CN111057738A - C2c12细胞在疫苗佐剂机制研究中的用途和研究分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种C2C12细胞在疫苗佐剂机制研究中的用途和研究分析方法,C2C12细胞可直接作为体外细胞模型用于研究疫苗佐剂的作用机制。对于待研究的疫苗佐剂,尤其是针对桔梗皂苷D,可体外刺激C2C12细胞与肌内注射小鼠股四头肌,分析二者在表观和基因表达谱特征方面的一致性,研究疫苗佐剂作用的机制。本发明运用该细胞模型,通过芯片检测数据分析,揭示了介导桔梗皂苷D佐剂作用的关键分子caspase‑1。C2C12细胞价廉易得、培养方法简单、成本低,重复性好,能模拟临床上疫苗免疫接种使用实际情况,体内外研究结果一致性高,为疫苗佐剂作用机制研究提供更具临床意义的细胞模型。
Description
技术领域
本发明涉及一种C2C12细胞在疫苗佐剂机制研究中的用途和研究分析方法。
背景技术
疫苗接种是预防和控制传染性疾病最经济、有效的措施[Rappuoli R,HanonE.Sustainable vaccine development:a vaccine manufacturer'sperspective.Current opinion in immunology.2018,53:111–118]。佐剂是传统疫苗和新型疫苗必不可少的组成成分,不仅影响机体对疫苗的适应性免疫应答强度,而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型[Gutjahr A,Tiraby G,Perouzel E,Verrier B,PaulS.Triggering intracellular receptors for vaccine adjuvantation.Trends inimmunology.2016,37(9):573–587;Ciabattini A,Pettini E,Fiorino F,Pastore G,Andersen P,Pozzi G,Medaglini D.Modulation of primary immune response bydifferent vaccine adjuvants.Frontiers in Immunology.2016,7:427]。目前研究报道的免疫佐剂种类甚多,但多由于存在毒副作用或安全隐患等不可避免的缺陷而难以实际应用[Mohanty NN,Ashokkumar D,Fayaz A,Chandrasekar S,Ramakrishnan MA.Trends inadjuvant and vaccine delivery systems.Journal of infectious diseases.2016,4:260]。当前,新型佐剂研发的窘境一定程度上归咎于人类对佐剂作用机制缺乏了解,这也导致了佐剂开发的新靶点严重缺乏[Harandi AM.Systems analysis of human vaccineadjuvants.Seminars in immunology.2018,39:30–34]。
目前,对佐剂机制的研究多集中于考察其对先天性免疫细胞或适应性免疫细胞的影响。据报道,树突状细胞(DC)[Welsby I,Detienne S,N'kuli F,et al.Welsby,I.etal.Lysosome-dependent activation of human dendritic cells by the vaccineadjuvant QS-21.Frontiers in Immunology.2016,7:663]或T细胞[Cibulski S P,Rivera-Patron M,Mourglia-Ettlin G,et al.Cibulski,S.P.et al.Quillajabrasiliensis saponin-based nanoparticulate adjuvants are capable oftriggering early immune responses.Scientific Reports.2018,8(1):13582]等激活在皂苷类佐剂(saponin-based adjuvants,SBAs)诱导的先天性和适应性免疫反应中具有重要作用。
先天性免疫细胞或适应性免疫细胞体外培养相对不易,且以其为体外模型获得的佐剂机制研究结果未能在体内实验中得到良好验证,缺乏一致性。
在临床上,大部分疫苗是通过肌内注射接种。而在肌肉组织中,免疫细胞相对较少,肌细胞占据主导地位[Sciorati C,Rigamonti E,Manfredi A A,et al.Cell death,clearance and immunity in the skeletal muscle.Cell death and differentiation,2016,23(6):927-937]。
