CN108853493A - 麦冬皂苷d及其纳米乳在制备疫苗佐剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及麦冬皂苷D及其纳米乳佐剂在制备疫苗佐剂中的应用。本发明筛选出具有显著疫苗佐剂活性的免疫刺激分子麦冬皂苷(OP‑D)，并通过低能乳化法成功制备出具有显著提高麦冬皂苷溶解度，质量稳定，粒径在1‑100纳米范围内的麦冬皂苷纳米乳(NOD)佐剂。通过体内外的急性毒性和细胞毒性研究证实，该纳米乳佐剂具有明显减低其毒副作用，能较好诱导疫苗抗原免疫应答，减低细菌定植量，提高动物的存活率和延长动物的存活时间，具有显著增强疫苗保护效果的作用。本发明研究证实，该免疫刺激分子OP‑D及其纳米乳佐剂能够发挥疫苗佐剂效果，具有良好的应用前景与实际应用价值。

Description

麦冬皂苷D及其纳米乳在制备疫苗佐剂中的应用
技术领域
本发明属于疫苗佐剂技术领域，涉及麦冬皂苷D及其纳米乳佐剂制备方法及应用。
背景技术
疫苗接种仍然是控制和预防传染病最具成本效益和意义的生物医学方法。特别是，重组蛋白疫苗具有一些明显的优势，尽管这些疫苗通常不那么具有免疫性，无法引起足够的免疫反应，需要外源性疫苗佐剂来增强其效力。不幸的是，尽管目前可获得的疫苗种类繁多，但已被批准用于使用的疫苗佐剂却很少。由于这些化合物可能增加抗原的免疫原性，铝盐被广泛用作疫苗佐剂。然而，铝佐剂也有一些缺点，如与这类佐剂相关的细胞免疫反应弱。因此，研发新的疫苗佐剂尤为重要。
传统中药麦冬因其强大的滋补作用而在历史上一直被广泛使用，这种中药最近被作为参麦散血脑的主要成分进行研究，但没有任何有关麦冬在佐剂中的应用。麦冬皂苷D(OP-D)是麦冬的主要药理活性成分，具有抑制静脉血栓形成、抗炎和抗氧化活性等药理作用。OP-D与其他皂苷一样，具有单糖链结构，其被认为是佐剂的活性中心。然而，在OP-D的开发应用中仍存在许多问题，如溶解度差和溶血作用强。
麦冬皂苷D皂苷能激活哺乳动物的免疫系统，这一发现引起了人们对其作为疫苗佐剂的潜在用途的极大兴趣。近期研究表明，QS-21作为皂苷的典型代表，在诱导抗体和细胞介导的免疫应答中具有较强的佐剂活性。因此，QS-21现在是许多试验疫苗的候选佐剂，包括HIV-1、癌症、乙肝、疟疾和其他疫苗。然而，QS-21由于某些缺陷，如Th2免疫反应低、溶血作用强、来源稀少等，在临床应用中应用有限。最近的研究表明，QSA-21是皂苷的典型代表，在诱导抗体和细胞介导的免疫应答方面具有很强的佐剂活性。因此，QS-21现在是许多试验疫苗的候选佐剂，包括HIV-1疫苗、癌症、乙型肝炎、疟疾和其他。然而，由于某些缺陷，如低Th2免疫应答、强溶血效应和非常稀少的来源，QS21在临床应用中的应用有限。尽管如此，各种单体皂苷也被证实具有很强的佐剂活性，尽管这些皂苷也有缺点。例如，喹啉A及其皂苷(如QS-21)的佐剂活性已被证明在兽医和人类疫苗的研究中，但高毒性和不希望的溶血作用是限制其在人类疫苗中使用的主要限制因素。此外，人参皂苷可诱导Th1和Th2免疫应答，根据抗原和种类而变化，但是，高剂量和低度佐剂需要与其他佐剂结合以增强效果。因此，皂苷作为佐剂的应用正受到越来越多的关注，因为其临床应用前景巨大。
众所周知，使用合适的疫苗佐剂和疫苗给药系统是设计理想疫苗的重要因素。申请人前期及最近研究表明，直径为1-100nm的纳米乳液由表面活性剂或助表面活性剂、油和水组成，具有高度热力学稳定性，并形成单一的光学各向同性液体。这种组合已经显示出有效的疫苗佐剂活性，特别是由完整病毒组成的纳米乳佐剂疫苗，如呼吸道合胞体流感和HIV。申请人最近的研究表明，纳米乳液为基础的佐剂可以有效地诱导广泛的粘膜免疫应答。此外，纳米乳液清楚地提高牛血清白蛋白或重组蛋白(HLAH35LISBD34-465)的稳定性，同时保持良好的结构完整性、特异性和相对生物活性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种麦冬皂苷D及其纳米乳在制备疫苗佐剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
