CN103342730B

CN103342730B - 中药饿蚂蝗提取物的制备方法及其抗衰老用途

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Publication number: CN103342730B
Application number: CN201310242492.0A
Authority: CN
Inventors: 戚建华; 林燕飞; 向兰; 曹时宁; 孙玉娟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-06-16
Filing date: 2013-06-16
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-06-16
Also published as: CN103342730A

Abstract

本发明提供饿蚂蝗提取物和、活性组分、活性化合物的制备方法，通过中药饿蚂蝗粉碎后粉碎浸提和分离，得到酯层活性组分，再经HPLC纯化得到三种五环三萜类活性化合物。用本发明制备的饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物，在酵母衰老模型K6001啤酒酵母细胞中表现出显著的延长酵母细胞复制性寿命活性。可在制备延缓衰老及治疗衰老性疾病等的药品或食品中的应用。中药材饿蚂蝗廉价易得，取材便利，本发明为该中药新的药理活性研究及开发提供了重要依据。

Description

中药饿蚂蝗提取物的制备方法及其抗衰老用途

技术领域

本发明属中药技术领域，具体涉及饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物的制备方法，以及其在延缓衰老及治疗衰老性疾病等药物及保健食品方面的应用。

背景技术

据统计，中国是目前世界上唯一一个老年人口过亿的国家。数据显示，目前全球老年人口约为7.39亿，中国老年人口约为1.78亿，占全球老年人口的18%，到2025年，老年人口总数将超过3亿，预计到2050年，全球老年人口约为20.16亿，中国约为4.37亿，约占全球老年人口的21.6%，中国平均每年增加1000万老年人口。老年人口的剧增，随之而来的是老年性疾病增多，使得国家医疗系统及经济体系承担莫大压力。

因此，防止早衰，延年益寿，预防或治疗衰老性疾病已经成为医学界所关注的热点问题。它不仅是一个医学难题,而将成为一个突出的社会问题。

此外，我国天然资源丰富，地大物博，有很多宝贵的道地药材，许多味中药材都是作为延缓衰老、延年益寿的传统用药。据统计，1981年1月至2006年9月新增加药物中来源于天然产物及天然产物衍生物的占28%。因此，来源于中药的新的成分和新的活性的研究已经得到充分的重视。

饿蚂蝗为豆科植物山蚂蝗属植物饿蚂蝗Desmodium tiflorum的全株，分布于我国广西、贵州、云南、福建等地。味甘、苦，性凉，具有活血止痛、解毒消肿功能，用于胃痛、小儿疳积、妇女干血痨、腰扭伤、创伤、尿道炎、腮腺炎和毒蛇咬伤等症。

从饿蚂蝗中分离得到的五环三萜提取物，在酵母衰老模型K6001啤酒酵母细胞中表现出显著的延长酵母细胞复制性寿命活性。以此为先导物，优化结构，为延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究，将具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种饿蚂蝗提取物、活性组分、活性化合物的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）粉碎和浸提：1000g中药饿蚂蝗粉碎后，用3L乙醇室温下浸提（偶尔震荡）。抽滤浓缩干燥后，得到乙醇提取物粗样50g，将其用水和乙酸乙酯交替萃取分离多次,得到酯层活性组分（A）10g；

（2）分离和纯化：将活性组分（A）先经一次硅胶开口柱分离（200-300目，以下溶剂系统均按体积比，第一次分离为氯仿:乙酸乙酯=100:0,90:10,80:20,70:30,50:50，0:10）,合并氯仿:乙酸乙酯为90:10至50:50的洗脱流分，得到活性组分（B）1g；然后，将活性组分（B）进一步用ODS开口柱分离（溶剂系统按体积比为甲醇:水=6:4,7:3,8:2,9:1,10:0），合并甲醇:水为7:3至9:1的洗脱流分，得到活性组分（C）150mg；活性组分（C）用HPLC纯化（色谱条件为：色谱柱ODS-HG-5(/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为80%-85%甲醇水溶液梯度洗脱60分钟），得到三个化合物，经核磁共振谱、质谱确定为五环三萜类化合物（1）50mg，化合物（2）25mg和化合物（3）2.5mg。

