CN112552420B - 具有免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途。该多糖是从中药西红花的原植物番红花Crocus sativus L.的花瓣中提取分离纯化得到的纯一多糖番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B和包含有这2种均一多糖的混合物番红花花瓣总多糖，具有显著的免疫佐剂作用。这些多糖可显著促进卵清蛋白及口蹄疫疫苗免疫小鼠自然杀伤细胞活性、脾细胞分泌IL‑2和IFN‑γ能力、提高血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平；增强免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答；增强RAW264.7细胞吞噬活性，上调巨噬细胞细胞因子和趋化因子mRNA表达，诱导RAW264.7细胞分泌细胞因子和趋化因子。

Description

具有免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及从中药西红花的原植物——番红花Crocus sativus L.的花瓣中提取分离纯化得到具有免疫佐剂作用的番红花花瓣多糖A(PCSPA)、番红花花瓣多糖B(PCSPB)和包含有这2种均一多糖的混合物——番红花花瓣总多糖(PCSP)，及其制备方法和以该多糖为活性成分的药物组合物，以及它们作为疫苗佐剂的应用。
背景技术
疫苗接种是预防和控制传染性疾病最经济、有效的措施[Rappuoli R,HanonE.Sustainable vaccine development:a vaccine manufacturer'sperspective.Current opinion in immunology.2018,53:111–118]。近年来，重组蛋白、合成肽、DNA等新型疫苗凭借安全可靠和靶点精确等优势在临床的应用逐渐增多，但这些疫苗均存在免疫原性低或反应原性弱，免疫保护力低等缺陷。佐剂是传统疫苗和新型疫苗必不可少的组成成分，不仅影响机体对疫苗的适应性免疫应答强度，而且能针对特定病原体诱导最有效的免疫应答类型[Gutjahr A,Tiraby G,Perouzel E,Verrier B,PaulS.Triggering intracellular receptors for vaccine adjuvantation.Trends inimmunology.2016,37(9):573–587；Ciabattini A,Pettini E,Fiorino F,Pastore G,Andersen P,Pozzi G,Medaglini D.Modulation of primary immune response bydifferent vaccine adjuvants.Frontiers in Immunology.2016,7:427]。目前研究报道的免疫佐剂种类甚多，但多由于存在毒副作用或安全隐患等不可避免的缺陷而难以实际应用[Mohanty NN,Ashokkumar D,Fayaz A,Chandrasekar S,Ramakrishnan MA.Trends inadjuvant and vaccine delivery systems.Journal of infectious diseases.2016,4:260]。目前，铝胶(EU,US)、MF59(EU)、AS01(EU)、AS04(EU,US)、和virosomes(EU)是为数不多经欧盟或美国FDA批准应用于临床的疫苗佐剂。随着新型疫苗的应用增多，对新型佐剂的需求越来越大，开发出更多的佐剂候选药物，对于增强疫苗的保护率具有重要意义。
中药多糖如香菇多糖、黄芪多糖、白藤梨多糖等具有较好的免疫增强作用，且具有天然、低毒、无药物残留等优点，已成为疫苗佐剂研究的一个热点。
西红花是鸢尾科(Iridaceae)植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，产量极低，价格昂贵，为引入栽培种，现北京、山东、浙江、四川等地均有栽培。具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。用于经闭症瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂。现代药理实验表明其具有神经保护、抗肿瘤、抗抑郁、抗惊厥、抗精神分裂和抗氧化活性。番红花花瓣在获取番红花柱头的过程中，往往作为废弃物被丢弃，从每公斤花中只能得到12克干西红花。另一方面，番红花花瓣约占番红花平均湿重的86.4％或干重的96.4％。研究表明，番红花花瓣含有大量的黄酮,、花青素等，具有神经保护、保肝、抗氧化、降压、镇咳等药理活性。我们以Quil A为阳性对照药，卵清蛋白(OVA)为模式抗原，研究了番红花花瓣的佐剂活性成分。通过比较番红花花瓣水提取物与乙醇提取物，以及水提物经D101大孔树脂柱分离的水及不同浓度乙醇洗脱得到流份的免疫佐剂活性，确定番红花花瓣的佐剂活性物质主要为多糖。
发明内容
本发明的首要目的是提供一类具有免疫佐剂作用的多糖。
本发明的第二个目的是提供中药西红花的原植物——番红花Crocus sativus L.的花瓣提取分离多糖的方法。
本发明的第三个目的是提供分析多糖结构的方法。
本发明的进一步目的是提供作为疫苗免疫佐剂的药物组合物。
本发明的还有一个目的是提供上述多糖和组合物制备预防传染性疾病的疫苗制剂中的应用。
