CN101402666A - 具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的疫苗制剂及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的疫苗制剂，以及它们在预防和治疗人兽传染性疾病和癌症中的应用。该皂苷是从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2和包含有这2种皂苷化合物的桔梗总皂苷，可诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答，且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。

Description

具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的疫苗制剂及用途

技术领域

本发明涉及具有免疫佐剂作用的皂苷及其制备方法和含该皂苷为佐剂的的疫苗制剂，以及它们在预防和治疗人兽传染性疾病和癌症剂中的应用。

背景技术

传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成，含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也有一定的佐剂作用，所以一般不需要外加佐剂[Lima KM，dos Santos SA，Rodrigues Jr JM，Silva CL.Vaccine adjuvant：it makes the difference.Vaccine 2004；22：2374-9]。随着免疫学基础理论研究的不断深入，以及抗原提纯技术和基因工程技术的迅速发展，出现了许多如基因疫苗、重组疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗。这些新型疫苗具有抗原纯度高、分子量小、特异性强、安全性好等优点，但免疫原性较弱，需要用免疫佐剂(简称佐剂)来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答[O’Hagan DT，Mackichan ML，Singh M.Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases.BiomolEng 2001；18(3)：69-85；Marciani DJ.Vaccine adjuvants：role and mechanisms ofaction in vaccine immunogenicity.Drug Discov Today 2003；8：934-43.；Rock KL，Hearn A，Chen CJ，Shi Y.Natural endogenous adjuvants.Springer SeminImmunopathol 2005；26(3)：231-46]。

目前研究的免疫佐剂很多，如油佐剂、弗氏佐剂、微生物及其代谢产物、核酸及其类似物、细胞因子、脂质体等，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺陷而难以实际应用。铝胶仍是人兽疫苗生产中应用最广的佐剂，而且也是唯一通过FDA批准的人用疫苗佐剂。然而，铝胶佐剂存在一些问题：①主要通过诱导Th2型免疫应答产生抗体起保护作用，不能诱生Th1型免疫应答和细胞介导的免疫反应，只适用于以抗体为主要保护性免疫的疫苗；②对人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒以及血吸虫病、百日咳和伤寒等多种抗原无佐剂作用；③可促进IgE抗体产生，容易诱导机体产生过敏反应；④有局部反应，会形成肉芽肿，极个别可发生局部无菌性脓肿；⑤因其理化性质特点，含铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶容易变性；⑥对人、畜神经系统可能有影响。免疫佐剂可以决定免疫应答的类型，而不同免疫应答类型对疫苗的免疫保护性有显著的影响[Cox JC and Coulter AR.Adjuvants-a classification and review of their modes of action.Vaccine 1997；15(3)：248-256]。Th1型免疫反应可介导细胞免疫应答，主要针对细胞内病原体如病毒、寄生虫、肿瘤等产生保护性免疫。Th2型免疫反应主要介导体液免疫应答，针对大多数细菌及特定的病毒性传染病能产生有效保护力，而对细胞内病原体及恶性肿瘤细胞一般没有保护力。因此，铝胶佐剂已远远不能满足新型疫苗发展的要求[O’Hagan DT，Mackichan ML，Singh M.Recent developments inadjuvants for vaccines against infectious diseases.Biomol Eng 2001；18(3)：69-85]。

