると仮定すると、がん患者を処置するのに十分な量の腫瘍特異的抗原ペプチドとＨＰＳ７０との複合体を生成するために、以下の物質が必要となる。一実施形態では、２４０μｇの用量のＨＳＰ７０を患者に１２回投与することを意図するものと仮定すれば、約３ｍｇのＨＳＰ７０が必要とされる。一実施形態において、１０個の２７マーペプチドがＨＳＰ７０と複合体形成される場合、複合体形成反応に必要とされるペプチドの総量は、総ペプチド：タンパク質の１：１のモル比を仮定して、１２４μｇ（各ペプチド１２．４μｇ）である。総ペプチド：タンパク質の４：１のモル比が好ましい場合、総ペプチド４９４μｇが必要とされる。ある特定の実施形態では、ＨＳＰ７０種は、組換えヒトＨｓｃ７０（ｒｈＨｓｃ７０）である。ある特定の実施形態では、ＨＳＰ７０種は、組換えヒトＨｓｐ７０（ｒｈＨｓｐ７０）である。ある特定の実施形態では、ｒｈＨｓｃ７０を、２．７ｍＭのリン酸二ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸カリウム一塩基、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む結合緩衝液中で、３７℃で抗原ペプチドの混合物と共に６０分間インキュベートする。例示的な代替結合緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液中の９％スクロース、または２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＡＤＰを含む。ＨＳＰ７０−ペプチド結合インキュベーション混合物は、場合により、必要な場合、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０アセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて、１回以上遠心分離して、任意の結合していないペプチドを除去してもよい。
ある特定の実施形態では、２５μｇ用量のＨＳＰ７０を患者に１２回投与し、これには合計で３００μｇのＨＳＰ７０を必要とする。１０個の２７マーペプチドが、ＨＳＰ７０と複合体を形成する一実施形態では、複合体化反応に必要とされるペプチドの総量は、総ペプチド：タンパク質のモル比が１：１であると仮定して１２．９μｇ（各ペプチド１．２９μｇ）である。総ペプチド：タンパク質の４：１のモル比が好ましいならば、５１．６μｇの総ペプチドが必要とされる。
上記のＨＳＰ７０およびペプチドの量は、患者へのワクチンの投与に必要な最小限の例示的な量であること、ならびに品質管理試験および特定の規制要件を満たす目的で追加の物質を製造してもよいことが理解されよう。
特定の実施形態において、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体は、患者への投与直前にベッドサイドでＱＳ−２１アジュバントと混合される。ある特定の実施形態では、ＱＳ−２１の用量は５０μｇである。
１０個未満または１０個超のペプチドがＨＳＰ７０と複合体を形成する場合、ペプチドの量は、場合によっては１：１，４：１または１０：１という好ましい総ペプチド：タンパク質のモル比を維持するように適宜、調整される。同様に、ＨＳＰ７０と複合体を形成するために長さが２７アミノ酸より短いペプチドまたは長いペプチドを使用することが望ましい場合、各ペプチドの分子量を計算し、１：１、４：１または１０：１という好ましいペプチド：タンパク質のモル比を維持するように適宜、各ペプチドの量が調整される。
あるいは、ペプチドとｇｐ９６またはｈｓｐ９０の非共有結合複合体を生成するために、各タンパク質の分子量を計算し、所与の患者について予想される総投与量を決定する。一例では、１２用量のｇｐ９６−ペプチド複合体が患者に投与され、ｇｐ９６の用量が２５μｇであると仮定すると、総タンパク質３００μｇが必要とされる。一実施形態において、１０個の２７マーペプチドがｇｐ９６と複合体を形成する場合、総ペプチド：タンパク質（この場合、ｇｐ９６）のモル比が１：１であると仮定して、複合体形成反応に必要なペプチドの総量は９．４μｇ（各ペプチド０．９４μｇ）である。総ペプチド：タンパク質の４：１のモル比が好ましいならば、総ペプチド３７．５μｇが必要とされる。結合緩衝液は、ＨＳＰ７０−ペプチド結合反応について記載された緩衝液と同様であり得る。
ペプチドとの複合体形成後、免疫原性ＨＳＰ複合体は、例えば、以下に記載する混合リンパ球標的細胞アッセイ（ＭＬＴＣ）を用いて場合によりアッセイしてもよい。特定の実施形態において、複合体は、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（Ｔａｇｕｃｈｉ Ｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９０；１２８：６５〜７３、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）によって測定される。一旦、ＨＳＰ−ペプチド複合体が単離され、希釈されれば、それらは、以下に考察される投与プロトコールおよび賦形剤を用いて、動物モデルにおいて、場合によりさらに特徴付けされてもよい。
ＨＳＰおよびペプチドの非共有結合複合体を作製する代わりに、抗原ペプチドをＨＳＰに共有結合させてもよい。
ＨＳＰは、化学的架橋によってペプチドに共有結合され得る。化学的架橋方法は当該技術分野において周知である。例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用してもよい。グルタルアルデヒド架橋は、ペプチドおよびＨＳＰの共有結合複合体の形成に使用されている（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｂａｒｒｉｏｓら、１９９２、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２：１３６５〜１３７２を参照のこと）。ＨＳＰ−ペプチド複合体１〜２ｍｇを、０．００２％グルタルアルデヒドの存在下で２時間架橋させる。グルタルアルデヒドは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して一晩透析することによって除去される（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｌｕｓｓｏｗら、１９９１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：２２９７〜２３０２）。あるいは、ＨＳＰおよびペプチドは、当該技術分野で公知の条件下で、紫外線（ＵＶ）架橋によって架橋されてもよい。
個別の共有結合および／または非共有結合の複合体形成反応由来のＨＳＰおよび抗原ペプチドの複合体を、対象に投与する前に、場合により組み合わせて組成物を形成してもよい。
抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の多数の異なる複合体を、本明細書に開示されるように、単一の組成物に含んでもよい。ある特定の実施形態では、組成物は、１００個以下の異なる抗原ペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の抗原ペプチド、例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個の抗原ペプチドを含む）。
ある特定の実施形態では、組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含む抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、２０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）の異なる抗原ペプチド（野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する）を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含む抗原ペプチドは含まない。
４．医薬組成物
本開示の組成物は、多発性骨髄腫（ＭＭ）などのがんの予防および処置のため、有効成分として単独で、または１つ以上のアジュバントと組み合わせて、異なる抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含む本明細書に記載の本発明の組成物を含む医薬組成物を包含する。そのような医薬組成物は、ワクチン製剤、特にがんワクチン製剤として有用である。ワクチン製剤は、安定な滅菌の、好ましくは注射可能な製剤をもたらす任意の方法によって調製してもよい。
ある特定の実施形態では、ストレスタンパク質／抗原ペプチド複合体の複合体を含む組成物は、１つ以上のアジュバントと混合されている。多くの異なるアジュバントが、本明細書に開示される組成物と共に使用されてもよい。組成物（複数可）およびアジュバント（複数可）は、同じ流量で一緒に混合されてもよく、組成物（複数可）は、１つ以上のアジュバント（複数可）を含んでもよい。
例えば、全身性アジュバントおよび粘膜アジュバントを含む、種々のアジュバントを使用してもよい。全身性アジュバントとは、非経口的に送達され得るアジュバントである。全身性アジュバントとしては、デポ効果を生じるアジュバント、免疫系を刺激するアジュバント、およびその両方を行うアジュバントが挙げられる。デポ効果を生じるアジュバントは、抗原を体内でゆっくりと放出させるアジュバントであり、したがって免疫細胞の抗原への曝露を延長する。このクラスのアジュバントとしては、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；またはエマルジョン系の製剤、例としては、鉱油、非鉱油、油中水型もしくは水中油型の油中型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ−ｉｎ ｏｉｌ）エマルジョン、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０、ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）などの水中油型エマルジョン；ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０で安定化された水中スクアレンエマルジョン；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ；およびＰＲＯＶＡＸ（安定化用洗剤およびミセル形成剤を含有する水中油型エマルジョン；ＩＤＥＣ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ）が挙げられる。
他のアジュバントは免疫系を刺激し、例えば、免疫細胞を産生させ、サイトカインまたはＩｇＧを分泌させる。このクラスのアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性核酸；ＱＳ−２１のようなサポナリア（ｓａｐｏｎａｒｉａ）樹の樹皮から精製されたサポニン；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）；ＲＮＡ模倣物、例えば、ポリイノシン酸：ポリ−リジンで安定化されたポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）またはポリＩ：Ｃ（ポリ−ＩＣＬＣ［Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）；Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃ．］；モノホスホリルリピドＡ（ＬＰＳ）のようなリポ多糖類（ＬＰＳ）の誘導体（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）およびトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミン二糖類；ＯＭ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、 Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ならびにリーシュマニア伸長因子（精製リーシュマニアタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が挙げられる。
他の全身性アジュバントは、デポ効果を生じ、免疫系を刺激するアジュバントである。これらの化合物は、全身性アジュバントの上記の機能の両方を有する。このクラスのアジュバントにとしては、限定するものではないが、ＩＳＣＯＭ（混合サポニン、脂質を含み、かつ抗原を保持することができる細孔を有するウイルスサイズの粒子；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａを形成する免疫賦活複合体）；ＭＰＬおよびＱＳ−２１を含有するリポソームに基づく製剤であるＡＳ０１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＡＳ０２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＭＰＬおよびＱＳ−２１を含有する水中油型エマルジョン：ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＡＳ０４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅであって、これはミョウバンおよびＭＰＬを含む；ＧＳＫ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＭＰＬおよびＱＳ−２１を含有するリポソームに基づく製剤であるＡＳ１５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、例えばＣＲＬ １００５（これらはポリオキシエチレン鎖に隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を有する；Ｖａｘｃｅｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ、Ｔｗｅｅｎ ８０および非イオン性ブロックコポリマーを含有する水中油型エマルジョン；Ｓｙｎｔｅｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏ．）が挙げられる。
本発明による有用である粘膜性アジュバントは、本発明の複合体と一緒に粘膜表面に投与したとき、対象において粘膜免疫応答を誘導できるアジュバントである。粘膜性アジュバントとしては、ＣｐＧ核酸（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９９／６１０５６号）；細菌毒素、例えば、コレラ毒（ＣＴ）、ＣＴ誘導体（例えば、限定するものではないが、ＣＴＢサブユニット（ＣＴＢ）；ＣＴＤ５３（Ｖａｌ→Ａｓｐ）；ＣＴＫ９７（Ｖａｌ→Ｌｙｓ）；ＣＴＫ１０４（Ｔｙｒ→Ｌｙｓ）；ＣＴＤ５３／Ｋ６３（Ｖａｌ→Ａｓｐ、Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）；ＣＴＨ５４（Ａｒｇ→Ｈｉｓ）；ＣＴＮ１０７（Ｈｉｓ→Ａｓｎ）；ＣＴＥ１１４（Ｓｅｒ→Ｇｌｕ）；ＣＴＥ１１２Ｋ（Ｇｌｕ→Ｌｙｓ）；ＣＴＳ６１Ｆ（Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）；ＣＴＳ１０６（Ｐｒｏ→Ｌｙｓ）；およびＣＴＫ６３（Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）、接着帯毒素（ｚｏｔ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン、不安定毒素（ＬＴ）、ＬＴ誘導体、例えば、限定するものではないが、ＬＴＢサブユニット（ＬＴＢ）；ＬＴ７Ｋ（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）；ＬＴ６１Ｆ（Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）；ＬＴ１１２Ｋ（Ｇｌｕ→Ｌｙｓ）；ＬＴ１１８Ｅ（Ｇｌｙ→Ｇｌｕ）；ＬＴ１４６Ｅ（Ａｒｇ→Ｇｌｕ）；ＬＴ１９２Ｇ（Ａｒｇ→Ｇｌｙ）；ＬＴＫ６３（Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）；およびＬＴＲ７２（Ａｌａ→Ａｒｇ）、百日咳毒素（ＰＴ）、例としては、ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ；毒素誘導体（以下参照）；リピドＡ誘導体（例えば、モノホスホリルリピドＡ、ＭＰＬ）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体；細菌外膜タンパク質（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの外表面プロテインＡ（ＯｓｐＡ）リポタンパク質、ナイセリア髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質）；水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）；アルミニウム塩（Ｉｓａｋａら、１９９８、１９９９）；ならびにサポニン類（例えば、ＱＳ２１、例えば、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ ＬＬＣ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、ＩＳＣＯＭｓ、ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ ８５およびＴｗｅｅｎ ８０を用いて安定化した水中スクアレン型エマルジョン；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）；ＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントのＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズ（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０；ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＰＲＯＶＡＸ（安定化界面活性剤およびミセル形成剤を含有する水中油型エマルジョン；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；Ｓｙｎｔｅｘｔアジュバント製剤（ＳＡＦ；Ｓｙｎｔｅｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏ．）；ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）］ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）およびリーシュマニア伸長因子（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が挙げられる。
ストレスタンパク質と抗原ペプチドとの複合体を含む本明細書に記載の本発明の組成物は、いくつかの方法でアジュバントと組み合わされてもよい。例えば、異なるペプチドを最初に一緒に混合して混合物を形成し、次いでストレスタンパク質および／またはアジュバント（複数可）と複合体形成して組成物を形成してもよい。別の例として、異なる抗原ペプチドを、個々にストレスタンパク質および／またはアジュバント（複数可）と複合体形成させ、次いで得られたストレスタンパク質／抗原ペプチド／アジュバント複合体のバッチを混合して、組成物を形成してもよい。アジュバントは、ストレスタンパク質と抗原ペプチドの複合体を含む組成物の投与の前に投与しても、投与中に投与しても、または投与後に投与してもよい。アジュバントおよびストレスタンパク質と抗原ペプチドとの複合体を含む組成物の投与は、同一投与部位であっても、または異なる投与部位であってもよい。ある特定の実施形態では、本発明の抗原ペプチドは、熱ショックタンパク質と複合体を形成する。抗原ペプチド−ＨＳＰ複合体は、共有結合であっても、または非共有結合であってもよい。
本明細書に開示される組成物に添加することができるアジュバント（複数可）としては、例えば、サポニンおよび免疫賦活性核酸が挙げられる。特定の実施形態では、ＨＳＰおよび抗原ペプチドを含む組成物に添加される第２のアジュバントは、ＱＳ−２１である。
本発明のワクチン製剤の効能が最適化されるペプチドの濃度は、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定されてもよく、例えば、ペプチド−ストレスタンパク質混合物に対する抗体もしくはＴ細胞応答、または対照の製剤、例えば、ペプチドもしくはストレスタンパク質のみを含む製剤に対する複合体によって決定されてもよい。
医薬組成物に使用されるストレスタンパク質／抗原ペプチド複合体および場合によりアジュバントの量は、抗原ペプチド、ストレスタンパク質、およびアジュバントの化学的性質および効力に応じて変化し得る。典型的には、ワクチン製剤中の抗原ペプチド、ストレスタンパク質、およびアジュバントの出発濃度は、従来の投与経路、例えば、筋肉内注射を用いて、所望の免疫応答を惹起するために慣用的に使用される量である。次いで、抗原ペプチド、ストレスタンパク質、およびアジュバントの濃度を、本発明の医薬組成物中で、例えば、希釈剤を用いて希釈することによって調節し、それによって有効な防御免疫応答が、当該技術分野で公知の標準的方法を用いて評価されるとおり達成される。
医薬組成物は、凍結乾燥製品として場合により調製してもよく、これはその後、経口投与のために製剤化してもよいし、または非経口投与のために液体形態に再構成してもよい。
本発明の医薬組成物は、増量剤、安定化剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、カルシウム塩、界面活性剤、酸化防止剤、キレート剤、他の賦形剤、およびそれらの組合せを含む薬学的に許容される担体または賦形剤として他の薬剤を含むようにさらに製剤化されてもよい。
増量剤は、ワクチン組成物の凍結乾燥製剤の調製において好ましい。そのような増量剤は、凍結乾燥製品の結晶部分を形成し、マンニトール、グリシン、アラニン、およびヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）からなる群より選択され得る。
安定化剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、およびアルギニンからなる群より選択され得る。これらの薬剤は、好ましくは１〜４％の量で存在する。塩化ナトリウムは、好ましくは１００〜３００ｍＭの量で本製剤に含まれてもよく、または前述の増量剤なしで使用される場合、３００〜５００ｍＭのＮａＣｌの量で製剤中に含まれてもよい。カルシウム塩としては、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、またはグルセプチン酸カルシウムが挙げられる。
緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸カリウム、ＴＲＩＳ［トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン］、ＢＩＳ−トリスプロパン（１，３−ビス−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−プロパン）、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−エタンスルホン酸）］、ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、およびＡＣＥＳ（Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸）を含むがこれらに限定されない緩衝液として作用する能力を有する、任意の生理学的に許容可能な化合物または化合物の組合せであってもよい。典型的には、緩衝剤は、１０〜５０ｍＭの濃度で含まれる。塩基緩衝液の具体例としては、（ｉ）ＰＢＳ；（ｉｉ）１０ｍＭのＫＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｉｉ）１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；（ｉｖ）１０ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭのＮａＣｌ；および（ｖ）２０ｍＭのクエン酸ナトリウムが挙げられる。使用することができる賦形剤としては、（ｉ）グリセロール（１０％、２０％）；（ｉｉ）Ｔｗｅｅｎ ５０（０．０５％、０．００５％）；（ｉｉｉ）９％スクロース；（ｉｖ）２０％ソルビトール；（ｖ）１０ｍＭのリジン；または（ｖｉ）０．０１ｍＭの硫酸デキストランが挙げられる。
界面活性剤は、存在する場合、好ましくは０．１％以下の濃度であり、かつポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックポリオール、およびＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）を含むがこれらに限定されない群から選択されてもよい。抗酸化剤は、使用する場合、医薬調製物との使用に適合していなければならず、好ましくは水溶性である。適切な抗酸化剤としては、ホモシステイン、グルタチオン、リポ酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ）、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、白金、グリシン−グリシン−ヒスチジン（トリペプチド）、およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が挙げられる。キレート剤は、好ましくは、カルシウム塩が組成物中に使用されている場合、カルシウムよりも高い親和性で銅および鉄のような金属を結合するべきである。好ましいキレーターはデフェロキサミンである。
当該技術分野で公知の多くの製剤を使用することができる。例えば、米国特許第５，７６３，４０１号は、１５〜６０ｍＭのショ糖、最大５０ｍＭまでのＮａＣｌ、最大５ｍＭまでの塩化カルシウム、６５〜４００ｍＭのグリシン、および最大５０ｍＭまでのヒスチジンを含む治療用製剤を記載している。いくつかの実施形態では、治療用製剤は、リン酸カリウム緩衝液中の９％スクロースの溶液である。
米国特許第５，７３３，８７３号（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの界面活性剤を含む製剤を開示する。この特許は、以下の範囲の賦形剤を有する製剤を開示する：少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０２〜１．０ｍｇ／ｍｌの量のポリソルベート２０または８０；少なくとも０．１ＭのＮａＣｌ；少なくとも０．５ｍＭのカルシウム塩；および少なくとも１ｍＭのヒスチジン。より詳細には、以下の具体的な製剤も開示される：（１）０．１％のＰＥＧ４０００または１９．９ｍＭのスクロースを含むかまたは含まない、１４．７−５０−６５ｍＭのヒスチジン、０．３１−０．６ＭのＮａＣｌ、４ｍＭの塩化カルシウム、０．００１−０．０２−０．０２５％のポリソルベート８０；ならびに（２）２０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２．６７ｍｇ／ｍｌのヒスチジン、１８ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、３．７ｍＭの塩化カルシウム、および０．２３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０。
低濃度または高濃度の塩化ナトリウムの使用が記載されており、例えば、米国特許第４，８７７，６０８号（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、０．５ｍＭ〜１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの塩化カルシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのヒスチジン、０．０１〜１０ｍＭのリジン塩酸塩および最大１０％までのマルトース、１０％のスクロース、または５％のマンニトールを含む製剤のような比較的低濃度の塩化ナトリウムを含む製剤を教示する。
