CN103848878B

CN103848878B - 从蛹虫草中提取n6-(2-羟乙基)腺苷的方法及其应用

Info

Publication number: CN103848878B
Application number: CN201410041896.8A
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 陈玉皎; 崔今松; 舒特俊; 陈剑清
Original assignee: Alatook (tianjin) Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Guizhou Gui'an Precision Medicine Co ltd
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2034-01-27
Also published as: CN103848878A

Abstract

本发明提供一种从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法：蛹虫草子实体为原料超微粉碎，得超微粉；超微粉中加超纯水，100℃加热提取，离心取上清，干燥；加少量超纯水使溶解即可，加95%乙醇至终浓度为80%，醇沉过夜后收集上清液，干燥；用15%甲醇-水溶液溶至200mg/ml，过制备液相色谱，洗脱方式为15%甲醇-水溶液等度洗脱30～80min，收集目的色谱峰，浓缩后干燥，得N6-(2-羟乙基)腺苷。该方法简单可控、重复性好，提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷纯度可达98%，被证明具有抗失眠作用可用于制备抗失眠药物。

Description

从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品加工技术领域，具体涉及一种从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，以及该提取到的N6-(2-羟乙基)腺苷在制备抗失眠药物中的应用。

背景技术

失眠是一种常见病、多发病，并且严重地影响了人们的生活、工作及身心健康。长期失眠者的严重意外事故和外伤发生率明显高于睡眠正常者。因此，人们发明了许多药物来治疗失眠。早期使用的巴比妥类药物副作用大，依赖性较强，现已较少被使用。苯二氮草类药物因其疗效较好，比较安全，对呼吸抑制较轻，药物相互作用较少，相对来说耐受性也较难形成，因而成为目前国内最通用的安眠药。但这类药物或多或少有延续反应、撤药反应、依赖性和抑制3-4期深睡等缺点，因而促使人们开始研究新型的非苯二氮草类药物。哇毗坦等新型非苯二氮草类药物克服了苯二氮草类药物的缺点，既能促使人眠，又能减少觉醒时间和次数，增加总睡眠时间，而且3-4期睡眠和REM睡眠均不受影响，无明显延续作用，也不易产生耐药性，停药后一般也不引起反跳性失眠等戒断反应，故已成为目前较为理想的安眠药，是当前欧洲和美国较常用的安眠药。

文献报道许多天然药物如颧草属植物，炒酸枣仁，合欢花与南蛇藤果实，冬虫夏草，花生叶，半夏汤等提取物具有良好的镇静作用，且不良反应较少，具有广阔的应用前景。但这些天然药物都没有开发出抗失眠活性单体，所以具有服药剂量大、服用时间长等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，该方法简单可控、重复性好，提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷纯度可达98%。该提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷被证明具有抗失眠作用，利用该N6-(2-羟乙基)腺苷进行制备抗失眠药物，其有效成分含量高，可减少服用剂量。

本发明所采用的技术方案为：

一种从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，该方法包括以下步骤：

（1）超低温粉碎：

取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉。

（2）溶剂提取：

（a）水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取上清，然后重复1～3次，将得到的上清合并，干燥，得到粗品A。

（b）乙醇沉淀：在粗品A中加少量超纯水使溶解即可，加入95%乙醇至终浓度为80%，充分混匀后，4℃中醇沉过夜，然后收集上清液，将上清液浓缩后干燥，得到粗品B。

与传统的直接用无水乙醇进行醇沉处理的提取方式相比，本发明粗品A先用少量超纯水溶解，使物质颗粒处于尽量分散状态，然后加入95%的乙醇至终浓度为80%，即在乙醇加入的整个过程中，物质颗粒所在的液体环境其乙醇浓度是慢慢由0%升至80%，而我们知道固体物质的溶解与其溶剂的浓度是有关系的，所以本发明使乙醇浓度由0%升至80%的过程中可以使尽可能多的物质种类和数量被溶解在液体中，这有利于提高N6-(2-羟乙基)腺苷被提取的可能性，有利于提高N6-(2-羟乙基)腺苷的提取率。

