CN110156904A - 紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用，所述紫甘薯多糖是从宁紫4号紫甘薯中提取得到的杂多糖，主要由木糖、鼠李糖和葡萄糖三种单糖组成，其中木糖含量为84.92±1.57％，鼠李糖含量为2.15％，葡萄糖含量为0.57％，平均分子量为0.82×10⁴Da；紫甘薯多糖对肺癌细胞A549、H1299、H460细胞增殖都具有明显的抑制作用，给予紫甘薯多糖FsPSP‑1治疗的BALB/c小鼠皮下肿瘤体积明显减少，肿瘤的重量也明显减轻。本发明提供了紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物方面的新用途，拓宽了紫甘薯多糖的应用领域，为开发天然活性抗肿瘤药物提供了物质基础，具有潜在的社会效益和经济效益。

Description

紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种甘薯多糖的应用，具体涉及一种紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用。

背景技术

近年来，全球肺癌发病率男性增加了10-30倍，女性增加了3-8倍。肺癌呈现“三高一低”的特征，即发病率高、死亡率高、增长率高、治愈率低。手术是早期肺癌患者最有效的治疗方法，但是大多数患者在诊断时已属晚期。化疗是转移性肺癌的主要治疗手段，然而，即便是在肺癌分子靶向治疗日新月异的今天，肺癌总体的5年生存率仍低于20％。

对于肺癌的治疗目前仍以铂类化疗药为主，但同时其严重的副作用和耐药性，极大地影响了患者的预后与生活质量，故寻找更为安全、有效的药物成为亟需解决的问题。

近年来，天然活性产物抗肿瘤的研究已成为新的热门研究方向，其免疫调节作用及抗肿瘤活性倍受关注，成为了抗肿瘤研究的中心课题。天然产物与其他抗肿瘤药物，特别是化疗药物相比，具有低毒高效、多途径、多靶点、物美价廉、并且能调节机体免疫力等优点，其在临床上的应用和发展潜力将非常广阔。

紫甘薯又称紫薯，旋花科甘薯属蔓生草本植物，薯肉呈紫至深紫色，是一种容易栽培、药食兼用的理想作物。紫甘薯的茎叶和根块中除含有各种营养成分外，还含有丰富的花青素和多糖，紫甘薯水提液具有抗突变和抗氧化能力，其中多糖的药理作用是目前的研究热点，但主要集中于抗氧化活性的研究，紫甘薯多糖抗肿瘤活性的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用，为治疗肺癌提供一种新的途径。

为实现上述目的，本发明提供紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用。所述紫甘薯多糖从宁紫4号紫甘薯中提取得到，为杂多糖，主要由木糖、鼠李糖和葡萄糖三种单糖组成，其中木糖含量为84.92±1.57％，鼠李糖含量为2.15％，葡萄糖含量为0.57％，平均分子量为0.82×10⁴Da。

所述紫甘薯多糖的制备方法是：超声波提取，葡聚糖凝胶柱层析纯化。柱层析采用的流动相为5％乙醇水溶液。

本发明还提供上述紫甘薯多糖在制备肺癌细胞生长抑制剂或肺癌细胞增殖抑制剂或肺癌肿瘤生长抑制剂中的应用。

所述肺癌细胞为人肺癌细胞系A549、H1299、H460。

所述肺癌细胞生长抑制剂或肺癌细胞增殖抑制剂或肺癌肿瘤生长抑制剂为静脉注射剂。

细胞实验表明，紫甘薯多糖FsPSP-1对肺癌细胞A549、H1299、H460细胞增殖都具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性；一定浓度下的FsPSP-1可以抑制肺癌细胞A549和H460细胞的集落形成，FsPSP-1可以使肺癌细胞独立生存能力降低，对肺癌的发生发展有长期抑制作用。

动物实验表明，给予紫甘薯多糖FsPSP-1治疗的BALB/c小鼠皮下肿瘤体积明显减少，肿瘤的重量也明显减轻。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供了紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物方面的新用途，拓宽了紫甘薯多糖的应用领域，为开发天然活性抗肿瘤药物提供了物质基础，具有潜在的社会效益和经济效益；

2.本发明的紫甘薯多糖来源于农产品，直接提取纯化即可获得，成本低，无污染，可产业化生产。

附图说明

图1为实施例2中紫甘薯多糖FsPSP-1对肺癌细胞的抑制作用；

图2为实施例3中紫甘薯多糖FsPSP-1对肺癌细胞集落形成的作用；

图3为实施例4中紫甘薯多糖FsPSP-1抑制肺癌细胞存活对小鼠体内肿瘤的体积和重量的影响(其中，A：肿瘤的体积增长曲线；B：肿瘤的重量；C：肿瘤的实物)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1紫甘薯粗多糖的提取、纯化