据报道,铝胶佐剂(Alum)、MF59[Seubert A,Monaci E,Pizza M,et al.Theadjuvants aluminum hydroxide and MF59 induce monocyte and granulocytechemoattractants and enhance monocyte differentiation toward dendriticcells.The Journal of Immunology,2008,180(8):5402-5412]、AS03[N,Vaughn DW,Didierlaurent A M.Development and evaluation of AS03,an Adjuvant Systemcontainingα-tocopherol and squalene in an oil-in-water emulsion.Expert reviewof vaccines,2012,11(3):349-366]和AS04[Didierlaurent A M,Morel S,Lockman L,etal.AS04,an aluminum salt-and TLR4 agonist-based adjuvant system,induces atransient localized innate immune response leading to enhanced adaptiveimmunity.The Journal of immunology,2009,183(10):6186-6197]等疫苗佐剂均通过诱导注射部位产生细胞因子和趋化因子,募集免疫细胞到局部组织,进而摄取抗原,并向淋巴结迁移,从而促进适应性免疫应答反应。
肌细胞表达多种Toll样受体(TLRs)[Frost R A,Lang C H.Regulation ofmuscle growth by pathogen-associated molecules.Journal of animal science,2008,86(suppl_14):E84-E93]。同时,能表达和分泌多种细胞因子(如IL-6、IL-1α、IL-1β等)和趋化因子(如CCL3、CCL4和CXCL2等)。这为肌细胞对环境因素(包括病原体、炎症细胞因子、激素和生长因子)作出反应提供了分子基础[Ulevitch R J.Therapeuticstargeting the innate immune system.Nature Reviews Immunology,2004,4(7):512-520;Boyd J H,Divangahi M,Yahiaoui L,et al.Toll-like receptors differentiallyregulate CC and CXC chemokines in skeletal muscle via NF-κB andcalcineurin.Infection and immunity,2006,74(12):6829-6838.]。肌肉组织在免疫反应中不再是一个被动的旁观者,而是一个积极的参与者[Marino M,Scuderi F,ProvenzanoC,et al.Skeletal muscle cells:from local inflammatory response to activeimmunity.Gene therapy,2011,18(2):109-116]。
据报道,MF59引起注射部位肌纤维活化,肌纤维可能是MF59作用的主要靶标[Mosca F,Tritto E,Muzzi A,et al.Molecular and cellular signatures of humanvaccine adjuvants.Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(30):10501-10506]。
分析佐剂在肌注模型中对局部肌肉组织的作用对阐明其作用机制研究具有指导意义,且与临床运用相契合。
原代肌细胞分离培养困难,而C2C12细胞(小鼠成肌细胞)体外培养方便。若C2C12细胞确能很好地模拟佐剂肌注涉及的生物学过程,将更好的服务于疫苗佐剂作用机制研究。
发明内容
本发明的第一个目的是结合临床使用实际,针对现有体外细胞模型的局限性,提供一种C2C12细胞在疫苗佐剂机制研究中的用途,以C2C12细胞直接作为体外细胞模型用于研究疫苗佐剂的作用机制。
本发明的第二个目的是提供一种所述的疫苗佐剂作用机制研究体外细胞模型可行性与合理性分析方法。
本发明的第三个目的是提供所述的疫苗佐剂作用机制研究体外细胞模型在皂苷佐剂作用机制研究中的应用。
为了实现上述的第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种疫苗佐剂作用机制研究分析方法,该方法为:
a.将待研究疫苗佐剂肌内注射小鼠股四头肌与体外刺激C2C12细胞,考察表观和基因表达谱变化;
b.运用该细胞模型验证基因芯片检测数据分析结果,并找到介导所研究疫苗佐剂作用的关键分子;
c.考察局部肌内注射上述关键分子抑制剂对所研究疫苗佐剂活性的影响,研究其佐剂活性依赖性。