本发明有免疫佐剂作用的多糖包括从中药西红花的原植物——番红花Crocussativus L.的花瓣中提取分离纯化得到的番红花花瓣多糖A(PCSPA)、番红花花瓣多糖B(PCSPB)和包含有这2种均一多糖的混合物——番红花花瓣总多糖(PCSP)。番红花花瓣多糖A的相对分子量为1.98×106Da，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16:5:7:3组成；番红花花瓣多糖B的相对分子量为2.53×106Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16:2:7:19:15:16组成。
本发明提供的番红花花瓣多糖A(PCSPA)、番红花花瓣多糖B(PCSPB)和包含有这2种均一多糖的混合物——番红花花瓣总多糖(PCSP)是从鸢尾科(Iridaceae)植物番红花Crocus sativus L.的干燥花瓣中提取的，制备方法包括以下步骤：
a.番红花花瓣以水提取。
b.浓缩水提取液，加入水提取液体积4倍的质量浓度95％乙醇沉淀。收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤后，溶于蒸馏水中，酶-sevage法脱蛋白，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得番红花花瓣总多糖(PCSP)。
c.番红花花瓣梨总多糖经凝胶色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集不同洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到3个流份。
d.后二个流份再经凝胶色谱柱纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B。
上述步骤c中所述的柱色谱凝胶为DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sephadex A-50、DEAE-Sepharose CL-4B、DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-Cellulose 32或DEAE-Cellulose52。步骤d中所说的柱色谱凝胶为Sephadex G-100、Sephadex G-150、Sephadex G-200、Sephacryl S-300、Sephacryl S-400、Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B或番红花瓣花瓣总多糖为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B或番红花花瓣总多糖的有效量为0.01μg/kg～100mg/kg体重。
本发明的多糖和药物组合物可用于制备预防传染性疾病的疫苗制剂。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域的药物载体。例如：稀释剂、赋形剂如水、生理盐水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如吐温-80；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明化合物可以组合物形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者或需要接种疫苗的对象。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、冻干粉、脂质体、微囊、微球、纳米囊、纳米球等。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药物组合物优选含有活性成分占总重量比为0.01％～99.9％。最优选含有活性成分占总重量比为0.5％～95％。
本发明多糖的使用量可根据抗原种类、所需的抗体水平、接种对象的特异性及所需的免疫程序等各种因素，其日剂量可以是0.01μg/kg～100mg/Kg体重，优选0.1～10mg/Kg体重。可一次或多次使用。
本发明的多糖动物实验结果显示出了显著的免疫佐剂作用，可显著促进卵清蛋白及口蹄疫疫苗免疫小鼠自然杀伤(NK)细胞活性、脾细胞分泌IL-2和IFN-γ能力、提高血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平；增强免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答；增强RAW264.7细胞吞噬活性，上调巨噬细胞细胞因子和趋化因子mRNA表达，诱导RAW264.7细胞分泌细胞因子和趋化因子。这些多糖可作为疫苗的免疫佐剂。
附图说明
图1是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的分离纯化。A是番红花花瓣粗多糖在DEAE-Sephadex A50柱的洗脱曲线；B是流份2(F2)在Sephadex G-200色谱柱的洗脱曲线；C是流份3(F3)在Sephadex G-200色谱柱的洗脱曲线；D是番红花花瓣多糖A的HPGPC色谱图；E是番红花花瓣多糖B的HPGPC谱图。
图2是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多B单糖组成的GC-MS谱图。