米国特許第５，６０５，８８４号（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、比較的高濃度の塩化ナトリウムを含む製剤の使用を教示する。これらの製剤は、０．３５Ｍ〜１．２ＭのＮａＣｌ、１．５〜４０ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、およびマンニトール、スクロースまたはマルトースのような最大１０％までの糖を含む。０．４５ＭのＮａＣｌ、２．３ｍＭの塩化カルシウム、および１．４ｍＭのヒスチジンを含む製剤が例示される。
国際特許出願ＷＯ９６／２２１０７号（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、糖であるトレハロースを含む製剤、例えば、以下；（１）０．１ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭの塩化カルシウム、１５ｍＭのヒスチジン、および１．２７Ｍ（４８％）のトレハロース；または（２）０．０１１％の塩化カルシウム、０．１２％のヒスチジン、０．００２％のＴＲＩＳ、０．００２％のＴｗｅｅｎ ８０、０．００４％のＰＥＧ ３３５０、７．５％のトレハロース、および０．１３％もしくは１．０３％のＮａＣｌのいずれかを含む製剤を記載している。
米国特許第５，３２８，６９４号（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）は、１００〜６５０ｍＭの二糖類および１００ｍＭ〜１．０Ｍのアミノ酸を含む製剤、例えば（１）０．９Ｍのスクロース、０．２５Ｍのグリシン、０．２５Ｍのリジン、および３ｍＭの塩化カルシウム；ならびに（２）０．７Ｍのスクロース、０．５Ｍのグリシン、および５ｍＭの塩化カルシウムを記載する。
５．使用方法
本明細書に開示される組成物は、がん、例えば多発性骨髄腫を治療および／または予防するための、抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含む。この組成物は、がんの治療または予防が望まれる個体または対象による使用のための薬剤およびワクチンを製造するのに使用してもよい。種々の実施形態において、そのような個体または対象は、動物、好ましくは哺乳動物、非ヒト霊長類、および最も好ましくはヒトである。「動物」という用語には、ネコおよびイヌなどのコンパニオンアニマル；動物園の動物；鹿、キツネおよびアライグマを含む野生動物；ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、シチメンチョウ、アヒルおよびニワトリを含む家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ、ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）および家禽、ならびにげっ歯類、ウサギおよびモルモットなどの実験動物が包含される。
５．１．がんの治療
本発明の組成物は、単独で、またはがんの処置のための他の療法と組み合わせて使用してもよい。
本発明の組成物を用いて処置され得るがんとしては、限定するものではないが、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫）、基底細胞がん、膀胱がん、芽細胞腫、脳転移、乳がん、バーキットリンパ腫、がん腫（例えば、腺がん（例えば、胃食道接合部の腺がん））、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん（結腸がんおよび直腸がん）、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃がん、胃食道接合部がん、消化管がん、グリア芽細胞腫（例えば、多形神経膠芽腫、例えば、新しく診断されるかまたは再発性）、神経膠腫、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、肝臓転移、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、腎臓がん（例えば、腎細胞がんおよびウィルムス腫瘍）、喉頭がん、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病）、肝臓がん（例えば、肝がんおよび肝細胞腫）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、および小細胞肺がん）、リンパ芽球性リンパ腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性脳腫瘍、転移性がん、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、神経芽細胞種、眼球メラノーマ、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん（例えば、膵管腺がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性）、転移性、転移性ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性、アンドロゲン非依存性））、腎細胞がん（例えば転移性）、唾液腺がん、肉腫（例えば、横紋筋肉腫）、皮膚がん（例えば、黒色腫（例えば、転移性黒色腫））、軟組織肉腫、固形腫瘍、扁平上皮がん、滑膜肉腫、精巣がん、甲状腺がん、転移性細胞がん（尿路上皮細胞がん）、ブドウ膜黒色腫（例えば、転移性）、褐変がん、外陰がん、ならびにワルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる。
ある特定の実施形態において、がんは、がん腫（例えば、腺がん）、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫または白血病である。
ある特定の実施形態では、がんは、ヒト肉腫またはがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん（例えば、転移性）、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生がん、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭管腫瘍、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫または網膜芽細胞腫である。
ある特定の実施形態において、がんは、急性リンパ球性白血病もしくは急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病または慢性リンパ球性白血病）；ホジキン病；非ホジキン病；急性骨髄性白血病；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；未分化大細胞リンパ腫；眼内リンパ腫；濾胞性リンパ腫；小腸リンパ腫；または脾辺縁帯リンパ腫である。
ある特定の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、胃腸間質腫瘍、頭頸部がん（例えば、咽頭扁平上皮細胞がん、喉頭扁平上皮がん、中咽頭の細胞がん、または喉頭いぼ状がん）、子宮内膜間質肉腫、肥満細胞肉腫、成人軟部肉腫、子宮肉腫、メルケル細胞がん、尿路上皮がん、脳転移を伴う黒色腫、ブドウ膜黒色腫、肝臓転移を伴うブドウ膜黒色腫、非小細胞肺がん、直腸がん、または骨髄異形成症候群である。
ある特定の実施形態において、がんは、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、黒色腫、気管支がん、膀胱がん、脳もしくは中枢神経系のがん、末梢神経系がん、子宮もしくは子宮内膜のがん、口腔もしくは咽頭のがん、非ホジキンリンパ腫、甲状腺がん、腎臓がん、胆道がん、小腸がんまたは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、扁平上皮がん、中皮腫、骨腺がん、胸腺腫／胸腺がん、グリア芽細胞腫、骨髄異形成症候群、軟部組織肉腫、ＤＩＰＧ、腺がん、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、または膵臓がんである。
ある特定の実施形態において、がんは、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝臓がんおよび肝細胞腫）、膀胱がん、乳がん、炎症性乳がん、メルケル細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、膀胱がん、子宮内膜がん、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、唾液腺がん腫、腎臓がん（例えば、腎細胞がんおよびウィルムス腫瘍）、基底細胞がん、黒色腫、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、精巣がん、食道がん、漿液性腺がんまたは種々の頭頸部がんである。ある特定の実施形態において、がんは、線維形成性黒色腫、炎症性乳がん、胸腺腫、直腸がん、肛門がん、または外科的に治療可能なもしくは非外科的に治療可能な脳幹グリオーマである。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。別の特定の実施形態では、がんは、多形神経膠芽腫である。いくつかの実施形態では、多形神経膠芽腫は、再発性である。いくつかの実施形態では、多形神経膠芽腫は、新たに診断される。いくつかの実施形態では、多形性神経膠芽腫は、非メチル化ＭＧＭＴプロモーターを有する対象に存在する。いくつかの実施形態では、多形神経膠芽腫は、ベバシズマブ療法に抵抗性である。いくつかの実施形態において、多形神経膠芽腫は、ベバシズマブ療法を受けていない対象にある。
ある特定の実施形態では、がんは多発性骨髄腫、グリア芽細胞腫、結腸直腸がん、肝細胞がん、肉腫、頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮がん）、乳がん、肺がんおよび黒色腫である。
ある特定の実施形態では、がんは転移性である。
本発明の組成物は、がんが検出されるか、または再発のエピソードの前もしくは最中の場合に投与されてもよい。
投与は、がんまたは再発の最初の徴候から開始し、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、およびその後の期間にわたってブースター用量を続けてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、切除された腫瘍組織から収集された抗原の代表的なセットを含む自己がんワクチンの治療有効量の生成のために、切除された腫瘍組織の量が不十分である（例えば、７ｇ未満、６ｇ未満、５ｇ未満、４ｇ未満、３ｇ未満、２ｇ未満、または１ｇ未満の切除された腫瘍組織）腫瘍切除手術を受けた、がんを有する対象に対して投与されてもよい。（例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００９年２月；９（２）：１７９−８６（参照によって本明細書に組み入れる）を参照のこと）。
本発明の組成物はまた、がんの再発に対する免疫化に使用してもよい。個体への組成物の予防投与によって、将来のがんの再発に対する保護を得ることができる。
５．２．併用療法
併用療法とは、がんを予防または治療するための別の様式による本発明の組成物の使用を指す。一実施形態では、この追加の形態の様式は、非ＨＳＰ様式、例えば、成分としてＨＳＰを含まない様式である。このアプローチは、一般に、併用療法、補助療法または連結療法（これらの用語は互換的に使用される）と呼ばれている。併用療法では、相加的な効力または相加的な治療効果が観察され得る。相乗効果的な転帰は、治療効能が相加的よりも大きい場合に求められる。併用療法の使用はまた、処置様式または本発明の組成物のみの投与よりも良好な治療プロフィールを提供し得る。相加効果または相乗効果によって、いずれかまたは両方の様式の用量および／または投与頻度を減少させて、有害作用を緩和することができる。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチド（例えば、化学的に合成された抗原ペプチド）に結合した精製ストレスタンパク質（例えば、組換えストレスタンパク質）の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の患者特異的組成物であって、この複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、この異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つが対象のがん細胞に存在する１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む組成物と；抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第２のがん型特異的組成物であって、この複合体それぞれが、異なる抗原ペプチドを含み、かつ異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つが、対象のがんと同種のがんで見出される場合が多い、１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む組成物と、の組合せが対象に投与される。第１および第２の組成物は、本明細書に記載のストレスタンパク質／抗原ペプチド組成物の任意の１つ以上の特徴を有してもよい。
本明細書で使用される「がんにおいて見出される場合が多い」という用語は、５％を超えるがんにおいて見出される１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを指す。
抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の多数の異なる複合体を、第２の組成物に含んでもよい。ある特定の実施形態では、この組成物は、１００個以下の異なる抗原ペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の抗原ペプチド；例えば、約２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００個の抗原ペプチド）を含む。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、がんに見られるｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ、ｎ−ｒａｓ、ｔｐ５３、またはｋｄｍ６Ａの１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む少なくとも１つの抗原ペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、第２の組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含む抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、この組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含む２０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の異なる抗原ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、この組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含む抗原ペプチドは含まない。
第１および第２のストレスタンパク質／抗原ペプチド組成物は、同時にまたは連続して投与することができる。特定の実施形態において、第２の組成物は、第１の組成物の投与前に投与される。
他の実施形態では、併用療法は、処置様式で処置された対象に対する本発明の組成物の投与を含み、ここで単独投与される処置様式とは、対象を処置するのに臨床的に十分ではなく、その結果その対象は、追加の有効な治療を必要とし、例えば対象は、組成物を投与することがなければ処置様式に対して不応答性である。そのような実施形態には、本発明の組成物を、対象が治療に応答したが副作用、再発、耐性の発症などを被っている処置様式を受けている対象に対して投与することを包含する方法が含まれる。そのような対象は、処置様式単独での処置に対しては、非応答性であっても、または難治性であってもよい。本発明の組成物を処置様式単独に対して難治性の対象に投与することを包含する本発明の方法は、本発明の方法によって企図されるように投与される場合、処置様式の治療有効性を改善し得る。処置様式の有効性の決定は、当該技術分野で公知の方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏでアッセイしても、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしてもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、異なるがんワクチンを含む第２の処置様式と組み合わせて投与される。
一実施形態では、対象に治療効果をもたらすために必要な第２の処置様式の量は少ない。ある特定の実施形態では、第２の処置様式の量の約１０％、２０％、３０％、４０％および５０％の減少が達成され得る。観察可能な治療上の利益を生じない範囲の量を含む、第２の処置様式の量は、当該技術分野で周知の方法による動物モデルで行われる用量応答実験によって決定することができる。
一実施形態では、組成物は、化学療法剤などの第２の処置様式と組み合わせて投与される。例としては、抗悪性腫瘍剤、例えば：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アドリアマイシン；アルデスロイキン；アルテラミン；アンボマイシン；ａ．酢酸メタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレチナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カンプトセシン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；コンブレスタチンａ−４；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ｄａｃａ（ｎ−［２−（ジメチル−アミノ）エチル］アクリジン−４−カルボキサミド）；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノマイシン；デシタビン；デキソルアプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドラサチン；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニリン；エリプチシン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタンダゾール；エチヨード化油ｉ１３１；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチンド；フルクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；５−ｆｄｕｍｐ；フルオシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；金ａｕ１９８；ホモカンプトテシン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−１ａ；インターフェロンγ−ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメテレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸ゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスパー；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リゾキシン；リゾキシンｄ；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセート・ナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スパルソマイシン；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムｓｒ８９；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チミタック；チアゾフリン；チラパザミン；トミュデックス；ｔｏｐ５３；塩酸トポテカン；クエン酸トレミファン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルコロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシル・マスタード；ウレデパ；バブレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；ビンクリスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン；２−クロロデオキシアデノシン；２’−デオキシフォルムマイシン；９−アミノカンプトセシン；ラルチトレキセド；Ｎ−プロパギル−５，８−ジデアサ葉酸；２−クロロ−２’−アラビノ−フルオロ−２’−デオキシアデノシン；２−クロロ−２’−デオキシアデノシン；アニソマイシン；トリコシタチンＡ；ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ；ＣＥＰ−７５１；リノミド；サルファ・マスタード；ナイトロジェン・マスタード（メクロレタミン）；シクロホスファミド；メルファラン；クロラムブシル；イホスファミド；ブスルファン；Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）；Ｎ，Ｎ’−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）；Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ’−シクロヘキシル−Ｎ−ニトロソウレア（ＣＣＮＵ）；Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ’−（トランス−４−メチルシクロヘキシル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭｅＣＣＮＵ）；Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（ジエチル）エチルホスホネート−Ｎ−ニトロソウレア（フォテムスチン）；ストレプトゾトシン；ダカルバジン（ｄｉａｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）；ミトゾロマイド；テモゾロマイド；チオテパ；マイトマイシンＣ；ＡＺＱ；アドゼレシン；シスプラチン；カルボプラチン；オルマプラチン；オキサリプラチン；Ｃ１−９７３；ＤＷＡ２１１４Ｒ；ＪＭ２１６；ＪＭ３３５；ビス（プラチナム）；トムデックス；アザシチジン；シタラビン；ゲムシタビン；６−メルカプトプリン；６−チオグアニン；ヒポキサンチン；テニポシド９−アミノカンプトセシン；トポテカン；ＣＰＴ−１１；ドキソルビシン；ダウノマイシン；エピルビシン；ダルビシン；ミトキサントロン；ロソキサントロン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）；アムサクリン；ピラゾロアクリジン；オ−ル・トランス・レチノール；１４−ヒドロキシ−レトロ−レチノール；オール・トランス・レチノイン酸；Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド；１３−シス・レチノイン酸；３−メチルＴＴＮＥＢ；９−シス・レチノイン酸；フルダラビン（２−Ｆ−ａｒａ−ＡＭＰ）；または２−クロロデオキシアデノシン（２−Ｃｄａ）が挙げられる。
他の治療用化合物としては、２０−ｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼルジン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルテラミン；アンバムステチン；アミドクス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォライド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）：抗背側化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン（前立腺がん）；抗エストロゲン；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンジアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスティン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体類；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビスアントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブレオマイシンＡ２；ブレオマイシンＢ２；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体類（例えば、１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）；カナリア痘ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレジン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）；クロリン類；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似物；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似物；コナゲニン；クラムベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体類；キュラシンＡ；シクロペンタントラキノン類；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクフォスファート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロダイデムニンＢ；２’デオキシコホルマイシン（ＤＣＦ）；デスロレリン；デキシフォスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ディスコデルモライド；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフール；エピルビシン；エポシロン類（Ａ、Ｒ＝Ｈ；Ｂ、Ｒ＝Ｍｅ）；エピシロン類；エプリステリド；エストラムスチン類似物；エストロゲンアゴニスト類；エストロゲンアンタゴニスト類；エタニダゾール；エトポシド；エトポシド４’−リン酸（ｅｔｏｐｏｆｏｓ）；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルビシン；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビサセタミド；ホモハリントニン（ＨＨＴ）；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活性ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イリノテカン；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトールスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似物；脂溶性二糖ペプチド；脂溶性白金化合物；リソクリンアミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルロトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；イフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチのある２本鎖ＲＮＡ；ミトラシン；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似物類；ミトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１ベースの治療薬；マスタード抗がん剤；マイカペルオキシドＢ；マイコバクテリウム細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド類；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；０６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキザウノマイシン；パクリタキセル類似物；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリサルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポドフィロトキシン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベースの免疫調節因子；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤（微細藻類）；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；エチドロン酸レニウムＲｅ １８６；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ １模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節因子；１本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラディスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオダイド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン；サリドマイド；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；サイマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トポテカン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療薬；ベラレソール；ベラミン；ベルディンス；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；バイタクシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、４−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−１，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミドアミド（ＷＯ２００６１２２１５０）などのインドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤が使用される。