麦冬皂苷D在制备疫苗佐剂中的应用。
优选的，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
一种疫苗佐剂，包含麦冬皂苷D。
优选的，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
麦冬皂苷D纳米乳(NOD)在制备疫苗佐剂中的应用，所述麦冬皂苷D纳米乳是以麦冬皂苷D为原料经低能乳化法制得。
优选的，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
优选的，所述麦冬皂苷D纳米乳粒度为1～100nm，电位为30～-30mV。
优选的，所述麦冬皂苷D纳米乳是通过以下质量百分比的组分制成的：表面活性剂0.5～27％，助表面活性剂0.1～9％，油相0.1～9％，麦冬皂苷D 0.1～1％，余量为蒸馏水。
进一步优选的，所述表面活性剂选自EL-35、吐温-80或RH40。
进一步优选的，所述助表面活性剂选自丙二醇、司盘85或司盘80。
进一步优选的，所述油相选自GTCC、角鲨烯或肉豆蔻酸异丙酯。
进一步优选的，所述麦冬皂苷D纳米乳的制备方法如下：将配方量的表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入麦冬皂苷D和油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。
一种疫苗佐剂，包含麦冬皂苷D纳米乳。
优选的，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
麦冬皂苷D纳米乳(NOD)，是以麦冬皂苷D为原料经低能乳化法制得。
本发明的有益效果在于：
本发明筛选出具有显著疫苗佐剂活性的免疫刺激分子麦冬皂苷(OP-D)，再通过低能乳化法成功制备出具有极高提高麦冬皂苷溶解度，质量稳定，粒径在1～100nm范围内麦冬皂苷纳米乳(NOD)。通过体内外急性毒性和细胞毒性研究证实，该纳米乳明显降低毒副作用，能较好诱导疫苗抗原免疫应答，减低细菌定植量，提高动物的存活率和延长动物的存活时间，能显著增强疫苗保护效果。本发明研究证实，该免疫刺激分子OP-D及其纳米乳佐剂能够发挥疫苗佐剂效果，具有良好的应用前景。具体如下：
1.本发明研究证实，麦冬皂苷D在剂量浓度为0.75～12mg/kg范围内具有良好的疫苗佐剂活性，能显著提高血清中IgG、IgG1、IgG2a等的抗体滴度，且效果明显好于目前常用的铝佐剂。
2.用低能乳化法成功制备出具有极高提高麦冬皂苷溶解度，质量稳定，粒径在1～100纳米范围，具有高度热力学稳定体系的麦冬皂苷纳米乳(NOD)。
3.该纳米乳佐剂具有明显的体外缓释作用，促进树突状细胞的吞噬、递呈和活化。研究发现，抗原/NOD诱导BMDC和pMΦ相比能够更加有效地激活抗原/OP-D。因此，NOD导致了更有效的BMDC激活，促进了APCs更高效的抗原捕获。
4.通过体内外急性毒性实验研究证实，该纳米乳佐剂具有明显降低其溶血、急性毒性和细胞毒性。
5.本发明的麦冬皂苷D纳米乳佐剂可以改善免疫反应，包括增加弱抗原的免疫原性、提高免疫反应的速度和持续时间、调节抗体的速度、特异性、同型或亚类分布。对于体液反应，与OP-D和磷酸铝佐剂(AlPO4)相比，用NOD配制的抗原会产生更强的抗体反应。此外，与抗原/OP-D和抗原/AlPO4配方相比，抗原/NOD配方诱导的IgG2a/IgG1比值显著升高。研究发现，抗原/NOD组的体液反应最强，根据IgG2a/IgG1比率，免疫反应被提升为Th1免疫应答。
