ES2257068T3 - Mezclas de adyuvantes de cpg y saponinas y metodos de empleo de las mismas. - Google Patents
Mezclas de adyuvantes de cpg y saponinas y metodos de empleo de las mismas.Info
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Abstract
Una mezcla de vacuna que incluye a) Un antígeno; b) Una saponina que posee actividad adyuvante inmune; y c) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
Description
Mezclas de adyuvantes de CpG y saponinas y
métodos de empleo de las mismas.
La presente invención está en el campo de los
adyuvantes inmunes y de las vacunas. Las mezclas de la invención
estimulan la inmunidad, fortalece la inmunidad generada por células
y fortalece la producción de anticuerpos.
Las saponinas adyuvantes han sido identificadas y
purificadas a partir de un extracto acuoso de la corteza del árbol
suramericano Quillaja saponaria Molina. De entre los 22
picos de saponina que fueron separables, las saponinas purificadas
más predominantes han sido identificadas como QS-7,
QS-17, QS-18 y
QS-21, también conocidas como QA-7,
QA-17, QA-18 y
QA-21, respectivamente. Estas saponinas han sido
sustancialmente purificadas por varios métodos incluyendo
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de
sílice líquida de baja presión y cromatografía hidrofílica
interactiva (HILIC). Se ha hallado que las saponinas sustancialmente
puras son útiles como adyuvantes inmunes para incrementar las
respuestas inmunes en los individuos (Kensil, et al.,
Patente U.S. No. 5,057,540; Kensil, et al., J. Immunol.
148:2357 (1991); Marciani, et al. Vaccine 9:89 (1991).)
Se ha demostrado recientemente que los
oligonucleótidos que contienen el dinucleótido no metilado
citosina-guanina ("CpG") en un contexto de
secuencia ó patrón particular, son potentes estimulantes in vitro
de varios tipos de células inmunes (Weiner, ., Proc. Natl. Acad.
Sci. 94:10833 (1997).)
Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye un patrón CpG no metilado es un dinucleótido- dentro del
oligonucleótido que desencandena consistentemente una respuesta
inmunoestimulatoria y libera citoquinas. Los patrones CpG pueden
estimular monocitos, macrófagos y células dendríticas que pueden
producir varias citoquinas incluyendo el ayudador T 1 (Th 1)
citoquina-interleuquina (IL) 12 (Carson, et
al., J. Exp. Med. 186:1621 (1997).). Este efecto causa la
inducción de secreción IFN-\gamma por células
asesinas naturales, las cuales a su vez activan macrófagos y
fortalecen el cambio del isotipo inmunoglobulina a IgG2a, que es un
rasgo de la diferenciación e inmunidad celular del ayudador T.
(Chu, et al., J. Exp. Med. 186:1623 (1997).) Klinman, et
al. Han demostrado que un patrón de ADN que consiste en un
dinucleótido no metilado CpG flanqueado por dos purinas 5' (GpA ó
ApA) y dos pirimidinas 3' (TpC ó TpT) estimularon de modo óptimo
las células B para que produjeran IL-6 e IL 12 y
estimularon células CD4+T para producir IL-6 e
IFN-\gamma tanto in vivo como in vitro
(Klinman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:2879 (1996).).
Davis et al., cuyo contenido se incorpora aquí como
referencia, descubrieron que los ácidos nucleicos que contienen por
lo menos un dinucleótido no metilado CpG puede afectar la respuesta
inmune de un sujeto (Davis, et al., WO 98/40100,
PCT/US98/04703).
WO-A-99 61056
divulga métodos y mezclas para inducir una respuesta inmune mucosa
empleando oligonucleótidos inmunoestimulatorios que contienen
dinucleótidos CpG. En algunas modalidades,
WO-A-99 61056 establece que, en
adición a los oligonucleótidos inmunoestimulatorios que contienen
dinucleótidos CpG, puede administrarse un adyuvante no mucosa, para
inducir la respuesta inmune.
Puesto que la inmunidad juega un papel importante
en la respuesta protectora a la infección con ciertos agentes
microbianos, existe la necesidad de caracterizar otros nuevos
adyuvantes que pueden inducir de modo seguro la inmunidad. Tales
adyuvantes pueden potencialmente ser incorporados en futuras
vacunas humanas. Sorprendentemente, se halló que una combinación de
un oligonucleótido que contiene por lo menos un dinucleótido no
metilado CpG y un adyuvante de saponina era un poderoso estimulante
de la inmunidad generada por células, comparada con el adyuvante
solo. Los títulos de anticuerpo (antígeno específico) en respuesta
a la vacunación, fueron significativamente más altos para vacunas
que incluyen combinaciones adyuvante de saponina/oligonucleótido
que contiene CpG, comparados tanto con la saponina como con el CpG
solos, y representaron un efecto adyuvante sinergístico positivo.
Juntos, estos resultados establecen que una mezcla adyuvante inmune
que incluye un oligonucleótido inmunoestimulatorio, el cual incluye
por lo menos un dinucleótido no metilado CpG y un adyuvante de
saponina, es una mezcla adyuvante candidata para que las vacunas
induzcan la inmunidad. De acuerdo con ello, la presente invención
suministra mezclas novedosas de vacuna que incluyen un
oligonucleótido inmunoestimulatorio, un adyuvante de saponina y un
antígeno. Otras modalidades que se describen acá son métodos para
incrementar la respuesta inmune a un antígeno, mediante la
administración de mezclas de vacunas de la invención y/o mezclas
adyuvantes inmunes.
La figura 1 representa una gráfica que muestra el
aumento de una respuesta inmune generada por células, por QS 21 y
por mezcla de oligonucleótido CpG/QS 21, como se evidenció por la
inducción CTL.
La figura 2 suministra una gráfica que muestra el
aumento de una respuesta inmune generada por células, por QS 21 y
por mezcla de oligonucleótido CpG/QS 21, como se evidenció por la
inducción CTL.
La Figura 3 muestra una gráfica de barras de la
producción incrementada de anticuerpos, particularmente las
subclases de anticuerpos tales como IgG2a que son influenciados por
las citoquinas Th 1.
La Figura 4 muestra una gráfica de barras del
título de IgG1 específico para polisacáridos del neumococo Tipo 14
con las diferentes formulaciones y para las combinaciones de QS21 y
el oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 21 días
después de haber dado una primera inmunización el día 0.