图3是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多B的红外光谱图。
图4是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多B的NMR谱图。A–E为番红花花瓣多糖A的1HNMR(A)、13C NMR(B)、1H-1H COSY(C)、HSQC(D)和HMBC(E)；F–J为番红花花瓣多糖B的1H NMR(F)、13C NMR(G),1H-1H COSY(H)、HSQC(I)和HMBC(J)。
图5番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的构象和超微结构。A是刚果红实验结果；B和C是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的30、1000和5000倍扫描电镜图；D和E是番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的AFM平面图和三维图。
图6是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价的影响。aP<0.05、bP<0.01和cP<0.001vs OVA对照组。
图7是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对卵清蛋白(OVA)免疫小鼠脾细胞增殖反应的影响。aP<0.05、bP<0.01和cP<0.001vs OVA对照组。
图8是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对OVA免疫小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响。
图9是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对OVA免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响。
图10是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对OVA免疫小鼠脾细胞中Th1和Th2型细胞因子和转录因子mRNA表达的影响。
图11是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对口蹄疫疫苗免疫小鼠血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价的影响。
图12是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对口蹄疫疫苗免疫小鼠脾细胞增殖反应的影响。
图13是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对口蹄疫疫苗免疫小鼠自然杀伤(NK)细胞活性的影响。
图14是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对口蹄疫疫苗免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子能力的影响。
图15是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对RAW264.7细胞增殖的影响
图16是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对RAW264.7细胞吞噬活性的影响
图17是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对RAW264.7细胞表面分子表达的影响。
图18是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对RAW264.7细胞分泌细胞因子和趋化因子能力的影响。
图19是番红花花瓣多糖A(PCSPA)和番红花花瓣多糖B(PCSPB)对RAW264.7细胞细胞因子和趋化因子mRNA表达水平的影响。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明，而非限制其范围。
实施例1：番红花花瓣多糖制备
1.制备番红花花瓣总多糖
药材番红花花瓣400g，加40倍水加热回流提取2小时，滤过，药渣继续以水回加热流提取2次。合并滤液，减压回收至600mL，放置至室温，加入4倍体积的质量浓度95％乙醇，混匀，4℃静置24小时，沉淀。快速滤纸减压过滤，收集沉淀，依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤3次。该沉淀加蒸馏水溶解并定容至300mL，加入120mL浓度为10mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，混合均匀，在60℃恒温酶解1h。再加入Sevage试剂105mL，室温搅拌20min，3500rpm离心10min，弃去蛋白和下层有机溶剂，继续加入Sevage试剂，同法操作，共进行6次，直至紫外扫描显示无蛋白。脱蛋白后得多糖溶液，透析除盐，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，即得番红花花瓣总多糖(PCSP)。番红花花瓣总多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。