为了实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
所述的疫苗佐剂作用机制研究体外细胞模型即C2C12细胞在研究caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK抑制桔梗皂苷D诱导C2C12细胞炎症反应中的应用。
所述的将以C2C12细胞为体外模型研究获得的桔梗皂苷D靶分子caspase-1类推到介导桔梗皂苷D对卵清蛋白(OVA)佐剂活性中的应用。
本发明的创造性在于:首次以C2C12细胞作为疫苗佐剂作用机制研究的体外细胞模型,并以此研究皂苷佐剂的作用机制。
本发明的优点在于:
1.临床上,大部分疫苗通过肌内注射接种。而在肌肉组织中,免疫细胞相对较少,肌细胞占据主导地位。以C2C12细胞为体外细胞模型分析佐剂在肌注模型中的作用机制与临床使用更契合。
2.C2C12细胞较免疫细胞与原代肌细胞,价廉易得、培养方法简单、成本低,重复性好,能模拟临床疫苗免疫接种使用实际情况,体内外研究结果一致性高,为疫苗佐剂作用机制研究提供更具临床意义的细胞模型。
附图说明
图1为桔梗皂苷D结构式。
图2为桔梗皂苷D肌注后不同时间小鼠股四头肌H&E染色组织病理学变化。
图3为桔梗皂苷D处理不同时间C2C12细胞显微形态学变化;其中,上图代表10倍物镜,下图代表40倍物镜。
图4为桔梗皂苷D(50μg)肌注不同时间小鼠股四头肌组织中炎症因子IL-6、IL-1β、CCL3和CXCL2基因表达变化。Fold change:变化倍数;**P<0.01和***P<0.001vs 0h;#P<0.05、##P<0.01和ns(无显著性差异)vs 2h组。
图5为不同浓度桔梗皂苷D刺激不同时间C2C12细胞炎症因子IL-6、IL-1β、CCL3和CXCL2基因表达变化。Fold change:变化倍数;*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001vs每个时间点的0μM组。
图6为桔梗皂苷D(50μg)肌注2h小鼠股四头肌中显著差异表达的基因。变化倍数(Fold change,FC)≥2.0且P<0.05,用火山图表示。
图7为桔梗皂苷D(25μM)处理4h的C2C12细胞显著差异表达的基因。变化倍数(Foldchange,FC)≥2.0且P<0.05,用火山图表示。
图8为桔梗皂苷D诱导的体内外112个共有显著差异表达基因的k-means聚类图。Cluster 1–4:聚类得到的4簇基因,分别包含19、16、45、32个显著差异表达基因;折线图为每个样本该簇基因的平均信号值。
图9为桔梗皂苷D诱导的体内外显著差异表达基因的生物学过程聚类图。
图10为桔梗皂苷D(25μM)处理4h的C2C12细胞caspase-1基因表达变化。***P<0.001vs Ctrl(未处理正常细胞)。
图11为桔梗皂苷D(25μM)刺激不同时间C2C12细胞caspase-1前体与成熟体蛋白表达变化。TBP:内参蛋白;p45:caspase-1前体;p10:caspse-1成熟体。
图12为caspase-1抑制剂YVAD对桔梗皂苷D诱导C2C12细胞炎症因子IL-6和IL-1β基因表达的影响。Fold change:变化倍数;PD:桔梗皂苷D;YVAD:caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK;***P<0.001vs未处理正常细胞;###P<0.001vs桔梗皂苷D(PD)单独处理细胞。
图13为caspase-1抑制剂YVAD对桔梗皂苷D肌注诱导小鼠股四头肌炎症因子IL-6和IL-1β基因表达的影响。Fold change:变化倍数;PD:桔梗皂苷D;YVAD:caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK;***P<0.001vs未处理正常细胞;#P<0.05和##P<0.01vs桔梗皂苷D(PD)单独处理细胞。
图14为caspase-1抑制剂对桔梗皂苷D联合OVA受免小鼠血清中OVA特异性的IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价的影响。OVA:卵清蛋白;PD:桔梗皂苷D;YVAD:caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK;***P<0.001vs OVA单独免疫组;##P<0.01和###P<0.001vs OVA联合PD免疫组。
图15为caspase-1抑制剂对桔梗皂苷D联合OVA受免小鼠抗原刺激脾细胞分泌IFN-γ和IL-10能力的影响。OVA:卵清蛋白;PD:桔梗皂苷D;YVAD:caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK;***P<0.001vs OVA单独免疫组;###P<0.001vs OVA联合PD免疫组。