La Figura 5 ilustra una gráfica de barras de los
títulos de IgG2a específico para polisacáridos del neumococo Tipo
14 con las diferentes formulaciones y/o combinaciones de QS21 y el
oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 21 días después
de haber dado una primera inmunización el día 0.
La Figura 6 suministra una gráfica de barras de
los títulos de IgG3 específico para polisacáridos del neumococo
Tipo 14 con las diferentes formulaciones y/o combinaciones de QS21
y el oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 21 días
después de haber dado una primera inmunización el día 0.
La Figura 7 representa una gráfica de barras de
los títulos de IgG1 específico para polisacáridos del neumococo
Tipo 14 con las diferentes formulaciones y/o combinaciones de QS21
y el oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 14 días
después de una segunda inmunización suministrada 28 días después de
la primera inmunización.
La Figura 8 suministra una gráfica de barras de
los títulos de IgG2a específico para polisacáridos del neumococo
Tipo 14 con las diferentes formulaciones y/o combinaciones de QS21
y el oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 14 días
después de una segunda inmunización suministrada 28 días después de
la primera inmunización.
La Figura 9 muestra una gráfica de barras de los
títulos de IgG3 específico para polisacáridos del neumococo Tipo 14
con las diferentes formulaciones y/o combinaciones de QS21 y el
oligonucleótido CpG en suero de ratón recolectado 14 días después
de una segunda inmunización suministrada 28 días después de la
primera inmunización.
El término "saponina", como es usado aquí,
incluye compuestos triterpenoides glicosídicos que producen espuma
en solución acuosa, tienen actividad hemolítica en la mayoría de
los casos y poseen actividad adyuvante inmune. La invención abarca
la saponina en sí misma, así como sales naturales y
farmacéuticamente aceptables y derivados farmacéuticamente
aceptables. El término "saponina" también abarca fragmentos
biológicamente activos de la misma.
Las saponinas de la presente invención pueden ser
obtenidas del árbol Quillaja Saporcaria Molina. (Dalsgaard,
Acta Veterinia Scandinavica, 69:1 (1978).). Un extracto de saponina
enriquecido parcialmente purificado, preparado como describe
Dalsgaard, (Quil-A), tiene actividad adyuvante. Tal
extracto puede ser adicionalmente separado. Entre los 22 picos de
saponina que fueron separables, las saponinas purificadas más
predominantes han sido identificadas como QS-7,
QS-17, QS-18, y
QS-21, también conocidas como QA-7,
QA-17, QA-18, y
QA-21, respectivamente. (Kensil, et al., U.S.
Patent No. 5,057,540.). Estas saponinas han sido sustancialmente
purificadas por varios métodos incluyendo HPLC, cromatografía de
silicio líquido de baja presión, y HILIC.
Como se describió en Kensil, et al.,
Patente U.S. No. 5,057,540, cuyos contenidos están totalmente
incorporados aquí como referencia, puede determinarse la actividad
adyuvante de tales saponinas por cualquiera de los varios métodos
que son conocidos por las personas familiarizadas con este medio.
Puede usarse como un criterio de la actividad adyuvante, el
incremento en el título de anticuerpo contra el antigeno específico
por administración de un adyuvante (Bomford, Int. Archs. Allergy
Appl. Immun. 77:409 (1985).). Brevemente, una de tales pruebas
implica inyectar intradérmicamente ratones CD1 con un antígeno (por
ejemplo albúmina de suero bovino (ASB)) mezclada con cantidades
variables del adyuvante potencial. Se recogió el suero de los
ratones dos semanas después y se le aplicó la prueba de ELISA para
anticuerpo antiABS.
Otra de tales pruebas implica la inyección por
vía subcutánea de ratones engendrados por endogamia tales como
C57BL/6 ó Balb/c, con un antígeno de proteína tal como ovoalbúmina
(OVA) ó un antígeno polisacárido tal como polisacárido neumococal,
mezclado con el adyuvante potencial. El suero recogido de los
ratones después de una, dos ó tres inmunizaciones, pudo ser recogido
y probado mediante ELISA para anticuerpos antígeno específico
(inmunoglobulina total) ó para subclases específicas IgG de ratones
tales como IgG1 ó IgG2a. Otra de tales pruebas involucra inyectar
ratones C57BL/6 con OVA, recoger los bazos después de una, dos ó
tres inmunizaciones, estimulando los esplenocitos con antígeno, y
luego haciendo análisis para actividad citolítica del linfocito T
("asesina") de las células objetivo que expresan el péptido del
OVA. Como alternativa, pudo medirse una respuesta proliferativa en
una prueba in vitro mediante la medición del consumo de
^{3}H timidina por parte de esplenocitos estimulados con
antígeno, los cuales fueron obtenidos de animales inmunizados.
"QS 21" designa la mezcla de componentes QS
21-V1 y QS 21-V2 que aparecen como
un pico individual en HPLC de fase reversa sobre Vydac C4 (tamaño de
partícula de 5 \mum, 300\ring{A} de poro, 4.6 mm diámetro
interno x 25 cm de longitud) en ácido acético 40 mM en metanol/agua
(58/42, v/v). Cuando se describen los experimentos realizados sobre
los componentes adicionalmente purificados, las fracciones
componentes son mencionadas específicamente como QS
21-V1 y QS 21-V2.
De acuerdo con Kensil, et al., Patente
U.S. No. 5,583,112, cuyos contenidos han sido totalmente
incorporados como referencia aquí, el grupo carboxilo del ácido
glucurónico de la Quillaja Saponaria Molina puede ser
conjugado con una proteína, un péptido ó una molécula pequeña que
tenga una amina primaria. Así, la presente invención se relaciona
con un adyuvante de saponina modificado químicamente ó una fracción
de la misma obtenida de un extracto crudo de Quillaja
Saponaria Molina donde la saponina modificada químicamente ó una
fracción de la misma incluye por lo menos una de
QS-17, QS-18, QS-21,
QS-21-V1, y
QS-21-V2 y donde la saponina
modificada retiene actividad adyuvante.
El término "parcialmente puras" significa
saponinas parcialmente separadas de los componentes normalmente
asociados en su estado natural.
El término "sustancialmente pura" significa
sustancialmente libre de los compuestos normalmente asociados con
la saponina en su estado natural y que exhiben una respuesta
cromatográfica, perfiles de elución y actividad biológica
reproducibles y constantes. El término "sustancialmente pura"
no se entiende como que excluyan mezclas artificiales ó sintéticas
de la saponina con otros compuestos.