皂苷是一类广泛存在于天然药物中的重要活性成分。自1951年发现皂苷能增强机体对口蹄疫疫苗的免疫反应以来，其佐剂作用受到广泛的关注。研究最多的是南美皂树(Quillaja saponaria Molina)树皮中筛选到具有佐剂活性总皂苷——Quil A及其活性成分QS-21[Skene CD and Sutton P.Saponin-adjuvantedparticulate vaccines for clinical use.Methods 2006；40：53-9]。Quil A和QS-21对外源性抗原既能刺激Th1免疫应答，又能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的佐剂。这一独特的特性使其成为亚单位疫苗、细胞内病原体疫苗及癌症疫苗的理想佐剂[Mbawuike I，Zang Y，Couch RB.Humoral and cell-mediated immuneresponses of humans to inactivated influenza vaccine with or without QS21 adjuvant.Vaccine 2007；25(17)：3263-9]。但Quil A存在严重的缺陷：①溶血性强、毒副作用大，可引起局部组织坏死，甚至全身不良反应和中毒[Waite DC，Jacobson EW，Ennis FA，Edelman R，White B，Kammer R，et al.Three double-blind，randomizedtrials evaluating the safety and tolerance of different formulations of the saponinadjuvant QS-21.Vaccine 2001；19：3957-7.]。临床安全性评价结果表明：Quil A用于人不安全。目前除了用于为某些绝症设计的疫苗如癌症疫苗和人免疫缺陷病重组疫苗等人用疫苗外，主要限用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等兽用疫苗。②其主要活性成分如QS-21、QS-17、QS-18和QS-7等分子结构中均存在酰基，易水解，其去酰化水解产物失去诱导Th1型免疫应答及产生特异性CTL的能力，只能引发Th2型免疫应答[Kensil CR.Immunomodulatory adjuvants from Quillajasaponaria.Immunopotentiators in Modern Vaccines 2007；109-22.]；③南美皂树资源匮乏，总皂苷含量低，同时Quil A中单体化合物分子量大，化学结构十分复杂，分离制备困难。因此，有必要进一步寻找高效、低毒、稳定的理想皂苷佐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一类用于疫苗的具有显著免疫佐剂作用的皂苷。

本发明的另一个目的是提供从中药桔梗中提取分离总皂苷及其化合物的方法。

本发明的进一步目的是提供预防和治疗人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂。

本发明的还有一个目的是提供上述皂苷化合物和总皂苷在制备预防和治疗人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂中的应用。

本发明具有免疫佐剂作用的皂苷包括从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含有这2种皂苷化合物的混合物——桔梗总皂苷。

本发明提供的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含有这2种皂苷的混合物——桔梗总皂苷是从中药桔梗中提取分离的，制备方法包括以下步骤：

a.将桔梗药材粉碎后，以乙醇提取；

b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。取水层以水饱和的丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物。

c.醇萃取物在大孔吸附树脂柱中进行色谱分离，以水和乙醇混合液进行梯度洗脱；

d.硅胶薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的洗脱液合并，浓缩，得到桔梗总皂苷；

e.桔梗总皂苷再经硅胶(包括Rp-18、Rp-8)或Sephadex LH-20柱色谱或HPLC色谱，以洗脱剂洗脱、分离，得到桔梗皂苷D以及桔梗皂苷D2。

上述步骤e中所说的洗脱剂为甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水的混合物。

本发明的疫苗制剂包含有免疫有效量的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或桔梗总皂苷为免疫佐剂，以及含有一种或多种药物学上可接受的载体。

本发明的化合物和混合物可用于制备预防和治疗传染性疾病和肿瘤的疫苗制剂。

上文所述药物学上可接受的载体是指药学领域的药用载体，如水、生理盐水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等稀释剂和赋形剂。另外，该组合物还可包括湿润剂、乳化剂、pH缓冲液，等等。

本发明的疫苗制剂可以是溶液、混悬液或乳浊液形式，可通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要接种的对象。本发明的疫苗制剂用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、脂质体、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是注射用冻干粉及溶液。

本发明的疫苗制剂可按照药学领域的任何常规生产方法制备。

疫苗制剂的典型单剂量可以根据制剂的形式而变化，并根据抗原种类、所需的抗体水平、接种对象的特异性及所需的免疫程序等各种因素进行确定。本发明的疫苗制剂中皂苷佐剂的量可为0.01μg～1g/单剂量，优选为0.1～100μg/单剂量。可以一次或多次施用。

