CN113480587B - 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 - Google Patents
一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113480587B CN113480587B CN202110553647.7A CN202110553647A CN113480587B CN 113480587 B CN113480587 B CN 113480587B CN 202110553647 A CN202110553647 A CN 202110553647A CN 113480587 B CN113480587 B CN 113480587B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adenosine
- hydroxyethyl
- fruiting bodies
- cordyceps sobolifera
- efficiently extracting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- BBOCDRLDMQHWJP-WOUKDFQISA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-(2-hydroxyethylamino)purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(NCCO)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O BBOCDRLDMQHWJP-WOUKDFQISA-N 0.000 title claims abstract description 36
- BBOCDRLDMQHWJP-UHFFFAOYSA-N N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine Natural products C1=NC=2C(NCCO)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O BBOCDRLDMQHWJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 241000357408 Ophiocordyceps sobolifera Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 22
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 241001625026 Cordyceps cicadae Species 0.000 claims description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 19
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 5
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 5
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000931705 Cicada Species 0.000 description 4
- 241001248610 Ophiocordyceps sinensis Species 0.000 description 4
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 108010060263 Adenosine A1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000030814 Adenosine A1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 229940077122 Adenosine A1 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940124258 Adenosine A1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190633 Cordyceps Species 0.000 description 1
- FFBDFADSZUINTG-UHFFFAOYSA-N DPCPX Chemical compound N1C=2C(=O)N(CCC)C(=O)N(CCC)C=2N=C1C1CCCC1 FFBDFADSZUINTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002582 adenosine A1 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 239000002598 adenosine A1 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 150000003835 adenosine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002082 anti-convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G18/00—Cultivation of mushrooms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G18/00—Cultivation of mushrooms
- A01G18/20—Culture media, e.g. compost
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
- C07H1/08—Separation; Purification from natural products
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于食用菌活性成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取蝉花虫草子实体中N6‑(2‑羟乙基)腺苷的方法。本发明所述高效提取蝉花虫草子实体中N6‑(2‑羟乙基)腺苷的方法，在现有技术传统的乙醇提取‑树脂分离‑制备型色谱分离的提取方法的基础上，通过在乙醇提取步骤中加入肌氨酸的方式进行辅助提取，有助于提高N6‑(2‑羟乙基)腺苷的提取效率。
Description
技术领域
本发明属于食用菌活性成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法。
背景技术
N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，HEA)是从蝉花虫草菌丝体中提取的腺苷类衍生物，是虫草的特有成分，已报道的功能包括杀菌、抗癌和抗惊厥等，并具有Ca2+拮抗作用和肌肉收缩活性。HEA是目前已知的第一个生物来源的钙离子拮抗剂，也是腺苷A1受体激动剂，使用DPCPX(腺苷A1受体拮抗剂)可以证明HEA是作用于腺苷A1受体，而虫草独特的药用价值更促使其药理学研究不断发展。目前，HEA的含量是衡量虫草品质的重要指标，但是，无论是天然虫草还是人工虫草，其HEA的含量均十分低，为HEA的提取造成了一定的困难，普遍存在着提取效率较低的问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，以解决现有技术中HEA提取率较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，包括如下步骤：
(1)取蝉花虫草子实体进行粉碎，加入乙醇溶液混匀，并加入肌氨酸进行辅助提取；
(2)收集提取液以树脂进行分离，并以低浓度乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，经浓缩干燥，备用；
(3)将所得浓缩物用低浓度甲醇溶液溶解，注入反相高效液相制备色谱进行分离，收集制备图谱中14.6-15.2min的色谱峰组分，干燥，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述肌氨酸的加入量占所述蝉花虫草子实体用量的3-8wt％。