2.制备番红花花瓣多糖A
番红花花瓣总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.1mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephadex G-200色谱柱纯化，以0.1mol/L氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到番红花花瓣多糖A。番红花花瓣多糖A的相对分子量为1.98×106Da，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，摩尔比为16:5:7:3组成。番红花花瓣多糖A总糖、乙酰基、磺酸基和糖醛酸质量含量分别为95.33±0.55％、5.10±0.06％，7.95±0.07％和13.12±0.12％。
3.制备番红花花瓣多糖B
番红花花瓣总多糖以DEAE-Sephadex A-50色谱柱分离，以0.1～2.0mol/L氯化钠洗脱，收集0.3mol/L氯化钠的洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥；再经Sephadex G-200色谱柱纯化，以0.1mol/L氯化钠洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到番红花花瓣多糖B。番红花多糖B相对分子量为2.53×106Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，摩尔比为16:2:7:19:15:16组成。番红花花瓣多糖B的总糖、乙酰基，磺酸基和糖醛酸质量含量分别为93.22±0.42％、3.33±0.07％、13.02±0.77％和15.73±0.11％。
实施例2：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的分子量及均一性测定
分别称取番红花花瓣多糖A(11mg)和番红花花瓣多糖B(10mg)，以水溶解，制成浓度为1mg/mL的溶液，以0.45μm滤膜过滤，即为样品溶液。另取不同分子量(Mw)的标准多糖，制备系列标准多糖溶液。采用Angilent 1260液相色谱系统，Shodex ks805色谱柱(8.0×300mm)，H2O为流动相，流速1mL/min；柱温35℃，进样量1μL，示差检测器测定，以logMW为纵坐标，保留时间为横坐标，绘制标准曲线,求得回归方程：log MW＝－0.2839X+10.749(R2＝0.9988)。结果显示；番红花花瓣多糖A(11mg)和番红花花瓣多糖B的色谱峰峰型均较好，峰宽较窄，基本符合均一多糖的要求(附图1)。番红花花瓣多糖A的分子量为1985951Da，分散系数为1.21；番红花花瓣多糖B，分子量为2531563Da，分散系数为1.14，分散系数均接近1。
实施例3：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的结构表征
1.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的单糖组成及摩尔比(GC-MS分析)
分别称取番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B约10mg，以2M三氟乙酸于110℃水解5h；水解液减压蒸干，加NaBH4，于60℃还原5h；加入乙酸消耗过量的NaBH4；加10％乙酸甲醇溶液，反复蒸干得到还原产物。番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖的还原产物在酸性条件下与吡啶-乙酸酐(1:1)发生乙酰化，乙酰化产物复溶于三氯甲烷，以0.22μm微孔滤膜过滤，分别进行GC-MS分析。
检测：仪器：GC–MS(Waters 7890/5975)；检测器：火焰离子检测器；色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样器温度:240℃；检测器温度：210℃；柱温升温程序：140℃保持6min，以2℃/min升高至190℃，在1min内升高至210℃，在210℃保持4min；以高纯氮气为载气；流速1mL/min。
结果表明：番红花花瓣多糖A由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖按摩尔比为16:5:7:3组成；番红花花瓣多糖B由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16:2:7:19:15:16组成(附图2)。
2.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的红外光谱(IR)分析
采用FTIR-100(Thermo Nicolet Co.)红外光谱仪，KBr压片，室温下，在频率4000～400cm-1范围内扫描，分辨率为4cm-1。如附图3所示，在3385cm-1或3406cm-1处有一个密集和宽的峰，表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均存在自由羟基。2934cm-1(番红花花瓣多糖A)和2937cm-1(番红花花瓣多糖B)的弱吸收带为糖环的C-H伸缩振动。1743cm-1(番红花花瓣多糖A)和1740cm-1(番红花花瓣多糖B)的吸附峰表明，这两种多糖都含有酯羰基(COOR)基团。1614cm-1(番红花花瓣多糖A)和1613cm-1(番红花花瓣多糖B)的吸收峰为羧酸的拉伸，表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B都含有醛酸。1238cm-1(番红花花瓣多糖A)和1240cm-1(番红花花瓣多糖B)的吸收带是由S＝O的伸缩振动引起的，这表明两种多糖中都含有磺酸基团。1145cm-1(番红花花瓣多糖A)、1146cm-1(番红花花瓣多糖B)、1101cm-1(番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B)、1017cm-1(番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B)的吸收峰表明这两种多糖中存在吡喃环。830cm-1和915cm-1处的峰是异常C1–H振动特征，表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均存在α-和β-D-糖苷键。
3.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的核磁共振(NMR)分析
分别称取番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B样品约15mg，溶于0.5mL D2O中，采用Angilent DD2-600型核磁共振仪(美国Angilent)检测。如图4所示，番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的1H和13C NMR谱中，大多数信号集中在相对狭窄的δH3.0-5.1ppm和δC 50～110ppm，是典型的多糖特征。端基氢(δH 4.5-5.5)和异头碳(δC 95～110ppm)的信号数表示单糖残基类型的数目。β-吡喃糖环异头碳化学位移高于102ppm，异头氢化学位移低于5.0ppm。异头氢化学位移δH 4.64–4.77、4.82、4.95、5.00ppm和异头碳δC 99.34、101.72、102.14、102.73和102.96ppm表明番红花花瓣多糖A含有5种不同类型的单糖残基。δC100.06、101.61、101.73、102.14、102.66、102.72、102.96、106.91和109.82ppm提示番红花花瓣多糖B含有9个不同类型的糖残基。各个异头碳的归属如表1所示。δC 20ppm、170ppm和δH2ppm表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B含COOR。δC 19.11ppm和δH 1.10–1.14ppm表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均含鼠李糖。δC 173.4和177.3ppm表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均半乳糖醛酸。δC 22.60ppm表明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均存在乙酰基。
表1碳原子化学位移及对应结构推测
Figure GDA0003756853340000081
Figure GDA0003756853340000091
4.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的脱硫和甲基化分析
分别称取番红花花瓣多糖A(52.4mg)和番红花花瓣多糖B(51.2mg)，溶于5mL蒸馏水，通过Amberlite CG-120柱，以水洗脱，洗脱液浓缩后，加入0.5mL吡啶中和，冷冻干燥分别得到番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的吡啶盐。将多糖吡啶盐置于含10％甲醇的DMSO溶液中，100℃反应4h，透析，冷冻干燥，即得番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的脱硫产物(ds-PCSPA和ds-PCSPB)。将番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B及其脱硫产物分别使用碘甲烷进行甲基化。具体步骤如下:称取适量番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B及其脱硫产物，分别溶于3mL的无水DMSO中，加入40mg NaOH粉末和2mL碘甲烷，在无水无氧环境反应3h，反应产物透析、冻干。上述甲基化反应重复进行3次。甲基化产物以2M三氟乙酸在110℃水解5h，水解液减压蒸干，加入NaBH4，于60℃还原5h，加入乙酸消耗过量的NaBH4，加入10％乙酸甲醇溶液反复蒸干得到还原产物。番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B及其脱硫产物、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和葡萄糖的还原产物在酸性条件下与吡啶-乙酸酐(1:1)发生乙酰化，乙酰化产物复溶于三氯甲烷，以0.22μm微孔滤膜过滤，进行GC-MS分析。