本发明的优点

本发明具有免疫佐剂作用的皂苷(包括桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及包含有这2种皂苷化合物的混合物)可诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答，且显示出比现有技术中已知的铝胶佐剂能诱导机体对疫苗产生更强的细胞免疫和体液免疫反应。因此，可以作为多种疫苗的免疫佐剂，发挥理想的免疫效果。以该类皂苷为佐剂的疫苗制备工艺简单、方法简便、质量容易控制、使用方便、可冰冻保存。该类皂苷成分的溶血性小和安全性好。

附图说明

图1为桔梗总皂苷对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PGS：桔梗总皂苷；^aP＜0.05，^bP＜0.01和^cP＜0.001 vs HBsAg对照组；^dP＜0.05，^eP＜0.01和^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图2为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D。^aP＜0.05，^bP＜0.01和^cP＜0.001vs HBsAg和铝胶对照组。

图3为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D；^aP＜0.05，^bP＜0.01和^cP＜0.001vsHBsAg对照组；^dP＜0.05，^eP＜0.01和^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图4为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D；^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^eP＜0.001、^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图5为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D；^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图6为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D；^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图7为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD2：桔梗皂苷D2。^aP＜0.05，^bP＜0.01和^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^dP＜0.05，^eP＜0.01和^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图8为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD2：桔梗皂苷D2；^aP＜0.05，^bP＜0.01和^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^dP＜0.05，^eP＜0.01和^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图9为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响HBsAg：重组乙肝表面抗原；Alum：铝胶；PD2：桔梗皂苷D2；^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^dP＜0.01和^fP＜0.001vs铝胶对照组。

图10为桔梗皂苷D对禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响rL-H5：禽流感-新城疫重组二联活疫苗；Alum：铝胶；PD：桔梗皂苷D；^cP＜0.001vs HBsAg对照组；^eP＜0.01vs铝胶对照组。

具体实施方式

下述参考例和实施例意在进一步描述本发明而非限制其范围。

实施例1：桔梗皂苷制备

制备桔梗总皂苷

药材桔梗粗粉5kg，以70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。水层以水饱和丁醇或戊醇萃取，直至萃取液近无色，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物。醇萃取物经大孔吸附树脂柱，用水和乙醇混合液进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分离得到桔梗总皂苷。

桔梗总皂苷为灰白色粉末。Lieberman-Burchard反应和Molish反应均呈阳性，示含三萜皂苷化合物。薄层色谱鉴别结果表明：其色谱中，在与桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

制备桔梗皂苷D

药材桔梗粗粉5kg，以70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。水层以水饱和丁醇或戊醇萃取，直至萃取液近无色，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物。醇萃取物经大孔吸附树脂柱，用水和乙醇混合液进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分离得到桔梗总皂苷。桔梗总皂苷进行硅胶或氧化铝柱色谱，先以氯仿、乙酸乙酯或二氯甲烷和甲醇(或乙醇)进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，含有桔梗皂苷D斑点的流份合并，浓缩，浸膏进一步经Rp-18柱层析、LH-20柱层析或HPLC，以甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水洗脱分离、纯化，得到桔梗皂苷D。