6.皂苷佐剂可诱导细胞免疫应答，但目前尚无针对OP-D的细胞免疫应答的研究。研究发现，结合抗原的OP-D、BNE、NOD或AlPO4，IFN-γ，IL-4和IL-17的诱导水平明显高于抗原组。结合抗原的OP-D可以刺激细胞的强烈免疫反应，而NOD+抗原会比OP-D+抗原产生更强的细胞因子释放。在不同的MRSA感染模型中，抗原特异性Th1/Th17反应与提高生存率，而Th2细胞反应有助于促进类转换并产生更多的功能性抗体反应。研究结果表明，NOD+抗原会引起细胞的强烈反应，这可能在保护作用中发挥重要作用。
上述这些结果表明，本发明的麦冬皂苷D(OP-D)及其纳米乳佐剂(NOD)是一种有前途的、安全的亚单位疫苗佐剂。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1OP-D的结构和用抗原联合不同剂量的OP-D免疫诱导强烈的抗体应答；
图2纳米乳佐剂(NOD)的制备及其表征；
图3纳米乳佐剂体外细胞和急性毒性研究；
图4纳米乳佐剂对DC细胞吞噬研究；
图5纳米乳佐剂对DC细胞活化研究；
图6NOD纳米乳佐剂的血清中抗体应答水平；
图7纳米乳佐剂增强细胞免疫应答；
图8NOD联合抗原在MRSA脓毒症模型中的保护作用；
图9NOD纳米佐剂联合OVA抗原免疫的免疫应答作用。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的实施例进行详细的描述。
实验动物和饲养环境：所有动物实验均按照《实验动物的护理和使用指南》进行，并获得第三军医大学(中国重庆)动物伦理实验委员会的批准。六周昆明小鼠来自中国重庆第三军医大学实验动物中心。BALB/c小鼠(SPF级，6-8周，雌鼠)和C57BL/6小鼠(SPF级，4-6周，母鼠)均来自北京HFK生物科学有限公司(北京)。所有老鼠热压处理过的颗粒饮食和无菌水在以下住房条件：23℃，湿度50％，半天光照/黑暗时期，以最小的干扰和安静的环境。
蛋白：MRSA重组蛋白HlaH35LIsdB348-465(1mg/mL)，来源于IsdB和Hla，其峰值时间为13.843min，纯度(HPLC)为99.4％，实验室自制(专利申请CN105251002A)。OVA(鸡卵清白蛋白)：Sigma公司。
1.OP-D能作为新颖疫苗佐剂的确定。
如图1所示，48只小鼠(n＝8)与不同剂量免疫剂量0，0.75，1.5，3.0，6.0，12mg/kg(折合成每只小鼠0、15、30、60、120、240μg/mice)0、7、14天三次肌肉免疫。末次免疫后7天，ELISA检测所有老鼠血清IgG抗体滴度，结果发现，麦冬皂苷D在剂量浓度为0.75mg/kg-12mg/kg范围内具有良好的疫苗佐剂活性。由于疫苗佐剂剂量繁多，以下将选择1.5mg/kg(30μg/mice)作为代表进行研究。
将40只小鼠随机分成5组，PBS，单纯OP-D、单纯抗原组、OP-D+抗原组、磷酸铝佐剂+抗原组，每只8只动物。分别对所有小鼠，0、7、14天三次肌肉免疫。末次免疫后7天，ELISA检测所有老鼠血清IgG及其IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度。结果再次发现，麦冬皂苷D具有良好的疫苗佐剂活性。在第21天的总IgG应答中，接种抗原/OP-D可诱导明显高于抗原(P<0.001)和抗原/AlPO4组的IgG滴度(P<0.001)。此外，IgG1、IgG2a和IgG2b水平的结果也表明，OP-D对AlPO4佐剂具有显著的免疫增强作用(P<0.05)。因此，OP-D增强了抗体免疫应答。
2.NOD纳米乳佐剂的处方与制备