別の実施形態では、本発明の組成物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体などを含むがこれらに限定されない１つ以上の抗体と組み合わせて使用される。開示された組成物と組み合わせられ得る例示的な抗体としては、限定されないが、抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３などの免疫チェックポイント阻害剤である抗体が挙げられる。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、パゾパニブ、ベバシズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ／ＭＫ−３４７５、ピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４；ＢＭＳ−９３５５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、イピリムマブまたはトレメリムマブが挙げられる。
別の実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の生物学的応答調節剤、例えばサイトカインと組み合わせて使用される。１つのこのような実施形態では、サイトカインは、本発明の組成物を投与される対象に投与される。別のそのような実施形態では、本発明の組成物は、化学療法剤、例えば抗ウイルス剤、抗体、アジュバント、または別の生物学的応答調節剤をサイトカインと組み合わせて投与される対象に対して、投与される。種々の実施形態では、１つ以上のサイトカインが用いられてもよく、これは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−γ、ＩＮＦ−α、ＳＬＣ、内皮単球活性化タンパク質−２（ＥＭＡＰ２）、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、またはＨＬＡ−Ｂ７などのＭＨＣ遺伝子からなる群より選択される。さらに、他の例示的サイトカインとしては、ＴＮＦファミリーの他のメンバー、例としては、限定するものではないが、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性誘発サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、リンホトキシンα（ＬＴ−α）、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、およびＡＩＴＲ−Ｌ、またはその機能的部分が挙げられる。例えば、ＴＮＦファミリーの一般的な概説に関しては、Ｋｗｏｎら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１：３４０〜３４５（参照によってその全体を本明細書に組み入れる）を参照のこと。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、処置様式の前に投与される。
他の実施形態では、本発明の組成物は、免疫系の種々のリガンド、受容体およびシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、１つ以上の生物学的応答調節剤と組み合わせて使用される。例えば、生物学的応答調節剤としては、限定するものではないが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９）のアゴニスト；ＬＰＳ；４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、およびＣＤ４０のアゴニスト；ならびにＦａｓリガンド、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが挙げられる。これらのアゴニストおよびアンタゴニストは、抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣化合物、多糖類、および小分子であってもよい。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、サポニンおよび免疫賦活性核酸などの１つ以上のさらなるアジュバントと組み合わせて使用してもよい。
Ｑｕｉｌｌａｊａサポニンは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの樹皮から抽出されたトリテルペン配糖体の混合物である。それらは、ワクチンアジュバントとして使用することができる免疫賦活物質として長く認識されており（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＪＢ、およびＰｅｅｒｂａｙｅ、Ｙ．Ａ．Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３（５）：５２６〜５３０（１９９２））、多数の市販の複合サポニン抽出物がアジュバントとして利用されている。その強力なアジュバント活性および低い毒性に起因して、サポニンＱＳ−２１（「Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）」アジュバントとして市販されている）は、有用な免疫アジュバントとして特定されている。（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ、Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）のＫｅｎｓｉｌ、ＣＲら、「ワクチンアジュバントＱＳ−２１の構造および免疫学的特性（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＱＳ−２１）」、これは参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。ＱＳ−２１は、キラ酸の複合トリテルペン配糖体である。ＱＳ−２１は、脂肪酸ドメイン中の第２の脂肪アシル単位のトリテルペン炭素３、トリテルペン炭素２８、および炭素５でグリコシル化される。
ある特定の実施形態では、開示された組成物は、サポニンと組み合わせて抗原ペプチドとストレスタンパク質との複合体を含む。ある特定の実施形態では、サポニンは、例えばＱＳ−２１または関連化合物（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第５，０５７，５４０号；第５，２７３，９６５号；第５，４４３，８２９号；第５，６５０，３９８号および第６，５２４，５８４号に開示されている）を含む。ＱＳ−２１は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いてさらに精製して、化学的に異なる化合物であることが示された２つのピーク、ＱＳ−２１−Ｖ１およびＱＳ−２１−Ｖ２に分解された。オボアルブミンおよびＱＳ−２１、ＱＳ−２１−Ｖ１、またはＱＳ−２１−Ｖ２のいずれかからなるワクチンで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、個々の成分ＱＳ−２１−Ｖ１およびＱＳ−２１−Ｖ２の両方が、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ２、ならびに全ＩｇＧ力価をブーストするために、元のＱＳ−２１ピーク（３：２ＱＳ−２１−Ｖ１およびＱＳ−２１−Ｖ２の混合物を含む）に対するアジュバント効果で匹敵する（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第６，２３１，８５９号に開示される）。
多くの免疫賦活性核酸は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであって、脊椎動物リンパ球に対して分裂促進性であり、かつ免疫応答を増強することが知られている（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｗｏｏｌｒｉｄｇｅら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、８９：２９９４〜２９９８を参照のこと）。このようなオリゴヌクレオチドは、国際特許公開番号ＷＯ０１／２２９７２号、ＷＯ０１／５１０８３号、ＷＯ９８／４０１００号およびＷＯ９９／６１０５６号、ならびに米国特許第６，２０７，６４６号、第６，１９４，３８８号、第６，２１８，３７１号、第６，２３９，１１６号、第６，４２９，１９９号および第６，４０６，７０５号（それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）に記載される。ＹｐＧモチーフおよびＣｐＲモチーフを含むホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような他の種類の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「オリゴヌクレオチドのＣｐＧ−モチーフにおけるシトシンおよびグアニンの化学修飾の効果：構造−免疫賦活活性関係（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ Ｇｕａｎｉｎｅ ｉｎ ａ ＣｐＧ−Ｍｏｔｉｆ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．）」Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９：８０７〜８１３（２００１）に記載されており、これは参照によってその全体を本明細書に組み入れる。粘膜経路（低用量投与を含む）または非経口経路による高用量で投与された場合、しばしばＣｐＧ核酸と同様に抗体応答を増大させる、ＣｐＧジヌクレオチドを欠く免疫賦活性オリゴヌクレオチドも包含されるが、応答はＴｈ２−偏向された（ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２ａ）（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、米国特許公開第２００１／００４４４１６号を参照のこと）。免疫賦活性オリゴヌクレオチドの活性を測定する方法は、上記の特許および刊行物に記載されているように行ってもよい。さらに、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、活性を調節するために、リン酸骨格、糖、核酸塩基およびヌクレオチド間の連結内で改変してもよい。そのような改変は、当業者に公知である。
ある特定の実施形態では、本開示は、生理学的に許容される担体中に、少なくとも１つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはサポニン（例えば、ＱＳ−２１）などのアジュバントと組み合わせた、がん細胞に由来する１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを有する異なる抗原ペプチドを有するストレスタンパク質の複合体を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、ＱＳ−２１と組み合わせた１つ以上の抗原ペプチドと複合体形成したｈｓｐ７０を含んでもよい。ある特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドと組み合わせた、１つ以上の抗原ペプチドと複合体形成されたｈｓｐ７０またはｈｓｃ７０を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ＱＳ−２１および少なくとも１つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドと組み合わせた、１つ以上の抗原ペプチドと複合体形成したｈｓｐ７０またはｈｓｃ７０を含む。
５．３．投与量
本明細書に開示される組成物の投与量、および併用療法が投与される場合のアジュバントなどの任意のさらなる処置様式の投与量は、治療されている対象の体重および一般的な健康状態、ならびに、ワクチン組成物の投与量、治療頻度および投与経路にかなりの程度まで依存する。この使用に有効な量はまた、疾患の段階および重篤度ならびに処方医の判定に依存するが、一般には、最初の免疫（すなわち、治療投与）のために、７０ｋｇの患者について、任意の１つの本明細書に開示されている組成物約１．０μｇ〜約１０００μｇ（１ｍｇ）（例えば、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２４０、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇを含む）の範囲であり、患者の血液中のＣＴＬ活性比を測定することにより、患者の応答および状態次第で、数週から数か月にわたる追加のレジメンに準拠して、組成物約１．０μｇ〜約１０００μｇ（例えば、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇを含む）のブースター投与が続く。部位、投与量および頻度を含む継続的治療のレジメンは、初期反応および臨床的判断によって導かれ得る。アジュバントの用量範囲およびレジメンは、当業者に公知であり、例えば、ＶｏｇｅｌおよびＰｏｗｅｌｌ、１９９５、Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ；Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１４１〜２２８頁を参照のこと。
好ましいアジュバントとしては、ＱＳ−２１、例えばＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＱＳ−２１の例示的な用量範囲は、１回の投与あたり１μｇ〜２００μｇである。他の実施形態では、ＱＳ−２１の投与量は、１回の投与あたり１０、２５、および５０μｇであってもよい。
ある特定の実施形態では、抗原ペプチドと複合体を形成する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を含む組成物の投与量は、投与経路および組成物中のＨＳＰの種類に依存する。例えば、組成物中のＨＳＰの量は、例えば１回の投与あたり５〜１０００μｇ（１ｍｇ）の範囲であってもよい。
ある特定の実施形態では、ｈｓｃ７０−、ｈｓｐ７０−および／またはｇｐ９６−抗原ペプチド複合体を含む組成物の投与量は、例えば、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、または１０００マイクログラムである。
ある特定の実施形態では、ｈｓｃ７０−、ｇｐ９６−またはｈｓｐ７０抗原ペプチド複合体を含む組成物の投与量は、その組成物が、皮内に投与される場合、１回の投与あたり約１０〜６００μｇおよび約５〜１００μｇの範囲である。
別の実施形態では、ｈｓｃ７０−、ｈｓｐ７０−および／またはｇｐ９６−抗原ペプチド複合体を含む組成物は、ヒト患者の場合、約５マイクログラム〜約６００マイクログラム、または約５マイクログラム〜約６０マイクログラムの範囲の量で投与される。他の実施形態では、組成物の投与量は、１００マイクログラム未満であってもよい。他の実施形態では、組成物の投与量は、約５マイクログラム、２５マイクログラム、５０マイクログラム、または２４０マイクログラムである。好ましくは、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとの複合体を含む組成物を精製する。
ある特定の実施形態では、ヒト患者におけるｈｓｐ−９０抗原ペプチド複合体を含む組成物の投与量は、約５〜１０００マイクログラムの範囲である。ある特定の実施形態では、組成物の投与量は、５、１０、２０、２５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、または１０００マイクログラムである。他の実施形態では、組成物の投与量は１００マイクログラムである。ある特定の実施形態では、ｈｓｐ９０抗原ペプチド複合体を含む組成物の皮内投与のための投与量は、１回の投与あたり約５〜５０μｇの範囲である。
治療レジメンの一実施形態では、より小さい非ヒト動物（例えば、マウスまたはモルモット）において有効であるとみなされるものと実質的に同等な投与量は、場合により、そのような哺乳類およびヒトにおける相対的なリンパ節の大きさに基づいて、５０倍増大を超えない補正因子の影響下で、ヒト投与に有効である。具体的には、ヒト用量について抗原性分子と非共有結合されるか、または抗原性分子と混合されたストレスタンパク質（またはＨＳＰ）の種間の用量応答の等価性は、マウスで観察される治療用量と単一倍率との積として推定され、５０倍増大を超えない。
別の実施形態では、組成物の投与量は、外挿によって推定される投与量よりもかなり小さくてもよい。一実施形態では、例えば、ヒト患者の場合、約２μｇから約１５０μｇの範囲の、ｈｓｃ７０−抗原ペプチド複合体、ｈｓｐ７０−抗原ペプチド複合体および／またはｇｐ９６−抗原ペプチド複合体を含む組成物の量が投与され、ヒトの投与量は２５ｇのマウスで使用されるものと同じである。ヒト患者におけるｈｓｐ−９０ペプチド複合体を含む組成物の投与量は、約１０〜１，０００マイクログラムの範囲である。別の実施形態では、組成物の投与量は、約２０マイクログラムである。
上記の用量は、最大１年または１年以上の期間にわたって、毎日、隔日、毎週、隔週または毎月など、１回または反復して投与されてもよい。用量は、好ましくは、約５２週またはそれ以上の期間、２８日ごとに１回投与される。
一実施形態では、組成物は、追加の処置様式（複数可）と合理的に同じ時期に対象に投与される。この方法によって、２つの投与が、例えば、同じ医者の診察で、互いに１分未満〜約５分、または最大約６０分までの時間枠内で行われることになる。
別の実施形態では、組成物およびさらなる処置様式（複数可）は、正確に同時に投与される。
さらに別の実施形態では、本発明の複合体およびさらなる処置様式（複数可）が共に作用して、それらが単独で投与された場合よりも大きい利益を提供することができるように、組成物およびさらなる処置様式（複数可）を、連続して、ある時間間隔内で投与する。
別の実施形態では、所望の治療または予防の転帰を得るために、組成物およびさらなる処置様式（複数可）を時間的に十分に接近して投与する。それぞれは、任意の適切な形態および任意の適切な経路によって、同時に投与されても、または別々に投与されてもよい。一実施形態では、本発明の複合体およびさらなる処置様式（複数可）は、異なる投与経路によって投与される。別の実施形態では、各々は同じ投与経路によって投与される。組成物は、同じ部位または異なる部位、例えば、腕と脚に投与されてもよい。同時に投与される場合、組成物および追加の処置様式（複数可）は、混合物中で投与されても、同じ投与経路によって同じ投与部位で投与されてもよいし、投与されなくてもよい。
種々の実施形態では、組成物およびさらなる処置様式（複数可）は、１時間未満空けて、約１時間空けて、１時間〜２時間空けて、２時間〜３時間空けて、３時間〜４時間空けて、４時間〜５時間空けて、５時間〜６時間空けて、６時間〜７時間空けて、７時間〜８時間空けて、８時間〜９時間空けて、９時間〜１０時間空けて、１０時間〜１１時間空けて、１１時間〜１２時間空けて、２４時間以下空けて、または４８時間以下空けて投与される。他の実施形態では、組成物およびワクチン組成物は、２〜４日空けて、４〜６日空けて、１週間空けて、１〜２週間空けて、２〜４週間空けて、１ヶ月空けて、１〜２ヶ月空けて、または２ヶ月以上空けて投与される。好ましい実施形態では、組成物およびさらなる処置様式（複数可）は、両方がまだ活性である時間枠内で投与される。当業者は、各投与成分の半減期を決定することによって、そのような時間枠を決定することができるであろう。
ある特定の実施形態では、組成物は、少なくとも４週間の間、毎週１回対象に投与される。ある特定の実施形態では、４回の毎週投与の後、組成物の少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回）のさらなる用量が対象に隔週投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、最終の週１回または隔週投与の３ヶ月後にブースターとして投与される。３ヶ月に１回のブースターを、対象の生活のために投与してもよい（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上の年数）。ある特定の実施形態では、対象に投与される組成物の用量の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回である。
一実施形態では、組成物および追加の処置様式（複数可）が同じ患者来院内で投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、追加の処置様式（複数可）を投与する前に投与される。別の具体的な実施形態では、組成物は、追加の処置様式（複数可）を投与した後に投与される。
ある特定の実施形態では、組成物および追加の処置様式（複数可）は、対象に周期的に投与される。周期的療法は、ある期間の組成物の投与、続いてある期間のある様式の投与、およびこの逐次投与を繰り返すことを包含する。周期的療法によって、１つ以上の療法に対する耐性の発達を低減させ、１つの療法の副作用を回避もしくは低減し、および／または治療の効能を改善し得る。そのような実施形態では、本開示は、組成物の交互投与を行い、続いて４〜６日後、好ましくは２〜４日後、より好ましくは１〜２日後に、ある様式を投与することを企図しており、そのような周期は任意選択で何度も繰り返されてもよい。ある特定の実施形態では、組成物および様式は、３週間未満、２週間に１回、１０日間に１回または毎週１回のサイクルで、交互に投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、ある様式の投与の１時間後から２４時間後の時間枠内で対象に投与される。遅いまたは連続的な放出型の様式の送達システムが使用される場合、この時間枠はさらに数日またはそれ以上に延長されてもよい。
５．４．投与経路
本明細書中に開示される組成物は、任意の所望の投与経路を用いて投与されてもよい。口腔、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜、鼻腔内、腫瘍内およびリンパ節内経路を含むが、これらに限定されない多くの方法を使用して、上記の組成物を導入してもよい。非粘膜投与経路としては、限定するものではないが、皮内および局所投与が挙げられる。粘膜投与経路としては、限定するものではないが、経口、直腸および経鼻投与が挙げられる。皮内投与の利点としては、それぞれ、より低用量の使用および急速な吸収が挙げられる。皮下投与または筋肉内投与の利点としては、それぞれいくつかの不溶性懸濁液および油性懸濁液に関する適性が挙げられる。粘膜投与のための調製物は、以下に記載されるような種々の製剤に適している。
溶解度および投与部位は、組成物の投与経路を選択する際に考慮すべき因子である。投与方式は、上記に列挙した投与経路を含む複数の投与経路の間で変えてもよい。
組成物が水溶性であるならば、それは適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水、または他の生理学的に適合性のある溶液、好ましくは滅菌溶液で製剤化されてもよい。あるいは、組成物が水性溶媒への溶解性が低いならば、Ｔｗｅｅｎまたはポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤を用いて製剤化されてもよい。したがって、組成物は、吸入もしくは吹送（口または鼻のいずれかを通して）による投与または経口、口腔、非経口もしくは直腸投与のために製剤化されてもよい。
経口投与の場合、組成物は、液体形態、例えば溶液、シロップもしくは懸濁液であってもよく、または使用前に水もしくは他の適切な媒体で再構成するための薬品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分画植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加剤を用いる、従来の手段によって調製されてもよい。組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化前のトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製された、錠剤またはカプセルの形態を取ってもよい。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によってコーティングされてもよい。
経口投与のための組成物は、徐放性の方式および／または時限的方式で放出されるように適切に製剤化されてもよい。
口腔投与のために、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