桔梗皂苷D  白色无定形粉末，Lieberman-Burchard反应和Molish反应均呈阳性。HRESI-MS谱准分子离子峰m/z 1247.5752[M+Na]⁺(计算值：1247.5672)，分子式：C₅₇H₉₂O₂₈。¹³C NMR数据(Pyridine-d₅)：45.2(C-1)、70.5(C-2)、86.7(C-3)、48.1(C-4)、47.0(C-5)、19.4(C-6)、33.5(C-7)、40.4(C-8)、47.7(C-9)、37.5(C-10)、24.2(C-11)、123.1(C-12)、144.3(C-13)、42.4(C-14)、36.2(C-15)、73.9(C-16)、49.7(C-17)、41.5(C-18)、46.3(C-19)、30.9(C-20)、36.0(C-21)、32.2(C-22)、63.6(C-23)、66.4(C-24)、18.4(C-25)、17.6(C-26)、27.1(C-27)、176.0(C-28)、33.2(C-29)、24.7(C-30)；Glucose 106.3(C-1)、75.2(C-2)、78.7(C-3)、71.6(C-4)、78.8(C-5)、62.6(C-6)；Arabinose 93.7(C-1)、75.4(C-2)、71.6(C-3)、67.0(C-4)、63.6(C-5)；Rhamnose 101.2(C-1)、71.9(C-2)、72.8(C-3)、83.9(C-4)、69.4(C-5)、18.4(C-6)；Xylose 106.8(C-1)、75.2(C-2)、84.8(C-3)、70.5(C-4)、68.5(C-5)；Apiose 111.3(C-1)、77.8(C-2)、80.5(C-3)、75.2(C-4)、65.4(C-5)。

制备桔梗皂苷D2

药材桔梗粗粉5kg，以70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浸膏加适量水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。水层以水饱和丁醇或戊醇萃取，直至萃取液近无色，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物。醇萃取物经大孔吸附树脂柱，用水和乙醇混合液进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分离得到桔梗总皂苷。桔梗总皂苷进行硅胶或氧化铝柱色谱，先以氯仿、乙酸乙酯或二氯甲烷和甲醇(或乙醇)进行梯度洗脱，，用薄层色谱检查洗脱液，含有桔梗皂苷D2斑点的流份合并，浓缩，浸膏进一步经Rp-18柱层析、LH-20柱层析或HPLC，以甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水洗脱分离、纯化，得到桔梗皂苷D2。

桔梗皂苷D2白色无定形粉末，Lieberman-Burchard反应和Molish反应均呈阳性。HRESI-MS谱准分子离子峰m/z 1409.6198[M+Na]⁺(计算值：1409.6201)，分子式：C₆₃H₁₀₂O₃₃。¹³C NMR数据(Pyridine-d₅)：45.0(C-1)、69.4(C-2)、88.6(C-3)、48.0(C-4)、47.0(C-5)、19.3(C-6)、33.6(C-7)、40.4(C-8)、47.7(C-9)、37.4(C-10)、24.1(C-11)、123.1(C-12)、144.3(C-13)、42.3(C-14)、36.1(C-15)、73.9(C-16)、49.6(C-17)、41.4(C-18)、46.5(C-19)、30.9(C-20)、36.0(C-21)、32.1(C-22)、63.6(C-23)、66.3(C-24)、18.4(C-25)、17.6(C-26)、27.1(C-27)、176.0(C-28)、33.2(C-29)、24.7(C-30)；Glucose(inner)105.7(C-1)、74.0(C-2)、88.6(C-3)、70.4(C-4)、78.1(C-5)、62.2(C-6)；Glucose(terminal)105.6(C-1)、75.4(C-2)、78.7(C-3)、71.9(C-4)、78.3(C-5)、62.5(C-6)；Arabinose 93.6(C-1)、75.5(C-2)、70.4(C-3)、66.3(C-4)、63.4(C-5)；Rhamnose 101.2(C-1)、71.6(C-2)、72.7(C-3)、83.8(C-4)、68.5(C-5)、18.2(C-6)；Xylose 106.7(C-1)、75.2(C-2)、84.8(C-3)、69.7(C-4)、66.9(C-5)；Apiose 111.2(C-1)、77.7(C-2)、80.4(C-3)、75.2(C-4)、65.4(C-5)。

实施例2含皂苷佐剂的乙肝疫苗制剂

称取桔梗总皂苷、桔梗皂苷D或桔梗皂苷D2500μg和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)100μg，以生理盐水10ml溶解，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装，每支1ml。每ml含皂苷50μg和HBsAg 10μg。