以下处方均能成功制备NOD纳米乳佐剂：
处方1：麦冬皂苷D 0.05g、丙二醇4.8g、吐温-80 19.6g、IPM 6g、蒸馏水69.55g。
制备方法：将表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入麦冬皂苷D和油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。
处方2：麦冬皂苷D 0.05g、丙二醇9g、EL-35 27g、IPM 9g、蒸馏水54.94g。制备方法同处方1。
处方3：麦冬皂苷D 0.5g、吐温-80 27g、司盘-80 9g、角鲨烯9g、蒸馏水54.5g。制备方法同处方1。
处方4：麦冬皂苷D 1.0g、司盘80 3g、吐温-80 27g、GTCC 9g、蒸馏水60g。制备方法同处方1。
处方5：麦冬皂苷D0.4g、司盘80 9g、RH-40 27g、角鲨烯9g、蒸馏水54.6g。制备方法同处方1。
处方6：麦冬皂苷D 0.1g、丙二醇0.2g、吐温-80 10g、RH40 5g、IPM 0.1g、蒸馏水84.6g。制备方法处方1。
处方7：麦冬皂苷D 0.02g、EL-35 1g、司盘-85 0.2g、角鲨烯0.1g、蒸馏水98.68g。制备方法同处方1。
处方8：麦冬皂苷D 0.1g、丙二醇2g、吐温-80 15g、IPM 6g、蒸馏水76.9g。制备方法同处方1。
处方9：麦冬皂苷D 0.2g、甘油0.2g、EL35 1g、GTCC 2g、蒸馏水96.6g。制备方法同处方1。
处方10：麦冬皂苷D 0.2g、EL-40 10g、丙二醇1g、GTCC 0.1g、蒸馏水87.8g。制备方法同处方1。
处方11：麦冬皂苷D 1g、EL-35 15g、RH-40 10g、司盘-80 9g、IPM 5g、蒸馏水60g。制备方法同处方1。
处方12：麦冬皂苷D 0.5g、EL-35 20g、司盘85 0.2g，IPM 9g、蒸馏水70.3g。制备方法同处方1。
处方13：麦冬皂苷D 0.8g、甘油5g、RH-40 27g、司盘-85 0.2g、GTCC 9g、蒸馏水58g。制备方法同处方1。
处方14：麦冬皂苷D 1.0g、甘油5g、RH-40 27g、司盘-80 5g、角鲨烯9g、蒸馏水38.9g。制备方法同处方1。
处方15：麦冬皂苷D 1.0g、吐温80 1g、RH40 20g、司盘-80 2g、GTCC 1g、蒸馏水75g。制备方法处方1。
处方16：麦冬皂苷D 0.5g、RH-40 1g、吐温80 15g、司盘80 8g、角鲨烯5g、蒸馏水70.5g。制备方法同处方1。
处方17：麦冬皂苷D 0.5g、吐温80 15g、丙二醇1g、司盘80 1g、GTCC 4g、蒸馏水81g。制备方法同处方1。
处方18：麦冬皂苷D 0.3g、EL-35 10g、RH-40 10g、丙二醇1g、GTCC 0.1g、蒸馏水78.6g。制备方法同处方1。
处方19：麦冬皂苷D 0.2g、吐温-80 10g、丙二醇1g、司盘80 1g、角鲨烯2g、蒸馏水85.8g。制备方法同处方1。
处方20：麦冬皂苷D 0.3g、吐温-80 15g、EL35 10g、司盘85 1g、GTCC 3g、蒸馏水69.7g。制备方法同处方1。
随机选择以上五个处方，将40只小鼠随机分成5组，每只8只动物。分别对所有小鼠，0、7、14天三次肌肉免疫。末次免疫后7天，ELISA检测所有老鼠血清IgG及其IgG1、IgG2a和IgG2b抗体滴度。结果再次发现，五个处方的麦冬皂苷D纳米乳具有良好的疫苗佐剂活性，均能有效诱导种抗原产生高强度的体液和细胞免疫应答。
由于本实验涉及处方众多，以下研究随机选取一个处方进行代表性研究。
3.NOD纳米乳的表征(图2)