La presente invención también emplea saponinas
inmunoestimulatorias aisladas de otras especies vegetales. Por
ejemplo, se ha demostrado que una saponina de Dolichos lablab es
útil como adyuvante (Katayan, et al., Vaccine 17:2733
(1999)).
El término "oligonucleótido inmunoestimulatorio
que incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado"
significa un oligonucleótido del cual se ha demostrado que activa
el sistema inmune. Preferiblemente, el oligonucleótido
inmunoestimulatorio puede incluir por lo menos un dinucleótido CpG
no metilado. Un "patrón CpG" es un trozo de ADN que incluye
uno ó mas dinucleótidos CpG dentro de una secuencia especificada.
El oligonucleótido que incluye la unidad CpG puede ser tan corto
como una longitud de 5-40 pares de bases. El
oligonucleótido inmunoestimulatorio que contiene el patrón CpG puede
ser un monómero ó parte de un multímero. Alternativamente, el
patrón CpG puede ser una parte de la secuencia de un vector que
también presente una vacuna ADN. Puede ser de trenza sencilla ó de
trenza doble. Puede ser preparado sintéticamente u obtenido a gran
escala en plásmidos. Una modalidad de la invención cubre el
oligonucleótido inmunoestimulatorio que contiene un patrón CpG que
tiene la fórmula 5'X1CGX23', donde por lo menos un nucleótido separa
los CpG's consecutivos, y donde X1 es adenina, guanina, ó timina, y
X2 es citosina, timina, ó adenina. En una modalidad preferida el
patrón CpG incluye TCTCCCAGCGTGCGCCAT (también conocido como
"1758") ó TCCATGACGTTCCTGACGTT (también conocido como
"1826").
Se ha encontrado que el ADN que contiene patrones
de dinucleótido CpG no metilado en el contexto de ciertas
secuencias flanqueantes, es un potente estimulador de varios tipos
de células inmunes in vitro (Ballas, et al., J.
Immunol. 157:1840 (1996); Cowdrey, et al., J. Immunol.
156:4570 (1996); Krieg, et al., Nature 374:546 (1995)).
Dependiendo de la secuencias flanqueantes, ciertos patrones CpG
pueden ser más nmunoestimulatorios para las respuestas de células T
ó células B y estimulan preferiblemente ciertas especies. Cuando se
desea una respuesta humoral, se preferirán los oligonucleótidos
inmunoestimulatorios que incluyen un patrón CpG no metilado y que
estimulan preferiblemente una respuesta de células B. Cuando se
desea inmunidad generada por células se preferirán los
oligonucleótidos inmunoestimulatorios que incluyen por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado y que estimulan preferiblemente la
secreción de citoquinas conocidas por facilitar una respuesta de
célula CD8+T.
Los oligonucleótidos inmunoestimulatorios de la
invención pueden ser modificados químicamente por varias vías con
objeto de estabilizar el oligonucleótido contra las endonucleasas
endógenas. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden contener
enlaces diferentes a los fosfodiéster en los cuales los nucleótidos
han sido reemplazados en el extremo 5' y/o en el extremo 3' del
oligonucleótido por cualquier número de bases ó grupos químicos no
tradicionales, tales como nucleótidos modificados por
fosforotioato. El oligonucleótido nmunoestimulatorio que incluye
por lo menos un dinucleótido CpG no metilado puede ser modificado
preferiblemente con por lo menos uno de tales nucleótidos
modificados por fosforotioato. Pueden prepararse los
oligonucleótidos con enlaces modificados por fosforotioato mediante
métodos bien conocidos en el medio, tales como fosforamidita
(Agrawal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7079 (1988)) ó
H-fosfonato (Froehler, et al., Tetrahedron
Lett. 27:5575 (1986)). Ejemplos de otros grupos químicos
modificadores incluyen alquilfosfonatos, fosforoditioatos,
alquilfosforotioatos, fosforamidatos,
2-O-metilos, carbamatos,
acetamidatos, ésteres de carboximetilo, carbonatos, y triésteres de
fosfato. Pueden prepararse oligonucleótidos con éstos enlaces de
acuerdo con métodos conocidos (Goodchild, Chem. Rev. 90:543 (1990);
Uhlmann, et al., Chem. Rev. 90:534 (1990); and Agrawal,
et al., Trends Biotechnol.. 10:152 (1992)).
Tal como es usado aquí, el término "adyuvante
inmune" se refiere a los compuestos que, cuando son
administrados a un individuo ó probados in vitro, incrementan la
respuesta inmune a un antígeno en el individuo ó sistema de prueba
al cual es administrado el antígeno. Preferiblemente tales
individuos son mamíferos y más preferiblemente son humanos, sin
embargo no se ha concebido la invención para que sea tan limitante.
Cualquier animal que pueda experimentar los efectos benéficos de
las vacunas de la invención está dentro del alcance de los animales
que pueden ser tratados de acuerdo con la invención reivindicada.
Algunos antígenos son débilmente inmunogénicos cuando son
administrados solos, es decir inducen o no, débiles títulos de
anticuerpo ó respuesta inmune generada por células. Un adyuvante
inmune puede aumentar la respuesta inmune del individuo
incrementando los títulos de anticuerpo y/o inmunidad generada por
células. El efecto adyuvante puede también reducir la dosis del
antígeno efectivo para lograr una respuesta inmune en el
individuo.
En un primer aspecto de la invención, puede
destinarse para administración una mezcla adyuvante inmune que
incluye un adyuvante de saponina y un ligonucleótido
inmunoestimulatorio. Más preferiblemente tal mezcla adyuvante inmune
puede incrementar la respuesta inmune a un antígeno en un individuo
ó en un sistema de prueba a los cuales sea administrado el
antígeno. Preferiblemente el adyuvante de saponina es una saponina
de la Quillaja Saponaria Molina. Más preferiblemente el
adyuvante de saponina puede ser una saponina parcialmente pura ó
sustancialmente pura de la Quillaja Saponaria Molina.
Preferiblemente la saponina parcialmente pura puede incluir
QS-7, QS-17, QS-18,
y QS-21 y puede incluir otras saponinas.
Preferiblemente el adyuvante de saponina sustancialmente puro es
QS-7, QS-17, QS-18,
ó QS-21. Más preferiblemente el adyuvante de
saponina sustancialmente puro es QS-21.