具体的，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的浓度为30-50v/v％。
具体的，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的用量为所述蝉花虫草子实体用量的2-4倍量。
具体的，所述步骤(2)中，所述树脂为D101大孔树脂。
具体的，所述步骤(2)中，控制所述子实体与所述树脂的用量比为1：8-12g/mL。
具体的，所述步骤(2)中，所述洗脱液为体积浓度15-25v/v％的乙醇溶液，使用量为3-5倍柱体积。
具体的，所述步骤(3)中，所述低浓度甲醇为体积分数10-20v/v％的甲醇溶液，并配置样品浓度为50-150mg/ml。
具体的，所述步骤(3)中，所述反相高效液相制备色谱条件包括：
色谱柱：C18键合相填料柱；
流动相：10-20v/v％甲醇-水溶液；
检测波长：紫外检测器260nm；
流动相流速：160ml/min；
进样量：10ml。
具体的，所述蝉花虫草子实体为N6-(2-羟乙基)腺苷高含量子实体。
本发明所述的N6-(2-羟乙基)腺苷高含量蝉花虫草子实体经由可提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的方法栽培获得，具体包括在液体培养基中进行液体菌种培养以及在固体培养基中进行子实体培养的步骤；
所述固体培养基包括质量比为1：0.8-1.5的固体基质和营养液；
所述固体基质包括如下重量份的组分：玉米渣20-30重量份、麸皮10-20重量份、蝉蛹粉10-20重量份、桑枝碎粒3-8重量份、烟叶茎秆碎粒5-12重量份、EM菌粉0.5-2重量份；
所述营养液包括如下质量含量的组分：碳源20-30g/L、氮源20-30g/L、无机盐5-12g/L，pH6-8。
具体的，所述提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的栽培方法：
所述碳源包括葡萄糖；
所述氮源包括蛋白胨；
所述无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁的混合物。
具体的，所述子实体培养步骤包括发菌步骤、转色步骤以及子实体管理步骤。
具体的，所述发菌步骤的控制条件包括：控制培养温度15-18℃、湿度60-80％，进行避光培养。
具体的，所述转色步骤的控制条件包括：控制光照条件为200-500lux，控制光周期光暗比为L15-18：D6-9，培养温度15-18℃，湿度60-80％。
具体的，所述子实体管理步骤的控制条件包括：控制光照条件为200-500lux，控制光周期光暗比为L15-18：D6-9，培养温度20-25℃，湿度60-80％。
具体的，所述液体培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖2-6％、鸡蛋清1-2％、蛋白胨1-3％、MgSO4·7H2O 0.05％、KH2PO4 0.05％，自然pH值。
具体的，所述液体菌种培养的条件包括：控制发酵温度20-25℃，搅拌转速150-180rpm。
具体的，还包括在所述液体菌种培养步骤前将所述菌株进行常规活化的步骤。
本发明还公开了由所述栽培方法得到的蝉花虫草子实体。
本发明所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，在现有技术传统的乙醇提取-树脂分离-制备型色谱分离的提取方法的基础上，通过在乙醇提取步骤中加入肌氨酸的方式进行辅助提取，有助于提高N6-(2-羟乙基)腺苷的提取效率。
本发明所述提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的栽培方法，在常规蝉花虫草子实体栽培工艺的基础上，通过对固体培养基基质的筛选，有效的诱导发酵过程中N6-(2-羟乙基)腺苷的积累，提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的含量。本发明所述方法特异性针对于发酵过程中N6-(2-羟乙基)腺苷的积累，相比于一般性针对于腺苷优化的方案，其对于N6-(2-羟乙基)腺苷含量的提高尤为突出。
具体实施方式
在本发明下述制备例中，选用的培育蝉花虫草的菌株为现有技术常规已知菌株即可，下述实施例选用的所述蝉花虫草菌株购于上海抚生实业有限公司。
本发明下述制备例中，所述蝉花虫草经液体培养获得相应的培养液(种子液)，再接种于相应的固体培养基中进行子实体的发酵。下述制备例中，所述液体培养步骤使用的液体培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖4％、鸡蛋清1％、蛋白胨2％、MgSO4·7H2O0.05％、KH2PO4 0.05％，自然pH值。经灭菌后，于无菌条件下，将保存的菌株挖块接种至上述液体培养基中，控制发酵温度22℃，搅拌转速160rpm进行摇瓶培养48h，获得如下实施例中待接种进行子实体固体发酵的种子液，备用。
制备例1
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣20重量份、麸皮20重量份、蝉蛹粉10重量份、桑枝碎粒8重量份、烟叶茎秆碎粒5重量份、EM菌粉2重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖20g/L、蛋白胨30g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L；
按照1：0.8的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例2
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣30重量份、麸皮10重量份、蝉蛹粉20重量份、桑枝碎粒3重量份、烟叶茎秆碎粒12重量份、EM菌粉0.5重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖30g/L、蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾4g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸镁4g/L；
按照1：1.5的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例3
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣25重量份、麸皮15重量份、蝉蛹粉15重量份、桑枝碎粒5重量份、烟叶茎秆碎粒8重量份、EM菌粉1重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖25g/L、蛋白胨25g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L；
按照1：1.2的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例4
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述EM菌粉。
制备例5
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述烟叶茎秆碎粒。
制备例6
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述桑枝碎粒。
实施例1
取上述制备例3中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例2
取上述制备例4中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例3
取上述制备例5中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例4
取上述制备例6中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
对比例1
本对比例所述HEA的提取方法同实施例1，其区别仅在于，所述提取步骤中不加入所述肌氨酸。
实验例
分别收集上述实施例1-4及对比例1中分离的N6-(2-羟乙基)腺苷，称量并计算其得率，记录于下表1。
表1 N6-(2-羟乙基)腺苷的提取量
| 重量/g | 得率/％ | |
| 实施例1 | 8.15 | 8.15 |
| 实施例2 | 7.73 | 7.73 |