調製物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは複数用量容器中で、防腐剤の添加と共に提供されてもよい。この調製物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含んでもよい。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成するために粉末形態であってもよい。
調製物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む、坐剤または停留浣腸のような直腸調製物中に製剤化してもよい。
先に記載した製剤に加えて、調製物はデポ調製物として製剤化してもよい。そのような長時間作用性製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、調製物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂で、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されてもよい。リポソームおよびエマルジョンは、親水性薬物の送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。
吸入による投与のために、組成物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用を伴う、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または注入器で使用するための、ゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化されてもよい。
５．５．患者（対象）評価
本明細書に開示される組成物で処置された患者を、抗腫瘍免疫応答について試験してもよい。これに関して、患者からの末梢血を採取して、抗腫瘍免疫のマーカーについてアッセイしてもよい。標準的な実験手順を使用して、末梢血から白血球を得て、異なる免疫細胞表現型の頻度、ＨＬＡサブタイプ、および抗腫瘍免疫細胞の機能についてアッセイしてもよい。
抗腫瘍応答におけるエフェクター免疫細胞の大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、したがってＨＬＡクラスＩが制限されている。他の腫瘍型で免疫療法ストラテジーを使用すると、ＨＬＡクラスＩ拘束性抗原を認識するＣＤ８＋細胞の増殖が大部分の患者に見られる。しかし、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびマクロファージおよび樹状細胞（抗原提示細胞として作用し得る）を含む、他の細胞型が抗腫瘍免疫応答に関与する。Ｔ細胞の集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＴｒｅｇ細胞）、マクロファージ、および抗原提示細胞は、フローサイトメトリーを用いて測定してもよい。ＨＬＡ分類は、当該技術分野における慣用的な方法、例えば、Ｂｏｅｇｅｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２，４：１０２（ｓｅｑ２ＨＬＡ）に記載される方法を用いて、またはＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）ＨＬＡシーケンシングパネル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を用いて行ってもよい。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＬＡサブタイプは、補体依存性微小細胞毒性試験によって決定してもよい。
抗腫瘍Ｔ細胞応答の増大があるか否かを決定するために、酵素結合免疫スポットアッセイを行って、ＩＦＮγ産生末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を定量してもよい。この技術は、抗原認識および免疫細胞機能のアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンに臨床的に応答する対象は、腫瘍特異的Ｔ細胞および／またはＩＦＮγ産生ＰＢＭＣの増大を有し得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞頻度は、フローサイトメトリーを用いて評価される。いくつかの実施形態では、酵素結合免疫スポットアッセイを用いて、抗原認識および免疫細胞機能を評価する。
いくつかの実施形態では、アッセイのパネルを行って、単独で使用されるか、または標準治療と組み合わせて与えられるＨＳＰＰＣ−９６に対して生成される免疫応答を特徴付けてもよい（例えば、多形神経膠芽腫に対する、最大外科的切除、放射線療法ならびにテモゾロミドによる併用およびアジュバント化学療法）。いくつかの実施形態では、アッセイのパネルは、以下の試験のうちの１つ以上を含む：全血球数、絶対リンパ球数、単球数、ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ、ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞のパーセンテージおよびＰＢＬ表面マーカーの他の表現型、タンパク質レベルで前炎症性サイトカインを検出する細胞内サイトカイン染色、ｍＲＮＡレベルでサイトカインを検出するｑＰＣＲ、およびＴ細胞増殖をアッセイするためのＣＦＳＥ希釈。
対象を評価する際には、対象の全体的な健康状態を判定するために、他の多くの検査を行ってもよい。例えば、対象から血液試料を採取し、血液学、凝固時間および血清生化学について分析してもよい。ＣＢＣの血液学には、赤血球数、血小板、ヘマトクリット、ヘモグロビン、白血球（ＷＢＣ）数、それに加えて好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球の絶対数を得るためのＷＢＣ差異が含まれてもよい。血清生化学には、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、総ビリルビン、ＢＵＮ、グルコース、クレアチニン、カリウムおよびナトリウムが含まれ得る。プロタイム（Ｐｒｏｔｉｍｅ）（ＰＴ）および部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）も試験してよい。以下のうち１つ以上の試験もまた実施してもよい：抗甲状腺（抗ミクロソームまたはサイログロブリン）抗体試験、抗核抗体の評価、およびリウマチ因子。尿中のタンパク質、ＲＢＣおよびＷＢＣレベルを評価するために、尿検査を行ってもよい。また、組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）状態を決定するための血液採取を行ってもよい。
いくつかの実施形態では、腫瘍サイズおよび状態を評価するために、放射線腫瘍評価を、治療を通して１回以上行う。例えば、腫瘍評価スキャンは、手術前３０日以内、手術後４８時間以内（例えば、切除率を評価するため）、最初のワクチン接種（例えば、ベースライン評価として）の１週間（最大１４日）前、およびその後およそ８週間ごとに特定の期間行ってもよい。ＭＲＩまたはＣＴ画像化を用いてもよい。典型的には、ベースライン評価に使用されたのと同じ画像化様式を、各腫瘍評価のための来院ごとに使用する。
６．キット
本明細書に開示される予防および治療方法を行うためのキットもまた提供される。キットには、場合により、キットの種々の構成要素の使用方法に関する説明書が添付されていてもよい。
特定の実施形態では、キットは、異なる抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含む組成物を含む第１の容器（各抗原ペプチドは、がん細胞由来の１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む）；および第２の容器（アジュバント（複数可）を含み、これは、第１の容器中のペプチドの投与前、投与と同時に、または投与後に投与された場合、抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導するのに有効である）とを備える。別の実施形態では、キットは、異なる抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含む組成物を含む第１の容器（各抗原ペプチドは、がん細胞由来の１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む）；アジュバント（複数可）を含有する第２の容器；および第２の処置様式を含む第３の容器を備える。さらに別の実施形態では、キットは、異なる抗原ペプチドに結合したストレスタンパク質の複合体を含む組成物を含む容器（各抗原ペプチドは、がん細胞由来の１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープおよびアジュバントを１つの容器に含む）、および第２の処置様式；またはＱＳ−２１、例えばＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ ＬＬＣ）を含むがこれに限定されないサポニンのような追加のアジュバントを含む第２の容器を備える。追加の容器は、組み合わせて使用することができる追加の処置様式のために存在してもよい。ある特定の実施形態では、容器内の組成物は、異なる抗原ペプチドに結合した熱ショックタンパク質の複合体の形態であり、各抗原ペプチドは、がん細胞由来の１つ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む。
ある特定の実施形態では、容器中の組成物およびアジュバントは、がんを治療またはがんの再発を予防するのに有効な所定の量で存在する。任意選択で、組成物は、その組成物の１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書を伴ってもよい。
実施例１：バンクになったヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）形質細胞試料における体細胞突然変異の特定
Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＨｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ（Ｍｉａｍｉ Ｂｅａｃｈ、ＦＬ）に保存されている５０個以上のＭＭ試料の以前にアノテーションされたＲＮＡと、完全エキソームシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＷＥＳ）に基づいて、本発明者らは、１９個の試料の非同義突然変異のリストを作成した。突然変異は計算的に特徴付けして、１０個の試料の各々について最大４８個のペプチドを、免疫学的アッセイで試験するために合成した。
実施例２：マウスＭＭ腫瘍細胞株で特定された体細胞突然変異
本発明者らは、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭに対する親株である、直ちに利用可能なＭＯＰＣ３１５のエキソームをプロファイリングした。Ｂ１６Ｆ１０（９６２個の非同義変異）およびＣＴ２６（１，６８８）の他の研究、ならびにＭＣ−３８（４，２８５）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ１（９４９）の公開された研究と同様に、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃゲノムに対する１，７６４個の非同義体細胞点突然変異（ＳＮＶ）を特定した。これらのＳＮＶは、１，５３９個の遺伝子に存在する（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２年３月１日；７２（５）：１０８１〜１０９１；Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年１１月２７日；５１５（７５２８）：５７２〜５７６；ＢＭＣゲノミクス、２０１４；１５：１９０（参照によってその全体を本明細書に組み入れる））。本発明者らは、ＭＯＰＣ３１５突然変異含有ペプチドの潜在的な免疫原性を計算した。次いで、免疫原性または腫瘍制御を予測すると報告された特徴を含むネオエピトープを特定するために、本発明者らは、３つのフィルターを適用した。これらのフィルターは、（ｉ）Ｍｅｌｌｍａｎおよび同僚（Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年１１月２７日；５１５（７５２８）：５７２〜５７６）に記載されているように、Ｔ細胞受容体に接近可能な位置（Ｐ３−Ｐ７）に位置するネオエピトープにおける点突然変異）；（ｉｉ）Ｓｒｉｖａｓｔａｖａおよび同僚（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１４年１０月２０日；２１１（１１）：２２３１〜２２４８）に記載されるように、予測されるネオエピトープとそれらの正常な対応物との間の親和性の最大差異；ならびに（ｉｉｉ）ＮｅｔＭＨＣｐａｎアルゴリズムを用いる、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−２ＤｄまたはＨ−２Ｌｄ ＨＬＡ対立遺伝子に対する親和性＜１５０ｎＭであった。
実施例３：ＭＭ患者のＰＢＭＣは、予測されるネオエピトープを認識するＴ細胞を含んだ
ワクチン接種されていないＭＭ患者のＰＢＭＣは、次世代シーケンシングによって特定されたネオエピトープを認識するＴ細胞を含むことが実証された。この実証によって、以下の第１相臨床試験の段階を設定する、「ベースライン」での突然変異腫瘍抗原認識の程度を確立した：（ａ）ワクチン接種前のベースラインと比較して種々の予測されたネオエピトープに特異的なＴ細胞の頻度の、ワクチンが誘発する増大、および（ｂ）ベースライン時に認識されなかった抗原に対する応答の、ワクチンが誘発する誘導。推定突然変異エピトープを含むペプチドを、プールして用いて、ＨＬＡ制限の対立遺伝子を事前に定義する必要なく、ＣＤ４／ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣによる天然に選択されたエピトープへのプロセッシング後に、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を独立して刺激してもよい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年２月１日；１７０（３）：１１９１〜１１９６、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。専門的抗原提示細胞および非専門的抗原提示細胞の両方ともが、天然にプロセシングされたエピトープのみがＴ細胞に提示されることを確実にする、ロングペプチドの取り込みおよびプロセシングを必要とし、ここで突然変異はＨＬＡ結合またはＴ細胞認識のいずれにとっても重要であり得る。この実施例で用いられるロングペプチドは、１）ロングペプチドが線状エピトープの抗体認識を容易にする（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００９；５２０：１１−１９、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）；２）ロングペプチドは、しばしばプロテアソーム依存的様式でＨＬＡクラスＩ拘束エピトープに自然にプロセシングされて、ＣＤ８Ｔ細胞によって認識される必要がある（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年２月１日；１７０（３）：１１９１−１１９６、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）；および３）ロングペプチドは、ＣＤ４Ｔ細胞の最適な標的である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００３年７月９日；１００（１５）：８８６２〜８８６７、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）という観察に基づいて、得られた。
免疫学的アッセイにおける認識について試験されたペプチドの合成の基礎。
ＭＭのサブクローンの患者内の突然変異の異質性特徴と、突然変異選択における不確実性との両方に取り組むために、ＭＭ ＡＳＶの個別化ワクチンは、最大４８例までの患者および腫瘍特異的新抗原（ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）を含む（Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ、２０１４年１月１３日；２５（１）：９１〜１０１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。ほとんどの患者にとって、これはそれらの腫瘍において見出される全ての発現した非同義突然変異を含む。Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ’ｓ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ ＢａｎｋのＭＭ形質細胞試料から生成された突然変異リストの分析を用いて、各試料の合成のための突然変異体ペプチドを最大４８個まで特定する。各ペプチドは、点突然変異を中心とする３１マーからなる。ロングペプチドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるプロセシングが、各対象において発現され得る最大６つまでの対立遺伝子に対する、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ結合エピトープのいずれかを表し得る、より短い断片を生成することを可能にする。単一の点突然変異を含むそれぞれのペプチドである長い合成ペプチドのプールを、各ペプチドの非突然変異対応物と一緒に合成し、Ｔ細胞および抗原提示細胞の供給源として、バルク自己ＰＢＭＣを用いるＴ細胞機能アッセイで試験する。可能であれば、Ｔ細胞によって認識される最小のネオエピトープが定義される。
方法
ｉ．前感作
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋには、アノテーションされたＲＮＡおよびＷＥＳデータが入手可能な、各ＭＭ患者から、合計約２〜４×１０７個のＰＢＭＣを含む、２本のグリーントップチューブが保持されている。悪性細胞の認識によってｉｎ ｖｉｖｏでプライミングされたネオエピトープに対する免疫応答を拡大するように設計された、単一のｉｎ ｖｉｔｒｏでの前感作が最初に行われた。細胞を解凍し、ＰＢＭＣを単離し、アリコートに分けて、前感作段階で使用した、または後で使用するために冷凍した。前感作のために、１×１０７個を２４ウェルプレート中で３１マーのペプチドのプールと共に培養した。ＮＧＳデータが４８個以下の突然変異を示す患者の場合、全ての突然変異についてロングペプチドが生成され、感作に使用された。＞４８個の突然変異が特定される場合、４８個の突然変異の無作為選択に基づく感作のために、最大４８個のペプチドが合成された。感作に使用されるペプチドプールのサイズおよび組成は、ペプチドの溶解性が培養プレート中で維持されるように、種々のペプチドの生化学的特徴に基づいて決定した。前感作は、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で１０〜２０日間行った。陽性対照として、ＰＢＭＣのサブセットは、ＣＥＦペプチドプールなどのリコールウイルス抗原で前感作した。ペプチドへの既存のＣＤ８Ｔ細胞応答は、１０日目頃にピークに達すると予想されたが、ＣＤ４Ｔ細胞は、培養の２０日目頃にピークに達し、繰り返しのサンプリングおよび機能試験により最適な検出を保証した。
ｉｉ．ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
どのペプチドプールが自己Ｔ細胞によって認識されているかを特定するために、次いで、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを、前感作培養物から採取したバルクのリンパ球で行った。自己のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（Ｂ−ＥＢＶ）および／またはＰＨＡ拡大Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）を、抗原提示細胞として使用し、前感作に使用した同じペプチドのより小さなサブプールで一晩パルスした（あるいは、標的細胞が制限される場合、細胞培養物を分割して、ペプチドのサブプールで感作させた）。非刺激細胞は、陰性対照として役立てた。ＣＥＦペプチドプールを陽性対照抗原として含み、ＰＨＡ／ＰＭＡ−イオノマイシンを、細胞の全体的な生存率および生存を評価するために用いた。ＩＦＮ−γ分泌リンパ球を表すスポットを、ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ分析装置およびソフトウェア（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）で定量した。有意であるとみなされるためには、抗原特異的なＩＦＮ−γ応答は、５０，０００個の細胞のうち５０個を超えるスポット数および対照の非パルス標的細胞を用いて得られるスポットの数の少なくとも３倍超でなければならない。
観察された全ての反応性を確認し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてロングペプチドのサブプールに応答するＴ細胞の表現型（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）を特定するために、ＣＤ８、ＣＤ４およびＩＦＮ−γに対するｍＡｂを用いた前感作培養からの残りの細胞でＩＣＳを行った。陽性反応とは、対照の非パルス標的細胞で得られたパーセンテージよりも＞０．５％および＞３倍大きいと定義される。いくつかの場合において、抗原特異的Ｔ細胞の頻度は、さらなる分析のための特異性を示す細胞株の凍結保存を可能にするために十分に高くてもよい。
ｉｉｉ．応答するリンパ球の特異性
１つ以上のネオエピトープ含有ペプチドのプールに対する反応性を、予備スクリーンで特定し、これらのプールを、認識について個々にペプチドを試験することによってデコンボリューションした。Ｔ細胞応答がネオエピトープ特異的であることを確認するために、各突然変異体ペプチドを、その非突然変異体（すなわち、野生型）対応ペプチドと共に試験した。上記のようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＣＳに続いて、前感作培養物をこれらの実験に使用した。
ｉｖ．最小ＣＤ８＋Ｔ細胞ネオエピトープの特定
上記のスクリーンを「通過する」３１マーペプチドの数および細胞バンクから回収されたＰＢＭＣの数に依存して、認識される最小Ｔ細胞ネオエピトープを特定するために一連のアッセイを行った。ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、有限のサイズ（典型的には９、１０または１１マー）であるが、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドはかなり長さが変化し得るので、最小限のエピトープ特定は、クラスＩ結合ペプチドのみに、したがって、上記のＩＣＳアッセイにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されることが示されている３１マーのみに注目した。各陽性３１マーについて、推定上のエピトープの各位置に、点突然変異が配置されている全ての可能な９、１０および１１マーが合成された。これらの短いペプチドに対する非突然変異対応物を対照として試験した。これには、６０個のペプチド（推定上の各ネオエピトープおよびその非突然変異対応物について、９個の９マー、１０個の１０マーおよび１１個の１１マー）の合成が必要であった。細胞増殖期は、同種変異体３１マーペプチドを刺激抗原として用いて達成された。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、最初に短い変異体ペプチドのプールを用いて行われた。上記のように、陽性プールを次にデコンボリューションし、この段階で、対応する非突然変異ペプチドを対照として用いて、認識について個別に試験してもよい。観察される頻度に依存して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＴ細胞による認識について個々の基準で短いペプチドを試験する前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの反復刺激が必要である場合があった。あるいは、抗原特異的Ｔ細胞の濃縮は、ＩＦＮ−γならびに／またはペプチド反応性細胞の選別ならびに異種フィーダーおよびＰＨＡによる単一特異性株の非特異的な拡大を可能にする他の望ましいサイトカインを測定するアッセイで試みられた。
実施例４：ＡｕｔｏＳｙｎＶａｘ（商標）の生物学的活性を、５ＴＭＭシリーズまたはＭＯＰＣなどの１つ以上のマウスＭＭモデルで試験した
がんのネオエピトープを含むペプチドと複合体形成したＨＳＰを含む、ＡｕｔｏＳｙｎＶａｘ（商標）（ＡＳＶ（商標））組成物の生物学的活性は、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭマウスＭＭモデルにおいて試験された。ＭＯＰＣ３１５．ＢＭは、ヒト疾患のいくつかの特徴に似ているＢＡＬＢ／ｃマウスと同系のマウス悪性形質細胞株である。それは骨髄に移植され、静脈内注射によって導入されると溶解性骨疾患を引き起こし、血清中でＥＬＩＳＡによって測定することができるＩｇＡラムダＭタンパク質を分泌する。このモデルは、イディオタイプワクチンストラテジーを調査するために使用されており、ラムダ軽鎖の超可変領域のネオエピトープ、ペプチド９１−１０１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて強力なＣＤ４＋Ｔ細胞免疫を誘発することができる。上記のように、親細胞株ＭＯＰＣ３１５は、完全エキソームシーケンシングを受け、予備的な突然変異のリストが特定された。この例では、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭをＷＥＳに供して特定し、ＲＮＡｓｅｑで転写物中の突然変異体の発現を確認した。特定された突然変異の数が、親株に見られるものと類似していると仮定すると、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ ＡＳＶ代用物で使用するための全ての対応するロングペプチドを合成することは不可能である。これはこのモデルで認識された限界である。代わりに、フィルターの選択を適用して、候補ロングペプチドのリストを最大４８個まで狭めた。各ペプチドは、点突然変異を中心とする３１マーからなる。４８個のロングペプチドを、Ｈｓｃ７０と複合体を形成させ、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）と混合して、代理ＡＳＶワクチンを生成した。次いで、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおけるＡＳＶの最適な投与を特定し、単独で、およびレナリドミドと組み合わせて免疫学的効能を評価するための実験を行った。実験は、用量所見、成分活性、および組合せ評価のために配列した。ワクチン接種スケジュールは、動物モデルで試験した、同様の合成ロングペプチドベースのワクチン調製物に基づいた（Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１１年１１月３日；２９（４７）：８５３０〜８５４１）。免疫原性試験の後に、予防的腫瘍保護試験およびレナリドミドと組み合わせた療法試験が続いた。
方法
ｉ．組換えＨｓｃ７０およびＭＯＰＣ３１５．ＢＭ ＡＳＶ代理ワクチンに封入するためのロングペプチドの選択
ＭＯＰＣ３１５．ＢＭで発現されることが予想される突然変異の数が多いため、代理ワクチンに含めるためのペプチドの選択に対する不可知論的なアプローチは不可能であった。代わりに、親株であるＭＯＰＣ３１５について上記した３つのようなフィルターを適用して、３つのＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子の全てを代表する各１６個のペプチドの３つのグループ（合計で最大４８個に達するように組み合わせる）を選択できるようにした。
ｉｉ．免疫原性試験