图16为caspase-1抑制剂对桔梗皂苷D联合OVA受免小鼠NK细胞活性的影响。OVA:卵清蛋白;PD:桔梗皂苷D;YVAD:caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK;**P<0.01vs OVA单独免疫组;##P<0.01vs OVA联合PD免疫组。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明,而非限制其范围。
实施例1:桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与处理C2C12细胞的表观变化
1.桔梗皂苷D肌注股四头肌组织病理学变化
取16只BALB/C雌性小鼠,按体重均匀分成4组,每组4只。左腿注射PBS,右腿注射桔梗皂苷D,注射体积50μL,桔梗皂苷D剂量50μg。作用一定时间后用剪刀镊子分离整块股四头肌,置于10%福尔马林中固定24h,石蜡包埋、切片,H&E染色,光学显微镜(Nikon ECLIPSE80i)镜检并拍照。
2.倒置显微镜观察C2C12细胞形态学变化
将浓度为1×105/mL的C2C12细胞悬液,按每孔1mL接种于24孔板,混匀,置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。以桔梗皂苷D(25μM)处理C2C12细胞不同时间(0.5h、1h、2h、4h和24h),对孔中央同一点在10×和40×倍镜下观察拍照。
3.桔梗皂苷D肌注股四头肌炎症因子基因表达的变化
取12只BALB/C小鼠,分3组,每组4只小鼠,左腿注射PBS缓冲液50μL,右腿注射1mg/mL的桔梗皂苷D稀释液50μL(即50μg桔梗皂苷D)。分别于肌注后1h、2h和4h,分离股四头肌,剪碎,用1mL TRIzol以Tissue Ruptor Disposable probes(QIAGEN)匀浆,收集至1.5mL离心管中,室温静置15min。每管加200μL氯仿萃取,室温静置3min后,4℃,13200rpm离心15min。吸取上清,1:1加入异丙醇,上下颠倒混匀,静置10min,4℃,13200rpm离心10min。弃上清,加75%乙醇1mL洗涤沉淀,4℃,15600rpm离心5min;弃上清,风干RNA沉淀。加入适量DEPC水,60℃水浴溶解10min。NANO Drop2000定量。取一200μL离心管,加入2μg RNA溶液,DEPC水补足体积至10.5μL,再分别加入1μL Oligo dT与1μL 6-Mer,指弹混匀,离心,65℃水浴5min。再迅速转移至-20℃冷却2min,加入余下的反转录试剂,混匀,置PCR仪中,42℃1h,72℃10min反转录成cDNA,参数设置为适当稀释cDNA,荧光定量PCR扩增反应体系,混匀,置荧光定量PCR仪中,以95℃预变性10min,循环(95℃15sec,60℃1min)40个循环的程序反应,分析IL-6和CXCL2等细胞因子mRNA表达变化。荧光定量PCR引物序列见表1。
表1荧光定量PCR引物序列
4.桔梗皂苷D处理C2C12细胞炎症因子基因表达的变化
将浓度为1×105/mL的C2C12细胞悬液,按每孔1mL接种于24孔板,混匀,置于5%CO2、37℃培养箱中,培养24h。以不同浓度的桔梗皂苷D稀释液处理C2C12细胞1h、2h、4h和6h。弃培养上清,加入1mL Trizol试剂,吹打,收集至1.5mL离心管中,室温静置15min。RNA抽提、反转录以及定量PCR方法同“3.桔梗皂苷D肌注股四头肌炎症因子基因表达的变化”。
5.实验结果
桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与刺激C2C12细胞表观考察结果见图2~5。从图2~5可见,⑴桔梗皂苷D肌注可诱导局部组织肌细胞肿胀裂解、炎细胞浸润(图2),以及细胞因子和趋化因子表达上调(图4);⑵桔梗皂苷D作用C2C12细胞可诱导其肿胀变圆、短期可恢复的细胞损伤(图3),并伴随细胞因子和趋化因子表达上调(图5);⑶体、内外模型在表观和分子水平上相一致,表明C2C12细胞可能是理想的桔梗皂苷D佐剂作用机制研究体外模型。
实施例2:桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与处理C2C12细胞基因表达谱分析
1.体内外芯片检测
桔梗皂苷D(50μg)肌内注射BALB/C小鼠股四头肌,2h后,分离股四头肌,剪碎,用1mL TRIzol以Tissue Ruptor Disposable probes(QIAGEN)匀浆,收集至1.5mL离心管。将1×105/mL的C2C12细胞悬液,按1mL/孔接种于24孔板,混匀,放于5%CO2、37℃培养箱中,培养24h。以桔梗皂苷D(25μM)作用C2C12细胞4h,弃培养上清,加入1mL TRIzol吹打,收集至1.5mL离心管。采用Agilent SurePrint G3小鼠基因表达谱芯片进行转录组学分析。样品总RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后,样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。首先,总RNA反转录成双链cDNA,再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version13.1,Agilent Technologies)进行quantile标准化和后续处理。