（3）色谱分离：

取粗品B用15%甲醇-水溶液（即甲醇与水以3：17的体积比配比而成）20℃～80℃超声溶解至浓度为200mg/ml，过膜（0.45μm有机膜抽滤）后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为15%甲醇-水溶液等度洗脱30～80min，检测波长为210～280nm，收集目的色谱峰，经多功能膜分离系统浓缩后真空冷冻干燥，得N6-(2-羟乙基)腺苷。

该步流动相的选择非常重要，经过大量的数据研究和反复试验，我们发现当使用15%甲醇-水溶液将粗品B溶解至200mg/mL时，最后收集得到的目的组分中N6-(2-羟乙基)腺苷的含量为最高，当浓度高于200mg/mL或低于200mg/mL时，最终得到的目的组分中其N6-(2-羟乙基)腺苷含量经过测试都没有200mg/mL时高；而先用15%甲醇-水溶液等度洗脱30～80min的洗脱方式也对目的组分的获得至关重要，使用该洗脱方式时，洗脱得到的各个峰之间比较分得开，使得到的目的组分中N6-(2-羟乙基)腺苷纯度高，提取率高。

所述步骤（1）中粉碎时间为12min。

所述步骤（2）中粗品A与超纯水混合的重量体积比（w/v）为（1～4）︰1。

所述步骤（2）中离心的转速为6000rpm。

所述步骤（2）中浓缩在旋转蒸发仪中进行，工艺条件为真空度0.08Mpa、温度60℃。

所述步骤（2）中干燥在60℃鼓风干燥箱内进行。

所述步骤（3）中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径10μm的C18、大小为150×250mm。

本发明还进一步提供上述从蛹虫草中提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷在制备抗失眠药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1、本发明采用超微粉碎机进行低温超微粉碎，以破除蛹虫草子实体坚硬的细胞壁，有利于内容物的溶出，有效提高了蛹虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的提取率；

2、本发明采用制备液相色谱进行物质组分的分离纯化，通过对各个分离步骤的试剂选择、工艺条件和工艺参数的优化，以及各个分离步骤之间良好的协同作用，最终成功从蛹虫草中中提取到N6-(2-羟乙基)腺苷，且提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷纯度可达98%；

3、本发明从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法相对于传统的溶剂萃取法，不但稳定可控，重复性好，得到的物质组分批次之间一致性高，且工艺简单，易于实施，具有快速、高效、分离纯化制备量大、适用于工业化大规模生产等特点；

4、经过试验，N6-(2-羟乙基)腺苷被证实具有抗失眠的效果：在给药剂量为16mg/kg时可提高入睡率、减少机体的自主活动性、缩短入睡前时间，在给药剂量为32mg/kg时可明显延长睡眠时间、改善睡眠质量；

5、本发明提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷纯度高，可开发成为抗失眠的药用活性单体，减少服药剂量，且该组分原料来源于天然，可进一步开发出药效更好、不良反应更小更少的新药，具有明显的社会效益和经济效益；

6、本发明通过动物试验来判定蛹虫草中抗失眠活性组分N6-(2-羟乙基)腺苷的抗失眠能力，并设阳性对照，结果直观、易判断；

7、本发明拓展了抗失眠药物或保健食品的原料来源，扩大了蛹虫草子实体的应用范围，使蛹虫草子实体成为抗失眠药物的有效组分原料，显著提高了蛹虫草子实体的附加值。

附图说明

图1所示的是本发明从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的工艺流程图；

图2所示的是本发明实施例1（3）步骤得到的色谱分离图；

图3所示的是本发明得到的N6-(2-羟乙基)腺苷组分的HPLC谱分析图；

图4所示的是本发明得到的N6-(2-羟乙基)腺苷的电喷雾质谱（ESI-MS）分析图；

图5所示的是本发明得到的N6-(2-羟乙基)腺苷的1D¹HNMR谱(CHCl₃-d6,400MHz)的数据图谱；

图6所示的是本发明得到的N6-(2-羟乙基)腺苷的1D¹³CNMR谱(CHCl₃-d6,400MHz)的数据图谱；

图7所示的是本发明得到的N6-(2-羟乙基)腺苷的IR数据图谱；

图8所示的是N6-(2-羟乙基)腺苷的分子结构式。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：蛹虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷的提取