实施例3含铝胶和皂苷佐剂的乙肝疫苗制剂

称取桔梗总皂苷、桔梗皂苷D或者桔梗皂苷D2适量，以生理盐水溶解，制成浓度为100μg/ml的溶液，以0.22μm微孔滤膜滤过。将该皂苷溶液与等体积的含铝佐剂乙型肝炎病毒表面抗原疫苗原液(每ml含HBsAg 20μg和氢氧化铝500μg)，混合均匀，无菌分装，每支1ml。每ml含皂苷50μg、HBsAg 10μg和氢氧化铝250μg。

实施例4桔梗总皂苷、桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2的溶血性

以真空采血管从兔耳静脉采集血液，加生理盐水，混匀，1500r/m离心10min，洗涤3次，收集红细胞以生理盐水稀释制成0.5％红细胞悬液，备用。取Quil A、桔梗总皂苷、桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2，分别用生理盐水溶解，并作倍比稀释制成浓度为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81μg/ml的稀释液。于96孔微量板中，分别加入0.5％兔红细胞悬液100μl及不同浓度的皂苷稀释液100μl，混匀，每个浓度重复3孔。另设生理盐水及蒸馏水分别作为最小和最大的溶血性对照。37℃培养箱放置30min，1500r/m离心10min。各孔取上清液100μl，以酶标仪于波长405nm处测定OD值。重复3次，计算引起50％溶血的浓度(HD₅₀)。结果显示：桔梗总皂苷、桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2对0.5％兔红细胞的HD₅₀值分别为37.91±2.24、11.79±0.55和18.57±1.37μg/ml，而QuilA在相同条件下测得的HD₅₀值为5.76±0.23μg/ml。说明桔梗总皂苷、桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2的溶血性均显著低于Quil A(p＜0.01)。

实施例5桔梗总皂苷对重组乙肝疫苗的佐剂作用

实验方法：清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只注射生理盐水0.2ml；重组乙肝表面抗原(HBsAg)对照组：每只注射浓度为20μg/ml的HBsAg溶液0.2ml；氢氧化铝对照组：每只注射0.2ml含200μg氢氧化铝的HBsAg溶液(20μg/ml)；桔梗总皂苷试验组：每只注射0.2ml含桔梗总皂苷(50、100、200μg)的HBsAg溶液(20μg/ml)。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天，采血，分离血清，进行抗原特异性抗体效价检测。

结果与分析：图1为桔梗总皂苷对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响。桔梗总皂苷能显著或极显著提高HBsAg免疫小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2b抗体滴度，且100、200μg剂量免疫小鼠血清中特异性IgG1和IgG2b抗体效价显著高于Alum免疫组。说明桔梗总皂苷既能诱导Th1型免疫应答反应，也能引发Th2型免疫应答反应，且对抗体应答的佐剂活性显著优于铝胶佐剂。

实施例6桔梗皂苷D对重组乙肝疫苗的佐剂作用

实验方法：清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只注射生理盐水0.2ml；重组乙肝表面抗原(HBsAg)对照组：每只注射浓度为20μg/ml的HBsAg溶液0.2ml；氢氧化铝对照组：每只注射0.2ml含200μg氢氧化铝的HBsAg溶液(20μg/ml)；桔梗皂苷D试验组：每只注射0.2ml含桔梗皂苷D(50、75、100μg)的HBsAg溶液(20μg/ml)。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天，采血，分离血清，检测特异性抗体效价；将小鼠断颈处死，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，进行脾细胞增殖反应、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞活性以及细胞因子分泌能力分析。