本发明利用超声波提取法提取紫甘薯的多糖，并采用响应面对提取工艺进行优化。

1、粗多糖提取

提取流程：紫甘薯宁紫4号→洗净→40℃干燥→粉碎→过80目筛→加入超纯水→超声波提取设备提取→过滤→旋转蒸发仪浓缩→乙醇沉淀→Sevage脱蛋白→过滤→计算粗多糖得率。

(1)超声法提取多糖，具体如下：将紫甘薯宁紫4号样品洗净、切块，烘干、粉碎，过80目筛，得到紫甘薯粉末；

(2)将紫甘薯粉末用体积分数为95％的乙醇浸泡24h，以除去色素等物质；

(3)低温冷冻干燥；

(4)提取、过滤：称取10g步骤(3)得出物于1L锥形瓶内，按料液比1:5加入超纯水。将锥形瓶放入超声波清洗机内，在300W功率下以2min/次，间隔1min，共30次的频率超声清洗；所得提取液进行减压蒸馏，得浓缩液；将浓缩液放入体积分数为95％的乙醇浸泡24h、抽滤，得沉淀。将沉淀真空干燥后得到沉淀粉末，将沉淀粉末放入蒸馏水中，然后用Sevage法脱蛋白，取上清液，得紫甘薯多糖提取液，计算多糖提取液中的多糖含量。

(5)多糖含量测定采用葡萄糖为对照品，利用苯酚-硫酸法测定。

(6)标准曲线的绘制：称取恒重的无水葡萄糖0.5g，溶于500ml双蒸水中，配制1.0g/L的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，加蒸馏水补足至1mL，分别加入5％苯酚1mL混匀，再加入浓硫酸5mL，振荡混匀放置30min。以蒸馏水作为空白对照。以波长490nm处的吸光值为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

标准曲线方程:y＝224.047x-164.93，R²＝0.9997，根据以下公式计算多糖提取率。

紫甘薯多糖提取率(％)＝X×V/M×100％式中X为计算后所得的浓度(ug/mL)，V为样品体积(mL)，M为紫甘薯质量(ug)。

上述方法所得粗多糖提取率为：32.6％，多糖含量为：21.2％。

2、紫甘薯粗多糖的分离、纯化

将获得的粗多糖经过脱蛋白、乙醇沉淀等方法进行初步纯化，得到非水溶性分散性多糖混合物，用葡聚糖凝胶柱层析方法进行二次纯化。

具体方法如下：

(1)将超声波提取的紫甘薯沉淀用0.5M NaOH/0.01M NaBH₄溶解(超声波提取12h)，反复提取3-4次，合并提取液；

(2)加入冰醋酸中和pH；

(3)静置，离心，沉淀物使用超纯水冲洗；

(4)用0.25M LiC1的DMSO溶液对沉淀物进行复溶、离心；上清液加水，透析、冷冻干燥，得到碱溶性多糖FsPSP混合物。使用Spehadex G100葡聚糖凝胶为分离介质，使用中压层析系统对其进行纯化，流动相采用5％乙醇水溶液，同时利用NH₄NO₃溶液(5mol/L)调节pH值到9.0。辅助以210nm波长，利用自动接收器接收组分，收集吸收值最高处的样品，合并，冷冻干燥，获得多糖纯品。

对FsPSP-1冷冻干燥获得多糖样本，FsPSP-1为杂多糖，平均分子量为0.82×10⁴Da，主要由木糖、鼠李糖和葡萄糖三种单糖组成，其中木糖含量为84.92±1.57％，鼠李糖含量为2.15％，葡萄糖含量为0.57％；白色偏黄色粉末状，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶于水，但加热后可部分溶解于热水中。

实施例2FsPSP-1对人肺癌细胞增值抑制作用

为了研究FsPSP-1对人肺癌细胞生长和增值的作用，采用MTT法测试实施例1所提取的FsPSP-1对人肺癌细胞(A549，H460，H1299)(购自中科院上海细胞库)的抑制作用。具体操作如下：

1、将解冻复苏的肿瘤细胞株A549、H460和H1299分别接种于含10％新生牛血清的1640培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养；

2、取对数生长期的待试肿瘤细胞制成1×10⁴/mL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200uL，置37℃、5％CO₂条件下培养24h，待细胞贴壁；

3、弃去原培养液，加入不同浓度的待测FsPSP-1的培养基处理细胞，另设空白对照组；将培养板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱，常规培养48h；

4、每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL，继续培养1-4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加DMSO 100uL/孔，室温下振荡10min；

5、测定各孔吸光度值，选择波长570nm；

6、计算FsPSP-1对肿瘤细胞的抑制率，其中抑制率的计算公式为：

抑制率(％)＝(对照细胞OD-给药细胞OD)/对照细胞OD×100％

计算结果如图1所示，结果显示，达到一定浓度后，FsPSP-1对肺癌细胞A549、H1299、H460细胞增殖都具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。

