DE60014076T2

DE60014076T2 - Adjuvans-zusammensetzung, enthaltend saponin und ein immunstimulatorisches oligonukleotid

Info

Publication number: DE60014076T2
Application number: DE60014076T
Authority: DE
Inventors: Martin Friede; Nathalie Garcon; Philippe Hermand
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-04
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-04-05
Also published as: US7399472B2; BR0010612B1; HU229255B1; CN1227030C; PL203951B1; JP4897547B2; PL351893A1; EP1187629A2; HK1044484B; EP2322210A1; AU4114900A; HUP0200815A3; KR20070114854A; HK1044484A1; US20080311156A1; CA2370697C; JP2007191491A; BRPI0010612B8; TWI232753B; NO20015073L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hilfsstoffzusammensetzungen zur Verwendung in Impfstoffen. Insbesondere umfassen die erfindungsgemäßen Hilfsstoffzusammensetzungen eine Kombination aus Saponin und einem immunstimulatorischen Oligonukleotid, wobei die Kombination gegebenenfalls zusätzlich einen Träger umfaßt. Ebenfalls bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung werden Impfstoffe, die die erfindungsgemäßen Hilfsstoffzusammensetzungen und wenigstens ein Antigen umfassen. Ferner bereitgestellt werden Verfahren zur Herstellung der Hilfsstoffzusammensetzungen und Impfstoffe der vorliegenden Erfindung und deren Verwendung als Medikamente. Zusätzlich stelle die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das für eine Krankheit anfällig ist oder daran leidet, durch die parenterale oder mukosale Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoffe bereit.
Immunstimulatorische Oligonukleotide, die unmethylierte CpG-Dinukleotide ("CpG") enthalten, sind auf diesem Gebiet als Hilfsstoffe bekannt, wenn sie sowohl auf dem systemischen als auch auf dem mukosalen Weg verabreicht werden (WO 96/02555, WP 468520, Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2): 870–876; McCluskie und Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463–6). CpG ist eine Abkürzung für in DNA vorhandene Cytosin-Guanosin-Dinukleotidmotive. Historisch wurde beobachtet, daß die DNA-Fraktion von BCG eine Antitumorwirkung ausüben konnte. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, daß synthetische Oligonukleotide, die aus BCG-Gensequenzen stammen, immunstimulatorische Wirkungen (sowohl in vitro als auch in vivo) induzieren können. Die Autoren dieser Untersuchungen schlossen, daß bestimmte Palindromsequenzen, einschließlich eines zentralen CG-Motivs, diese Aktivität tragen. Die zentrale Rolle des CG-Motivs in der Immunstimulation wurde später in einer Veröffentlichung von Krieg aufgeklärt, Nature 374, S. 546, 1995. Eine ausführliche Analyse hat gezeigt, daß das CG-Motiv in einem gewissen Sequenzkontext sein muß, und daß solche Sequenzen üblich in bakterieller DNA sind, aber selten in Wirbeltier-DNA sind. Die immunstimulatorische Sequenz ist häufig Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin; worin das Dinukleotid-CG-Motiv nicht methyliert ist, aber andere unmethylierte CpG-Sequenzen sind als immunstimulatorisch bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. WO 98/18810 beschreibt CpG-Hilfsstoffe, die mit anderen herkömmlichen Hilfsstoffen kombiniert werden können. Saponine allgemein werden in diesem Dokument nicht beschrieben.
In bestimmten Kombinationen der sechs Nukleotide ist eine Palindromsequenz vorhanden. Verschiedene dieser Motive, entweder als Repeats eines Motivs oder als eine Kombination unterschiedlicher Motive, können im gleichen Oligonukleotid vorhanden sein. Die Gegenwart eines oder mehrerer dieser Oligonukleotide, die eine immunstimulatorische Sequenz enthalten, kann verschiedene Immununtergruppen aktivieren, einschließlich natürlicher Killerzellen (die Interferon-γ erzeugen und cytolytische Aktivität besitzen) und Makrophagen (Wooldrige et al., Bd. 89 (Nr. 8), 1997). Dennoch wurde jetzt gezeigt, daß andere, unmethyliertes CpG enthaltende Sequenzen, die nicht dieses Konsensus-Sequenz aufweisen, immunmodulatorisch sind.
Bei Formulierung zu Impfstoffen wird CpG allgemein in freier Lösung zusammen mit freiem Antigen (WO 96/02555; McCluskie und Davis, siehe oben) oder kovalent an ein Antigen konjugiert (WO 98/16247) oder mit einem Träger wie Aluminiumhydroxid formuliert verabreicht ((Hepatitis-Oberflächenantigen) Davis et al., siehe oben; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).
Saponine werden gelehrt in M. Lacaille-Dubois und H. Wagner (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine Bd. 2, S. 363–386). Saponine sind Steroid- oder Triterpen-Glycoside, die im Pflanzenreich und im Reich der marinen Tiere weitverbreitet sind. Saponine sind bekannt für die Bildung kolloidaler Lösungen in Wasser, die beim Schütteln schäumen, und für die Ausfällung von Cholesterol. Wenn Saponine nahe an Zellmembranen sind, erzeugen sie porenartige Strukturen in der Membran, die das Aufbrechen der Membran verursachen. Die Hämolyse von Erythrozyten ist ein Beispiel für dieses Phänomen, das eine Eigenschaft bestimmter, aber nicht aller Saponine ist.
Saponine sind als Hilfsstoffe in Impfstoffen für die systemische Verabreichung bekannt. Die Hilfsstoff- und hämolytische Aktivität individueller Saponine wurde umfassend auf diesem Gebiet untersucht (Lacaille-Dubois und Wagner, siehe oben). Zum Beispiel werden Quil A (das aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja Saponaria Molina stammt) und Fraktionen davon in US 5 057 540 und "Saponins as vaccine adjuvants", C.R. Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1996, 12(1-2): 1–55; und in EP 0 362 279 B1 beschrieben.
Partikuläre Strukturen, die als immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) bezeichnet werden, die Fraktionen von Quil A umfassen, sind hämolytisch und wurden in der Herstellung von Impfstoffen verwendet (B. Morein, EP 0 109 942 B1 ). Es wurde berichtet, daß diese Strukturen Hilfsstoffaktivität besitzen ( EP 0 109 942 B1 ; WO 96/11711).
Die hämolytischen Saponine QS21 und QS17 (HPLC-gereinigte Fraktionen von Quil A) wurden als wirksame systemische Hilfsstoffe beschrieben, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in US-PS 5 057 540 und EP 0 362 279 B1 offenbart. Ebenfalls beschrieben in diesen Zitaten wird die Verwendung von QS7 (eine nicht-hämolytische Fraktion von Quil-A), das als wirksamer Hilfsstoff für systemische Impfstoffe wirkt. Die Verwendung von QS21 wird ferner in Kensil et al. beschrieben (1991, J. Immunology, Bd. 146, 431–437). Kombinationen aus QS21 und Polysorbat und Cyclodextrin sind ebenfalls bekannt (WO 99/10008). Partikuläre Hilfsstoffsysteme, die Fraktionen von QuilA umfassen, wie QS21 und QS7, werden in WO 96/33739 und WO 96111711 beschrieben.
Andere Saponine, die in systemischen Impfungsuntersuchungen verwendet wurden, schließen diejenigen ein, die aus anderen Pflanzenarten stammen, wie Gypsophila und Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572–577, 1992).
Es ist ebenfalls bekannt, daß Saponine in mukosal eingesetzten Impfstoffuntersuchungen verwendet wurden, die unterschiedlichen Erfolg in der Induzierung von Immunreaktionen hatten. Es wurde zuvor gezeigt, daß Quil-A-Saponin keine Wirkung auf die Induzierung einer Immunreaktion hat, wenn Antigen intranasal verabreicht wird (Gizurarson et al., 1994, Vaccine Research 3, 23–29). Dagegen haben andere Autoren diesen Hilfsstoff mit Erfolg verwendet (Maharaj et al., Can. J. Microbiol., 1986, 32(5): 414–20; Chavali und Campbell, Immunobiology, 174(3): 347–59). ISCOMs, die Quil A-Saponin umfassen, wurden in intragastrischen und intranasalen Impfstofformulierungen verwendet und wiesen Hilfsstoffaktivität auf (McI Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317–322; McI Mowat und Donachie, Immunology Today, 12, 383–385). WO 98/56415 beschreibt einen oralen Impfstoff, der QS21 umfaßt, optional zusammen mit CpG. Es gibt keine Offenbarung der synergistischen Kombination von CpG und Saponin in den hier beanspruchten Formen in WO 98/56415.
QS21, die nicht-toxische Fraktion von Quil A, wurde ebenfalls als oraler oder intranasaler Hilfsstoff beschrieben (Sumino et al., J. Virol. 1998, 72(6): 4931–9, WO 98/56415).
WO 00/09159 ist eine gleichzeitig anhängige Patentanmeldung, die Stand der Technik nur für die Neuheit gemäß Artikel 54(3) EPÜ darstellt. Diese Druckschrift offenbart die Kombination von CpG zusammen mit Saponin. Jedoch schweigt WO 00/09159 über die Form des Saponins, die hier beansprucht wird.
Die Verwendung anderer Saponine in intranasalen Impfungsuntersuchungen wurde beschrieben. Zum Beispiel wurden Chenopodium quinoa-Saponine sowohl in intranasalen als auch intragastrischen Impfstoffen verwendet (Estrada et al., Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21(3): 225–36).
Die vorliegende Erfindung betrifft den überraschenden Befund, daß Kombinationen aus immunstimulatorischen Oligonukleotiden (CpG) und Saponin äußerst wirksame Hilfsstoffe sind. Entsprechend wird eine Hilfsstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine Kombination aus Saponin und einem immunstimulatorischen Oligonukleotid umfaßt. Bevorzugt können die Hilfsstoffe der vorliegenden Erfindung zusätzlich einen Träger umfassen. In einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung wirken das Saponin und die Oligonukleotide in den Hilfsstoff- und Impfstoff-Zusammensetzungen synergistisch in der Induzierung von Antigen-spezifischem Antikörper und sind wirksam in der Induzierung von Immunreaktionen, die herkömmlich mit dem Immunsystem des Th1-Typs verbunden sind. Entsprechend sind die Hilfsstoffkombinationen nicht nur geeignet zur Immunprophylaxe von Krankheiten, sondern überraschend auch zur Immuntherapie von Krankheiten wie anhaltenden viralen, bakteriellen oder parasitären Infektionen und auch chronischen Störungen, wie Krebs.