これらの実験によって、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおけるＡＳＶのＭＯＰＣ３１５．ＢＭ代用物の最適な投与を特定し、免疫学的効能を単独で、およびレナリドミドと組み合わせて評価した。実験は、用量所見、ワクチン成分活性および組合せ評価のために配列された。ワクチン接種スケジュールは、動物モデルで試験した同様のワクチン調製物に基づいた（Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１１年１１月３日；２９（４７）：８５３０〜８５４１、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。
（ａ）ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ（「ＭＯＰＣ」）ＡＳＶ用量所見。
４つの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１日目および８日目の皮内注射によって漸増用量のＡＳＶを投与した。１つの群に、陽性対照としてＭＯＰＣラムダ軽鎖イディオタイプλ２（Ｉｄ ＡＳＶ）から残基９１〜１０１を含むペプチドで製剤化されたＡＳＶを投与し（参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ、１９８９；８（７）：１９４７〜１９５２）、ワクチン接種を受けていないマウスは陰性対照として役立てた。ＡＳＶ製剤は、Ｈｓｃ７０と総ペプチド混合物とが１：１のモル比で、４８個の合成３１マーペプチド（体細胞突然変異が中心、天然に存在する残基に隣接する）に対して複合化された１０，３０または１００μｇのＨｓｃ７０であった。この複合体を、１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）と混合した後に、１００μｌの総容量の滅菌生理食塩水に注入した。１００μｌの全血を、ワクチン接種の前および各実験の最後に、後眼窩採血によって各対象から得て、血清は、体液性免疫応答の潜在的な将来の分析のために凍結保存した。１５日目に対象を安楽死させ、赤血球の機械的破壊およびＡＣＫ緩衝液溶解により全脾細胞を回収した。Ｔ細胞免疫を、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。これによって、その後の実験のためのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性および最適用量を確立した。
（ｂ）ワクチン成分評価。
各ワクチン成分の相対的寄与を、上記パート（ａ）で確立された最適用量で各成分を含むワクチンを４匹試験対象の群に接種することによって評価した。予防接種スケジュールは、上記パート（ａ）に記載されているとおりであった。群には、ＭＯＰＣ ＡＳＶ（ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）を含む）、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）を含まないＭＯＰＣ ＡＳＶ、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）を含むＭＯＰＣペプチド（但し、Ｈｓｃ７０なし）、ＭＯＰＣペプチドのみ、ＭＯＰＣ Ｉｄ ＡＳＶまたは未処理対照が含まれた。抗原特異的Ｔ細胞応答は、記載のとおり評価した。
（ｃ）ＭＯＰＣ３１５．ＢＭに対するレナリドミド活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析。
ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ細胞に対するレナリドミドの直接的な活性は、８点用量曲線生存率アッセイによってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。９６ウェルプレート中の３連ウェルのＭＯＰＣ３１５．ＢＭを、漸増用量でレナリドミドと共インキュベートし、細胞生存率を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）蛍光によって４０時間で定量した。１０μｍのボルテゾミブは、細胞傷害性の陽性対照として役立てた。ＨＰ Ｄ３０００ディスペンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いてＤＭＳＯ中の１０ｍＭのレナリドミド・ストック溶液の自動化アリコートにより８点用量曲線を作成した。レナリドミドおよび対照は、エッジ効果を排除するためにプレート中にランダムに分布し、分析前に４０時間のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ蛍光読み取り値をデコンボリューションした。これらのデータによって、さらなる分析のための推定ＬＤ５０濃度が得られた。ＬＤ５０を、以前のワクチン接種モデルからの生理学的用量レベルと比較して、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ．３０−３２の推定単剤活性レベルより低い標的用量を特定した。
（ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏでＡＳＶ免疫プライミングを促進する際のレナリドミド活性。
ＭＯＰＣ ＡＳＶによる免疫プライミングを促進する際のレナリドミドの活性を動物モデルで評価した。試験対象の群に、腹腔内（ＩＰ）注射（滅菌生理食塩水中に希釈した１０ｍＭのＤＭＳＯストック）により、最適用量（上記（ｃ）パートで特定された）で単独またはレナリドミドと共に投与されたＭＯＰＣ ＡＳＶまたはＩｄ ＡＳＶを用いてワクチン接種した。未処置マウスは、陰性対照として役立てた。免疫学的効能は、前述のように評価した。
（ｅ）ＭＯＰＣ ＡＳＶ誘発性Ａｇ特異的免疫の機能的特徴付け。
ワクチン接種に対する細胞性免疫応答の詳細な特徴付けを行うために、１０匹のマウスのコホートに、レナリドミドの同時投与と共に、ＭＯＰＣ ＡＳＶまたはＩｄ ＡＳＶのいずれかをワクチン接種した；非ワクチン接種マウスは陰性対照として役立てた。全脾細胞をプールして、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、抗体結合磁気ビーズソーティングによって分離して、総ペプチドプールで再刺激した。増殖されたＴ細胞プールを、分析のために分けた。特定のネオエピトープに対するＴ細胞応答の頻度は、上記のようなマトリックスＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって特定された。これらの集団は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、パーフォリン、グランザイム、ＩＬ−４、およびＩＬ−５発現についての再刺激およびＩＣＳ／フローサイトメトリーによって機能的に特徴付けられた。突然変異ネオエピトープのレパートリーの特異性は、刺激のために、突然変異型または野生型ペプチドを使用するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって確認した。エピトープ特異的Ｔ細胞を単離して、ＩＦＮ−γ捕捉によりサブクローニングした。
ＭＯＰＣに対する細胞傷害活性は、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出アッセイによって評価した；自己由来、ペプチドパルス標的細胞および緩衝液溶解は、陽性対照であり、かつパルスしていない細胞は陰性対照であった。ＭＯＰＣネオエピトープレパートリーに対する特異性は、ＭＯＰＣまたはＨＯＰＣ １Ｆ／１２およびＲＰＣ５．４（ＡＴＣＣ；マナサス、ＶＡ）のような他のＢＡＬＢ／ｃ鉱油誘発形質細胞株に対する細胞傷害性アッセイによって評価した。これらの細胞株における潜在的な交差反応性突然変異の存在は、ＷＥＳおよびＭＯＰＣについて記載された分析によって評価された。
ｉｉｉ．予防的腫瘍保護研究：
（ａ）腫瘍チャレンジの最適化。
ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ細胞の数は、尾静脈注射によって漸増数の細胞数を導入することにより、ｉｎ ｖｉｖｏモデル化に最適化された。細胞を、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、１００μｌの総容量で標的細胞負荷を送達するために再懸濁した。ベースラインおよび７日間隔で、後眼窩採血によって１００μｌの全血を採取し、ＩｇＡ ＥＬＩＳＡおよび免疫増強のために血清を単離し、疾患進行のマーカーとしてＭ−スパイクを追跡した。試験動物を、脊柱における罹患前疾患負荷の指標である後肢麻痺について観察し、この事象で安楽死させた。大腿骨および脊柱を、骨髄中のＣＤ３＋リンパ球である、ＣＤ１３８＋形質細胞の形態学および免疫組織化学（ＩＨＣ）評価のための、屠殺、パラフィン包埋、および切片作製のために、剖検時に回収した。生存曲線をプロットして、１００％の死亡率をもたらす最小の腫瘍チャレンジ用量を特定した。
（ｂ）レナリドミドのｉｎ ｖｉｖｏ用量最適化。
レナリドミド投与は、ＭＯＰＣに対する単剤活性を最小化し、ＭＯＰＣ ＡＳＶとの同時刺激活性を最大にするように最適化された。１０匹のマウスのコホートに、最適化された用量でＭＯＰＣ腫瘍チャレンジを投与した。３日後、腫瘍生着を可能にするために、試験対象に、上記（ｉｉ）（ｄ）で特定された用量を中心に３つの異なる用量レベルでレナリドミドの毎週の腹腔内（ＩＰ）投与（滅菌生理食塩水で希釈した１０ｍＭのＤＭＳＯストック）を与えた。レナリドミドを用いない腫瘍チャレンジマウスは、陰性対照として役立てた。試験動物を、ＩｇＡレベルおよび後肢麻痺についてモニターし、腫瘍負荷を、剖検標本の病理およびＩＨＣによって確認した。カプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ）生存曲線を作成して、バックグラウンドよりも生存期間を有意に延長させない最大レナリドミド用量レベルを特定した。
（ｃ）ＭＯＰＣ ＡＳＶおよびレナリドミド抗腫瘍免疫の予防モデル。
１日目および８日目に、１２匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスのコホートに、ＭＯＰＣ ＡＳＶ＋レナリドミドまたは対照（ＭＯＰＣ Ｉｄ ＡＳＶ陽性対照、最適用量および未処置マウス陰性対照でのレナリドミド単独）をワクチン接種し、その後１５日目に、１００μｌの滅菌生理食塩水を尾静脈注射液に懸濁させた最適化チャレンジのＭＯＰＣ３１５．ＢＭ細胞を投与した。未処置の腫瘍保有動物は、陰性対照として役立てた。腫瘍の増殖に続いて、毎週の採血およびＩｇＡ ＥＬＩＳＡおよび身体検査を行った。後肢麻痺が検出されたときに動物を安楽死させ、最後の陰性対照対象が疾病前病期に到達すると、残りの対象を全て安楽死させた。カプランマイヤー生存曲線を、試験動物および未処理対照動物について作成した。各実験の終了時に、上記のようなＡｇ特異的免疫、エピトープ特異性、細胞傷害性およびＴｈ表現型の評価のために総脾細胞を回収した。剖検標本は、腫瘍負荷および骨髄へのＴ細胞浸潤についてＩＨＣによって検査した。
（ｄ）ＭＯＰＣ ＡＳＶおよびレナリドミドの治療モデル。
試験対象のコホートに、腫瘍チャレンジを投与し、３日後に上記の（ｉｉｉ）（ｃ）のようにＭＯＰＣ ＡＳＶ＋レナリドミドまたは対照を毎週ワクチン接種した。腫瘍の増殖に続いて、ＩｇＡ ＥＬＩＳＡおよび身体検査を行って、死後の評価を、記載されているように脾細胞および骨髄に対して行った。
実施例５：ＭＭを再発した患者におけるＡＳＶの最初のヒト臨床試験の第１相の適切な材料の製造
適格な患者は、ＭＭを再発した患者であり、最大４回の先行治療に続く移植について適格となった。患者は、標準のケア用ＩｍｉＤｓおよび／または低用量の経口用Ｃｙｔｏｘａｎと組み合わせてワクチンで処置された。エンドポイントとしては、安全性、免疫応答、および抗ＭＭ療法に対するワクチンの相加効能のシグナルが挙げられた。免疫モニタリングに関して、バイオマーカーの長期的な研究を行って、ワクチンに対する免疫学的応答を特定し、腫瘍の発達を追跡した。血液および潜在的には骨髄試料を、ワクチン接種の前および後に採取し、例えば、ネオエピトープ特異的Ｔ細胞表現型、ＴＣＲレパートリーおよび突然変異遺伝子の発現レベルの変化についてアッセイした。形質細胞エキソソームはまた、これらの分析のいくつかにとって便利でかつ有用な供給源であり得る。ＭＭ患者を試験に登録し、ワクチン接種の全過程で処置した後、免疫モニタリングおよび腫瘍進展の追跡を支援する研究を行った。
方法
ｉ．臨床試験デザイン
再発性多発性骨髄腫（ｎ＝約３０）の患者で、安全性、実現可能性および免疫学的応答を、第Ｉ相試験で評価する。この研究の目的は、ワクチンに対する安全性、薬物動態、臨床的および免疫学的応答を評価することである。必須の包含基準は以下である：１）処置レジメン後少なくとも１回、但し処置レジメン前４回以下の再発性ＭＭ、２）測定可能な疾患（血清Ｍタンパク質２ ０．５ｇｍ／ｄＬまたは関係する無血清軽鎖（ｓＦＬＣ）２１００ｍｇ／Ｌ、および異常ｓＦＬＣ比（＜０．２６または＞１．６５）または尿Ｍ−タンパク質２ ２００ｍｇ／２４時間）、３）末梢血絶対リンパ球数２１０００／μｌで示される適切な免疫予備量、４）Ｈｇｂ２８．０ｇｍ／ｄＬおよびｐｌｔ２５０，０００／μｌ、ならびに５）ＥＣＯＧ ＰＳ ２２。除外基準は以下である：１）多発性骨髄腫に対するワクチン免疫療法による事前治療、２）自己免疫疾患の病歴、３）同種異型造血幹細胞移植前、４）既知のＨＩＶまたは活性のＨｅｐＢもしくはＣ、および５）非黒色腫皮膚がん、上皮内がん（表在性膀胱がんを含む）、子宮頸部上皮内新生物または臓器限定前立腺がん（進行性疾患の証拠のない）を除く５年以内の同時２次悪性腫瘍。
患者は、組織の送達から８週間かかると予測される、ワクチン製造の基礎であるＮＧＳの組織獲得を用いたスクリーニングで骨髄生検を受けた。登録された患者は、各々２８日サイクル（サイクル１および２）の１〜２１日目にレナリドミド２５ｍｇを経口で毎日、１〜７日目にシクロホスファミド５０ｍｇを経口で１日２回、およびプレドニゾン２０ｍｇを経口で毎日、という暫定治療を受けた。シクロホスファミドは、多発性骨髄腫のためにレナリドミドおよびデキサメタゾンと組み合わせて一般的に使用されるアルキル化剤である（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１１年８月；８６（８）：６４０〜６４５；Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２００７年５月；１３７（３）：２６８〜２６９）。その直接的な細胞傷害作用に加えて、低用量のシクロホスファミドは、Ｔｒｅｇｓの頻度を減少させて、動物モデルおよびヒト研究における樹状細胞成熟およびＴｈ１／Ｔｈ１７ Ｔ細胞表現型を通じた免疫プライミングの好ましい環境を促進することが示されている（Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ．２０１３年５月；６２（５）：８９７〜９０８；Ｂｌｏｏｄ、２０１０年６月３日；１１５（２２）：４３８４〜４３９２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００６年３月１日；１７６（５）：２７２２〜２７２９；Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１年２月１日；７１（３）：６６１〜６６５；それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。規則的または低用量のシクロホスファミドと治療用腫瘍ワクチンとの早期臨床試験によって、優れた免疫学的および場合によっては臨床的効能との関連性が実証された（Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ、２０１２年５月；６１（５）：６２９〜６４１；Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ．２０１３年１月；６２（１）：１７１〜１８２；Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２年８月；１８（８）：１２５４〜１２６１、それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる）。したがって、レナリドミド、低用量の経口シクロホスファミド、およびプレドニゾンの組合せは、ＡＳＶでのワクチン接種前の暫定治療の合理的選択であった。三つ組みの組合せは、レナリドミドおよびデキサメタゾンを以前に受けた患者においてさえ、相加的な効果をもたらした。プレドニゾンは、試験のワクチン部分に入っている患者がグルココルチコイドに少なくとも３週間曝露されないようにしてこれらの薬剤の免疫抑制作用を軽減するために、各２８日サイクルの最初の週にのみ投与された。
患者は、２８日のサイクル３の１、８、１５および２２日目にＡＳＶを皮内注射で、ならびに１〜２１日目にレナリドミド２５ｍｇを経口で毎日投与された後、各々２８日サイクルの１〜２１日目に、レナリドミド２５ｍｇの経口投与［ＰＯ］と同時に、各後続のサイクルの間に毎月ワクチンを投与された（Ｃ４〜Ｃ１２）。これは、１年間の治療期間にわたって合計１５回のワクチン投与を構成した。患者は、各ワクチン接種の前に低用量のシクロホスファミドを投与され続けた。一旦、プロトコールのワクチン部分が競合すれば（Ｃ１２）、対象は、Ｃ１２を通じて、レナリドミド２５ｍｇを、各２８日のサイクルの１〜２１日目に経口的に毎日投与され続けた。レナリドミドに関して、帰属する毒性のためにプロトコールで指定された用量の差し控えまたは低減が認められていた。血栓予防、ビスホスホネートおよび造血成長因子を含む、臨床的に示された同時投薬が可能であった。対象は、Ｃ１２（試験の終了）後に完全な再ステージングおよび免疫学的評価を受けた。フォローアップ来院は、ＰＦＳを評価するために、３か月ごとに２４ヶ月間継続された。
免疫原性、薬物動態学（ＰＫ）、および薬力学（ＰＤ）が評価された。安全性評価には、有害事象（ＡＥ）および重篤なＡＥの頻度、重症度、および関係が挙げられ、薬物の組合せを、試験薬物の最終投与後最大６０日間評価した。免疫学的評価は以下で完了した：（１）ワクチン前、（２）４週間の投与後；（３）それ以降の月２回または試験の最終来院。客観的な反応（厳格な完全応答、完全応答、非常に良好な部分応答（ＶＧＰＲ）、およびＰＲを含むＯＲ）、疾患の進行および再発を、副次目的として評価し、各サイクルの最後または試験終了来院時に評価した。反応は、国際骨髄腫ワーキンググループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ：ＩＭＷＧ）の基準に従って評価した。
実施例６：データベースから誘導されたＭＭネオエピトープ
ＭｅｄＧｅｎｏｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と協力して、本発明者らは、公表された情報源と、未公表のＴＣＧＡおよびＩＣＧＣ研究から特定されたＭＭの体細胞突然変異の手動でキュレーションされたデータベース（ＯｎｃｏＭＤ）を検索した。ＯｎｃｏＭＤは、体細胞突然変異特定する生のＮＧＳ ｆａｓｔｑファイル、ならびに腫瘍突然変異のプロファイルおよび発現サインを特定する多様なゲノミクスおよびバイオインフォマティクスデータを組み合わせるアノテーションエンジンを素早く処理する広範な計算ワークフローを有する。ＭＭに特有の４５０５個の固有なキュレーションされた突然変異データの要約を表２に示す。重要なことに、データベースはまた、この徴候におけるキュレーションプロセスの忠実性に対して問いかける、ＭＭ（例えば、ＭＹＣ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＴＰ５３、およびＫＤＭ６Ａ）における悪性進行に関連する遺伝子において、突然変異を報告する。キュレーションされたデータベースのほとんどの突然変異は、４１３個の試料の中で１回のみ発生する。これは、ゲノム中でランダムに生じるパッセンジャー突然変異の大規模な配列を示しており、突然変異のランダムな性質によって、結果として生じるネオエピトープが主に個々に腫瘍特異的である理由が説明される。
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ＭＭ中の４５０５個の固有の突然変異から、１２個のＨＬＡ対立遺伝子に対するネオエピトープおよび親和性を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎを用いて予測した（図１）。ネオエピトープのサイズは、９および１０マーに限定された。一般に、ＩＣ５０が＜１５０ｎＭのペプチドは、中間の結合剤に対して強いと考えられ、一方で＜５００ｎＭは、弱い結合剤であると考えられる。代表的な産物は、ＩＣ５０が＜１５０ｎＭの３６２個の９マーを示し、ＩＣ５０が＜５０ｎＭの１９２個の９マーが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１について予測された。表３は、ＩＣ５０が＜５０ｎＭである実際の予測されたネオエピトープを列挙する。ＩＣ５０＜１５０ｎＭの全てのペプチドについてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の場合にそれらの非突然変異対応物に対するする予測された９マーおよび１０マーのネオ−エピトープの親和性を比較する散布図を作成した（図３）。ＯｎｃｏＭＤでキュレーションされたＭＭ試料の場合、ネオエピトープ／正常対応物の対の間の予測された親和性における類似性もまた観察される（表３および図３）。表３において、ペプチド配列を、突然変異ペプチド配列における突然変異アミノ酸（第２列）および突然変異位置（６列目）で天然ペプチド配列に通常見出されるアミノ酸を除いて、小文字で示しており、これは、括弧内に大文字で示す。
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実施例７：グリア芽細胞腫（ＧＬＢ）ネオエピトープ
本明細書に開示される方法を使用して、免疫原性組成物（ワクチン）への組み込みのための３１アミノ酸長の最大２４個のペプチドを、３人の対象について特定した。表４は、３人の対象全てのデータの要約を示しており、表５〜７は、各々の対象（それぞれ患者Ａ、ＢおよびＣ）についての概要を示す。
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実施例８：がん特異的突然変異ペプチドの特定
Ｉ．主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩの両方に対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を単離した。使用される方法次第で、免疫親和性精製を使用して、種々のレベルの特異性のＨＬＡを単離してもよい（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｓｅｗａｒｄら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１１年３月；１０（３）：Ｍ１１０．００２４７７を参照のこと）。例えば、Ｗ６／３２抗体を使用して、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡサブプールを集合的に表すＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃタンパク質を単離してもよい。同様に、Ｌ２４３抗体を用いて、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質を単離してもよい。標的ＨＬＡ結合ペプチドを含む組織をホモジナイズし、次いで組織ホモジネートを、目的のＨＬＡ分子に対する適切な抗体を含有する、免疫親和性カラムに通した。カラムに結合したＨＬＡ分子を適切に洗浄した後、抗体結合タンパク質およびその関連ペプチドを、低ｐＨ洗浄で遊離した。この溶出液を、低分子量カットオフフィルターを用いて限外濾過して、遊離ペプチドがタンパク質とは別個に流れるようにさせた。次いで、得られたペプチド画分を濃縮し、適切な溶媒系（例えば、水中０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の溶媒Ａ）に移し、次いでキャピラリーまたはナノ逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムにロードした。次いで、９０分間の時間経過にわたって溶媒勾配（例えば、１０％〜５５％溶媒Ｂ：８０％アセトニトリル２０％水に含まれる０．１％ギ酸）を用いてカラム結合ペプチドを溶出した。
勾配の間にペプチドが溶出するので、それらを質量分析（ＭＳ）によって分析した。質量分析は、典型的には、分析下で分子の親イオンおよび断片の両方の高正確性質量測定を行うことができる、四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）または四重極オービトラップ型質量分析計のような、ある形式のハイブリッドタンデム質量分析計でのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および質量分析を用いて行った。そのような質量分析によって、分析されるペプチドの配列が明確に定義されるように、またはほとんどそうであるように、インタクトな分析物および断片の質量の親の質量が典型的には提供される。
次いで、バイオインフォマティクス法を用いてペプチド配列を分析し、それらが正常（野生型）タンパク質配列に相当するか、または突然変異（異常）タンパク質配列に相当するかを決定した。これに加えて、または代わりに、病変組織から得られた配列を、同じ患者または適切な対照（例えば、別の対象由来の試料または正常組織試料由来の既知のペプチドのデータベース）由来の正常組織（非がん組織）の分析によって決定される配列と比較した。さらなる分析は、ＭＳによって特定された配列と、正常および疾患組織の両方のシーケンシングによる個々の患者のゲノムのゲノム分析によって決定されたタンパク質配列との比較によって可能であった。
ＩＩ．正常組織または異常組織に直接対応する、天然の非改変ペプチド配列の分析に加えて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に供されたＭＨＣ結合ペプチドについても分析を行ってもよい（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｓｅｗａｒｄ（前出）；およびＤｒｏｕｉｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、２０１３年１月；６５（１）：１８６〜９６を参照のこと）。翻訳後修飾のこのような分析は、正確な前駆体質量測定および衝突誘起解離を用いて行ってもよい（例えば、前出のＳｅｗａｒｄを参照のこと）。適切なソフトウェアを使用して、ペプチドコア配列および関連ＰＴＭおよびその位置を特定してもよい。特定され得るＰＴＭの範囲には、限定するものではないが、酸化メチオニン、アミノ末端グルタミンおよびグルタミン酸由来のピログルタミン酸、ならびにグルタミンおよびアスパラギンの脱アミノ化が挙げられる。特定され得る追加のＰＴＭとしては、ＳｅｒまたはＴｈｒでのＯ−Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｌｙｓまたはアミノ末端でのアセチル化；カルボキシル末端でのアミド化；Ａｒｇ→シトルリン；Ｓ−システイン化；Ｓ−システイニルグリシン；Ｓ−グルタチオニル化；Ｌｙｓまたはアミノ末端での糖化；Ｓホモシステイン化；Ｃｙｓ、ＬｙｓまたはＨｉｓにおける４−ヒドロキシ−５−ノネナール；Ｌｙｓのマロンジアルデヒド；ＬｙｓまたはＡｒｇでのメチル化；Ｃｙｓにおける酸化；およびＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒでのリン酸化が挙げられる。データベース検索によって識別された全ての識別情報は、手動で最適に検証される。
ＩＩＩ．ある範囲のＰＴＭについてのＭＨＣ結合ペプチドの分析に加えて、ＭＨＣ結合ペプチドの事前分画を行って、特定のＰＴＭ中で分析されたペプチドプールを濃縮してもよい。例えば、リン酸部分を含むペプチドを、このアプローチを用いて分析してもよい（例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００６年１０月３日；１０３（４０）：１４８８９〜９４を参照のこと）。総ＭＨＣ結合ペプチドは、上記のような方法で単離された。次いで、得られた総ペプチドプールを、メチル化に供して、カルボキシレート基（例えば、Ｃ末端ＣＯＯＨおよび側鎖ＡｓｐおよびＧｌｕ ＣＯＯＨ）をそれらの対応するメチルエステルに変換してもよい。次いで、メチル化されたペプチドプールを、Ｆｅ３＋固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムに通した。リン酸化されたペプチドを、洗浄後カラムに保持し、次いで、穏やかな酸洗浄（例えば、希アスコルビン酸）で溶出し、これを、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに直接適用した。次いで、このホスホペプチド画分を、溶媒勾配を用いて追加のＲＰ−ＨＰＬＣカラムを通して質量分析計中に溶離させ、分析して親イオンおよび断片ＭＳ／ＭＳデータの両方を得て、コアペプチド配列およびリン酸化修飾の位置の特定をさせた。