1、原料、材料：

蛹虫草子实体为本实验室生产。

2、试剂：

超纯水由密立博纯水仪生产；95%乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级甲醇购自Honeywell公司。

3、仪器设备：

超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂；C18色谱柱（150×250mm）江苏汉邦科技有限公司；多功能膜分离系统杭州凯洁膜分离技术有限公司。

蛹虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷的提取步骤如下：

（1）超低温粉碎：

取烘干的蛹虫草子实体为原料，称取150g烘干的蛹虫草子实体，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，以降低粉碎温度，确保有效成分的释放和生物活性的稳定，超微粉碎时间为5-20min，经过实践摸索12min为最宜，得到超微粉。

（2）溶剂提取：

（a）水煮：在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，6000rpm离心取上清，然后重复两次，将三次得到的上清合并，在60℃鼓风干燥箱内干燥，得到粗品A。

（b）乙醇沉淀：在粗品A中加适量超纯水（溶解即可，约2:1（w/v））分散，加入95%的乙醇至终浓度为80%，充分混匀后，4℃冰箱中沉淀过夜收集上清液，上清液于旋转蒸发仪中浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥，得到粗品B。

（3）色谱分离：

取粗品B用15%甲醇-水溶液50℃超声溶解至浓度为200mg/ml，0.45μm有机膜抽滤，然后通过制备液相色谱进行分离。色谱柱填料为粒径10μm的C18、大小为150×250mm。洗脱方式为15%甲醇-水溶液等度洗脱.70min，检测波长为260nm，得到色谱图如图2所示，收集图2中两虚线之间的区段，经多功能膜分离系统浓缩后真空冷冻干燥，即得本发明目的组分N6-(2-羟乙基)腺苷，重量为8.5g，计算其得率为5.6%。

当然，在前期的有效组分探索过程中，进行制备液相色谱时，我们收集图2所示的各个峰，先对其使用HPLC进行纯度检测，对纯度达80%以上的收集峰再进行质谱检测，根据质谱显示的分子量初步判定两虚线之间的区段为N6-(2-羟乙基)腺苷，然后再对该组分进行进一步确认和验证。

实施例2：N6-(2-羟乙基)腺苷的确认

1、HPLC进行纯度分析：

将实施例1得到的目的组分N6-(2-羟乙基)腺苷经HPLC进行纯度分析。经高效液相检测纯度达到98%，HPLC谱图见图3。

2、质谱分析：

对目的组分N6-(2-羟乙基)腺苷进行正离子模式电喷雾质谱（ESI-MS）分析：Varian450GC-320TQ-M，瀚盟生物技术(天津)有限公司，质谱图见图4。电喷雾质谱[(+)-ESI-MS]给出准分子离子峰m/z为311.97[M+H]⁺；提示分子组成为C₁₂H₁₇N₅O₅。

3、核磁共振分析：

对目的组分N6-(2-羟乙基)腺苷进行核磁共振分析：

1D¹HNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：δ：8.358(1H,s,H-8)，8.216(1H，s，H-2)，7.699(1H，brs，N⁶H)，5.882(1H，d，J=6.3Hz，H-1’)，5.447(1H，d，J=6.3Hz,2’-OH)，5.416(1H，dd，J=6.9，4.7Hz，5’-OH)，5.189(1H，J=4.7Hz，3’-OH)，4.769(1H，brs，OH-2’)，4.605(1H，dd，J=11.3，6.0Hz，H-2’)，4.148(1H，m，H-3’)，3.959(1H，dd，J=6.6，3.6Hz)，3.665(1H，dt，J=12.1，3.9Hz，Ha-5’)，3.573(4H，brs，H-1”,2”)，图谱如图5所示。