Die bevorzugten Oligonukleotide zur Verwendung in Hilfsstoffen oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt zwei oder mehr Dinukleotid-CpG-Motive, die durch mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens sechs oder mehr Nukleotide getrennt sind. Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Internukleotid im Oligonukleotid Dithiophosphat oder besonders bevorzugt eine Thiophosphat-Bindung, obwohl Phosphodiester und andere Internukleotid-Bindungen im Umfang der Erfindung sind, einschließlich von Oligonukleotiden mit gemischten Internukleotid-Bindungen. Verfahren zur Herstellung von Thiophosphat-Oligonukleotiden oder Dithiophosphat werden in US 5 666 153 , US 5 278 302 und WO 95/26204 beschrieben.
Beispiele für bevorzugte Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen. Die Sequenzen enthalten bevorzugt Thiophosphat-modifizierte Internukleotid-Bindungen.

OLIGO 1 (SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

Alternative CpG-Oligonukleotide können die obigen bevorzugten Sequenzen umfassen, indem sie folgenlose (inkonsequente) Deletionen oder Additionen daran aufweisen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten CpG-Oligonukleotide können durch jedes fachbekannte Verfahren synthetisiert werden (z.B. EP 468 520 ). Zweckmäßig können solche Oligonukleotide unter Verwendung eines Syntheseautomaten synthetisiert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Internukleotidbindung im Oligonukleotid Dithiophosphat oder besonders bevorzugt eine Thiophosphat-Bindung, obwohl Phosphodiester im Umfang der vorliegenden Erfindung sind. Oligonukleotide, die unterschiedliche Internukleotidbindungen umfassen, werden erwogen, z.B. gemischte Thiophosphatphosphodiester. Andere Internukleotid-Bindungen, die das Oligonukleotid stabilisieren, können verwendet werden.
Die Saponine, die in den erfindungsgemäßen Hilfsstoffkombinationen verwendet werden können, schließen diejenigen ein, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammen, bezeichnet als Quil A, und Fraktionen davon, beschrieben in US 5 057 540 und "Saponins as vaccine adjuvants", C.R. Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12(1-2): 1–55; und EP 0 362 279 B1 . Besonders bevorzugte Fraktionen von Quil A sind QS21, QS7 und QS17.
β-Escin ist ein anderes bevorzugtes hämolytisches Saponin zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Hilfsstoffzusammensetzungen. Escin wird im Merck-Index (12. Auflage, Eintrag 3737) als eine Mischung von Saponinen beschrieben, die in den Samen der Roßkastanie, Lat.: Aesculus hippocastanum, auftreten. Seine Isolierung wird durch Chromatographie und Reinigung (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) und durch Ionenaustauscherharze (Erbring et al., US 3 238 190 ) beschrieben. Fraktionen von Escin, α und β, wurden gereinigt, und es wurde gezeigt, daß sie biologisch aktiv sind (M. Yoshikawa et al. (Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) Aug. 1996; 44(8): 1454–1464)). β-Escin ist ebenfalls als Aescin bekannt.
Ein anderes bevorzugtes hämolytisches Saponin zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Digitonin. Digitonin wird im Merck-Index (12. Auflage, Eintrag 3204) als Saponin beschrieben, das aus den Samen von Digitalis purpurea stammt und gemäß dem Verfahren gereinigt wird, das beschrieben wird von Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; und Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem , 1955, 301, 621. Seine Verwendung als klinisches Reagens zur Cholesterol-Bestimmung wird beschrieben.
Die Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung können ferner einen Träger umfassen, so daß das Saponin oder CpG oder beide mit einer partikulären Trägereinheit verbunden sein können, um die Hilfsstoffaktivität der Kombination zu steigern. Besonders bevorzugte systemische Impfstoffe umfassen z.B. ein Trägermolekül.
Das in den erfindungsgemäßen Hilfsstoffkombinationen verwendete CpG kann in freier Lösung sein oder an partikuläre Träger komplexiert sein, wie Mineralsalze (z.B., aber nicht beschränkt auf Aluminium- oder Calciumsalze), Liposome, ISCOMs, Emulsionen (Öl-in-Wasser, Wasser-in-Öl, Wasser-in-Öl-in-Wasser), Polymere (wie z.B., aber nicht beschränkt auf Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyphosphazin, Polyaminosäure, Alginat, Chitosan) oder Mikropartikel. Bevorzugt sind diese Träger kationisch. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ferner ein Antigen, das mit dem CpG-Träger-Komplex verbunden sein kann oder nicht mit dem CpG-Träger-Komplex verbunden sein braucht. In diesem Fall kann das Antigen eine freie Suspension sein oder mit einem separaten Träger verbunden sein.
Die Saponine, die einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden, können in Form von Micellen getrennt sein oder können in Form von großen geordneten Strukturen sein, wie ISCOMs ( EP 0 109 942 B1 ) oder Liposome (WO 96/33739), wenn sie mit Cholesterol und Lipid formuliert werden, oder in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion (WO 95/17210). Die Saponine können bevorzugt mit einem Metallsalz verbunden sein, wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (WO 98/15287). Alternativ kann das Saponin mit einem partikulären Träger wie Chitosan verbunden sein. Das Saponin kann ebenfalls in einem trockenen Zustand sein, wie z.B. als Pulver. Die fertigen Formulierungen besitzen in der Form, in der sie an die Schleimhautoberfläche des Impflings verabreicht werden, bevorzugt eine hämolytische Natur. Das Saponin kann mit dem Antigen entweder durch eine direkte Bindung oder durch Wechselwirkung mit dem gleichen partikulären Trägermolekül physikalisch verbunden sein oder nicht (GB 9822712.7; WO 98116247). Das CpG und Saponin in den Hilfsstoffen und Impfstoffen der vorliegenden Erfindung können selbst separat oder assoziiert sein. Zum Beispiel können das CpG und Saponin in einer freien Suspension sein oder können über einen Träger assoziiert sein, besonders bevorzugt einen partikulären Träger, wie Aluminiumhydroxid, oder durch ein kationisches Liposom oder ISCOM.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Hilfsstoffkombination ist aus einem oder mehreren CpG-Oligonukleotiden zusammengesetzt, die wenigstens 3, bevorzugt wenigstens 6 Nukleotide zwischen zwei benachbarten CG-Motiven enthalten, zusammen mit QS21 und einem partikulären Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Öl-in-Wasser-Emulsion oder DQ umfaßt. Am meisten bevorzugt umfaßt die Hilfsstoffkombination CpG 2006 (SEQ ID NO:4) oder CpG 1758 (SEQ ID NO:2) oder CpG 1826 (SEQ ID NO:1), vermischt mit QS21, und einen partikulären Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder DQ umfaßt. Entsprechend umfassen besonders bevorzugte Impfstoffe z.B. solche Hilfsstoffkombinationen und ein Antigen. Der bevorzugte Impfstoff der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um systemische Immunreaktionen nach Verabreichung an ein Individuum durch den systemischen Weg zu erzeugen.
Die Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung können sowohl als systemischer als auch als mukosaler Hilfsstoff verwendet werden. In einer besonderen Form der Erfindung wird ein systemischer Impfstoff zur Verabreichung durch den systemischen oder parenteralen Weg bereitgestellt, wie z.B. durch intramuskuläre, intradermale, transdermale, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung. Ein bevorzugter Weg der Verabreichung ist über den transdermalen Weg, z.B. durch Hautpflaster.
Die systemischen Impfstoffzubereitungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein Säugetier zu schützen oder zu behandeln, das anfällig für eine Krankheit ist oder daran leidet, mittels Verabreichung des Impfstoffs durch intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale, transdermale, intravenöse oder subkutane Verabreichung. Verfahren der systemischen Verabreichung der Impfstoffzubereitungen können herkömmliche Spritzen und Nadeln einschließen, oder Vorrichtungen, die zur ballistischen Übertragung fester Impfstoffe entwickelt wurden (WO 99/27961), oder eine nadellose Druckflüssigkeitsstrahlvorrichtung ( US 4 596 556 ; US 5 993 412 ), oder transdermale Pflaster (WO 97148440; WO 98/28037). Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls zur Steigerung der Immunogenität von auf die Haut aufgetragenen Antigenen verwendet werden (transdermale oder transkutane Übertragung WO 98/20734; WO 98/28037). Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Übertragungsvorrichtung für die systemische Verabreichung bereit, vorgefüllt mit den Impfstoff- oder Hilfsstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Entsprechend wird ein Verfahren zur Induzierung einer Immunreaktion in einem Individuum bereitgestellt, umfassend die Verabreichung eines Impfstoffs, der ein Antigen und immunstimulatorisches Oligonukleotid, ein Saponin und einen Träger umfaßt, an das Individuum, wobei der Impfstoff auf dem parenteralen oder systemischen Weg verabreicht wird. Bevorzugte Verfahren zur Induzierung einer Immunreaktion umfassen die Verabreichung eines Impfstoffs, der ein Oligonukleotid mit SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 oder 5 umfaßt, mit einem aus QuilA stammenden Saponin, wie QS21, und einem Träger, wie einer Öl-in-Wasser-Emulsion, einem Cholesterol-enthaltenden Liposom oder Alaun.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Impfstoffzubereitungen verwendet werden, um ein Säugetier zu schützen oder zu behandeln, das an einer Krankheit leidet oder dafür anfällig ist, mittels Verabreichen des Impfstoffs auf dem mukosalen Weg, wie dem oralen/Ernährungs- oder nasalen Weg. Alternative mukosale Wege sind intravaginal und intrarektal. Der bevorzugte mukosale Weg der Verabreichung ist über den nasalen Weg, bezeichnet als intranasale Impfung. Verfahren der intranasalen Impfung sind allgemein fachbekannt, einschließlich der Verabreichung einer Tröpfchen-, Spray- oder trockenen gepulverten Form des Impfstoffs in den Nasenrachen des zu immunisierenden Individuums. Vernebelte oder aerolisierte Impfstofformulierungen bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung. Enterische Formulierungen, wie magensaftresistente Kapseln und Granalien zur oralen Verabreichung, Suppositorien zur rektalen oder vaginalen Verabreichung, bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung.