| 实施例3 | 6.43 | 6.43 |
| 实施例4 | 6.91 | 6.91 |
| 对比例1 | 7.41 | 7.41 |
可见，本发明所述提取方法可以有效提高蝉花虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷的提取效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取蝉花虫草子实体进行粉碎，加入乙醇溶液混匀，并加入肌氨酸进行辅助提取；
(2)收集提取液以树脂进行分离，并以低浓度乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，经浓缩干燥，备用；
其中，所述低浓度乙醇溶液为体积浓度15-25v/v％的乙醇溶液，使用量为3-5倍柱体积；
(3)将所得浓缩物用低浓度甲醇溶液溶解，注入反相高效液相制备色谱进行分离，收集制备图谱中14.6-15.2min的色谱峰组分，干燥，即得；
其中，所述低浓度甲醇为体积分数10-20v/v％的甲醇溶液，并配置样品浓度为50-150mg/ml。
2.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述肌氨酸的加入量占所述蝉花虫草子实体用量的3-8wt％。
3.根据权利要求1或2所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的浓度为30-50v/v％。
4.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的用量为所述蝉花虫草子实体用量的2-4倍量。
5.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述树脂为D101大孔树脂。
6.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，控制所述子实体与所述树脂的用量比为1：8-12g/mL。
7.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述反相高效液相制备色谱条件包括：
色谱柱：C18键合相填料柱；
流动相：10-20v/v％甲醇-水溶液；
检测波长：紫外检测器260nm；
流动相流速：160ml/min；
进样量：10ml。
8.根据权利要求1所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，所述蝉花虫草子实体为N6-(2-羟乙基)腺苷高含量子实体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110553647.7A CN113480587B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110553647.7A CN113480587B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113480587A CN113480587A (zh) | 2021-10-08 |
| CN113480587B true CN113480587B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=77933382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110553647.7A Active CN113480587B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113480587B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114276395A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-05 | 安徽农业大学 | 具有胰脂肪酶抑制活性的N6-羟乙基-5’-乙酰基-β-核糖腺苷及其制备方法 |
| CN114315936A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-12 | 安徽农业大学 | 具有抑制胰脂肪酶活性的N6-乙酸乙酯基-5’-乙酰基-β-核糖腺苷及制备方法 |
| CN114276396A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-05 | 安徽农业大学 | 具有抑制胰脂肪酶活性的N6-乙酸乙酯基-3’-乙酰基-β-核糖腺苷及制备方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102070690A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种同时制备腺苷、虫草素、n6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法 |
| CN102558265A (zh) * | 2012-01-04 | 2012-07-11 | 正源堂（天津）生物科技有限公司 | 蛹虫草腺苷的提取方法 |
| CN103113442A (zh) * | 2013-02-28 | 2013-05-22 | 华南理工大学 | 一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法 |
| CN103242402A (zh) * | 2013-04-26 | 2013-08-14 | 浙江省亚热带作物研究所 | 一种快速制备高纯度的n6-（2-羟乙基）腺苷的方法 |
| CN103278585A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-09-04 | 复旦大学 | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 |
| CN103848878A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-06-11 | 正源堂（天津）生物科技有限公司 | 从蛹虫草中提取n6-(2-羟乙基)腺苷的方法及其应用 |
| CN103908476A (zh) * | 2014-04-29 | 2014-07-09 | 洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司 | 一种蛹虫草提取物及其制备方法与制剂 |
| CN104211744A (zh) * | 2013-05-30 | 2014-12-17 | 北京东方瑞德生物技术有限公司 | 一种s-腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸硫酸盐的制备方法 |
| CN106317149A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 湖州新驰医药科技有限公司 | 一种金蝉花腺苷制剂及提取工艺 |
| CN106922389A (zh) * | 2015-12-31 | 2017-07-07 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | 一种蝉花的人工培养方法 |
| CN108948115A (zh) * | 2018-10-16 | 2018-12-07 | 安徽祥康生物工程有限公司 | 一种高效提取蛹虫草腺苷的方法 |
| TW201932133A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-16 | 明谷農業生技股份有限公司 | 蟬花萃取液之萃取方法及其用途 |
-
2021
- 2021-05-20 CN CN202110553647.7A patent/CN113480587B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102070690A (zh) * | 2010-11-30 | 2011-05-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种同时制备腺苷、虫草素、n6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法 |
| CN102558265A (zh) * | 2012-01-04 | 2012-07-11 | 正源堂（天津）生物科技有限公司 | 蛹虫草腺苷的提取方法 |