用透射电子显微镜(TEM；JEM-1230，东京，日本)表征其形态。用纳米ZS 90(MalvnIndices Ltd.，Malvern，英国)DLS测量纳米乳液的物理化学特性，如粒径、多分散性指数和Zeta电位。用在25℃下，在13000g离心30分钟后，评价了纳米乳液的热力学稳定性，用浊度、相分离、沉淀、药物分离、破乳和乳浊液等指标对纳米乳的外观进行了研究。
用DSC-TGA Q600仪器(TA仪器，美国)在氮气气氛下从室温至200℃加热速率为10℃/min，进行差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TG)分析。测定OP-D和NOD的重量损失，并在铝板上仔细密封样品。通过监测某些波段的峰值频率和位置，确定了所有可能的化学变化和相互作用。
研究结果发现，通过低能乳化的方法制备了新型的NOD的佐剂。TEM显示，纳米乳乳滴主要在1～100nm范围内，DLS其NOD的平均尺寸适当(76.45±0.32nm)，分布窄(PdI值为0.16±0.022，PdI<0.3)，电位(0.3±0.20mV)。此外，NOD的电泳迁移率和电导率分别为-0.055±0.016μmcm/Vs，0.055±0.007mS/cm，分别。由于NOD在离心后没有浑浊、相或药物分离、乳化、沉淀、破乳或其他不稳定的外观(13000g，30min)，所以系统是稳定的。综上所述，所得NOD具有良好的尺寸分布和稳定的电位。在OP-D的热力学曲线图中，主峰63.84℃，但是，在NOD中该主峰完全吸收。此外，NOD在80.52℃出现峰值，说明OP-D封装在纳米乳内导致峰迁移。然后又进行了TG测试，以确定OP-D是否成功封装为NOD，TG分析的峰值显示最高失重率。结果所示，OP-D和NOD的TG峰均有类似的一步失重。OP-D和NOD均是在大约30℃开始减重，分别在大约68.16℃和81.86℃最大失重。OP-D和NOD均显著失重(分别为3.10％和4.23％)。因此，这些数据说明成功加载了OP-D。
4.纳米乳佐剂的稳定性研究
稳定性是一个制剂非常重要的评价指标。根据长期稳定性，NOD样品(n＝3)分别放置在4℃下，分别为0,1,3个月和6个月。用高效液相色谱法测定OP-D的NOD浓度。得到了NOD的相对百分率及其保存时间。基于OP-D相对百分含量随时间变化的影响，NOD的保存时间为17.08个月。
5.麦冬皂苷纳米乳减毒作用(图3)
用CCK-8试剂盒(DOJUDO，日本)测定了L929细胞中OP-D和NOD的细胞毒性。测量并计算细胞存活率和半数最大抑制浓度(IC50)。无菌盐水溶液在180g离心5分钟，将脱脂绵羊血液(MRC，中国)等份洗涤三次，最后将球团稀释至0.5％，在盐水溶液中制备细胞悬液，将0.5毫升细胞悬浮液与0.5毫升稀释液混合。在生理盐水中加入麦冬皂苷D 0、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、3.84mg/ml，在37℃下孵育30min，70g离心10min，在412nm处分光光度法测定上清液中游离血红蛋白。Triton X-100(PBS中的1％V/V；Sigma)被用作阳性对照。从所有组中减去盐水对照的溶血百分率。每个实验包括在每个浓度上的三倍。四个独立的实验进行了每个HD50值的分析。
为评估急性毒性，昆明小鼠灌胃或肌肉注射给药O-D或NOD。监测小鼠24小时，记录死亡时间和死亡率。计算生存曲线和OP-D和NOD的LD50值。BALB/c小鼠在第1天通过肌肉注射免疫64、32、16、8和4mg/kg OP-D或NOD。监测小鼠14天，记录死亡时间和死亡率。计算生存曲线和OP－D和NOD的LD50值。对急性肌肉毒性在组织病理学方面，注射用10％磷酸缓冲福尔马林固定并注射石蜡包埋肌肉组织。制备四微米厚切片，用苏木精和曙红(HE)染色显微镜检查。在第1天和第3天从所有小鼠中收集血清，并在80℃保存。用ELISA试剂盒测定上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子的水平。