2.显著差异表达基因筛选
以变化倍数(Fold change,FC)≥2.0和P<0.05进行显著差异表达基因筛选。桔梗皂苷D肌注诱导小鼠股四头肌650个显著差异表达基因,其中上调438个,下调212个(见图6)。桔梗皂苷D诱导C2C12细胞3410个基因产生显著差异表达,包括上调基因1921个和下调基因1489个(见图7)
3.芯片检测数据分析
桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与处理C2C12细胞共同调节的核心显著差异表达基因112个。使用Multiexperiment Viewer对112个核心基因进行K均值(k-means)聚类分析以比较其表达模式;运用Metascape Bioinformatics Resources(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)对桔梗皂苷D处理C2C12细胞和肌注小鼠股四头肌显著差异表达基因分别进行富集分析,选择GO Biological Processes数据库,以确定体内、外模型各自涉及的生物学过程。以P<0.01筛选富集的条目,总共获得具有统计学意义的生物学过程条目1481条。条目之间相似度>0.3的条目被聚类为同一簇。
4.实验结果
桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与处理C2C12细胞基因表达谱分析结果见图8、9。⑴112个共同调节的显著差异表达基因在股四头肌与C2C12细胞中的基础表达水平不一致,但是桔梗皂苷D给药或刺激后,第一簇、第三簇与第四簇基因的平均表达水平呈现相近的上调趋势,而第二簇基因的平均表达水平则呈现小幅度下降趋势(图8),表明这112个核心基因在体内外呈现相似的表达模式;⑵Metascape富集的Top 20簇中有14簇为体内、外模型所共有,且这14簇条目均与炎症、死亡和免疫相关(图9),即桔梗皂苷D处理C2C12细胞体外模型和肌注小鼠股四头肌体内模型均能诱导产生一个以炎症、死亡和免疫为核心的应答过程,说明桔梗皂苷D处理C2C12细胞体外模型能很好地模拟肌注小鼠股四头肌体内模型中涉及的生物学过程;⑶体内外模型基因表达谱特征的一致性,充分说明C2C12细胞是桔梗皂苷D佐剂作用机制理想的体外细胞模型。
实施例1和实施例2的可行性与合理性分析结果:桔梗皂苷D肌注小鼠股四头肌与刺激C2C12细胞在表观和基因表达谱特征上的一致性,表明C2C12细胞是佐剂作用机制研究理想的体外细胞模型。
实施例3:运用该细胞模型寻找介导桔梗皂苷D佐剂作用的关键分子
1.荧光定量PCR检测caspase-1基因表达情况
将浓度为1×105/mL的C2C12细胞悬液,按每孔1mL接种于24孔板,混匀,置于5%CO2、37℃培养箱中,培养24h。桔梗皂苷D(25μM)处理4h。收集细胞,进行基因表达检测,方法同实施例1。
2.Western blot检测caspase-1蛋白表达情况
将浓度为1×105/mL的C2C12细胞悬液,按每孔1mL接种于24孔板,混匀,置于5%CO2、37℃培养箱中,培养24h。桔梗皂苷D(25μM)处理一定时间后,收集细胞。以RIPA裂解缓冲液,于冰浴中裂解30min,于4℃,15000rpm离心5min;吸取上清至新的1.5mL离心管中,每管取出3μL于0.2mL离心管中用于蛋白定量,其余按比例加入5×SDS loading buffer。充分混匀后稍离心;100℃沸水浴煮沸5min,然后取出冷却至室温,置于-20℃备用。
蛋白电泳、转膜、封闭、孵一抗、孵二抗,用iCor C-DiGit Blot scanner(LiCor,Lincoln,NE)曝光。
3.caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK对桔梗皂苷D诱导C2C12细胞炎症因子基因表达的影响
将浓度为1×105/mL的C2C12细胞悬液,按每孔1mL接种于24孔板,混匀,置于5%CO2、37℃培养箱中,培养24h。弃培养基,以Ac-YVAD-CMK(25μM)预处理2h,再桔梗皂苷D(25μM)处理4h。收集细胞,进行炎症因子基因表达检测,方法同实施例1。
4.实验结果
运用该细胞模型寻找介导桔梗皂苷D佐剂作用的关键分子的结果见图10~12。从图10~12可见,⑴桔梗皂苷D显著上调C2C12细胞caspase-1mRNA表达水平(图10)以及caspase-1前体p45与剪切体p10的蛋白表达水平(图11),即桔梗皂苷D活化caspase-1分子;⑵caspase-1抑制剂(Ac-YVAD-CMK)能显著降低桔梗皂苷D诱导C2C12细胞上调的IL-6和IL-1β基因表达水平(图12),说明caspase-1参与桔梗皂苷D对炎性因子基因表达表达的调控作用。