Alternativamente, la mezcla adyuvante inmune puede incluir más de
un adyuvante de saponina sustancialmente puro con el
oligonucleótido inmunoestimulatorio. En una modalidad adicional
preferida, el adyuvante de saponina puede cubrir un adyuvante de
saponina químicamente modificado ó una fracción del mismo obtenible
de un extracto de Quillaja Saponaria Molina, donde la
saponina químicamente modificada ó fracción de la misma incluye por
lo menos uno de QS-17, QS-18,
QS-21, QS-21- V1, y
QS-21-V2 y donde la saponina
químicamente modificada retiene la actividad adyuvante.
Preferiblemente, el oligonucleótido inmunoestimulatorio incluye por
lo menos un dinucleótido CpG no metilado. El dinucleótido CpG es
preferiblemente un monómero ó un multímero. Otra modalidad
preferida del patrón CpG es una parte de la secuencia de un vector
que también presenta una vacuna de ADN. Aún otra modalidad de la
mezcla adyuvante inmune está dirigida al oligonucleótido
inmunoestimulatorio, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
está modificado. La modificación particular puede incluir por lo
menos un nucleótido modificado por fosforotioato. Además, el
oligonucleótido inmunoestimulatorio que contiene por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado puede incluir un patrón CpG que tiene
la fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3' donde por lo menos un nucleótido
separa CpG's consecutivos y donde X_{1} es adenina, guanina, ó
timina, y X_{2} es citosina, timina, ó adenina. El patrón CpG
puede ser preferiblemente TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó
TCCATGACGTTCCTGACGTT.
En un segundo aspecto, la invención está dirigida
al uso de ((i) antígeno, (ii) una saponina que tiene actividad
adyuvante inmune y (iii) un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado en la
preparación de una mezcla de vacuna para ser usado para incrementar
la respuesta inmune a dicho antígeno en un individuo ó sistema de
prueba.
Preferiblemente el adyuvante de saponina es una
saponina de Quillaja Saponaria Molina. Más preferiblemente,
el adyuvante de saponina es una saponina sustancialmente pura ó
parcialmente pura de Quillaja Saponaria Molina. El método
también puede encarnar una mezcla adyuvante inmune que incluye más
de un adyuvante de saponina sustancialmente pura y oligonucleótido
inmunoestimulatorio El adyuvante de saponina sustancialmente puro es
preferiblemente QS-7, QS-17,
QS-18, ó QS-21. Más preferiblemente
el adyuvante de saponina sustancialmente puro es
QS-21. En una modalidad aún más preferida el
adyuvante de saponina puede cubrir un adyuvante de saponina
modificado químicamente ó una fracción del mismo obtenible de un
extracto crudo de Quillaja Saponaria Molina donde la
saponina químicamente modificada ó un fragmento de la misma incluye
por lo menos uno de QS-17, QS-18,
QS-21, QS-21-V1, y
QS-21-V2 y donde la saponina
químicamente modificada retiene su actividad adyuvante. En una
modalidad preferida del método, el oligonucleótido
inmunoestimulatorio incluye por lo menos un dinucleótido CpG no
metilado. El patrón CpG es preferiblemente un monómero ó un
multímero. Otra modalidad preferida del método incluye el patrón
CpG como una parte de la secuencia de un vector que presenta una
vacuna de ADN. Aún otra modalidad está dirigida al método donde el
oligonucleótido inmunoestimulatorio incluye por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado y donde además el oligonucleótido
inmunoestimulatorio puede estar químicamente modificado para
estabilizar el oligonucleótido contra las endonucleasas endógenas.
La modificación puede incluir por lo menos un nucleótido modificado
con fosforotioato. Además, el método puede ser dirigido, en parte,
al oligonucleótido inmunoestimulatorio que tiene por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado que incluye un patrón CpG que tiene la
fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3' donde por lo menos un oligonucleótido
separa los CpG's consecutivos y donde X_{1} es adenina, guanina,
ó timina, y X_{2} es citosina, timina, ó adenina. En otro método
preferido, el patrón CpG no metilado es TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó
TCCATGACGTTCCTGACGTT.
El término "mezcla de vacuna" aquí se
refiere a una mezcla capaz de producir una respuesta inmune. Una
mezcla de vacuna, de acuerdo con la invención produciría inmunidad
contra las enfermedades en los individuos. Puede administrarse a un
individuo la combinación de saponina y oligonucleótido
inmunoestimulatorio de la presente invención, para aumentar la
respuesta inmune a cualquier antígeno. Preferiblemente la mezcla de
vacuna estimula la inmunidad. Más preferiblemente la mezcla de
vacuna aumenta la producción de anticuerpos a un antígeno y aumenta
una respuesta inmune generada por células a un antígeno.
La mezcla de vacuna de la invención puede
aumentar la producción de anticuerpos a un antígeno de una forma
sinergística positiva. El efecto adyuvante sinergístico del
oligonucleótido inmunoestimulatorio y del adyuvante de saponina
descritos acá, puede ser mostrado por varias vías. Por ejemplo un
efecto adyuvante sinergístico puede ser demostrado como un
incremento en la máxima respuesta inmune esperada. Al combinar dos
adyuvantes puede esperarse un efecto aditivo. Específicamente, si
un adyuvante, usado en las dosis óptimas, produce "X" y el
otro adyuvante, también usado en las dosis óptimas, produce
anticuerpo "Y", entonces puede esperarse que la combinación
produzca "X+Y" si el resultado es aditivo y no sinergístico.
Un nivel máximo de respuesta que fuera considerablemente más alto
que "X+Y" sería considerado un efecto sinergístico y sería
inesperado. Un segundo indicio de sinergismo sería la aparición de
un efecto adyuvante sustancial en dosis a las que normalmente no se
espera que produzcan tal efecto. Un tercer indicio de sinergismo
sería la aparición de una respuesta inmune con cinética más
temprana que la esperada con cualquier adyuvante solo.
Además, los antígenos adecuados típicos para la
respuesta inmune aumentada incluyen antígenos derivados de
cualquiera de los siguientes: virus, tales como influenza, virus de
leucemia felina, virus de immunodeficiencia felina,
HIV-1, HIV-2, rabia, sarampión,
hepatitis B, ó aftosa; bacterias, tales como ántrax, difteria,
enfermedad de Lyme, neumococos, ó tuberculosis; ó protozoarios,
tales como Babeosis bovis ó Plasmodium. Preferiblemente el
antígeno puede ser una proteína, un péptido, un polisacárido, un
lípido, un glicolípido, un fosfolípido, ó un ácido nucleico que
codifique la proteína antigénica ó péptido antigénico de interés.