番红花花瓣多糖A含6种糖残基:→4)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、→4)-β-D-Xylp-(1→、→3,4)-β-D-Xylp-(1→、→4)-α-L-Arap-(1→和α-L-Rhap-(1→(表2)；番红花花瓣多糖B含11种糖残基类型:β-D-Galp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→、→4)-α-L-Rhap-(1→、→3,4)-α-L-Rhap-(1→、→2)-α-L-Arap-(1→、α-L-Araf-(1→、→4)-β-D-Xylp-(1→、→3,4)-β-D-Xylp-(1→和→6)-β-D-Manp-(1→(表3)。比较脱硫前后的甲基化产物的相对含量，番红花花瓣多糖A脱硫产物的→4)-β-D-Xylp-(1→的摩尔比显著增加，而→3,4)-β-D-Xylp-(1→的摩尔比显著减少，据此推测番红花花瓣多糖A中磺酸基存在于→4)-β-D-Xylp-(1→的C-3位置。同法，可以推测番红花花瓣多糖B的→4)-β-D-Xylp-(1→和→4)-α-L-Rhap-(1→的C-3发生磺酸化。
表2番红花花瓣多糖A及其脱硫物甲基化产物的GC-MS分析结果
Figure GDA0003756853340000101
表3番红花花瓣多糖B及其脱硫物甲基化产物的GC-MS分析结果
Figure GDA0003756853340000102
5.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的刚果红实验
分别称取番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B，溶于双蒸水，制成2mg/mL的溶液；取1mL多糖溶液与3mL不同浓度NaOH溶液混匀，再分别加入1.5mL 0.2mM刚果红溶液和0.5mL双蒸水，混匀，静置1h。以刚果红溶液和对应浓度氢氧化钠溶液混合液作为对照，采用紫外分光光度计检测最大吸收波长。如图5A所示，番红花花瓣多糖A–刚果红复合物的最大吸收波长随着氢氧化钠溶液浓度的增大而显著增加。番红花花瓣多糖B–刚果红复合物的最大吸收波长随着氢氧化钠溶液浓度的增大未发生显著变化。这些结果提示番红花花瓣多糖A溶液存在三螺旋结构。
6.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的微观结构观察
将番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B粉末置于用双面胶带固定的试样支架上，进行表面喷金处理，在高真空条件下，用场发射扫描电子显微镜(FESEM，日本)在3.0kV加速电位下观察样品的微观结构。分别使用双蒸水配制10μg/mL的番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B的溶液。将多糖溶液均匀涂布于云母片(1.0×1.0cm2)上，自然干燥，采用原子力显微镜观察其结构。番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均可观察到片状结构；在低倍镜(30×)下，番红花花瓣多糖A可观察到棒状结构(图5B和图5C)。在高倍镜(1000×和5000×)下，番红花花瓣多糖B可观察到规则的鳞片状结构。在高倍镜(5000×)下，番红花花瓣多糖A中可观察到片状断面。原子力显微镜下，番红花花瓣多糖A观察到大量因糖链自发卷曲形成的许多岛状结构(图5D和图5E)。番红花花瓣多糖A的表面起伏(-7.4nm～7.1nm)明显大于番红花花瓣多糖B(-2.6nm～3.1nm)，番红花花瓣多糖A的Rmax、Rq和Ra分别为15.6nm、1.99nm和1.57nm；番红花花瓣多糖B的Rmax、Rq和Ra分别为7.30nm、0.771nm和0.593nm。可见：番红花花瓣多糖A的表面比番红花花瓣多糖B更粗糙。
实施例4：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对OVA的免疫佐剂作用
清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只皮下注射生理盐水0.2ml；卵清蛋白(OVA)对照组：每只皮下注射OVA溶液(0.125mg/ml)0.2ml；Quil A对照组：每只皮下注射0.2ml含10μg Quil A的OVA溶液(0.125mg/ml)；番红花花瓣多糖A试验组：每只注射0.2ml含番红花花瓣多糖A(25、50、100μg)的OVA溶液(0.125mg/ml)；番红花花瓣多糖B试验组：每只注射0.2ml含番红花花瓣多糖B(25、50、100μg)的OVA溶液(0.125mg/ml)。各组免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天。二免后14天处死动物，取脾脏，制备脾细胞悬液；取血，分离制备血清。采用ELISA、MTT法和RT-PCR检测OVA免疫小鼠血清中特异性抗体效价、脾细胞增殖反应、NK细胞活性、培养上清中细胞因子含量以及细胞因子和转录因子mRNA表达水平。
结果表明：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均能显著提高免疫小鼠血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(图6)；增强OVA受免小鼠Con A、LPS和OVA刺激脾细胞增殖反应(图7)；促进免疫小鼠NK细胞对K562细胞的杀伤活性(图8)；增强免疫小鼠脾细胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的能力(图9)；上调免疫小鼠脾细胞IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等细胞因子及T-bet、GATA-3、STAT4和STAT6等转录因子mRNA表达水平(图10)。说明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B不仅能促进免疫小鼠对OVA的体液免疫和细胞免疫应答，而且可诱导平衡的Th1/Th2免疫应答。