1D¹³CNMR谱中(DMSO-d6,400MHz)的数据结果如下：155.19(C-6)，152.77(C-2)，148.75(C-4)，140.25((C-8)，120.27(C-5)，88.40(C-1’)，86.36(C-4’)，73.94(C-2’)，71.11(C-3’)，62.13(C-5’)，60.14(C-2”)，42.95(C-1’)，图谱如图6所示。

IR谱中：cm^-1，3419.86(NH),3305.66,3268.83，3151.46(OH)，1626.34(C=N)，图谱如图7所示。

实施例1所得化合物为白色结晶形粉末。根据ESI-MS，NMR和IR鉴定结果，经结构解析，确定其为N6-(2-羟乙基)腺苷，N6-(2-羟乙基)腺苷的分子结构式如图8所示。

实施例3：N6-(2-羟乙基)腺苷在抗失眠效果试验

1、药品及试剂：

枣仁安神胶囊购自贵州同济堂制药有限公司；艾司唑仑片购自天津太平洋制药有限公司；戊巴比妥钠由Sigma公司分装。

2、试验动物：

KM小鼠（18～22g）（动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779）购自购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3、器材及仪器

注射器购自上海治宇医疗器械有限公司；秒表、EL电子天平购自常州天之平仪器设备有限公司。

取实施例1提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷，进行抗失眠效果试验，方法步骤如下：

1、药物制备：

N6-(2-羟乙基)腺苷灌胃剂：称定一定重量的N6-(2-羟乙基)腺苷样品至研钵中，充分研磨后再加入所需体积的生理盐水，混匀后备用。

枣仁安神胶囊灌胃剂：将胶囊内容物取出后进行称取，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。

艾司唑仑片灌胃剂：将艾司唑仑片粉碎研磨后，称取一定重量至研钵中，加入所需体积的生理盐水，充分研磨、混匀后备用。

2、动物分组及给药：

将60只实验小鼠共分为6组，每组10只，雌雄各半，分为①N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组（32mg/kg）、②N6-(2-羟乙基)腺苷中剂量组（16mg/kg）、③N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组（8mg/kg）、④枣仁安神胶囊组、⑤艾司唑仑片组、⑥空白组，以上除空白组外，其余各组均按相应给药剂量每日给药一次，连续给药15天，空白组在相同给药时间及给药时长灌胃给予生理盐水，连续灌胃15天。N6-(2-羟乙基)腺苷给药剂量参考三磷酸腺苷二钠片临床给药剂量20mg/片×2片/次×3次/日=120mg/日，经过人鼠给药剂量换算得出的。

3、观察指标：

3.1小鼠大体状态

每日对小鼠进行体重、饮食量的称定并记录。

3.2对小鼠自发活动（旷野法）的影响

小鼠连续灌胃15天后，在末次给药后1小时，采用旷野法将小鼠放入100cm×100cm×40cm无盖箱，待小鼠适应5分钟后，记数2分钟内前肢向上抬举次数，连续2次，取平均值进行结果的统计分析。

3.3对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响

观察受试药物能否延长戊巴比妥类使小白鼠翻正反射消失的时间。各组连续给药15天，末次给药1小时后，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠闭上催眠剂量（使100%动物入睡，但又不使睡眠时间过长的腹腔注射剂量），睡眠以翻正反射消失为指标。将动物背朝下仰卧于平板上，若动物保持此姿式30秒以上，则认为翻正反射消失。观察记录入睡潜伏期（腹腔注射至翻正反射消失的时间）和睡眠持续时间（翻正反射消失至恢复的时间），结果进行统计学分析。

3.4对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响

用阈下催眠剂量戊巴比妥钠和受试药物合用，以翻正反射消失为指标,观察有无睡眠作用。各组连续给药15天，末次给药1小时后，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠阈下催眠剂量（使90-100%的动物翻正反射不消失的最大剂量），观察30分钟内有多少动物翻正反射消失达1分钟以上，如超过1分钟即为发生睡眠的动物，计算各给药组入睡率。

4、数据统计：

对小鼠自发活动的影响及对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响数据均以表示，采用SPSS18.0软件进行统计，各组别采用one-wayANOVALSD检验。对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响数据以入睡百分率表示，采用SPSS18.0软件进行统计，各组别进行χ²检验。

5、实验结果：

实验结果如表1所示，由该实验结果可知，N6-(2-羟乙基)腺苷在给予剂量为32mg/kg及16mg/kg，服药天数为15天时与空白组小鼠在一定时间内前臂抬举次数比较有极显著差异（P<0.01），即自主活动性降低，且此剂量与枣仁安神胶囊组（中药对照组）、艾司唑仑片组（西药对照组）比较无明显差异。

在入睡潜伏时间方面，N6-(2-羟乙基)腺苷在给予剂量为32mg/kg及16mg/kg时，与空白组比较有显著差异（P<0.05），直观观测略优于枣仁安神胶囊组（中药对照组）及艾司唑仑片组（西药对照组）。

在睡眠持续方面，N6-(2-羟乙基)腺苷在给予剂量为32mg/kg时，与空白组比较有极显著差异（P<0.01）；且此剂量与枣仁安神胶囊组（中药对照组）比较无明显差异。

在阈下剂量入睡率方面，N6-(2-羟乙基)腺苷在给予剂量为32mg/kg时，与空白组比较有极显著差异（P<0.01）；在给予剂量为16mg/kg时，与空白组比较有显著差异（P<0.05），两种剂量与枣仁安神胶囊组（中药对照组）及艾司唑仑片组（西药对照组）比较无明显差异。

在给药期间，N6-(2-羟乙基)腺苷高剂量组及及艾司唑仑片组（西药对照组）体重增长速度要略快于其他组别，N6-(2-羟乙基)腺苷中剂量组、N6-(2-羟乙基)腺苷低剂量组及枣仁安神胶囊组（中药对照组）体重增长速度相近，增长速度低于正常组别。此外，各组别饮食量均在一定范围内波动，无明显差别。

综上所述，推测N6-(2-羟乙基)腺苷在给药剂量为16mg/kg时可提高入睡率，减少机体的自主活动性，缩短入睡前时间；在给药剂量为32mg/kg时，可明显延长睡眠时间，改善睡眠质量。

表1：抗失眠相关试验结果

注：与空白组比较^**p<0.01、^*p<0.05。

结论：利用本发明方法从蛹虫草中提取得到的N6-(2-羟乙基)腺苷，其纯度为98%，在给药剂量为16mg/kg时可提高入睡率，减少机体的自主活动性，缩短入睡前时间；在给药剂量为32mg/kg时，可明显延长睡眠时间，改善睡眠质量。这显示了N6-(2-羟乙基)腺苷在开发有效的抗失眠药物方面的潜力。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物制品加工的普通市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取烘干的蛹虫草子实体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉碎全过程用2～10℃的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5-20min，得到超微粉；

(2)在超微粉中加入超纯水，超纯水的加入量为超微粉质量的8～10倍，100℃加热3～10小时进行提取，离心取上清，然后重复1～3次，将得到的上清合并，干燥，得到粗品A；在粗品A中加少量超纯水使溶解即可，加入95％乙醇至终浓度为80％，充分混匀后，4℃中醇沉过夜，然后收集上清液，将上清液浓缩后干燥，得到粗品B；

(3)取粗品B用15％甲醇-水溶液20℃～80℃超声溶解至浓度为200mg/ml，过膜后通过制备液相色谱进行分离，洗脱方式为15％甲醇-水溶液等度洗脱30～80min，检测波长为210～280nm，收集目的色谱峰，经多功能膜分离系统浓缩后真空冷冻干燥，得N6-(2-羟乙基)腺苷。

2.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(1)中粉碎时间为12min。

3.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(2)中粗品A与超纯水混合的重量体积比为(1～4)︰1。

4.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(2)中离心的转速为6000rpm。

5.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(2)中浓缩在旋转蒸发仪中进行，工艺条件为真空度0.08MPa、温度60℃。

6.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(2)中干燥在60℃鼓风干燥箱内进行。

7.根据权利要求1所述的从蛹虫草中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于：所述步骤(3)中制备液相色谱使用的色谱柱填料为粒径10μm的C18、大小为150×250mm。