このアプローチの改変（例えば、上記のＺａｒｌｉｎｇを参照）では、２つの試料（例えば、正常および疾患組織、または２つの異なる細胞株）の比較を、単一の分析で行ってもよい。単一の試料を２つの部分に分け、ｄ０−またはｄ４−メタノールでメチル化し、これによって、軽、重の安定な同位体標識を有する２つの部分を生じる。異なる同位体標識を有する試料を組み合わせ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりホスホペプチドを富化させ、上記のようにＬＣ−ＭＳにより分析する。ホスホペプチドのシグナルは、分子中のカルボキシレート基あたり３ｍ／ｚ単位で分離された二重線として質量スペクトルに現れる。一方または他方の試料に特有のホスホペプチドは一重項として現れる。
データ分析は、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で利用可能なクロマトグラムの３次元視覚表示を使用して実行した。ペプチド配列は、ＭＳ／ＭＳスペクトルのマニュアル解釈、正確な質量測定、およびＭＡＳＣＯＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｑｕｅｒｙ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）の組合せによって決定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、対応する合成ペプチドに記録することにより、配列を確認した。確認されたペプチド配列のタンパク質供給源は、ヒトタンパク質についてのｎｒおよびＲｅｆＳｅｑデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を検索することによって得た。
当業者であれば、前述の技術を改変し得ること、本明細書中に開示される方法および組成物において有用な突然変異体ペプチド（例えば、リンペプチド）の特定を補助する他の技術が公知であることを理解するであろう。適切な方法は、例えば、それぞれ、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｍｅｙｅｒら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ、２００９年７月；８（７）：３６６６〜７４；ＷＯ２０１３１７７５９３；ＷＯ１９９２０２１０３３；ＷＯ２０１１１４９９０９；ＷＯ２０１４０３６５６２；ＷＯ２０１５０３４５１９；ＷＯ２０１４０３９６７５；ＷＯ２０１４０９３８５５；および米国特許第７，０２６，１６７号に見出され得る。
実施例９：Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫におけるＡＳＶ組成物の腫瘍保護活性
Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫、Ｂ１６−Ｍ２７およびＢ１６−Ｍ３０（Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、５２０［７５４９］：６９２〜６［２０１５］）における２つの予測されたネオエピトープを含むＡＳＶ組成物の治療効能を、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫で試験した。Ｍ２７およびＭ３０の配列を表８に示す。
材料
− Ｃｏｒｎｉｎｇ １７５ｃｍ２細胞培養フラスコ、カタログ番号４３１０８０、ロット番号０５４１５００６
− ＦＢＳ、Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ１００−１０６、ロットＡ９６Ａ００Ｙ
− ＰＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２１−０４０−ＣＶ、ロット２１０４０３４４
− Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ１５１４０−１２２、ロット１６６５６０１
− Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ、カタログ２５０３０−０８１、ロット１６２７６５６
− ２メルカプトエタノール、Ｇｉｂｃｏ、カタログ２１９８５−０２３、ロット１６２８４４８
− ＲＰＭＩ１６４０、Ｇｉｂｃｏ、カタログ１０−０４０−ＣＶ、ロット１００４０６０９
− 完全培地組成物：４５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０，５０ｍｌのＦＢＳ、５ｍｌのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、５ｍｌのＬ−グルタミン、および５００ｕｌの２メルカプトエタノール。
− ＴｒｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（トリプシン）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
方法
ｉ．Ｂ１６．Ｆ１０細胞の細胞培養および腫瘍チャレンジ：
バイアルのＢ１６．Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ；Ｐ７）を解凍し、１５ｍｌコニカルチューブで、予め温めた完全ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。その細胞を２５℃で、４分間１５００ＲＰＭで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを新鮮な完全培地に再懸濁し、完全培地５０ｍＬを含む１７５ｃｍ２フラスコ中、３７℃で培養した。＞８０％コンフルエントになるまで、隔日、顕微鏡下で細胞を観察した。
細胞が＞８０％コンフルエンシーに達したら、培地を回収し、１０ｍＬの予め温めたＰＢＳを加えた。ＰＢＳを採取し、次いで、５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓをフラスコに加えて、細胞を表面から剥がした。フラスコをトリプシンと共に３７℃で５分間インキュベートした。トリプシン反応を、新鮮な２０ｍＬの完全培地で停止させた。細胞懸濁液を、１０ｍＬピペットを使用して上下にピペッティングして、単一細胞懸濁液を生成した。細胞を５０ｍＬコニカルチューブに集め、２５℃で、４分間、１５００ＲＰＭで遠心分離した。上清を廃棄して、細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁した。細胞を１７５ｃｍ２の４つのフラスコ中で１：２０の比で培養した。
細胞を、上記のようにマウス（Ｃ５７ＢＬ／６；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注射する日に採取した。細胞を無血清ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×１０５細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再懸濁した。マウス１匹あたり１００μｌの細胞を皮下に注射した。全部で６０匹のマウスを注射した。腫瘍体積（ｍｍ３）の測定は、腫瘍チャレンジ後１２日で開始して２〜３日ごとに得た。
ｉｉ．ＡＳＶ組成物および治療群の調製：
ＡＳＶ組成物は、Ｍ２７およびＭ３０黒色腫突然変異を含む２つの２７マーペプチドで調製した。Ｈｓｃ７０（Ｂｉｏｍａｙ ＡＧ）とペプチドとの混合物を、Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比が１：１０で、０．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＫＣｌ中で、１群あ
たりそれぞれ１２匹のマウスについてマウス１匹あたり２００μＬの投与中で３μｇ、１０μｇまたは３０μｇのＡＳＶ投与量で調製した。対照試料はまた、Ｈｓｃ７０単独（３０μｇ）、ペプチド単独（各ペプチド６．６μｇ［ＡＳＶ３０μｇ中に存在する量に等しい］）およびペプチド＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（各ペプチド１００μｇ、５０μｇのポリ［ＩＣ］））の投与について、示すとおり調製した。
各々の群について、ペプチド−Ｈｓｃ７０複合体を、各ペプチドについて個別に作製し、その後混合した。治療群は以下のとおりであった：
Figure 2018515519
Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体を３７℃で２時間インキュベートした後、マウス１匹あたり全部で３回の注射のアリコートを調製し、アリコートを凍結させた。治療群６では、ポリ（Ｉ：Ｃ）をマウス注射の直前に遊離ペプチドに添加した。
腫瘍チャレンジ後、３日目、９日目および１５日目に、腫瘍から最も離れた部位にマウス１匹あたり２００μｌの治療用量を皮下に注射した。
結果：
マウス１匹あたり１０μｇおよび３０μｇの用量でＡＳＶを用いた治療により、Ｈｓｃ７０単独での治療と比較して有意な腫瘍保護が得られた（図４、腫瘍細胞注入後最大１６日目までの腫瘍増殖曲線を示す；各プロットの右下のボックスの番号は、１６日目にまだ生存しているマウスの数を示す）。具体的には、「混合モデル」試験（ｐ＜０．００５；Ｈｓｃ７０およびペプチドのみの対照群との有意差を示す群は、アスタリスクで示す）を用いて、負の対照群（Ｈｓｃ７０またはペプチド単独）よりも有意に遅い速度で腫瘍が増殖した。１０および３０μｇのＡＳＶ用量（第２群および第３群）で処置したマウスの腫瘍増殖率は、陽性対照群（ペプチド＋ポリ［Ｉ：Ｃ］）と有意に異なることはなかった。各治療群におけるマウスにまたがる平均腫瘍体積を図５に示す。
実施例１０：Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫において、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の有無で２つのネオエピトープを含む異なる治療用量のＡＳＶ組成物を試験した。
実施例９に記載のＭ２７およびＭ３０ネオエピトープを含有するＡＳＶ組成物の治療効能を、サポニンアジュバントＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントの有無で、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫において試験した。実施例９に記載の腫瘍拒絶アッセイを、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の有無において繰り返し、この実施例では、Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体を、Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比１：２０で調製した。
方法：
７つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与のために、以下のＡＳＶ組成物および対照試
料を調製したことを除いて、実施例９に記載の方法を繰り返した。１群あたり１２匹のマウスの各々についてマウス１匹あたり２００μＬの投与中３μｇ、１０μｇまたは３０μｇのＡＳＶ投与量に対して、Ｈｓｃ７０とペプチドとの混合物を、０．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＫＣｌの中で、Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比１：２０で調製した。対照試料はまた、Ｈｓｃ７０単独（３０μｇ）、ペプチド＋ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（各ペプチド１３．３μｇ（３０μｇのＡＳＶ中に存在する量に等しい）、Ｈｓｃ７０なし）、およびペプチド＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（各ペプチド１００μｇ）の投与について示すとおり調製した。治療群は以下のとおりであった：
Figure 2018515519
結果：
マウス１匹あたり１０μｇ、３０μｇおよび３０μｇ＋１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の用量のＡＳＶ組成物での治療は、Ｈｓｃ７０単独による治療と比較して有意な腫瘍保護を提供した（図６は腫瘍細胞注入後最大１６日目までの腫瘍増殖を示している）。ペプチド単独（３０μｇのＡＳＶ中に存在するのと同じ量）およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（第６群）を用いた療法も、有意な保護を提供した。各治療群のマウスにまたがる平均腫瘍体積（最大１８日目まで）を、図７に示す。治療群における率生存に対応する効果が観察され、全てのＡＳＶ投与量で、Ｈｓｃ７０単独と比較して生存期間が延長した（図８）。ペプチド単独（３０μｇのＡＳＶ中に存在するのと同じ量）およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（第６群）で処置したマウスにおいても、生存期間の延長が観察された。
実施例１１：ＡＳＶ処置マウスにおけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞応答の分析
ネオエピトープに対するＴ細胞応答を、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞によるチャレンジ、ならびに実施例９および１０に記載のＭ２７およびＭ３０ Ｂ１６．Ｆ１０ネオエピトープを含むＡＳＶによる処置の後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて分析した。マウスに、腫瘍細胞をチャレンジして、実施例１０に記載のようにＡＳＶ試料を投与した。腫瘍チャレンジ後２２日目に、マウス脾細胞を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行って、Ｔ細胞応答をプローブした。
材料：
− ＡＣＫ溶解緩衝液、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１０４９２−０１、ロット番号１７０１３７８
− ＦＢＳ、Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ１００−１０６、ロットＡ９６Ａ００Ｙ
− ７０ミクロンセルストレーナ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３１７５１、ロット１１１６６６
− ＰＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２１−０４０−ＣＶ、ロット２１０４０３４４
− 繊細な操作はさみ４．７５”ストレートシャープ／シャープ、Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ−６７０２
− ＢＤ ＥＬＩＳＰＯＴプレート、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ、カタログ番号５１−２４４７ＫＣ
− ＢＤ ＮＡ／ＬＥ精製抗マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（滅菌）、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ、カタログ番号５１−２５２５ＫＣ、ロット番号５０４４５７９、ストック濃度１ｍｇ／ｍＬ、最終濃度５μｇ／ｍＬで使用するために滅菌ＰＢＳで１：２００に希釈。
− ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ、カタログ番号５１−１８１８ＫＺ、ロット番号５０４４５７８、ストック濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、最終濃度２μｇ／ｍＬのためにＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中で１：２５０に希釈。
− ストレプトアビジン−ＨＲＰ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ、カタログ番号５１−９０００２０９、ロット番号５１６３５０９、１００倍ストック濃度、最終濃度のためにＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中で１：１００に希釈。
− ＡＥＣ基質セット１０プレート、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ、カタログ番号５５１９５１、ロット番号６０１１７８６、５０倍ストック濃度；最終作業濃度のために各１ｍＬのＡＥＣ基質で希釈したＡＥＣ色素原１滴（２０μＬ）。
− Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ細胞培養グレード（Ｃｏｎ Ａ）のコンカナバリンＡ（５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ番号Ｃ０４１２−５ＭＧ、ロット番号ＳＬＢＮ５２０９Ｖ、最終濃度５μｇ／ｍＬに希釈。
− Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ５９２７−５００ＭＬ、ロット番号０４３Ｋ０１５４１、最終濃度が０．０５％になるようにＰＢＳで希釈。
− Ｔ細胞培地（ＴＣＭ）：
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方法：
−１日目（腫瘍チャレンジの前日）に、５０マイクロリットルのＩＦＮ−γ捕捉抗体を、１０ｍＬの滅菌ＰＢＳに希釈し、希釈した抗体１００マイクロリットルを、９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートの各ウェルに添加した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。
翌日（０日目）、抗体溶液を捨て、プレートを完全Ｔ細胞培地で洗浄し、各ウェルを、完全Ｔ細胞培地（ＴＣＭ）（１０％ＦＢＳ含有）で満たして、室温で少なくとも２時間プレートをブロックした。２時間後、ブロッキング緩衝液を破棄した。
１０匹のマウスを屠殺し、それらの脾臓を採取した。脾臓を、７０ミクロンセルストレーナで処理し、脾臓１つあたりＡＣＫ溶解緩衝液１ｍＬを用いて赤血球を溶解させた。完全培地を数分後に加え、その混合物をスピンダウンし、それを５００万細胞／ｍＬの濃度で、単一細胞懸濁液として再懸濁した。ナイーブなマウスを屠殺し、脾細胞を採取し、同一の方法で再懸濁した。ナイーブ脾細胞の半分を、３０分間（３０００ｒａｄ）照射して、抗原提示細胞として機能させ、残りの半分を対照として使用するために保存した。照射後、細胞を１０００万細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。
完全Ｔ細胞培地中の各マウス由来の脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの各列に、１００マイクロリットルのＴＣＭ中に５００，０００個の細胞で播種した。照射された脾細胞を３つの群に分けた：第１群は、ペプチドを投与せず（陰性対照）、第２群は５μｇ／ｍＬのペプチドＭ２７でパルスし、第３群は５μｇ／ｍＬのペプチドＭ３０でパルスした。これらの照射された脾細胞を、１００μｌのＴＣＭ中１，０００，０００個の細胞の濃度で各マウスの脾細胞に対応するウェルに対して、各条件について２連で加えた。陽性対照として、各マウスの１つのウェルを、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を用いて最終濃度５μｇ／ｍＬで刺激した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。
２日間のインキュベーション後、プレートの内容物を廃棄し、プレートを２００μＬの脱イオン（ＤＩ）水で２回洗浄した。水で２回洗浄した後、ウェルを２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。洗浄後、ビオチン化ＩＦＮ−γ検出抗体４０μＬを、ＰＢＳ中の１０ｍＬの１０％ＦＢＳに希釈し、希釈した抗体１００μＬを各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。
２時間後、抗体溶液を廃棄し、プレートを２００μＬのＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄した。洗浄後、１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを、ＰＢＳ中の９．９ｍＬの１０％ＦＢＳに希釈した。１００μＬの酵素複合体溶液を各ウェルに添加し、そのプレートを室温で１時間インキュベートした。
１時間のインキュベーションの後、酵素コンジュゲート溶液を廃棄して、ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎでプレートを４回洗浄した。４回目の洗浄後、プレートを２００μＬのＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎなし）で２回洗浄した。ＡＥＣクロモゲン１０滴をＡＥＣ基質１０ｍＬに希釈することにより、現像液最終基質溶液を調製した。最終基質溶液１００μＬを、各ウェルに添加し、反応を約２０分間続けさせた（スポットが現れるまで、過度に発達しないようにした）。反応を停止するために、ウェルをＤＩ水で数回洗浄した。洗浄後、プレートを完全に乾燥させ、暗所で一晩乾燥させた。翌日、プレートをＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ ＭａｃｒｏＡｎａｌｙｚｅｒプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）および関連のソフトウェアＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．１．３６を用いて分析した。
実施例１２：Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫における追加のＡＳＶ組成物の腫瘍保護活性
Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫における１８個の予測されたネオエピトープを含むＡＳＶ組成物の治療効能を、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫マウスモデルにおいて試験した。１８個のペプチドを、ロングペプチド（２７マー）として合成し（表８）、組換えヒトＨｓｃ７０（ｒｈＨｓｃ７０）と複合体形成させた。次いで、この複合体を、生きたＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞をチャレンジしたマウスにおける治療効能について試験した。腫瘍を保有していないＣ５７ＢＬ／６マウスの別個のコホートを、免疫原性評価のために、１８個のペプチドのうち２つ（Ｍ２７およびＭ３０；以下の表８参照）と複合体形成したＨｓｃ７０を用いて免疫化した。
Figure 2018515519
材料および方法
ｉ．Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍細胞の培養および腫瘍チャレンジ：
低継代（Ｐ７）Ｂ１６．Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ）を組織培養から採取し、無血清ＰＢＳ中で洗浄し、５×１０５細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。３日前に脇腹を削ったＣ５７Ｂｌ／６マウスに、１００μｌ中で５×１０４個の細胞を、剃毛した領域に皮下注射した。
ｉｉ．合成Ｂ１６．Ｆ１０ペプチド：
１８個の免疫原性Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍ネオエピトープを、点突然変異を中心にして２７マーとしてＣＳ Ｂｉｏにより合成した（表８）。ペプチドは、粉末形態で投与され、１００％ＤＭＳＯ中に２５〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で溶解した。
ｉｉｉ．腫瘍を保有するマウスの治療のためのＡｕｔｏＳｙｎＶａｘワクチン代用物の組成：
Ｂ１６．Ｆ１０ペプチドの凍結ストックを、ＰＢＳ中で作業濃度に希釈し、次いで等モルの１８個のペプチドのプールを生成した。ペプチドプールは、総ペプチド：タンパク質のモル比１：１でｒｈ−Ｈｓｃ７０と混合した。したがって、各ペプチドは、１／１８：１のモル比で表された。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでマウスの注射まで氷上に置いた。
ｉｖ．腫瘍を保有していないマウスにおける免疫原性試験のためのＨｓｃ７０−ペプチド複合体の組成：
腫瘍を保有していないマウスの免疫化に使用したワクチン物質は、ペプチド：タンパク質のモル比１０：１で、ｒｈＨｓｃ７０のアリコートをＭ２７およびＭ３０ Ｂ１６．Ｆ１０ペプチドの各々と混合することによって調製した。２つの複合体を、別々に３７℃で１時間インキュベートし、次いで混合して、マウスの注射まで氷上に置いた。
ｖ．ワクチンの投与および腫瘍増殖動態の評価：
腫瘍を保有するマウス（１群あたりｎ＝１１〜１２）を、注射直前に１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントと混合した、３０または１００μｇ（Ｈｓｃ７０の量を参照）のＡｕｔｏＳｙｎＶａｘワクチンで処置した。陰性対照として、ペプチドの非存在下でビヒクル（ＰＢＳ）または１００μｇのＨｓｃ７０および１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の混合物を用いて２つの群のマウスを処置した。陽性対照として、５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントと混合した、高用量のＭ２２、Ｍ２７、Ｍ３０、Ｍ４４、Ｍ４８およびＭ５０ペプチド（各５０〜１００μｇ）からなるプールを用いて、1つの群のマウスを処置した。腫瘍チャレンジ後３、９および１５日目に、腫瘍の反対側の脇腹に対角線上に、処置は、２００μｌの皮下投与を行った。腫瘍のサイズは、３〜４週間にわたって２〜３日ごとにノギスを用いて評価し、腫瘍体積を時間の関数としてプロットした。腫瘍体積は、以下の式を用いて決定した：（Ｌｘ［Ｗ２］）÷２、式中、Ｌは最長軸の長さであり、Ｗは腫瘍の幅である。
腫瘍を保有していないマウスを、Ｍ２７ペプチドと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０、および１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントと混合したＭ３０ペプチドを用いて１週間間隔で２回、注入直前に免疫化した。対照群のマウスを、（ａ）ペプチドの非存在下で１０μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）と混合した３０μｇのＨｓｃ７０、または（ｂ）５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバント中の各々１００μｇの２つのペプチドを用いて免疫した。
ｖｉ．免疫原性評価：
腫瘍を保有していないマウスにおける免疫原性試験のために、ＲＢＣ溶解後の脾細胞から単核細胞を調製し、各々５μｇ／ｍｌのペプチドの存在下で、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５細胞で播種した。陽性対照として、脾細胞を、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）で、５μｇ／ｍＬの最終濃度で刺激した。培養物を４１時間インキュベートし、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ２．０、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて計数した。