| CN103113442A (zh) * | 2013-02-28 | 2013-05-22 | 华南理工大学 | 一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法 |
| CN103242402A (zh) * | 2013-04-26 | 2013-08-14 | 浙江省亚热带作物研究所 | 一种快速制备高纯度的n6-（2-羟乙基）腺苷的方法 |
| CN103278585A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-09-04 | 复旦大学 | 一种尿液中肌氨酸的衍生化方法 |
| CN104211744A (zh) * | 2013-05-30 | 2014-12-17 | 北京东方瑞德生物技术有限公司 | 一种s-腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸硫酸盐的制备方法 |
| CN103848878A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-06-11 | 正源堂（天津）生物科技有限公司 | 从蛹虫草中提取n6-(2-羟乙基)腺苷的方法及其应用 |
| CN103908476A (zh) * | 2014-04-29 | 2014-07-09 | 洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司 | 一种蛹虫草提取物及其制备方法与制剂 |
| CN106922389A (zh) * | 2015-12-31 | 2017-07-07 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | 一种蝉花的人工培养方法 |
| CN106317149A (zh) * | 2016-08-18 | 2017-01-11 | 湖州新驰医药科技有限公司 | 一种金蝉花腺苷制剂及提取工艺 |
| TW201932133A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-16 | 明谷農業生技股份有限公司 | 蟬花萃取液之萃取方法及其用途 |
| CN108948115A (zh) * | 2018-10-16 | 2018-12-07 | 安徽祥康生物工程有限公司 | 一种高效提取蛹虫草腺苷的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 不同产地大蝉草的ITS鉴定及氨基酸和核苷成分比较;吴潇 等;《Mycosystema》;第38卷(第2期);第222-229页 * |
| 蝉花化学成分及人工培养的研究进展;何雯雯 等;《中药材》;第42卷(第7期);第1691-1696页 * |
| 蝉花微生物群落结构研究及优势真菌的分离培养;淳于彦洁;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;全文 * |
| 蝉花虫草中核苷类成分的分离纯化和鉴定;陈安徽 等;《食品科学》;第34卷(第1期);第131-134页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113480587A (zh) | 2021-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113480587B (zh) | 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 | |
| CN102174449B (zh) | 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用 | |
| CN108753627B (zh) | 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤剂中的应用 | |
| CN108660082B (zh) | 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用 | |
| CN108689803B (zh) | 一种废弃烟叶综合利用的方法 | |
| CN102586358B (zh) | 一种提高埃博霉素b产率的生物合成方法 | |
| CN105331668B (zh) | 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 | |
| WO2021143833A1 (zh) | 二酮哌嗪二聚体高产冠突散囊菌菌株及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法 | |
| CN103898004A (zh) | 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法 | |
| CN111500472B (zh) | 一种富含黄酮和多酚的古尼虫草菌丝体及其生产方法 | |
| CN102399837A (zh) | 微生物发酵合成阿卡波糖的方法 | |
| CN101629193B (zh) | 海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法 | |
| CN101033457B (zh) | 一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法及其发酵培养基 | |
| CN106086147A (zh) | 利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法 | |
| CN111411045B (zh) | 一种海洋真菌来源azaphilones二聚体类化合物及其制备方法 | |
| CN110982869B (zh) | 一种生物转化三七总皂苷制备20(R)-人参皂苷Rh1的方法 | |
| WO2024027251A1 (zh) | 一种利用狐粪青霉菌发酵生产7-羟基丁苯酞的方法 | |
| CN1165610C (zh) | 一种黑曲霉菌及用其生产香草酸和香草醛的微生物转化方法 | |
| CN111690706B (zh) | 一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素a3的方法 | |
| CN103146594B (zh) | 纤维堆囊菌菌株及其在埃博霉素合成方面的应用 | |
| CN113774002B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌培养基及其应用 | |
| CN106929464B (zh) | 一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中甾醇类有效成分积累的方法 | |
| CN106282032B (zh) | 桔青霉lb及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用 | |
| CN114667890A (zh) | 一种松茸子实体分离培育菌种和菌丝体的方法，以及松茸菌丝体粉和浓缩液的制备方法 | |
| CN107034253A (zh) | 一种采用滇龙胆内生真菌进行生物转化的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240401 Address after: 415000 Plant 9, SME Incubation Park, Jinshi Avenue, Jinshi City High tech Development Zone, Changde City, Hunan Province Applicant after: Hunan Hejian Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 221018 Lishui Road, Yunlong District, Xuzhou, Jiangsu 2 Applicant before: XUZHOU University OF TECHNOLOGY Country or region before: China |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |