CN103113442A - 一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法，包含以下步骤：（1）将虫草菌丝体或其提取液加水配置成菌丝体的混合液，其中菌丝体的含量范围为1-700g/L；（2）在步骤（1）的菌丝体混合液中加入10-700g/L可溶性无机盐，以及10-600g/L醇类或酮类亲水性有机物，得到的多相混合液静置分相，上相为富含腺苷的溶剂相，下相为富含多糖的富盐相；（3）从上相中分离得到腺苷，从下相中分离得到虫草多糖。本发明克服了目前从虫草菌丝体中分离多糖与腺苷工艺存在的诸多弊端，使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及到微生物菌丝体的分离技术，特别涉及到从微生物菌丝体中分离虫草多糖与腺苷的方法。
背景技术
冬虫夏草（Cordyceps inensis）为传统中医药的珍品，具有抗肿瘤、抗病毒、止血化痰、润肺补肾等功效，与人参、鹿茸并称为中药三大补品。目前，虫草菌丝体主要通过天然采摘和经发酵培养获得两条途径获得，其中经发酵培养获得的菌丝体，由于其主要成分、药理作用及临床效果上与天然冬虫夏草基本相似，因此受到了广泛的重视。目前虫草菌丝体中的药物活性成分主要包含多糖，腺苷与虫草酸等。其中，虫草多糖具有提高免疫功能、抗放疗和抗肿瘤的作用；腺苷具有神经保护、减慢心率、抗惊厥、抗辐射等功能，因此分离纯化虫草的多种药理成分一直是研究的热点之一。
目前从虫草菌丝体中分离纯化药物活性成分，多采用高速离心、膜过滤、萃取、醇沉、柱层析、离子交换树脂或分子筛吸附和减压蒸馏等多步方法将某种药理成分分离。Rongmin Yu等用醇沉、Sevag法除蛋白、醇洗以及硅胶柱层析的方法纯化虫草多糖（Fitoterapia，2004，75(7-8):662–666），但最终仅得到多糖产品，并且收率较低。Jian Ya Ling等研究了超临界萃取法（Separation andPurification Technology,2009,66(3):625–629）自菌丝体中分离腺苷，但回收率仅为6.56%，并且需要40MPa的高压，不但能耗巨大，而且容易破坏其他活性成分。现有针对虫草菌丝体中有效成分的分离多需要几步甚至十几步的分离工艺，工艺复杂，操作条件不易控制，并且不能同时兼顾多种有效成分的分离，导致整个分离过程存在收率低、成本高等问题，因此急需新的工艺以提高其分离效率。
双水相萃取技术始于20世纪60年代,双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于水中并达到一定浓度时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用,无法相互渗透,从而形成不互溶的两相,称为双水相。由于该方法具有条件温和,容易放大,可连续操作等优点,因此在蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化中，受到了广泛的重视，但由于水溶性高聚物大多黏度大,难挥发，使工业化应用受到限制。事实上，在适当条件下,如果亲水性有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮等，与水和无机盐在适当浓度下混合时，会出现液液分相现象，从而形成一种新型的双水相萃取体系。其分相更清晰,成本更低,萃取相可通过精馏或蒸馏的方式加以回收。尽管这方面研究在国内外刚刚起步,但已表现出良好的分离性能,如蛋白、金属离子以及生物小分子上均得到相当满意的结果。
发明内容
本发明的目的是针对目前从虫草菌丝体存在的分离工艺复杂，分离能力小，总体收率低，成本高等问题，提供了一种采用双水相萃取的方法从虫草菌丝体中分离多糖和腺苷的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法，包含以下步骤：
（1）将虫草菌丝体或其提取液加水配置成菌丝体的混合液，其中菌丝体的含量范围为1-700g/L；
（2）在步骤（1）的菌丝体混合液中加入10-700g/L可溶性无机盐，以及10-600g/L醇类或酮类亲水性有机物，得到的多相混合液静置分相，上相为富含腺苷的溶剂相，下相为富含多糖的富盐相；
（3）从上相中分离得到腺苷，从下相中分离得到虫草多糖。
优选地，所述亲水性有机物为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或多种。
优选地，所述亲水性有机物选择甲醇时，菌丝体混合液中添加的可溶性无机盐的阴离子为三价。
优选地，所述阴离子为三价的无机盐为磷酸氢二钾/钠、磷酸钾/钠或其混合物。
优选地，所述可溶性无机盐为氯化钠、硫酸铵、碳酸钾、碳酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种。
优选地，所述可溶性无机盐为固体或盐溶液，加盐后菌丝体溶液中盐的饱和度达到10%～100%。
优选地，步骤（3）中分离腺苷是采用蒸馏或精馏法从溶剂相中萃取以回收溶剂，得到腺苷粗品；分离虫草多糖是采用超滤或透析将多糖和其他小分子分离，浓缩或经吸附得到多糖粗品。萃取操作方式可以是间歇的，也可以是连续的；对于分配系数较小的体系可以采用多级萃取的方式。如果菌丝体未经过滤或离心直接进行萃取操作，这时往往在上下相之间形成一个富含菌体的固相层，有时也在下相底部形成固相层，这个系统可被称为多相系统。萃取操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。
为了使腺苷尽可能多地分配到上相，多糖尽可能保留在下相，可以调节体系的pH值。优选地，步骤（2）中所述多相混合液的pH值控制在3-13之间。
虫草菌丝体可以来自天然冬虫夏草，也可以通过人工发酵产生。可用水提、醇提、超声或微波破碎的方法进行预处理，也可未经预处理的虫草菌丝体。优选地，所述虫草菌丝体混合液的制备方法如下：取虫草菌粉于试管中，加入水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，后75℃水浴提取3h即可。