实施例4:体内验证caspase-1介导桔梗皂苷D对OVA的免疫佐剂活性
1.Ac-YVAD-CMK对桔梗皂苷D肌注诱导小鼠股四头肌炎症因子基因表达的影响
雌性BALB/C小鼠随机分组,每组4只。对照组肌注25μL PBS,实验组肌注Ac-YVAD-CMK(1μg/g),预处理1h,再原位注射25μL PBS或桔梗皂苷D(50μg),2h后收集股四头肌,进行炎症因子基因表达检测,方法同实例1。
2.Ac-YVAD-CMK对OVA联合桔梗皂苷D肌注免疫小鼠佐剂效果的影响
雌性BALB/C小鼠随机分组,设4组,即模式抗原单独免疫对照组(OVA),佐剂桔梗皂苷D(PD)对照组(50μg PD+10μg OVA),抑制剂对照组(抑制剂预处理),佐剂桔梗皂苷D(PD)实验组(抑制剂预处理+PD-OVA),每组4只小鼠。分别于第1天和第15天肌注免疫小鼠,每次免疫前均肌注25μL抑制剂或PBS预处理1h,再原位点注射疫苗。。二免14天后处死小鼠,股动脉采血,收集于1.5mL离心管中,室温放置2h,6000rpm离心5min,收集上清,采用ELISA方法检测血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体效价;剖取脾脏,制备单细胞悬液,采用ELISA试剂盒检测抗原特异性刺激脾细胞培养上清中细胞因子含量,以及MTT法检测免疫自然杀伤细胞(NK)的活性。
3.实验结果
体内验证caspase-1介导桔梗皂苷D对OVA的免疫佐剂活性结果见图13~16。⑴caspase-1抑制剂AC-YVAD-CMK可显著抑制桔梗皂苷D肌内注射诱导小鼠股四头肌上调的IL-6和IL-1β基因表达水平(图13),表明桔梗皂苷D通过caspase-1调控炎症反应,与体外结果一致。⑵Ac-YVAD-CMK显著降低了桔梗皂苷D联合OVA受免小鼠血清中OVA特异性的IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(图14)、抑制OVA特异性刺激脾细胞分泌IFN-γ和IL-10的能力(图15)以及NK细胞活性(图16),即caspase-1介导桔梗皂苷D对OVA的免疫佐剂活性。
综上所述,本发明的细胞模型C2C12细胞是佐剂作用机制研究的理想体外模型。桔梗皂苷D刺激C2C12细胞与肌注小鼠股四头肌在表观以及基因表达谱特征上相一致,且能应用于桔梗皂苷D佐剂作用的机制研究,获得桔梗皂苷D佐剂活性关键分子。鉴于C2C12细胞易培养,符合疫苗肌注接种实际,因此,小鼠C2C12细胞是一种用于佐剂作用机制研究理想的体外细胞模型。
Claims (9)
1.C2C12细胞在疫苗佐剂作用机制研究中的用途,其特征在于,以C2C12细胞直接作为体外细胞模型用于研究疫苗佐剂的作用机制。
2.如权利要求1所述的C2C12细胞在疫苗佐剂作用机制研究中的用途,其特征在于,所述的疫苗佐剂是皂苷佐剂。
3.如权利要求2所述的C2C12细胞在疫苗佐剂作用机制研究中的用途,其特征在于,介导皂苷佐剂作用的关键分子为caspase-1。
4.一种疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于,方法为:
a.将待研究疫苗佐剂肌内注射小鼠股四头肌与体外刺激C2C12细胞,考察表观和基因表达谱变化;
b.运用该细胞模型验证基因芯片检测数据处理结果,并找到介导所研究疫苗佐剂作用的关键分子;
c.考察局部肌内注射上述关键分子抑制剂对所研究疫苗佐剂活性的影响,研究其佐剂活性依赖性。
5.根据权利要求4所述的疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于:a中的待研究疫苗佐剂为皂苷佐剂,是中药桔梗中提取分离制备的具有佐剂活性的桔梗皂苷D。
6.根据权利要求5所述的疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于:a中的桔梗皂苷D肌注剂量为50μg,时间2h;体外刺激C2C12细胞浓度为25μM,时间4h。
7.根据权利要求5所述的疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于:a中的考察基因表达谱变化所用的基因芯片为Agilent SurePrint G3 8×60K小鼠基因表达谱芯片。
8.根据权利要求5所述的疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于:针对介导皂苷佐剂作用的关键分子caspase-1其抑制剂为Ac-YVAD-CMK。
9.根据权利要求5所述的疫苗佐剂作用机制研究分析方法,其特征在于:该方法中免疫所用抗原为卵清蛋白OVA。
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