Los antígenos pueden ser purificados a partir de una fuente
natural, sintetizados por medio de síntesis de fase sólida, ó
pueden ser obtenidos por medio de ingeniería genética.
De acuerdo con esto, en un tercer aspecto, la
invención también abarca una mezcla de vacuna que incluye un
adyuvante de saponina, un oligonucleótido inmunoestimulatorio y un
antígeno. El adyuvante de saponina puede ser saponina parcialmente
pura ó sustancialmente pura de Quillaja Saponaria Molina.
Las mezclas de vacuna pueden también incluir más de un adyuvante de
saponina parcialmente puro ó sustancialmente puro, un
oligonucleótido inmunoestimulatorio que además incluye por lo menos
un patrón CpG no metilado y un antígeno. Preferiblemente, el
adyuvante de saponina parcialmente incluye QS- 7,
QS-17, QS-18, y/ó
QS-21 y puede incluir otras saponinas.
Preferiblemente, el adyuvante de saponina sustancialmente puro es
QS-7, QS-17, QS-18,
ó QS-21. Otra modalidad preferida abarca adyuvantes
de saponina, donde un adyuvante de saponina modificado químicamente
ó un fragmento del mismo obtenible de un extracto crudo de
Quillaja Saponaria Molina, donde la saponina modificada
químicamente ó fracción de la misma incluye por lo menos uno de
QS-17, QS-18,
QS-21, QS-21-V1, y
QS-21-V2 y donde la saponina
modificada químicamente retiene su actividad adyuvante. Más
preferiblemente, el adyuvante de saponina parcialmente puro ó
sustancialmente puro en la mezcla de vacuna es
QS-21. Preferiblemente, el oligonucleótido
inmunoestimulatorio puede incluir por lo menos un dinucleótido CpG
no metilado. Preferiblemente el patrón CpG puede ser un monómero ó
un multímero. Otra modalidad preferida del patrón CpG es como una
parte de la secuencia de un vector que también presenta una vacuna
de ADN. Aún otra modalidad de la mezcla de vacuna descrita aquí
está dirigida al oligonucleótido inmunoestimulatorio que incluye
por lo menos un dinucleótido CpG no metilado que incluye una
modificación química. Más particularmente el oligonucleótido
inmunoestimulatorio puede ser modificado con por lo menos un
nucleótido modificado con fosforotioato. Además el oligonucleótido
inmunoestimulatorio que tiene por lo menos un dinucleótido CpG no
metilado de la mezcla de vacuna incluye un patrón CpG que tiene la
fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3' donde por lo menos un nucleótido
separa los CpG's consecutivos y donde X_{1} es adenina, guanina,
ó timina, y X_{2} es citosina, timina, ó adenina. De acuerdo con
éste aspecto de la invención, el patrón CpG no metilado puede
incluir preferiblemente TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó
TCCATGACGTTCCTGACGTT.
Esta invención también encarna el uso de una
mezcla de vacuna que incluye más de un adyuvante de saponina puro ó
sustancialmente puro, un oligonucleótido inmunoestimulatorio y un
antígeno. Preferiblemente, el adyuvante de saponina parcialmente
puro incluye QS-7, QS-17,
QS-18 y/o QS-21 y puede incluir
otras saponinas. Preferiblemente, el adyuvante de saponina
sustancialmente puro incluye QS-7,
QS-17, QS-18 o
QS-21. Más preferiblemente, de acuerdo con ésta
invención, el adyuvante de saponina parcialmente puro ó
sustancialmente puro es QS-21. El adyuvante de
saponina puede ser uno químicamente modificado ó una fracción del
mismo obtenibles del extracto crudo de Quillaja Saponaria
Molina, donde la saponina modificada químicamente ó fracción de la
misma incluye por lo menos uno de QS-17,
QS-18, QS-21,
QS-21-V1 y
QS-21-V2 y donde la saponina
modificada químicamente retiene su actividad adyuvante.
Preferiblemente la invención incluye el uso de un oligonucleótido
inmunoestimulatorio el cual además incluye por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado. Allí, el dinucleótido CpG es un
monómero ó multimero. Otra modalidad preferida del uso incluye el
patrón CpG como una parte de la secuencia de un vector que también
presenta una vacuna de ADN. Aún otra modalidad de los usos aquí
divulgados está dirigida al oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado, donde el
oligonucleótido inmunoestimulatorio puede ser modificado
químicamente para incrementar su estabilidad frente a las
endonucleasas endógenas. Tal modificación puede incluir por lo
menos un nucleótido modificado por fosforotioato. Además, el
oligonucleótido inmunoestimulatorio que tiene por lo menos un
dinucleótido CpG no metilado puede incluir un patrón CpG que tiene
la fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3' donde por lo menos un nucleótido
separa los CpG's consecutivos y donde X_{1} es adenina, guanina,
ó timina, y X_{2} es citosina, timina, ó adenina. En otra
modalidad preferida, el patrón no metilado CpG es
TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
Otras indicaciones útiles para la mezcla de la
vacuna incluyen el aumento en la producción de anticuerpos a un
antígeno y el aumento de la inmunidad generada por células. Más
preferiblemente, la mezcla de vacuna aumenta la producción de
anticuerpos a un antígeno y aumenta la inmunidad generada por
células. Más preferiblemente, la mezcla de vacuna aumenta de una
manera sinérgica positiva la producción de anticuerpos a un
antígeno.
La administración de las mezclas de la presente
invención puede ser parenteral, vía intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intranasal, oral, mucosa ó por cualquier otro medio
adecuado. La dosis administrada puede depender de la edad, peso,
clase de tratamiento concurrente si existe, y naturaleza del
antígeno administrado. La dosis inicial puede ser seguida por una
dosis de estímulo después de un período de más ó menos cuatro
semanas para aumentar la respuesta inmunogénica. También pueden
administrase dosis adicionales de estímulo. Pueden suministrarse
las mezclas en una sola inyección de una formulación de saponina,
oligonucleótido y antígeno ó en inyecciones separadas suministradas
en el mismo sitio en un período corto de tiempo (es decir entre 0 y
2 días).
Las mezclas efectivas de la presente invención
pueden ser utilizadas en formas tales como cápsulas, soluciones
líquidas, suspensiones ó elíxires para administración oral, ó
formas estériles líquidas tales como suspensiones ó soluciones.
Puede usarse preferiblemente cualquier vehículo inerte aceptable
tal como salino ó PBS ó cualquier otro vehículo aceptable en el cual
las mezclas de la presente invención tengan adecuadas propiedades
de solubilidad para el uso de la presente invención.
Se empleó un modelo animal bien establecido para
evaluar si las formulaciones de oligonucleótido CpG y
QS-21 juntas podrían funcionar como un adyuvante
inmune. Brevemente, se definieron experimentos para comparar
QS-21 con el patrón CpG adyuvante recientemente
reportado. Se seleccionó una secuencia CpG (por ejemplo 1758) de la
que se ha reportado que sirve como un adyuvante para una vacuna de
idiotipo KLH de linfoma de células B en ratones. Un experimento
evaluó si el patrón CpG, solo ó en combinación con
QS-21, puede servir como un adyuvante para una
vacuna de subunidad, por ejemplo OVA, en ratones induciendo
respuestas CTL. Este trabajo incluyó un experimento de rango de
dosis con CpG para determinar la dosis óptima.
Adicionalmente a la comparación de CpG y
QS-21 como adyuvantes, se realizó un segundo
experimento combinando oligonucleótido CpG con dosis subóptimas de
QS-21 (por ejemplo 1,25 \mug) para evaluar si el
oligonucleótido CpG puede afectar el efecto adyuvante de
QS-21.
También se realizó un experimento para determinar
si la mezcla de CpG y QS-21 podría aumentar la
producción de anticuerpos, específicamente el perfil isotipo de una
respuesta anticuerpo antígeno específico.
Finalmente, se desarrollaron una serie de
experimentos para determinar si una mezcla de oligonucleótido CpG y
saponina podrían aumentar la producción de anticuerpos de una
manera sinergística positiva. Este trabajo empleó formulaciones de
vacunas de polisacárido de neumococo tipo 14 y QS-21
y oligonucleótido CpG y evaluó los títulos de anticuerpo específico
recogidos de ratones en los días 21 y 42 después de la inmunización
los días 0 y 28. Se seleccionó otra secuencia CpG (por ejemplo
1826), de la cual se reporta que sirve como un adyuvante en ratones
para lisozima de huevo de gallina.
Los experimentos fueron realizados utilizando
materiales de los siguientes proveedores: OVA Grado VI (Sigma);
polisacárido de neumococo Tipo 14 (ATTC); QS-21
(Aquila); oligonucleótidos CpG incluida la secuencia 1758
TCTCCCAGCGTGCGCCA modificada con fosforotioato y la secuencia 1826
TCCATGACGTTCCTGACGTT modificada con fosforotioato (Life Technologies
(Gibco)).
Ejemplo
1
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (5 por grupo,
hembras, 8-10 semanas de edad) por vía subcutánea
los días 1, 15 y 29. Las vacunas fueron 25 \mug de antígeno OVA
más las dosis indicadas de adyuvante en un volumen total de 0,2 ml
de solución salina regulada con fosfato. El patrón CpG usado en
este experimento era un oligonucleótido 1758 modificado con
fosforotioato con una secuencia de TCTCCCAGCGTGCGCCA (Weiner, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10833 (1997).). El día 42 fueron
removidos los esplenocitos, para usarlos como células efectoras en
el ensayo CTL. Ellos fueron estimulados in vitro por 6 días
con células E.G7-OVA tratadas con mitomicina C y
luego fueron usadas en un ensayo normal CTL de liberación de
^{51}Cr. Como células objetivo se usaron células
E.G7-OVA (cargadas con ^{51}Cr). Para obtener un
porcentaje de lisis antígeno-específico, se restó
la lisis básica de células EL4 (no transfectadas con OVA) de la
lisis de las células E.G7-OVA.
Tal como se muestra en la Figura 1, los
resultados indican que en ausencia de adyuvante no se observó
lisis, con cualquier dosis CpG ó con 1,25 \mug de QS- 21 (dosis
subóptima). Sin embargo, la dosis subóptima de Qs-21
en combinación con CpG indujo CTL significativo. Los resultados
muestran un efecto adyuvante sustancial, a niveles de dosis en los
que normalmente no se esperaría que produjera dicho efecto
adyuvante. Este efecto sinergístico positivo fue más notable en la
dosis más alta de CpG (50 \mug). El efecto adyuvante fue
comparable al alcanzado con el control óptimo de
QS-21 de 10 \mug.
Ejemplo
2
Se emplearon en un ensayo CTL esplenocitos de
ratón inmunizados como se describió en la Figura 1. Los
esplenocitos fueron estimulados in vitro por 6 días con OVA
desnaturalizado antes del uso en la prueba CTL. La prueba fue
llevada a cabo contra células E.G7-OVA, tal como se
describió en el Ejemplo 1.
Como es evidente a partir de los resultados en la
Figura 2, no se observó lisis en ausencia de adyuvante, con
cualquier dosis de CpG, ó con 1,25 \mug de QS-21
(dosis subóptima). Sin embargo, la dosis subóptima de
QS-21 en combinación con CpG indujo CTL
significativo (comparable al control óptimo de QS-21
de 10 \mug). Los resultados muestran el sinergismo positivo entre
el CpG y el QS-21 que era inesperado a un nivel
subóptimo de dosis.
\newpage
Ejemplo
3
Se determinaron los títulos de suero al OVA,
mediante EIA sobre suero colectado el día 42, de los ratones
inmunizados como se describe en el Ejemplo 1. Se determinaron los
títulos IgG subclases IgG1 e IgG2a, para ratones individuales (5
ratones por grupo) y se graficaron como un título promedio
geométrico. Los títulos IgG1 fueron los más altos en los grupos que
recibieron sólo QS-21 (a la dosis de 10 \mug) ó
10 \mug de QS-21 en combinación con bien sea 10 ó
50 \mug (incremento de aproximadamente 10 veces sobre el grupo
sin adyuvante), como se muestra en la figura 3. No fue detectable
la respuesta a IgG2a en cualquiera de los grupos excepto para la
combinación de 10 \mug de QS-21 (dosis óptima)
con 10 ó 50 \mug de CpG y la combinación de 1,25 \mug de
QS-21 (dosis subóptima) con 50 \mug de CpG. No se
detectó IgG2a con cualquiera dosis de CpG usado solo, con
cualquiera dosis de QS-21 usado solo ó en el grupo
sin adyuvante.
Ejemplo
4
Se inmunizaron ratones BALB/c (5 ratones por
grupo, hembras, 8-10 semanas de edad) por vía
subcutánea los días 0 solamente ó a los días 0 y 28. Las vacunas
fueron 0,5 \mug de polisacárido de neumococo Tipo 14 más las dosis
indicadas de adyuvante en un volumen total de 0,2 ml de salino
regulado con fosfato. El patrón inmunoestimulatorio CpG usado en
este experimento fue un oligonucleótido 1826 modificado con
fosforotioato, con una secuencia TCCATGACGTTCCTGACGTT (Chu, et
al., J. Exp. Med. 186:1623-1631 (1997)). Se uso
QS-21 a una dosis de 1.25 \mug ó 10 \mug. Se
usó CpG ODN 1826 a una dosis de solo 10 \mug.
El día 21 se recolectó suero de ratones que
recibieron una inmunización sencilla. El día 42 se recolectó suero
de ratones que recibieron dos inmunizaciones. Se determinó en el
suero el título específico de anticuerpo para polisacárido Tipo 14.
Se determinaron los IgG de las subclases IgG1, IgG2a e IgG3, para
una muestra compuesta equivolumétrica de suero de los ratones de
cada grupo. Luego de una inmunización sencilla, los títulos IgG1
eran 66 veces más altos para la mezcla 10 \mug
QS-21/10 \mug CpG que para QS-21
solo y fueron 43 veces más altas que para CpG solo (Figura 4). Los
títulos IgG2a fueron 11 veces más altos para la mezcla 10 \mug
QS-21/CpG que para QS-21 solo ó CpG
solo (Figura 5). Los títulos IgG3 fueron 85 veces más altos para la
mezcla 10 \mug QS-21/CpG que para
QS-21 solo y fueron 95 veces más altos que para CpG
solo (Figura 6).
Después de dos inmunizaciones, los títulos IgG1
fueron 46 veces más altos para la mezcla 10 \mug
QS-21/CpG que para QS-21 solo y
fueron 444 veces más altos que para CpG solo (Figura 7). Los
títulos IgG2a fueron 476 veces más altos para la mezcla 10 \mug
QS-21/CpG que para QS-21 solo y
fueron 127 veces más altos que para CpG solo (Figura 5). Los
títulos IgG3 fueron 67 veces más altos para la mezcla 10 \mug
QS-21/CpG que para QS-21 solo y
fueron 243 veces más altos que para CpG solo (Figura 9). El aumento
de éstos títulos muestra que éste es un efecto sinergístico
positivo y que no es simplemente un efecto adyuvante aditivo
resultante de la combinación de éstos dos adyuvantes.
Adicionalmente, la combinación de bajas dosis de
QS-21 (1.25 \mug) con 10 \mug CpG también
produjo después de dos inmunizaciones títulos de IgG1 e IgG3 que
fueron más altos que los producidos por 1.25 \mug
QS-21 solo, 10 \mug QS-21 solo, ó
10 \mug CpG solo.
Claims (51)
1. Una mezcla de vacuna que incluye
a) Un antígeno;
b) Una saponina que posee actividad adyuvante
inmune; y
c) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
2. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde la saponina es derivada de la Quillaja
Saponaria Molina.
3. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 2, donde la saponina es una ó mas saponinas
sustancialmente puras
4. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 3, donde la saponina ó las saponinas más
sustancialmente puras son QS-7,
QS-17, QS-18,
QS-21, QS-21-V1, ó
QS-21-V2 ó más de una de las
anteriores.
5. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 4, donde la saponina sustancialmente pura es
QS-21
6. La mezcla de vacuna como se definió en la
Reivindicación 1, para usarse en incrementar la respuesta inmune en
un individuo al antígeno, donde el oligonucleótido
inmunoestimulatorio es modificado, y donde la mezcla de vacuna es
administrada al individuo por medios parenteral, intravenosa,
intramuscular ó subcutáneo.
7. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 6, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio está
modificado con por lo menos un nucleótido modificado con
fosforotioato.
8. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
incluye un patrón CpG que tiene la fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3'
donde por lo menos un nucleótido separa CpG's consecutivos y donde
X_{1} es adenina, guanina, ó timina, y X_{2} es citosina,
timina, ó adenina.
9. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 8, donde el patrón CpG incluye TCTCCCAGCG
TGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
TGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
10. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde la mezcla incrementa adicionalmente la
respuesta inmune al antígeno.
11. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde la mezcla aumenta adicionalmente la
producción de anticuerpo al antígeno.
12. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde la mezcla aumenta adicionalmente la
producción de anticuerpo al antígeno de una forma sinergística
positiva.
13. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde la mezcla aumenta adicionalmente la
inmunidad generada por células.
14. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, donde el antígeno incluye una proteína, un
péptido, un polisacárido, un lípido, un glicolípido, un
fosfolípido, ó un ácido nucleico que codifica la proteína ó el
péptido.
15. Una mezcla adyuvante inmune que incluye
d) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, y
e) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio no
es una parte de un vector de vacuna de ADN, ó
a) Una saponina que posee actividad adyuvante
inmune, donde la saponina es derivada de la Quillaja
Saponaria, y
b) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
Donde la saponina es una ó más sustancialmente
purificada QS-7, QS-17,
QS-18 ó
a) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, y
b) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
incluye
TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
ó
a) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, donde la saponina es saponina modificada químicamente,
y
b) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
16. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 15, donde la mezcla adyuvante
incluye
f) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, y
g) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio no
es una parte de un vector de vacuna de ADN
17. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 15, donde la mezcla adyuvante
incluye
a) Una saponina que posee actividad adyuvante
inmune, donde la saponina es derivada de la Quillaja
Saponaria, y
b) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
donde la saponina es una ó más sustancialmente
pura QS-7, QS-17 ó
QS-18.
18. la mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 15, donde la mezcla adyuvante
incluye
h) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, y
i) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
incluye
TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
19. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 15, donde la mezcla adyuvante
incluye
a) Una saponina que posee una actividad adyuvante
inmune, donde la saponina es una saponina modificada químicamente,
y
b) Un oligonucleótido inmunoestimulatorio que
incluye por lo menos un dinucleótido CpG no metilado
20. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 16, donde la saponina es como se
definió en las reivindicaciones 2, 3, 4 ó 5.