实施例5：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对口蹄疫疫苗的佐剂作用
清洁级ICR小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组：每只皮下注射生理盐水0.2ml；146S对照组：每只皮下注射口蹄疫146S抗原溶液(7.5μg/ml)0.2ml；铝胶对照组：每只皮下注射0.2ml含200μg铝胶的口蹄疫146S抗原溶液(7.5μg/ml)；番红花花瓣多糖A试验组：每只注射0.2ml含番红花花瓣多糖A(25、50、100μg)的口蹄疫146S抗原溶液(7.5μg/ml)；番红花花瓣多糖B试验组：每只注射0.2ml含番红花花瓣多糖B(25、50、100μg)的口蹄疫146S抗原溶液(7.5μg/ml)。各组免疫2次，二次免疫间隔14天。二免后14天处死动物，取脾脏，制备脾细胞悬液；取血，分离制备血清。采用ELISA、MTT法和RT-PCR检测口蹄疫疫苗免疫小鼠血清中特异性抗体效价、脾细胞增殖反应、NK细胞活性以及培养上清中细胞因子含量。
结果表明：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B能显著提高口蹄疫疫苗受免小鼠血清中146S抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体效价(图11)；增强口蹄疫疫苗受免小鼠Con A和LPS刺激脾细胞增殖反应(图12)以及NK细胞对K562细胞的杀伤活性(图13)；促进口蹄疫疫苗免疫小鼠脾细胞分泌IL-10和IFN-γ的能力(图14).说明番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B不仅能促进口蹄疫疫苗免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，而且可诱导平衡的Th1/Th2免疫应答。
实施例6:番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞的活化作用
1.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞增殖的的影响
按每孔100μL将细胞浓度1.5×105/mL的RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板中。贴壁培养24h，每孔加入不同浓度番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B稀释液100μL，置于37℃CO2培养箱孵育20h；每孔加入2mg/mL的MTT溶液50μL，继续孵育4h。取出96孔板，2000rpm离心5min，甩弃上清。每孔加酸性DMSO 150μL，微量振荡器震荡15min，于490nm波长处测定OD值。如图15所示，番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B在浓度低于5μg/mL对RAW264.7细胞增殖无影响(P＞0.05)，而浓度10μg/mL及以上可极显著抑制RAW264.7细胞增殖(P＜0.01)。
2.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞吞噬活性的影响
按每孔1mL将细胞浓度4×105/mL的RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中。贴壁培养2h，每孔加入不同浓度番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B稀释液1mL，置于37℃CO2培养箱孵育24h，收集细胞样品，加入FITC标记的葡聚糖(1mg/mL)100μL，其中一组置于4℃冰浴孵育30min，另一组置于37℃培养箱中孵育30min。取出流式管，每管加入2mL预冷的PBS终止反应，1500rpm离心，倾弃上清，涡旋，每管加入2mL冰浴的PBS缓冲液洗涤一次，1500rpm离心5min。倾弃上清，涡旋，加PBS缓冲液500μL重悬细胞，以流式细胞仪检测吞噬活性。如图16所示，1.25、2.5和5μg/mL的番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B可浓度依赖性促进RAW264.7细胞的吞噬活性(P＜0.01)。
3.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞表面分子表达的影响
按每孔1mL将细胞浓度4×105/mL的RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中。贴壁培养2h，每孔加入不同浓度番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B稀释液1mL，置于37℃CO2培养箱孵育24h，收集细胞样品。采用流式细胞仪检测细胞表面分子表达水平。结果表明：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均可浓度依赖性显著上调RAW264.7细胞表面分子CD40、CD86、CD80、MHC I和MHC II表达的水平(图17)。
4.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞分泌细胞因子和趋化因子能力的影响
按每孔1mL将细胞浓度4×105/mL的RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中。贴壁培养2h，每孔加入不同浓度番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B稀释液1mL，置于37℃CO2培养箱孵育4、8、24h，分别收集细胞培养上清，使用ELISA试剂盒检测细胞因子(IL-1β、IL-10、IL-12p40和TNF-α)和趋化因子(CCL5和CCL22)含量。结果表明：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均可显著促进RAW264.7细胞分泌细胞因子(IL-1β、IL-10、IL-12p40和TNF-α)和趋化因子(CCL 5和CCL 22)，呈浓度依赖性和时间依赖性关系(如图18)。
5.番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B对RAW264.7细胞细胞因子和趋化因子mRNA表达的影响
按每孔1mL将细胞浓度4×105/mL的RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中。贴壁培养2h，每孔加入不同浓度番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B稀释液1mL，置于37℃CO2培养箱孵育2、4、8h，分别收集细胞，采用qRT-PCR检测细胞因子(IL-1β、IL-10、IL-12p40和TNF-α)和趋化因子(CCL5和CCL22)基因表达水平。结果表明：番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B均可显著上调RAW264.7细胞IL-1β、IL-10、IL-12p40和TNF-α等细胞因子以及CCL 5和CCL 22等趋化因子基因表达水平，呈浓度依赖性和时间依赖性关系(如图19)。
综上所述，本发明的多糖通过活化巨噬细胞发挥免疫佐剂作用，可开发成疫苗的免疫佐剂。

Claims (4)

1. 番红花花瓣多糖在制备口蹄疫疫苗佐剂中的应用，其特征在于，所述多糖是从中药西红花的原植物——番红花Crocus sativus L.的花瓣中提取分离纯化得到番红花花瓣多糖A（PCSPA）、番红花花瓣多糖B（PCSPB）；所述番红花花瓣多糖A的相对分子量为1.98×106Da，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16 : 5 : 7 : 3组成；番红花花瓣多糖B的相对分子量为2.53×106 Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16 : 2 : 7 : 19 : 15 : 16组成；番红花花瓣多糖A（PCSPA）、番红花花瓣多糖B（PCSPB）的结构中存在半乳糖醛酸、磺酸基和乙酰基；所述多糖作为疫苗的免疫佐剂，促进体液免疫和细胞免疫应答，诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖的制备方法，其具体步骤如下：
a. 将番红花花瓣以水提取；
b. 浓缩水提取液，加入4倍水提取液体积的质量浓度95%乙醇沉淀，收集沉淀依次以乙醇、丙酮和石油醚洗涤后，溶于蒸馏水中，酶-sevage法脱蛋白，透析，渗余物减压浓缩，冷冻干燥，得番红花花瓣总多糖；
c. 番红花花瓣总多糖经凝胶色谱柱DEAE-Sephadex A-50分离，以0.1mol/L、0.3 mol/L氯化钠洗脱，收集不同洗脱液，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到2个流份；
d.二个流份分别再经凝胶色谱柱Sephadex G-200纯化，以氯化钠溶液洗脱，浓缩，脱盐，冷冻干燥，得到番红花花瓣多糖A和番红花花瓣多糖B。
3. 作为口蹄疫疫苗佐剂的药物组合物，其中含有治疗有效量的番红花花瓣多糖A、或番红花花瓣多糖B和在药物学上可接受的载体；所述番红花花瓣多糖A的相对分子量为1.98×106 Da，由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16 : 5 : 7 : 3组成；番红花花瓣多糖B的相对分子量为2.53×106 Da，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖按摩尔比为16 : 2 : 7 : 19 : 15 : 16组成；番红花花瓣多糖A、番红花花瓣多糖B的结构中存在半乳糖醛酸、磺酸基和乙酰基。
4. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于番红花花瓣多糖A、或番红花花瓣多糖B的有效量为0.01μg/kg～100 mg/kg体重。
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