实施例3FsPSP-1对肺癌细胞集落形成的影响

利用实施例1所提取的紫甘薯多糖FsPSP-1，进行集落形成实验，检测FsPSP-1对人肺癌细胞(A549，H460)的长期抑制作用。具体操作如下：

1、取对数生长期的A549和H460细胞，分别在24孔板中接种，细胞接种密度为300细胞/孔；

2、37℃、CO₂培养箱中培养，待完全贴壁后，弃去原培养液，按组别加入不同浓度FsPSP-1的药液，设置的多糖浓度为：0ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、200ug/ml、30ug/ml，培养基每3天换一次；

3、14天后，有肉眼可见的细胞集落形成，由50个以上细胞组成的细胞团，计为1个集落；

4、甲醇固定液固定2-3min后，PBS液洗，5min×3次；

5、吉姆萨染色15min，PBS液洗，5min×3次；

6、凝胶成像系统(Bio-Rad)拍照，并使用Image J软件计数集落个数。

细胞集落形成率按以下公式计算：

细胞集落形成率(CFE)＝(每孔形成的集落数/每孔接种的细胞数)×100％

细胞集落形成实验结果显示：集落形成率表示细胞独立生存能力，该实验结果提示，一定浓度下的FsPSP-1可以抑制肺癌细胞A549和H460细胞的集落形成(图2)。表明FsPSP-1可以使肺癌细胞独立生存能力降低，对肺癌的发生发展有长期抑制作用。

实施例4FsPSP-1对A549荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用

1、实验动物

BALB/c小鼠，8周龄，清洁级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(沪)2013-0016。

2、主要试剂

紫甘薯多糖FsPSP-1：按实施例1所述方法提取纯化。

3、数据处理

采用SPSS16.0分析统计软件，实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较采用Dunnet t检验，实验组之间两两比较采用q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

4、BALB/c小鼠肿瘤生长模型的建立、分组和给药

选取细胞密度为85％的A549细胞，进行清洗，再消化、离心，收集细胞至EP管，加PBS；细胞计数，细胞密度控制在l×10⁷/ml；在BALB/c小鼠前腿腋下，消毒皮肤，抽取0.1ml细胞悬液在注射点进行皮下注射A549细胞；接种后的BALB/c小鼠随机分成：空白对照组、紫甘薯多糖低剂量组、紫甘薯多糖高剂量组，每组8只。紫甘薯多糖低剂量组：腹腔注射FsPSP-1 1mg/Kg，紫甘薯多糖高剂量组：腹腔注射FsPSP-1 10mg/Kg。

每天观察小鼠的日常行为、穿刺点有无感染及肿瘤生长情况；肿瘤逐渐长大，待可测量时，隔天用游标卡尺测量肿瘤的最长径及最短径；肿瘤体积计算公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝l×d²/2

式中l为肿瘤组织的长径(mm)，d为肿瘤组织的短径(mm)；

14天后，脱臼处死BALB/c小鼠，获取肿瘤组织。

5、实验结果

如图3所示，A为各实验组小鼠皮下肿瘤的体积增长曲线，B为各实验组小鼠皮下肿瘤的重量，C为各实验组小鼠皮下肿瘤的实物图。动物实验发现，给予FsPSP治疗的BALB/c小鼠皮下肿瘤体积明显减少，肿瘤的重量也明显减轻。

Claims (8)

1.紫甘薯多糖在制备抗肺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫甘薯多糖从宁紫4号紫甘薯中提取得到，为杂多糖，主要由木糖、鼠李糖和葡萄糖三种单糖组成，其中木糖含量为84.92±1.57％，鼠李糖含量为2.15％，葡萄糖含量为0.57％，平均分子量为0.82×10⁴Da。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫甘薯多糖的制备方法是：超声波提取，葡聚糖凝胶柱层析纯化，所述柱层析采用的流动相为5％乙醇水溶液。

4.紫甘薯多糖在制备肺癌细胞生长抑制剂或肺癌细胞增殖抑制剂或肺癌肿瘤生长抑制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述紫甘薯多糖从宁紫4号紫甘薯中提取得到，为杂多糖，主要由木糖、鼠李糖和葡萄糖三种单糖组成，其中木糖含量为84.92±1.57％，鼠李糖含量为2.15％，葡萄糖含量为0.57％，平均分子量为0.82×10⁴Da。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述紫甘薯多糖的制备方法是：超声波提取，葡聚糖凝胶柱层析纯化，所述柱层析采用的流动相为5％乙醇水溶液。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肺癌细胞为人肺癌细胞系A549、H1299、H460。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肺癌细胞生长抑制剂或肺癌细胞增殖抑制剂或肺癌肿瘤生长抑制剂为注射剂。