结果与分析：(1)图2为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠脾细胞增殖反应的影响。桔梗皂苷D能显著或极显著促进Con A、LPS和HBsAg诱导的免疫小鼠脾细胞增殖反应，而铝胶对Con A、LPS和HBsAg诱导的免疫小鼠脾细胞增殖反应无显著影响。说明桔梗皂苷D能显著增强小鼠T、B淋巴细胞对HBsAg的免疫应答反应，且对细胞免疫应答的佐剂作用显著优于铝胶。(2)图3为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响。桔梗皂苷D能显著或极显著提高HBsAg免疫小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价，且100μg剂量免疫组小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度显著或极显著高于Alum免疫组。说明桔梗皂苷D既能诱导Th1型免疫应答反应，也能引发Th2型免疫应答反应，且对抗体应答的佐剂活性显著优于铝胶佐剂。(3)图4为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠NK细胞活性的影响。桔梗皂苷D能显著增强HBsAg免疫小鼠NK细胞活性，而铝胶免疫组与HBsAg单独免疫组的NK细胞活性无显著性差异。说明桔梗皂苷D能显著促进HBsAg免疫小鼠NK细胞的非特异性杀伤活性。(4)图5为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠特异性CTL活性的影响。桔梗皂苷能显著增强HBsAg免疫小鼠抗原特异性CTL活性，而铝胶佐剂对免疫小鼠CTL应答无显著性影响。说明桔梗皂苷D能诱导免疫小鼠产生特异性CTL应答，显著增强免疫小鼠CTL的特异性杀伤活性。(5)图6为桔梗皂苷D对HBsAg免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响。桔梗皂苷D联合HBsAg免疫小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-10含量极显著高于HBsAg单独免疫小鼠。说明桔梗皂苷D不仅能显著促进HBsAg免疫小鼠分泌Th2型细胞因子的能力，而且也诱导Th1型细胞因子的产生，进一步证实桔梗皂苷D能诱导机体对疫苗抗原同时产生Th1型和Th2型免疫应答。

实施例7桔梗皂苷D2对重组乙肝疫苗的佐剂作用

实验方法：清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只注射生理盐水0.2ml；重组乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗对照组：每只注射浓度为20μg/ml的HBsAg溶液0.2ml；氢氧化铝对照组：每只注射0.2ml含200μg氢氧化铝的HBsAg溶液(20μg/ml)；桔梗皂苷D试验组：每只注射0.2ml含桔梗皂苷D2(50、75、100μg)的HBsAg溶液(20μg/ml)。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天，采血，分离血清，检测特异性抗体效价；将小鼠断颈处死，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，进行脾细胞增殖反应及分泌细胞因子能力检测。

结果与分析：(1)图7为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。桔梗皂苷D2与HBsAg联合免疫小鼠脾细胞经Con A、LPS和HBsAg刺激后，增殖反应显著高于HBsAg对照组和铝胶对照组。说明桔梗皂苷D2能显著增强免疫小鼠T、B淋巴细胞对HBsAg的免疫应答反应，对细胞免疫应答的佐剂作明显著优于铝胶佐剂。(2)图8为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响。桔梗皂苷D2能显著或极显著提高HBsAg免疫小鼠血清中特异性IgG、IgGl、IgG2a和IgG2b抗体滴度，且特异性IgG2a和IgG2b抗体滴度显著或极显著高于Alum免疫组。说明桔梗皂苷D2既能诱导Th1型免疫应答反应，也能引发Th2型免疫应答反应，且对Th1免疫应答的佐剂活性显著优于铝胶佐剂。(3)图9为桔梗皂苷D2对HBsAg免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响。桔梗皂苷D和HBsAg联合免疫小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-10含量极显著高于HBsAg单独免疫小鼠和铝胶免疫小鼠。说明桔梗皂苷D2不仅能同时显著促进HBsAg免疫小鼠分泌Th1型和Th2型细胞因子的能力，而且对脾细胞分泌细胞因子的佐剂活性显著优于铝胶佐剂。