细胞毒性发现，NOD的IC50值L929细胞(1144.91μg/ml)是OP-D的2.96倍(384.62μg/ml)。溶血毒性表明,NOD能明显降低其溶血毒性。通过不同剂量(8、16、32和64mg/kg)的胃内给药评估OP-D和NOD的急性口服毒性。结果显示，随着OP-D和NOD剂量的增加，生存率明显降低。此外，NOD的LD50(193.786mg/kg)；95％LD50、74.553-463.426mg/kg比OP-D高4.18倍(46.328mg/kg)；95％LD50,15.258-125.873mg/kg)。这些结果表明，NOD可以显著降低细胞和小鼠的毒性，说明NOD在动物中是安全的。用不同剂量(8,16,32和64mg/kg)肌肉注射给药，评价OP-D和NOD的急性口服和急性肌肉毒性。通过肌肉注射不同剂量(4.0,8.0,16.0,32.0和64.0mg/kg)评价OP-D和NOD肌肉毒性。随着OP-D和NOD剂量的增加，存活率显着降低。此外，NOD的LD50(49.43mg/kg；95％LD50，258.88-93.22mg/kg)比OP-D高2.38倍(20.74mg/kg；95％LD50,10.69-40.27mg/kg)。组织学分析和严重程度评分的结果表明，低剂量OP-D和NOD组小鼠的注射部位肌肉比高剂量组显示出更少的肌肉脓肿和炎性细胞浸润。
结果所示，随着OP-D和NOD剂量的增加，存活率显著降低。NOD高2.31倍。IL-1β、IL-6和TNF-α是促炎性细胞因子，是炎症反应的重要介质。NOD组IL-1β、IL-6和TNF-α明显低于OP-D组(P＜0.01)，提示纳米乳佐剂OP-D可减轻炎症反应。
6.NOD对疫苗的增强免疫应答，提高疫苗保护作用
将48只小鼠随机分成6组，PBS,单纯抗原组、OP-D+抗原组(抗原/OP-D)、NOD+抗原组、空白纳米乳+抗原组(BNE/抗原)、磷酸铝佐剂+抗原组(抗原/AlPO4)，每只8只动物。分别对所有小鼠，0、7、14天三次肌肉免疫。在第7、14天和第21天从所有小鼠中收集血清，并在-80℃储存。第二抗体包括HRP结合的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b(美国)。将血清从1:500串联倍比稀释至1:52000。将所有抗体滴度作为对数2值，并在450nm处检测OD值；滴度被定义为产生的吸光度值大于空白对照的两倍以上的最高稀释度。在2.5×106细胞/ml浓度的培养基中(RPMI 1640，10％FBS)悬浮脾细胞，在37℃下用10μg/mL蛋白抗原刺激脾细胞3天。收集上清液进行细胞因子测定，用相应的ELISA试剂盒(美国)测定IFN-γ、TNF-α、白细胞介素-4(IL-4)、IL-12P40、IL-6和IL-17A的水平。对于脓毒症感染模型，BALB/c小鼠分别在第28天或第21天静脉注射MRSA 252(致死感染剂量)1×109CFU或MRSA 252(感染剂量)2.5×108CFU。为确定存活率，在感染后14天对小鼠进行监测。为了评估细菌定植量，在感染后第1天和第3天检测所有的主要器官(血液，脾脏和肾脏)细菌定植量。