本发明制备的活性组分（C），其中五环三萜类化合物的总含量＞50%，同时确定了三个五环三萜类化合物，化合物（1）为3β,,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-3β-咖啡酸酯（3β,,23,28-trihydroxy-12-oleanene-3β-caffeate）；化合物（2）为3β,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-23-咖啡酸酯（3β,23,28-trihydroxy-12-oleanene-23-caffeate）；化合物（3）为3β,23,28-三羟基齐墩果烷-12-烯（3β,23,28-triol olean-12-ene）。具体结构式如下：化合物（1）结构式：

化合物（2）的结构式：

化合物（3）的结构式：

本发明的另一个目的是提供饿蚂蝗提取物、活性组分（A）-（C）、活性化合物（1）-（3）在制备延缓衰老及治疗衰老性疾病等的药品或食品中的应用。

饿蚂蝗提取物、活性组分（A）-（C）、活性化合物（1）-（3）具有显著的延长酵母细胞复制性寿命的活性，因此可将其作为有效成分，添加药学或食品可接受的载体，制备延缓衰老及治疗衰老性疾病等的药品或食品。

所述的食品可接受的载体是指食品领域常规的载体，例如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等填充剂，淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等粘合剂，硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等湿润剂，聚山梨脂、卵磷脂等吸收促进剂，伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等表面活性剂，另外还可以添加香味剂、甜味剂等其它辅剂。

所述的药学可接受的载体可参照现有技术。将所述的活性成分或化合物制成药品后，可以以单位剂量形式给用，给药途径可以为肠道或非肠道给药。

药品的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体剂型，上述各种剂型可采用现有生产方法进行制备。

本发明进一步还提供一种延缓衰老及治疗衰老性疾病等方面药物组合物，该药物组合物含有生理有效量的饿蚂蝗提取物或其活性组分和活性化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。

这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如是等，填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等；湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等；吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明所述的饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物可以以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道和非肠道，包括口服、肌肉、皮下和鼻腔。

本发明所述的化合物给药途径可为静脉给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和穴位注射。

本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

给药剂型可以是固体制剂、胶囊剂或液体制剂，包括片剂、胶囊剂、分散片、口服液、大输液、小针、冻干粉针、软膏、搽剂或栓剂。

本发明的优点是：用本发明制备的饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物，在酵母衰老模型K6001啤酒酵母细胞中表现出显著的延长酵母细胞复制性寿命活性。

本发明中的中药材饿蚂蝗廉价易得，且至今无其具有延缓衰老及治疗衰老性疾病的相关报道。因此，本发明对该中药新的药理活性研究及开发具有重要意义。

附图说明

图1是饿蚂蝗提取物延长酵母细胞的复制性寿命。

图2是饿蚂蝗酯层活性组分（A）延长酵母细胞的复制性寿命。

图3是饿蚂蝗活性组分（B）延长酵母细胞的复制性寿命。

图4是饿蚂蝗活性组分（C）延长酵母细胞的复制性寿命。

图5是化合物（1）延长酵母细胞的复制性寿命。

图6是化合物（2）的衍生物延长酵母细胞的复制性寿命。

图7是化合物（3）的衍生物延长酵母细胞的复制性寿命。

具体实施方式

以下通过对该类若干具体化合物制备实例的实施方式和附图再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1饿蚂蝗中五环三萜提取物的制备

（1）粉碎和浸提：1000g中药饿蚂蝗粉碎后，用3L乙醇室温下浸提（偶尔震荡）。抽滤浓缩干燥后，得到乙醇提取物粗样50g，将其用水和乙酸乙酯交替萃取分离多次,得到酯层活性组分（A）10g。