21. La mezcla adyuvante inmune, como se definió
en las Reivindicaciones 16, 17, 18 ó 19, para ser usada en el
incremento de la respuesta inmune a un antígeno en un individuo al
cual se ha suministrado el antígeno, donde el oligonucleótido
inmunoestimulatorio está modificado y donde la mezcla de adyuvante
inmune es administrada al individuo por vía parenteral,
intravenosa, intramuscular ó subcutánea.
22. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 21, donde el oligonucleótido
inmunoestimulatorio está modificado con por lo menos un nucleótido
modificado con fosforotioato.
23. La mezcla adyuvante inmune, como se
reivindicó en la Reivindicación 16, donde el oligonucleótido
inmunoestimulatorio es como se definió en las Reivindicaciones 8 ó
9.
24. Una mezcla de vacuna como se definió en
cualquiera de las Reivindicaciones 1-5,
8-14 para ser usada en el incremento de la respuesta
inmune a un antígeno en un individuo.
25. El uso de un (i) antígeno, (ii) una saponina
que posee actividad adyuvante inmune y (iii) un oligonucleótido
inmunoestimulatorio que incluye por lo menos un dinucleótido CpG no
metilado en la preparación de una mezcla de vacuna para ser usada
en el incremento de la respuesta inmune a dicho antígeno en un
individuo.
\newpage
26. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 25, donde la saponina es como se definió en las
Reivindicaciones 2, 3, 4 o 5.
27. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 25, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
está modificado y donde la mezcla de vacuna es administrada al
individuo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular ó
subcutánea.
28. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 27, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
está modificado con al menos un nucleótido modificado con
fosforotioato.
29. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 25, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio es
como se definió en las Reivindicaciones 8 ó 9.
30. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 25, donde el uso aumenta adicionalmente la
producción de anticuerpos al antígeno.
31. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 30, donde el uso aumenta adicionalmente la
producción de anticuerpos de una manera sinergística positiva.
32. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 25, donde el uso aumenta adicionalmente la inmunidad
generada por células.
33. La mezcla adyuvante inmune como se definió en
cualquiera de las Reivindicaciones 16, 20 y 23 para el uso en el
incremento de la respuesta inmune a un antígeno en un individuo al
cual es administrado el antígeno.
34. El uso de (i) una saponina que posee
actividad adyuvante inmune y (ii) un oligonucleótido
inmunoestimulatorio que contiene al menos un dinucleótido CpG no
metilado en la preparación de una mezcla adyuvante inmune para ser
usada en el incremento de la respuesta inmune a un antígeno en un
individuo al cual es administrado el antígeno.
35. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 34, donde la saponina es como se definió en las
Reivindicaciones 2, 3, 4 ó 5.
36. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 34, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
está modificado y donde la mezcla de adyuvante inmune es
administrada al individuo por vía parenteral, intravenosa,
intramuscular ó subcutánea.
37. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 36, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
está modificado con al menos un nucleótido modificado con
fosforotioato.
38. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 34, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio
incluye un patrón CpG que tiene la fórmula 5'X_{1}CGX_{2}3'
donde por lo menos un nucleótido separa CpG's consecutivos y donde
X_{1} es adenina, guanina, ó timina, y X_{2} es citosina,
timina, ó adenina.
39. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 38, donde el patrón CpG incluye
TCTCCCAGCGTGCGCCAT ó TCCATGACGTTCCTGACGTT.
40. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 34, donde el antígeno incluye un péptido, una
proteína, un polisacárido, un lípido, un glicolípido, un
fosfolípido, ó un ácido nucleico que codifica la proteína ó el
péptido.
41. La mezcla adyuvante inmune como se reivindicó
en las Reivindicaciones 18 o 19, donde la saponina es como se
definió en las Reivindicaciones 2, 3, 4, ó 5.
42. La mezcla adyuvante inmune como se reivindicó
en cualquiera de las Reivindicaciones 17 ó 19, donde el
oligonucleótido inmunoestimulatorio es como se definió en las
Reivindicaciones 8 ó 9.
43. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, el uso como se reivindicó en cualquiera de las
Reivindicaciones 25-28 y 34-38, ó la
mezcla adyuvante inmune como se reivindicó en las reivindicaciones
17, 18 ó 19, donde el oligonucleótido inmunoestimulatorio tiene una
longitud de 5-40 bases.
44. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1, el uso como se reivindicó en cualquiera de las
Reivindicaciones 25-28 y 34-38, ó la
mezcla adyuvante inmune como se reivindicó en las reivindicaciones
16, 17 ó 18, donde la saponina es una saponina modificado
químicamente.
45. La mezcla de vacuna como se reivindicó en la
Reivindicación 1 ó el uso como se reivindicó en cualquiera de las
Reivindicaciones 25-28 y 34-38,
donde la mezcla, cuando es administrada a un humano, incrementa la
respuesta inmune del humano al antígeno, ó donde la mezcla cuando
es administrada a un animal, incrementa la respuesta inmune del
animal al antígeno.
46. La mezcla adyuvante inmune como se reivindicó
en cualquiera de las Reivindicaciones 16, 17, 18, 19 y 41, donde la
mezcla, cuando es administrada a un humano, incrementa la respuesta
inmune del humano a un antígeno que es administrado al humano, ó
donde la mezcla cuando es administrada a un animal, incrementa la
respuesta inmune del animal a un antígeno que es administrado al
animal.
47. La mezcla adyuvante inmune como se reivindicó
en la Reivindicación 46, donde el antígeno incluye una proteína, un
péptido, un polisacárido, un lípido, un glicolípido, un
fosfolípido, ó un ácido nucleico que codifica la proteína ó el
péptido.
48. La mezcla adyuvante inmune como se reivindicó
en cualquiera de las Reivindicaciones 17, 18, 19, 41 y 42, para uso
en incrementar la respuesta inmune a un antígeno en un individuo al
cual se administra el antígeno.
49. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 34 ó 35, donde se administra el antígeno al
individuo dentro de los dos días de haber administrado la mezcla
adyuvante inmune, y donde la mezcla adyuvante inmune es administrada
al individuo por vía parenteral, intravenosa, intramuscular ó
subcutánea.
50. El uso como se reivindicó en la
Reivindicación 49, donde el antígeno es administrado ak individuo
en forma concurrente con la mezcla adyuvante inmune
51. El uso como se reivindicó en las
Reivindicaciones 49-50, donde el antígeno incluye
una proteína, un péptido, un polisacárido, un lípido, un
glicolípido, un fosfolípido, ó un ácido nucleico que codifica la
proteína ó el péptido.
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