結果
ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントと混合した３０または１００μｇのＡｕｔｏＳｙｎＶａｘワクチンでの処置は、腫瘍体積に対する有意な処置時間相互作用について試験する線形混合モデルを用いて、ＰＢＳまたはペプチドなしのＨｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の混合物で処置したマウスと比較した場合（ｐ＜０．０１）、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍保有マウスの腫瘍増殖を有意に遅延させることが観察された（図９および図１０）。達成されたこの腫瘍増殖阻害の程度は、ポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバントを投与された６つのペプチドの高用量プールからなる陽性対照で観察されたものと同等であった（図示されていない）。ポリ（Ｉ：Ｃ）を投与されたそれぞれ５０〜１００μｇの６つのペプチドと比較して、３０および１００μｇのＡｕｔｏＳｙｎＶａｘワクチン群に、それぞれ１８個のペプチドが７２および２４０ｎｇしか存在しなかったことから、この観察によって、Ｈｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）が、その後のプロセシングおよびネオエピトープ特異的Ｔ細胞への提示のために、抗原提示細胞にペプチドを送達するかなりの効率が実証された。
１８個のペプチドのうち５つ、すなわちＭ２２、Ｍ２７、Ｍ４４、Ｍ４８およびＭ５０を含有するＡＳＶ組成物を合成し、上記のような同様の研究においてＢ１６．Ｆ１０黒色腫で試験した。ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントと組み合わせて投与した場合、１８ペプチドＡＳＶ組成物と同様に、５ペプチドＡＳＶ組成物（３０または１００μｇ）は、ＰＢＳまたはＨｓｃ７０およびＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（ペプチドを含まない）の混合物で処置したマウスと比較した場合、Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍保有マウスの腫瘍増殖を遅らせた（図１１および１２）。
腫瘍を保有していないマウスにおける免疫原性評価のために、Ｈｓｃ７０−Ｍ２７／Ｍ３０ Ｂ１６．Ｆ１０ペプチド複合体＋ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）ワクチン群の３匹のマウスを、２回目の免疫化の１週間後に屠殺して、ペプチドに対するＴ細胞応答を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて検出することができるか否かを評価した。３匹中２匹のマウスで有意な反応が検出された（図１３）。陽性対照ワクチン（ポリ（Ｉ：Ｃ）アジュバント中のＭ２７／Ｍ３０ペプチド）に対する応答はまた、３匹中２匹のマウスでも観察されたが、一方でペプチドを含まないＨｓｃ７０／ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）の混合物で免疫したマウスでは応答が観察されなかった（図示されていない）。
実施例１３：サイズ排除クロマトグラフィーによるＨｓｃ７０−ペプチド複合体形成の検討
Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体形成は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した。Ｈｓｃ７０は、サイズ排除カラム上の２つの主要なピークにおいて分解したが、一方のピークはそのモノマー形態に対応し、他方のピークはオリゴマー形態に対応した（図１４）。Ｈｓｃ７０は、結合ペプチド（ＺｈｕｒａｖｌｅｖａおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、１１２［２２］：Ｅ２８６５〜７３［２０１５］）にコンフォメーション変化を受け、それによって、ペプチド結合形態に対応するＳＥＣクロマトグラムに新しいピークが出現した（図１５）。クロマトグラム上のＨｓｃ７０の形態に対応する各ピークの表面積を測定することにより、ペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０のパーセンテージを決定してもよい。Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体形成における、Ｈｓｃ７０とペプチドのモル比の効果は、１：４，１：１０，１：２０および１：５０のＨｓｃ７０／ペプチドモル比で、Ｈｓｃ７０および試験ペプチドを組み合わせ、次いで得られた混合物をＳＥＣで分離して複合体形成の程度を決定することによって決定した。これらの実験で使用されたペプチドは、Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、５２０（７５４９）：６９２〜６（２０１５）に記載されているように、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫特異的突然変異を含む免疫原性ペプチドＢ１６−Ｍ２７（「Ｍ２７」）であった（実施例９〜１１にも記載されている）。マウスにおいて高度に免疫原性であるアミノ酸配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４４８）を有するニワトリオボアルブミンペプチドに高親和性Ｈｓｃ７０結合ペプチド配列を付加する複合体形成に対する影響（Ｚｅｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５８：２１１〜２１４［２００９年３月１２日］）も試験した。高親和性Ｈｓｃ７０結合配列、ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）を、オボアルブミンペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加し、配列ＦＦＲＫ（配列番号４４７）を有するリンカーによりオボアルブミンペプチドに連結した（米国特許第７，３０９，４９１号に開示されているとおり）。
材料および方法：
標準サイズ排除クロマトグラフィーは、最終容量５０μｌ中２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭのＫＣＬを含む反応緩衝液中の７μＭの組換えヒトＨｓｃ７０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１１１４２．１）（Ｂｉｏｍａｙ ＡＧ）を用いて行った。反応物を、３７℃で１または２時間インキュベートし、１３０００ＲＰＭで２分間遠心分離した。反応生成物（１０μｇ）を、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４μｍ粒子サイズ、２５ｎｍ孔径ゲル濾過クロマトグラフィーカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分離した。ペプチドを含む反応では、ペプチドを、Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比が１：４、１：１０、１：２０、および１：５０で反応混合物に含めた。適切なピークの表面積を測定することによって、各反応混合物中のペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０のパーセンテージを計算した。
結果：
Ｍ２７ペプチドと複合体形成したＨｓｃ７０のパーセンテージは、図１６に示すように、Ｍ２７ペプチドとＨｓｃ７０のモル比の増大と共に増大した。Ｈｓｃ７０：ペプチドモル比が１：４では、Ｈｓｃ７０の２０％のみが、Ｍ２７ペプチドに結合したが、１：１０の比では、Ｈｓｃ７０の約４０％が複合体形成した。１：２０（約５０％）および１：５０（約６５％）のＨｓｃ７０：ペプチドモル比では、複合体形成されたＨｓｃ７０の割合は次第にさらに増大した（図１７）。インキュベーション時間を２時間〜３時間に増大させたとき、複合体形成の程度のわずかな増加しか観察されなかった（図１８）。
Ｈｓｃ７０と、リンカーＦＦＲＫ（配列番号４４７）を介してそのＣ末端に融合された高親和性Ｈｓｃ７０結合ペプチド配列ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）を有するオボアルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４４８）との間で、複合体形成を分析した場合、Ｈｓｃ７０の９０％以上がペプチドに複合体形成されていた（図１９；Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比が１：１０で試験；完全長ペプチド配列は、ＳＩＩＮＦＥＫＬＦＦＲＫＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４４９）であった）。両方の場合において、ＦＦＲＫ（配列番号４４７）リンカーを介して連結された、オボアルブミンペプチドのＮ末端およびＣ末端に高親和性Ｈｓｃ７０結合配列を配置する比較効果も試験した。複合体形成の程度は、Ｎ末端に比べてＣ末端に位置するＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）で有意に大きかった（図２０、Ｈｓｃ７０：ペプチドのモル比１：２を有する反応混合物のクロマトグラムを示す；１：５の比率で同じ結果が観察された）。Ｃ末端高親和性Ｈｓｃ７０結合配列を有する試験ペプチドの配列は、ＳＩＩＮＦＥＫＬＦＦＲＫＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４４９）であり、Ｎ末端高親和性Ｈｓｃ７０結合配列を有する試験ペプチドの配列は、ＮＬＬＲＬＴＧＦＦＲＫＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４５０）であった。
実施例１４：高親和性Ｈｓｃ７０結合ペプチド配列を含有するＡＳＶ組成物
この実施例では、高親和性Ｈｓｃ７０結合配列に連結された抗原ペプチドを含むＡＳＶ組成物が生成された。
材料および方法
ｉ．Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍ネオエピトープおよび高親和性Ｈｓｃ７０結合ペプチドによるそれらの改変：
以下の４つのペプチドを、Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞株の腫瘍ネオエピトープを代表する、９５％の純度（Ｂｏｓｔｏｎ Ｏｐｅｎ Ｌａｂｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に合成し、選択的にリンカー配列ＦＦＲＫ（配列番号４４７）および高親和性Ｈｓｃ７０結合ペプチドＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）
Ｍ２７：ＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＤ（配列番号４５８）
Ｍ３０：ＰＳＫＰＳＦＱＥＦＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱＰＦＬ（配列番号４６１）
Ｍ２７−Ｊａｖ：ＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＤＦＦＲＫＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４６９）
Ｍ３０−Ｊａｖ：ＰＳＫＰＳＦＱＥＦＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱＰＦＬＦＦＲＫＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４７０）を加えてＣ末端を改変した。
ｉｉ．Ｈｓｃ７０−Ｍ２７／Ｍ３０ペプチド複合体の生成：
上に列挙したペプチドを、ＰＢＳ中のＨｓｃ７０と共に３７℃で１時間個別にインキュベートして、非共有結合Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体を形成させた。Ｍ２７およびＭ３０については、ペプチドを２０：１モル過剰（ペプチド：Ｈｓｃ７０）でＨｓｃ７０に添加し、一方で、Ｍ２７−ＪａｖおよびＭ３０−Ｊａｖについては、ペプチドを４：１モル過剰で添加した。インキュベーション後、混合物を、ＰＢＳ中で、４℃で１０倍に希釈し、３０ｋＤａのＭＷのカットオフのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離フィルターを用いて濃縮し、Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体を遊離の非複合体ペプチドから分離した。保持された複合体Ｈｓｃ７０−Ｍ２７およびＨｓｃ７０−Ｍ３０をプールして、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析して、ペプチドを負荷したＨｓｃ７０分子の割合を定量した。Ｈｓｃ７０分子の四十三（４３）％が、Ｍ２７／Ｍ３０ペプチドを負荷されていることが観察された。Ｈｓｃ７０−Ｍ２７−ＪａｖおよびＨｓｃ７０−Ｍ３０−Ｊａｖ複合体について、同じプール、濾過およびＳＥＣ分析工程を行い、Ｈｓｃ７０分子の７３％にペプチドが負荷されているという観察結果を得た。
ｉｉｉ．ワクチン投与および免疫原性評価：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝１０／群）に、５×１０４個のＢ１６．Ｆ１０腫瘍細胞を剃毛した脇腹に皮下接種し、腫瘍チャレンジ後３、９および１５日目に以下のワクチン材料で処置した：
第１群：５μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）＋５μｇのＭＰＬ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）アジュバントと混合した１００μｇのＭ２７＋１００μｇのＭ３０
第２群：Ｍ２７−Ｊａｖ／Ｍ３０−Ｊａｖと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０
第３群：５μｇのＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）＋５μｇのＭＰＬアジュバントと混合したＭ２７−Ｊａｖ／Ｍ３０−Ｊａｖと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０
第４群：Ｍ２７／Ｍ３０と複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０
第５群：２．６μｇのＭ２７−Ｊａｖ／Ｍ３０−Ｊａｖ（各ペプチド１．３μｇ）
腫瘍チャレンジ後２２日目に、上記の５つの群のそれぞれから３匹のマウスを安楽死させ、脾細胞をワクチン免疫原性評価のために採取した。ナイーブなＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞も、免疫原性試験における陰性対照群として採取した。
免疫原性試験のために、ＲＢＣ溶解後の脾細胞から単核細胞を調製し、５μｇ／ｍｌの以下のペプチドの各々の存在下、９６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種した。
Ｍ２７：ＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＭＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＤ（配列番号４５８）
Ｍ３０：ＰＳＫＰＳＦＱＥＦＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱＰＦＬ（配列番号４６１）
野生型Ｍ２７：ＲＥＧＶＥＬＣＰＧＮＫＹＥＴＲＲＨＧＴＴＨＳＬＶＩＨＤ（配列番号４７１）
野生型Ｍ３０：ＰＳＫＰＳＦＱＥＦＶＤＷＥＫＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱＰＦＬ（配列番号４７２）
陽性対照として、１０μｇ／ｍＬの最終濃度のコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）で脾細胞を刺激した。培養物を４１時間インキュベートし、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ２．０、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いてＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を計数した。
結果
図２１に示すように、Ｍ２７−Ｊａｖ／Ｍ３０−Ｊａｖと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０（第２群）で免疫化したマウスから単離した脾細胞は、突然変異体Ｍ２７およびＭ３０ペプチドの混合物への曝露の際に、１４位置に野性型残基を含む同じペプチドに対する曝露と比較して、有意に多いＩＦＮ−γを分泌した（二元ＡＮＯＶＡによりｐ値＜０．０５）。このＨｓｃ７０−ペプチド複合体に対するＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）およびＭＰＬアジュバントの添加（第３群）は、応答の増強をもたらさなかった（図示されていない）。ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）／ＭＰＬアジュバントにおける高用量のＭ２７およびＭ３０突然変異体ペプチド（第１群）による免疫は、有意なＩＦＮ−γ産生を誘発した（図示されていない）。
Ｍ２７−Ｊａｖ／Ｍ３０−Ｊａｖと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０（第２群）を用いて免疫化し、突然変異体Ｍ２７およびＭ３０ペプチドで刺激したマウスの脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌は、高親和性ＨＳＰ７０結合配列を含まないＭ２７／Ｍ３０ペプチドと複合体形成した３０μｇのＨｓｃ７０（第４群）で免疫したマウスの脾細胞の応答よりも有意に大きかった（二元ＡＮＯＶＡによりｐ値＜０．０５）。これらのデータによって、Ｈｓｃ７０と、高親和性Ｈｓｃ７０結合ドメインを含有する腫瘍ネオエピトープとの複合体の増強された免疫原性が、Ｈｓｃ７０と、このような高親和性Ｈｓｃ７０結合ドメインを欠く腫瘍性ネオエピトープとの複合体と比較して、実証された。
Ｈｓｃ７０の非存在下で、Ｍ２７−ＪａｖおよびＭ３０−Ｊａｖペプチド（第５群）で免疫化したマウスでは、観察されたＩＦＮ−γの分泌は最小限であった。同様に、Ｍ２７／Ｍ３０突然変異体または野生型ペプチドに曝露されたナイーブな（非免疫）マウスの脾細胞からはＩＦＮ−γ分泌は観察されなかった。
Ｈｓｃ７０と、高親和性Ｈｓｃ７０結合ドメインを含有しないＭ２７／Ｍ３０ペプチドとの間の複合体は、初期の実験では抗原特異的免疫応答を誘発した（図１３）が、この研究においては誘発しなかった（図２１）ことは注目に値する。理論に縛られるものではないが、その相違は、以前の研究ではＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）アジュバントが存在したが、現在の研究では存在しなかったことによって説明され得る。
実施例１５：ホスホペプチドエピトープを含むＡＳＶ組成物
リン酸化セリン残基を含む４つのペプチド（表９）を、９５％純度（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に合成した。ペプチドは、リンカー配列ＦＦＲＫ（配列番号４４７）および高親和性ＨＳＰ結合ペプチド配列ＮＬＬＲＬＴＧ（配列番号４３９）を付加したＣ末端またはＮ末端のいずれかで改変されたＣＤＣ２５またはＩＲＳ−２抗原のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合エピトープを含んでいた。これらのペプチドを、４：１モル過剰（ペプチド：Ｈｓｃ７０）で、３７℃で１時間、ＰＢＳ中のＨｓｃ７０と個別にインキュベートして、非共有Ｈｓｃ７０−ペプチド複合体を形成した。インキュベーション後、その複合体をＳＥＣで分析し、ペプチドを負荷したＨｓｃ７０分子の割合を定量した。その結果を表９に示す。
Figure 2018515519
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内におさまることが意図される。
本明細書中に引用される全ての参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）は、あたかもそれぞれの個々の参考文献（例えば、刊行物または特許または特許出願）が、全ての目的のために参照によってその全体を組み入れるかのように、具体的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、全ての目的のために参照によってその全体を本明細書に組み入れる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (147)

  1. 抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第１の組成物であって、該複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、該異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つががん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含み、該組成物が野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する５以下の異なる抗原ペプチドを含む、前記組成物。
  2. 野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有するいかなる抗原ペプチドも含まない、請求項１に記載の組成物。
  3. １００以下の異なる抗原ペプチドを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、５００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ分子に結合する、請求項１に記載の組成物。
  5. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、５００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ Ｉ分子に結合する、請求項１に記載の組成物。
  6. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、１０００ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０でＭＨＣ ＩＩ分子に結合する、請求項１に記載の組成物。
  7. ＭＨＣ分子はヒトＭＨＣ分子である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、がん細胞由来の１よりも多い突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、５００ｎＭ未満のＩＣ５０で１よりも多い異なるＭＨＣ分子に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは対象のがん細胞において発現されるが、該対象の正常細胞においては発現されない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは単一対象のがん細胞において発現されるが、該対象の正常細胞においては発現されない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、対象のがん細胞において、該対象の正常細胞と比べて高いレベルで発現される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、アミノ酸突然変異または遺伝子融合突然変異を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. アミノ酸突然変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である、請求項１３に記載の組成物。
  15. アミノ酸突然変異は０．０５より大きな対立遺伝子頻度で対象の腫瘍に存在する、請求項１３に記載の組成物。
  16. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは改変アミノ酸を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 改変アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 改変アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓアミノ酸の模倣物である、請求項１６に記載の組成物。
  19. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、同じ徴候の複数のがんにわたり１ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ：マップされたリード１００万本あたりの転写物１キロベースあたりのリード数）よりも大きな発現レベル中央値を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、同じ徴候の複数のがんにわたり５ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ：マップされたリード１００万本あたりの転写物１キロベースあたりのリード数）よりも大きな発現レベル中央値を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの少なくとも１つは、対象腫瘍において１０ＮＭＲＣ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅａｄ Ｃｏｕｎｔｓ：正規化突然変異含有リードカウント）よりも大きな発現レベルを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープのそれぞれ１つは、対象腫瘍において５０ＮＭＲＣよりも大きな発現レベルを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、該抗原ペプチドが投与される対象において１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを発現している腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を刺激する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、該抗原ペプチドが投与される対象において１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを発現している腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を刺激する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、タンパク質の全アミノ酸配列を含まない、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、５から５０アミノ酸長である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２５から４０アミノ酸長である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２７から３１アミノ酸長である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、２１から３１アミノ酸長である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、アミノ酸配列の中央付近に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 抗原ペプチドの少なくとも１つは２７アミノ酸長であり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項３２に記載の組成物。
  34. 抗原ペプチドの少なくとも１つは２９アミノ酸長であり、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項３２に記載の組成物。
  35. 抗原ペプチドの少なくとも１つは３１アミノ酸長であり、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項３２に記載の組成物。
  36. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、化学合成ペプチドである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 抗原ペプチドのそれぞれ１つは、熱ショックタンパク質結合配列をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
  38. 熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドのＮまたはＣ終端にある、請求項３７に記載の組成物。
  39. 熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドのＣ終端にある、請求項３８に記載の組成物。
  40. 熱ショックタンパク質結合配列は、ペプチドリンカーを介して抗原ペプチドの残部に連結している、請求項３８に記載の組成物。
  41. ペプチドリンカーは、配列番号４４７のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 熱ショックタンパク質結合配列は、配列番号４３９〜４４６からなる群から選択される、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 熱ショックタンパク質結合配列は、配列番号４３９である、請求項４２に記載の組成物。
  44. 熱ショックタンパク質結合配列は、抗原ペプチドのＣ終端にある、請求項４３に記載の組成物。
  45. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、Ｃ終端に配列番号４７７のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の組成物。
  46. 抗原ペプチドの少なくとも１つは：
    ｉ）腫瘍特異的突然変異を含む第１の部分、ならびに
    ｉｉ）熱ショックタンパク質結合配列、および場合によりペプチドリンカーを含む第２の部分
    を含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
  47. 第１の部分は２７〜３１アミノ酸長である、請求項４６に記載の組成物。
  48. 第１の部分は２７アミノ酸長である、請求項４６に記載の組成物。
  49. 第１の部分は２９アミノ酸長である、請求項４６に記載の組成物。
  50. 第１の部分は３１アミノ酸長である、請求項４６に記載の組成物。
  51. 第１の部分は、該第１の部分のアミノ酸配列の中央付近に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項４７に記載の組成物。
  52. 第１の部分は２７アミノ酸長であり、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項５１に記載の組成物。
  53. 第１の部分は２９アミノ酸長であり、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項５１に記載の組成物。
  54. 第１の部分は３１アミノ酸長であり、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９位に腫瘍特異的突然変異を有する、請求項５１に記載の組成物。
  55. 第２の部分は、配列番号４３９〜４４６、４４７、４７７、および４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載の組成物。
  56. 抗原ペプチドの少なくとも１つは３８アミノ酸長である、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  57. 抗原ペプチドの少なくとも１つは４０アミノ酸長である、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 抗原ペプチドの少なくとも１つは４２アミノ酸長である、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 組成物は、少なくとも１０の異なる抗原ペプチドを含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
  60. それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、少なくとも１対１である、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
  61. それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、１対１またはそれ未満である、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
  62. それぞれの複合体におけるストレスタンパク質と抗原ペプチドのモル比は、１対２、１対４、１対５、１対１０、１対２０、１対５０またはそれ未満である、請求項６１に記載の組成物。
  63. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、またはＡＰＣの１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
  64. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、配列番号１〜４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
  65. ストレスタンパク質は組換えストレスタンパク質である、請求項１〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
  66. ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびその２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. ストレスタンパク質はｈｓｃ７０である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
  68. ストレスタンパク質はヒトｈｓｃ７０である、請求項６７に記載の組成物。
  69. ストレスタンパク質はｈｓｐ７０である、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の組成物。
  70. ストレスタンパク質はヒトｈｓｐ７０である、請求項６９に記載の組成物。
  71. ストレスタンパク質は抗原ペプチドに非共有結合している、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
  72. ストレスタンパク質は抗原ペプチドに共有結合している、請求項１〜７０に記載の組成物。
  73. 組成物中のストレスタンパク質の量は１０μｇから６００μｇである、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
  74. 組成物中のストレスタンパク質の量は２５μｇである、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の組成物。
  75. 複合体のそれぞれ１つは、対象に投与された場合、該対象の細胞表面でのＭＨＣ分子による１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープの提示を達成することができる、請求項１〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
  76. アジュバンドをさらに含む、請求項１〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
  77. アジュバンドはサポニンまたは免疫賦活性核酸を含む、請求項４９に記載の組成物。
  78. アジュバンドはＱＳ−２１を含む、請求項４９に記載の組成物。
  79. 組成物中のＱＳ−２１の量は１０μｇ、２５μｇ、または５０μｇである、請求項５１に記載の組成物。
  80. がん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む抗原ペプチドを製造する方法であって：
    （ａ）対象のがん細胞由来のゲノムＤＮＡの１つまたはそれ以上のエキソームの配列を決定する工程；
    （ｂ）基準ゲノムＤＮＡと比べた場合、突然変異タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の非同義突然変異対立遺伝子を該エキソームから同定する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で同定された該突然変異対立遺伝子が該対象のがん細胞で発現されているかどうかを判定する工程；
    （ｄ）工程（ｂ）で同定された該突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度を決定する工程；
    （ｅ）該対象の１つまたはそれ以上のＭＨＣタイプを決定する工程；
    （ｆ）工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子によりコードされる突然変異ペプチドを選択する工程であって、
    該突然変異対立遺伝子が０．０５よりも大きな対立遺伝子頻度を有し、該対象のがん細胞で発現され、
    該突然変異ペプチドが、該対象に投与された場合、該対象のＭＨＣ分子の少なくとも１つにより提示することができると予想される、工程、および
    （ｇ）工程（ｆ）で選択された該ペプチドのうちの１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ以上のペプチドを合成し、それによってがん細胞由来の１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む抗原ペプチドを製造する工程
    を含む前記方法。
  81. 工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子を含有するｍＲＮＡの発現レベルを決定する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が対象のがん細胞において１０ＮＭＲＣよりも大きな発現レベルを有することをさらに必要とする、請求項８１に記載の方法。
  83. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が他の個体の同じ徴候のがん細胞において１ＲＰＫＭよりも大きな発現レベル中央値を有することをさらに必要とする、請求項８１に記載の方法。
  84. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドをコードする突然変異対立遺伝子が対象の正常細胞で発現されないことをさらに必要とする、請求項８１に記載の方法。
  85. 対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対する１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドの結合親和性を決定する工程をさらに含む、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対する１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドの結合親和性はコンピュータモデリングにより予測される、請求項８５に記載の方法。
  87. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異対立遺伝子によりコードされる１つまたはそれ以上の突然変異ペプチドが対象のＭＨＣ分子の１つまたはそれ以上に対して５００ｎ
    Ｍ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする、請求項８０〜８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが対象のＭＨＣクラスＩ分子の１つまたはそれ以上に対して５００ｎＭ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが対象のＭＨＣクラスＩＩ分子の１つまたはそれ以上に対して１０００ｎＭ未満のＩＣ５０を有することをさらに必要とする、請求項８０〜８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが特定のタイプのがんに特徴的である突然変異対立遺伝子によりコードされていることをさらに必要とする、請求項８０〜８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 工程（ｆ）でのペプチドの選択は、突然変異ペプチドが遺伝子融合突然変異、またはアミノ酸挿入、欠失、もしくは置換突然変異を含有することをさらに必要とする、請求項８０〜９０のいずれか１項に記載の方法。
  92. 工程（ｆ）で選択される突然変異ペプチドを
    （ｉ）突然変異ペプチドに存在する予測されるＭＨＣ結合エピトープの数、ここで、突然変異ペプチドで予測されるＭＨＣ結合エピトープの数が多くなるに従って、順位は高くなる；
    （ｉｉ）対象のＭＨＣに結合することに対する突然変異ペプチドのＩＣ５０、ここで、ＩＣ５０が低くなるに従って、順位は高くなる；
    （ｉｉｉ）対象の正常細胞中の突然変異ペプチドの野生型等価物の発現の有無、ここで、突然変異ペプチドの野生型等価物が対象の正常細胞では発現されていない場合、突然変異ペプチドの順位は高くなる；
    （ｉｖ）対象のＭＨＣへの突然変異ペプチドのＣ終端の結合の安定性、ここで、安定性が高くなるに従って、順位は高くなる；および／または
    （ｖ）突然変異ペプチドのプロテアソーム分解の予測される動態、ここで、突然変異ペプチドがプロテアソームに対する基質として良好であると予測されるに従って、順位は高くなる、
    に基づいて順位付けする工程をさらに含む、請求項８０〜９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 最高順位ペプチドの２０以下が工程（ｇ）で合成される、請求項９２に記載の方法。
  94. ゲノムＤＮＡは対象由来の腫瘍試料または体液から単離される、請求項８０〜９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. ゲノムＤＮＡは対象から得られるエキソソーム（exosomes）、または循環している腫瘍細胞から単離される、請求項８０〜９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. ゲノムＤＮＡは対象から得られる循環している腫瘍細胞ＤＮＡである、請求項８０〜９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. エキソームの配列は次世代シーケンシングにより決定される、請求項８０〜９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 基準ゲノムＤＮＡは対象の正常細胞由来のゲノムＤＮＡであり、突然変異対立遺伝子の対立遺伝子頻度は次世代シーケンシングリード再マッピングにより工程（ｄ）で決定される、請求項８０〜９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 非同義突然変異対立遺伝子の発現は、対象のがん細胞から単離されるｍＲＮＡの次世代シーケンシングにより工程（ｃ）で決定される、請求項８０〜９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 工程（ｂ）で同定された突然変異対立遺伝子は、対象でまたは少なくとも１０００ゲノムで見出される一塩基多型（ＳＮＰ）ではない、請求項８０〜９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 合成ペプチドは５から５０アミノ酸長である、請求項８０〜１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 合成ペプチドは２５から４０アミノ酸長である、請求項８０〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 合成ペプチドは２７から３１アミノ酸長である、請求項８０〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. がん細胞は多発性骨髄腫または多形神経膠芽腫細胞である、請求項８０〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 抗原ペプチドの１つまたはそれ以上は、請求項８０〜１０４のいずれか１項に記載の方法を使用して製造された、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
  106. 抗原ペプチドのすべては、請求項８０〜１０４のいずれか１項に記載の方法を使用して製造された、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
  107. がんを有する対象において抗原ペプチドへの細胞性免疫応答を誘導するための方法であって、請求項１〜７９、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の組成物の有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
  108. がんを有する対象を処置する方法であって、請求項１〜７９、１０５、または１０６のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
  109. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープの１つまたはそれ以上は対象自身のがん細胞に存在していると確認された、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. 突然変異ＭＨＣ結合エピトープのすべては対象自身のがん細胞に存在していると確認された、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  111. 腫瘍細胞から少なくとも約６５％純度まで精製されたストレスタンパク質の少なくとも１５０μｇの単離を可能にするために対象から入手可能である腫瘍細胞の量では不十分である、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  112. ストレスタンパク質は、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、その突然変異体、およびその２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
  113. ストレスタンパク質はｈｓｃ７０である、請求項１１２に記載の方法。
  114. ストレスタンパク質はヒトｈｓｃ７０である、請求項１１３に記載の方法。
  115. ストレスタンパク質はｈｓｐ７０である、請求項１１２に記載の方法。
  116. ストレスタンパク質はヒトｈｓｐ７０である、請求項１１５に記載の方法。
  117. 対象は湿重量が６ｇまたはそれ未満である腫瘍を有する、請求項１０７〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する組成物の能力は、該対象への組成物の投与に先立って判定される、請求項１０７〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
  119. 対象から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）においてＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を誘導する組成物の能力は、該対象への組成物の投与後に判定される、請求項１０７〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 組成物は、１０μｇから６００μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される、請求項１０７〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 組成物は、２５μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される、請求項１０７〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 組成物は、２４０μｇのストレスタンパク質を含む単位用量で対象に投与される、請求項１０７〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
  123. 組成物は４週間の間、毎週１回対象に投与される、請求項１０７〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. ４回の毎週投与の後、組成物の少なくとも２回のさらなる用量が対象に隔週で投与される、請求項１０７〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 合計で組成物の少なくとも６用量が投与される、請求項１２３または１２４に記載の方法。
  126. 組成物は、最終の週１回または隔週投与の３ヶ月後にブースターとしてさらに投与される、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 組成物は少なくとも１年間３ヶ月毎にさらに投与される、請求項１２６に記載の方法。
  128. レナリドミド、デキサメタゾン、シクロホスファミド、インターロイキン−２、コビメチニブ、ダブラフェニブ、ダカルバジン、タリモジーンラハーパレプベック、組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェレオン（peginterfereon）アルファ−２ｂ、トラメチニブ、またはベムラフェニブを対象に投与することをさらに含む、請求項１０７〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１０７〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤は４−アミノ−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ’−ヒドロキシ−１，２，５−オキサジアゾール−３−カルボキシイミドアミドを含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. チェックポイント抗体を対象に投与することをさらに含む、請求項１０７〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. チェックポイント抗体は、抗ＧＩＴＲ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＩＭ−３、および抗ＬＡＧ−３からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
  133. 抗原ペプチドに結合した精製ストレスタンパク質の少なくとも２つの異なる複合体を含む第２の組成物であって、該複合体それぞれが異なる抗原ペプチドを含み、該異なる抗原ペプチドのそれぞれ１つが対象のがんと同じタイプのがんに頻繁に見出される１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む、前記組成物を該対象に投与することをさらに含む、請求項１０７〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 第２の組成物は少なくとも５つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 第２の組成物中のストレスタンパク質は組換えストレスタンパク質である、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. 第２の組成物中の抗原ペプチドのそれぞれ１つは化学合成ペプチドである、請求項１３３〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 第２の組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有する５以下の異なる抗原ペプチドを含む、請求項１３３〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
  138. 第２の組成物は、野生型ＭＨＣ結合エピトープのみを含有するいかなる抗原ペプチドも含まない、請求項１３３〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
  139. 第２の組成物は１００以下の異なる抗原ペプチドを含む、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. 第１の組成物は第２の組成物と同時に投与される、請求項１３３〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. 第１の組成物は第２の組成物と逐次投与される、請求項１３３〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
  142. 第２の組成物は第１の組成物の投与に先立って投与される、請求項１３３〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
  143. 抗原ペプチドの少なくとも１つは、ＭＹＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＤＭ６Ａ、ＮＰＭ１、Ｈ−ＲＡＳ、ＦＧＦＲ３、ＭＳＨ６、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＢＬ１、ＣＴＮＮＢ１、ＫＩＴ、ＨＮＦ１Ａ、ＪＡＫ２、ＢＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、またはＡＰＣの１つまたはそれ以上の突然変異ＭＨＣ結合エピトープを含む、請求項１０７〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. がんは多発性骨髄腫、多形神経膠芽腫、またはメラノーマである、請求項１０７〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. ＭＨＣ結合エピトープはヒトＭＨＣ結合エピトープである、請求項１〜１４４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  146. ＭＨＣ分子はヒトＭＨＣ分子である、請求項４〜１４４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
  147. 対象はヒト対象である、請求項１０〜１４４のいずれか１項に記載の方法または組成物。
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