如图6在第21天测量了血清中IgG和IgG亚组的反应。用于制备抗原的四种佐剂的IgG水平均显著高于单独的抗原(P<0.001)。此外，与抗原/OP-D、抗原/AlPO4、抗原/BNE及单独在第7、14、21天的抗原相比，NOD诱导的IgG滴度显著高于抗原/OP-D、抗原/AlPO4、抗原/BNE和抗原诱导的IgG滴度(P<0.05)。此外，抗原/NOD组IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度明显高于抗原/OP-D组；P<0.01)。IgG2a/IgG1比值，抗原/NOD组明显高于抗原/OP-D、抗原/AlPO4、抗原/BNE、抗原组；P<0.01)，提示抗原/NOD可诱导Th1偏向Th1的免疫应答。因此，包在纳米乳中的OP-D通过诱导抗原特异性抗体反应，显著提高了疫苗的有效性。
图7研究发现观察到显著增加IFN-γ和IL-12p40抗原/NOD组抗原/OP-D相比,抗原/BNE和抗原/AlPO4组(P<0.01),表明抗原配方NOD增强Th1细胞应答。其次，与抗原/OP-D和抗原/BNE接种相比，接种抗原/NOD的Th2(IL-4)反应明显高于抗原/OP-D和抗原/BNE接种(P<0.01)，但抗原/NOD组的反应水平与抗原/AlPO4组相当(P>0.05)。第三，与抗原/OP-D、抗原/BNE、抗原/AlPO4相比，NOD配制的抗原明显增加了IL-17的生成(P<0.01)，说明用NOD配制的抗原也提高了Th17细胞因子谱。综上所述，用NOD配制的抗原会导致Th1、Th2和Th17的细胞反应，主要是Th1/Th17的免疫反应。
图8为了评价纳米乳佐剂的保护作用，在感染后的第1天和第3天分别测定血液、肾脏和脾脏中的细菌负担。用佐剂配制的抗原组(OP-D、BNE、NOD、AlPO4)与仅用佐剂配制的组相比，各器官中的细菌水平均有显著下降；P<0.05)。与接受抗原/AlPO4(P<0.05)和抗原(P<0.05)的组相比，在血液、肾脏和脾脏中，与OP-D相比，抗原具有明显减弱的细菌水平。然而，在第3天抗原/OP-D和抗原/AlPO4组之间的感染后，没有统计学上的显著差异(P>0.05)。此外，与抗原/OP-D相比，以NOD配制的抗原在这些器官中的细菌清除效果更好(P<0.05)。这些数据表明，抗原/NOD和抗原/OP-D两组均有保护作用，而NOD形成的抗原具有理想的保护作用。
图8通过对MRSA 252的致命挑战来确定小鼠的存活率。接受佐剂配制的抗原组(OP-D、BNE、NOD、AlPO4)的生存率(分别为80％、50％、100％、60％)均高于抗原组(20％)。此外，抗原/NOD和抗原/OP-D组的保护效果明显优于抗原/AlPO4和抗原/BNE组(P<0.05)。虽然抗原/NOD组与抗原/OP-D组生存率相近(P>0.05)，但抗原/NOD组仍能获得最大的保护效果。因此，我们认为在MRSA感染模型中，抗原/NOD免疫具有高度保护作用。
7.NOD的抗原吞噬(图4)和DC细胞的活化(图5)
从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，并在20ng/ml小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D系统，美国)和20ng/ml鼠IL-4(PEPTECH，美国)的存在下培养。将BMDCs接种于24孔板上，每孔覆盖1×106个细胞，在37℃下培养一个晚上，加入OP-D，用20μg/ml的GFP蛋白(Sigma美国)配制的NOD，在37℃孵育30分钟。然后将细胞固定在4％多聚甲醛中，用鬼笔环肽(SalaBio，中国)和DAPI(Sigma，美国)染色。使用ZeIS-LSM800激光扫描共聚焦荧光显微镜(ZeISS，德国)获得图像。腹腔巨噬细胞(PM巨噬细胞s)从预刺激的C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄)中获得。在24孔板上培养BMDC和PM-S，并与PBS、抗原、OP-D加抗原(抗原/OP-D)、NOD加抗原(抗原/NOD)或ALPO4佐剂加抗原(抗原/AlPO4)孵育24小时，然后收获细胞，收集上清液。用ELISA试剂盒(ELISA)测定上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的细胞因子水平。