（2）分离和纯化：将活性组分（A）先经一次硅胶开口柱分离（200-300目，以下溶剂系统均按体积比，第一次分离为氯仿:乙酸乙酯=100:0,90:10,80:20,70:30,50:50，0:10）,合并氯仿:乙酸乙酯为90:10至50:50的洗脱流分，得到活性组分（B）1g；然后，将活性组分进一步用ODS开口柱分离（溶剂系统按体积比为甲醇:水=6:4,7:3,8:2,9:1,10:0），合并甲醇:水为7:3至9:1的洗脱流分，得到活性组分（C）150mg；活性组分（C）用HPLC纯化（色谱条件为：色谱柱ODS-HG-5(/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为80%-85%甲醇水溶液梯度洗脱60分钟），得到三个五环三萜类化合物（1）50mg，化合物（2）25mg和化合物（3）2.5mg。

实施例2对实施例1所得化合物理化特征及化学结构的定性鉴定

化合物（1）-（3）的结构经MS、¹H NMR、¹³C NMR测试，并与文献数据对比后确定。

化合物1:白色固体;(c1.0,MeOH);C₃₉H₅₆O₆（HRESI-TOF-MS m/z(M+Na)⁺Calcd.for C₃₉H₅₆O₆Na:643.3969,Found:643.3981）;¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.51(1H,d,J=15.8Hz),7.03(1H,d,J=2.0Hz),6.94(1H,dd,J=8.2,2.0Hz),6.78(1H,d,J=8.2Hz),6.23(1H,d,J=15.8Hz),5.20(1H,brt),4.97(1H,dd,J=9.1,7.6Hz),3.52(2H,d,J=10.0Hz),3.35(d,10Hz,1H),3.16(1H,d,J=12.7Hz),3.11(1H,d,J=11.8Hz),1.23(3H,s),1.07(3H,s),1.02(3H,s),0.89(6H,s),0.83(3H,s)。

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ169.2,149.5,146.7,146.6,145.8,127.7,123.4,122.9,116.5,115.6,115.1,75.8,69.8,64.7,49.1,47.9,47.8,43.8,43,43,41,39.2,38.1,37.7,35.3,33.7,33.1,32.3,31.8,26.6,26.6,24.6,24.1,24,22.9,18.8,17.3,16.5,13.9。

化合物2：白色固体;(c1.0,MeOH);高分辨质谱显示出其分子式为C₃₉H₅₆O₆（HR ESI-TOF-MS m/z(M+Na)⁺Calcd.for C₃₉H₅₆O₆Na:643.3969,Found:643.3972）;¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.57(1H,d,J=15.9Hz),7.04(1H,brs),6.94(1H,dd,J=8.2),6.79(1H,d,J=8.2Hz),6.27(1H,d,J=15.9Hz),5.19(1H,brt),4.13(1H,d,11.3Hz),4.03(1H,d,11.3Hz),3.63(1H,d,11.1Hz,6.3Hz),3.50(1H,d,J=12Hz),3.09(1H,d,J=11.0Hz),1.13(3H,s),1.02(3H,s),1.00(3H,s),0.88(6H,s),0.79(3H,s)。

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ169.13,149.74,146.99,146.92,145.82,127.69,123.48,123.07,116.58,115.15,115.15,72,69.7,66.5,49.39,49.05,47.7,43.86,43.31,42.85,41.12,39.8,38.1,37.94,35.28,33.78,33.52,32.32,31.89,27.47,26.6,26.54,24.6,24,22.8,19.2,17.3,16.4,12.82。

化合物3的理化性质：白色固体;(c1.0,CHCl₃);分子式为C₃₀H₅₂O₃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)　5.18(brt,1H),3.67(m,1H),3.73(d,J=10.3Hz,1H),3.44(d,J=10.3Hz,1H),1.15(s,3H),3.55(d,10.9Hz,1H),3.20(d,11.0Hz,1H),0.97(s,3H),0.93(s,3H),0.90(s,3H),0.87(s,3H),0.88(s,3H)。

实施例3饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物在抗衰老化合物的体外筛选模型中，显著延长酵母细胞的复制性寿命。

酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。在人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，其中包括有关细胞周期的蛋白、信号蛋白和蛋白质加工酶。它的不对称分裂常常被用来研究其复制性寿命，但需要在母细胞裂殖前，用显微操纵杆把子细胞移走。Stefanie，Jarolim等人发现的酿酒酵母的突变菌株（K6001）在葡萄糖培养基中，只有母细胞可以分裂产生子细胞，而子细胞不能产生后代，所以只要在显微镜下数出子细胞的个数就可以确定K6001酵母细胞的复制性寿命。因此，K6001酵母细胞非常适合作为筛选抗衰老化合物的模型生物。而白藜芦醇是目前长寿研究领域中最有效小分子化合物，它不仅能延长酵母，线虫，果蝇和小鼠的寿命，而且对恒河猴的寿命有延长的作用。以白藜芦醇作为阳性对照，筛选得到的活性化合物对进一步的抗衰老研究具有很大的现实意义。

本发明发现饿蚂蝗提取物及其活性组分和活性化合物在K6001模型中，显著延长酵母细胞的复制性寿命，且其活性与阳性对照10μM白藜芦醇（Resveratrol，以下缩写为Res）相当。

1）实验方法：

(1)将-30度保存的K6001酵母菌株用5mL无菌水洗涤三次，除去其中的甘油。加入1mL无菌水，吹打使其悬浮，加入到10mL液体培养基(1%的酵母粉，2%的蛋白胨，3%的半乳糖)中。将其放入摇床，28度振摇培养48小时，使其恢复生长能力。

(2)从摇床中取出培养好的酵母，用5mL无菌水洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数。

(3)在培养皿中加入5mL的固体培养基(1%的酵母粉，2%的蛋白胨，2%的葡萄糖，2%的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其中加入溶解好的样品，包括：饿蚂蝗提取物、其活性组分（A）-（C）及化合物（1）-（2），再加入4000个酵母，放入恒温培养箱中28度恒温培养48小时。

(4)显微镜下数出母细胞产生的子细胞个数，作图分析。其中的阳性对照为白藜芦醇。

2）实验结果：

与阴性对照比较，饿蚂蝗提取物及其活性组分（A）-（C）一定浓度下均具有显著延长酵母细胞复制性寿命(P＜0.05)的活性，与阳性对照10μM白藜芦醇（Res）相当(参见图1-4)。

此外，化合物（1）3β,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-3β-咖啡酸酯（3β,23,28-trihydroxy-12-oleanene-3β-caffeate）和化合物（2）3β,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-23-咖啡酸酯（3β,23,28-trihydroxy-12-oleanene-23-caffeate）以及化合物（3）3β,23,28-三羟基齐墩果烷-12-烯（3β,23,28-triol olean-12-ene）在抗衰老化合物的体外筛选模型中，均可以显著延长酵母细胞的复制性寿命（参见图5和图6以及图7）。

Claims

1.一种五环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）粉碎和浸提：1000 g中药饿蚂蝗粉碎后，用3 L乙醇室温下浸提，抽滤浓缩干燥后，得到乙醇提取物粗样，将其用水和乙酸乙酯交替萃取分离，得到酯层活性组分（A）；

（2）分离和纯化：将活性组分（A）先经一次硅胶开口柱分离，按体积比溶剂系统为氯仿:乙酸乙酯 = 100:0，90:10，80: 20，70:30，50:50，0:10，合并氯仿:乙酸乙酯从90:10至 50:50的洗脱流分，得到活性组分（B）；然后，将活性组分（B）进一步用ODS开口柱分离，按体积比溶剂系统为甲醇:水 = 6:4，7:3，8:2，9:1，10:0，合并甲醇:水从7:3至 9:1的洗脱流分，得到活性组分（C）；活性组分（C）用HPLC纯化，色谱条件为：色谱柱ODS-HG-5，流速3 ml/min，检测波长210 nm，流动相为80%-85%甲醇水溶液梯度洗脱60 分钟，得到三个五环三萜类化合物（1）50 mg，化合物（2）25 mg和化合物（3）2.5 mg；

所述化合物（1）为3 ,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-3 -咖啡酸酯，化合物（2）为3,23,28-三羟基-12-齐墩果烯-23-咖啡酸酯，化合物（3）为 3,23,28-三羟基齐墩果烷-12-烯。