实施例8桔梗皂苷D对禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)的佐剂作用

实验方法：将桔梗皂苷D以生理盐水溶解制成浓度分别为0.5、0.75和1.0mg/ml的稀释液，以0.22μm微孔滤膜滤过，备用。将商品铝胶(Alum)以生理盐水稀释制成2mg/ml的混悬液。将商品禽流感-新城疫重组二联活疫苗(rL-H5株)加入生理盐水500ml，混匀，制成疫苗稀释液。取疫苗稀释液与等量生理盐水、铝胶稀释液或桔梗皂苷D稀释液等量混匀，分别于第1和15天皮下注射免疫小鼠。二免后14天，采血，分离血清，进行H5抗原特异性抗体效价检测。

结果与分析：图10为桔梗皂苷D对禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫小鼠血清中特异性抗体效价的影响。桔梗皂苷D2能显著或极显著提高免疫小鼠血清中H5抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度，且75μg剂量免疫小鼠血清中特异性IgG2a和IgG2b抗体滴度显著高于Alum免疫组。说明桔梗皂苷D能同时诱导Th1型和Th2型免疫应答反应，且对Th1型免疫应答的佐剂活性显著优于铝胶佐剂。

实施例9桔梗皂苷D2对H22瘤苗的免疫佐剂作用

实验方法：将桔梗皂苷D2以生理盐水溶解制成浓度分别为0.1、0.25和0.5mg/ml的稀释液，以0.22μm微孔滤膜滤过，备用。称取Quil A适量，以生理盐水溶解制成浓度为0.1mg/mL的稀释液，以0.22μm微孔滤膜滤过，备用。取小鼠H₂₂肝癌细胞以磷酸缓冲液(pH7.2)制成2×10⁷个/ml的细胞悬液，置液氮罐口放置10min，取出后迅速放入37℃的水浴，如此反复冻融5次。1500r/min离心10min，收集上清液，10000r/min离心10min。取上清液以0.22μm的滤膜过滤，得H22肝癌细胞的冻融抗原溶液。取冻融抗原溶液与等量生理盐水、Quil A稀释液或桔梗皂苷D2稀释液混匀，皮下注射免疫小鼠，每只小鼠注射容量0.2mL。1周后加强免疫，免疫方法及剂量相同。二免后7天，于前肢腋下皮下注射H₂₂瘤液0.2mL。接种瘤液后第10天，称体重，断颈处死小鼠，取出瘤块并称重，计算抑瘤率。

结果与分析：桔梗皂苷D2联合H22细胞冻融抗原免疫荷瘤小鼠的瘤重显著小于抗原单独免疫小鼠，说明结果桔梗皂苷D2对肿瘤疫苗具有显著的佐剂作用(表1)。

表1桔梗皂苷D2对H22瘤苗的免疫佐剂作用

Claims (6)

1、具有免疫佐剂作用的皂苷，其特征是从中药桔梗中提取分离的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2和包含有这2种皂苷化合物的桔梗总皂苷。

2、制备权利要求1中涉及的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2以及桔梗总皂苷的方法，该方法包括以下步骤：

a.将桔梗药材粉碎后，以乙醇提取；

b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用乙醚或石油醚萃取至醚液近无色。取水层以水饱和的正丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，减压回收、浓缩，得到醇萃取物；

c.醇萃取物在大孔吸附树脂柱中进行色谱分离，以水和乙醇混合液进行梯度洗脱；

d.硅胶薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的洗脱液合并，浓缩，得到桔梗总皂苷；

e.桔梗总皂苷再经硅胶、Sephadex LH-20柱色谱或HPLC，以洗脱剂洗脱、分离，得到桔梗皂苷D和桔梗皂苷D2。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤e中所说的洗脱剂为甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水的混合物。

4、用于预防和治疗人兽传染性疾病和癌症的疫苗制剂，其中包含有免疫有效量的权利要求1所述的桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或桔梗总皂苷和药物学上可接受的载体。

5、根据权利要求5所述的疫苗制剂，其特征在于桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或桔梗总皂苷量为0.01μg～1g/单剂量。

6、根据权利要求1的所述的具有免疫佐剂作用的皂苷，在制备预防和治疗传染性疾病和癌症的疫苗制剂中的应用。

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