我们探讨了应用GFP而不是抗原检测抗原呈递增强的可能性。结果发现，在孵育30分钟后，BMDCs中的NOD/GFP颗粒被吞噬体样泡状结构包围。而O-D组也表现出在BMDC中观察到的绿色荧光，在BMDC中没有吞噬体样的泡状结构。这些数据表明，封装在纳米乳液中的OP-D对于BMDC捕获抗原更有效。APC在抗原呈递和随后启动的适应性免疫应答中发挥重要作用。我们还测定了BMDC和PM-S的上清液中炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的浓度。结果发现，抗原/NOD、抗原/OP-D和抗原/ALPO4处理均显著增加了BMDCs和PM-S的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，与单纯的抗原治疗相比，差异有显著性(P＜0.05)。此外，NOD配制的抗原显著改善OP-D和ALPO4组观察到的APCs活化(P＜0.05)；OP-D和ALPO4组诱导细胞因子释放的水平相当(P＞0.05)。这些结果表明，用抗原配制的NOD有效地增强APC激活。
8.NOD在OVA模式抗原发挥疫苗佐剂作用(图9)
将48只小鼠随机分成6组，PBS,OVA,NOD,BNE,OP-D+OVA,NOD+OVA，每只8只动物。分别对所有小鼠，0、14、28天三次肌肉免疫。末次免疫前和首次免疫后21、28、35、42天，ELISA检测所有老鼠血清IgG滴度。结果发现，麦冬皂苷D纳米乳和OP-D具有良好的疫苗佐剂活性，均能有效诱导种抗原产生高强度的体液和细胞免疫应答。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.麦冬皂苷D在制备疫苗佐剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
3.一种疫苗佐剂，其特征在于，包含麦冬皂苷D。
4.根据权利要求1所述的一种疫苗佐剂，其特征在于，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
5.麦冬皂苷D纳米乳在制备疫苗佐剂中的应用，其特征在于，所述麦冬皂苷D纳米乳是以麦冬皂苷D为原料经低能乳化法制得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗佐剂中所含麦冬皂苷D的浓度为0.75～12mg/kg。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述麦冬皂苷D纳米乳是通过以下质量百分比的组分制成的：表面活性剂0.5～27％，助表面活性剂0.1～9％，油相0.1～9％，麦冬皂苷D 0.1～1％，余量为蒸馏水。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述麦冬皂苷D纳米乳的制备方法如下：将配方量的表面活性剂与助表面活性剂混合制成混合表面活性剂，然后向混合表面活性剂中加入麦冬皂苷D和油相混合均匀，再用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳。
9.一种疫苗佐剂，其特征在于，包含麦冬皂苷D纳米乳。
10.麦冬皂苷D纳米乳，其特征在于，是以麦冬皂苷D为原料经低能乳化法制得。
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