本发明克服了目前从虫草菌丝体中分离多糖与腺苷工艺存在的诸多弊端，使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在：亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相对多糖和腺苷均有较好的萃取分离效果，双水相萃取可同步分离菌体和菌体碎片，免除了菌体分离步骤，并且可同步分离多糖和腺苷，解决了现有分离工艺复杂，收率低，成本高等问题。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
本实施例中所用虫草菌种为蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali）（提取自天然冬虫夏草），购于中国科学院微生物研究所。培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如蔗糖或葡萄糖等碳源，豆粕粉或酵母粉等氮源，钠、钾、氨、镁、钙等阳离子和磷酸根、硫酸根、氯离子等阴离子，以及锌、铁、锰、铜、钴、硼、和钼等微量元素。实施例中的虫草菌丝体是采用蝙蝠蛾拟青霉批式发酵得到的，虫草菌丝体中多糖含量为5.89%，腺苷含量为3.119mg/g。
实施例1
取1g虫草菌粉于试管中，加入40mL水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，后75℃水浴提取3h，取1mL虫草菌丝体混合液（25g/L），加入0.6g的碳酸钾，再加入0.4g乙醇，混合、静置、分相，得腺苷主要分配在上相，分配系数为29.5，回收率为93.7%；多糖主要分配在下相，分配系数为0.07，回收率为85.6%。
实施例2
取1g虫草菌粉于试管中，加入40mL水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，75℃水浴提取3h，取1mL虫草菌丝体混合液（25g/L），加入0.3g的碳酸钠，再加入0.4g乙醇，混合、静置、分相，得腺苷主要分配在上相，分配系数为49.4，回收率为98.3%；多糖主要分配在下相，分配系数分别为0.16，回收率分别为68.3%。
实施例3
取1g虫草菌粉于试管中，加入40mL水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，75℃水浴提取3h，取1mL虫草菌丝体混合液（25g/L），加入0.4g的硫酸铵，再加入0.4g乙醇，混合、静置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系数为8.89，回收率为84.9%；多糖主要分配在下相，分配系数分别为0.23，回收率分别为87.3%。
实施例4
取1g虫草菌粉于试管中，加入40mL水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，75℃水浴提取3h，取1mL虫草菌丝体混合液（25g/L），加入0.6g的磷酸氢二钾，再加入0.4g乙醇，混合、静置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系数为22.6，回收率为97.3%；多糖主要分配在下相，分配系数分别为0.19，回收率分别为63.2%。
实施例5
取1g虫草菌粉于试管中，加入40mL水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，75℃水浴提取3h，取1mL虫草菌丝体混合液（25g/L），加入0.3g的硫酸钠，再加入0.4g乙醇，混合、静置、分相。腺苷主要分配在上相，分配系数为6.5，回收率为91.1%；多糖主要分配在下相，分配系数分别为0.19，回收率分别为52.8%。
Claims (9)
1.一种从冬虫夏草菌丝体中提取虫草多糖和腺苷的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）将虫草菌丝体或其提取液加水配置成菌丝体的混合液，其中菌丝体的含量范围为1-700g/L；
（2）在步骤（1）的菌丝体混合液中加入10-700g/L可溶性无机盐，以及10-600g/L醇类或酮类亲水性有机物，得到的多相混合液静置分相，上相为富含腺苷的溶剂相，下相为富含多糖的富盐相；
（3）从上相中分离得到腺苷，从下相中分离得到虫草多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲水性有机物为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亲水性有机物选择甲醇时，菌丝体混合液中添加的可溶性无机盐的阴离子为三价。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述阴离子为三价的无机盐为磷酸氢二钾/钠、磷酸钾/钠或其混合物。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述可溶性无机盐为氯化钠、硫酸铵、碳酸钾、碳酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述可溶性无机盐为固体或盐溶液，加盐后菌丝体混合液中盐的饱和度达到10%～100%。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中分离腺苷是采用蒸馏或精馏法从溶剂相中回收溶剂，得到腺苷粗品；分离虫草多糖是采用超滤或透析将多糖和其他小分子分离，浓缩或经吸附得到多糖粗品。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述多相混合液的pH值控制在3-13之间。
9.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于，所述菌丝体混合液的制备方法如下：取虫草菌粉于试管中，加入水，混匀后，在33kHZ，冰浴条件下，超声处理15min，后75℃水浴提取3h即可。
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