Die Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung stellen eine Klasse von mukosalen Hilfsstoffen dar, die geeignet zur Anwendung bei Menschen sind, um die systemische Impfung durch die mukosale Impfung zu ersetzen. In einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung können reine Saponine, wie Quil A oder Derivate davon, einschließlich QS21; Escin; Digitonin; oder Gypsophila- oder Chenopodium quinoa-Saponine in Kombination mit immunstimulatorischen Oligonukleotiden als Hilfsstoffe zur mukosalen Verabreichung von Antigenen verwendet werden, um eine systemische Immunreaktion zu erreichen.
Die Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung werden in der Formulierung von Impfstoffen verwendet, wobei die Impfstoffe auf dem systemischen oder mukosalen Weg verabreicht werden können. Wenn die Impfstoffe zur mukosalen Verabreichung verwendet werden, umfaßt die Hilfsstoffkombination bevorzugt ein hämolytisches Saponin.
Zur mukosalen Verabreichung umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung bevorzugt ein hämolytisches Saponin. Hämolytisches Saponin oder hämolytische Saponin-Zubereitung innerhalb der Bedeutung dieser Erfindung wird unter Bezugnahme auf den folgenden Test bestimmt.

1. Frisches Blut aus Meerschweinchen wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 3-mal in einer Tischzentrifuge gewaschen. Nach Resuspendieren auf das ursprüngliche Volumen wird das Blut weiter 10-fach in PBS verdünnt.
2. 50 μl dieser Blutsuspension werden zu 800 μl PBS gegeben, das zweifache Verdünnungen von Tensid oder Saponin enthält.
3. Nach 8 Stunden wird die Hämolyse visuell oder durch Messung der optischen Dichte des Überstandes bewertet. Die Gegenwart eines roten Überstandes, der Licht bei 570 nm absorbiert, zeigt die Gegenwart von Hämolyse an.
4. Die Ergebnisse werden als Konzentration der ersten Saponin-Verdünnung ausgedrückt, bei der keine Hämolyse mehr auftritt.

Für die Zwecke dieser Erfindung ist die Saponin-Hilfsstoffzubereitung hämolytisch, falls sie die Erythrozyten bei einer Konzentration von weniger als 0,1% lysiert. Als Bezugsmittel sind im wesentlichen reine Proben von guilA, QS21, QS7, Digitonin und β-Escin alle hämolytische Saponine, wie sie in diesem Test definiert werden. Innerhalb der inhärenten experimentellen Varianz eines solchen biologischen Tests besitzen die Saponine der vorliegenden Erfindung bevorzugt eine hämolytische Aktivität von etwa 0,5–0,00001%, besonders bevorzugt von 0,05–0,00001%, noch mehr bevorzugt von 0,005–0,00001% und am meisten bevorzugt von 0,001–0,0004%. Idealerweise sollten die Saponine eine hämolytische Aktivität ähnlich (d.h. innerhalb eines 10-fachen Unterschieds) derjenigen von QS21 haben.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem oralen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen kann der pharmazeutisch akzeptable Exzipient ebenfalls alkalische Puffer oder enterische Kapseln oder Mikrogranalien einschließen. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem vaginalen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen können die pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten ebenfalls Emul gatoren, Polymere, wie CARBOPOL^®, und andere bekannte Stabilisatoren für Vaginalcremes und -suppositorien einschließen. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem rektalen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen können die Exzipienten ebenfalls Wachse und Polymere einschließen, die fachbekannt zur Bildung rektaler Suppositorien sind.
Zubereitungen aus mehr als einem Saponin in den Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel Kombinationen aus wenigstens zweien der folgenden Gruppe, die QS21, QS7, Quil A, β-Escin oder Digitonin umfaßt. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Kombinationen aus mehr als einem immunstimulatorischen Oligonukleotid umfassen.
In einer ähnlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die CpG/Saponin-Kombinationen sowohl für die systemische als auch mukosale Verabreichung ferner mit anderen Hilfsstoffen kombiniert werden, einschließlich Monophosphoryllipid A und seinem nicht-toxischen Derivat 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A. Alternativ können die Saponin-Formulierungen mit Impfstoffträgern kombiniert werden, die zusammengesetzt sind aus Chitosan oder anderen polykationischen Polymeren, Polylactid- und Polylactid-co-glycolid-Partikeln, Polymermatrix auf Basis von Poly-N-acetylglucosamin, Partikeln, die aus Polysacchariden oder chemisch modifizierten Polysacchariden zusammengesetzt sind, Liposomen und Partikeln auf Lipidbasis, Partikeln, die aus Glycerin-Monoestern zusammengesetzt sind, etc. Die Saponine können ebenfalls in Gegenwart von Cholesterol formuliert werden, um partikuläre Strukturen zu bilden, wie Liposome oder ISCOMs. Außerdem können die Saponine zusammen mit einem Polyoxyethylenether oder -ester formuliert werden, entweder in einer nicht-partikulären Lösung und Suspension oder in einer partikulären Struktur, wie paucilamellarem Liposom oder ISCOM. Die Saponine können ebenfalls mit Exzipienten wie Carbopol^® formuliert werden, um die Viskosität zu erhöhen, oder können in einer Trockenpulverform mit einem Pulverexzipienten wie Lactose formuliert werden.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A ist ein allgemein bekannter Hilfsstoff, der von Ribi Immunochem, Montana, hergestellt wird. Es kann durch die in GB 2122204B gelehrten Verfahren hergestellt werden. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipd A ist in der Form einer Emulsion mit einer geringen Teilchengröße von weniger als 0,2 μm Durchmesser ( EP 0 689 451 B1 ). Besonders bevorzugte Hilfsstoffe sind Kombinationen aus 3D-MPL und QS21 ( EP 0 671 948 B1 ), Öl-in-Wasser-Emulsionen, die 3D-MPL und QS21 umfassen (WO 95/17210, WO 98/56414), oder 3D-MPL, das mit anderen Trägern formuliert ist ( EP 0 689 454 B1 ).
Bevorzugt enthalten die Impfstofformulierungen der vorliegenden Erfindung ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung, die eine Immunreaktion gegen ein humanes Pathogen hervorrufen kann, wobei das Antigen oder die antigene Zusammensetzung abstammt aus HIV-1 (wie tat, nef, gb120 oder gp160), humanen Herpesviren, wie gD oder Derivaten davon, oder Immediate Early Protein, wie ICP27 aus HSV1 oder HSV2, Cytomegalovirus (speziell human) (wie gB oder Derivate davon), Rotavirus (einschließlich lebend-abgeschwächter Viren), Epstein-Barr-Virus (wie gp350 oder Derivate davon), Varicella Zoster-Virus (wie gpI, II und IE63), oder aus einem Hepatitisvirus, wie Hepatitis B-Virus (z.B. Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon), Hepatitis A-Virus, Hepatitis C-Virus und Hepatitis E-Virus, oder aus anderen viralen Pathogenen, wie Paramyxoviren; Respiratory Syncytial-Virus (wie F- und G-Proteine oder Derivate davon), Parainfluenza-Virus, Masernvirus, Mumpsvirus, humane Papillomaviren (z.B. HPV6, 11, 16, 18, ...), Flaviviren (z.B. Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, Zecken-bürtiges Enzephalitisvirus, Japanisches Enzephalitisvirus) oder Grippevirus (ganzes Lebend- oder inaktiviertes Virus, geteiltes Grippevirus, gezüchtet in Eiern oder in MDCK-Zellen), oder ganze Grippevirosomen (wie von R. Gluck beschrieben, Vaccine, 1992, 10, 915–920), oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon, wie HA-, NP-, NA- oder M-Proteine oder Kombinationen daraus), oder abstammend aus bakteriellen Pathogenen, wie Neisseria spp., einschließlich N. gonorrhea und N. meningitidis (z.B. Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, Transferrin-bindende Proteine, Lactoferrin-bindende Proteine, PilC, Adhäsine); S. pyogenes (z.B. M-Proteine oder Fragmente davon, C5A-Protease, Lipoteichonsäuren), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., einschließlich M. catarrhalis, ebenfalls bekannt als Branhamella catarrhalis (z.B. Adhäsine und Invasine mit hohem und niedrigem Molekulargewicht); Bordetella spp., einschließlich B. pertussis (z.B. Pertactin, Pertussistoxin oder Derivate davon, filamentöses Hämagglutinin, Adenylatcyclase, Fimbrien), B. parapertussis und B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., einschließlich M. tuberculosis (z.B. ESAT6, Antigen 85A, -B oder -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberuclosis, M. smegmatis; Legionella spp., einschließlich L. pneumophila; Escherichia spp., einschließlich enterotoxisches E. coli (z.B Kolonisierungsfaktoren, hitzelabiles Toxin oder Derivate davon, hitzestabiles Toxin oder Derivate davon), enterohämorrhagisches E. coli, enteropathogenes E. coli (z.B. Shigatoxin-artiges Toxin oder Derivate davon); Vibrio spp., einschließlich V. cholera (z.B. Choleratoxin oder Derivate davon); Shigella spp., einschließlich S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., einschließlich Y. enterocolitica (z.B. ein Yop-Protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., einschließlich C. jejuni (z.B. Toxine, Adhäsine und Invasine) und C. coli; Salmonella spp., einschließlich S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., einschließlich L. monocytogenes; Helicobacter spp., einschließlich H. pylori (z.B. Urease, Catalase, vakuolierendes Toxin); Pseudomonas spp., einschließlich P. aeruginosa; Staphylococcus spp., einschließlich S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., einschließlich E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., einschließlich C. tetani (z.B. Tetanustoxin und Derivate davon), C. botulinum (z.B. Botulinumtoxin und Derivate davon), C. difficile (z.B. Clostridiumtoxine A oder B und Derivate davon); Bacillus spp., einschließlich B. anthracis (z.B. Botulinumtoxin und Derivate davon); Corynebacterium spp., einschließlich C. diphtheriae (z.B. Diphteriatoxin und Derivate davon); Borrelia spp., einschließlich B. burgdorferi (z.B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (z.B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (z.B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (z.B. OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., einschließlich E. equi und der Verursacher der humanen granulocytischen Ehrlichiose; Rickettsia spp., einschließlich R. rickettsii; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis (z.B. MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. pneumoniae (z.B. MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. psittaci; Leptospira spp., einschließlich L. interrogans; Treponema spp., einschließlich T. pallidum (z.B. die seltenen äußeren Membranproteine), T. denticola, T. hyodysenteriae; oder abstammend aus Parasiten, wie Plasmodium spp., einschließlich P. falciparum; Toxoplasma spp., einschließlich T. gondii (z.B. SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., einschließlich E. histolytica; Babesia spp., einschließlich B. microti; Trypanosoma spp., einschließlich T. cruzi; Giardia spp., einschließlich G. lamblia; Leshmania spp., einschließlich L. major; Pneumocystis spp., einschließlich P. carinii; Trichomonas spp., einschließlich T. vaginalis; Schisostoma spp., einschließlich S. mansoni, oder abstammend aus Hefe, wie Candida spp., einschließlich C. albicans; Cryptococcus spp., einschließlich C. neoformans.
Andere bevorzugte spezifische Antigene für M. tuberculosis sind z.B. Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 und hTCC1 (WO 99/51748). Proteine für M. tuberculosis schließen ebenfalls Fusionsproteine und Varianten davon ein, wobei wenigstens zwei, bevorzugt drei Polypeptide von M. tuberculosis zu einem größeren Protein fusioniert sind. Bevorzugte Fusionen schließen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MT2-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748) ein.
Am meisten bevorzugte Antigene für Chlamydia schließen z.B. das High Molecular Weight Protein (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 ( EP 366 412 ) und mutmaßliche Membranproteine ("putative membrane proteins", Pmps) ein. Andere Chlamydia-Antigene der Impfstofformulierung können aus der in WO 99/28475 beschriebenen Gruppe ausgewählt werden.
Bevorzugte bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die aus Streptococcus spp. stammen, einschließlich S. pneumoniae (z.B. Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, PsaA, PspA, Streptolysin, Cholinbindende Proteine), und das Proteinantigen Pneumolysin (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1008, Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337–342) und mutierte detoxifizierte Derivate davon (WO 90/06951; WO 99/03884). Andere bevorzugte bakterielle Impfstoffe umfassen Antigene, die aus Haemophilus spp. stammen, einschließlich H, influenzae Typ B (z.B. PRP und Konjugate davon), nicht-typifizierbares H. influenzae, z.B. OMP26, Adhäsine mit hohem Molekulargewicht, P5, P6, Protein D und Lipoprotein D und Fimbrin und aus Fimbrin stammende Peptide ( US 5 843 464 ) oder multiple Kopievarianten oder Fusionsproteine davon.
Derivate des Hepatitis B-Oberflächenantigens sind allgemein fachbekannt und schließen u.a. diejenigen PreS1, PreS2 S-Antigene ein, die in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-414 374, EP-A-0 304 578 und EP 198 474 beschrieben werden. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die Impfstofformulierung der Erfindung das HIV-1-Antigen, gp120, speziell bei Expression in CHO-Zellen. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Impfstofforumulierung der Erfindung gD2t wie hier oben definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Impfstoffe, die den beanspruchten Hilfsstoff enthalten, Antigen, das aus dem humanen Papillomavirus (HPV), das als verantwortlich für Genitalwarzen betrachtet wird (HPV6 oder HPV11 und andere), und aus den HPV-Viren stammt, die für Gebärmutterhalskrebs verantwortlich sind (HPV16, HPV18 und andere).
Besonders bevorzugte Formen von prophylaktischem oder therapeutischem Impfstoff für Genitalwarzen umfassen L1-Partikel oder Kapsomere und Fusionsproteine, die ein oder mehrere Antigene umfassen, die aus den HPV6- und HPV11-Proteinen E6, E7, L1 und L2 ausgewählt sind.
Die am meisten bevorzugten Formen von Fusionsprotein sind: L2E7, wie in WO 96/26277 offenbart, und Protein D(1/3)-E7, offenbart in GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).
Eine bevorzugte HPV-Impfstoffzusammensetzung zur Prophylaxe oder Therapie von Gebärmutterhalsinfektion oder -krebs kann HPV16- oder -18-Antigene umfassen. Zum Beispiel L1- oder L2-Antigen-Monomere oder L1- oder L2-Antigene, die zusammen als ein virusartiges Partikel ("virus like particle", VLP) angeboten werden, oder das L1-Protein allein, angeboten allein in einer VLP- oder Kapsomerstruktur. Solche Antigene, virusartigen Partikel und Kapsomere sind als solche bekannt. Siehe z.B. WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 und WO 93/02184.
Zusätzliche frühe Proteine können allein oder als Fusionsproteine eingeschlossen werden, wie z.B. E7, E2 oder vorzugsweise E5; besonders bevorzugte Ausführungsformen davon schließen ein VLP ein, das L1E7-Fusionsproteine umfaßt (WO 96/11272).
Besonders bevorzugt HPV16-Antigene umfassen die frühen Proteine E6 oder E7 in Fusion mit einem Protein D-Träger zur Bildung von Protein D-E6- oder -E7-Fusionen aus HPV16 oder Kombinationen daraus; oder Kombination von E6 oder -E7 mit L2 (WO 96/26277).
Alternativ können die HPV16 oder -18 frühen Proteine E6 und E7 in einem einzelnen Molekül dargestellt werden, bevorzugt in einer Protein D-E6/E7-Fusion. Ein solcher Impfstoff kann gegebenenfalls eines oder beide der E6- und E7-Protein aus HPV18 enthalten, bevorzugt in der Form eines Protein D-E6- oder Protein D-E7-Fusionsproteins oder eines Protein D-E6/E7-Fusionsproteins.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich Antigene aus anderen HPV-Stämmen umfassen, bevorzugt aus den Stämmen HPV31 oder 33.
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ferner Antigene, die aus Parasiten stammen, die Malaria verursachen. Zum Beispiel schließen bevorzugte Antigene aus Plasmodia falciparum RTS,S und TRAP ein. RTS ist ein Hybridprotein, das im wesentlichen den gesamten C-terminalen Teil des Circumsporozoit-(CS)-Proteins von P. falciparum umfaßt, gebunden über vier Aminosäuren des preS2-Teils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen-(S)-Antigen des Hepatitis B-Virus. Seine vollständige Struktur wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP95/02591 offenbart, veröffentlicht unter der Nr. WO 93/10152 und unter Beanspruchung der Priorität der GB-Patentanmeldung Nr. 9124390.7. Bei Expression in Hefe wird RTS als ein Lipoproteinpartikel erzeugt, und bei seiner Coexpression mit dem S-Antigen aus HBV erzeugt es ein als RTS,S bekanntes gemischtes Partikel. TRAP-Antigene werden in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB89/00895 beschrieben, veröffentlicht als WO 90/01496. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Malariaimpfstoff, worin die antigene Zubereitung eine Kombination der RTS,S- und TRAP-Antigene umfaßt. Andere Plasmodia-Antigene, die wahrscheinliche Kandidaten für Komponenten eines Malaria-Mehrstufenimpfstoffs sind, sind P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STRAP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 und ihre Analoga in Plasmodium spp.
Die Formulierungen können ebenfalls ein Antitumor-Antigen enthalten und können nützlich zur immuntherapeutischen Behandlung von Krebs sein. Zum Beispiel findet die Hilfsstofformulierung Anwendung mit Tumorabstoßungsantigenen, wie denjenigen für Prostata-, Brust-, kolorektalen, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren- oder Melanomkrebs. Exemplarische Antigene schließen MAGE 1 und MAGE 3 oder andere MAGE-Antigene (zur Behandlung von Melanom), PRAME, BAGE oder GAGE ein (Robbins und Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, S. 628–636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (eingereicht 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, S. 293). Tatsächlich werden diese Antigene in einer großen Vielzahl von Tumortypen exprimiert, wie Melanom, Lungenkarzinom, Sarkom und Blasenkarzinom. Andere tumorspezifische Antigene sind geeignet zur Verwendung mit den Hilfsstoffen der vorliegenden Erfindung und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf tumorspezifische Ganglioside, prostataspezifisches Antigen (PSA) oder Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, Mammaglobin, MUC-1, karzinoembryonisches Antigen (CEA). Entsprechend wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff bereitgestellt, der eine erfindungsgemäße Hilfsstoffzusammensetzung und ein Tumorabstoßungsantigen umfaßt.
Es ist ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung, daß die Impfstoffe ein Tumorantigen umfassen; solche Impfstoffe sind überraschend wirksam in der Therapie von Krebs, wie Prostata-, Brust-, kolorektalem, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren-, Eierstock- oder Melanomkrebs. Entsprechend können die Formulierungen tumorassoziierte Antigene sowie Antigene enthalten, die mit Tumorunterstützungsmechanismen assoziiert sind (z.B. Angiogenese, Tumorbefall). Zusätzlich umfassen Antigene, die besonders relevant für Impfstoffe in der Therapie von Krebs sind, ebenfalls prostataspezifisches Membranantigen (PSMA), Prostata-Stammzellantigen (PSCA), Tyrosinase, Survivin, NY-ESO1, Prostase, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Zusätzlich kann das Antigen ein Selbstpeptidhormon sein, wie ein Gonadotrophinhormon-freisetzendes Hormon voller Länge (GnRH, WO 95/20600), ein kurzes Peptid von 10 Aminosäuren Länge, das nützlich in der Behandlung von Krebs oder in der Immunkastration ist.
Es wird vorhergesehen, daß Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Formulierung von Impfstoffen verwendet werden, die aus Borrelia sp. stammende Antigene enthalten. Zum Beispiel können Antigene Nukleinsäure, aus Pathogen stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, rekombinant erzeugtes Protein oder Peptide und chimäre Fusionsproteine einschließen. Insbesondere ist das Antigen OspA. Das OspA kann ein vollständiges reifes Protein in einer lipidierten Form aufgrund der Wirtszelle (E. coli) sein, als (Lipo-OspA) bezeichnet, oder ein nicht-lipidiertes Derivat. Solche nicht-lipidierten Derivate schließen das nicht-lipidierte NS1-OspA-Fusionsprotein ein, das die ersten 81 N-terminalen Aminosäuren des Nichtstrukturproteins (NS1) des Grippevirus aufweist, und das vollständige OspA-Protein, und ein anderes, MDP-OspA, ist eine nicht-lipidierte Form von OspA, die drei zusätzliche N-terminale Aminosäuren trägt.
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können zur Prophylaxe oder Therapie von Allergie verwendet werden. Solche Impfstoffe würden allergenspezifische (z.B. Der p1) und allergen-nicht-spezifische Antigene umfassen (z.B. aus humanem IgE stammende Peptide, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Stanworth-Decapeptid ( EP 0 477 231 B1 )).
Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Prophylaxe oder Therapie von anderen chronischen Störungen als Allergie, Krebs oder infektiösen Krankheiten verwendet werden. Solche chronischen Störungen sind Krankheiten wie Atherosklerose und Alzheimer.
Antigene, die für die Prophylaxe und Therapie von Patienten relevant sind, die an neurodegenerativer Alzheimer-Krankheit leiden oder dafür anfällig sind, sind insbesondere das N-terminale Fragment mit 39–43 Aminosäuren (Aβ) des Amyloid-Vorläuferproteins und kleinere Fragmente. Dieses Antigen wird in WO 99/27944 (Athena Neurosciences) offenbart.
Die Proteinmenge in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine Immunschutzreaktion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird abhängig davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt und wie es angeboten wird. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1–1000 μg Protein umfassen wird, bevorzugt 1–500 μg, bevorzugt 1–100 μg, am meisten bevorzugt 1–50 μg. Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung der geeigneten Immunreaktionen in geimpften Probanden beinhalten. Im Anschluß an eine Erstimpfung können Patienten eine oder mehrere Auffrischungsimpfungen in angemessenen Abständen erhalten. Eine solche Impfstofformulierung kann auf eine Schleimhautoberfläche eines Säugetiers entweder in einer Erstimpfungs- oder Auffrischungsimpfungsdosis angewendet werden; oder kann alternativ systemisch verabreicht werden, z.B. über die transdermalen, subkutanen oder intramuskulären Wege.
Die Menge von CpG oder immunstimulatorischen Oligonukleotiden in den Hilfsstoffen oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung ist allgemein klein, aber kann abhängig von der Impfstofformulierung im Bereich von 1–1000 μg/Dosis sein, bevorzugt 1–500 μg pro Dosis und besonders bevorzugt zwischen 1 und 100 μg pro Dosis.
Die Saponinmenge zur Verwendung in den Hilfsstoffen der vorliegenden Erfindung kann im Bereich von 1–1000 μg pro Dosis sein, bevorzugt 1–500 μg pro Dosis, besonders bevorzugt 1–250 μg pro Dosis und am meisten bevorzugt zwischen 1 und 100 μg pro Dosis. Das Verhältnis CpG:Saponin (G/G) wird deshalb im Bereich von 1:1000 bis 1000:1 sein und wird typischerweise im Bereich von 1:100 bis 100:1 und bevorzugt im Bereich von 1:10 bis 1:1 oder 1:1 bis 10:1 und am meisten bevorzugt 1:1, 4:1 oder 10:1 sein.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können sowohl für prophylaktische als auch für therapeutische Zwecke verwendet werden. Entsprechend wird die Verwendung einer Kombination aus einem Saponin und einem CpG-Molekül in der Herstellung eines Impfstoffs zur Prophylaxe und Behandlung von viralen, bakteriellen, parasitären Infektionen, Allergie, Krebs und anderen nicht-chronischen Störungen bereitgestellt. Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers vor, das an einer infektiösen Krankheit oder Krebs oder Allergie oder Autoimmunerkrankung leidet oder dafür anfällig ist. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoff- oder Hilfsstoffkombination bereitgestellt, die ein Saponin und CpG wie hier zur Verwendung als Medikament beschrieben umfaßt. Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "New Trends and Developments in Vaccines", herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978.
Es wird vorhergesehen, daß Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Formulierung vom Impfstoffen verwendet werden, die aus einer großen Vielzahl von Quellen stammende Antigene enthalten. Zum Beispiel können Antigen einschließen: humane, bakterielle oder virale Nukleinsäure, aus Pathogen stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, aus Tumor stammendes Antigen oder antigene Zubereitungen, aus dem Wirt stammende Antigene, einschließlich aus IgE stammende Peptide, wie das Histaminfreisetzende Decapeptid von IgE (bekannt als Stanworth-Decapeptid), rekombinant erzeugtes Protein oder Peptide und chimäre Fusionsproteine.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine systemische Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die ein Antigen, ein Saponin und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfaßt. Entsprechend wird ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereitgestellt, das an einer Krankheit leidet oder dafür anfällig ist, durch die Verabreichung einer Zusammensetzung im wesentlichen wie hier beschrieben auf dem systemischen Weg an das Individuum. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Verhinderung der Infektion eines Individuums mit einer Krankheit, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die infektiöse, bakterielle und virale Krankheiten, parasitäre Krankheiten, Prostata-, Brust-, kolorektalen, Lugen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren-, Eierstock- oder Melanomkrebs, nicht-kanzeröse chronische Störungen, Allergie, Alzheimer und Atherosklerose umfaßt, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung wie im wesentlichen hier beschrieben auf dem systemischen Weg an das Individuum.
Alternativ wird durch die vorliegende Erfindung eine mukosale Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die ein Antigen und ein hämolytisches Saponin umfaßt. Entsprechend wird ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereitgestellt, das an einer Krankheit leidet oder dafür anfällig ist, durch die Verabreichung einer Zusammensetzung im wesentlichen wie hier beschrieben an die Schleimhautoberfläche des Individuums.
Außerdem wird ein Verfahren zur Induzierung einer systemischen antigenspezifischen Immunreaktion in einem Säugetier beschrieben, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, die ein Antigen und ein hämolytisches Saponin umfaßt, an eine Schleimhautoberfläche des Säugetiers. Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs oder Hilfsstoffs bereitgestellt, umfassend das Nehmen eines Saponins und das Nehmen eines CpG-Moleküls und ihr Vermischen mit einem Antigen.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch akzeptable Exzipienten zur Verwendung in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung schließen Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und isotonische Pufferlösungen ein.
Figurenbeschreibung
1: OspA-spezifische IgG-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
2: OspA-spezifische LA2-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
3: Gripgestamm-spezifische Serum-IgG-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
4: Grippestamm-spezifische Serum-Hämagglutinierungsinhibierungs-(HAI)-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
5: OspA-spezifische LA2-Titer in Mäusen.
6: gp120-spezifische Lymphoproliferationsaktivität von Milzzellen aus immunisierten Mäusen. Die antigenspezifische Aktivität wird als SI für unterschiedliche Antigenkonzentrationen für alle vier experimentellen Gruppen ausgedrückt.
7: HBsAg-spezifische CTL-Aktivität von Milzzellen aus immunisierten Mäusen. Die Effektorzellaktivität wurde durch Untersuchung der ⁵¹Cr-Freisetzung von P815-Zellen (offene Kreise) oder s-transfizierten P815-Zellen (geschlossene Kreise) bewertet.
8: HBsAg-spezifische Antikörper-Reaktionen in immunisierten Mäusen. Spezifische Antikörpertiter (ausgedrückt als EU/ml) und Isotyp-Profile wurden unter Verwendung von ELISA-Tests ausgewertet. Werte aus vereinigten Seren sind in der Tabelle gezeigt, und Isotyp-Verteilungen sind ebenfalls in einer Graphik dargestellt.
9: HBsAg- und gp120-spezifische Lymphoproliferationsaktivität von Milzzellen aus immunisierten Mäusen. Die antigenspezifische Aktivität wird als SI für unterschiedliche Antigenkonzentrationen für alle vier experimentellen Gruppen ausgedrückt.
10: HBsAg- und gp120-spezifische CTL-Aktivität von Milzzellen aus immunisierten Mäusen. Die Effektorzellaktivität wurde durch Untersuchung der ⁵¹Cr-Freisetzung von Kontroll-P815-Zellen (offene Symbole) oder P815-Zellen bewertet, die ein HBsAg- oder gp120-CTL-Epitop zeigen (geschlossene Symbole).
11: Gp120-spezifische und HbsAg-spezifische Antikörperreaktionen in immunisierten Mäusen. Spezifische Antikörpertiter (ausgedrückt in μg/ml) (11A) und Isotypprofile wurden unter Verwendung von ELISA-Tests ausgewertet. Werte aus vereinigten Seren sind in der Tabelle gezeigt, und Isotypverteilungen sind ebenfalls in einer Graphik dargestellt. 11B zeigt das Isotypmuster von gp120-spezifischen Antikörpern.
12: Zeitabhängige Entwicklung des mittleren Tumorwachstums pro Gruppen von 10 Tieren.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, aber nicht darauf beschränkt.
Beispiel 1: Verwendung von QS21 und CpG zur intranasalen Auffrischung von systemischen Antikörpern gegen Lipo-OspA
In diesem Beispiel untersuchten wird, ob lytische Saponine wie QS21 und Immunstimulantien wie CpG systemische immunologische Reaktionen auf eine intranasale Auffrischungsimpfung von Mäusen in einer synergistischen Weise steigern konnten. Weibliche Balb/c-Mäuse (5 Tiere pro Gruppe) im Alter von 8 Wochen wurden intramuskulär mit lipo-OspA (1 μg) immunisiert, das auf Alaun (50 μg) formuliert war. Nach 3 Monaten wurden die Mäuse intranasal (unter Anästhesie) mit 10 μl einer Lösung aufgefrischt (5 μl pro Nasenloch, übertragen als Tröpfchen mit einer Pipette), die 5 μg lipo-OspA enthielt in entweder A: PBS; B: 20 μg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 μg QS21 (erhalten von Cambridge Biotech, USA); D: 20 μg CpG 1001 + 5 μg QS21; oder E: durch intramuskuläre Injektion von 1 μg lipo-OsapA, adsorbiert auf Alaun (50 μg). 1 und 2 zeigen die OspA-spezifischen IgG-Titer und LA2-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
Verfahren
ELISA zur Messung von OspA-spezifischem Serum-IgG in Mäusen
Maxisorb Nunc-Immunoplatten werden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung von 1 μg/ml OspA, verdünnt in PBS (in Zeilen B bis H der Platte), oder mit 50 μl von 5 μg/ml gereinigtem Ziege-Anti-Maus-Ig (Boehringer) in PBS (Zeile A) beschichtet. Freie Stellen auf den Platten werden unter Verwendung von Sättigungspuffer blockiert (1 Stunde, 37°C): PBS enthaltend 1% BSA, 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (TWEEN 20) und 4% Normalrinderserum (NBS). Dann werden serielle 2-fache Verdünnungen von IgG-Isotypenmischung, verdünnt in Sättigungspuffer (50 μl pro Vertiefung) und hinzugegeben als Standardkurve (Mischung von monoklonalen Maus-Antikörpern IgG1, IgG2a und IgG2b von Sigma, beginnend mit 200 ng/ml und zugegeben zu Zeile A), und Serumproben (beginnend mit einer 1/100-Verdünnung und zugegeben zu Zeilen B bis H) für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten werden dann mit Waschpuffer (PBS, 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (TWEEN 20)) gewaschen (× 3). Dann wird biotinyliertes Ziege-Anti-Maus-IgG (Amersham), verdünnt 1/5000 in Sättigungspuffer, für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert (50 μl/Vertiefung). Nach 3 Spülungen und anschließender Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Amersham) werden die Platten 5-mal gewaschen und für 20 min bei Raumtemperatur mit 50 μl/Vertiefung von Aufdeckungspuffer (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) und H₂O₂ 0,03% in 50 mM pH 4,5 Citratpuffer) inkubiert. Die Aufdeckung wird durch Zugeben von 50 μl/Vertiefung H₂SO₄ 2N beendet. Optische Dichten werden bei 492 und 630 nm unter Verwendung eines Biorad 3550 Immunoreader ausgelesen. Antikörpertiter werden durch das mathematische 4-Parameter-Verfahren unter Verwendung der Software SoftMaxPro berechnet.
Inhibierungstest zur Messung von LA2-artigen Serum-Antikörpertitern gegen lipo-OspA
Antikörpertiter in den Impflingen wurden in bezug auf ihre LA2-artige Spezifität untersucht. LA2 ist ein muriner monoklonaler Antikörper, der ein OspA-Konformationsepitop auf der Oberfläche der Bakterien erkennt, und von dem gezeigt wurde, daß er B. burgdorferi in vitro töten sowie Mäuse gegen eine Exposition mit im Labor gezüchteten Spirochäten schützen kann (U.E. Schaible et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3768–3772). Außerdem wurde gezeigt, daß LA-2-mab mit bakteriziden Antikörpern korreliert, und Untersuchungen zu Humanseren zeigten ebenfalls eine gute Korrelation zwischen den Anti-OspA-IgG-Gesamttitern und den LA-2-Titern (gemäß Messung durch ELISA). Maxisorp Nunc-Immunplatten werden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung von 0,5 μg/ml Lipo-OspA, verdünnt in PBS, beschichtet. Freie Stellen wurden mit Sättigungspuffer für 1 h bei 37°C mit 100 μl/Vertiefung von Sättigungspuffer geblockt: PBS/BSA 1%/Tween 20 0,1%/NBS 4%). Serielle 2-fache Verdünnungen von monoklonalem LA2-Ab (mAb), beginnend mit 4 μg/ml, wurden in Sättigungspuffer (50 μl pro Vertiefung) zur Bildung einer Standardkurve verdünnt. Verdünnungen der Serumproben aus den Impflingen (beginnend mit einer 1/10-Verdünnung) wurden ebenfalls hinzugegeben und die Platten für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden nach der Inkubation 3-mal mit PBS/TWEEN 20 (0,1%) gewaschen. LA2-mAb-Peroxidase-Konjugat (1/10 000), verdünnt in Sättigungspuffer, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben (50 μl/Vertiefung) und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 5 Spülungen werden die Platten für 20 min bei Raumtemperatur (im Dunkeln) mit 50 μl/Vertiefung von Aufdeckungspuffer (OPDA 0,4 mg/ml und H₂O₂ 0,03% in 50 mM pH 4,5 Citratpuffer) inkubiert. Die Reaktion und Farbbildung wurde mit H₂SO₄ 2N beendet. Optische Dichten werden bei 492 und 630 nm unter Verwendung eines Biorad 3550 Immunoreader ausgelesen. LA2-artige Ab-Titer werden durch das mathematische 4-Parameterverfahren unter Verwendung der Software SoftMaxPro berechnet. LA2-artige Antikörpertiter wurden durch Vergleich mit der Standardkurve bestimmt.
Ergebnisse
CpG sowie QS21 verbessern signifikant die intranasale Auffrischung von systemischen Antikörpern gegen Lipo-OspA. Wenn beide Hilfsstoffe kombiniert werden, wird außerdem eine synergistische Wirkung auf diese Reaktionen deutlich gezeigt, speziell in bezug auf LA2-Antikörper. Humorale Reaktionen, die in Gegenwart von QS21 und CpG ausgelöst werden, sind signifikant höher als diejenigen, die durch die parenterale Auffrischung induziert werden. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse deutlich das Potential von intranasalen Formulierungen, die ein lytisches Saponin und ein Immunstimulans kombinieren.
Beispiel 2: Synergistische Kombination von QS21 und CpG zur Steigerung der intranasalen Auffrischung von systemischen Antikörpern gegen das Grippevirus
In diesem Beispiel untersuchten wird, ob hämolytische Saponine wie Qs21 (siehe Beispiel) und Immunstimulantien wie CpG die intranasale Auffrischung von systemischen Antikörpern in Mäusen, die intranasal mit inaktiviertem ganzem Grippevirus stimuliert, in einer synergistischen Weise steigern konnten. Weibliche Balb/c-Mäuse (10 Tiere pro Gruppe) im Alter von 8 Wochen wurden intranasal mit β-Propiolacton-inaktiviertem dreiwertigem ganzem Grippevirus (A/Peking/262/95; A/Johannesburg/33/94; B/Panama/45/90; 5 μg HA/Stamm) zur Nachahmung der natürlichen, bei Menschen auftretenden Stimulation intranasal stimuliert. Nach 28 Tagen wurden die Mäuse intranasal (unter Anästhesie) mit 20 μl von Lösung aufgefrischt (10 μl pro Nasenloch, übertragen als Tröpfchen durch eine Pipette), die 1,5 μg HA/Stamm von β-Propiolacton-inaktiviertem trivalentem ganzem Grippevirus (gleiche Stämme wie in der Stimulationsimmunisierung) enthielt in entweder A: PBS; B: 50 μg CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT, Krieg 2006); C: 4,5 μg QS21 (erhalten von Cambridge Biotech, USA); D: 50 μg CpG + 4,5 μg QS21; oder E: durch intramuskuläre Injektion von 1,5 μg HA/Stamm von trivalentem gespaltenem Grippevirus (gleiche Stämme wie in der Stimulationsimmunisierung). Grippe-Antigene wurden von SSD GmbH (Dresden, Deutschland) bereitgestellt. 3 und 4 zeigen die Grippestammspezifischen Serum-IgG-Titer und Hämagglutinierungsinhibierungs-(HAI)-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
Verfahren
ELISA zur Messung von Antigrippe-IgG-Titern in Mäusen
Maxisorp Nunc-Immunoplatten werden über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Vertiefung von 1 μg/ml ganzem Grippevirus-Antigen, verdünnt in PBS (in Zeilen B bis H der Platte), oder mit 50 μl von 5 μg/ml gereinigtem Ziege-Anti-Maus-Ig (Boehringer) in PBS (Zeile A) beschichtet. Freie Stellen auf den Platten werden unter Verwendung von Sättigungspuffer blockiert (1 Stunde, 37°C): PBS, enthaltend 1% BSA, 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (TWEEN 20) und 4% Normalrinderserum (NBS). Dann werden serielle 2-fache Verdünnungen von IgG-Isotypenmischung, verdünnt in Sättigungspuffer (50 μl pro Vertiefung) und zugegeben als Standardkurve (Mischung von monoklonalen Maus-Antikörpern IgG1, IgG2a und IgG2b von Sigma, beginnend mit 200 ng/ml und zugegeben zu Zeile A), und Serumproben (beginnend mit einer 1/100-Verdünnung und zugegeben zu Zeilen B bis H) für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten werden dann mit Waschpuffer (PBS, 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (TWEEN 20)) gewaschen (× 3). Dann wird biotinyliertes Ziege-Anti-Maus-IgG (Amersham), verdünnt 1/5000 in Sättigungspuffer, für 1 h 30 min bei 37°C inkubiert (50 μl/Vertiefung). Nach drei Spülungen und anschließender Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Amersham) werden die Platten 5-mal gewaschen und für 20 min bei Raumtemperatur mit 50 μl/Vertiefung von Aufdeckungspuffer (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) und H₂O₂ 0,035 in 50 mM pH 4,5 Citratpuffer) inkubiert. Die Aufdeckung wird durch Zugabe von 50 μl/Vertiefung von H₂SO₄ 2N beendet. Optische Dichten werden bei 492 und 630 nm unter Verwendung eines Biorad 3550 Immunoreader ausgelesen. Antikörpertiter werden durch das mathematische 4-Parameter-Verfahren unter Verwendung der Software SoftMaxPro berechnet. Das für die Beschichtung verwendete ganze Grippevirus (Stamm A/Peking/262/95), inaktiviert mit β-Propiolacton (BPL), wird von SSD GmbH (Dresden, Deutschland) bereitgestellt.
Hämagglutinierungsinhibierungs-(HAI)-Aktivität von Grippe-spezifischen Serum-Abs in Mäusen
Seren (25 μl) werden zuerst für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) mit 100 μl Boratpuffer 0,5 M (pH 9) und 125 μl von Dade Behring erworbenem Kaolin behandelt. Nach Zentrifugieren (30 min, 3000 U/min oder 860 g) werden 100 μl Überstand (entsprechend einer 1/10 Verdünnung des Serums) entnommen und für 1 Stunde bei 4°C mit 0,5% roten Blutkörperchen aus Huhn inkubiert. Der Überstand wird nach Zentrifugieren für 10 Minuten mit 3200 U/min (970 g) aufgefangen. Beide Vorgänge werden zur Eliminierung der in den Seren enthaltenen natürlichen Hämagglutinierungsfaktoren durchgeführt. Dann werden 25 μl behandelte Seren in 25 μl PBS in Greiner-Platten mit 96 Vertiefungen verdünnt (serielle 2-fache Verdünnungen, ausgehend von 1/20). BPL-inaktiviertes ganzes Virus wird mit einer Konzentration von 4 Hämagglutinierungs-Einheiten hinzugegeben (25 μl/Vertiefung) (d.h. mit einer Verdünnung, die 4-fach niedriger als die letzte ist, die eine Agglutinierung von roten Blutkörperchen hervorruft) für 30 Minuten bei RT unter Rühren. Rote Blutkörperchen aus Huhn werden dann für 1 Stunde bei RT hinzugegeben (25 μl/Vertiefung). Platten werden schließlich über Nacht bei 4°C aufbewahrt, bevor sie ausgelesen werden. Der HAI-Titer entspricht der letzten Serumverdünnung, die die Virus-induzierte Hämagglutinierung inhibiert.
Ergebnisse
CpG sowie QS21 verbessern nicht die intranasale Auffrischung von IgG- oder HAI-Antikörpern gegen Grippestämme. Wenn jedoch beide Hilfsstoffe kombiniert werden, wird eine synergistische Wirkung auf diese Reaktionen deutlich gezeigt. Die HAI-Reaktionen, die in Gegenwart von QS21 und CpG hervorgerufen wurden, sind sogar ähnlicher als diejenigen, die durch die parenterale Auffrischung induziert wurden. Diese Ergebnisse bestätigen das Potential intranasaler Formulierung, die ein hämolytisches Saponin und ein Immumstimulans kombinieren. Sie zeigen ebenfalls, daß mehrere CpG-Sequenzen in diesem Zusammenhang wirksam sein können (Krieg 2006 im vorliegenden Beispiel und Krieg 1826 in den Beispielen 3 und 5).
Beispiel 3: Synergistische Komponente von β-Escin und CpG zur Steigerung der intranasalen Auffrischung systemischer Antikörper gegen Lipo-OspA
Wir bewerten im vorliegenden Beispiel die Möglichkeit, daß eine Synergie ähnlich derjenigen, die zwischen QS21 und CpG beobachtet wird, mit anderen hämolytischen Saponinen (siehe Beispiel), wie β-Escin, erhalten werden könnte. Das nicht-hämolytische Saponin, Glycyrrhizinsäure, wird ebenfalls getestet. Weibliche Balb/c-Mäuse (6 Tiere pro Gruppe) im Alter von 8 Wochen wurde intramuskulär mit Lipo-OspA (1 μg) stimuliert, das auf Alaun (50 μg) formuliert war. Nach 3 Monaten wurden die Mäuse intranasal (unter Anästhesie) mit 10 μl von Lösung aufgefrischt (5 μl pro Nasenloch, übertragen als Tröpfchen durch eine Pipette), die 5 μg Lipo-OspA enthielt in entweder A: PBS; B: 50 μg CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); C: 5 μg β-Escin (erworben von Sigma); D: 50 μg CpG 1001 + 5 μg β-Escin; E: 5 μg Glycyrrhizinsäure (erworben von Sigma); F: 50 μg CpG 1001 + 5 μg Glycyrrhizinsäure oder G: durch intramuskuläre Injektion von 1 μg Lipo-OspA, adsorbiert auf Alaun (50 μg). 5 zeigt die OspA-spezifischen LA2-Titer 14 Tage nach der nasalen Auffrischung.
Verfahren
Die Verfahren sind die gleichen wie in Beispiel 1 aufgeführt.
Ergebnisse
β-Escin und CpG wirken synergistisch zur Steigerung der intranasalen Auffrischung von systemischen LA2-Abs. Diese Kombination ruft stärker erhöhte Ab-Reaktionen als die parenterale Auffrischung hervor. Andererseits wird ein solcher Synergismus nicht durch Kombinieren von CpG mit Glycyrrhizinsäure erhalten.
Diese Ergebnisse und die vorhergehenden dieses Patents zeigen zusammengenommen die Fähigkeit von CpG und unterschiedlichen hämolytischen Saponinen zur Unterstützung von Immunreaktionen in einer synergistischen weise.
Beispiel 4: Immunogenitätsuntersuchung unter Verwendung von P. falciparum RTS,S und HIV-1 gp120, formuliert mit CpG und/oder DQS21
1. Skizzierung des Experiments
Zwei Mäuse-Immunogenitätsuntersuchungen wurden durchgeführt, um potentielle additive oder synergistische Wirkungen von CpG-Oligonukleotiden (CpG) und QS21 auszuwerten. Gruppen von Mäusen wurden mit RTS,S und gp120 immunisiert, formuliert mit CpG und QS21 allein oder in Kombination. Diese Hilfsstoffkombinationen wurden ebenfalls in Gegenwart von Träger, Al(OH)₃, oder einer Öl-in-Wasser-(o/w)-Emulsion getestet.
Die Immunogenität der Formulierungen wurde nach zwei parenteralen Immunisierungen geprüft. Seren wurden auf Gegenwart von antigenspezifischen Antikörpern und auf Verteilung von Antikörper-Isotypen analysiert. Milzzellen wurden verwendet, um zellvermittelte Immunreaktionen auszuwerten. Diese Zellen wurden auf Gegenwart von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und lymphoproliferativen (Lymphoproliferations-)Zellen getestet.
Tabelle 1: Gruppen von Mäusen in Experiment 1
Tabelle 2: Gruppen von Mäusen in Experiment 2
2. Formulierung
2.1. Experiment 1
Formulierungsverfahren:
Formulierungen wurden drei Tage vor jeder Injektion zubereitet. Nach Bedarf wurden RTS,S (10 μg) und gp120 (10 μg) auf 100 μg Al(OH)₃ adsorbiert. Nach Bedarf wurde MPL (5 μg) hinzugegeben und 30 min inkubiert vor der Pufferzugabe als Mischung aus 10-fach konzentriertem PBS pH 7,4 und H₂O, ausgenommen die Gruppe ohne DQ, für die der Puffer PO₄, NaCl 10/150 pH 6,8 war. Nach 30 min wurde nach Bedarf QS21 (5 μg), vermischt mit Liposomen in einem Gewichtsverhältnis QS21/Cholesterol von 1/5 (bezeichnet als DQ), zur Formulierung gegeben. 30 Minuten später wurden für die Formulierungen mit dem Oligonukleotid 100 μg CpG 30 min vor der Zugabe von 50 μg/ml von Thiomersal als Konservierungsmittel hinzugegeben.
Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter Bewegen durchgeführt.
2.2. Experiment 2
Formulierungsverfahren:
Formulierungen werden simultan für beide Injektionen durchgeführt. Das Injektionsvolumen für eine Maus beträgt 100 μl. 50 μg/ml von Thiomersal werden als Konservierungsmittel hinzugegeben.
Gruppe 1: RTS,S (10 μg) und gp120 (10 μg) werden mit H₂O und PBS pH 6,8 auf Isotonizität verdünnt. Nach 5 min wird die Formulierung an CpG 1856 (100 μg) adsorbiert.
Gruppe 2: RTS,S (10 μg) und gp120 (10 μg) werden mit H₂O und PBS pH 7,4 auf Isotonizität verdünnt. Nach 30 Minuten werden RTS,S und gp120 an DQ (5 μg) adsorbiert. Nach 30 min Adsorption wird die Formulierung an CpG 1856 (100 μg) adsorbiert.
Gruppe 3: RTS,S (10 μg) und gp120 (10 μg) werden mit H₂O und PBS pH 6,8 auf Isotonizität verdünnt. Nach 5 min wird die Formulierung an einer o/w-Emulsion adsorbiert. Nach 5 min Adsorption wird die Formulierung an QS21 (5 μg) vor der Zugabe von CpG (100 μg) adsorbiert.
3. Immunologische Verfahren
Neun (Balb/C × C57B1/6) F1-Mäuse pro Gruppe erhielten in die hintere Fußsohle 2 × 50 ml Impfstoff zweimal in einem zweiwöchigen Intervall. Zwei Wochen später wurden Seren erhalten, um Antikörperreaktionen zu bewerten, und Milzzellen wurden geerntet, um zellvermittelte Immunreaktionen zu bestimmen.
Zur Lymphoproliferationsanalyse wurden Zellen in vierfacher Ausführung in Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Konzentration von 2 × 10⁶ pro ml übergeimpft. Die Zellen wurden für 72 oder 96 h in RPMI-1640, ergänzt mit Antibiotika, Glutamin und 1% (V/V) Normalmausserum, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von RTS,S oder gp120-Antigen kultiviert. Kontrollzellen wurden ohne Antigen kultiviert. Dann wurden die Zellen über Nacht mit 1 μCi/Vertiefung [³H]-Thymidin gepulst, geerntet und die aufgenommene Radioaktivität in einem beta-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse werden als mittlere Impulse pro Minute (cpm) ausgedrückt.
Zur CTL-Analyse wurden Zellen für 7 Tage in Platten mit 6 Vertiefungen in Gegenwart von 10 μg pro ml von synthetischem Peptid pCMI003 (IPQSLDSWWTSL) kultiviert, entsprechend einem HbsAg-CTL-Epitop (Schimbeck et al., 1995), oder Peptid pCMI007 (GIHIGPGRAFYAARK), das ein gp120-CTL-Epitop darstellt (Casement et al., 1995). Am Ende des Kulturzeitraums wurden Effektorzellen in doppelter Ausführung auf HBsAg-spezifische cytolytische Aktivität in Standard-[⁵¹Cr]-Freisetzungstests unter Verwendung von Kontroll- und S-transfizierten P815-Zellen bewertet. Gp120-spezifische Cytotoxizität wurde unter Verwendung von P815-Zielzellen bestimmt, die entweder unbehandelt gelassen oder für 1 h mit Peptid pCMI007 gepulst wurden. Die minimale und maximale Freisetzung wurden mit Zielzellen ohne Effektorzellen bzw. durch Zugabe von 3% (V/V) Triton X-100 bestimmt. Die Ergebnisse werden als % [⁵¹Cr]-Freisetzung (cpm der experimentellen Kultur – cpm der spontanen Freisetzung/cpm der maximalen Freisetzung – cpm der spontanen Freisetzung) ausgedrückt.
Titration und Isotypisierung von vereinigten Seren wurden in einem standardmäßigen enzymgebundenen Immunosorbenstest-(ELISA)-Format unter Verwendung von mit HbsAg beschichteten Platten durchgeführt. Die Seren wurden in PBS/BSA beginnend mit 1:400 verdünnt. Biotinylierte sekundäre Antikörper, die spezifisch für Ig oder die Isotypen IgG1, IgG2a und IgG2b sind, gefolgt von einem Meerrettichperoxidase-Streptavidin-Konjugat wurden zur Detektion gebundener Antikörper verwendet. ELISA-Titer wurden aus einer Referenz durch SoftmaxPro berechnet und in ELISA-Einheiten (EU/ml) ausgedrückt. Gp120-spezifische Antikörpertiter wurden in einem Standard-ELISA unter Verwendung von mit gp120-Protein beschichteten Platten bestimmt. Seren wurden in PBS/Tween20/BSA beginnend mit 1:100 verdünnt. Biotinylierte sekundäre Antikörper, die spezifisch für Ig oder die Isotypen IgG1, IgG2a und IgG2b sind, gefolgt von Meerrettichperoxidase-Streptavidin-Konjugat wurden zur Detektion gebundener Antikörper verwendet. Die Titer wurden relativ zu einem Standard-Maus-Ig berechnet und als μg/ml ausgedrückt.
4. Ergebnisse
Experiment 1
Die Analyse der Lymphoproliferationsreaktionen zeigte keine signifikanten Unterschiede der Reaktivität gegen RTS,S zwischen den Gruppen. Im Gegensatz zeigten die Gruppen 1 und 3, die sowohl CpG als auch DQS21 enthielten, bessere gp120-spezifische Lymphoproliferationsreaktionen als die Gruppen, die allein CpG oder DQS21 enthielten (6).
In diesem Experiment wurden nur HBsAg-spezifische CTL gemessen. Es gab keinen betonten Unterschied der CTL-Induzierung zwischen den Gruppen 1 und 3, die CpG und DQS21 in Kombination erhalten hatten, und den Gruppen 2 und 4, die nur mit einem der zwei Hilfsstoffkomponenten immunisiert wurden, während die Gegenwart von Al(OH)₃ die CTL-Aktivität verringerte, die für die Kombination von CpG und DQS21 in Gruppe 1 beobachtet wurde (7). Jedoch war ein Trend vorhanden, wonach CpG und DQS21 besser als DQS21 allein waren und die Kombination mehr CTL in Gegenwart von Al(OH)₃ als CpG allein induzierte (7).
Die humorale Immunreaktion der Mäuse wurde nur für die Gegenwart von HBsAg-spezifischen Antikörpern untersucht. Die Titer waren ähnlich in allen Gruppen, ausgenommen Gruppe 3, die eine ca. dreifache Zunahme zeigte, was belegt, daß die Kombination aus DQS21 und CpG in Gegenwart von Al(OH)₃ stärker immunogen als CpG allein ist (8). Die Isotypenverteilung war ähnlich für die Al(OH)₃-haltigen Gruppen 3 und 4, während die Kombination aus CpG und DQS21 in Abwesenheit von Al(OH)₃ ein stärkeres T_H1-artiges Isotypenmuster als DQS21 allein induzierte (8).
Experiment 2
Für RTS,S und gp120 spezifische Lymphoproliferationsreaktionen waren ähnlich in diesem Experiment. Die Daten zeigen, daß die Zugabe von DQS21 (entweder allein oder mit einer o/w-Emulsion) die Lymphoproliferationsreaktionen gegen beide Antigene steigert (9).
CTL-Reaktionen wurden unter Verwendung sowohl eines HBsAg- als auch eines gp120-CTL-Epitoppeptids ausgewertet. In beiden Fällen konnte CTL nach der Immunisierung der Gruppe 1 mit CpG allein detektiert werden (10). Jedoch führte die Zugabe von DQS21 zu einer beträchtlichen Zunahme des CTL für beide Antigene (10). Die Gegenwart einer o/w-Emulsion neutralisierte entweder die positive Wirkung von DQS21 (gp120) oder erhöhte den Hintergrund des In-vitro-Tests (HBsAg).
Antikörperreaktionen gegen HBsAg und gp120 erhöhten sich durch Zugabe von DQS21 zum CpG-Hilfsstoff (11A). Eine weitere Zunahme wurde beobachtet, als eine o/w-Emulsion in der Formulierung eingeschlossen wurde (11A). Die Zugabe von DQS21 zu CpG verschob die gp120-Isotypenprofile hin zu einer betonteren T_H1-Hervorhebung (11B), während der Einfluß auf die HBsAg-Isotypenprofile in diesem Experiment weniger betont war.
5. Schlußfolgerungen
Immunisierung mit RTS,S und gp120, formuliert mit der Kombination aus CpG und DQS21, führt zu starken antigenspezifischen Immunreaktionen. Die Kombination der Hilfsstoffkomponenten CpG und DQS21

– steigert die Lymphoproliferationsreaktionen
– erhöht die CTL-Aktivität
– unterstützt Antikörpertiter und T_H1-Isotypenmuster im Vergleich zu den einzelnen Komponenten.

Beispiel 5: Therapeutisches Potential von CpG- und/oder DQS21-Formulierungen im T_C1-Tumormodell
1. Experimenteller Aufbau
Vier Gruppe von 10 C57bl/6-Mäusen erhielten 106 (200 μl) TC1-Zellen (E7 exprimierende Tumorzellen) subkutan am Tag 0 in die Flanke. Die Mäuse wurden dann zweimal an den Tagen 14 und 21 nach der Tumorexposition mit 5 μg von formuliertem PD1/3E7-HPV16 geimpft, das in die Fußsohle injiziert wurde. Das Tumorwachstum wurde individuell zweimal wöchentlich gemessen. Gruppen von Mäusen:

1. Kein Impfstoff
2. PD1/3E7 + CpG (10 μg ODN 2006)
3. PD1/3E7 + DQS21 (0,5 μg)
4. PD1/3E7 + CpG + DQS21

Das Tumorwachstum wurde durch Messung individueller Tumoren zweimal wöchentlich überwacht.
2. Formulierungen
Formulierungen wurden am Tag der Injektionen durchgeführt. Das Injektionsvolumen für eine Maus betrug 100 μl. Nach Bedarf wurde PD1/3E7 (5 μg) mit H₂O und PBS pH 7,4 auf Isotonizität verdünnt. Nach 5 min wurde nach Bedarf QS21 (0,5 μg), vermischt mit Liposomen in einem Gewichtsverhältnis QS21/Cholesterol 1/5 (bezeichnet als DQ), zur Formulierung gegeben. 30 min später wurden zur Formulierung mit dem Oligonukleotid 10 μg CpG (ODN 2006) 30 min vor der Zugabe von 1 μg/ml von Thiomersal als Konservierungsmittel hinzugegeben.
3. Ergebnisse
Die zeitliche Entwicklung des mittleren Tumorwachstums pro Gruppen von 10 Tieren ist in 12 gezeigt. 100% der Tiere, die eine Tumorexposition mit 10⁶ T_C1-Zellen erhielten, entwickelten progressiv einen wachsenden Tumor. 70–80% der nicht-geimpften Tiere oder der mit E7-Protein in DQS21 geimpften Tiere starben bis zum Tag 35.
Zwei Impfungen mit dem E7-Protein, formuliert in DQS21, hatten fast keine Wirkung auf das Tumorwachstum. Im Gegenteil induzierten 2 Impfungen IFP (Tag 14, 21) mit 5 μg ProtD1/3-E7-HPV16 in CpG-Hilfsstoff die Regression dieser voretablierten Tumoren und schützten die Mäuse vor dem Sterben: 70–80% der Mäuse waren am Tag 35 noch lebendig. Die Kombination der zwei Immunostimulantien CpG und DQS21 zeigte eine leicht vorteilhafte Wirkung gegenüber dem allein verwendeten CpG.
Sequenzprotokoll

Claims

Hilfsstoffzusammensetzung, die ein Saponin und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfaßt, worin das Saponin in Form eines ISCOM oder eines mit Cholesterol und Lipid formulierten Liposoms oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion ist oder mit einem Metallsalz oder Chitosan assoziiert ist.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das immunstimulatorische Oligonukleotid eine Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-Sequenz umfaßt.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das immunstimulatorische Oligonukleotid aus der Gruppe ausgewählt ist, die: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO:1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEQ ID NO:2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEQ ID NO:3); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO:4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO:5) umfaßt.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das immunstimulatorische Oligonukleotid wenigstens zwei unmethylierte CG-Repeats enthält, die durch wenigstens 3 Nukleotide getrennt sind.
Hilfsstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, worin das immunstimulatorische Oligonukleotid wenigstens zwei unmethylierte CG-Repeats enthält, die durch 6 Nukleotide getrennt sind.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Saponin aus quilA stammt.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin das quilA-Derivat QS21 ist.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Saponin und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfaßt, das unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, worin das Saponin in Form eines Liposoms ist.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Saponin und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfaßt, das unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, worin das Saponin in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion ist.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Metallsalz-Partikel umfaßt.
Hilfsstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 10, worin das Metallsalz-Partikel Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat ist.
Impfstoffzusammensetzung, die eine Hilfsstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt und ferner ein Antigen umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin das Antigen aus einem Organismus stammt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfaßt: humanes Immundefizienzvirus, Varicella Zoster-Virus, Herpes Simplex-Virus Typ 1, Herpes Simplex-Virus Typ 2, humanes Cytomegalovirus, Dengue-Virus, Hepatitis A, B, C oder E, Respiratory Syncytial-Virus, humanes Papillomavirus, Grippevirus, Hib, Meningitis-Virus, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacterien, Haemophilus, Plasmodium oder Toxoplasma, Stanworth-Decapeptid; oder Tumorassoziierte Antigene (TAA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2/neu, CEA, PSA, KSA oder PRAME; oder ein Selbstpeptidhormon, GnRH.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin das Antigen aus der Gruppe stammt, die (a) Tumor-assoziierte Antigene PSMA, PSCA, Tyrosinase, Survivin, NY-ESO1, Prostase, PS108, RAGE, LAGE, HAGE; oder (b) das N-terminale Fragment mit 39–43 Aminosäuren (Abeta) des Amyloid-Vorläuferproteins; oder (c) mit Atherosklerose assoziierte Antigene umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Ansprüchen 12 bis 14, worin der Impfstoff systemisch verabreicht wird.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Ansprüchen 12 bis 14, worin der Impfstoff mukosal verabreicht wird.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 16, worin das Saponin der Hilfsstoffzusammensetzung hämolytisch ist.
Impfstoff gemäß Ansprüchen 12 bis 14 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Kombination aus einem Saponin und einem CpG-Molekül gemäß Ansprüchen 12 bis 18 in der Herstellung eines Impfstoffs zur Prophylaxe und Behandlung von viralen, bakteriellen oder parasitären Infektionen, Allergie, Krebs oder anderen chronischen Störungen.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung gemäß Ansprüchen 12 bis 18, umfassend das Vermischen eines Saponins, eines immunstimulatorischen Oligonukleotids und eines Antigens, worin das Saponin in Form eines ISCOM oder eines mit Cholesterol und Lipid formulierten Liposoms oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion ist oder mit einem Metallsalz oder Chitosan assoziiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß Anspruch 20, umfassend das Vermischen der folgenden: (a) ein Saponin, (b) ein immunstimulatorisches Oligonukleotid und (c) ein Antigen, worin das Saponin in Form eines Liposoms ist und worin das Oligonukleotid unmethylierte CpG-Dinukleotide enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß Anspruch 20, umfassend das Vermischen der folgenden: (a) ein Saponin, (b) ein immunstimulatorisches Oligonukleotid und (c) ein Antigen, worin das Saponin in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion ist und worin das Oligonukleotid unmethylierte CpG-Dinukleotide enthält.